СИНБИОТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ Российский патент 2022 года по МПК A23L33/135 A61K35/745 A61K31/702 A61P1/16 A61P3/04 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области пищевых композиций для детей грудного возраста и направлено на предотвращение метаболических нарушений в более позднем возрасте.

Уровень техники изобретения

Грудное вскармливание является предпочтительным способом кормления младенцев. Было высказано предположение, что грудное вскармливание в раннем возрасте может повлиять на возникновение расстройств в более позднем возрасте. Однако существуют обстоятельства, которые делают грудное вскармливание невозможным или менее желательным. В этих случаях детская смесь первого уровня и молочная смесь второго уровня являются хорошей альтернативой. Композиция современных детских смесей первого уровня и молочных смесей второго уровня уже хорошо адаптирована таким образом, что она удовлетворяет многим особым потребностям в питании быстро растущего и развивающегося младенца.

Тем не менее улучшения могут быть внесены в состав детских молочных смесей. По сравнению с младенцами на грудном вскармливании, младенцы на искусственном вскармливании имеют повышенный риск развития ожирения, развития метаболических заболеваний в более позднем возрасте, увеличения массы печени или неалкогольной жировой болезни печени (NFALD) или развития сердечно-сосудистых заболеваний в более позднем возрасте. Кормление в раннем возрасте оказывает длительное программирующее воздействие на риск развития таких заболеваний во взрослом возрасте. Эти состояния являются серьезными проблемами здравоохранения в западном мире и основной предотвратимой причиной смерти во всем мире, с растущей распространенностью среди взрослых и детей, и власти считают это одной из самых серьезных проблем в области здравоохранения в 21 веке. Около 12-25% людей в США имеют NAFLD, в то время как NASH поражает от 2 до 5% людей в США. По оценкам, расстройства спектра неалкогольной жировой болезни печени поражают примерно 1 миллиард человек во всем мире.

В WO 2006/091103 описана композиция, содержащая Bifidobacterium и два неусваиваемых олигосахарида для стимуляции кишечной флоры грудного ребенка, вскармливаемого грудным молоком.

В WO 2013/036102 описаны композиции со специфическим жировым компонентом, который оказывает программирующее воздействие на организм и приводит к снижению уровня общего холестерина в крови в более позднем возрасте при употреблении диеты по западному образцу, тем самым снижая риск возникновения заболеваний западного образа жизни.

US 9386793 относится к терапевтическим способам, включающим использование пробиотика Dorea, и, необязательно, пребиотиков, для восстановления здоровой бактериальной микробиоты кишечника млекопитающих.

В WO 2011/096808 описана композиция, содержащая сиалилолигосахарид и живые Bacteroides ssp. для снижения риска избыточного веса или ожирения у младенца в более позднем возрасте.

Сущность изобретения

Авторы изобретения неожиданно обнаружили при использовании животных моделей, что пищевая добавка с Bifidobacterium breve в сочетании с неусваиваемыми олигосахаридами в раннем возрасте приводили к преимуществам в более позднем возрасте. В частности, было обнаружено, что в более позднем возрасте после увеличения потребления калорий и жира в рационе по западному образцу улучшается метаболизм липидов, что приводит к улучшению здоровья печени и улучшению показателей липидов в плазме по сравнению с контрольной группой, которая не получала этого пищевого вмешательства, и которая получала диету по западному образцу.

Авторы изобретения обнаружили на мышиной модели, что возможно запрограммировать младенцев таким образом, чтобы они могли лучше противостоять рискам, обычно связанным с диетой по западному образцу. Когда младенцы получали питание с добавлением Bifidobacterium breve в сочетании с неусваиваемыми олигосахаридами в раннем возрасте, было обнаружено, что предотвращается избыточное увеличение массы печени. Накопление жира в печени, в частности, триглицеридов, в более позднем периоде жизни было снижено, а образование кетонового тела, определяемое количеством бета-гидрокси-масляной кислоты в плазме, увеличилось, что свидетельствует о снижении поглощения жира и увеличении расхода жира в печени. Исследования экспрессии генов показали, что в группе, получавшей B. breve с неусваиваемыми олигосахаридами в раннем возрасте, метаболизм липидов и пути биосинтеза холестерина были изменены по сравнению с контрольной группой и более сопоставимы со здоровой эталонной группой, не получавшей диету по западному образцу. Удивительно, но эти эффекты не наблюдались или в гораздо меньшей степени наблюдались в группе, которая получала только неусваиваемые олигосахариды без B. breve.

