Способ выделения кардиомиоцитов из ткани сердца человека Российский патент 2021 года по МПК G01N33/48 G09B23/28 C12N5/77 

Изобретение относится к области медицины, и может быть использовано при проведении в биофизических, биологических лабораториях для осуществления различных исследований прикладного и фундаментального характера.

Очень актуально на сегодняшний день изучение действия различных препаратов, назначаемых пациентам, в том числе антиаритмиков, на потенциал-зависимые ионные каналы человеческих кардиомиоцитов для выявления наиболее эффективных на клеточном уровне и даже на молекулярном. Изолированные человеческие кардиомиоциты можно использовать для исследования на предмет изменения морфологических особенностей, например, при ГКМП (гипертрофическая кардиомиопатия), исследование при возникновении аритмий особенностей изменения в функциональности потенциал зависимых ионных каналов, которые играют важнейшую роль в генерации потенциала действия, т.е. в формировании электрического возбуждения сердечной ткани. Также различные каналопатии связаны с нарушением работы определенных ионных каналов, доказательство которому можно найти, исследовав электрофизиологические свойства потенциал-зависимых ионных каналов изолированных кардиомиоцитов пациента с помощью метода пэтч-кламп.

Известен способ получения клеточных масс кардиомиоцитов, получаемых из плюрипотентных стволовых клеток. Способ предусматривает дифференцировку и индукцию плюрипотентных стволовых клеток с получением клеточных масс кардиомиоцитов. Далее проводят диспергирование клеточных масс до отдельных клеток и их культивирование в культуральной среде в условиях отсутствия сыворотки для их повторной агрегации (Патент РФ 2467066, МПК C12N 5/04, публ. 2012).

Недостатком такого метода является высокая стоимость (использование факторов роста, сывороток, сред для поддержания жизнеспособности дифференцированных кардиомиоцитов), длительный период получения взрослых кардиомиоцитов для исследований, поскольку для получения изолированных кардиомиоцитов после дифференцировки полученный слой клеток диспергируют с помощью ферментов и снова высевают на подложку в гораздо меньшей концентрации. Требует много времени (от 30 до 40 дней) для дифференцировки и восстановление клеток после диспергирования. Выход кардиомиоцитов при диспергировании небольшой, т.к. наряду с кардиомиоцитами остаются и другие клетки.

Наиболее близким является способ выделения кардиомиоцитов из ткани-биоптата сердца человека, включающий забор биоптата, размещение его в буферном растворе, не содержащим Са²⁺, измельчение биоптата, с последующей перфузией в чистом буферном растворе того же состава, перенос фрагментов биоптата в ферментативный буфер, содержащий смесь ферментов, один из которых коллагеназа, инкубирование с последующим удалением супернатанта (надосадочной жидкости) и повторным проведением инкубирования в свежем растворе ферментативного буфера с тем же составом, в затем проведение инкубирования ферментативным буфером, содержащим только коллагеназу, выполнение фильтрации клеточной суспензии и проведение центрифугирования, после которого удаляют супернатант и повторно суспензируют осажденные миоциты, вводят в суспензию Са²⁺ в виде водного раствора CaCl₂ (A modifed method for isolation of human cardiomyocytes to model cardiac diseases. Guang-ran Guo, Liang Chen, Man Rao, Kai Chen, Jiang-ping Song and Sheng-shou Hu. Journal of Translational Medicine (2018) 16:288). Для эффективного осуществления способа необходимо наличие слайсера для биоптата, чтобы нарезать его на 200 мкм толщиной, наличие буферного раствора для транспортировки и быстрая доставка из операционной в лабораторию для выделения кардиомиоцита из биоптата сердца.

Недостатком этого способа является высокая стоимость его проведения, в методе используется специальный слайсер для нарезки сердечного биоптата на части толщиной 200 мкм и специальный буфер для транспортировки биоптата, кроме того конечный выход кардиомиоцитов небольшой, а время, в течении которого можно проводить выделение кардиомиоцитов из биоптата ограничено.

Задачей предлагаемого изобретения является устранение указанных недостатков, создание более простого, экономичного способа получения изолированных жизнеспособных кардиомиоцитов из биоптата человеческого сердца.

