СПОСОБ ЗАЩИТЫ ОВОЩНЫХ КУЛЬТУР ОТ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ Российский патент 2022 года по МПК A01N25/00 

Изобретение относится к области защиты растений, в частности к способу применения комплекса фосфодиэстераз, экзонуклеаз, эндонуклеаз и рибонуклеаз, для защиты овощных культур от вирусов в условиях защищенного грунта.

Способ заключается в опрыскивании овощных культур препаратом, включающим в себя ферменты бактериального синтеза и активатор.

Аналогом изобретения является способ применения панкреатической рибонуклеазы, обладающей гидролитическими свойствами в отношении фитопатогенных вирусов, что позволяет замедлить или предотвратить размножение вирусов [1].

Недостатком способа применения панкреатической рибонуклеазы в качестве противовирусного средства защиты растений является высокая себестоимость фермента, производство которого в промышленных масштабах экономически не целесообразно.

Еще одним аналогом является способ применения средства защиты растений от вирусных инфекций и профилактики заболеваний, обладающий широкой областью применения, высокой эффективностью защиты, экологической безопасностью и безвредностью для человека, животных, растений. При данном способе в качестве ингибитора репликации вирусов используют продуцируемый бактериями Bacillus pumilus внеклеточный фермент - бактериальную рибонуклеазу Bacillus pumilus [2].

Недостатком этого способа является отсутствие возможности экономически выгодного промышленного производства для удовлетворения потребностей сельхозтоваропроизводителей, а также наличие результатов исследований только по ингибирующей способности фермента.

Наиболее близок к заявленному способу, является способ применения бактериальной нуклеазы Serratia marcescens для защиты картофеля от вирусов [3, 4].

Недостатком данного способа является трудоемкость наработки, отсутствие способа промышленного производства, использование для получения бактериальной нуклеазы Serratia marcescens трансгенных растений, проблема безопасности которых недостаточно изучена и дороговизной осуществления технологии, а также наличие условной патогенности применяемого штамма-продуцента ферментов бактерии Serratia marcescens.

Перечисленные недостатки различных способов защиты овощных культур, основанных на применении ферментов с гидролитической активностью в отношении нуклеиновых кислот, существенно ограничивают возможности применения данных способов для защиты растений, использующихся в пищевых целях, от вирусиндуцированных заболеваний.

Технической задачей предлагаемого изобретения является разработка способа защиты растений от вирусных инфекций и профилактики вирусиндуцированных заболеваний, адаптированного под условия производства, оказывающего высокоэффективную защиту от вирусов, обладающего экологической безопасностью и стимулирующим действием на развитие растений благодаря комплексу микроэлементов.

Цели достигают тем, что в качестве противовирусного средства используют продуцируемый несовершенным грибом Penicillium citrinum внеклеточный фермент-грибковую нуклеазу P1 P. citrinum. Использовался Penicillium citrinum, полученный без применения трансгенных растений, который нарабатывался в достаточном для широкого применения количестве, отличающийся от аналогов степенью очистки и наличием ферментов, оказывающих гидролитическое действие не только на ДНК/РНК, но и на липопротеиды, в частности на белковую оболочку вирусов (капсид). Активацию фермента проводили активатором (далее по тексту активатор), в состав которого входят сульфат магния, оксид кремния, оксид кальция, хелат магния, хелат железа.

Отличительной особенностью настоящего изобретения являются подходы к способам обработки, в частности расчет кратности обработок и концентрации рабочего раствора с учетом степени распространения вирусной инфекции в тепличном комплексе, с применением молекулярно-генетических методов контроля вирусной нагрузки, как в помещениях (оборудование, инвентарь, вспомогательные материалы, стены, настилы), так и в растениях. Определена концентрация активатора, которая необходима для активации фермента.

Технический результат достигается следующим образом.

Скрининг на наличие/отсутствие вирусов в растениях проводят раз в две недели. В качестве исследуемого материала используют листья растений и смывы с поверхностей помещений. После выявления РНК вирусов в исследуемом материале до обнаружения внешних проявлений признаков инфекции исследования производили еженедельно. От момента выявления РНК в исследуемом материале, до появления признаков инфекции проходит инкубационный период развития вирусной инфекции, который в среднем составляет до 3 недель.

Заявляемое техническое решение характеризуется примерами.

Пример 1. Рассаду огурца, инфицированную вирусом зеленой крапчатой мозаики огурца (ВЗКМО), обрабатывали 1 литром рабочего раствора приготовление, которого осуществляли смешиванием 150 мг (15000 ЕА) ферментов с 3 г активатора в теплой воде (37-50°С). Обработки проводили ежедневно для недопущения развития внешних признаков инфекции. До начала обработки проводили отбор проб для определения вирусной нагрузки. Ее значение составляло 7,87×10¹⁰ После 3 обработок на контрольном и опытном участках были обнаружены следы вируса (ВЗКМО). После 4 обработок количество вирусных копий в смывах с рабочих поверхностей и настила общей площадью 20 см² составило - 0,068×10⁶ копий (Фиг. 1). Полученные в ходе эксперимента данные, свидетельствую о снижении числа инфицированных растений.