Поэтому, применение B. breve вместе с неусваиваемыми олигосахаридами, вводимыми в младенчестве, особенно подходит для улучшения метаболизма липидов в более позднем возрасте и для предотвращения нарушений, связанных с метаболизмом липидов, в частности, жировой болезни печени и/или гиперхолестеринемии, и/или атеросклероза, связанного с холестерином в плазме крови.

Подробное описание изобретения

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу профилактики и/или снижения риска возникновения расстройств, связанных с нарушением метаболизма липидов, выбранных из группы, состоящей из жировой болезни печени, гиперхолестеринемии и атеросклероза, связанного с холестерином в плазме крови, в более позднем возрасте у субъекта-человека путем введения пищевой композиции, содержащей комбинацию Bifidobacterium breve и неусваиваемых олигосахаридов, в раннем возрасте. Предпочтительно настоящее изобретение относится к способу профилактики и/или снижения риска возникновения расстройства, связанного с нарушением метаболизма липидов, причем расстройство представляет собой жировую болезнь печени в более позднем возрасте у субъекта-человека, путем введения пищевой композиции, содержащей комбинацию Bifidobacterium breve и неусваиваемых олигосахаридов, в раннем возрасте. В частности, настоящее изобретение относится к способу профилактики и/или снижения риска возникновения жировой болезни печени в более позднем возрасте у субъекта-человека, путем введения пищевой композиции, содержащей комбинацию Bifidobacterium breve и неусваиваемых олигосахаридов, в раннем возрасте.

В одном варианте осуществления настоящий способ представляет собой немедицинский способ профилактики и/или снижения риска возникновения расстройств, связанных с нарушением метаболизма липидов, выбранных из группы, состоящей из жировой болезни печени, гиперхолестеринемии и атеросклероза, связанного с холестерином в плазме крови, в более позднем возрасте у субъекта-человека, путем введения пищевой композиции, содержащей комбинацию Bifidobacterium breve и неусваиваемых олигосахаридов, в раннем возрасте. Предпочтительно настоящее изобретение относится к немедицинскому способу профилактики и/или снижения риска возникновения расстройства, связанного с нарушением метаболизма липидов, причем расстройство представляет собой жировую болезнь печени в более позднем возрасте у субъекта-человека, путем введения пищевой композиции, содержащей комбинацию Bifidobacterium breve и неусваиваемых олигосахаридов, в раннем возрасте. В частности, настоящее изобретение относится к немедицинскому способу профилактики и/или снижения риска возникновения жировой болезни печени в более позднем возрасте у субъекта-человека, путем введения пищевой композиции, содержащей комбинацию Bifidobacterium breve и неусваиваемых олигосахаридов, в раннем возрасте.

Изобретение также может быть сформулировано как использование комбинации Bifidobacterium breve и неусваиваемых олигосахаридов для получения пищевой композиции для использования в целях профилактики и/или снижения риска возникновения расстройств, связанных с нарушением метаболизма липидов, выбранных из группы, состоящей из жировой болезни печени, гиперхолестеринемии и атеросклероза, связанного с холестерином в плазме крови, в более позднем возрасте у субъекта-человека путем введения пищевой композиции субъекту-человеку в раннем возрасте. Предпочтительно настоящее изобретение относится к применению комбинации Bifidobacterium breve и неусваиваемых олигосахаридов для получения пищевой композиции для применения для профилактики и/или снижения риска возникновения расстройства, связанного с нарушением метаболизма липидов, причем расстройство является жировой болезнью печени в более позднем возрасте у субъекта-человека, путем введения пищевой композиции субъекту-человеку в раннем возрасте. В частности, настоящее изобретение относится к применению комбинации Bifidobacterium breve и неусваиваемых олигосахаридов для получения пищевой композиции для использования в профилактике и/или снижении риска возникновения жировой болезни печени в более позднем возрасте у субъекта-человека путем введения пищевой композиции субъекту-человеку в раннем возрасте.

