Способ выделения звездчатых клеток печени Российский патент 2022 года по МПК C12N5/71 

Изобретение относится к области медицины и предназначено для получения зведчатых клеток печени (ЗКП).

Известен способ получения зведчатых клеток печени путем перфузии печени с использованием ферментов: коллагеназа, проназа Е (Isolation and Time Lapse Microscopy of Highly Pure Hepatic Stellate Cells / Matthias Bartneck, Klaudia Theresa Warzecha, Carmen Gabriele Tag, Sibille Sauer-Lehnen, Felix Heymann, Christian Trautwein, Ralf Weiskirchen, Frank Tacke // Analytical Cellular Pathology. - 2015. P. 1-13.). Недостатком данного способа является значительный расход ферментов во время перфузии печени (длительность перфузии по 4,5 минуты со скоростью 6,5 мл в минуту): Проназа Е 14,6 мг и коллагеназа Р 21,9 U (14,6 мг) https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Roche/Bulletin/1/collprobul.pdf).

Наиболее близким техническим решением к заявляемому является способ получения зведчатых клеток печени методом перфузии печени с предварительным внутривенным введением инкапсулированного в липосомы дихлорметилендифосфа. Данный способ позволяет получить значительное количество звездчатых клеток печени с высоким уровнем жизнеспособности (Isolation and culture of hepatic stellate cells from mouse liver / Wenju Chang, Mengxuan Yang, Lujun Song, Kuntang Shen, Hongshan Wang, Xiaodong Gao, Min Li, Weixin Niu, and Xinyu Qin // Acta Biochimica et Biophysica Sinica. - 2014. - Vol. 46, №4. P 291-298).

Недостатком данного способа является значительный расход ферментов во время перфузии печени (длительность перфузии 8 минут со скоростью 6,5 мл в минуту): Проназа Е 26,0 мг и коллагеназа 26,0 мг).

Задачей данного изобретения является расширение арсенала материалов для получения зведчатых клеток печени (ЗКП).

Технический результат, который будет получен от использования изобретения, заключается в получении ЗКП с более высоким уровнем жизнеспособности, а также с большим количеством полученных клеток на единицу массы печени и с меньшим расходом количества ферментов (Проназы Е и коллагеназы).

Технический результат достигается тем, что в способе выделения звездчатых клеток печени, включающим получение мононуклеарных клеток в растворе ферментов коллагенеза и проназы Е, ресуспендирование в растворе гистоденза, последующего центрифугирования для получения суспензии, добавление в сусуспезию раствора Гейса и повторное центрифугирование для отмывки от гистоденза, удаление супернатанта и ресуспендирование клеток в питательной среде, клети выделяют из латеральной доли печени, тщательного ее измельчают и помещают в раствор ферментов, содержащий 3 мг коллагенеза и 3 мг проназы Е.

Изобретение осуществляется следующим образом.

Эксперименты выполнены на 20 зрелых лабораторных мышах в возрасте 10 недель. Животные содержались в стандартных условиях лабораторного вивария при естественном освещении и сбалансировашшм рационе.

Выделение и идентификация звездчатых клеток печени.

1. Приготовление раствора ферментов: в 10 мл фосфатного буфера (PBS) суспендировали 3 мг коллагеназы, 3 мг проназы Е.

2. Лабораторная мышь наркотизирована, с использованием препарата «Золетил» (10 мг/кг).

3. Оперативным путем вскрыта передняя брюшная стенка и произведено удаление левой латеральной доли печени. Операционная рана ушита.

4. Выделенная доля печени подвергается механическому измельчению с использованием лезвия в стерильной чашке Петри.

5. Тщательно измельченная доля печени помещена в пробирку с ферментами (коллагеназой и проназой Е) в фосфатном буфере (пункт №1).

6. Пробирку с измельченной долей печени и ферментами поместить на водяную баню при 37°С в течение 45 минут, с шейкером со скоростью 1-2 цикла в секунду.