Способ включает забор биоптата, размещение его в буферном растворе, не содержащем Са²⁺, измельчение биоптата, с последующим переносом в чистый буферный раствор того же состава, перемешивание, затем перенос фрагментов биоптата в ферментативный буфер, содержащий смесь ферментов, один из которых коллагеназа, инкубирование при 37°С при перемешивании с последующим удалением надосадочной жидкости и повторным проведением инкубирования в свежем растворе ферментативного буфера с тем же составом и в том же режиме, а затем осуществление инкубирования в ферментативном буфере, содержащем только коллагеназу и с последующей фильтрацию клеточной суспензии, проведение центрифугирования, затем удаление надосадочной жидкости и введение чистого буферного раствора, не содержащего Са²⁺, повторное суспензирование осажденных кардиомиоцитов, затем введение Са²⁺ в виде водного раствора CaCl₂. Новым является то, что биоптат измельчают до размера 1-2 мм, а в качестве ферментативного буфера из смеси ферментов используют смесь коллагеназы 4 типа в концентрации 1,02-1,42 мг/мл и проназы в концентрации 0,17-0,2 мг/мл. Ферментативный буфер, содержащий только коллагеназу 4 типа используют с той же ее концентрацией 1,02-1,42 мг/мл, при этом каждое инкубирование проводят в течение 7-13 минут. Инкубирование в ферментативном буфере, содержащем только коллагеназу осуществляют, по меньшей мере, 3 раза по 7-15 минут, а центрифугирование проводят при 800 об/мин в течение 1-3 минут.

То, что в предлагаемом способе выбирается 1-2 мм измельчение биоптата и обработка ведется в предлагаемых в ферментных буферах и режимах обработки биоптата позволяет получить большой выход конечного продукта, даже при значительной по времени транспортировке.

Способ осуществляется следующим образом.

Иссечение биоптата сердца человека происходит по протоколу по стандартной методике, затем его переносят в кардиоплегический раствор.

Предварительно готовят рабочее пространство, для этого ламинар обжигают ультрафиолетом, инструменты для выделения и стеклянный стакан с магнитным элементом стерилизуют в автоклаве или используют водяную баню.

Биоптат переносят с помощью пинцета из банки с кардиоплегическим раствором в подготовленную чашку Петри с буферным раствором, не содержащим Са²⁺. У биоптата отделяют жир и соединительную ткань по стандартному методу с помощью пинцета и ножниц. Затем биоптат измельчают до фракций размером 1-2 мм.

Пипеткой Пастера все фракции переносят в подготовленный стакан с чистым буфером, не содержащем Са²⁺. Осуществляют медленное перемешивание, например, в стакане на магнитной мешалке при скорости 250-350 об/мин в течение 9-10 минут, или на водяной бане. Таким образом фракции биоптата промываются от остатков кардиоплегического раствора.

В это время готовят раствор ферментативного буфера, содержащего коллагеназу 4 типа в концентрации 1,02-1,42 мг/мл и проназу в концентрации 0,17-0,2 мг/мл, добавляют ферментативный буфер к фракциям биоптата, инкубируют при перемешивании при 37°С в течение 7-13 минут. Данное действие повторяют, слив первую порцию надосадочной жидкости.

Далее цикл инкубирования при 37°С при постоянном перемешивании продолжают в ферментативном буфере, содержащем только коллагеназу 4 типа концентрацией 1,02-1,42 мг/мл, по меньшей мере, три раза по 7-15 минут. Надосадочную жидкость отбирают и добавляют новую порцию ферментативного буфера того же состава после каждого цикла инкубирования.

Для увеличения конечного выхода кардиомиоцитов, по окончании времени инкубации с ферментативным буфером, раствор с фракциями биоптата можно тритурировать с помощью пипетки Пастера 10-15 раз http://www.worthington-biochem.com./NCIS/default.html).

Надосадочную жидкость фильтруют с помощью фильтра с размером пор 100 мкм, затем центрифугируют при 800 об/мин в течение 1-3 минут.

После центрифугирования удаляют надосадочную, а осадок повторно суспензируется в чистом буферном растворе, не содержащим Са²⁺.

Последним этапом является введение ионов кальция в суспензию кардиомиоцитов в виде водного раствора CaCl₂.

После данного этапа через полчаса выделенные кардиомиоциты человека готовы к исследованиям в соответствии с поставленными задачами.

Пример 1.

У пациента А, 54 года, с диагнозом ИБС во время операции по коронарному шунтированию после искусственного кровообращения иссекли биоптат размером 5 мм × 7 мм от правого предсердия.

