ШТАММ ВИРУСА ЗЕЛЕНОЙ КРАПЧАТОЙ МОЗАИКИ ОГУРЦА ВИРОГ-43М ДЛЯ ВАКЦИНАЦИИ РАСТЕНИЙ ОГУРЦА Российский патент 2008 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной генетики и представляет собой бессимптомный штамм вируса зеленой крапчатой мозаики огурца (ВЗКМО), который можно использовать для защиты растений огурца путем вакцинации растений.

Метод вакцинации растений давно разработан и успешно применяется в сельском хозяйстве. Эффект вакцинации слабопатогенным (ослабленным) штаммом заключается в том, что размножение такого предварительно введенного штамма вируса служит препятствием для размножения родственного патогенного вируса. При введении в растение слабопатогенного штамма вируса эти растения приобретают "иммунитет" к сильнопатогенным штаммам. В этом случае слабопатогенный штамм называют вакцинным. "Иммунитет" проявляется либо в удлинении срока появления симптомов заболевания, либо вообще в его отсутствие в течение всего времени вегетации, что приводит к уменьшению потерь и сохранению урожая (К.С.Сухов, Т.С.Подъяпольская, Извекова Л.И. Иммунизация растений против патогенного действия вирусов. М.: Наука, 1979).

Существуют вакцинные штаммы для защиты растений томата от вируса табачной мозаики томата: это ВТМ V-69 (Сухов К.С., Подъяпольская Т.С., Извекова Л.И. и др. Вакцинный штамм вируса табачной мозаики V-69: получение, свойства и практическое применение. Известия АН СССР. Серия биол. 1982, 1:113-125) и L11А (Nishiguchi М, Kikuchi S, Kiho Y, Ohno T, Meshi Т, Okada Y. Molecular basis of plant viral virulence; the complete nucleotide sequence of an attenuated strain of tobacco mosaic virus. Nucleic Acids Res. Aug 1985, 12; 13(15):5585-90). Ослабленные штаммы также используются для защиты перца от мягкой крапчатой мозаики перца (Ichiki TU, Nagaoka EN, Hagiwara K, Uchikawa K, Tsuda S, Omura Т.. Integration of mutations responsible for the attenuated phenotype of Pepper mild mottle virus strains results in a symptomless cross-protecting strain. Arch Virol. Oct; 150(10):2009-20. Epub 2005 Jun 22).

Нам не известны ослабленные штаммы ВЗКМО, используемые для защиты растений огурца. Выделение и применение таких штаммов может существенно повысить урожай, поскольку ВЗКМО в форме резкой зеленой мозаики поражает листья и плоды, вызывая значительные потери (до 40%). Вирус длительно сохраняется в семенах (1-2%) и затем быстро распространяется от растения к растению при ручной обработке, через почву и орудия труда.

Задачей данного изобретения являлось получение бессимптомного на растениях огурца вакцинного штамма ВЗКМО. Эта задача была решена с помощью штамма ВИРОГ-43М, который был получен в результате селекции патогенных штаммов ВЗКМО. Бессимптомные изоляты отбирались с помощью метода серодиагностики со специфической к ВЗКМО антисывороткой и препаративной очисткой. Штамм хранится в коллекции Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН.

Штамм ВИРОГ-43М имеет следующие морфологические характеристики: форма вирионов - жесткая палочка размером 270×18 нм. На растениях огурца и кабачка бессимптомен.

Штамм ВИРОГ-43М накапливается в листьях огурца в меньшей концентрации (0,5-0,75 мкг/г свежей ткани), чем патогенный ВЗКМО (1,5-2,0 мкг/г).

Штамм ВИРОГ-43А относится к РНК-содержащим вирусам и имеет следующую первичную структуру генома:

