МИКРОФЛЮИДНЫЙ КАРТРИДЖ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ БИОМОЛЕКУЛ Российский патент 2018 года по МПК B01L3/00 B01L7/00 C12Q1/68 

Изобретение относится к микрофлюидному картриджу для детекции биомолекул в растворе пробы и к соответствующему способу детекции.

В многочисленных задачах молекулярно-биологического исследования и диагностики требуется определение количества или концентрации определенных биомолекул, например, определенных нуклеиновых кислот в пробе. В контексте этого изобретения термин нуклеиновая кислота также включает в себя последовательности нуклеиновой кислоты

В эффективных и быстрых способах детекции применяется матричная технология с использованием так называемых ДНК-чипов, обеспечивающих возможность поверхностно-чувствительной детекции событий гибридизации олигомеров нуклеиновой кислоты. Часто фактической и без того высокочувствительной детекции дополнительно предшествует этап амплификации, на котором подлежащие детекции нуклеиновые кислоты копируются так, что в конечном итоге они присутствуют в концентрации, лежащей выше предела детекции выбранного способа детекции.

Для такой специальной амплификации нуклеиновых кислот из уровня техники известны различные способы, например полимеразная цепная реакция (PCR). PCR используется практически во всех областях науки и медицины, в том числе в судебной медицине, пренатальной диагностике, онкологии и, не в последнюю очередь, в микробиологической диагностике. PCR представляет собой ферментативную реакцию для амплификации нуклеиновых кислот, которая протекает, по существу, в водной или жидкой реакционной смеси при очень небольших объемах. В этой реакционной смеси присутствуют проба, содержащая нуклеиновую кислоту, а также необходимые для реакции праймеры, нуклеотиды и полимераза. Путем добавления буферов и, предпочтительно, двухвалентных ионов, реакционную смесь регулируют так, чтобы для соответствующего типа применения преобладали оптимальные условия реакции.

PCR основана на многократно повторяющемся цикле из трех этапов: денатурации, гибридизации и удлинения, протекающих при разных температурах. В каждом цикле количество репродуцируемых нуклеиновых кислот приблизительно удваивается, так что с помощью небольшого числа циклов может быть достигнута значительная амплификация.

За общей и дополнительной информацией о PCR в целом, о PCR реального времени, в которой количество нуклеиновой кислоты определяется в процессе реакции PCR, и о предпочтительных способах электрохимической детекции событий гибридизации олигомеров нуклеиновой кислоты на тестовых участках ДНК-чипа можно обратиться к патентной заявке DE 102011056606 В3 настоящего заявителя, содержание которой включено в настоящую заявку по ссылке.

Микрофлюидное устройство для обработки биочастиц известно, например, из патентной заявки DE 102010043030 А1.

Исходя из этого, задачей настоящего изобретения является создание микрофлюидного устройства, экономичного в изготовлении и обеспечивающего возможность простой и быстрой детекции биомолекул.

Эта задача решается посредством признаков независимых пунктов формулы изобретения. Дополнительные варианты осуществления изобретения являются предметом зависимых пунктов формулы изобретения.

Согласно настоящему изобретению заявлен микрофлюидный картридж для детекции биомолекул в растворе пробы, содержащий:

- камеру детекции, выполненную с возможностью подачи в нее раствора пробы через впускной канал и вывода из нее анализируемого раствора пробы через выпускной канал,

- микрочип на основе комплементарной структуры металл-оксид-полупроводник (CMOS), имеющий сенсорную область, расположенную в камере детекции, и контактную область, герметично отделенную от камеры детекции,

- причем сенсорная область микрочипа содержит систему функционализованных тестовых участков для электрохимической детекции биомолекул в растворе пробы,

- при этом каждый тестовый участок сенсорной области снабжен собственным сигма-дельта модулятором для аналого-цифрового преобразования электрических сигналов, генерируемых на тестовых участках при электрохимической детекции.

Сигма-дельта модуляторы предпочтительно представляют собой сигма-дельта модуляторы первого порядка, выводящие в качестве оцифрованного сигнала поток битов, нечувствительный к шумам и взаимным помехам. Подразумевается, что поток битов, выводимый сигма-дельта модуляторами и пригодный для полного аналого-цифрового преобразования в впоследствии обрабатывается в соответствии с принципами сигма-дельта технологии,, чтобы обеспечить преобразованные выходные сигналы на контактных участках контактной области.

В варианте осуществления изобретения микрофлюидный картридж дополнительно содержит реакционную камеру, предназначенную для амплификации нуклеиновых кислот в растворе пробы, из которой раствор пробы подают в камеру детекции через впускной канал.

Предпочтительно реакционная камера выполнена с возможностью нагрева в ней раствора пробы до заданной температуры, приближенной к его нормальной точке кипения, и реакционная камера соединена по текучей среде через выравнивающий канал с камерой давления, которая свободна в нормальном режиме работы от жидкости, выполнена с возможностью нагрева до температуры выше нормальной температуры кипения раствора пробы, и предназначена для выпаривания доли текучей среды пробы, выталкиваемой в камеру давления через выравнивающий канал газовыми пузырьками в растворе пробы, с созданием тем самым обратного давления, действующего на раствор пробы, находящийся в реакционной камере, и уменьшающего количество газовых пузырьков.

Предпочтительно микрофлюидный картридж дополнительно содержит встроенное насосное устройство, соединенное по текучей среде с реакционной камерой и камерой детекции и выполненное с возможностью перемещения раствора пробы в реакционную камеру и оттуда, в заданных объемах раствора пробы, в камеру детекции. Насосное устройство предпочтительно дополнительно выполнено с возможностью подавать рабочую текучую среду, находящуюся в насосном устройстве, во внешнюю систему отбора пробы и, после обогащения рабочей текучей среды биомолекулами, подлежащими детекции, во внешней системе отбора пробы, подавать образованный таким образом раствор пробы обратно в картридж, а именно в реакционную камеру, и оттуда, в заданных объемах раствора пробы, в камеру детекции.