Изобретение также может быть сформулировано как пищевая композиция, содержащая комбинацию Bifidobacterium breve и неусваиваемых олигосахаридов, для применения для профилактики и/или снижения риска возникновения расстройств, связанных с нарушением метаболизма липидов, выбранных из группы, состоящей из жировой болезни печени, гиперхолестеринемии и атеросклероза, связанного с холестерином в плазме крови, в более позднем возрасте у субъекта-человека, путем введения пищевой композиции субъекту-человеку в раннем возрасте. Предпочтительно настоящее изобретение относится к пищевой композиции, содержащей комбинацию Bifidobacterium breve и неусваиваемых олигосахаридов, для использования в профилактики и/или снижении риска возникновения расстройства, связанного с нарушением метаболизма липидов, причем расстройство представляет собой жировую болезнь печени в более позднем возрасте у субъекта-человека, путем введения пищевой композиции субъекту-человеку в раннем возрасте. В частности, настоящее изобретение относится к пищевой композиции, содержащей комбинацию Bifidobacterium breve и неусваиваемых олигосахаридов, для использования в профилактики и/или снижении риска возникновения жировой болезни печени в более позднем возрасте у субъекта-человека, путем введения пищевой композиции субъекту-человеку в раннем возрасте.

В одном варианте осуществления настоящий способ или использование предназначены для использования в профилактики и/или снижении риска возникновения жировой болезни печени в более позднем возрасте. В одном варианте осуществления настоящий способ или использование предназначены для использования в профилактики и/или снижении риска возникновения неалкогольной жировой болезни печени в более позднем возрасте.

В одном варианте осуществления настоящий способ или использование предназначены для использования в профилактики и/или снижении риска возникновения гиперхолестеринемии и/или атеросклероза, связанного с холестерином в плазме крови, в более позднем возрасте.

Bifidobacterium breve

Пищевая композиция в способе или использовании согласно настоящему изобретению, далее также называемая настоящей (пищевой) композицией, содержит Bifidobacterium breve. Было установлено, что присутствие B. breve вместе с неусваиваемыми олигосахаридами благотворно влияет на метаболизм липидов и здоровье печени в более позднем возрасте. Bifidobacterium breve представляет собой грамположительную, анаэробную, разветвленную палочковидную бактерию. Данная B. breve имеет предпочтительно по меньшей мере 95% идентичности последовательности 16S рРНК с типовым штаммом B. breve ATCC 15700, более предпочтительно по меньшей мере 97% идентичности (Stackebrandt & Goebel, 1994, Int. J. Syst. Bacteriol. 44:846-849). Предпочтительными являются штаммы B. breve, выделенные из кала здоровых младенцев на грудном кормлении. Обычно они коммерчески доступны у производителей молочно-кислых бактерий, но также могут быть выделены из кала, идентифицированы, описаны и выведены. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящая композиция содержит по меньшей мере одну B. breve, выбранную из группы, состоящей из B. breve Bb-03 (Rhodia/Danisco), B. breve M-16V (Morinaga), B. breve R0070 (Institute Rosell, Lallemand), B. breve BR03 (Probiotical), B. breve BR92) (Cell Biotech), DSM 20091, LMG 11613, YIT4065, FERM BP-6223 и CNCM I-2219. Наиболее предпочтительно B. breve выбрана из группы, состоящей из B. breve M-16V и B. breve CNCM I-2219, наиболее предпочтительно B. breve представляет собой M-16V. B. breve I-2219 был опубликован в WO 2004/093899 и в US 7410653 и был депонирован в Collection Nationale de Cultures de Microorganisms, Institute Pasteur, Paris, France 31 мая 1999 года компанией Compagnie Gervais Danone. B. breve M-16V был депонирован как BCCM/LMG23729 и коммерчески доступен от Morinaga Milk Industry Co., Ltd..

