ПРОБИРКА ДЛЯ УДАРНОЙ ОБРАБОТКИ ШАРИКАМИ И СПОСОБ ЭКСТРАКЦИИ ДЕЗОРИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ И/ИЛИ РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ ИЗ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 2021 года по МПК C12N15/10 C12N1/06 C12Q1/68 

1. Предпосылки создания изобретения

Генетическое тестирование и диагностика инфекционных заболеваний играют важную роль в области клинической микробиологии. Для преодоления систематических ошибок и ограничений, присущих методологиям, основанным на использовании культур, все более широко применяют генетическое тестирование с целью обнаружения микроорганизмов, содержащихся в образце. Для того чтобы можно было проводить такое генетическое тестирование, клетки необходимо подвергать лизису для осуществления экстракции ДНК и/или РНК из микроорганизмов в максимально возможной концентрации.

Zhongtang Yu с соавторами в «Improved extraction of PCR-quality community DNA from digesta and fecal samples», BioTechniques, т. 36(5), 2004, cc. 808-812 описали метод выделения ДНК из образцов продуктов пищеварения и фекалий. Согласно указанному методу сначала смешивают 0,25 г образца жидкости, взятой из желудочно-кишечной системы коровы, которая предположительно содержит микроорганизмы, а именно бактерии, с 1 мл буфера, содержащего 500 мМ хлорид натрия, 50 мМ Трис гидрохлорид, рН 8,0, 50 мМ этилендиаминтетрауксусную кислоту и 4% додецилсульфата натрия. Затем в образец жидкости вносят 0,4 г стерильных циркониевых шариков. После этого полученную таким образом смесь, находящуюся в пробирке для образца, подвергают колебаниям с помощью устройства Mini-Bead Beater™ в течение трех минут таким образом, чтобы шарики разрушали клеточные стенки микроорганизмов. При осуществлении этого процесса происходит высвобождение содержащейся в клетках ДНК. Буфер служит также для защиты ДНК от расщепления ДНКазами, которые содержатся в образце жидкости. После осуществления ударной обработки шариками из образца удаляют примеси посредством осаждения ацетатом аммония. Нуклеиновые кислоты получают путем осаждения изопропанолом. На следующей стадии метода ДНК расщепляют последовательно РНКазой и протеиназой K и затем очищают с использованием колонки.

Недостаток метода заключается в его относительной сложности. Поскольку образец жидкости разбавляют путем добавления буфера, то происходит снижение концентрации ДНК в образце. Поэтому метод обладает лишь ограниченной точностью определения и чувствительностью.

Таким образом, существует необходимость в усовершенствованных устройствах и методах осуществления лизиса клеток и экстракции нуклеиновых кислот из микроорганизмов, содержащихся в образце жидкости.

2. Краткое изложение сущности изобретения

Настоящая заявка относится к усовершенствованным пробиркам для ударной обработки шариками и к системам и способам ударной обработки шариками. В контексте настоящего описания понятие «пробирка для ударной обработки шариками» и понятие «пробирка для образца» используются взаимозаменяемо. Не вдаваясь в конкретную теорию, при создании изобретения было сделано предположение, что ударная обработка шариками дает возможность нуклеиновым кислотам растворяться в растворе. Настоящее изобретение в частности основано на открытии того, что применение ударной обработки шариками в методах экстракции нуклеиновых кислот приводит к потере нуклеиновых кислот вследствие абсорбции на шариках и что такую потерю можно предупреждать путем применения блокирующего агента в соответствующем количестве для блокирования сайтов связывания на шариках. Настоящее изобретение основано также на установленном факте того, что хотя некоторые буферы для лизиса, которые ранее применяли при осуществлении ударной обработки шариками, могут содержать реагенты, которые действуют в качестве блокирующих агентов, такие реагенты можно применять в количестве, намного меньшем того, в котором их обычно применяли. В контексте настоящего описания понятие «буфер для лизиса» относится к буферному раствору, который применяют для разрушения свободных клеток. Буферы для лизиса могут содержать, например, буфер (например, Трис-HCl) и одну или несколько солей (например, NaCl, KCl) и/или детергентов (например, додецилсульфат натрия).

Кроме того, настоящее изобретение основано также на установленном факте того, что некоторые биологические образцы, такие как кровь, сами по себе содержат блокирующие агенты и, следовательно, их можно подвергать ударной обработке шариками в отсутствии добавок, таких как буферы для лизиса. Так, например, кровь можно подвергать ударной обработке шариками непосредственно после сбора в поступающую в продажу пробирку для сбора крови, например, путем добавления шариков, используемых для ударной обработки шариками, в пробирку для сбора и осуществления интенсивного встряхивания пробирки для сбора. Примеры поступающих в продажу пробирок для сбора включают пробирки с сиреневой крышкой, содержащие ЭДТК, пробирки со светло-синей (голубой) крышкой, содержащие цитрат натрия, пробирки с серой крышкой, содержащие оксалат калия, или пробирки с зеленой крышкой, содержащие гепарин. В альтернативном варианте часть крови можно переносить в пробирку для образца для ударной обработки шариками.

Конкретные объекты изобретения относятся к системам для ударной обработки шариками, которые целесообразно применять, когда предназначенные для ударной обработки шариками образцы, которые в исходном состоянии не содержат блокирующие агенты или содержат блокирующие агенты в количествах, меньших тех, которые обеспечивают эффективную блокаду абсорбции нуклеиновых кислот шариками. Системы для ударной обработки шариками, предлагаемые в изобретении, включают сухие блокирующие агенты. При создании изобретения неожиданно было установлено, что при применении систем для ударной обработки шариками, предлагаемых в изобретении, для осуществления лизиса микроорганизмов и экстракции дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК) и/или рибонуклеиновых кислот (РНК) из микроорганизмов, содержащихся в жидком образце, можно достигать большего уровня экстракции ДНК и/или РНК, чем при использовании соответствующей пробирки для ударной обработки шариками, которая не содержит блокирующего агента.

Системы для ударной обработки шариками, предлагаемые в изобретении, позволяют также избегать необходимости объединять образец с раствором для лизиса перед осуществлением ударной обработки шариками, что дает возможность выделять нуклеиновые кислоты в больших количествах благодаря отсутствию разведения образца.

Другие объекты изобретения относятся к способам осуществления ударной обработки шариками для осуществления лизиса клеток и экстракции нуклеиновых кислот из биологических образцов. Способы включают осуществление ударной обработки шариками биологических образцов в отсутствии буфера для лизиса. В способах ударной обработки шариками можно применять предлагаемые в изобретении системы для ударной обработки шариками или стандартные системы для ударной обработки шариками. При применении стандартных систем для ударной обработки шариками в некоторых вариантах осуществления изобретения в системы для ударной обработки шариками добавляют один или несколько блокирующих агентов. В других вариантах осуществления изобретения, в частности в тех случаях, когда биологический образец в естественных условиях включает один или несколько блокирующих агентов, перед осуществлением ударной обработки шариками блокирующий агент не добавляют.

В некоторых вариантах осуществления изобретения система для ударной обработки шариками, предлагаемая в изобретении, состоит из пробирки для образца, которая содержит элемент, представляющий собой контейнер, с внутренней полостью, отверстие для внесения образца жидкости, содержащей микроорганизмы, во внутреннюю полость, и присоединенную или не присоединенную крышку для закрытия отверстия, где во внутреннюю полость помещено множество макроскопических частиц, которые приспособлены для механического разрушения клеточных стенок микроорганизмов, содержащихся в образце жидкости, когда образец жидкости вносят во внутреннюю полость и пробирку для ударной обработки шариками подвергают механическим колебаниям. Примеры систем для ударной обработки шариками описаны ниже в разделе 4.1 и вариантах осуществления изобретения с номерами 1-24 и 90-98. Примеры пробирок для образцов, которые можно применять в системах для ударной обработки шариками, описаны в разделе 4.1.1, примеры блокирующих агентов, которые можно применять в системах для ударной обработки шариками, описаны в разделе 4.1.2, а примеры шариков, которые можно применять в системах для ударной обработки шариками, описаны в разделе 4.1.3.

Изобретение относится также к способу осуществления лизиса микроорганизмов для экстракции дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и/или рибонуклеиновой кислоты (РНК) из микроорганизмов, в котором получают образец жидкости, предположительно содержащий микроорганизмы, в котором в образец жидкости вносят множество частиц, способных перемещаться друг относительно друга, и образец жидкости с содержащимися в нем частицами подвергают колебаниям, в результате чего частицы могут механически разрушать клеточные стенки микроорганизмов, содержащихся в образце жидкости. Примеры образцов, из которых можно экстрагировать ДНК, описаны в разделе 4.2, а примеры стадий предварительной обработки образцов, которые можно применять для приготовления образцов перед осуществлением экстракции нуклеиновых кислот, описаны в разделе 4.3. Примеры способов экстракции нуклеиновых кислот из образцов, например, из образцов, описанных в разделе 4.2, или образцов, которые подвергали предварительной обработке согласно процедуре, описанной в разделе 4.3, описаны ниже в разделе 4.4 и в вариантах осуществления изобретения с номерами 25-81 и 99-104. Наборы, которые можно применять для осуществления экстракции нуклеиновых кислот согласно способам, предлагаемым в изобретении, описаны ниже в разделе 4.7 и в вариантах осуществления изобретения с номерами 82-89.

3. Краткое описание чертежей

На чертежах показано:

на фиг. 1 - вид сбоку на приведенную в качестве примера систему (1) для ударной обработки шариками, содержащую пробирку (2) для образца и запорную крышку (6);

на фиг. 2 - вид сверху на систему для ударной обработки шариками, представленную на фиг. 1;

на фиг. 3 - вид снизу на систему для ударной обработки шариками, представленную на фиг. 1;

на фиг. 4 - продольное сечение через центральную плоскость системы для ударной обработки шариками, представленной на фиг. 1, с удаленной с пробирки для образца запорной крышкой, на котором показано отверстие (4), через которое можно осуществлять доступ во внутреннюю полость (3) пробирки для образца. Показаны находящиеся во внутренней полости шарики (7) и лиофилизированный блокирующий агент (8);

на фиг. 5 - продольное сечение через центральную плоскость системы для ударной обработки шариками, которая представлена на фиг. 1, заполненную образцом жидкости (5);

на фиг. 6 - интенсивность измеренного сигнала от продукта ПЦР-амплификации с использованием в качестве матрицы ДНК, выделенной из С. albicans после ударной обработки шариками. Calbil 44 и Calbi54 представляют собой два различных целевых гена С. albicans, a HC01-Rat87 представляет собой ген, применяемый в качестве отрицательного контроля. В данном исследовании продемонстрировано, что мочевина оказывает блокирующее воздействие при осуществлении ударной обработки шариками, облегчая выделение ДНК С. albicans из жидкости, полученной при перитонеальном диализе (ПД-жидкость);

на фиг. 7 - интенсивность сигнала от продукта ПЦР-амплификации с использованием в качестве матрицы ДНК, выделенной из С. albicans после ударной обработки шариками. Calbil 44 и Calbi54 представляют собой два различных целевых гена С. albicans, a HC01-Rat87 представляет собой ген, применяемый в качестве отрицательного контроля. В данном исследовании продемонстрировано, что РНК оказывает блокирующее воздействие при ударной обработки шариками, облегчая выделение ДНК С. albicans из ПД-жидкости;

на фиг. 8 - интенсивность сигнала от продукта ПЦР-амплификации с использованием в качестве матрицы ДНК, выделенной из С. albicans после ударной обработки шариками. Calbil 44 и Calbi54 представляют собой два различных целевых гена С. albicans, a HC01-Rat87 представляет собой ген, применяемый в качестве отрицательного контроля. В качестве матрицы включали ДНК С. albicans в количестве, соответствующем максимальному теоретическому выходу после экстракции. В данном исследовании продемонстрировано, что ДНК С. albicans можно выделять путем ударной обработки крови шариками в отсутствии добавок;

на фиг. 9 - интенсивность сигнала от продукта ПЦР-амплификации с использованием в качестве матрицы ДНК, выделенной из S. aureus после ударной обработки шариками. Выявленные гены применяют для обнаружения эубактерий (Eub), грам-отрицательных бактерий (Gng), грам-положительных бактерий (Gpo), стафилококков (AHStaph), энтеробактерий (Entb), S. aureus (Sau), микоплазмы (Myco). N03 Rat 87 представляет собой отрицательный контроль, а СС представляет собой внутренний контроль. В качестве матрицы включали ДНК С. albicans в количестве, соответствующем максимальному теоретическому выходу после экстракции. В данном исследовании продемонстрировано, что ДНК С. albicans можно выделять путем ударной обработки крови шариками в отсутствии добавок;

на фиг. 10 - интенсивность измеренного сигнала от продукта ПЦР-амплификации с использованием в качестве матрицы ДНК, выделенной из Е. coli после ударной обработки шариками. Выявленные гены применяют для обнаружения эубактерий (Eub), грам-отрицательных бактерий (Gng), грам-положительных бактерий (Gpo), Е. coli (Есо), стафилококков (AHStaph), энтеробактерий (Entb). N03 Rat 87 представляет собой отрицательный контроль, а СС представляет собой внутренний контроль. В качестве матрицы включали ДНК Е. coli в количестве, соответствующем максимальному теоретическому выходу после экстракции. В данном исследовании продемонстрировано, что ДНК Е. coli можно выделять путем ударной обработки крови шариками в отсутствии добавок.

4. Подробное описание изобретения

Ударная обработка шариками представляет собой процесс гомогенизации, применяемый для лизиса клеток с целью высвобождения их содержимого, включая их нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК). Образцы помещают в пробирки, содержащие соответствующие размалывающие шарики и подвергают интенсивному (высокоэнергетическому) перемешиванию. Затем образцы, как правило, центрифугируют и отделяют лизат от указанных выше шариков. Как правило, образцы подвергают ударной обработке шариками в присутствии буфера для лизиса для облегчения высвобождения ДНК из клеток.