7. Суспензию клеток механически и ферментативно измельченной доли печени профильтровать через фильтры диаметром 70 мкм.

8. По градиенту плотности гистоденза (Histodenz, Sigma) провести разделение клеток. Для этого клетки ресуспендировать в растворе гистоденза (28,7%), суспензию клеток, которую получили, подслаивать к раствору гистоденза (7%). Далее центрифугировать при 600 g 17 мин. ЗКП оказываются в верхнем слое. Клетки собрать в другую пробирку. Суспензию клеток довести до объема 15 мл с помощью раствора Гейса (GBSS, Sigma) и затем цептрифугировать 15 мин. при 800 g с целью отмывки от гистоденза. После удаления супернатанта клетки ресуспендировать в питательной среде.

Выделенные, таким образом, клетки были использованы для дальнейшего иммуногистохимического и иммунофенотипического исследования.

Иммунофенотипирование ЗКП

Полученную суспензию ЗКП иммунофенотипировали непосредственно после выделения методом проточной цитометрии на проточном питометре Navios (Beckman Coulter, США). Производилась оценка эндогенной ретиноидной флуоресценции ЗКП. Для этого использовали моноклональные антитела, которые конъюгированы с флуорохромами (Becton Dickinson, США).

Непосредственно после выделения ЗКП характеризовались положительной флуоресценцией на ретинол и отрицательной на α-SMA-маркер миофибробластов a-гладкомышечный актин. Количество Ретинол положительных клеток составляет 99,4%,

количество SMA+клеток составляет 0,7%. Количество жизнеспособных клеток с положительной флуоресценцией на ретинол составило 98,9%. Количество выделенных ЗКП составило 2,88±0,17 на 1 грамм печени мыши. Достоверность отличий в сравниваемых выборках проведено с применением непараметрического (рангового) метода Манна-Уитни. Статистическая обработка данных проведена с помощью программного пакета SPSS Statistics (версия 17,0).

Примечание: - отличие от прототипа, достоверно с р<0,05

Анализируя данные заявляемого способа, следует отметить, жизнеспособность выделенных звездчатых клеток печени, их количество и чистота достоверно больше, чем в прототипе. При этом расход ферментов коллагеназа и проназа Е меньше, чем в прототипе.

Полученные результаты свидетельствуют, что заявляемый способ (выделение ЗКП без перфузии сосудов печени) эффективнее в плане получения количества звездчатых клеток печени и их жизнеспособности

Настоящее изобретение относится к области клеточной биологии и медицины, в частности к способу получения звёдчатых клеток печени. Для осуществления способа сначала получают мононуклеарные клетки в растворе ферментов коллагенезы и проназы Е. Для этого клетки выделяют из латеральной доли печени, тщательно ее измельчают и помещают в раствор ферментов, содержащий 3 мг коллагенезы и 3 мг проназы Е. Далее клетки ресуспендируют в растворе гистоденза, после чего центрифугируют для получения суспензии. После чего добавляют в суспезию раствор Гейса и повторно центрифугируют для отмывки от гистоденза. Далее осуществляют удаление супернатанта и ресуспендирование клеток в питательной среде. Настоящее изобретение позволяет получить звёздчатые клетки печени с более высоким уровнем жизнеспособности, а также с большим количеством полученных клеток на единицу массы печени и с меньшим расходом количества ферментов. 2 табл., 1 пр.

Способ выделения звездчатых клеток печени, включающий получение мононуклеарных клеток в растворе ферментов коллагеназы и проназы E, ресуспендирование в растворе гистоденза, последующего центрифугирования для получения суспензии, добавление в сусуспезию раствора Гейса и повторное центрифугирование для отмывки от гистоденза, удаление супернатанта и ресуспендирование клеток в питательной среде, отличающийся тем, что выделение клеток осуществляют из латеральной доли печени, тщательного ее измельчения и помещения в раствор ферментов, содержащий 3 мг коллагеназы и 3 мг проназы Е.