Микрофлюидный картридж целесообразно снабжен коннектором для внешней системы отбора пробы, выполненным в виде коннектора Люэра. Коннектор Люэра представляет собой стандартную соединительную систему для шланговых систем в области медицины, в которой уплотнение соединителя достигается посредством конусообразной конструкции соединительных частей, так называемого конуса Люэра. Для фиксации соединения конус Люэра может иметь резьбу с накидной гайкой, в этом случае он называется наконечником Люэра. Соединение закрывается и открывается при половине оборота. Термин «коннектор Люэра» также включает в себя фиксированное соединение посредством наконечника Люэра.

В микрофлюидном картридже предпочтительно разработана микроканальная система, проходящая от насосного устройства к коннектору для внешней системы отбора пробы через камеру детекции и реакционную камеру. В контексте данного изобретения микроканалы или микрофлюидные каналы имеют в частности диаметр или наибольшую поперечную протяженность от 0,5 до 3,2 мм.

Для обеспечения возможности проведения PCR в реакционной камере картриджа, в предпочтительном варианте осуществления микрофлюидный картридж, включая встроенное при необходимости насосное устройство, выполнен из подходящего для PCR пластика, такого как поликарбонат. При этом картридж может быть выполнен, например, аддитивным способом изготовления, таким как 3D-печать, формовочным процессом, таким как горячая штамповка, или, особенно предпочтительно инжекционным формованием.

В предпочтительном варианте осуществления насосное устройство выполнено в виде двойного шприца для подачи рабочей текучей среды в микроканальную систему картриджа. При этом двойной шприц содержит:

- цилиндрическую внешнюю камеру, образующую резервуар для размещения рабочей текучей среды,

- цилиндрическую внутреннюю камеру, расположенную внутри внешней цилиндрической камеры, имеющую в своем дистальном торце цилиндра выпускное отверстие для соединения с микроканальной системой картриджа и соединенную по текучей среде с внешней камерой через сквозные отверстия,

- внутренний поршень, выполненный с возможностью перемещения в осевом направлении во внутренней камере, который в закрытом положении закрывает сквозные отверстия со стороны внутренней камеры, а в открытом положении открывает сквозные отверстия и обеспечивает возможность протекания текучей среды из внешней камеры во внутреннюю камеру, и

- кольцевой поршень, выполненный с возможностью перемещения во внешней камере в осевом направлении к дистальному концу внешней камеры, который

i) в проксимальном к резервуару положении запирает резервуар для рабочей текучей среды,

ii) при перемещении к дистальному концу выталкивает рабочую текучую среду, находящуюся в резервуаре, во внутреннюю камеру через сквозные отверстия, если внутренний поршень находится в открытом положении, и

iii) в дистальном закрытом положении закрывает сквозные отверстия со стороны внешней камеры и обеспечивает, таким образом, возможность вывода текучей среды из микроканальной системы картриджа обратно во внутреннюю камеру посредством осевого перемещения внутреннего поршня к проксимальному концу.

Изобретение также относится к способу детекции биомолекул в растворе пробы посредством картриджа описанного типа, в котором

- раствор пробы подают через впускной канал в камеру детекции и направляют на сенсорную область микрочипа на основе CMOS, расположенную в камере детекции,

- регистрируют сигнал, генерируемый в функционализованных тестовых участках при электрохимической детекции биомолекул, и анализируют его для детекции биомолекул в растворе пробы.

Другие предпочтительные этапы способа согласно изобретению раскрыты в приведенном ниже описании чертежей, а именно в описания к фиг. 1, 2.

Преимущества изобретения, а также дополнительные варианты его осуществления описаны ниже со ссылкой на прилагаемые чертежи, изображения на которых для наглядности приведены без соблюдения масштаба и пропорций.

На чертежах показано следующее.

На фиг. 1 - схематическое изображение принципа детекции нуклеиновых кислот в пробе посредством системы детекции согласно изобретению,

на фиг. 2 - схематический вид микрофлюидного картриджа для детекции биомолекул в растворе пробы в соответствии с вариантом осуществления изобретения,

на фиг. 3 - схематический вид в разрезе картриджа с фиг. 2 в области микрочипа вдоль линии III-III,

на фиг. 4 - частичный вид сверху в аксонометрии микрофлюидного картриджа согласно изобретению в области камеры детекции и камеры PCR,

на фиг. 5 - частичный вид микрофлюидного устройства для обработки биомолекул в растворе пробы с контролируемой температурой,

на фиг. 6 - схематический вид в разрезе двойного шприца, который может быть использован в качестве насосного устройства в микрофлюидном картридже;

на фиг. 7 (а)-(с) - вид двойного шприца с фиг. 6 в разных состояниях при подаче/обратной подаче текучей среды, и

на фиг. 8 (а)-(е) - вид двойного шприца с множеством текучих сред в разных состояниях при подаче/обратной подаче текучих сред.

На фиг. 1 показан принцип детекции определенных нуклеиновых кислот в пробе 92, находящейся в системе 90 отбора пробы, посредством системы 10 детекции. Проба 92 может представлять собой, например, пробу в виде мазка пациента, находящуюся на конце палочки-тампона в пробирке 90, которая должна быть анализирована микробиологически на штаммы метициллин-резистентного золотистого стафилококка (MRSA).

Система 10 детекции содержит насосное устройство 20 с рабочей текучей средой 22, подаваемой в пробу 92 на этапе подачи через микроканальную систему 30 и открытый клапан 80 (направление потока 32). На своем пути через микрокананальную систему 30 рабочая текучая среда 22 проходит через область 70 резервуара, в которой она поглощает находящиеся там химические реагенты 72, в варианте осуществления, например, для выделения ДНК из пробы 92. Камера 40 детекции, реакционная камера 50 и камера 60 давления системы 10 детекции на этом этапе подачи еще не играют никакой роли.

Затем, на этапе обратной подачи раствор пробы, образовавшийся в результате лизиса пробы 92 в системе 90 отбора пробы, подается обратно в систему 10 детекции насосным устройством 20 (направление потока 34). Отсюда, как правило, раствор пробы подается обратно по всему пути к насосному устройству 20 для обеспечения того, что по меньшей мере реакционная камера 50 системы 10 детекции заполнена раствором пробы. После этапа обратной подачи клапан 80 закрывается по отношению к внешней системе 90 отбора пробы для наличия определенного объема текучей среды в системе 10 детекции и получения изолированной системы.