Настоящее изобретение относится к усовершенствованным способам и системам для ударной обработки шариками. Способы ударной обработки шариками можно осуществлять без использования буфера для лизиса, что упрощает процесс клеточного лизиса и экстракции нуклеиновых кислот и позволяет избегать разведения образца, минимизируя при этом потерю вследствие абсорбции на шариках.

Способы, предлагаемые в настоящем изобретении, относятся к осуществлению ударной обработки шариками с использованием блокирующих агентов в соответствующем количестве. Блокирующие агенты могут быть экзогенными или эндогенными по отношению к образцу. Например, моча содержит мочевину, т.е. реагент, который, как было установлено, блокирует связывание нуклеиновых кислот, присутствующих в биологическом образце, с шариками, предназначенными для ударной обработки шариками. Таким образом, в настоящем изобретении предложены способы ударной обработки шариками таких образцов без добавления экзогенных блокирующих агентов, хотя также предусматривается и пополнение эндогенных блокирующих агентов экзогенными блокирующими агентами. Для биологических образцов, не содержащих или содержащих в малом количестве эндогенные блокирующие агенты, можно применять экзогенные блокирующие агенты. В настоящем изобретении предложены также системы для ударной обработки шариками, в которые вносят сухие блокирующие агенты, дающие возможность осуществлять ударную обработку шариками биологических образцов без добавления реагентов, которые приводят к разбавлению образцов.

Таким образом, в настоящем изобретении предложены системы для ударной обработки шариками, которые включают сухие блокирующие агенты. Кроме того, в настоящем изобретении предложены способы осуществления ударной обработки шариками для лизиса клеток, содержащихся в биологических образцах, и экстракции нуклеиновых кислот из них. Способы предусматривают осуществление ударной обработки биологических образцов в отсутствии буфера для лизиса. В способах ударной обработки можно применять предлагаемые в изобретении системы для ударной обработки шариками или стандартные системы для ударной обработки шариками. В некоторых вариантах осуществления изобретения при применении стандартных систем ударной обработки шариками в системы для ударной обработки шариками добавляют один или несколько блокирующих агентов. В других вариантах осуществления изобретения, прежде всего в тех случаях, когда биологический образец в естественных условиях содержит один или несколько блокирующих агентов, блокирующий агент не добавляют перед осуществлением ударной обработки шариками.

В настоящем описании предложены также наборы, содержащие системы ударной обработки шариками, предлагаемые в изобретении (или пригодные для их получения).

4.1 Система для ударной обработки шариками

В настоящем изобретении предложены системы для ударной обработки шариками, которые можно применять для лизиса клеток и экстракции дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК) и рибонуклеиновых кислот (РНК) из клеток (например, микроорганизмов), содержащихся в жидком образце. Системы для ударной обработки шариками, предлагаемые в изобретении, содержат пробирку для образца, а также шарики и сухой блокирующий агент, помещенные в пробирку для образца. Блокирующие агенты, которые можно применять в системах для ударной обработки шариками, предлагаемых в изобретении, включают мочевину, соли гуанидина, детергенты, нуклеотиды, поливинилпирролидон (ПВП) и олигонуклеотиды. Блокирующие агенты подробно описаны в разделе 4.1.2. Шарики, которые можно применять в системах для ударной обработки шариками, предлагаемых в изобретении, включают шарики, содержащие минерал и/или металл. Шарики, которые можно применять в системах для ударной обработки шариками, предлагаемых в изобретении, описаны в разделе 4.1.3.

4.1.1 Пробирка для образца

Системы для ударной обработки шариками, предлагаемые в изобретении, содержат пробирку для образца, имеющую внутреннюю полость, в которую можно осуществлять доступ через отверстие и в которую можно помещать шарики, блокирующий агент и жидкий образец. Пробирка для образца может быть сделана из любого биологически инертного материала (например, из пластика или боросиликата), и предпочтительно она сделана из пластика (например, полипропилена, сополимера полипропилена или поликарбоната). В контексте настоящего описания понятие «пробирка» включает флаконы (например, стаканы для помола) и пробирки (например, конические пробирки).

Система для ударной обработки шариками может включать закрывающее устройство для закрытия отверстия и запечатывания пробирки для образца. Закрывающее устройство может быть закреплено на пробирке для образца (например, крышка, закрепленная на пробирке для образца с помощью шарнира) или ее можно снимать с пробирки для образца (т.е. удаляемая крышка). Пробирка для образца может включать резьбовую область, приспособленную для соединения с имеющей резьбу крышкой. Резьба может находиться на внутренней или внешней поверхности пробирки для образца (например, как продемонстрировано на фиг. 4-5).

Пробирки для образца, которые можно применять в системе для ударной обработки шариками, предлагаемой в изобретении, поступают в продажу, например, снабженные завинчивающейся крышкой полипропиленовые пробирки или центрифужные пробирки. При изготовлении пробирок и систем для ударной обработки шариками, предлагаемых в изобретении, можно использовать стандартные размеры пробирок, например, 0,5 мл, 1,7 мл, 2 мл, 4,5 мл, 7 мл, 15 мл, 50 мл или 250 мл.

4.1.2 Блокирующий агент

Системы для ударной обработки шариками, предлагаемые в изобретении, включают сухие блокирующие агенты. В контексте настоящего описания «сухой» или «высушенный» блокирующий агент представляет собой блокирующий агент, влажность которого составляет менее 20%. В некоторых вариантах осуществления изобретения влажность сухого блокирующего агента составляет менее 15%, менее 10%, менее 5%, менее 4%, менее 3%, менее 2% или менее 1%.

Сухой блокирующий агент предпочтительно обладает долговременной стабильностью, т.е. систему для ударной обработки шариками можно без проблем транспортировать и хранить в течение длительного периода времени без значительного снижения блокирующего действия. Сухой блокирующий агент можно свободно помещать во внутреннюю полость элемента, представляющего собой контейнер, и/или на часть или всю внутреннюю полость элемента можно наносить слой или пленку из блокирующего агента. Блокирующий агент предпочтительно лиофилизируют. Блокирующий агент можно лиофилизировать до или после внесения шариков в пробирку.

Примеры блокирующих агентов включают один или несколько хаотропных агентов (например, мочевину, соли гуанидина), один или несколько детергентов, один или несколько нуклеотидов, поливинилпирролидон (ПВП), один или несколько олигонуклеотидов или любую их комбинацию. Более подробно такие примеры блокирующих агентов описаны ниже в разделах 4.1.2.1-4.1.2.5. Включение блокирующих агентов, которые вносят вклад в осуществление лизиса клеточной стенки микроорганизмов (например, детергента), может повышать выход нуклеиновых кислот, получаемых с использованием систем для ударной обработки шариками, предлагаемых в изобретении, и позволяет избегать объединения образца с раствором для лизиса перед осуществлением ударной обработки шариками. Как правило, количества блокирующих агентов, применяемые в системах для ударной обработки шариками, предлагаемых в изобретении, меньше, чем тех, которые применяют в растворах для лизиса.

Систему для ударной обработки шариками можно получать путем лиофилизации раствора для лизиса (который называют также буфером для экстракции или буфером для лизиса) в пробирке для ударной обработки шариками. Растворы для лизиса, содержащие блокирующие агенты, известны в данной области или они поступают в продажу.

В некоторых вариантах осуществления изобретения блокирующий агент содержит один или несколько хаотропных агентов. В некоторых вариантах осуществления изобретения блокирующий агент содержит один или несколько детергентов. В некоторых вариантах осуществления изобретения блокирующий агент содержит один или несколько нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения блокирующий агент содержит один или несколько олигонуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения блокирующий агент содержит один или несколько хаотропных агентов и один или несколько детергентов. В некоторых вариантах осуществления изобретения блокирующий агент содержит один или несколько хаотропных агентов и один или несколько нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения блокирующий агент содержит один или несколько хаотропных агентов и один или несколько олигонуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения блокирующий агент содержит один или несколько детергентов и один или несколько нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения блокирующий агент содержит один или несколько детергентов и один или несколько олигонуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, блокирующий агент содержит один или несколько нуклеотидов и один или несколько олигонуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, блокирующий агент содержит один или несколько хаотропных агентов, один или несколько детергентов, и один или несколько нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, блокирующий агент содержит один или несколько хаотропных агентов, one or more детергентов, и один или несколько олигонуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, блокирующий агент содержит один или несколько хаотропных агентов, один или несколько нуклеотидов и один или несколько олигонуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, блокирующий агент содержит один или несколько детергентов, один или несколько нуклеотидов, и один или несколько олигонуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, блокирующий агент содержит один или несколько хаотропных агентов, один или несколько детергентов, один или несколько нуклеотидов, и один или несколько олигонуклеотидов.

Блокирующий агент может содержать или дополнительно содержать этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТК) и/или ее натриевую соль. ЭДТК связывает кальций, магний и железо и тем самым инактивирует дезоксирибонуклеазы и рибонуклеазы. Эта мера препятствует также расщеплению ДНК и РНК, содержащихся в образце жидкости, обработанном с применением системы для ударной обработки шариками. Таким образом, обеспечивается более высокая чувствительность и воспроизводимость результатов измерений при исследовании ДНК и/или РНК, экстрагированной из клеток (например, микроорганизмов) с применением системы для ударной обработки шариками, предлагаемой в изобретении.

Блокирующий агент можно свободно помещать во внутреннюю полость элемента, представляющего собой контейнер, например, в порошкообразной форме. Порошок можно, например, смешивать с шариками в образце или можно вносить в пробирку для образца в виде слоя, находящегося над и/или под шариками. В альтернативном или дополнительном варианте внутренняя стенка пробирки для образца может быть по меньшей мере частично покрыта слоем или пленкой из блокирующего агента. Слой или пленку можно получать путем выпаривания жидкости из водной смеси, содержащей блокирующий агент, которую добавляют в пробирку для образца. В другом варианте осуществления изобретения некоторая часть или все шарики в системе для ударной обработки шариками могут быть покрыты блокирующим агентом.

4.1.2.1 Хаотропные агенты

Хаотропные агенты нарушают структуру и вызывают денатурацию макромолекул, таких как белки и нуклеиновые кислоты. Хаотропные растворенные вещества снижают чистый гидрофобный эффект, обусловленный гидрофобными областями, путем нарушения порядка молекул воды, находящихся вблизи белка. Это вызывает солюбилизацию гидрофобной области в растворе, приводя тем самым к денатурации белка. Вышеуказанное воздействие непосредственно относится также к гидрофобной области в липидных бислоях; если достигается критическая концентрация хаотропного растворенного вещества (в гидрофобной области бислоя), то может нарушаться целостность мембраны и может иметь место лизис клетки.

Ниже представлены примеры хаотропных агентов, которые можно применять в качестве блокирующих агентов.

Мочевина: Когда блокирующий агент содержит мочевину (или тиомочевину; в настоящем описании, если из контекста не следует иное, понятие мочевина включает тиомочевину), количество мочевины можно приводить в соответствие с количеством образца жидкости, которое предполагается использовать при применении системы для ударной обработки шариками, так чтобы концентрация мочевины, растворенной в образце жидкости после добавления образца жидкости, в пробирку для образца составляла от 10 до 100 г/литр, от 50 до 100 г/литр, от 20 до 50 г/л или от 25 до 35 г/л. Таким образом, согласно представленным выше вариантам осуществления изобретения в случае пробирки вместимостью 2 мл, в которую добавляют 1 мл образца, количество мочевины, применяемой в качестве блокирующего реагента, должно составлять от 10 до 100 мг, от 50 до 100 мг, от 20 до 50 мг или от 25 до 35 мг соответственно, а в случае пробирки вместимостью 2 мл, в которую добавляют 0,8 мл образца, количество мочевины, применяемой в качестве блокирующего реагента, должно составлять от 8 до 80 мг, от 40 до 80 мг, от 16 до 40 мг или от 20 до 28 мг соответственно.

Соли: Определенные соли могут обладать характеристиками, присущими хаотропным агентам. Соли могут обладать хаотропными свойствами за счет защитных зарядов и предупреждения стабилизации солевых мостиков.

Хаотропные соли включают различные соли гуанидина, лития и магния.

Соли гуанидина: Соли гуанидина, которые можно применять в качестве блокирующих агентов в системах для ударной обработки шариками, предлагаемых в изобретении, включают изоцианат гуанидина, хлорид гуанидина и их комбинации.

Соли лития: Соли лития, которые можно применять в качестве блокирующих агентов в системах ударной обработки шариками, предлагаемых в изобретении, включают перхлорат лития, ацетат лития и их комбинации.

Соли магния: Соли магния, которые можно применять в качестве блокирующих агентов в системах для ударной обработки шариками, предлагаемых в изобретении, включают хлорид магния.

Детергенты: Определенные детергенты могут действовать в качестве хаотропных агентов, например, додецилсульфат натрия («ДСН). Применение детергентов в качестве блокирующих агентов описано в разделе 4.1.2.3.

4.1.2.2 Креатинин

Когда блокирующий агент содержит креатинин, то наличие креатинина во внутренней полости пробирки для образца может препятствовать расщеплению ДНК и/или РНК, содержащейся в образце, подвергнутом обработке с использованием системы для ударной обработки шариками. Кроме того, креатинин предупреждает неспецифическое связывание ДНК и/или РНК с шариками и/или внутренней стенкой пробирки для образца. Это обеспечивает более высокий выход при экстракции ДНК и/или РНК из клеток (например, микроорганизмов), обработанных с использованием системы, содержащей пробирку для ударной обработки шариками.

4.1.2.3 Детергенты

Детергенты, которые можно применять в качестве блокирующих агентов в системах для ударной обработки шариками, предлагаемых в изобретении, включают додецилсульфат натрия, лауроилсульфатсаркозинат натрия, полиоксиэтилен(20)сорбитанмонолаурат и их комбинации. Полиоксиэтилен(20)сорбитанмонолаурат известен также под названием полисорбат 20.