Настоящая композиция предпочтительно содержит жизнеспособные B. breve. Настоящая композиция предпочтительно содержит от 10⁴ до 10¹² колониеобразующих единиц (КОЕ) B. breve на грамм сухой массы настоящей пищевой композиции, предпочтительно от 10⁴ до 10¹¹, более предпочтительно от 10⁵ до 10¹⁰, наиболее предпочтительно от 10⁶ до 1×10⁹ КОЕ B. breve на грамм сухой массы настоящей композиции. Предпочтительно композиция содержит от 10⁴ до 10¹³ КОЕ B. breve на 100 мл, более предпочтительно от 10⁶ до 10¹¹ КОЕ B. breve на 100 мл, наиболее предпочтительно от 10⁷ до 10¹⁰ КОЕ B. breve на 100 мл. В контексте настоящего изобретения следует понимать, что пищевая композиция предпочтительно не содержит других пробиотических бактерий, следовательно, пробиотические бактерии, отличные от Bifidobacterium breve, предпочтительно исключаются из пищевой композиции в способе или применении в соответствии с настоящим изобретением.

Неусваиваемые олигосахариды

Пищевая композиция в способе или применении по настоящему изобретению содержит неусваиваемые олигосахариды (NDO). Термин «олигосахарид», используемый в настоящем изобретении, предпочтительно относится к сахариду со степенью полимеризации (DP) от 2 до 250, предпочтительно DP от 2 до 100, более предпочтительно от 2 до 60. Понятно, что в контексте настоящего изобретения сахарид с DP в определенном диапазоне может включать смесь сахаридов с различными средними DP, например, если в настоящую композицию включен олигосахарид с DP от 2 до 100, он может включать композиции, которые содержат олигосахариды со средним DP от 2 до 5, средним DP от 50 до 70 и средним DP от 7 до 60. Термин «неусваиваемый олигосахарид», используемый в настоящем изобретении, относится к олигосахаридам, которые не перевариваются или частично перевариваются в кишечнике под действием кислот или пищеварительных ферментов, присутствующих в верхних отделах пищеварительного тракта человека (тонкая кишка и желудок), но которые ферментируются кишечной флорой человека. Например, сахароза, лактоза, мальтоза и мальтодекстрины считаются усваиваемыми. Например, галактоолигосахариды, фруктоолигосахариды считаются неусваиваемыми олигосахаридами.

Предпочтительно неусваиваемые олигосахариды являются растворимыми. Термин «растворимый», как он используется в настоящем описании, когда имеет ссылку на олигосахарид, означает, что олигосахарид растворим в соответствии со способом, описанным L. Prosky et al., J. Assoc. Off. Anal. Chem. 71, 1017-1023 (1988).

Неусваиваемый олигосахарид предпочтительно выбран из группы, состоящей из фруктоолигосахаридов, галактоолигосахаридов, глюко-олигосахаридов, арабино-олигосахаридов, маннан-олигосахаридов, ксило-олигосахаридов, фукоолигосахаридов, арабиногалактоолигосахаридов, глюкоманно-олигосахаридов, галактоманно-олигосахаридов, сиаловой кислоты, включающей олигосахариды и олигосахариды уроновой кислоты.

Предпочтительно настоящая композиция содержит фруктоолигосахариды и/или галактоолигосахариды, более предпочтительно галактоолигосахариды, наиболее предпочтительно трансгалактоолигосахариды. В предпочтительном варианте осуществления композиция содержит смесь галактоолигосахаридов и фруктоолигосахаридов. Предпочтительно настоящая композиция содержит галактоолигосахариды с DP 2-10, предпочтительно со средним DP от 2 до 10, и/или фруктоолигосахариды с DP 2-60, предпочтительно со средним DP от 2 до 60, предпочтительно со средним DP от 10 до 60, предпочтительно со средним DP от 15 до 60, предпочтительно со средним DP от 20 до 60. Присутствие неусваиваемых олигосахаридов в этих предпочтительных вариантах осуществления будет оказывать улучшенное влияние на метаболизм липидов и здоровье печени в более позднем возрасте.