Для амплификации нуклеиновых кислот, подлежащих детекции, в реакционной камере 50 проводят полимеразную цепную реакцию (PCR). Химические реагенты 52, необходимые для этой цели, предварительно находятся под защитой слоя воска. В начале амплификации слой воска плавится путем повышения температуры, и за счет этого химические реагенты 52 PCR добавляются к раствору пробы в реакционной камере 50. В течение PCR расплавленный воск остается жидким или принимается множеством резервуаров в краевом участке реакционной камеры 50, чтобы гарантировать, что затвердевший воск не закупорит соседние микроканалы 30.

Цикличный температурный режим в реакционной камере 50, необходимый для PCR, создается посредством устройства нагрева/охлаждения (не показано), предназначенного для реакционной камеры 50. Управляемый ход PCR, который не является естественным в микрофлюидных системах, обеспечивается в системе 10 детекции камерой 60 давления, соединенной по текучей среде с реакционной камерой 50 через выравнивающий канал 38. Как описано более подробно ниже, камера 60 давления свободна от жидкости в нормальном режиме работы и поддерживается при температуре, значительно превышающей нормальную температуру точки кипения раствора пробы, например, T_DK=120°C, посредством устройства нагрева (не показано), предназначенного для камеры давления.

Газовые пузырьки, возникающие в реакционной камере 50 на этапе денатурации при Т≈96°C, выталкивают небольшое количество текучей среды пробы в камеру 60 давления, где она сразу испаряется из-за повышенной температуры камеры давления. Вследствие образующегося при испарении большого объема газа, в камере 60 давления быстро возникает обратное давление на раствор пробы, находящийся в реакционной камере 50, которое значительно уменьшает количество и размер газовых пузырьков. Реакционная камера 50 и камера 60 давления образуют, таким образом, саморегулируемую подсистему для подавления нежелательных газовых пузырьков в реакционной камере 50, обеспечивая тем самым хорошо контролируемый ход PCR.

В частности, в системе 10 детекции осуществляется PCR особого типа, называемая PCR реального времени, поскольку количество нуклеиновых кислот, присутствующих в растворе пробы, определяется при прохождении реакции. PCR реального времени позволяет более точно определять концентрацию нуклеиновой кислоты в растворе пробы в виде чистого определения конечной точки в конце PCR. В PCR реального времени, осуществляемой в системе 10 детекции, сначала выполняется первое заданное количество циклов реакции амплификации, например 15 циклов, чтобы увеличить концентрацию нуклеиновой кислоты до диапазона измерения.

Затем посредством насосного устройства 20 определенный объем раствора пробы с амплифицированными нуклеиновыми кислотами передается из реакционной камеры 50 в камеру 40 детекции (поток 36). В камере детекции расположена сенсорная область 42 микрочипа на основе CMOS, имеющая систему функционализованных тестовых участков для электрохимической детекции нуклеиновых кислот в растворе пробы. При электрохимической детекции каждый из тестовых участков генерирует электрический сигнал, величина которого является мерой концентрации нуклеиновой кислоты в переданном объеме для детекции. Один предпочтительный способ электрохимической детекции описан в патентной заявке DE 102011056606 В3, содержание которой включено в настоящую заявку по ссылке.

Затем в каждом случае повторно проводится дополнительный цикл PCR, чтобы дополнительно увеличить концентрацию нуклеиновой кислоты, при этом после каждого цикла определенный объем раствора пробы с амплифицированными нуклеиновыми кислотами передается из реакционной камеры 50 в камеру 40 детекции, и электрохимически определяется концентрация нуклеиновой кислоты. Таким образом, например, может быть проведено в общей сложности 30-40 циклов PCR. В конце способа для определения конечной точки в камеру 40 детекции может быть дополнительно подан другой, еще больший финальный объем раствора пробы, и концентрация нуклеиновой кислоты может быть детектирована электрохимически.

В качестве примера конкретной реализации системы 10 детекции на фиг. 2 схематически показан вариант осуществления в виде микрофлюидного картриджа 100 для детекции биомолекул в растворе пробы, выполненного в соответствии с принципами, описанными в связи с фиг. 1.

Картридж 100 полностью выполнен из поликарбоната, за исключением химических реагентов и микрочипа 142, например, аддитивным способом изготовления или инжекционным формованием. Картридж 100 представляет собой одноразовый картридж для экономичной детекции требуемых нуклеиновых кислот, например, при скрининге MRSA.

Для соединения с системой отбора пробы картридж 100 содержит коннектор 110 Люэра, к которому, например, может быть присоединена пробирка 90 с подлежащей анализу пробой 200 в виде мазка.

В картридже 100 выполнена микроканальная система 120, проходящая от насосного устройства 200 через камеру 140 детекции и камеру 150 PCR с химическими реагентами 152 PCR, защищенными слоем воска, и резервуар 170 для химических реагентов 172 для лизиса к коннектору 110 Люэра. В других конструкциях химические реагенты 172 для лизиса расположены в другом месте, например, в коннекторе Люэра или в пробирке 90.

Насосное устройство выполнено в виде двойного шприца 200, описанного более подробно ниже, и образует встроенный компонент поликарбонатного картриджа 100. Таким образом, внешняя камера 204 двойного шприца 200 заполнена необходимой рабочей текучей средой 202 с обеспечением стабильности при хранении, так что картридж 100, за исключением устройства нагрева/охлаждения, по существу содержит все компоненты, необходимые для требуемой детекции.

Для определения концентрации нуклеиновых кислот в растворе пробы, картридж содержит микрочип 142 на основе CMOS, контур которого показан пунктирной линией на фиг. 2. Микрочип 142 содержит сенсорную область 144, расположенную в камере 140 детекции, и контактную область 146, герметично отделенную от камеры детекции. Для более подробного описания на фиг. 3 схематически показан вид картриджа 100 в разрезе в области микрочипа 142 по линии III-III на фиг. 2.