Количество детергента, применяемого в качестве блокирующего агента, можно приводить в соответствие с количеством образца жидкости, которое предполагается использовать при применении системы для ударной обработки шариками. В определенных вариантах осуществления изобретения концентрация детергента, растворенного в образце жидкости после добавления образца жидкости, в пробирку для образца составляет от 1 до 50 мг/мл, от 1 до 25 мг/мл или от 25 до 50 мг/мл. Таким образом, согласно описанным выше вариантам осуществления изобретения в случае пробирки вместимостью 2 мл, в которую добавляют 1 мл образца, количество детергента, применяемого в качестве блокирующего агента, должно составлять от 1 до 50 мг, от 1 до 25 мг, или от 25 до 50 мг соответственно, а в случае пробирки вместимостью 2 мл, в которую добавляют 0,8 мл образца, количество детергента, применяемого в качестве блокирующего агента, должно составлять от 0,8 до 40 мг, от 0,8 до 20 мг или от 20 до 40 мг.

4.1.2.4 Нуклеотиды

Нуклеотиды, которые можно применять в системах для ударной обработки шариками, предлагаемых в изобретении, включают рибонуклеотиды, дезоксирибонуклеотиды и их комбинации.

Нуклеотиды могут представлять собой встречающиеся в естественных условиях нуклеотиды. Встречающиеся в естественных условиях рибонуклеотиды представляют собой аденозинмонофосфат, гуанозинмонофосфат, цитозинмонофосфат и тимидинмонофосфат. Встречающиеся в естественных условиях дезоксирибонуклеотиды, которые можно применять в качестве блокирующих агентов, представляют собой дезоксиаденозинмонофосфат, дезоксигуанозинмонофосфат, дезоксицитозинмонофосфат и дезокситимидинмонофосфат.

Нуклеотиды могут представлять собой не встречающиеся в естественных условиях аналоги встречающихся в естественных условиях нуклеотидов. Примеры не встречающиеся в естественных условиях аналогов включают (но, не ограничиваясь только ими) пептидные нуклеотиды, нуклеотиды замкнутой нуклеиновой кислоты («LNA») (которые содержат бициклические сахарные фрагменты вместо сахаров дезоксирибозы или рибозы), нуклеотиды с незаряженными связями (например, метилфосфонаты, фосфотриэфиры, фосфороамидаты, карбаматы и т.д.) и с заряженными связями (например, фосфоротиоаты, фосфородитиоаты и т.д.), и нуклеотиды, содержащие «качающиеся» основания. В конкретных вариантах осуществления изобретения аналог представляет собой 4-ацетилцитозин, 8-гидрокси-N6-метиладенозин, азиридинилцитозин, псевдоизоцитозин, 5-(карбоксигидроксилметил)урацил, 5-фторурацил, 5-бромурацил, 5-карбоксиметиламинометил-2-тиоурацил, 5-карбоксиметиламинометилурацил, дигидроурацил, инозин, N6-изопентениладенин, 1-метиладенин, 1-метилпсевдоурацил, 1-метилгуанин, 1-метилинозин, 2,2-диметилгуанин, 2-метиладенин, 2-метилгуанин, 3-метилцитозин, 5-метилцитозин, N6-метиладенин, 7-метилгуанин, 5-метиламинометилурацил, 5-метоксиаминометил-2-тиоурацил, бета-D-маннозилквеозин, 5'-метоксикарбонилметилурацил, 5-метоксиурацил, 2-метилтио-N6-изопентениладенин, метиловый эфир урацил-5-оксиуксусной кислоты, урацил-5-оксиуксусную кислоту, оксибутоксозин, псевдоурацил, квеозин, 2-тиоцитозин, 5-метил-2-тиоурацил, 2-тиоурацил, 4-тиоурацил, 5-метилурацил, метиловый эфир N-урацил-5-оксиуксусной кислоты, урацил-5-оксиуксусную кислоту и 2,6-диаминопурин или 7-деазагуанозин.

В некоторых вариантах осуществления изобретения блокирующий агент содержит смесь по меньшей мере двух, по меньшей мере трех или четырех встречающихся в естественных условиях рибонуклеотидов. В других вариантах осуществления изобретения блокирующий агент блокирующий агент содержит смесь по меньшей мере двух, по меньшей мере трех или четырех встречающихся в естественных условиях дезоксирибонуклеотидов. В следующих вариантах осуществления изобретения блокирующий агент содержит смесь по меньшей мере двух, по меньшей мере трех, четырех или даже более четырех нуклеотидных аналогов. В следующих вариантах осуществления изобретения блокирующий агент содержит смесь (а) встречающихся в естественных условиях рибонуклеотидов и встречающихся в естественных условиях дезоксирибонуклеотидов, (б) встречающихся в естественных условиях рибонуклеотидов и нуклеотидных аналогов, (в) встречающихся в естественных условиях дезоксирибонуклеотидов и нуклеотидных аналогов или (г) встречающихся в естественных условиях рибонуклеотидов, встречающихся в естественных условиях дезоксирибонуклеотидов и нуклеотидных аналогов.

Количество рибонуклеотидов, применяемых в блокирующем агенте, можно приводить в соответствие с количеством образца жидкости, которое предполагается использовать в системе для ударной обработки шариками. В конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация рибонуклеотидов, растворенных в образце жидкости, после добавления образца жидкости в пробирку для образца составляет от 200 пг/мл до 20 мкг/мл, от 1 нг/мл до 15 мкг/мл или от 1 мкг/мл до 10 мкг/мл. Таким образом, согласно указанным выше вариантам осуществления изобретения в случае пробирки вместимостью 2 мл, в которую добавляют 1 мл образца, количество рибонуклеотидов, применяемых в блокирующем агенте, должно составлять от 200 пг до 20 мкг, от 1 нг до 15 мкг или от 1 мкг до 10 мкг соответственно, а в случае пробирки вместимостью 2 мл, в которую добавляют 0,8 мл образца, количество рибонуклеотидов, применяемых в блокирующем агенте, должно составлять от 160 пг до 16 мкг, от 0,8 нг до 12 мкг или от 0,8 мкг до 8 мкг.

4.1.2.5 Олигонуклеотиды

Олигонуклеотиды, применяемые в качестве блокирующих агентов можно синтезировать или получать из встречающихся в естественных условиях источников.

В контексте настоящего описания понятие «олигонуклеотид» не связано с размером молекулы и относится к полимерной форме нуклеотидов любой длины. Однако, как правило, олигомеры состоят не более чем из 2000 нуклеотидов, 1000 нуклеотидов, более типично не более чем из 500 нуклеотидов и еще более типично не более чем из 250 нуклеотидов. Понятие «олигонуклеотид» включает двух- и одноцепочечные (но предпочтительно по меньшей мере частично одноцепочечные) ДНК и РНК. Оно включает также наличие известных типов модификаций, например, меток, известных в данной области, метилирования, «кэпов» и замены одного или нескольких встречающихся в естественных условиях нуклеотидов на аналоги (такие, как аналоги, описанные в разделе 4.1.2.4).

Олигонуклеотиды могут представлять собой смесь олигонуклеотидов различных размеров и/или могут содержать рибонуклеотиды, дезоксирибонуклеотиды, нуклеотидные аналоги или комбинацию двух или большего количества указанных выше элементов (например, смесь рибонуклеотидов и дезоксирибонуклеотидов, смесь рибонуклеотидов и нуклеотидных аналогов, смесь дезоксирибонуклеотидов и нуклеотидных аналогов или смесь рибонуклеотидов, дезоксирибонуклеотидов и нуклеотидных аналогов). В некоторых вариантах осуществления изобретения блокирующий агент содержит РНК.

Синтетические олигонуклеотиды, которые можно применять в системах для ударной обработки шариками, предлагаемых в изобретении, как правило, имеют длину от 2 до 120 нуклеотидов. В различных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотиды имеют длину, равную 2, 5, 8, 10, 15, 18, 25, 40, 50, 80, 100 или 120 нуклеотидам, или олигонуклеотиды имеют длину, находящуюся между любыми двумя из указанных выше величин, например, длину от 2 до 100 нуклеотидов, длину от 2 до 50 нуклеотидов, длину от 2 до 25 нуклеотидов, длину от 5 до 40 нуклеотидов, от 2 до 15 нуклеотидов, от 8 до 120 нуклеотидов, от 8 до 80 нуклеотидов, от 10 до 100 нуклеотидов, от 15 до 50 нуклеотидов, от 50 до 100 нуклеотидов, от 100 до 120 нуклеотидов и т.д. и т.п.

Встречающиеся в естественных условиях олигонуклеотиды могут быть получены путем выделения ДНК из одного или нескольких встречающихся в естественных условиях источников, например, из ДНК спермы лосося, ДНК тимуса теленка, ДНК спермы сельди или их комбинаций.

Количество олигонуклеотидов, применяемых в блокирующем агенте, можно приводить в соответствие с количеством образца жидкости, которое предполагается использовать в системе для ударной обработки шариками. В конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация олигонуклеотидов, растворенных в образце жидкости, после добавления образца жидкости в пробирку для образца составляет от 200 пг/мл до 20 мкг/мл, от 1 нг/мл до 15 мкг/мл или от 1 мкг/мл до 10 мкг/мл. Таким образом, согласно указанным выше вариантам осуществления изобретения в случае пробирки вместимостью 2 мл, в которую добавляют 1 мл образца, количество олигонуклеотидов, применяемых в блокирующем агенте, должно составлять от 200 пг до 20 мкг, от 1 нг до 15 мкг или от 1 мкг до 10 мкг соответственно, а в случае пробирки вместимостью 2 мл, в которую добавляют 0,8 мл образца, количество олигонуклеотидов, применяемых в блокирующем агенте, должно составлять от 160 пг до 16 мкг, от 0,8 нг до 12 мкг или от 0,8 мкг до 8 мкг.

4.1.3 Шарики

Система для ударной обработки шариками, предлагаемая в изобретении, содержит шарики, которые могут перемещаться друг относительно друга, когда их помещают в образец жидкости. В контексте настоящего описания понятие «шарик» включает как сферические, так и несферические частицы. Шарики могут представлять собой минеральные шарики, например, сделанные из кристаллических частиц (например, циркония, циркона (силиката циркония) и двуокиси циркония (диоксида циркония), кварца, оксида алюминия, карбида кремния (который называют также карборундом), гранат, керамических частиц, стекол различных типов (например, стекла из двуокиси кремния или диоксида кремния) или комбинаций, включающих один или несколько из вышеуказанных материалов (например, шарики из диоксида циркония/диоксида кремния или шарики из диоксида циркония/иттрия). Шарики могут представлять собой также металлические шарики, например, шарики из нержавеющей стали или шарики из хромистой стали.

Для выделения бактериальной ДНК шарики предпочтительно включают кварцевые частицы и/или циркониевые частицы. Такие шарики поступают в продажу в больших количествах, и они являются химически инертными по отношению к ДНК и РНК. Кварцевые и/или циркониевые частицы имеют относительно высокий удельный вес, они являются твердыми и могут иметь острые грани. Поэтому они хорошо подходят для открытия клеточных мембран, когда их подвергают механическим вибрациям.

Специалисты в данной области могут выбирать материал и размер шариков для конкретной системы для ударной обработки шариками на основе идентификации типов клеток в образце жидкости, предназначенном для обработки. Как правило, шарики должны иметь диаметр от 50 пм до 3 мм. Для экстракции нуклеиновых кислот из бактериальных клеток можно применять шарики размером от малого до среднего, как правило, сделанные из стекла или циркония, которые имеют диаметр от 50 мкм до 0,5 мм. Для экстракции нуклеиновых кислот из более крупных клеток микробов, таких как дрожжевые клетки, можно применять шарики размером от среднего до большого (например, шарики диаметром 0,5, 1 или 1,5 мм, как правило, сделанные из стекла или циркония). Шарики различных размеров и составов поступают в продажу (см., например, документ фирмы Benchmark Scientific, Product Note: Benchmark Bead Beating Guide, доступный на сайте www.denvillescientific.com/sites/default/files/Bead_Blasting_Notes.pdf).

Системы для ударной обработки шариками, предлагаемые в изобретении, могут включать шарики нескольких типов и/или шарики нескольких размеров одного типа, в частности в тех случаях, когда требуется осуществлять выделение нуклеиновой кислоты из нескольких источников (например, бактериальная и грибная ДНК). Примеры систем для ударной обработки шариками с шариками нескольких типов включают системы с комбинацией шариков из оксида алюминия и шариков из карбида кремния, комбинацией керамических шариков и шариков из диоксида кремния, комбинацией стеклянных шариков и шариков из оксида циркония, комбинацией циркониевых шариков и шариков из оксида алюминия или комбинацией шариков из карбида кремния и стеклянных шариков. Шарики различных типов могут иметь одинаковые или различные размеры.

4.2 Образцы

Примеры образцов, из которых можно экстрагировать нуклеиновые кислоты с использованием способов ударной обработки шариками, предлагаемых в изобретении, включают различные образцы жидкости. В некоторых случаях образец может представлять собой образец общей воды организма индивидуума. Образец может включать ткань, взятую из организма индивидуума. Образец может включать общую воду организма, выделения (секрет) и/или ткань индивидуума. Образец может представлять собой биологический образец. Биологический образец может представлять собой образец общей воды организма, секрета и/или ткани. Примеры биологических образцов могут включать (но, не ограничиваясь только ими) кровь, сыворотку, слюну, мочу, желудочный и пищеварительный сок, слезы, испражнения, сперму, вагинальную жидкость, интерстициальные жидкости, выделенные из опухолевой ткани жидкости, глазные жидкости, пот, слизь, ушную серу, жир, железистые секреты, выдыхаемый продукт, спинальную жидкость, волосы, ногти, клетки кожи, плазму, мазок из носа или носоглоточный смыв, спинальную жидкость, спинномозговую жидкость, ткань, мазок из глотки, мазок из раны, биопсию, плацентарную жидкость, амниотическую жидкость, кровь из пуповины, эмфатические жидкости, внутриполостные жидкости, мокроту, гной или другие экссудаты из раны, образцы инфицированной ткани, полученные при хирургической обработке или иссечении, спинномозговую жидкость, лаваж, продукты лейкопоэза, жидкость, полученную при перитонеальном диализе, молоко и/или другие выделения, а также растения и их части.