1GTTTTAATTTTTATAATTAAACCAACAACAACAACAACAACAAACATTTTAAAACAACAA61TGGCAAACATTAATGAACAAATCAACAATCAACGTGATGCTGCTGCTAGCGGGAGAAATA121ATCTCGTTAGTCAGCTAGCATCAAAGAGGGTGTATGACGAGGCCGTTCGCTCGTTAGATC181ATCAAGATAGACGCCCAAAAATGAACTTTTCTCGTGTGGTCAGTACAGAGCACACCAGGC241TTATCACCGATGCGTATCCGGAGTTTTCGATTAGTTTCACCGCTACCAAGAACTCAGTTC301ATTCCCTTGCGGGAAGTCTGAGGCTTCTTGAATTGGAGTACATGATGATGCAGGTACCTT361ATGGTTCACCTTGCTTTGATATTGGCGGTAATTACACGCAGCATTTATTTAAAGGCAGAT421CATATGTACATTGCTGCAATCCGTGCCTGGATCTTAAAGACGTTGCGAGGAATGTGATGT481ACAATGACATAATTACGCAACATGTGCAGAGGCATAAAGGATCTGGTGGATGCAGACCTC541TTCCGACTTTCCAGATAGATGCTTTCAGGAGGTACGAAGATTCGCCCGTTGCAGTCACCT601GTCCAGACGTTTTCCAAGAATGTTCCTATGATTTCGGGAGTGGCAGGGATAATCATGCGG661TCTCATTGCATTCGATTTATGATATCCCTTATTCTTCGATCGGACCAGCTCTTCATAGGA721AAAACGTGAGAGTCTGTTATGCAGCCTTTCATTTCTCGGAGGCGTTGCTCTTAGGTTCGC781CCGTGGGTAATTTAAATAGTATAGGGGCTCAATTTAGGGTTGATGGTGACGATGTGCATT841TTCTTTTTAGTGAGGAGTCAACTTTGCATTATACTCATAGTTTAGAGAATATTAAGTTAA901TCGTAATGCGTACTTATTTTCCTGCTGATGATAGGTTCGTGTATATTAAGGAGTTTATGG961TTAAGCGTGTGGACACTTTCTTCTTTAGGTTGGTTAGGGCAGACACACATATGCTTCATA1021AATCTGTAGGGCACTATTCGAAGTCGAAATCTGAGTATTTTGCGTTGAACACCCCCCCGA1081TTTTTCAAGATAAGGCCACGTTTTCTGTGTGGTTTCCCGAAGCGAAACGGAAGGTGTTGA1141TACCTAAGTTCGAACTCTCGAGATTTCTTTCTGGAAATGTGAAAGTCTCTAGGATGCTTG1201TCGATGCTGATTTTGTCCATACCATTATTAATCACATTAGCACGTACGATAACAAGGCTT1261TAGTGTGGAAGAATGTTCAGTCTTTTGTAGAATCTATACGCTCTAGGGTAATTGTAAACG1321GAGTTTCCGTGAAATCTGAATGGAACGTGCCGATCGATCAGCTTACTGATATCTCATTCT1381CGATATTCCTTCTCGTGAAGGTTAGAAAGGTGCAGATTGAGCTAATGTCTGATAAGGTCG1441TGATCGAGGCGAGGGGTTTGCTTCGGAGGTTCGCTGATAGTCTTAAATCCGCCGTAGAAG1501GACTAGGTGACTGCGTCTATGATGCTCTAGTTCAAACCGGTTGGTTTGACACCTCCAGCG1561ACGAACTGAAAGTATTGCTACCTGAACCGTTTATGACCTTTTCAGATTACCTCGAAGGGA1621TGTACGAGGCAGATGCGAAAATTGAGAGAGAGAGTGTCTTTGAGCTGCTTGCTTCTGGAG1681ATGATCTGTTCAAGAAGATTGATGAGATAAGGAACAATTACAGCGGAGTTGAATTTGATG1741TGGAGAAATTTCAAGAATTCTGTAAAGAACTGAATGTTAATCCCATGCTAATTGGTCATG1801TGATCGAAGCTATTTTTTCGCAGAAGGCAGGGGTGACAGTCACGGGCCTAGGCACGCTCT1861CTCCTGAGATGGGTGCTTCCGTTGCGTTGTCCAATAATTCTGTAGATACATGTGATGATA1921TGGATGTAACTGAGGATATGGAGGAAATAGTGTTGATGGCAGACAAGAATCACTCTTACA1981TTTCTCCAGAAATGTCGAGATGGGCTAATATGAAATATGGCAATAATAACGGGGCCTTAG2041TTGAATACAAGGTCGGAACCTCGATGACTTTACCTGCCACCTGGGCAGAAAAGGGTAAGG2101CTGTCTTACCGTTGTCGGGAATCTGTGTGAGAAAGCCCCAATTTTCAAAGCTACTCGATG2161AGGAGGACGACTTGAGGTTGTCAAACATGAATTTCTTTAAGGTGAGTGATCTAAAGTTAA2221AGAAGACTATCACTCCAGTTGTTTATACTGGGACCATTCGAGAGAGGCAGATGAAGAATT2281ATATCGATTATCTATCGGCTTCTCTGGGTTCTACGCTTGGTAATCTTGAGAGAATTGTCA2341GGAGTGATTGGAATGGTACCGAGGAGAGCATGCAAACTTTTGGATTGTACGATTGTGAGA2401AGTGCAAGTGGTTGCTGTTACCATCCGAGAAGAAACACGCCTGGGCTGTAGTCCTAGCGA2461GTGATGATACCACTCGTATAATCTTCCTGTCGTATGATGAATCCGGTTCTCCTATAATTG2521ATAAGAAAAATTGGAAGCGGTTCGCTGTCTGTTCTGATACTAAAGTTTATAGTGTGATTC2581GTAGTTTAGAAGTCTTAAATAAGGAGGCCATAGTCGATCCTGGGGTGCATATAACTTTAG2641TCGATGGGGTGCCGGGCTGTGGAAAAACTGCAGAAATTATAGCGAGGGTCAATTGGAAAA2701CTGACCTTGTGTTGACTCCCGGAAGGGAAGCGGCTGCTATGATCAGGCGAAGAGCCTGTG