Сенсорная область 144 микрочипа 142 содержит систему из, например, 109 функционализованных тестовых участков 130 с восьмиугольным расположением для электрохимической детекции нуклеиновых кислот, подлежащих детекции, в растворе пробы. Подходящий способ детекции описан, например, в патентной заявке DE 102011056606 В3.

Для достижения особо хорошего результата считывания каждый из тестовых участках 130 сенсорной области 144 снабжен собственным сигма-дельта модулятором 132 первого порядка для аналого-цифрового преобразования электрических сигналов, генерируемых на контрольных точках 130. Сигма-дельта модуляторы 132 выводят в качестве оцифрованного сигнала поток битов, нечувствительный к шумам и взаимным помехам, который, однако, для полного аналого-цифрового преобразования в соответствии с собственно известными принципами сигма-дельта технологии, дополнительно обрабатывается в цепи 134 обработки для создания конечных выходных сигналов. Выходные сигналы могут быть сняты на контактных площадках 136 контактной области 146 микрочипа 142 и могут быть поданы известным способом в блок анализа и отображения.

Как показано на фиг. 3, контактная область 146 микрочипа 142 герметично отделена от камеры 140 детекции с содержащимся в ней при применении раствором пробы, например, посредством резинового кольца 138 или материала круговой заливки компаундом.

Для анализа пробы 92 картридж 100 сначала соединяется с системой 90 отбора пробы через коннектор 110 Люэра, при этом клапан 180, если он еще не открыт, открывается. После этого сквозные отверстия 218 между внешней камерой и внутренней камерой 206 могут быть открыты за счет небольшого подъема 220 внутреннего поршня 216 двойного шприца 200 посредством соответствующего поршневого штока (фиг. 7 (b)). Путем опускания 230 резинового кольца 214 имеющаяся рабочая текучая среда 202 подается через микроканальную систему 120 в пробу 92, при этом рабочая текучая среда поглощает химические реагенты 172 лизинга в резервуаре 170.

Опущенное резиновое кольцо 214 закрывает сквозные отверстия 218 с внешней стороны камеры, так что путем дальнейшего осевого перемещения внутреннего поршня 216 посредством поршневого штока раствор пробы, возникший в результате лизиса пробы 92, может быть подан обратно в микроканальную систему 120 картриджа 100 до внутренней камеры 206 двойного шприца 200. В этом состоянии канальная система 120, включая камеру 150 PCR и камеру 140 детекции, заполнена раствором пробы. Напротив, камера 160 давления, соединенная по текучей среде с камерой 150 PCR через выравнивающий канал 122, по существу свободна от жидкости. Затем закрывается клапан 180 к внешней системе 90 отбора пробы, так чтобы определить замкнутый объем текучей среды в системе детекции для последующей PCR.

Для проведения PCR, картридж 100 может быть использован, например, в амплификаторе, обеспечивающем устройства нагрева/охлаждения для ступеней температуры циклов PCR. В частности, в камере 150 PCR путем плавления слоя воска в раствор пробы добавляются химические реагенты 152 PCR и проводится PCR путем создания требуемого циклического температурного режима. Как описано более подробно ниже, путем нагрева камеры 160 давления до температуры TD выше температуры кипения раствора пробы также подавляется образование газовых пузырьков в камере 150 PCR, так что PCR может протекать надежно и контролируемым образом.

После заданного количества начальных циклов PCR, из камеры 150 PCR в камеру 140 детекции передается определенный объем раствора пробы с амплифицированными нуклеиновыми кислотами путем контролируемого подъема внутреннего поршня 216 двойного шприца. Требуемые значения концентрации нуклеиновой кислоты в растворе пробы определяются путем электрохимической детекции событий гибридизации олигомеров нуклеиновой кислоты на тестовых участках 130 микрочипа 142, как, например, более подробно описано в DE 102011056606 В3.

После следующего цикла PCR, из камеры 150 PCR в камеру 140 детекции передается следующий определенный объем дополнительно амплифицированного раствора пробы путем постепенного подъема внутреннего поршня 216, и определяется концентрация нуклеиновой кислоты. Например, камера 150 PCR может иметь объем 30 μl, и после завершения начальных циклов PCR в течение от 15 до 25 циклов после каждого цикла PCR в камеру 140 детекции передается объем 1 μl. В конце процесса в камеру 140 детекции может быть подан еще больший завершающий объем раствора пробы, и может быть определена конечная точка концентрации. Следует понимать, что определение концентрации может быть выполнено и при более длительных интервалах, например, после каждого второго или каждого третьего цикла PCR.

Пример конкретной конструкции картриджа 100 в области камеры 140 детекции и камеры 150 PCR показан в аксонометрии на виде сверху с фиг. 4 варианта осуществления. В этом варианте осуществления камера 150 PCR разделена на множество расположенных друг за другом дискообразных субкамер 154, из которых на чертеже показана только последняя субкамера 154. От камеры 150 PCR или последней субкамеры 154 проходит впускной канал 124 в камеру 140 детекции, от которой к двойному шприцу 200 проходит выпускной канал 126.

Контур микрочипа 142 на основе CMOS снова показан пунктирной линией. При этом сенсорная область 144 микрочипа 142 с системой тестовых участков 130 расположена в камере 140 детекции и герметично отделена от контактной области 146 с контактными площадками 136 посредством кольца 139 круговой заливки компаундом.

Саморегулируемая подсистема для подавления газовых пузырьков в камере PCR снова более подробно пояснена в описании к фиг. 5. Описанный принцип не ограничивается применением в PCR, он может быть использован в других микрофлюидных процессах обработки с контролируемой температурой, в которых раствор пробы должен сохраняться свободным от газовых пузырьков вблизи нормальной точки кипения раствора пробы.

На фиг. 5 показана часть микрофлюидного устройства 400 для обработки раствора 410 пробы с контролируемой температурой, в данном случае для описанной выше детекции нуклеиновых кислот. Микрофлюидное устройство 400 содержит реакционную камеру 450, в которой раствор пробы с нуклеиновыми кислотами может быть нагрет посредством устройства 452 нагрева/охлаждения до заданной температуры, приближенной к нормальной точки кипения раствора 410 пробы. В случае упомянутой выше PCR реального времени, раствор 410 пробы нагревается, например, на этапе денатурации до примерно 96°C.