Галактоолигосахарид предпочтительно выбран из группы, состоящей из трансгалактоолигосахаридов. В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящий способ включает введение трансгалактоолигосахаридов ([галактоза]_n-глюкоза; где n представляет собой целое число от 1 до 60, то есть 2, 3, 4, 5, 6, …., 59,60; предпочтительно n выбран из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10). Трансгалактоолигосахариды (TOS) продаются, например, под торговой маркой Vivinal^TM (Borculo Domo Ingredients, Netherlands). Предпочтительно сахариды трансгалактоолигосахаридов являются β-связанными.

В одном варианте осуществления пищевая композиция в способе или применении по настоящему изобретению предпочтительно содержит фруктоолигосахарид. Используемый в настоящем описании термин «фруктоолигосахарид» относится к неусваиваемому полисахариду, содержащему цепь, по меньшей мере, из 2 β-связанных фруктозных звеньев с DP от 2 до 250, предпочтительно от 7 до 100, более предпочтительно от 20 до 60. В одном варианте осуществления предпочтительно используют инулин. Инулин, например, доступен под торговой маркой “Raftilin HP^®”, (Orafti). Средний DP настоящего фруктоолигосахарида предпочтительно составляет по меньшей мере 7, более предпочтительно по меньшей мере 10, предпочтительно ниже 100. Используемый фруктоолигосахарид предпочтительно имеет (большинство) фруктозных звеньев, связанных β(2→1) связью. Другие термины для фруктоолигосахаридов включают инулин, фруктополисахарид, полифруктозу, фруктаны и олигофруктозу. Настоящая композиция предпочтительно содержит фруктоолигосахариды с DP от 2 до 200.

В предпочтительном варианте осуществления настоящая композиция содержит два или несколько неусваиваемых углевода, различающихся по составу моносахаридных звеньев или различающихся по степени полимеризации (DP), или оба. Два неусваиваемых углевода различаются по моносахаридной композиции, когда разница составляет по меньшей мере 30%, более предпочтительно разница по меньшей мере 50% в композиции моносахаридов на основе общего числа моносахаридных звеньев. Например, галактоолигосахариды со средней композицией Glu-Gal3 и фруктоолигосахариды со средней композицией Glu-Fru3 различаются на 75%. Два неусваиваемых углевода отличаются по DP, если среднее значение DP двух углеводов отличается более чем на 5 моносахаридных звеньев, предпочтительно более чем на 10 звеньев, еще более предпочтительно более чем на 15 звеньев. Например, гидролизованный инулин со средним DP 4 и инулин с длинной цепью со средним DP 25 имеет разницу в DP 21 звеньев.

Предпочтительно настоящая композиция содержит галактоолигосахариды со средним DP от 2 до 10 и фруктоолигосахариды со средним DP от 10 до 60. Предпочтительно настоящая композиция содержит фруктоолигосахариды со средним DP между 2 и 10 и фруктоолигосахариды со средним DP от 15 до 60. Предпочтительно настоящая композиция содержит галактоолигосахариды со средним DP от 2 до 10 и фруктоолигосахариды со средним DP от 2 до 10. Присутствие неусваиваемых олигосахаридов в этих предпочтительных вариантах осуществления будет оказывать улучшенное влияние на метаболизм липидов и здоровье печени в более позднем возрасте.

Предпочтительно настоящая композиция содержит галактоолигосахариды и фруктоолигосахариды в массовом отношении от 20 до 0,5, более предпочтительно от 20 до 1, наиболее предпочтительно от 12 до 2.

Предпочтительно настоящая композиция содержит от 80 мг до 2 г неусваиваемых олигосахаридов на 100 мл, более предпочтительно от 150 мг до 1,50 г, еще более предпочтительно от 300 мг до 1 г на 100 мл. Из расчета на сухую массу композиция предпочтительно содержит от 0,25% масс. до 20% масс., более предпочтительно от 0,5% масс. до 10% масс., еще более предпочтительно от 1,5% масс. до 7,5% масс. неусваиваемых олигосахаридов.

Предпочтительно настоящая композиция содержит от 10⁴ до 10¹² КОЕ B. breve на грамм сухой массы и от 0,25% масс. до 20% масс. неусваиваемых олигосахаридов в расчете на сухую массу, более предпочтительно от 10⁵ до 10¹⁰ КОЕ B. breve на грамм сухой массы и от 0,5% масс. до 10% масс. неусваиваемых олигосахаридов в расчете на сухую массу. Предпочтительно настоящая композиция не содержит пробиотические бактерии, отличные от Bifidobacterium breve.