2761CCCTGCACAA3TCACCTGTAGCTACTAGTGATAACGTTAGGACTTTTGACTCTTTCGTAA2821TGAATAAGAA3GTTTTTAAATTTGATGCCGTTTATGTAGATGAGGGTCTTATGGTCCATA2881CGGGGTTGCTCAACTTCGCGTTGAAGATTTCAGGTTGTAAAAAAGCCTTTGTCTTCGGTG2941ATGCTAAGCAAATTCCGTTTATTAATAGGGTTATGAATTTTGATTATCCTAAGGAATTAA3001GAACTTTAATAGTTGATAACGTAGAGCGTAGGTATATTACCCATAGGTGTCCTAGAGATG3061TCACTAGCTTTCTTAATACTATTTATAAAGCTGCGGTTTCTACCACTAGTCCGGTTGTAC3121ATTCCGTGAAGGCAATAAAGGTTTCTGGGGCTGGTATTCTGAGGCCCGAGTTGACGAAGA3181TCAAAGGGAAGATCATAACGTTTACTCAGTCTGATAAACAATCCTTGATCAAGAGTGGGT3241ACAATGATGTGAATACTGTGCATGAGATTCAAGGGGAGACCTTTGAGGAAACGGCGGTTG3301TACGTGCGACACCGACTCCAATAGGTCTGATTGCTCGAGATTCACCACACGTGTTGGTGG3361CTTTAACGCGGCATACCAAGGCAATGGTGTATTATACCGTTGTGTTCGATGCCGTTACAA3421GCATAATAGCAGATGTGGAAAAGGTCGATCAGTCAATTCTGACCATGTTTGCTACTACTG3481TGCCTACCAAATAGCAATTAACGCAGAACTCTCTGTATGTTCACCGCAATATTTTCCTCC3541CTGTCACTAAGACAGGGTTTTATACGGATATGCAGGAGTTCTATGATAGGTGCCTTCCAG3601GGAATTCCTTTGTTTTGAACGATTTCGATGCCGTCACCATGCGGTTGAGGGATAACGAAT3661TTAATTTGCAACCTTGTAGATTAACTTTAAGTAATTTAGATCCGGTGCCGGCTTTGATCA3721AGAGTGAGGCAAAAGATTTTCTGGTTCCCGTATTGCGAACGGCTTGCGAAAGGCCACGTA3781TTCCGGGTCTTCTCGAAAATCTTGTTGCTATGATAAAGAGGAATATGAATACTCCTGATT3841TGGCTGGAACCGTGGACATAACTAACATGTCTATTTCTATAGTAGATAATTTCTTTTCTT3901CCTTTGTTAGGGACGAGGTTCTACTTGATCATTTAGATTGCGTTAGAGCTAGTTCTATGC3961AGAGTTTTTCTGATTGGTTTTCTTGTCAGCCAACCTCGGCGGTTGGCCAGTTAGCTAATT4021TTAATTTCATAGATTTACCTGCCTTTGATACATATATGCATATGATTAAGAGGCAGCCTA4081AGAGTCGGTTAGATACTTCAATTCAGTCCGAATATCCGGCCTTGCAAACTATTGTATATC4141ATCTGAAGGTGGTAAACGCAGTTTTCGGGCCGGTTTTTAAGTATCTGACTACTAAGTTTC4201TTAGCATGGTAGATAATTCTAAGTTTTTCTTTTATACTAGAAAAAAGCCAGAGGATCTGC4261AGGAGTTTTTCTCGGATCTTTCTTCCCATTCTGATTATGAAATTCTTGAGCTCGATGTTT4321CTAAATATGATAAGTCGCAGTCCGATTTCCATTTCTCCATCGAGATGGCAATTTGGGAAA4381GGCTAGGACTAGATGATATTTTAGCTTGGATGTGGTCCATGGGTCATAAGAGAACTATAC4441TGCAAGACTTCCAAGCTGGAATAAAGACGCTCATTTATTATCAAAGGAAGTCTGGTGATG4501TAACTACTTTTATAGGTAATACTTTTATTATTGCAGCGTGCGTAGCTAGTATGTTACCGT4561TAGATAAGTGTTTTAAGGCTAGTTTTTGTGGTGATGATTCGTTAATCTACCTTCCTAAGG4621GTTTGGAGTATCCTGATATTCAGGCTACCGCCAATTTGGTTTGGAATTTTGAGGCGAAAC4681TTTTCCGGAAGAAGTATGGTTACTTCTGCGGGAAATATATCATTCATCACGCCAACGGCT4741GTATTGTTTACCCTGACCCTTTAAAGTTAATTAGTAAATTAGGTAGTAAGAGTCTTGTCG4801GGTATGAGCATGTCGAGGAGTTTCGTATATCTCTCCTTGATGTCGCTCATAGTTTGTTTA4861ATGGTGCTTATTTCCATTTGCTCGACGATGCAATCCACGAGTTGTTTCCTAATGCTGGGG4921GTTGCAGTTTTGTAATAAATTGTTTGTGTAAGTACTTGAGTGATAAGCGCCTTTTCCGTA4981GTCTTTATATAGATGTCTCTAAGTAAGGTGTCGGTCGAGAACTCGTTGAAACCTGAGAAA5041TTCGTTAAAATTTCCTGGGTTGACAAGTTGCTCCCTAATTACTTTTCTATTCTTAAGTAC5101CTATCTATAACTGACTTTAGTGTAGTTAAAGCTCAGAGTTATGAATCCCTCGTGCCTGTC5161AAGTTGTTGCGTGGTGTTGATCTTACAAAACACCTTTATGTCACACTGTTGGGCGTTGTG5221GTTTCTGGTGTATGGAACGTACCGGAATCCTGTAGGGGTGGTGCTACTGTTGCTTTGGTT5281GACACAAGGATGCATTCTGTTGCAGAAGGAACTATATGCAAATTTTCAGCTCCCGCCACC5341GTCCGCGAATTCTCTGTTAGGTTCATCCCTAACTATTCTGTCGTGGCTGCGGATGCCCTT5401CGCGATCCTTGGTCTTTATTTGTAAGGCTCTCTAACGTAGGTATTAAGGATGGTTTTCAT5461CCATTAACTTTAGAGGTCGCCTGTTTAGTTGCCACTACTAATTCTATTATAAAAAAGGGG5521CTTAGAGCTTCTGTAGTTGAGTCTGTTGTCTCTTCCGATCAGTCGATTGTTCTAGATTCT