Транспортировка биоптата производилась на холоде в консервирующем растворе Кустодиол в течение 1.5 часов. Биоптат был измельчен в чистом буферном растворе, не содержащем Са²⁺, на фракции размером 1 мм × 1 мм, затем перенесли в чистый буферный раствор того же состава и инкубировали при перемешивании в чистом буферном растворе в течение 10 минут. Затем инкубировали при перемешивании в растворе с проназой с концентрацией 0,17 мг/мл и коллагеназой IV типа концентрацией 1,02 мг/мл. Длительность первого раза составляла 13 минут, второго раза -10 минут.

В ферментативном буфере с коллагеназой IV типа с концентрации 1,02 мг/мл инкубировали 4 раза по 9 минут, а последний пятый раз в течение 15 минут.

Суспензию с клетками центрифугировали со скоростью 800 об/мин? в течение 3 минут.

Введение в суспензию кардиомиоцитов ионов Са²⁺ проводили путем введения раствора CaCl₂ с концентрацией 30 ммоль/л в дозах 0,5; 1; 2; 4 мкл, которые вводили через каждые 5 минут, доводя до концентрации ионов Са²⁺ 0,25 ммоль/л в суспензии клеток объемом 1 мл.

Получили кардиомиоциты палочковидной формы с поперечной полосатостью, соответствующие по форме предсердным кардиомиоцитам.

Из полученных клеток с помощью метода локальной фиксации потенциала были исследованы электрофизиологические характеристики быстрых натриевых и медленных калиевых каналов. Полученные данные позволили установить, что не было отклонений в работе потенциалзависимых ионных каналов предсердных кардиомиоцитов пациента, полученных из биоптата пациента в самом начале операции по коронарному шунтированию.

Пример 2.

Пациента Л, возраст 62 года, Диагноз: ИБС

Биоптат размером 10 мм × 7 мм был получен до искусственного кровообращения, транспортировка биоптата в научную лабораторию производилась в консервирующем кардиоплегическом растворе Кустодиол. По предлагаемому методу выделения кардиомиоцитов из биоптата, измельчение произвели в буферном растворе, не содержащем Са²⁺, на фракции размером 1-2 мм.

Измельченные фракции сердечного биоптата отмывали от кардиоплегического раствора в буфере того же состава в течение 10 минут.

Раствор смеси ферментов содержал 0,17 мг/мл проназы и 1,42 мг/мл коллагеназой IV типа, при этом инкубировали при перемешивании в данном растворе смеси ферментов 2 раза по 10 минут.

В буферном растворе с коллагеназой концентрацией 1,42 мг/мл инкубировали при перемешивании первый раз 11 минут, остальные 4 раза в течение 9 минут. Суспензию с клетками центрифугировали при скорости 800 об/мин в течение 3 минут. Введение в суспензию кардиомиоцитов Са²⁺ проводили стандартно согласно предлагаемому способу.

Получили кардиомиоциты палочковидной формы с поперечной полосатостью, соответствующие по форме предсердным кардиомиоцитам Выделенные кардиомиоциты использовали в исследовании потенциал-зависимых быстрых калиевых каналов задержанного выпрямления с помощью метода локальной фиксации потенциала (метод пэтч кламп). Исследование показало, что в кардиомиоцитах пациента, полученных из биоптата, взятого до искусственного кровообращения во время операции, работа калиевых каналов задержанного выпрямления не была нарушена.

Пример 3.

У пациента Ж, в возрасте 72 лет с диагнозом ИБС стенокардия 3Ф К, иссекли два биоптата размерами 20 мм × 30 мм.

По предлагаемому способу выделения кардиомиоцитов из биоптата человека, измельчение произвели в буферном растворе, не содержащем Са²⁺, биоптаты измельчили до фракций размером 2 мм. Перемешивание производилась в буферном растворе, не содержащем Са²⁺, дважды по 9 минут.

Ферментативный буфер содержал концентрации ферментов равные 0,2 мг/мл проназы и 1,3 мг/мл коллагеназы IV типа, инкубирование при перемешивании в смеси ферментов проводилось в течение 7 минут 2 раза.

Инкубирование при перемешивании в ферментативном буфере, содержащем только коллагеназу IV типа проводилось также в концентрации 1,3 мг/мл 3 раза, в течение 7 минут каждый раз.

Центрифугировали в режиме скорости 800 об/мин в течение 1 минуты. Ресуспензирование и добавление кальция проводили по предлагаемому способу.

Получили кардиомиоциты палочковидной формы с поперечной полосатостью, соответствующие по форме предсердным кардиомиоцитам. Жизнеспособность полученных данным методом кардиомиоцитов позволила изучить ионные токи быстрых натриевых каналов методом локальной фиксации потенциала (метод пэтч-кламп). Это исследование показало, что отклонений от нормы в работе быстрых натриевых каналов, отвечающие за передний фронт волны возбуждения в сердце, до искусственного кровообращения не было.