Наличие в микрофлюидных устройствах газовых пузырьков может приводить не только к большим разностям температуры в растворе пробы в реакционной камере 450, но и к выталкиванию раствора пробы из реакционной камеры и сильному колебанию текучей среды в микрофлюидной системе. Различные меры предлагались для подавления образования газовых пузырьков в микрофлюидных системах PCR, было предложено особое конструкционное исполнение реакционной камеры, обработка поверхности стенок реакционной камеры, уплотнение реакционной камеры при повышенном давлении, дегазация раствора пробы и добавление реагентов с высокой точкой кипения.

В примененном здесь предпочтительном решении, газовые пузырьки подавляются в реакционной камере 450 посредством присоединения по текучей среде реакционной камеры 450 к камере 460 давления, свободной от жидкости в нормальном рабочем режиме и имеющей температуру выше температуры нормальной точки кипения раствора 410 пробы. Как показано на фиг. 5, реакционная камера 450 соединена по текучей среде через выравнивающий канал 422 с камерой 460 давления, нагреваемой посредством устройства 462 нагрева до температуры TDK, значительно большей нормальной точки кипения раствора пробы. В этом варианте осуществления температура камеры давления составляет от 110°C до 130°С, например, при TDK=125°C. Так как температура камеры давления выше точки кипения, камера 460 давления свободна от жидкости в нормальном режиме работы.

Не вдаваясь в детали, под механизмом подавления газовых пузырьков в настоящее время понимается следующее: если газовые пузырьки 454 образуются в реакционной камере 450 во время обработки биомолекул с контролируемой температурой, такой как упомянутый выше этап денатурации PCR, то первые образующиеся газовые пузырьки выталкивают небольшую долю 464 текучей среды пробы через выравнивающий канал 422 в камеру 460 давления, где она сразу испаряется из-за высокой температуры, преобладающей в камере 460 давления. Возникающий в результате испарения газовый объем от 1000 до 2000 раз больше объема испаренной текучей среды, так что в камере 460 давления возникает сильное повышение давления, что, в свою очередь, приводит к увеличению давления в реакционной камере 450 и, таким образом, к уменьшению количества и размера газовых пузырьков и противодействует образованию дополнительных газовых пузырьков. Согласно современному пониманию, основными эффектами при этом являются увеличение давления пара и сжатие имеющихся газовых объемов.

Поскольку сила возникающего обратного давления увеличивается с объемом испаренной текучей среды и, таким образом, с объемом 464 текучей среды, вытесненным газовыми пузырьками, этот подход приводит к саморегулированию газовых пузырьков 454 в растворе 410 пробы. Камера 460 давления может быть легко встроена в микрофлюидную систему и не требует реакционной камеры сложной конструкции, добавок к раствору пробы или других дорогостоящих мер для подавления образования газовых пузырьков, которые обычно могут предотвращать нуклеацию газовых пузырьков на стенках реактора, или как в случае добавок к раствору пробы, влиять на течение PCR.

Для подачи рабочей текучей среды 202 в микрофлюидную систему, такую как микроканальная система 120, 140, 150, 170, 180 на фиг. 2, предпочтительно используется двойной шприц 200, конструкция и принцип работы которого описаны подробно со ссылками на фиг. 6.

Двойной шприц 200 содержит две концентрически расположенные цилиндрические камеры 204, 206, в которых в каждом случае размещены перемещаемые в осевом направлении поршни 214, 216. В данном описании, конец двойного шприца 200, имеющий выпускное отверстие 210, называется дистальным концом D шприца или цилиндров, а противоположный в осевом направлении конец - проксимальным концом Р. Если точнее, двойной шприц содержит цилиндрическую внешнюю камеру 204, образующую резервуар 208 для рабочей текучей среды 202. Концентрически во внешней камере 204 расположена цилиндрическая внутренняя камера 206, дистальный конец которой закрывается внешней камерой 204. Выпускное отверстие 210 двойного шприца расположено на дистальном торце 212 цилиндра внутренней камеры 206. Обе цилиндрические камеры 204, 206 соединены друг с другом по текучей среде через систему сквозных отверстий 218, выполненных в области дистального конца камер 204, 206 по окружности в общей цилиндрической стенке 205 внутренней и внешней камеры на одинаковой осевой высоте.

Во внутренней камере 206 размещен перемещаемый в осевом направлении внутренний поршень 216, имеющий на своей проксимальной стороне захватный элемент 222, который может захватываться снаружи отдельным подходящим поршневым штоком 240 (фиг. 7 (b)) для обеспечения возможности перемещения внутреннего поршня 216 в осевом направлении вверх и вниз (стрелки 220). Вместо захватного элемента 222 в проксимальной стороне внутреннего поршня 216 может быть, например, выполнена полость, в которой захватывается соответственно выполненный дистальный конец поршневого штока.

Если внутренний поршень 216 находится на дистальном конце внутренней камеры 206, то внутренний поршень 216 закрывает сквозные отверстия 218 со стороны внутренней камеры посредством кругового уплотнения 224, например, резинового уплотнения, так что поток текучей среды от резервуара 208 внешней камеры 204 к выпускному отверстию 210 невозможен. Это положение внутреннего поршня 216 соответственно называется закрытым положением и показано на фиг. 7(a).

Если внутренний поршень 216 несколько перемещается в проксимальном направлении, т.е. как показанона фиг. 6, поднимается, он открывает сквозные отверстия 218 и обеспечивает возможность потока текучей среды от внешней камеры 204 через внутреннюю камеру 206 к выпускному отверстию 210. Соответственно, такое положение внутреннего поршня 216 называется открытым положением, которое показано на фиг. 7(b).

Во внешней камере 204 размещен кольцевой уплотнительный внешний поршень, окружающий внутреннюю камеру 206, здесь в виде резинового кольца 214, перемещаемый в осевом направлении к дистальному концу D внешней камеры (стрелки 230). В проксимальном положении резервуара резиновое кольцо 214 перекрывает резервуар 208 для рабочей текучей среды 202, как показано на фиг. 7(a). В дистальном закрытом положении, показанном на фиг. 7(c), резиновое кольцо 214 закрывает сквозные отверстия 218 со стороны внешней камеры 201 и обеспечивает, таким образом, возможность вывода текучей среды из микроканальной системы во внутреннюю камеру 206 посредством осевого перемещения внутреннего поршня 216 к проксимальному концу Р шприца.