Образец можно помещать в пробирку для ударной обработки шариками сразу после его взятия из организма индивидуума или его можно подвергать определенной форме предварительной обработки (например, с использованием процедур, описанных ниже в разделе 4.3), хранить или транспортировать перед помещением в пробирку для ударной обработки шариками. Образец можно добавлять в систему для ударной обработки шариками без обработки или осуществлять ее несколько раз.

Индивидуум может предоставлять образец сам и/или образец может быть взят из организма индивидуума (например, образец крови можно собирать в пробирку для сбора крови, содержащую антикоагулянт, такой как ЭДТК). Индивидуум может представлять собой человека или животное кроме человека. Образец может быть взят из организма живого или мертвого индивидуума. Животное может представлять собой млекопитающее, такое как сельскохозяйственное животное (например, корову, свинью, овцу), спортивное животное (например, лошадь) или домашнее животное (например, собаку или кошку). Индивидуум может представлять собой пациента, индивидуума на клинической или доклинической стадии. Индивидуум может находиться на стадии установления диагноза, лечения и/или контроля заболевания, или подвергаться коррекции образа жизни или профилактическим мерам. За индивидуумом может осуществлять уход профессиональный медицинский работник или такой уход может не осуществляться.

В некоторых вариантах осуществления изобретения образец может представлять собой образец, взятый из окружающей среды. Примеры образцов, взятых из окружающей среды, включают образцы воздуха, образцы воды (например, грунтовой воды, поверхностной воды или сточной воды), образцы почвы или растительные образцы.

Дополнительными примерами образцов могут служить пищевые продукты, напитки, производственные материалы, текстильные изделия, химикаты, терапевтические средства или любые другие образцы.

4.3 Предварительная обработка образца

В некоторых случаях может оказаться предпочтительным подвергать образец предварительной обработке перед осуществлением обработки в системе для ударной обработки шариками, предлагаемой в изобретении. Примеры стадий предварительной обработки, которые можно применять перед внесением образца в пробирку для ударной обработки шариками, включают фильтрацию, дистилляцию, экстракцию, концентрирование, центрифугирование, инактивацию вредных компонентов, добавление реагентов и т.п., как представлено в настоящем описании, или, в ином случае, согласно процедурам, известным в данной области.

Может оказаться особенно предпочтительным удалять нежелательные типы клеток и состоящий из частиц продукт из биологических образцов перед их внесением в пробирку для ударной обработки шариками, предлагаемую в изобретении, для достижения максимального выхода ДНК из представляющего интерес типа клеток.

Если предполагается обнаруживать бактерии в биологическом образце, то желательно биологический образец подвергать предварительной обработке, пропуская через фильтр так, чтобы состоящий из частиц продукт и небактериальные клетки удерживались на фильтре, в то время как бактериальные клетки (включая их споры, если это требуется) проходили через него. В контексте настоящего описания «фильтр» представляет собой мембрану или устройство, который/которое обеспечивает дифференциальное прохождение частиц и молекул в зависимости от размера. Как правило, это осуществляют с использованием фильтра, имеющего поры конкретного номинального размера. Например, фильтры, представляющие особый интерес для применения с целью обнаружения бактерий, имеют поры, достаточно большие для обеспечения прохождения бактерий, но достаточно малые для того, чтобы предупреждать прохождение эукариотических клеток, которые присутствуют в представляющем интерес образце. Как правило, диаметр бактериальных клеток составляет от 0,2 до 2 мкм (микрометров или микронов), диаметр большинства грибных клеток составляет от 1 до 10 мкм, тромбоциты имеют диаметр примерно 3 мкм, а большинство имеющих ядра клеток млекопитающих, как правило, имеют диаметр от 10 до 200 мкм. Таким образом, для удаления небактериальных клеток из биологического образца, если предполагается осуществлять обнаружение бактерий, наиболее пригодны фильтры с размерами пор менее 2 мкм или менее 1 мкм.

Дополнительно или вместо стадии фильтрации биологический образец можно подвергать центрифугированию для удаления клеток и дебриса из образца перед осуществлением ударной обработки шариками. Параметры центрифугирования, позволяющие осаждать эукариотические, но не бактериальные клетки, известны в данной области. После этого супернатант можно подвергать фильтрации, если это требуется.

Фильтрат, полученный на стадии фильтрации, может представлять собой «образец» и его помещают в пробирку для ударной обработки шариками, предлагаемую в изобретении, или подвергают дальнейшим стадиям предварительной обработки (например, концентрированию или разведению).

4.4 Ударная обработка шариками

В качестве начальной стадии при получении нуклеиновой кислоты образец помещают в пробирку для ударной обработки шариками для осуществления ударной обработки шариками. На стадии ударной обработки шариками можно применять систему для ударной обработки шариками, предлагаемую в изобретении, или стандартную систему для ударной обработки шариками. В некоторых случаях при использовании стандартной системы для ударной обработки шариками можно добавлять один или несколько экзогенных блокирующих агентов, но в случае биологических образцов, содержащих эндогенные блокирующие агенты, добавление экзогенных блокирующих агентов не является обязательным. Когда добавляют один или несколько блокирующих агентов, то их можно добавлять в пробирку для ударной обработки шариками перед добавлением образца, после добавления образца или образец и блокирующий(е) агент(ы) можно добавлять одновременно (например, образец и блокирующий(е) агент(ы) можно смешивать и затем переносить в пробирку для ударной обработки шариками).

После помещения образца в пробирку для ударной обработки шариками пробирку подвергают встряхиванию для осуществления механического лизиса клеток. Лизис можно обеспечивать с использованием обычного лабораторного вихревого смесителя или гомогенизатора. Хотя время обработки в вихревом смесителе в 3-10 раз больше, чем в специальном гомогенизаторе, интенсивное перемешивание «работает» в случае легко разрушаемых клеток и является экономичным.

Для ударной обработки шариками пригодны многие поступающие в продажу гомогенизаторы, и их можно применять с системами для ударной обработки шариками, предлагаемыми в изобретении. Примерами гомогенизаторов являются BeadBug и BeadBlaster 24 (фирма Benchmark Scientific), PowerLyzer 24 (фирма МО Bio Laboratories Inc.), FastPrep-24, FastPrep-24 5G и SuperFastPrep-1 (фирма MP Biomedicals) и Mini-Beadbeater-16 (фирма BioSpec Products).

Параметры гомогенизации можно выбирать согласно рекомендациям производителя. Как правило, продолжительность механического разрушения (например, ударной обработки шариками) может составлять менее 1 с, 1-5 с, 5-10 с, 10-25 с, 25-60 с, 1-2 мин, 2-5 мин, 5 мин или более. Число повторений механического разрушения (например, число циклов ударной обработки шариками) может составлять 2, 3, 4, 5, 6, 7, 7-10, 10 или более. Скорость разрушения (например, скорость или установочное значение для ударной обработки шариками) может составлять менее 50, 50-100, 100-250, 250-500, 500-750, 750-1000, 1000-1500, 1500-2000, 2000 или более оборотов (колебаний) в минуту.

4.5 Очистка нуклеиновой кислоты

После осуществления лизиса клеток образец жидкости отделяют от шариков, например, путем удаления образца жидкости из пробирки для образца с помощью пипетки или т.п., оставляя в ней шарики, которые сохраняются на дне пробирки для образца.

Примеси, которые могут мешать анализу экстрагированной ДНК, можно удалять, например, путем осаждения примесей с помощью известных методов, например, с помощью ацетата аммония или с использованием поступающего в продажу набора.

Нуклеиновую кислоту можно выделять и промывать и необязательно подвергать дальнейшей очистке. Выделение и/или очистку нуклеиновой кислоты можно осуществлять с помощью стандартных методов, таких как осаждение изопропанолом, или с использованием поступающего в продажу набора или автоматизированного устройства.

4.6 Анализ нуклеиновой кислоты

Анализ образца на присутствие представляющих интерес нуклеиновых кислот (таких как бактериальная или грибная ДНК) можно осуществлять с помощью любого метода анализа нуклеиновых кислот, включая (но, не ограничиваясь только ими) технологии амплификации, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), изотермическую амплификацию, полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), количественную полимеразную цепную реакцию в реальном времени (Q-ПЦР), цифровую ПЦР, гель-электрофорез, капиллярный электрофорез, масс-спектрометрию, флуоресцентное обнаружение, ультрафиолетовую спектрометрию, гибридизационные анализы, секвенирование ДНК или РНК, рестрикционный анализ, обратную транскрипцию, NASBA (амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот), аллель-специфическую полимеразную цепную реакцию, полимеразную циклическую сборку (РСА), асимметричную полимеразную цепную реакцию, линейную после экспоненциальной полимеразную цепную реакцию (LATE-ПЦР), геликазо-зависимую амплификацию (HDA), полимеразную цепную реакцию с горячим стартом, специфическую в отношении микросателлитных последовательностей полимеразную цепную реакцию (ISSR), инвертированную полимеразную цепную реакцию, опосредованную лигированием полимеразную цепную реакцию, специфичную к метилированию полимеразную цепную реакцию (MSP), мультиплексную полимеразную цепную реакцию, гнездовую полимеразную цепную реакцию, твердофазную полимеразную цепную реакцию или любую их комбинацию. Указанные технологии хорошо известны специалистам в данной области. Информация о последовательности нуклеиновой кислоты-мишени дает возможность ученому конструировать праймеры и/или зонды, которые позволяют осуществлять амплификацию и/или обнаружение мишени. Можно также осуществлять секвенирование ПЦР-ампликонов для подтверждения их идентичности.

С помощью системы для ударной обработки шариками, предлагаемой в изобретении, можно экстрагировать ДНК и/или РНК из содержащихся в жидком образце микроорганизмов в концентрации, достаточной для прямого микробиологического исследования ДНК и/или РНК с помощью хорошо известных методов. Это можно осуществлять, в частности, путем приведения в контакт образца жидкости с иммобилизованными на поверхности рецепторами, которые специфически связываются с содержащейся в нем ДНК и/или РНК и/или компонентами ДНК и/или РНК. Связывание ДНК и/или РНК и/или компонентов ДНК и/или РНК с рецепторами можно обнаруживать хорошо известным образом с использованием маркеров, в частности, оптических маркеров, таких как флуоресцентные красители, и при необходимости осуществлять их количественную оценку. Альтернативно этому ДНК и/или РНК из микроорганизмов, содержащихся в образце жидкости, можно амплифицировать перед осуществлением исследования, например, с помощью ПЦР.

4.7 Наборы

В настоящем изобретении предложены также наборы, содержащие (или пригодные для получения) системы для ударной обработки шариками, предлагаемые изобретении. Наборы могут содержать пробирку для образца, такую как пробирка для образца, описанная в разделе 4.1.1, один или несколько блокирующих агентов, таких как агенты, описанные в разделе 4.1.2, и/или один или несколько типов шариков, таких как шарики, описанные в разделе 4.1.3. Каждый из одного или нескольких блокирующих агентов может быть предварительно лиофилизирован и может быть помещен внутрь пробирки или находиться вне пробирки. Аналогично этому шарики могут быть помещены внутрь пробирки или находиться вне пробирки.

В некоторых вариантах осуществления изобретения набор содержит пробирку для образца и один или несколько блокирующих агентов. В другом варианте осуществления изобретения набор дополнительно содержит один или несколько типов шариков.

Наборы, предлагаемые в изобретении, могут включать один или несколько компонентов для предварительной обработки образца, например, соляной раствор, один или несколько буферных растворов, фильтр, описанный в разделе 4.3, и т.д.

Наборы могут включать один или несколько олигонуклеотидов для амплификации ДНК и/или РНК из одного или нескольких представляющих интерес патогенов (например, одного или нескольких видов Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, Staphylococcus aureus, устойчивого к метициллину Staphylococcus aureus (MRSA), Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfuluezae, Moraxella catarrhalis, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter sp., Bordetella pertussis, Neisseria meningitidis, Bacillus anthracis, Nocardia sp., Actinomyces sp., Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumonia, Legionella species, Pneumocystis jiroveci, вируса гриппа А, цитомегаловируса, риновируса, Enterococcus faecium, Acinetobacter baumannii, Corynebacterium amycolatum, Enterobacter aerogenes, Enterococcus faecalis CI 4413, Serratia marcescens, Streptococcus equi и Candida albicans).

Наборы могут включать один или несколько зондов для обнаружения ДНК и/или РНК из одного или нескольких представляющих интерес патогенов (например, одного или нескольких видов Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium subsp paratuberculosis, Staphylococcus aureus, устойчивого к метициллину Staphylococcus aureus (MRSA), Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfuluezae, Moraxella catarrhalis, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter sp., Bordetella pertussis, Neisseria meningitidis, Bacillus anthracis, Nocardia sp., Actinomyces sp., Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumonia, Legionella species, Pneumocystis jiroveci, вируса гриппа А, цитомегаловируса, риновируса, Enterococcus faecium, Acinetobacter baumannii, Corynebacterium amycolatum, Enterobacter aerogenes, Enterococcus faecalis CI 4413, Serratia marcescens, Streptococcus equi и Candida albicans). В одном из вариантов осуществления изобретения один или несколько зондов содержит(ат) олигонуклеотиды, меченные флуоресцентным красителем. Различные зонды могут быть мечены различными красителями для того, чтобы можно было осуществлять одновременно обнаружение нескольких представляющих интерес патогенов.

5. Пример системы для ударной обработки шариками

Пример системы для ударной обработки шариками представлен на чертежах. Система для ударной обработки шариками, обозначенная номером позиции (1) на фиг. 1-3, содержит пробирку (2) для образца, имеющую внутреннюю полость (3) и закрываемое отверстие (4). Пробирка для образца предпочтительно изготовлена из пластика, но она может быть изготовлена также из другого биологически инертного материала.

Образец жидкости (5), который предположительно содержит микроорганизмы, можно вносить во внутреннюю полость (3) пробирки (2) для образца и удалять из нее через отверстие (4). Для закрывания отверстия (4) пробирка для образца имеет крышку (6), которая приспособлена для перевода в открытое и закрытое положения и которая сконструирована в виде запорного колпачка, имеющего внутреннюю резьбу, приспособленную для завинчивания на внешнюю резьбу, которой снабжена краевая область внешней стенки пробирки (2) для образца, ограничивающая отверстие (4).