По предлагаемому способу проведены выделения кардиомиоцитов 24 биоптатов сердца человека, что дало возможность провести фундаментальные и прикладные исследования электрофизиологических свойств ионных каналов кардиомиоцитов.

В результате выделения кардиомиоцитов данным способом, были получены палочковидные кардиомиоциты с типичной поперечной полосатостью, а также исследованы электрофизиологическим методом локальной фиксации потенциала (метод пэтч кламп), с помощью которого были получены электрические характеристики специфичных для кардиомиоцитов потенциал-зависимых ионных каналов. Были получены активационные характеристики быстрых натриевых и медленных калиевых ионных каналов, которые отвечают за нормальную проводимость возбуждения по сердцу.

Предлагаемый способ позволяет получить пациент-специфичные кардиомиоциты из биоптата сердца для дальнейшего использования их в исследованиях, вносящих вклад в постановку диагноза при заболеваниях сердца, для проведения фундаментальных исследований, а также для изучения влияния различных препаратов как на структуру клетки, так и на ионные каналы, характерные только для человеческих кардиомиоцитов.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано при проведении в биофизических, биологических лабораториях. Способ включает: забор биоптата, размещение его в буферном растворе, не содержащем Са²⁺, измельчение биоптата, с последующим переносом в чистый буферный раствор того же состава, перемешивание, затем перенос фрагментов биоптата в ферментативный буфер, содержащий смесь ферментов, один из которых коллагеназа, инкубирование при 37°С при перемешивании с последующим удалением надосадочной жидкости и повторным проведением инкубирования в свежем растворе ферментативного буфера в том же режиме. Затем осуществление инкубирования в ферментативном буфере, содержащем только коллагеназу, и с последующей фильтрацией клеточной суспензии, проведение центрифугирования, затем удаление надосадочной жидкости и введение чистого буферного раствора, не содержащего Са²⁺, повторное суспензирование осажденных кардиомиоцитов, затем введение водный раствора CaCl₂. При этом биоптат измельчают до размера 1-2 мм, а в качестве ферментативного буфера из смеси ферментов используют смесь коллагеназы 4 типа в концентрации 1,02-1,42 мг/мл и проназы в концентрации 0,17-0,2 мг/мл. Ферментативный буфер, содержащий только коллагеназу 4 типа, используют с той же ее концентрацией 1,02-1,42 мг/мл, при этом каждое инкубирование проводят в течение 7-13 минут. Инкубирование в ферментативном буфере, содержащем только коллагеназу, осуществляют, по меньшей мере, 3 раза по 7-15 минут, а центрифугирование проводят при 800 об/мин в течение 1-3 минут. Предлагаемый способ более простой, экономичный и обеспечивает получения изолированных жизнеспособных кардиомиоцитов из биоптата человеческого сердца. 3 пр.

Способ выделения кардиомиоцитов из ткани сердца человека, включающий забор биоптата, размещение его в буферном растворе, не содержащем Са²⁺, измельчение биоптата, с последующим переносом в чистый буферный раствор того же состава, перемешивание, затем перенос фрагментов биоптата в ферментативный буфер, содержащий смесь ферментов, один из которых коллагеназа, инкубирование при 37°С при перемешивании с последующим удалением надосадочной жидкости и повторным проведением инкубирования в свежем растворе ферментативного буфера в том же режиме, а затем осуществление инкубирования в ферментативном буфере, содержащем только коллагеназу, и с последующей фильтрацией клеточной суспензии, проведение центрифугирования, затем удаление надосадочной жидкости и введение чистого буферного раствора, не содержащего Са²⁺, повторное суспензирование осажденных кардиомиоцитов, затем вводят водный раствор CaCl₂, отличающийся тем, что биоптат измельчают до размера 1-2 мм, а в качестве ферментативного буфера из смеси ферментов используют смесь коллагеназы 4 типа в концентрации 1,02-1,42 мг/мл и проназы в концентрации 0,17-0,2 мг/мл, а ферментативный буфер, содержащий только коллагеназу 4 типа, используют с той же ее концентрацией, при этом каждое инкубирование проводят в течение 7-13 минут, а инкубирование в ферментативном буфере, содержащем только коллагеназу, осуществляют, по меньшей мере, 3 раза по 7-15 минут, центрифугирование осуществляют при 800 об/мин в течение 1-3 минут.