5581TTATCTGAGAAAGTTGAGCCTTTCTTCGATAAAGTCCCTATTTCAGCGGCCGTAATGGCG5641AGAGACCCCAGTTATAGGTCTAGGTCGCAGTCTGTCGTTGGTCGTGGTAAGCGGCATTCT5701АААССТССААATCGGAGGTCGGACTCTGCTTCTGAAGAGTCCAGTTCTGTATCTTTCGAA5761GATGGCTTACAATCCGATCACGCCTAGCAAACTTATTGCGTTTAGTGCTTCCTATGTTCC5821CGTTAGAACTТТАСТТААТТTTCTAGTGGCGTCGCAAGGTACTGCTTTCCAAACTCAGGC5881AGGAAGAGATTCCTTCCGTGAGTCTTTGTCTGCGTTACCTTCATCTGTTGAAGATATTAA5941TTCTAGGTTCCCGAGTGCGGGTTTTTACGCТТТССТСААСGGTCCTGTGTTGAGGCCTAT6001CTTCGTTTCGCTTCTTAGCTCTACGGATACGCGTAATAGGGTCATTGAGGTTGTAGATCC6061TAGCAATCCGACGACTGCTGAGTCGCTTAACGCAGTCAAGCGTACTGACGATGCGTCTAC6121AGCCGCTAGGGCTGAGATAGATAATTTGATAGAGTCTATCTCTAAGGGGTTTGATGTTTA6181TGACAGGGCTTCTTTTGAAGCCGCGTTTTCGGTAGTCTGGTCAGAGGCTAССАССТСТАА6241GGCTTAGCCTTGAGGGTCTTCTGACGGTGGTGCACACCATAGTGCATAGTGCTTTCCCGT6301ТСАСТТТААТCGAACGGTTTGCTCATTGGTTTGCGAAAACCTCTCGCGTGTGACGCTGAA6361GTTTTTATGGGCAGTAATTCTGCAAGGGGTTCGAATCCCCCCTTTCCCCGGGTAGGGGCC6421СА     