На проксимальной стороне внутреннего поршня 216 может быть расположен резервуар 226 для размещения химических реагентов. Изначально химические реагенты удерживаются в резервуаре 226, однако могут быть выпущены в заданное время с помощью средства выпуска, например, плавкого воскового покрытия или покровного слоя магнитных частиц.

Принцип работы двойного шприца 100 описывается более подробно ниже с помощью фиг. 7(а)-7(с), на которых рабочая текучая среда 202, находящаяся во внешней камере 204 двойного шприца 200, подается в микрофлюидную систему, которая сама не показана.

В исходном состоянии с фиг. 7(a) внутренний поршень 216 находится в своем дистальном закрытом положении, а резиновое кольцо 214 - в своем проксимальном положении резервуара. Резервуар 208 внешней камеры 206 предварительно заполнен требуемой рабочей текучей средой 202 с обеспечением стабильности при хранении.

Если рабочую текучую среду 202 требуется подать в микрофлюидную систему, то захватный элемент 222 внутреннего поршня 216 захватывается подходящим поршневым штоком 240 и поднимается в показанное на фиг. 7(b) открытое положение, в котором сквозные отверстия 218 выпускают поток текучей среды от резервуара 208 внешней камеры 204 к выпускному отверстию 210. Путем опускания резинового кольца 214, рабочая текучая среда 202 может быть полностью закачана в микрофлюидную систему (поток 242).

Как показано на фиг. 7(c), резиновое кольцо 214 и положение сквозных отверстий 218 в цилиндрической стенке 205 согласованы друг с другом так, что резиновое кольцо 214 закрывает в своем дистальном закрытом положении сквозные отверстия 218 со стороны внешней камеры. В этом состоянии двойной шприц может использоваться как обычный шприц путем осевого перемещения поршневого штока 240 вверх и вниз во внутренней камере 206, при этом текучая среда может перемещаться в обоих направлениях. В частности, путем дальнейшего подъема, а именно путем осевого перемещения внутреннего поршня 216 по направлению к проксимальному концу, текучая среда может быть подана из микрофлюидной системы во внутреннюю камеру 206 (поток 244).

Таким образом, например, в случае варианта осуществления с фиг. 2, раствор пробы, возникший посредством лизиса пробы 92, подается из пробирки 90 обратно в микроканальную систему картриджа 100 и в итоге во внутреннюю камеру 206 двойного шприца. Кроме того, в течение проведения PCR небольшие объемы текучей среды постепенно передаются от камеры 150 PCR в камеру 140 детекции после каждого цикла PCR путем контролируемого подъема поршневого штока 240.

При подходящей конструкции таким двойным шприцем в микрофлюидную систему также можно подавать две или более текучих сред. На фиг. 8 показан такой двойной шприц с множеством текучих сред, выполненный, например, для подачи n=2 текучих сред в микрофлюидную систему. Возможность увеличения подачи до трех или более текучих сред ясно следует из приведенного ниже описания.

Двойной шприц 300 с двумя текучими средами с фиг. 8 также содержит две концентрически расположенные цилиндрические камеры 304, 306 и, соответственно, представляет собой двойной шприц. Цилиндрическая внешняя камера 304 образует n=2 резервуары 308-1, 308-2 для размещения текучих сред 302-1, 302-2 для подачи.

Во внешней камере 304 концентрично расположена цилиндрическая внутренняя камера 306, которая закрывается на своем дистальном конце с внешней камерой 304. Выпускное отверстие 310 двойного шприца 300 расположено на дистальном торце цилиндра внутренней камеры 306.

Обе цилиндрические камеры 304, 306 соединены по текучей среде друг с другом посредством разнесенных в осевом направлении n=2 групп сквозных отверстий 318-1, 318-2. Каждая группа сквозных отверстий 318-1, 318-2 состоит при этом из системы сквозных отверстий, выполненных по окружности в общей цилиндрической стенке 305 внутренней и внешней камеры на одинаковой осевой высоте.

Во внутренней камере 306 размещен перемещаемый в осевом направлении внутренний поршень 316, имеющий на своей проксимальной стороне захватный элемент 322, который может захватываться снаружи отдельным подходящим поршневым штоком для обеспечения возможности перемещения внутреннего поршня 316 в осевом направлении вверх и вниз (стрелки 320). Вместо захватного элемента 322 в проксимальной стороне внутреннего поршня 316 в данном случае также может быть, например, выполнена полость, в которой захватывается соответственно выполненный дистальный конец поршневого штока.

Если внутренний поршень 316 находится на дистальном конце внутренней камеры 306, как в показанном на фиг. 8(a) исходном положении, то внутренний поршень 316 закрывает n=2 групп сквозных отверстий 318-1, 318-2 со стороны внутренней камеры посредством кругового резинового уплотнения, так что поток текучей среды от резервуаров внешней камеры 304 к выпускному отверстию 310 невозможен. Это положение внутреннего поршня 316 соответственно называется закрытым положением.

Если внутренний поршень 316 слегка перемещается в проксимальном направлении, он открывает сначала только первую группу сквозных отверстий 318-1 и обеспечивает возможность потока текучей среды первой текучей среды 302-1 от внешней камеры 404 через внутреннюю камеру 306 к выпускному отверстию 310. Это положение внутреннего поршня 316 называется первым открытым положением и показано на фиг. 8(b). Путем дальнейшего проксимального перемещения внутренний поршень 316 достигает второго открытого положения, в котором вторая группа сквозных отверстий 318-2 также открывается со стороны внутренней камеры (см. фиг. 8(d)).

В общем случае имеется n открытых положений, разнесенных друг от друга в осевом направлении, в которых внутренний поршень 316 постепенно открывает все большее количество k=1,…n групп сквозных отверстий и обеспечивает возможность соответствующего потока текучей среды от внешней камеры во внутреннюю камеру.