Кроме того, во внутренней полости (3), размещают 2 г шариков (7) (например, шариков из диоксида кремния и/или циркония), наибольший размер которых составляет в среднем примерно 100 мкм. Шарики (7) находятся в форме свободно насыпанного продукта и при этом могут перемещаться друг относительно друга. Лиофилизированный блокирующий агент (8) также размещают во внутренней полости (3).

Шарики (7) служат для механического разрушения клеточных стенок микроорганизмов, содержащихся в образце жидкости (5), когда образец жидкости (5) вносят во внутреннюю полость (3) и пробирку для ударной обработки шариками подвергают механическим колебаниям, например, ультразвуковым колебаниям. Их можно создавать с помощью генератора колебаний, который не проиллюстрирован подробно на чертеже, и может быть подведен к системе (1) для ударной обработки шариками. Такой генератор колебаний поступает в продажу под названием MPBio Bead Beater от фирмы MP Biomedicals. В результате разрушения клеточных стенок нуклеиновые кислоты (например, ДНК), содержащиеся в микроорганизмах, высвобождаются и растворяются в образце жидкости (5).

6. Конкретные исследования

6.1 Применение ударной обработки шариками для выделения патогенной ДНК из мокроты

Mycobacterium tuberculosis («MTB») представляет собой облигатный патогенный вид бактерий семейства Mycobacteriaceae и является возбудителем туберкулеза в большинстве случаев. Являясь патогеном для респираторной системы млекопитающих, она прежде всего, инфицирует легкие. Доказано, что микобактерии способны переходить в состояние, в котором отсутствует репликация, или «спящее» состояние (образование спор) в условиях стресса, вызванного дефицитом питательных веществ или гипоксией. Образование спор делает затруднительным осуществление лизиса бактериальных клеток с целью экстракции бактериальной ДНК.

Другая сложность при осуществлении выделения микобактериальной ДНК заключается в том, что штаммы микобактерий, как правило, выделяют из мокроты инфицированных пациентов. Мокрота является густой, вязкой и трудно поддается обработке. Большинство образцов мокроты, предназначенных для анализа, содержат различные количества органических остатков и различной загрязняющей нормальной или транзиторной бактериальной флоры. Химическую очистку/обработку, как правило, применяют для снижения вязкости и уничтожения источников загрязнения, обеспечивая тем самым возможность осуществлять выделение микобактерий.

Образцы, в которых предполагается присутствие MTB, несут потенциальный риск для работающего с ними персонала. Поэтому для снижения указанного риска образец мокроты следует подвергать предварительной обработке путем нагревания и/или включения реагентов, пригодных для инактивации микроорганизмов, присутствующих в образце. Инактивацию микроорганизмов, таких как MTB, можно осуществлять путем нагревания (например, 90°С, 5 мин) с целью денатурации активных белков, ферментативного расщепления структур клеточной стенки, механического разрушения с целью физического разрушения или инактивации клеток, химической обработки или комбинации указанных процедур.

Образец мокроты (как правило, собранный в объеме, составляющем 1-10 мл, 5-10 мл или более) сначала можно разжижать для снижения его вязкости и гетерогенности до уровней, пригодных для обработки образца. Работа с образцами мокроты сопряжена с определенными проблемами. МТВ в мокроте является одним из представляющих наибольшую трудность типов клеток и образцов для обработки вследствие богатой липидами гидрофобной клеточной стенки кислотоустойчивых бактерий и вязкой гетерогенной природы мокроты. Стандартные методы экстракции при работе с мокротой, как правило, начинаются с процесса осаждения, в котором часто применяют обработку муколитическим агентом, таким как N-ацетил-L-цистеин (NALC), зефиран-тринатрийфосфат (Z-TSP) или бензалконий, после чего осуществляют центрифугирование, декантацию и ресуспендирование.

Таким образом, при обработке обладающих высокой вязкостью образцов, таких как мокрота, образец можно подвергать химической обработке для снижения вязкости так, чтобы не затруднять последующие стадии обработки. В одном из вариантов осуществления изобретения разжижение образцов мокроты путем химической обработки муколитическими агентами осуществляют в течение 20 мин при 60°С. Мокрота имеет вязкость, составляющую примерно 100-6000 кПа (мПа⋅с) при скорости сдвига 90 с^-1. Вязкость, измеренную в мПа⋅с, определяют путем деления сопротивления сдвигу на скорость сдвига. Предпочтительно образец разжижают для снижения вязкости мокроты по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99%.

После ресуспендирования образец добавляют в систему для ударной обработки шариками (описанную в разделе 4.1), предлагаемую в изобретении, для лизиса клеток как описано в разделе 4.4. После лизиса и экстракции нуклеиновой кислоты (см. раздел 4.5), можно анализировать ДНК МТВ с помощью ПЦР-амплификации последовательностей МТВ и можно анализировать устойчивость МТВ к лекарственным средствам с помощью амплификации генов, обусловливающих устойчивость к лекарственным средствам. Образцы мокроты можно анализировать в отношении других бактериальных и вирусных патогенов, включая (но, не ограничиваясь только ими) Staphylococcus aureus, устойчивый к метициллину Staphylococcus aureus (MRSA), Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfuluezae, Moraxella catarrhalis, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter sp., Bordetella pertussis, Neisseria meningitidis, Bacillus anthracis, Nocardia sp., Actinomyces sp., Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumonia, Legionella species, Pneumocystis jiroveci, вирус гриппа А, цитомегаловирус и риновирус.

6.2 Применение ударной обработки шариками для выделения ДНК из важных для ветеринарии патогенов

Mycobacterium avium, подвид paratuberculosis (MAP), представляет собой важный для ветеринарии патоген, вызывающий паратуберкулез или болезнь Йоне (JD), хронический грануломатозный гастроэнтерит у домашних и диких жвачных животных. MAP передается в стадах как непосредственно через сперму, молоко, молозиво и внутриутробно, так и опосредованно оральным путем через зараженный корм, фураж, подножный корм (на пастбище), воду и т.д. (фекально-оральный путь). JD оказывает истощающее действие на продуктивность крупного рогатого скота (ранняя выбраковка и сниженное производство молока), в результате чего животноводство несет огромные экономические потери. Усилия по контролю JD сдерживаются из-за персистентности MAP в почве и воде, а также их из-за выделения находящимся на доклинической и клинической стадии крупным рогатым скотом.

Как указано в предыдущем разделе, образование спор затрудняет осуществление лизиса микобактериальных клеток для экстракции бактериальной ДНК. Поэтому системы для ударной обработки шариками, предлагаемые в изобретении, можно применять для увеличения выхода MAP. Например, системы для ударной обработки шариками можно применять для выделения ДНК из MAP, присутствующих в молоке, почве, фекалиях, сперме и т.д.

Образцы молока можно обрабатывать непосредственно с помощью систем для ударной обработки шариками, предлагаемых в изобретении, или их можно подвергать предварительной обработке, например, для увеличения концентрации MAP, если они присутствуют, в образце. Пример метода предварительной обработки включает центрифугирование образца молока с получением фракции крема, фракции сыворотки и дебриса. Фракцию сливок и дебрис можно объединять и добавлять в систему для ударной обработки шариками, предлагаемую в изобретении, для лизиса клеток.

Образцы фекалий можно подвергать предварительной обработке, например, путем приготовления содержащих фекалии суспензий, которые затем можно добавлять в систему для ударной обработки шариками, предлагаемую в изобретении, для лизиса клеток. Например, содержащую фекалии суспензию можно приготавливать путем смешения образца фекалий с водой, соляным раствором или буфером (например, фосфатом натрия, забуференным фосфатом соляным раствором, Трис и т.д.), давая возможность осадиться смеси, путем разделения и последующего центрифугирования супернатанта и, наконец, ресуспендирования дебриса в пригодной жидкости, такой как вода, соляной раствор или буфер.

Образцы почвы можно суспендировать в жидкости (например, воде, соляном растворе или буфере) и затем добавлять в систему для ударной обработки шариками, предлагаемую в изобретении, для лизиса. Образцы спермы можно аналогичным образом подвергать предварительной обработке путем объединения образца спермы с определенным количеством воды, соляного раствора или буфера перед осуществлением ударной обработки шариками.

6.3 Применение ударной обработки шариками для выделения ДНК патогена из ран

Для обнаружения инфекций в ране мазок из раны можно инкубировать в соляном растворе, среде для клеточных культур или препаративном растворе для образца из поступающего в продажу набора. Мазок, как правило, инкубируют в течение периода времени примерно от 5 мин до 1 ч и более предпочтительно 0,25-1 ч (например, 0,25 ч, 0,5 ч или 0,75 ч). Пригодный объем раствора составляет от 200 мкл до 10 мл, и в конкретных вариантах осуществления изобретения он составляет 500 мкл, 1 мл, 2 мл, 5 мл, 8 мл или его выбирают из диапазона, ограниченного любыми двумя значениями, представленными в указанных выше вариантах (например, от 1 до 5 мл, от 500 мкл до 10 мл, от 200 мкл до 8 мл и т.д. и т.п. Раствор можно периодически встряхивать или перемешивать для стимулирования высвобождения патогенных клеток из мазка. После окончания периода инкубации мазок можно отжимать и выбрасывать.

После этого раствор можно помещать в систему для ударной обработки шариками, предлагаемую в изобретении.

Перед осуществлением ударной обработки шариками его необязательно можно фильтровать и/или концентрировать.

Патогены, которые обычно инфицируют раны, включают (но не ограничиваясь только ими) Е. coli, P. aeruginosa, Е. faecium, S. aureus (включая MRSA), K. pneumoniae, A. baumannii, С. amycolatum, Е. aerogenes, Е. faecalis CI 4413, S. marcescens, S. equi и С. albicans. Таким образом, образцы мазков из раны можно анализировать в отношении любого из указанных выше организмов индивидуально или в комбинации.

6.4 Применение ударной обработки шариками для выделения ДНК патогена из жидкости, полученной при осуществлении перитонеального диализа

Перитонеальный диализ представляет собой лечение пациентов с серьезным хроническим заболеванием почек. При осуществлении этого типа диализа брюшину в брюшной полости пациента используют в качестве мембраны, через которую обменивают жидкости и растворенные вещества из крови. Жидкость вводят через постоянную трубку в брюшную полость и затем выводят для очистки от избытка солей, мочевой кислоты и других отработанных субстанций. В результате осмоса через перитонеальную мембрану происходит обмен растворенными веществами между кровью и используемой для диализа жидкостью. По истечении соответствующего времени жидкость для диализа удаляют из брюшины и утилизируют. В результате этого состав крови становится сбалансированным и предупреждается бесконечное накопление в крови конечных метаболических продуктов, таких как мочевая кислота.

Основные осложнения при осуществлении перитонеального диализа связаны с инфекцией, обусловленной присутствием постоянной трубки в брюшной полости. По меньшей мере одной областью инфекции является перитонеальное пространство, она приводит к боли в брюшной полости, мутному вытекающему продукту диализа и обнаружению патогенов на окрашенных по Граму мазках или в культурах, взятых из внутренней полости катетера. Кроме того, туннель в ткани или внешние поверхности катетера являются типичными областями инфекции, обусловленной контактным загрязнением. Инфекция в области туннеля в ткани наиболее часто обусловлена переносом с участков кожи. Инфекции могут приводить к перитониту и в некоторых случаях к смерти.

Перитонеальные инфекции можно обнаруживать в жидкости, используемой для перитонеального диализа, взятой после осуществления перитонеального диализа у индивидуумов. Хотя за большинство инфекций ответственны S. aureus и P. aeruginosa, в них могут участвовать и другие бактерии (дифтероиды, анаэробные организмы, неферментирующие бактерии, стрептококки, нетуберкулезные микобактерии, Legionella, дрожжи и грибы). Таким образом, можно анализировать образцы жидкости, полученной при перитонеальном диализе, в отношении любого из указанных выше организмов индивидуально или в комбинации.

Жидкость, полученную при перитонеальном диализе, можно подвергать предварительной обработке путем фильтрации и необязательно концентрирования, как это описано в разделе 4.3.

6.5 Применение ударной обработки шариками для выделения ДНК из загрязняющих продуктов сточных вод

В примере 1 патента U.S. 9290796, посвященного обнаружению видов бактерий, создающих проблемы, связанные с пенообразованием и скоплением, при осуществлении процессов биологической обработки сточных вод, описана экстракция ДНК из сточных вод, собранных на предприятиях по очистке сточных вод, с использованием протокола ударной обработки шариками. Протокол ударной обработки шариками можно адаптировать для включения системы для ударной обработки шариками, предлагаемой в изобретении.

6.6 Применение ударной обработки шариками для выделения ДНК из пищевых патогенов

Образцы жидкой пищи можно подвергать предварительной обработке путем фильтрации и/или центрифугирования как это описано выше в разделе 4.3, перед осуществлением ударной обработки шариками. Например, напитки предпочтительно можно предварительно обрабатывать путем фильтрации для сбора микроорганизмов, которые могут в них присутствовать. Микроорганизмы, собранные путем фильтрации, необязательно можно промывать и подвергать центрифугированию перед осуществлением ударной обработки шариками. Для обнаружения патогенов в твердых пищевых продуктах, таких как мясо или рыба, можно брать мазок с пищевого продукта для сбора микроорганизмов с поверхности пищевого продукта. Затем микроорганизмы можно смывать с мазка и подвергать ударной обработке шариками.

В некоторых случаях может оказаться предпочтительным осуществлять предварительное культивирование образца пищи в течение определенного периода времени для усиления роста патогенов (например, Salmonella), которые могут присутствовать на или в образце, перед осуществлением ударной обработки шариками. Например, образец твердой пищи можно измельчать с помощью лабораторного блендера (например, измельчителя-гомогенизатора Stomacher®, фирма Seward Limited, Великобритания) и затем культивировать для усиления роста микроорганизма (например, в течение 8-12 ч). Затем образец культуры можно подвергать ударной обработке шариками.