Первичную структуру вирусной РНК ВИРОГ-43М определяли с помощью автоматического секвенирования фрагментов кДНК, полученных методом праймер-опосредованной «прогулки по геному».

Для получения вакцины штамм сначала накапливают в растениях огурца в течение трех недель после заражения при температуре 18-25°С. Затем проводят выделение ослабленного штамма из листьев огурца и его очистку по методике. Такой препарат может храниться в ампулах в течение 1,5-3 лет при +5°С.

Вакцинация в производственных условиях осуществляется путем опрыскивания 10-12-дневных сеянцев огурца в стадии 1-2 развернутых настоящих листьев водным раствором вакцинного препарата с помощью бытовых пылесосов и прилагаемых к ним распылителей не менее чем за 3-4 дня до высадки в грунт.

Пример 1. Эксперименты по испытанию свойств штамма ВИРОГ-43М проводили в условиях лабораторных теплиц в трехкратной повторности по 100 растений в каждом опыте (таблица 1).

Таблица 1Длительность сохранения бессимптомности ВИРОГ-43М в условиях лабораторного опыта и интерференция с патогенным штаммом ВЗКМОВарианты опыта*Число бессимптомных растений в %Число растений с симптомами резкой мозаики, %Время испытания после заражения ВИРОГ-43МВремя испытания (месяцы)Время испытания (месяцы)1,52,02,53,01,52,02,53,0ВИРОГ-43М10010098,098,0002,02,0ВИРОГ-43М + ВЗКМО (через 2 недели после заражения ВИРОГ-43М)98,095,093,085,02,05,07,015,0ВЗКМО0000100100100100* Для заражения использовали препараты вирусов в концентрации 0,5 мкг/мл

В условиях лабораторного эксперимента растения огурца, зараженные ВИРОГ-43М, остаются бессимптомными в течение трех месяцев испытаний (табл.1), что свидетельствует о высокой генетической стабильности штамма ВИРОГ-43М.

Штамм ВИРОГ-43М обладает способностью к интерференции с патогенными штаммами ВЗКМО, так как обладает вакцинными свойствами, которые проявляются в длительном сохранении бессимптомности у вакцинированных растений после заражения их резким мозаичным штаммом ВЗКМО (табл.1).

Пример 2. Производственные испытания проводили в ЗАО агрокомбината «Московский» на площади по 1 га вакцинированных и невакцинированных посадок.

Таблица 2Подавление развития мозаичного заболевания ВЗКМО на посадках огурца, обработанных ВИРОГ-43МВарианты опыта и гибриды огурцаСроки наблюдений через 1 месяц после обработки ВИРОГ-43М и % резкой мозаики ВЗКМО в летнем обороте1-й месяц2-й месяц3-й месяц4-й месяцВИРОГ-43М 0,5 мг/мл; F₁ Кураж0,12,03,27,5Без обработки2,012,234,151,5ВИРОГ-43М,0,5 мг/мл; F₁ Пассалимо5,411,019,334,2Без обработки3,725,048,082,9

Исходя из приведенных в таблице данных, можно сделать вывод, что штамм ВИРОГ-43М обладает бессимптомностью, генетической стабильностью и способностью к интерференции с патогенными штаммами ВЗКМО. Следовательно, данный штамм может быть использован в практике защиты растений огурца от патогенного ВЗКМО, где на фоне резкой мозаики можно ожидать прибавки урожая не менее 25-30%.

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной генетики и представляет собой бессимптомный штамм вируса зеленой крапчатой мозаики огурца. Формой вирионов штамма является жесткая палочка размером 270×18 нм, и штамм относится к РНК-содержащим вирусам. Изобретение задерживает развитие заболевания крапчатой мозаики огурца и позволяет повысить урожай. 2 табл.

Штамм вируса зеленой крапчатой мозаики огурца ВИРОГ-43М для вакцинации растений огурца.