Пример 2. Растения огурца, выращиваемые в личном подсобном хозяйстве на участке 8 м² обрабатывали 10 л рабочего раствора, используя 1,5 г ферментов (150 TEA) и 30 г активатора. Обработки проводили еженедельно для профилактики развития вируса мозаики огурца (ВОМ). После 5 недель обработок на исследуемом участке наблюдается значительное снижение растений с поражениями верхнего яруса (Фиг. 2).

Пример 3. Один из участков тепличного комбината, на котором выращивались томаты, инфицированные вирусом желтой курчавости листьев томата (ВЖКЛТ), обрабатывали 100 л рабочего раствора: 15 г ферментов (1,5 MEA) и 300 г активатора. Томаты обрабатывали еженедельно опрыскиванием листовых пластин. Наблюдалось отрастание здоровых верхушек и восстановление процессов цветения и плодообразования (Фиг. 3).

Пример 4. Растения огурца, выращиваемые на площади в 1 га тепличного комбината, инфицированные ВЗКМО, обрабатывались 1000 л рабочего раствора для приготовления, которого использовали 140 г ферментов (14 MEA) и 1000 г активатора. При еженедельной обработке растений удавалось добиться отрастания здоровых верхушек, восстановления процессов оплодотворения и плодообразования. Лабораторные исследования показали достоверное снижение вирусной нагрузки в опытных группах, которые обрабатывались заявленным способом (Фиг. 4).

Пример 5. Растения томата, инфицированные ВЖКЛТ, 2 раза в неделю обрабатывали 5 литрами рабочего раствора: 0,75 г фермента (75000 ЕА) и 15 г активатора. По прошествии 5 недель обрабатываемые растения значительно превосходили по высоте и облиственности растения, которые не были подвержены обработке (Фиг. 5).

Известно, что Penicillium citrinum продуцирует фермент гидролизующий нуклеиновые кислоты вирусов (РНК или ДНК), кроме того, данный микроорганизм продуцирует ряд других ферментов, которые гидролизуют оболочку вирусов, состоящую как правило из липопротеидов, то есть сложных белков, не является токсином для человека и животных. Заявленный способ защиты овощных культур от вирусных инфекций заключается в следующем: фермент с активатором применяют в производственных условиях, с использованием интерплантинга, при выращивании овощных культур гидропонным методом, а также в производственных условиях без применения интерплантинга с применением гидропонного метода выращивания.

Для приготовления рабочего раствора фермента (активностью 14 MEA) и активатора фермента, предварительно наливают 10 л воды, температура которой от 37 до 40°С; измеряют рН, оптимальным считается рН 8, допустимым 7-9. Пакет с активатором вскрывают и вносят в воду до полного растворения, после чего пакет с ферментом вскрывают и вносят в раствор с активатором, перемешивая до полного растворения. Затем полученный концентрированный раствор выливают в емкость с водой доводя объем до 1000 л.

Обработку осуществляют методом опрыскивания листовых пластин в концентрациях, приведенных в таблице 1.

Список литературы

1. Мартынова Р.В. Ингибирующее действие панкреатической рибонуклеазы на фитопатогенные вирусы // Биологические исследования на Дальнем Востоке. Владивосток: ДВНЦ АН СССР, 1975. - С. 149-152.

2. Шарипова М.Р., Балабан Н.П., Марданова A.M., Тойменцева А.А. Применение фермента рибонуклеазы bacillus pumilus в качестве ингибитора фитопатогенных вирусов. Патент 2542480 RU от 20.05.2015.

3. Леонова Н.С., Салганик Р.И. Применение бактериальной эндонуклеазы для оздоровления картофеля от вирусов / Сибирский вестник сельскохозяйственной науки, 1991, №5, С. 25-28.

4. Блажко Н.В., Вышегуров С.X., Хрипко Ю.И., Рябинина В.А. Способ защиты овощных культур от инфекций, вызываемых вирусами. Патент 2720423 RU от 1.02.2019.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ защиты овощных культур от вирусных инфекций, заключающийся в опрыскивании овощных культур водным раствором, включающим в себя ферменты бактериального синтеза и активатор, который состоит из сульфата магния, оксида кремния, оксида кальция, хелата магния, хелата железа. Данный способ позволяет значительно снижать вирусную нагрузку в отдельно взятом растении, но и препятствует широкому распространению заболевания в теплице. В свою очередь, микроэлементы, входящие в состав активатора, оказывают стимулирующее действие на рост и развитие растений. 5 ил., 1 табл., 5 пр.

Способ защиты овощных культур от вирусных инфекций состоит в опрыскивании растений рабочим раствором, состоящим из воды от 1 л до 1000 л, температура которой варьирует 37-40°С, внеклеточного фермента продуцента Penicillium citrinum в концентрации от 15 TEA до 14 MEА с добавлением активатора фермента в количестве от 3 до 1000 г, включающим сульфат магния, оксид кремния, оксид кальция, хелат магния, хелат железа.