Во внешней камере 304 размещены n=2 резиновых кольца, окружающих внутреннюю камеру 306, разнесенных друг от друга в осевом направлении и перемещаемых, соответственно, в осевом направлении к дистальному концу D внешней камеры (стрелки 330-1, 330-2). В проксимальном положении резервуара резиновые кольца 314-1, 314-2 перекрывают соответственно резервуар для одной их подаваемых рабочих текучих сред 302-1, 302-2, как показано на фиг. 8(a).

В дистальном закрытом положении первое резиновое кольцо 314-1 закрывает первую группу сквозных отверстий 318-1 (см. фиг. 8 (с)), тогда как второе резиновое кольцо 314-2 закрывает вторую группу сквозных отверстий 318-2 в своем дистальном закрытом положении (см. фиг. 8 (е)). Если внутренний поршень 316 находится в своем первом или втором открытом положении, то путем перемещения обоих резиновых колец 314-1, 314-2 или только второго резинового кольца 314-2 по направлению к дистальному концу текучая среда, находящаяся в первом или втором резервуаре, может постепенно выталкиваться во внутреннюю камеру 306 через первую или вторую группу сквозных отверстий 318-1, 318-2. Если оба резиновых кольца 314-1, 314-2 приведены в свое дистальное закрытое положение, то все сквозные отверстия закрыты, и текучая среда может быть подана обратно из микрофлюидной системы во внутреннюю камеру 306 путем проксимального перемещения внутреннего поршня 316:

Из исходного состояния с фиг. 8(a) захватный элемент 322 внутреннего поршня 316 захватывается подходящим поршневым штоком и поднимается в первое открытое положение (фиг. 8(b)). Путем опускания обоих резиновых колец 314-1, 314-2, первая рабочая текучая среда 302-1 может быть полностью закачана в микрофлюидную систему (направление потока 342). При этом вследствие несжимаемости текучих сред достаточно активно надавливать в дистальном направлении на самое верхнее из n резиновых колец, здесь - на резиновое кольцо 314-2. Приложенное давление переносится через несжимаемую вторую рабочую текучую среду 302-2 на первое резиновое кольцо 314-1, так что оба резиновых кольца перемещаются в дистальном направлении на неизменном расстоянии друг от друга, и объем резервуара 308-2 остается неизменным в течение подачи первой рабочей текучей среды 302-1 (ср. фиг. 8(a) и 8(c)).

Как показано на фиг. 8(c), первое резиновое кольцо 314-1 и положение первой группы сквозных отверстий 318-1 в цилиндрической стенке 305 согласованы друг с другом так, что первое резиновое кольцо 314-1 закрывает в своем дистальном закрытом положении первую группу сквозных отверстий 318-1 со стороны внешней камеры.

Теперь внутренний поршень 316 может быть поднят дальше во второе открытое положение (фиг. 8 (d)), при этом путем опускания второго резинового кольца 314-2 вторая рабочая текучая среда 302-2 может быть полностью закачана в микрофлюидную систему (направление потока 344). При этом, как показано на фиг. 8(e), второе резиновое кольцо 314-2 и положение второй группы сквозных отверстий 318-2 в цилиндрической стенке 305 согласованы друг с другом так, что второе резиновое кольцо 314-2 закрывает в своем дистальном закрытом положении вторую группу сквозных отверстий 318-1 со стороны внешней камеры.

Так как все резиновые кольца 314-1, 314-2 теперь находятся в своем дистальном закрытом положении, двойной шприц 300 может использоваться как обычный шприц путем осевого перемещения внутреннего поршня 316 посредством поршневого штока вверх и вниз во внутренней камере 206, при этом текучая среда может перемещаться в обоих направлениях. В частности, путем дальнейшего подъема, а именно путем осевого перемещения внутреннего поршня 316 по направлению к проксимальному концу, текучая среда может быть подана из микрофлюидной системы во внутреннюю камеру 306 (направление потока 246).

В двойном шприце с множеством текучих сред с n кольцевыми поршнями первые n-1 дистальные кольцевые поршни необязательно должны быть уплотняющими. Например, для уменьшения трения кольцевой поршень 314-1 двойного шприца 300 может быть выполнен с некоторым зазором по отношению к цилиндрическим стенкам внутренней или внешней камеры, тогда как проксимальный кольцевой поршень 314-2 выполнен уплотняющим для запирания резервуаров для подаваемых текучих сред 302-1, 302-2 с обеспечением стабильности при хранении. На практике отсутствует диффузия или смешивание текучих сред через узкий зазор кольцевого поршня 314-1 или они в любом случае пренебрежимо малы.

В более простом варианте осуществления можно обойтись без n разнесенных в осевом направлении групп сквозных отверстий и n разнесенных в осевом направлении открытых положений. Напротив, уже достаточно того, что внутренняя камера соединена по текучей среде с внешней камерой через одну или более разнесенных в осевом направлении групп сквозных отверстий, причем в закрытом положении внутренний поршень закрывает одну или более групп сквозных отверстий на стороне внутренней камеры, и в одном или более открытых положениях обеспечивает возможность потока текучей среды из внешней камеры во внутреннюю камеру. Также в такой простой конструкции текучая среда, находящаяся в k-ом резервуаре, может быть постепенно выпущена во внутреннюю камеру через сквозные отверстия путем перемещении кольцевого поршня во внешней камере по направлению к дистальному концу, если внутренний поршень находится в соответствующем открытом положении. Если имеется менее n групп сквозных отверстий, не каждый из n кольцевых поршней должен закрывать группу сквозных отверстий; необходимо лишь обеспечить, чтобы n кольцевых поршней в своем дистальном закрытом положении вместе закрывали одну или более групп сквозных отверстий со стороны внешней камеры, так чтобы вывод текучей среды из микрофлюидной системы во внутреннюю камеру становился возможным путем осевого перемещения внутреннего поршня к проксимальному концу, если все n кольцевых поршней приведены в свое дистальное закрытое положение.

