СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГКР-ЧИПА ДЛЯ ИММУНОХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА Российский патент 2022 года по МПК G01N21/65 

Изобретение относится к созданию чипа для иммунохимического анализа (ИХА) с применением эффекта гигантского комбинационного рассеяния (ГКР).

В настоящее время иммуночипы находят применение в скрининге антител, обнаружении наркотических веществ, диагностических системах для многих заболеваний (малярии, СПИДа, туберкулеза и т.д.) и многих других областях.

В настоящее время развитие ИХА направлено не только в сторону повышения точности определения искомого вещества, но и на уменьшение времени, затрачиваемого на получение результатов и возможность проведения анализа вне стен лаборатории. На практике уже нашли широкое применение системы для быстрого скрининга - тест-полоски (стрип-тесты) [М.-С. Hennion, D. Barcelo «Strengths and limitations of immunoassays for effective and effcient use for pesticide analysis in water samples: A review», Analytica Chimica Acta, 1998, 362, 3-34]. Но, несмотря на высокую скорость получения аналитического отклика, они имеют относительно невысокую чувствительность и служат лишь для качественного определения вещества в пробе. Ограничения мобильности многих методов ИХА из-за громоздкости оборудования, применяемого для детекции иммунных комплексов, дали стимул многим исследователям к разработке портативных оптических систем, интегрированных с иммуночипами (иммуносенсорами) [D. Sugumar, L. Kong «Lab-on-Chip Devices for Immunoassays)), In: Li D. (eds) Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics, 2015, Springer, New York, NY. https://doi.org/10.1007/978-1-4614-5491-5_775].

Разработано большое количество различных ГКР-субстратов, предназначенных для решения разнообразных задач по идентификации веществ с применением ИХА. Например, в патентной заявке [GB 2439656 А, 2006 «Detection of enhanced multiplex signals by surface enhanced raman spectroscopy (sers)»] для таргетного захвата антигенов из аналита применяют чипы с иммобилизованными на их поверхностях меченными ГКР-репортерами антителами. Для получения сигнала используют детектирующие антитела, ковалентно связанные с наночастицами золота. Недостатком этого изобретения является трудновоспроизводимая методика синтеза конъюгатов антител и наночастиц серебра.

В качестве прототипа предлагаемого изобретения взят способ получения ГКР-чипа, описанный в патенте [0587008 А1, 1994 «Surface-enhaced raman spectroscopy immunoassay))]. На очищенную поверхность предметных стекол осаждались частицы серебра, полученные путем восстановления реагента Толленса D-глюкозой. Таким образом была сформирована наноостровковая пленка металла толщиной порядка 100 нм. Чипы показали хорошее усиление сигнала комбинационного рассеяния на примере динитробензола и его конъюгата с бычьим сывороточным альбумином. Была продемонстрирована принципиальная возможность определения соединений на примере изменения ГКР-спектров 2-[4-гидроксифенилазо]бензойной кислоты вследствие ее специфического взаимодействия с авидином. К недостаткам изобретения следует отнести:

• достаточно сложную и трудновоспроизводимую методику получения ГКР-поверхности;

• наноостровковая серебряная пленка, получаемая на предметных стеклах, обладает неоднородными свойствами, что может привести к невоспроизводимости результатов анализа;

• не приведены статистические данные о воспроизводимости сигнала с применением получаемых ГКР-чипов, что ставит под сомнение возможность их реализации в количественном ИХА;

• короткий срок хранения - 1 неделя.

Техническим результатом предложенного изобретения является совершенствование способа получения ГКР-чипа для ИХА, повышение стабильности и воспроизводимости получаемых результатов анализа, а также увеличение срока хранения.

Технический результат достигается путем получения ГКР-чипа для ИХА, представляющего собой кремниевую подложку, модифицированную веществами следующей структуры:

где Х=-Cl, -Br, -I, -F, -ОСН₃, -ОС₂Н₅; Y=-NH₂, -CN, -SH; n=3-10, с иммобилизованными на ее поверхности в двух зонах коллоидными частицами серебра. Коллоидный раствор серебра для иммобилизации получен путем восстановления нитрата серебра цитратом натрия и его последующим концентрированием. В качестве метки используют вещество, обладающее хорошо различимым ГКР-спектром и хорошо связывающееся с белковыми молекулами.

Изобретение характеризуется следующими графическими материалами:

• Фиг. 1 - Поверхность кремниевой подложки после иммобилизации на нее частиц серебра из коллоидного раствора;

• Фиг. 2 - ГКР-спектр тетраметилродаминизотиоцианата (ТРИТЦ), полученного на изготовленных ГКР-субстратах;

• Фиг. 3 - Распределение величины относительной интенсивности сигнала первой и второй зон внутри партии ГКР-подложек. Интенсивность спектров оценена по величине пика спектра ТРИТЦ 1641 см^-1. По оси абсцисс отложены отношения интенсивностей сигнала первой и второй зон, по оси ординат - количество подложек, соответствующих этим отношениям;

• Фиг. 4 - График зависимости интенсивности ГКР-сигнала от концентрации конъюгата иммуноглобулина кролика с ТРИТЦ (IgG_кр-ТРИТЦ) в координатах lgI (-lgC).

Пример 1.

Приготовление коллоидного раствора нитрата серебра

5,1 мг нитрата серебра марки х.ч. растворяют в 30 мл деионизированной воды. 9,8 мг цитрата натрия растворяют в 300 мкл деионизированной воды. Раствор нитрата серебра доводят до кипения при интенсивном перемешивании и к нему по каплям добавляют раствор цитрата натрия. Реакцию проводят в течение 60 минут. После этого полученный коллоидный раствор охлаждают до комнатной температуры и концентрируют в 2-50 раз в ячейке на мембране с размером пор 4 нм.