6.7 Применение ударной обработки шариками для выделения ДНК патогенов из крови

Всемирная Организация Здравоохранения рассматривает разработку быстрых тестов молекулярной диагностики для человеческих инфекций в качестве наиболее приоритетной задачи в области совершенствования здравоохранения во всем мире (Daar и др., Nat. Genet. 32, 2002, сс. 229-232). Серьезные инфекции крови являются важной причиной заболеваемости и смерти среди госпитализированных пациентов во всем мире и одной из наиболее важных проблем для интенсивной терапии. Например, согласно современным оценкам в Соединенных Штатах встречаемость сепсиса составляет 240 случаев на 100000. Значительным является социальное и экономическое бремя, обусловленное сепсисом (Grossi и др., Surg. Infect. (Larchmt) 7, 2006, сс. 87-91). Несмотря на прогресс в борьбе с инфекционными заболеваниями и совершенствование интенсивной терапии, и многочисленные попытки разработать новые подходы к лечению, коэффициент смертности от сепсиса остается на неприемлемо высоком уровне, составляющем от 20 до 50%. Распознавание признаков серьезных инфекций в крови и/или серьезного сепсиса и установление раннего и точного диагноза имеют решающее значение для улучшения ухода и повышения коэффициента выживаемости. Фактически, быстрая диагностика может повышать выживаемость пациента за счет уменьшения интервала времени между взятием образца крови и применением противомикробной терапии.

В случае методов обнаружения патогенов на молекулярном уровне (например, ПЦР и анализа последовательности ДНК) адекватное выделение ДНК патогена имеет решающее значение для гарантии успешного обнаружения. В различных методах для улучшения выделения ДНК патогена из крови применяют буферы для лизиса, иногда в сочетании с методами физического разрушения, такими как ударная обработка шариками.

В настоящем изобретении используются преимущества, обусловленные присутствием встречающихся в естественных условиях блокирующих агентов в крови, и предложены упрощенные способы выделения ДНК патогена из крови. Кровь можно собирать из организма индивидуума, например, с использованием поступающей в продажу пробирки для сбора крови (например, пробирки для сбора крови BD Vacutainer®). В продажу поступает целый ряд стандартных пробирок для сбора крови, некоторые из которых содержат антикоагулянты и снабжены цветовой маркировкой для облегчения идентификации, например, можно применять пробирки с сиреневой крышкой, содержащие ЭДТК, пробирки со светло-синей (голубой) крышкой, содержащие цитрат натрия, пробирки с серой крышкой, содержащие оксалат калия, или пробирки с зеленой крышкой, содержащие гепарин. Кровь, например, которая была собрана в пробирку для сбора крови, содержащую ЭДТК, можно подвергать ударной обработке шариками, не разбавляя ее какими-либо буферами или другими добавками, с использованием предлагаемой в изобретении системы для ударной обработки шариками (содержащей блокирующие агенты) или традиционной системы для ударной обработки шариками (не содержащей блокирующие агенты). После осуществления ударной обработки шариками можно применять стандартные методы для выделения ДНК патогена, такие как методы, описанные в разделе 4.5. Затем необязательно анализируют выделенную ДНК патогена, например, с помощью методов, описанных в разделе 4.6.

Вызывающие сепсис патогены, как правило, представляют собой бактерии или грибы. Обычными бактериальными возбудителями сепсиса являются грамотрицательные бациллы (например, Е. coli, P. aeruginosa, Е. corrodens и Н. influenzae). Другими бактериями, также вызывающими сепсис, являются S. aureus, Streptococcus spp., Enterococcus spp. и Neisseria. К наиболее часто встречающимся грибам, которые вызывают сепсис, относятся Candida spp. Следовательно, образцы крови можно анализировать в отношении любых указанных выше организмов индивидуально или в комбинации.

7. Примеры

7.1 Пример 1: Системы для ударной обработки шариками приводят к занижению (определяемого) количества ДНК

7.1.1 Материалы

В данном исследовании использовали следующие материалы:

Пробирка для ударной обработки шариками: каталожный номер: ARY0007 OPS Diagnostics, криопробирка вместимостью 4,5 мл, содержащая 2,0 г шариков из Si0₂ размером 100 мкм.

ПД-жидкость: Жидкость, полученная при перитонеальном диализе, содержащая глюкозу и в необходимой для баланса концентрации Na⁺, Са²⁺, Mg²⁺.

Буфер BE: фирма Taigen Bioscience. Содержит 1 мкг РНК/мкл.

Мочевина: степень чистоты, соответствующая стандарту ACS (Американское химическое общество).

7.1.2 Методы

В качестве стандартного матрикса использовали два (2) мл ПД-жидкости, в которую впрыскивали ЭДТК до концентрации 10 мМ и С. albicans в количестве 5000 КОЕ/мл. К образцу добавляли в двенадцати (12) различных концентрациях мочевину и буфер BE, как проиллюстрировано ниже в таблице 1:

Все образцы подвергали ударной обработке шариками в течение 45 с. После осуществления ударной обработки шариками ДНК выделяли из образцов с помощью системы для экстракции нуклеиновой кислоты LabTurbo® 48 (фирма Taigen Bioscience Corporation, Тайбэй, Тайвань) с использованием реагентов и протокола производителя. ДНК, выделенную из 2,0 мл каждого образца, подвергнутого ударной обработке шариками, элюировали в 100 мкл буфера ТЕ (Трис-ЭДТК). Выделенную ДНК подвергали амплификации с помощью ПЦР в реальном времени и количественно оценивали для определения количества целевой ДНК в каждом образце.

Результаты

Отношение оптических плотностей (которое является показателем чистоты выделенной ДНК) и соответствующая концентрация ДНК для каждого образца представлены ниже в таблице 2:

Выход ДНК, о котором свидетельствует интенсивность сигнала, полученного в результате визуализации сигнала от массива после ПЦР-амплификации и гибридизации, представлен на графиках на фиг. 6 и фиг. 7.

7.1.4 Выводы

В образце 1, не содержащем блокирующий агент, выход ДНК С. albicans составлял лишь 5,5 нг/мл. Включение мочевины в качестве блокирующего агента повышало выход в 3-4 раза, а включение РНК в качестве блокирующего агента повышало выход примерно в 10-20 раз, и выход приближался к максимальному теоретическому выходу. Этот повышенный выход приводил к улучшению ПЦР-амплификации гена С. albicans

7.2 Пример 2: Экстракция ДНК с использованием системы для ударной обработки шариками, предлагаемой в изобретении

7.2.1 Получение системы для ударной обработки шариками, предлагаемой в изобретении

Приготавливали маточный раствор блокирующего агента, содержащий 250 мг/мл мочевины, 25 мг/мл тетранатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТК), 125 мг/мл аденозинамонофосфата, 125 мг/мл гуанозинмонофосфата, 125 мг/мл цитозинмонофосфата, 125 мг/мл тимидинмонофосфата и 75 мг/мл лауроилсаркозината натрия в буфере ТЕ (Трис/ЭДТК).

200 мкл маточного раствора добавляли в пробирку для образца вместимостью от 4,5 до 5 мл и сушили досуха в вакууме, в результате чего высушенный блокирующий агент откладывался на внутренней стенке в нижней области пробирки для образца. Ожидается, что высушенный блокирующий агент должен сохранять стабильность по меньшей мере в течение одного года.

Затем в пробирку для образца добавляли 2,0 г шариков из диоксида кремния размером 100 мкм.

7.2.2 Применение системы для ударной обработки шариками, предлагаемой в изобретении

6 мл мочевины и 6 мл жидкости для перитонеального диализа, фильтровали через стерильный фильтр с размером пор 0,4 мкм и затем к фильтратам мочевины и жидкости для перитонеального диализа, добавляли выращенную в культуре в лабораторных условиях Staphylococcus aureus, в количестве 10000 колониеобразующих единиц/мл.

2,9 мл зараженной мочевины и 2,9 мл зараженной жидкости для перитонеального диализа переносили в пробирки для образцов, подготовленные согласно процедуре, описанной в разделе 7.2.1, или в пробирки для образцов, содержащие 2,0 г шариков из диоксида кремния размером 100 мкм, но без блокирующего агента.

Пробирки закрывали крышками и зажимали в устройство для ударной обработки шариками фирмы MPBio и осуществляли обработку в течение 30 с при полной мощности. Крышки удаляли и пробирку помещали на штатив для образцов поступающего в продажу устройства для выделения ДНК. Из каждой пробирки извлекали по 2 мл каждого образца и затем добавляли агенты для экстракции ДНК (LabTurbo®). После этого осуществляли экстракцию ДНК. Для каждого образца получали по 100 мкл экстракта ДНК.

Количество экстрагированной ДНК Staphylococcus aureus в каждом образце определяли с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени согласно методу, описанному у Gillespie и др., «Simultaneous Detection of Mastitis Pathogens, Staphylococcus aureus, Streptococcus uteris, and Streptococcus agalactiae by Multiplex Real-Time Polymerase Chain Reaction», J. Dairy Sci. 88, 2005, cc. 3510-3518. 1 мкл каждого экстракта ДНК амплифицировали в реакционном объеме 20 мкл.

Образцы, обработанные с использованием пробирок для образцов без блокирующего агента, характеризовались величиной порогового цикла, равной 32 в случае мочевины и 38 в случае жидкости для перитонеального диализа, что свидетельствовало о низком выходе ДНК.

Образцы, обработанные с использованием пробирок для образцов с блокирующим агентом, характеризовались величиной порогового цикла, равной 31 в случае мочевины и 32 в случае жидкости для перитонеального диализа, что свидетельствовало об увеличенном выходе в случае жидкости для перитонеального диализа в указанных условиях.

7.3 Пример 3: Кровь в качестве блокирующего агента

7.3.1 Введение

Данное исследование проводили для идентификации оптимальных условий осуществления ударной обработки шариками образцов крови. Не содержащие культуры патогенов образцы крови заражали патогенами S. aureus, E. coli и С .albicans. Осуществляли ПЦР для положительного контроля. Концентрация (количество геномных копий) в этом контроле соответствовала теоретическому 100%-му выходу интродуцированного патогена. Результаты этого исследования продемонстрировали, что можно экстрагировать ДНК из присутствующих в крови патогенов с помощью ударной обработки шариками при отсутствии добавок, таких как буферы, детергенты и т.д.

7.3.2 Материалы

В исследовании использовали следующие конкретные материалы:

Пробирка для ударной обработки шариками: каталожный номер: ARY0007 OPS Diagnostics, криопробирка вместимостью 4,5 мл, содержащая 2,0 г шариков из Si0₂ размером 100 мкм.

Кровь: не содержащая культуры патогенов, взятая из организма здоровых доноров.

Культуры S. aureus, Е. coli и С. albicans: все получены из АТСС.

7.3.3 Методы

Приготавливали серии по тридцать восемь (38) зараженных образцов крови, состоящие из 3,0 мл крови и 15 мкл соляного раствора, содержащего выращенные в культуре патогены. К каждому образцу крови не добавляли ничего за исключением соляного раствора, содержащего выращенные в культуре патогены. Пробирки для ударной обработки обрабатывали с использованием гомогенизатора FastPrep®-24 (фирма MP Biomedicals) при скорости 6,5 м/с. Затем из образцов выделяли ДНК с помощью системы для экстракции нуклеиновых кислот LabTurbo® 48 (фирма Taigen Bioscience Corporation) с использованием реагентов и протокола производителя. ДНК амплифицировали, осуществляя 55 циклов ПЦР и гибридизовали с массивом, который затем промывали и визуализировали. Количества патогенов и периоды времени ударной обработки шариками представлены ниже в таблице 3:

Для трех различных патогенов при данном уровне заражения рассчитывали геномный выход на 1 мкл на основе выделенной ДНК. Это количество геномных копий использовали в качестве целевой 100%-ной эффективности.

7.3.4 Результаты

Результаты графически проиллюстрированы на фиг. 8-10, на которых представлен выход, о котором свидетельствует интенсивность сигнала, полученного в результате визуализации сигнала от массива после ПЦР-амплификации и гибридизации. На фиг. 8 представлены данные для серии периодов времени обработки С. albicans, а также для целевой 100%-ной эффективности. На фиг. 9 представлены данные для серии периодов времени обработки S. aureus, а также для целевой 100%-ной эффективности. На фиг. 10 представлены данные для серии периодов времени обработки Е. coli, а также для целевой 100%-ной эффективности.

7.3.5 Выводы

Для трех различных патогенов не было выявлено потери сигнала, обусловленной связыванием ДНК патогена с шариками. Во всех случаях был продемонстрирован выход, составляющий по меньшей мере 100% от теоретического. В двух случаях выход составлял более 100%, что возможно было обусловлено присутствием ДНК из погибших бактерий в материале, использованном для заражения.

8. Конкретные варианты осуществления изобретения

Примеры конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения представлены ниже.

1. Система для ударной обработки шариками, содержащая (I) пробирку для образца, имеющую внутреннюю полость, в которую можно осуществлять доступ через отверстие, (II) шарики и (III) сухой блокирующий агент, где шарики и сухой блокирующий находятся во внутренней полости пробирки для образца.

2. Система для ударной обработки шариками по варианту осуществления изобретения 1, в которой блокирующий агент содержит один или несколько хаотропных агентов, креатинин, один или несколько нуклеотидов, один или несколько олигонуклеотидов или их комбинацию.

3. Система для ударной обработки шариками по варианту осуществления изобретения 2, в которой блокирующий агент содержит один или несколько хаотропных агентов, включающих мочевину, одну или несколько солей гуанидина, одну или несколько солей лития, одну или несколько солей магния, один или несколько детергентов или их комбинацию.

4. Система для ударной обработки шариками по варианту осуществления изобретения 3, в которой блокирующий агент содержит одну или несколько солей гуанидина, включая изоцианат гуанидина, хлорид гуанидина или их комбинацию.

5. Система для ударной обработки шариками по варианту осуществления изобретения 3 или варианту осуществления изобретения 4, в которой блокирующий агент содержит одну или несколько солей лития, включая перхлорат лития, ацетат лития или их комбинацию.

6. Система для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 3-5, в которой блокирующий агент содержит хлорид магния.