Предпочтительно настоящая композиция содержит от 10⁴ до 10¹³ КОЕ B. breve и от 80 мг до 2 г неперевариваемых олигосахаридов на 100 мл, более предпочтительно от 10⁶ до 10¹¹ КОЕ B. breve и от 300 мг до 1 г неусваиваемых олигосахаридов на 100 мл. Предпочтительно настоящая композиция не содержит пробиотические бактерии, отличные от Bifidobacterium breve.

Предпочтительно настоящая пищевая композиция содержит i) от 1×10⁵ КОЕ до 1×10¹⁰ КОЕ B. breve на грамм сухого веса, более предпочтительно от 1×10⁶ КОЕ до 1×10¹⁰ КОЕ; и или ii) от 0,5 до 20% масс. галактоолигосахаридов в расчете на сухую массу, более предпочтительно от 0,5 до 10% масс. галактоолигосахаридов, или iii) от 0,05 до 2% фруктоолигосахаридов в расчете на сухую массу, более предпочтительно от 0,1 до 1% масс. фруктоолигосахаридов или оба ii) и iii). Предпочтительно настоящая пищевая композиция не содержит пробиотические бактерии, отличные от Bifidobacterium breve.

Пищевая композиция

Пищевая композиция в способе или применении в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно особенно подходит для обеспечения ежедневных потребностей в питании для субъекта-человека в возрасте до 36 месяцев, особенно для субъекта-человека в возрасте менее 24 месяцев, еще более предпочтительно для субъекта-человека в возрасте до 18 месяцев, наиболее предпочтительно для ребенка до 12 месяцев. Следовательно, пищевая композиция предназначена для кормления или используется для кормления субъекта-человека. Настоящая композиция предпочтительно содержит липид и белок и усвояемый углеводный компонент, где липидный компонент предпочтительно обеспечивает от 30 до 60% от общего количества калорий, белковый компонент предпочтительно обеспечивает от 5 до 20%, более предпочтительно от 5 до 15% масс. от общего количества калорий и усвояемый углеводный компонент предпочтительно обеспечивает от 25 до 75% от общего количества калорий. Предпочтительно настоящая композиция содержит липидный компонент, обеспечивающий от 35 до 50% от общего количества калорий, белковый компонент, обеспечивающий от 6 до 12% от общего количества калорий, и усвояемый углеводный компонент, обеспечивающий от 40 до 60% от общего количества калорий. Общее количество калорий определяют суммой калорий, полученных из белков, липидов и усваиваемых углеводов.

Настоящая композиция не является грудным молоком человека. Настоящая композиция предпочтительно содержит растительные липиды. Настоящая композиция предпочтительно содержит другие фракции, такие как витамины и минералы в соответствии с международными директивами относительно детских смесей. Предпочтительно пищевая композиция представляет собой молочную смесь первого уровня, молочную смесь второго уровня или смесь для ребенка раннего возраста, более предпочтительно молочную смесь первого уровня и молочную смесь второго уровня.

Предпочтительно пищевая композиция не содержит Lactobacilli. Было обнаружено, что количество Lactobacillus было снижено в группе, которая получала B. breve и неусвояемые олигосахариды в раннем возрасте, и имела улучшенные показатели метаболизма липидов и здоровье печени в более позднем возрасте.

В одном варианте осуществления настоящая композиция представляет собой порошок, подходящий для приготовления жидкой композиции после восстановления водным раствором, предпочтительно водой. Предпочтительно настоящая композиция представляет собой порошок для восстановления водой.

Для удовлетворения потребности грудного ребенка в калориях, композиция предпочтительно содержит 50-200 ккал/100 мл жидкости, более предпочтительно 60-90 ккал/100 мл жидкости, еще более предпочтительно 60-75 ккал/100 мл жидкости. Такая калорийность обеспечивает оптимальное соотношение между потреблением воды и калорий. Осмолярность настоящей композиции предпочтительно составляет от 150 до 420 мОсмоль/л, более предпочтительно, от 260 до 320 мОсмоль/л. Низкая осмолярность направлена на снижение желудочно-кишечной нагрузки. Нагрузка может вызвать образование адипоцитов.