Группа изобретений относится к молекулярно-биологическому диагностированию. Микрофлюидный картридж (100) для детекции биомолекул содержит камеру (140) детекции, микрочип (142) на основе комплементарной структуры металл-оксид-полупроводник (CMOS), имеющий сенсорную область (144), расположенную в камере (140) детекции, и контактную область (146), герметично отделенную от камеры (140) детекции. Камера (140) детекции выполнена с возможностью подачи раствора пробы через впускной канал (124) и вывода анализируемого раствора пробы через выпускной канал (126). Сенсорная область (144) микрочипа (142) содержит систему функционализованных тестовых участков (130) для электрохимической детекции биомолекул в растворе пробы. Каждый тестовый участок (130) сенсорной области (140) снабжен собственным сигма-дельта модулятором (132) для аналого-цифрового преобразования электрических сигналов, генерируемых на тестовых участках (130) при электрохимической детекции. Обеспечивается упрощение и сокращение времени процесса детекции биомолекул. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 14 ил.

1. Микрофлюидный картридж для детекции биомолекул в растворе пробы, содержащий:

- камеру детекции, выполненную с возможностью подачи в нее раствора пробы через впускной канал и вывода из нее анализируемого раствора пробы через выпускной канал,

- микрочип на основе комплементарной структуры металл-оксид-полупроводник (CMOS), имеющий сенсорную область, расположенную в камере детекции, и контактную область, герметично отделенную от камеры детекции посредством резинового кольца или кольца круговой заливки компаундом,

- причем сенсорная область микрочипа содержит систему функционализованных тестовых участков для электрохимической детекции биомолекул в растворе пробы,

- при этом каждый тестовый участок сенсорной области снабжен собственным сигма-дельта модулятором для аналого-цифрового преобразования электрических сигналов, генерируемых в тестовых участках при электрохимической детекции.

2. Микрофлюидный картридж по п. 1, причем картридж содержит реакционную камеру, которая предназначена для амплификации нуклеиновых кислот в растворе пробы и из которой раствор пробы подают в камеру детекции через впускной канал.

3. Микрофлюидный картридж по п. 2, причем реакционная камера выполнена с возможностью нагрева в ней раствора пробы до заданной температуры, приближенной к его нормальной точке кипения, и реакционная камера соединена по текучей среде через выравнивающий канал с камерой давления, которая свободна в нормальном режиме работы от жидкости, выполнена с возможностью нагрева до температуры выше нормальной температуры кипения раствора пробы и предназначена для выпаривания доли жидкости пробы, выталкиваемой в камеру давления через выравнивающий канал газовыми пузырьками в растворе пробы, с созданием тем самым обратного давления, действующего на раствор пробы, находящийся в реакционной камере, и уменьшающего количество газовых пузырьков.

4. Микрофлюидный картридж по одному из пп. 1-3, причем картридж содержит встроенное насосное устройство, соединенное по текучей среде с реакционной камерой и камерой детекции и выполненное с возможностью перемещения раствора пробы в реакционную камеру и оттуда в заданных объемах раствора пробы в камеру детекции.

5. Микрофлюидный картридж по п. 4, причем насосное устройство дополнительно выполнено с возможностью подавать рабочую жидкость, находящуюся в насосном устройстве, во внешнюю систему отбора проб и после обогащения рабочей жидкости биомолекулами, подлежащими детекции во внешней системе отбора пробы, подавать созданный таким образом раствор пробы обратно в картридж, а именно в реакционную камеру и оттуда в заданных объемах раствора пробы в камеру детекции.

6. Микрофлюидный картридж по одному из пп. 1-5, причем картридж содержит коннектор для внешней системы отбора пробы, выполненный в виде коннектора Люэра.

7. Микрофлюидный картридж по п. 2, причем картридж содержит встроенное насосное устройство, соединенное по текучей среде с реакционной камерой и камерой детекции и выполненное с возможностью перемещения раствора пробы в реакционную камеру и оттуда в заданных объемах раствора пробы в камеру детекции, при этом картридж содержит коннектор для внешней системы отбора пробы, выполненный в виде коннектора Люэра, и в картридже выполнена микроканальная система, проходящая от насосного устройства через камеру детекции и реакционную камеру к коннектору для внешней системы отбора пробы.

8. Микрофлюидный картридж по одному из пп. 1-7, причем картридж, включая встроенное при необходимости насосное устройство, выполнен из подходящего для полимеразной цепной реакции (PCR) пластика, такого как поликарбонат.

9. Микрофлюидный картридж по одному из пп. 4-8, причем насосное устройство выполнено в виде двойного шприца для подачи рабочей жидкости в микроканальную систему картриджа, причем двойной шприц содержит:

- цилиндрическую внешнюю камеру, образующую резервуар для размещения рабочей жидкости,

- цилиндрическую внутреннюю камеру, расположенную внутри внешней камеры, имеющую на своем дистальном торце цилиндра выпускное отверстие для соединения с микроканальной системой картриджа и соединенную по текучей среде с внешней камерой через сквозные отверстия,

- внутренний поршень, который выполнен с возможностью перемещения в осевом направлении во внутренней камере и который в закрытом положении закрывает сквозные отверстия со стороны внутренней камеры, а в открытом положении открывает сквозные отверстия и обеспечивает возможность протекания текучей среды из внешней камеры во внутреннюю камеру, и

- кольцевой поршень, который выполнен с возможностью перемещения во внешней камере в осевом направлении к дистальному концу внешней камеры, который

i) в проксимальном к резервуару положении запирает резервуар для рабочей жидкости,

ii) при перемещении к дистальному концу выталкивает рабочую жидкость, находящуюся в резервуаре, во внутреннюю камеру через сквозные отверстия, если внутренний поршень находится в открытом положении, и

iii) в дистальном закрытом положении закрывает сквозные отверстия со стороны внешней камеры и обеспечивает, таким образом, возможность вывода жидкости из микроканальной системы картриджа обратно во внутреннюю камеру посредством осевого перемещения внутреннего поршня к проксимальному концу.

10. Способ детекции биомолекул в растворе пробы посредством картриджа по одному из пп. 1-9, в котором

- раствор пробы подают через впускной канал в камеру детекции и направляют на сенсорную область микрочипа на основе CMOS, расположенную в камере детекции,

- регистрируют сигнал, генерируемый в функционализованных тестовых участках при электрохимической детекции биомолекул, и анализируют его для детекции биомолекул в растворе пробы.