7. Система для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 3-6, в которой блокирующий агент содержит один или несколько детергентов, включая додецилсульфат натрия, лауроилсульфатсаркозинат натрия, полиоксиэтилен(20)сорбитанмонолаурат или их комбинацию.

8. Система для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 2-7, в которой блокирующий агент содержит один или несколько нуклеотидов, включая встречающиеся в естественных условиях нуклеотиды, не встречающиеся в естественных условиях нуклеотиды или их комбинацию.

9. Система для ударной обработки шариками по варианту осуществления изобретения 8, в которой один или несколько нуклеотидов включают один или несколько встречающихся в естественных условиях дезоксирибонуклеотидов, один или несколько встречающихся в естественных условиях рибонуклеотидов или их комбинацию.

10. Система для ударной обработки шариками по варианту осуществления изобретения 9, в которой блокирующий агент содержит один или несколько дезоксирибонуклеотидов, включая дезоксиаденозинмонофосфат, дезоксигуанозинмонофосфат, дезоксицитозинмонофосфат и дезокситимидинмонофосфат или их комбинацию.

11. Система для ударной обработки шариками по варианту осуществления изобретения 9 или варианту осуществления изобретения 10, в которой блокирующий агент содержит один или несколько рибонуклеотидов, включая аденозинмонофосфат, гуанозинмонофосфат, цитозинмонофосфат и тимидинмонофосфат или их комбинацию.

12. Система для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 2-11, в которой блокирующий агент содержит один или несколько олигонуклеотидов, включая рибонуклеотиды, дезоксирибонуклеотиды, нуклеотидные аналоги или их комбинацию.

13. Система для ударной обработки шариками по варианту осуществления изобретения 12, в которой блокирующий агент содержит один или несколько олигонуклеотидов, каждый из которых независимо имеет длину от 2 до 120 нуклеотидов, от 2 до 100 нуклеотидов, от 2 до 50 нуклеотидов, от 2 до 25 нуклеотидов, от 5 до 40 нуклеотидов, от 2 до 15 нуклеотидов, от 8 до 120 нуклеотидов, от 8 до 80 нуклеотидов, от 10 до 100 нуклеотидов, от 15 до 50 нуклеотидов, от 50 до 100 нуклеотидов или от 100 до 120 нуклеотидов.

14. Система для ударной обработки шариками по варианту осуществления изобретения 12 или варианту осуществления изобретения 13, в которой олигонуклеотиды содержат ДНК и/или РНК.

15. Система для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 1-14, в которой внутренняя полость пробирки для образца по меньшей мере частично покрыта слоем или пленкой из блокирующего агента.

16. Система для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 1-15, в которой некоторые или все шарики частично или полностью покрыты слоем или пленкой из блокирующего агента.

17. Система для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 1-16, которая содержит порошок, содержащий блокирующий агент.

18. Система для ударной обработки шариками по варианту осуществления изобретения 17, в которой порошок представляет собой лиофилизированный порошок, содержащий блокирующий агент.

19. Система для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 1-18, в которой шарики приспособлены для осуществления лизиса бактерий, дрожжей, нитчатых грибов, спор, клеток растений или клеток животных.

20. Система для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 1-19, в которой шарики включают минеральные шарики, керамические шарики, стеклянные шарики, металлические шарики или их комбинацию.

21. Система для ударной обработки шариками по варианту осуществления изобретения 20, в которой шарики включают шарики из циркония, шарики из силиката циркония, шарики из диоксида циркония, шарики из кварца, шарики из оксида алюминия, шарики из карбида кремния, керамические шарики, стеклянные шарики из диоксида кремния, шарики из нержавеющей стали, шарики из хромистой стали или их комбинацию.

22. Система для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 1-21, в которой шарики имеют диаметр в пределах от 50 мкм до 3 мм.

23. Система для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 1-22, которая дополнительно содержит этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТК) и/или ее натриевую соль, находящуюся во внутренней полости пробирки для образца.

24. Система для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 1-22, которая дополнительно содержит креатинин, находящийся во внутренней полости пробирки для образца.

25. Способ лизиса клеток (например, для экстрагирования нуклеиновых кислот из клеток), содержащихся в жидком образце, включающий встряхивание жидкого образца в пробирке для образца, входящей в систему для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 1-24, в условиях, обеспечивающих лизис клеток.

26. Способ лизиса клеток (например, для экстрагирования нуклеиновых кислот из клеток), содержащихся в жидком образце, который содержит экзогенный блокирующий агент, включающий встряхивание жидкого образца в системе для ударной обработки шариками, которая содержит пробирку для образца и шарики, в отсутствии буфера для лизиса и/или добавок.

27. Способ лизиса клеток (например, для экстрагирования нуклеиновых кислот из клеток), содержащихся в жидком образце, который не инкубировали с буфером для лизиса, включающий встряхивание жидкого образца и одного или нескольких блокирующих агентов в системе для ударной обработки шариками, которая содержит пробирку для образца шариками и шарики, где необязательно один или несколько блокирующих агентов представляют собой блокирующий агент, присутствующий в пробирке для образца по одному из вариантов осуществления изобретения 1-24.

28. Способ по варианту осуществления изобретения 0, в котором жидкий образец содержит эндогенный блокирующий агент.

29. Способ по одному из вариантов осуществления изобретения 26-28, в котором шарики приспособлены для лизиса бактерий, дрожжей, нитчатых грибов, спор, клеток растений или клеток животных.

30. Способ по одному из вариантов осуществления изобретения 26-29, в котором шарики включают минеральные шарики, керамические шарики, стеклянные шарики, металлические шарики или их комбинацию.

31. Способ по варианту осуществления изобретения 30, в котором включают шарики из циркония, шарики из силиката циркония, шарики из диоксида циркония, шарики из кварца, шарики из оксида алюминия, шарики из карбида кремния, керамические шарики, стеклянные шарики из диоксида кремния, шарики из нержавеющей стали, шарики из хромистой стали или их комбинацию.

32. Способ по одному из вариантов осуществления изобретения 26-31, в котором шарики имеют диаметр в пределах от 50 мкм до 3 мм.

33. Способ по одному из вариантов осуществления изобретения 25-32, дополнительно включающий стадию, на которой помещают жидкий образец в пробирку для образца перед осуществлением встряхивания жидкого образца.

34. Способ по одному из вариантов осуществления изобретения 25-34, в котором встряхивание включает приведение системы для ударной обработки шариками в колебательное движение.

35. Способ по одному из вариантов осуществления изобретения 25-34, в котором образец представляет собой биологический образец, образец, взятый из окружающей среды, или пищевой продукт.

36. Способ по варианту осуществления изобретения 35, в котором образец представляет собой биологический образец, выбранный из крови, сыворотки, слюны, мочи, желудочного сока, пищеварительного сока, слез, испражнений, спермы, вагинальной жидкости, интерстициальной жидкости, выделенной из опухолевой ткани жидкости, глазной жидкости, пота, слизи, ушной серы, жира, железистых секретов, выдыхаемого продукта, спинальной жидкости, волос, ногтей, клеток кожи, плазмы, жидкости, полученной из мазка из носа, жидкости, полученной из носоглоточного смыва, цереброспинальной жидкости, образца ткани, жидкости или ткани, полученной из мазка, взятого из глотки, жидкости или ткани, полученной из мазка, взятого из раны, ткани, полученной путем биопсии, плацентарной жидкости, амниотической жидкости, жидкости, полученной при перитонеальном диализе, крови из пуповины, лимфатических жидкостей, внутриполостных жидкостей, мокроты, гноя, микрофлоры, мекония, грудного молока или образца, полученного путем обработки, экстракции или фракционирования любого из указанных выше образцов.

37. Способ по варианту осуществления изобретения 36, в котором биологический образец представляет собой мочу, мокроту или образец, полученный путем обработки, экстракции или фракционирования мочи.

38. Способ по варианту осуществления изобретения 36, в котором биологический образец представляет собой мокроту или образец, полученный путем обработки, экстракции или фракционирования мокроты.

39. Способ по варианту осуществления изобретения 36, в котором биологический образец представляет собой мазок из раны или образец, полученный путем обработки, экстракции или фракционирования мазка из раны.

40. Способ по варианту осуществления изобретения 36, в котором биологический образец представляет собой кровь или образец, полученный путем обработки, экстракции или фракционирования крови.

41. Способ по варианту осуществления изобретения 40, в котором кровь содержит антикоагулянт.

42. Способ по варианту осуществления изобретения 41, в котором антикоагулянт представляет собой ЭДТК.

43. Способ по варианту осуществления изобретения 41, в котором антикоагулянт представляет собой цитрат (например, цитрат натрия).

44. Способ по варианту осуществления изобретения 41, в котором антикоагулянт представляет собой оксалат (например, оксалат калия).

45. Способ по варианту осуществления изобретения 41, в котором антикоагулянт представляет собой гепарин (например, гепарин натрия).

46. Способ по варианту осуществления изобретения 41, дополнительно включающий перенос крови из пробирки для сбора крови в пробирку для образца перед осуществлением встряхивания, при этом в пробирку для образца необязательно переносят всю или только часть крови, находящейся в пробирке для сбора крови.

47. Способ по варианту осуществления изобретения 46, в котором пробирка для сбора крови содержит антикоагулянт.

48. Способ по варианту осуществления изобретения 47, в котором антикоагулянт представляет собой ЭДТК.

49. Способ по варианту осуществления изобретения 47, в котором антикоагулянт представляет собой цитрат (например, цитрат натрия).

50. Способ по варианту осуществления изобретения 47, в котором антикоагулянт представляет собой оксалат (например, оксалат калия).

51. Способ по варианту осуществления изобретения 47, в котором антикоагулянт представляет собой гепарин (например, гепарин натрия).

52. Способ по одному из вариантов осуществления изобретения 46-51, дополнительно включающий осуществление сбора крови в пробирку для сбора крови перед переносом крови в пробирку для образца.

53. Способ по варианту осуществления изобретения 52, в котором пробирка для сбора крови содержит антикоагулянт перед осуществлением указанного сбора.

54. Способ по варианту осуществления изобретения 52 или варианту осуществления изобретения 53, дополнительно включающий перенос и/или хранение крови в пробирке для сбора крови перед переносом крови в пробирку для образца.

55. Способ лизиса клеток (например, для экстракции нуклеиновых кислот из клеток), содержащихся в образце крови, который не инкубировали с буфером для лизиса, включающий (а) объединение шариков и крови в пробирке для сбора крови, содержащей кровь, и (б) встряхивание крови в присутствии шариков, в результате чего происходит лизис клеток, содержащихся в образце крови.

56. Способ по варианту осуществления изобретения 55, в котором шарики добавляют в пробирку для сбора крови, содержащую кровь.

57. Способ по варианту осуществления изобретения 55, в котором кровь собирают в пробирку для сбора крови, содержащую шарики.

58. Способ по одному из вариантов осуществления изобретения 55-57, в котором пробирка для сбора крови содержит антикоагулянт.

59. Способ по варианту осуществления изобретения 58, в котором антикоагулянт представляет собой ЭДТК.

60. Способ по варианту осуществления изобретения 58, в котором антикоагулянт представляет собой цитрат (например, цитрат натрия).

61. Способ по варианту осуществления изобретения 58, в котором антикоагулянт представляет собой оксалат (например, оксалат калия).

62. Способ по варианту осуществления изобретения 58, в котором антикоагулянт представляет собой гепарин (например, гепарин натрия).

63. Способ по варианту осуществления изобретения 36, в котором биологический образец представляет собой жидкость, полученную при перитонеальном диализе, или образец, полученный путем обработки, экстракции или фракционирования жидкости, полученной при перитонеальном диализе.

64. Способ по варианту осуществления изобретения 35, в котором образец представляет собой образец, взятый из окружающей среды, который выбран из образца почвы, грунтовой воды, поверхностной воды, сточной воды или образец, полученный путем обработки, экстракции или фракционирования любого из указанных выше образцов.

65. Способ по одному из вариантов осуществления изобретения 25-64, в котором клетки содержат один или несколько патогенов.

66. Способ по варианту осуществления изобретения 65, в котором один или несколько патогенов включают один или несколько бактериальных патогенов, вирусных патогенов, грибных патогенов или их комбинацию.

67. Способ по варианту осуществления изобретения 65 или варианту осуществления изобретения 66, в котором один или несколько патогенов включают один или несколько из следующих патогенов: Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, Staphylococcus aureus, устойчивую к метициллину бактерию Staphylococcus aureus (MRSA), Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfuluezae, Moraxella catarrhalis, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter sp., Bordetella pertussis, Neisseria meningitidis, Bacillus anthracis, Nocardia sp., Actinomyces sp., Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumonia, Legionella species, Pneumocystis jiroveci, вирус гриппа А, цитомегаловирус, риновирус, Enterococcus faecium, Acinetobacter baumannii, Corynebacterium amycolatum, Enterobacter aerogenes, Enterococcus faecalis CI 4413, Serratia marcescens, Streptococcus equi и Candida albicans.

68. Способ по варианту осуществления изобретения 65, в котором образец представляет собой мокроту или образец, полученный из мокроты путем обработки, экстракции или фракционирования, и один или несколько патогенов включают один или несколько из следующих патогенов: Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, Staphylococcus aureus, устойчивую к метициллину бактерию Staphylococcus aureus (MRSA), Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfuluezae, Moraxella catarrhalis, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter sp., Bordetella pertussis, Neisseria meningitidis, Bacillus anthracis, Nocardia sp., Actinomyces sp., Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumonia, Legionella species, Pneumocystis jiroveci, вирус гриппа А, цитомегаловирус и риновирус.

69. Способ по варианту осуществления изобретения 68, в котором один или несколько патогенов включают Mycobacterium tuberculosis.

70. Способ по варианту осуществления изобретения 65, в котором образец представляет собой молоко или сперму, или образец, полученный из молока, почвы, фекалий или спермы путем обработки, экстракции или фракционирования, и один или несколько патогенов включают Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis.