Предпочтительно настоящая композиция находится в жидкой форме с вязкостью ниже 35 мПа.с, более предпочтительно ниже 6 мПа.с, как измерено в вискозиметре Брукфильда при 20°С при скорости сдвига 100 с^-1. Соответственно, композиция находится в порошкообразной форме, которую можно восстановить водой с образованием жидкости, или в форме жидкого концентрата, которую следует разбавить водой. Когда композиция находится в жидкой форме, предпочтительный объем, вводимый ежедневно, находится в диапазоне от около 80 до 2500 мл, более предпочтительно от около 450 до 1000 мл в день.

Применение

При использовании животной модели было обнаружено, что комбинация B. breve и неусваиваемых олигосахаридов, но не только неусваиваемых олигосахаридов без B. breve, при введении в раннем возрасте благоприятно влияет на параметры, которые указывают на улучшение метаболизма липида и здоровье печени в более позднем возрасте по сравнению с контрольной группой, которая не получала этого пищевого вмешательства, и которая получала диету по западному образцу.

Настоящее изобретение относится к пищевой композиции, содержащей Bifidobacterium breve и неусваиваемые олигосахариды, для применения для улучшения метаболизма липида и здоровья печени в более позднем возрасте у субъекта-человека путем введения пищевой композиции субъекту-человеку в раннем возрасте.

Наблюдалось значительное влияние на предотвращение избыточной массы печени в более позднем возрасте, когда мыши были взрослыми и после того, как мышей подвергали диете по западному образцу. Также наблюдалось значительное снижение уровня триглицеридов в печени и снижение уровня холестерина в печени. Это наблюдалось в постнатальный день 98, который является моментом времени, соответствующим состоянию зрелости человека. Это указывает на то, что раннее питание оказывает благоприятное влияние на увеличение массы печени, предотвращая чрезмерное увеличение массы печени и предотвращая нежелательные состояния печени, продолжающееся после периода, в котором оно фактически вводится. Кроме того, было неожиданно обнаружено, что субъекты проявляют пониженное накопление жира, повышенное образование кетонового тела, на что указывают эффекты на уровни бета-гидроксибутирата и GIP в плазме. Повышенное образование кетоновых тел после голодания или физических упражнений свидетельствует об улучшенном быстром метаболическом переключении окисления углеводов на окисление жиров. Кетогенез в условиях повышенного или высокого содержания жира в рационе может способствовать удалению значительной части жира, поступающего в печень, а нарушение функции этого пути может способствовать развитию НАЖБП. Кетогенез может играть важную роль в предотвращении вызванной диетой НАЖБП. Контрольная группа, которая получала диету по западному образцу и не получала синбиотическую композицию в раннем возрасте, имела склонность к фенотипу NAFDL, на что указывают неблагоприятные воздействия на липидный гомеостаз, дополнительно поддерживаемые эффектами на гомеостаз глюкозы. Кроме того, слабовыраженное хроническое воспаление является основополагающим фактором в прогрессировании НАЖБП в сторону более высокого риска цирротических состояний. Кроме того, исследование экспрессии генов показало, что липидные пути в группе синбиотиков были более сопоставимы со здоровой эталонной группой, чем контрольной группой, получавшей диету по западному образцу, которая не получала синбиотики в раннем возрасте. Дисрегуляция метаболического гомеостаза, такая как изменение чувствительности к инсулину или метаболизма липидов, может быть связано с развитием жировой болезни печени (ЖБП). Следовательно, фенотип NAFDL и жировая болезнь печени и их прогрессирование предотвращаются в группе, которая получала синбиотики в начале жизни.