Пример 2

Модифицирование кремниевых подложек

Кремниевые подложки обрабатывают ультразвуком в аммиачной смеси в течение 30 минут, затем тщательно промывают деионизированной водой.

Промытые подложки обрабатывают ультразвуком в 0,1-15% водном растворе вещества структуры:

где Х=-Cl, -Br, -I, -F, -ОСН₃, -ОС₂Н₅; Y=-NH₂, -CN, -SH; n=3-10, после чего тщательно промывают деионизированной водой.

Пример 3

Иммобилизация частиц серебра на модифицированную кремниевую поверхность

На каждую кремниевую подложку из примера 2 наносят по 2 одинаковые капли коллоидного раствора серебра из примера 1. Иммобилизацию частиц серебра проводят в течение 2 часов в закрытой чашке Петри, после чего подложки высушивают и промывают водой. Поверхность полученных ГКР-субстратов охарактеризована при помощи двухлучевого просвечивающего электронного микроскопа (Фиг. 1).

Пример 4

Получение сигнала на ГКР-субстратах

Полученные ГКР-субстраты погружают в 0,02% водный раствор ТРИТЦ на 5 минут, после чего ополаскивают в воде, высушивают на воздухе и проводят измерение сигнала при длине волны возбуждающего лазера 523 нм (Фиг. 2).

Пример 5

Характеристика воспроизводимости сигнала

Проводят статистическую обработку относительной интенсивности сигнала первой и второй зоны для 100 ГКР-подложек по величине пика 1641 см^-1 с применением методики, описанной в примере 4 (Фиг. 3). Из рисунка видно, что для ГКР-субстратов, полученных заявляемым способом, отклонение отношения интенсивностей сигналов двух зон не превышает 20% для каждой из подложек.

Пример 6

Приготовление конъюгата IgG_кр-ТРИТЦ

IgG_кр был выбран в качестве модели из-за того, что антитела, применяемые во всех известных схемах ИХА, относятся к этой фракции белков.

1 rp IgG_кр растворяют в 5 мл физиологического раствора и доводят рН до 9,0, затем при интенсивном перемешивании к нему добавляют по каплям 6 мл свежеприготовленного раствора ТРИТЦ в ДМСО (с=2,5 мг/мл). Реакцию проводят 3 часа при рН 9,0. Реакционную смесь отделяют от непрореагировавшего ТРИТЦ диализом против PBS. В результате получается раствор меченого IgG_кр-ТРИТЦ в PBS с концентрацией белка 1 мг/мл и соотношением белок/краситель - 1/4.

Пример 7

Определение зависимости интенсивности ГКР-сигнала от концентрации конъюгата IgG-ТРИТЦ

Делают серию кратных разведений раствора IgG_кр-ТРИТЦ из примера 6 путем его разбавления PBS в 2 раза. Таким образом получают растворы меченого белка с концентрациями от 1 до 2,0×10^-3 мг/мл. В эти растворы погружают подложки аналогично примеру 4. На основании полученных данных построен график зависимости интенсивности ГКР-сигнала от концентрации конъюгата IgG_кр-ТРИТЦ в логарифмических координатах (Фиг. 4). Из рисунка видно, что график имеет прямолинейный участок при значениях -lgC от 0 до 2, что соответствует диапазону концентраций белка от 1 до 8,0×10^-3 мг/мл. Это говорит о том, что применение при таких условиях меченых иммунореагентов делает возможным реализацию различных схем твердофазного ИХА (прямой, сэндвич, конкурентный) в количественном анализе. В конкретном случае предел обнаружения белкового соединения будет составлять 8,0×10^-3 мг/мл, так как после этой точки график выходит на плато. Этот предел можно будет впоследствии снизить путем подбора другого более чувствительного красителя или методики мечения иммунореагентов.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к оборудованию, а именно созданию чипа для иммунохимического анализа (ИХА) с применением эффекта гигантского комбинационного рассеяния (ГКР). Способ получения ГКР-чипа включает обработку кремниевой подложки путем ее модифицирования веществом структуры:

при воздействии ультразвука и последующей мобилизации наночастиц серебра из концентрированного коллоидного раствора. Приготовление коллоидного раствора включает растворение 5,1 мг нитрата серебра в 30 мг деионизированной воды, растворение 9,8 мг цитрата натрия в 300 мкл деионизированной воды, доведение раствора нитрата серебра до кипения и добавление к нему по каплям раствора цитрата натрия, охлаждение полученного коллоидного раствора до комнатной температуры и последующее его концентрирование в 2-50 раз. Изобретение обеспечивает получение технического результата, заключающегося в повышении качества анализа за счет повышения точности определения искомого вещества, уменьшение времени, затрачиваемого на получение результатов, и повышение удобства пользования при одновременном увеличении срока хранения полученных результатов. 4 ил., 2 табл., 7 пр.

Способ получения ГКР–чипа для иммунохимического анализа путем обработки кремниевой подложки, отличающийся тем, что ее модифицируют веществом структуры:

при воздействии ультразвука и последующей иммобилизации наночастиц серебра из концентрированного коллоидного раствора, приготовление которого включает растворение 5,1 мг нитрата серебра в 30 мл деионизированной воды, растворение 9,8 мг цитрата натрия в 300 мкл деионизированной воды, доведение раствора нитрата серебра до кипения и добавление к нему по каплям раствора цитрата натрия, охлаждение полученного коллоидного раствора до комнатной температуры и его концентрирование в 2-50 раз.