71. Способ по варианту осуществления изобретения 65, в котором образец представляет собой мазок из раны или образец, полученный из мазка из раны путем обработки, экстракции или фракционирования, и один или несколько патогенов включают один или несколько из следующих патогенов: Е. coli, Р. aeruginosa, Е. faecium, S. aureus, K. pneumoniae, A. baumannii, С. amycolatum, Е. aerogenes, Е. faecalis CI 4413, S. marcescens, S. equi и С. albicans.

72. Способ по варианту осуществления изобретения 65, в котором образец представляет собой жидкость, полученную при перитонеальном диализе, или образец, который получен из жидкости, полученной при перитонеальном диализе путем обработки, экстракции или фракционирования, и один или несколько патогенов включают S. aureus и/или P. aeruginosa.

73. Способ по одному из вариантов осуществления изобретения 25-72, в котором жидкий образец содержит клетки из различных видов.

74. Способ по одному из вариантов осуществления изобретения 25-73, дополнительно включающий извлечение жидкого образца из пробирки для образца после лизиса клеток.

75. Способ по варианту осуществления изобретения 74, дополнительно включающий очистку нуклеиновых кислот из извлеченного жидкого образца.

76. Способ по одному из вариантов осуществления изобретения 25-75, дополнительно включающий осуществление анализа одной или нескольких нуклеиновых кислот.

77. Способ по варианту осуществления изобретения 76, в котором анализ осуществляют с использованием микромассива или путем секвенирования одной или нескольких нуклеиновых кислот.

78. Способ по варианту осуществления изобретения 76 или варианту осуществления изобретения 77, в котором последовательность-мишень амплифицируют перед осуществлением анализа.

79. Способ по варианту осуществления изобретения 78, в котором последовательность-мишень амплифицируют с помощью ПЦР.

80. Способ по одному из вариантов осуществления изобретения 25-79, в котором нуклеиновые кислоты содержат ДНК.

81. Способ по одному из вариантов осуществления изобретения 25-80, в котором нуклеиновые кислоты содержат РНК.

82. Набор для лизиса клеток (например, для экстракции нуклеиновых кислот из клеток), которые содержатся в жидком образце, содержащий систему для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 1-24 и необязательно: (I) один или несколько компонентов для приготовления жидкого образца, (II) один или несколько олигонуклеотидов для амплификации одной или нескольких нуклеиновых кислот, (III) один или несколько зондов для обнаружения одной или нескольких нуклеиновых кислот или (IV) любую комбинацию компонентов, указанных в подпунктах (I)-(II).

83. Набор по варианту осуществления изобретения 82, который содержит один или несколько компонентов для получения жидкого образца и в котором один или несколько компонентов для получения жидкого образца включают воду, соляной раствор, буфер, фильтр или их комбинацию.

84. Набор по варианту осуществления изобретения 82 или варианту осуществления изобретения 83, который содержит один или несколько олигонуклеотидов для амплификации одной или нескольких нуклеиновых кислот.

85. Набор по одному из вариантов осуществления изобретения 82-84, который содержит один или несколько зондов для обнаружения одной или нескольких нуклеиновых кислот.

86. Набор для получения системы для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 1-24, содержащий пробирку для образца, шарики и сухой блокирующий реагент.

87. Набор по варианту осуществления изобретения 86, в котором шарики и/или сухой блокирующий реагент включены в набор отдельно от пробирки для образца.

88. Набор по варианту осуществления изобретения 86, в котором шарики и/или сухой блокирующий реагент включены в набор в пробирке для образца.

89. Набор по одному из вариантов осуществления изобретения 86-88, дополнительно содержащий один или несколько компонентов для получения содержащего клетки образца для экстракции нуклеиновой кислоты с помощью системы для ударной обработки шариками, один или несколько олигонуклеотидов для амплификации одной или нескольких нуклеиновых кислот, один или несколько зондов для обнаружения одной или нескольких нуклеиновых кислот или их комбинацию.

90. Система (1) для ударной обработки шариками, включающая пробирку для образца, которая содержит элемент, представляющий собой контейнер (2), с внутренней полостью (3), отверстие (4) для внесения образца жидкости (5), который может содержать микроорганизмы, во внутреннюю полость (3), и крышку (6) для закрытия отверстия (4), где во внутренней полости (3) размещено множество макроскопических минеральных частиц (7), которые приспособлены для механического разрушения клеточных стенок микроорганизмов, содержащихся в образце жидкости (5), когда образец жидкости (5) вносят во внутреннюю полость (3) и систему (1) для ударной обработки шариками подвергают механическим колебаниям, отличающаяся тем, что во внутренней полости (3) пробирки для образца располагается находящийся в высушенной форме блокирующий агент (8), содержащий мочевину и/или по меньшей мере одну соль гуанидина, и/или по меньшей мере один детергент.

91. Система (1) для ударной обработки шариками по варианту осуществления изобретения 67, отличающаяся тем, что блокирующий агент (8) содержит дезоксиаденозинмонофосфат, дезоксигуанозинмонофосфат, дезоксицитозинмонофосфат, дезокситимидинмонофосфат или смесь по меньшей мере двух указанных монофосфатов.

92. Система (1) для ударной обработки шариками по варианту осуществления изобретения 90 или 91, отличающаяся тем, что блокирующий агент (8) содержит аденозинмонофосфат, гуанозинмонофосфат, цитозинмонофосфат, тимидинмонофосфат или смесь по меньшей мере двух указанных монофосфатов.

93. Система (1) для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 90-92, отличающаяся тем, что по меньшей мере один монофосфат, содержащийся в блокирующем агенте (8), представляет собой олигонуклеотид, состоящий как минимум из 2 и как максимум из 120 нуклеотидов.

94. Система (1) для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 90-93, отличающаяся тем, что по меньшей мере один детергент содержит додецилсульфат натрия, лауроилсульфатсаркозинат натрия и/или полиоксиэтилен(20)сорбитанмонолаурат.

95. Система (1) для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 90-94, отличающаяся тем, что высушенный блокирующий агент, предпочтительно находящийся в порошкообразной форме, свободно расположен во внутренней полости (3) представляющего собой контейнер элемента (2).

96. Система (1) для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 90-95, отличающаяся тем, что внутренняя стенка представляющего собой контейнер элемента (2) по меньшей мере частично покрыта слоем или пленкой блокирующего агента.

97. Система (1) для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 90-96, отличающаяся тем, что во внутреннюю полость (3) пробирки для образца помещена этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТК) и/или ее натриевая соль.

98. Система (1) для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 90-97, отличающаяся тем, что во внутреннюю полость (3) пробирки для образца помещен креатинин.

99. Применение системы (1) для ударной обработки шариками по одному из вариантов осуществления изобретения 90-98 для экстракции дезоксирибонуклеиновой кислоты и/или рибонуклеиновой кислоты из микроорганизмов.

100. Способ экстракции дезоксирибонуклеиновой кислоты и/или рибонуклеиновой кислоты из микроорганизмов, в котором получают образец жидкости (5), предположительно содержащий микроорганизмы, в котором вносят в образец жидкости (5) множество минеральных частиц (7), которые могут перемещаться относительно друг друга, и образец жидкости (5) с содержащимися в нем частицами (7) подвергают колебаниям таким образом, чтобы частицы (7) могли механически разрушать клеточные стенки микроорганизмов, содержащихся в жидком образце (5),

отличающийся тем, что до и/или в процессе осуществления колебаний частиц (7) в образец жидкости (5) вносят блокирующий агент (8), содержащий мочевину и/или по меньшей мере одну соль гуанидина, и/или по меньшей мере один детергент.

101. Способ по варианту осуществления изобретения 100, отличающийся тем, что количество мочевины приводят в соответствие с количеством образца жидкости (5) таким образом, чтобы концентрация мочевины, растворенной в образце жидкости (5), составляла от 10 до 100 г/л, в частности, от 20 до 50 г/л и предпочтительно от 25 до 35 г/л.

102. Способ по варианту осуществления изобретения 100 или 101, отличающийся тем, что до и/или в процессе осуществления колебаний частиц (7) в жидкий образец (5) вносят один или несколько из следующих монофосфатов: дезоксиаденозинмонофосфат, дезоксигуанозинмонофосфат, дезоксицитозинмонофосфат, дезокситимидинмонофосфат.

103. Способ по одному из вариантов осуществления изобретения 100-102, отличающийся тем, что до и/или в процессе осуществления колебаний частиц (7) в образец жидкости (5) вносят один или несколько из следующих монофосфатов: аденозинмонофосфат, гуанозинмонофосфат, цитозинмонофосфат, тимидинмонофосфат.

104. Способ по одному из вариантов осуществления изобретения 100-103, отличающийся тем, что до и/или в процессе осуществления колебаний частиц (7) в образец жидкости (5) вносят креатинин и/или этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТК) и/или ее натриевую соль.

9. Цитирование ссылок

Все публикации, патенты, заявки на патент и другие документы, процитированные в настоящей заявке, полностью включены в нее в качестве ссылки для всех целей в той степени, как если бы было индивидуально указано, что каждая/каждый индивидуальная/индивидуальный публикация, патент, заявка на патент или другой документ включена/включен в качестве ссылки для всех целей. В случае несоответствия между доктриной одной или нескольких ссылок и настоящего описания следует руководствоваться доктриной настоящей заявки.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ лизиса клеток, содержащихся в крови с антикоагулянтом, включающий встряхивание крови в условиях, эффективных для лизиса грибкового патогена, в системе для ударной обработки шариками, которая включает (I) пробирку для образца или пробирку для сбора крови и (II) шарики, в отсутствие буфера для лизиса и какой-либо добавки. Изобретение обеспечивает повышение концентрации нуклеиновых кислот при их экстракции из патогенных микроорганизмов, содержащихся в биологическом образце. 35 з.п. ф-лы, 10 ил., 3 табл. 3 пр.

1. Способ лизиса клеток, которые содержатся в крови, содержащей антикоагулянт, включающий встряхивание крови в условиях, эффективных для лизиса грибкового патогена, в системе для ударной обработки шариками, которая включает (I) пробирку для образца или пробирку для сбора крови и (II) шарики, в отсутствие буфера для лизиса и в отсутствие какой-либо добавки.

2. Способ по п. 1, в котором шарики приспособлены для лизиса дрожжей или нитчатых грибов.

3. Способ по п. 1 или 2, в котором шарики включают минеральные шарики, керамические шарики, стеклянные шарики, металлические шарики или их комбинацию.

4. Способ по п. 1 или 2, в котором шарики включают шарики из циркония, шарики из силиката циркония, шарики из диоксида циркония, шарики из кварца, шарики из оксида алюминия, шарики из карбида кремния, керамические шарики, стеклянные шарики из диоксида кремния, шарики из нержавеющей стали, шарики из хромистой стали или их комбинацию.

5. Способ по одному из пп. 1-4, в котором шарики имеют диаметр в пределах от 50 мкм до 3 мм.

6. Способ по одному из пп. 1-5, дополнительно включающий стадию, на которой собирают кровь в пробирку для сбора крови.

7. Способ по одному из пп. 1-6, который включает внесение крови в пробирку для образца перед осуществлением встряхивания.

8. Способ по одному из пп.1-7, где грибковый патоген представляет собой Candida albicans.

9. Способ по одному из пп.1-8, в котором условия также являются достаточными для лизиса бактериальных патогенов.

10. Способ по п.9, в котором бактериальные патогены включают Staphylococcus aureus и Escherichia coli.

11. Способ по одному из пп. 1-10, в котором встряхивание включает приведение системы для ударной обработки шариками в колебательное движение.

12. Способ по п.11, в котором встряхивание включает в себя воздействие на систему для ударной обработки шариками 2000 или более колебаний в минуту.

13. Способ по одному из пп.1-12, в котором встряхивание осуществляют с помощью шейкера или гомогенизатора.

14. Способ по п.13, в котором встряхивание осуществляют с помощью гомогенизатора.

15. Способ по п.14, в котором встряхивание проводят в течение 25-60 секунд.

16. Способ по п. 14, в котором встряхивание осуществляют в течение 1-2 минут.

17. Способ по одному из пп. 1-16, в котором антикоагулянт представляет собой ЭДТА.

18. Способ по одному из пп. 1-16, в котором антикоагулянт представляет собой цитрат.

19. Способ по п. 18, в котором антикоагулянт представляет собой цитрат натрия.

20. Способ по одному из пп. 1-16, в котором антикоагулянт представляет собой оксалат.

21. Способ по п. 20, в котором антикоагулянт представляет собой оксалат калия.

22. Способ по одному из пп. 1-16, в котором антикоагулянт представляет собой гепарин.

23. Способ по одному из пп. 1-22, в котором система для ударной обработки шариками включает пробирку для образца и шарики.

24. Способ по одному из пп. 1-22, в котором система для ударной обработки шариками включает пробирку для сбора крови и шарики.

25. Способ по одному из пп. 1-24, в котором клетки содержат один или несколько патогенов.

26. Способ по п.25, где клетки содержат один или несколько бактериальных патогенов, вирусных патогенов, грибковых патогенов или их комбинацию.

27. Способ по п. 26, где клетки содержат один или несколько грибковых патогенов.

28. Способ по п.27, где один или несколько грибковых патогенов включают Candida albicans.

29. Способ по одному из пп. 26-28, где клетки содержат один или несколько бактериальных патогенов.

30. Способ по п.29, где клетки содержат Staphylococcus aureus.

31. Способ по п.29, где клетки содержат Escherichia coli.

32. Способ по одному из пп. 1-31, в котором кровь содержит клетки из нескольких видов.

33. Способ по одному из пп. 1-32, дополнительно включающий извлечение лизата из пробирки для образца после лизиса клеток.

34. Способ по п. 33, дополнительно включающий очистку одной или более нуклеиновых кислот из лизата.

35. Способ по п. 34, дополнительно включающий проведение анализа одной или более нуклеиновых кислот, в котором необязательно:

(а) анализ осуществляют с использованием микромассива или путем

секвенирования одной или нескольких нуклеиновых кислот;

(б) перед осуществлением анализа амплифицируют последовательность - мишень, необязательно с помощью ПЦР.

36. Способ по п. 34 или 35, в котором одна или более нуклеиновых кислот включают ДНК и/или РНК.