Жировая болезнь печени включает алкогольную жировую болезнь печени и неалкогольную жировую болезнь печени (НАЖБП). Предпочтительно настоящую синбиотическую композицию вводят в раннем возрасте для применения в профилактики или снижении риска возникновения в более позднем возрасте НАЖБП. НАЖБП охватывает спектр активности заболевания. Этот спектр начинается с накопления жира в печени (стеатоз печени). Печень может оставаться жирной, без нарушения функции печени, но также может прогрессировать и превращаться в неалкогольный стеатогепатит (НАСГ), состояние, при котором стеатоз сочетается с воспалением и фиброзом (стеатогепатит). НАСГ является прогрессирующим заболеванием: в течение 10 лет у до 20% пациентов с НАСГ разовьется цирроз печени, а 10% умрут от заболевания печени.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к пищевой композиции, содержащей Bifidobacterium breve и неусваиваемые олигосахариды, для применения в профилактики и/или снижении риска возникновения увеличения массы печени и/или жирового заболевания печени в более позднем возрасте у субъекта-человека путем введения пищевой композиции субъекту-человеку в раннем возрасте, более предпочтительно для применения в профилактики и/или снижении риска возникновения НАЖБП.

Значительное снижение уровня холестерина в плазме наблюдали в более позднем возрасте в группе, которая получала синбиотики в раннем возрасте. Кроме того, исследования экспрессии генов показали, что биосинтез холестерина, хранение, распределение транспорта и клеточный гомеостаз в группе синбиотиков были более сопоставимы со здоровой эталонной группой, чем контрольной группой, получавшей диету по западному образцу, которая не получала синбиотики в раннем возрасте. Снижение уровней холестерина в плазме свидетельствует о предотвращении или снижении риска возникновения гиперхолестеринемии и/или атеросклероза. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к пищевой композиции, содержащей Bifidobacterium breve и неусваиваемые олигосахариды, для применения в снижении уровней холестерина в плазме в более позднем возрасте и/или для применения в профилактики и/или снижении риска гиперхолестеринемии и/или атеросклероза, связанного с холестерином в плазме крови, в более позднем возрасте у субъекта-человека, путем введения пищевой композиции субъекту-человеку в раннем возрасте.

Настоящая композиция должна вводиться человеку в раннем возрасте. Ранняя стадия жизни предпочтительно относится к случаю, когда субъект-человек имеет возраст менее 36 месяцев, предпочтительно, когда субъект-человек имеет возраст менее 24 месяцев, еще более предпочтительно, когда субъект-человек имеет возраст менее 18 месяцев, более предпочтительно, когда субъект-человек представляет собой младенца в возрасте до 12 месяцев, наиболее предпочтительно, когда субъект-человек представляет собой младенца в возрасте до 6 месяцев. В одном варианте осуществления настоящую композицию вводят здоровому субъекту-человеку в раннем возрасте, предпочтительно рожденному в срок субъекту-человеку.

Согласно настоящему изобретению более поздний возраст означает предпочтительно, когда субъектом-человеком является ребенок или предпочтительно взрослый. Предпочтительно более поздний возраст относится к тому, когда субъект-человек находится в возрасте старше 5 лет, и более предпочтительно старше 18 лет. Профилактика в более позднем возрасте или снижение риска возникновения в более позднем возрасте отличается от прямого профилактического эффекта, эффекта, который возникает при пищевом вмешательстве, в том смысле, что он продлевает свое воздействие на здоровье намного дольше в жизни после прекращения употребления пищевой композиции, например, минимум 2 года после прекращения введения смеси, более предпочтительно минимум 4 года, более предпочтительно минимум 15 лет. Считается, что этот эффект в более позднем возрасте обусловлен программирующим эффектом, при котором в раннем возрасте, когда субъект-человек все еще растет и развивается, органы и их метаболические возможности (такие как образование адипоцитов, образование массы В-клеток панкреатической железы, развитие печени) программируются в течение критического периода в раннем возрасте, а эффекты, происходящие в этот период времени, оказывают влияние на здоровье в более позднем возрасте. Действительно, перенос микробиоты в постнатальный день 42 не оказывал влияния на метаболическое здоровье, указывая на то, что критический период прошел у мышей.

В предпочтительном варианте осуществления пищевая композиция, содержащая B. breve и неусваиваемые олигосахариды, должна использоваться у субъекта-человека, который подвержен ожирению или растущего в среде, ведущей к развитию ожирения, и/или который употребляет после младенчества диету по западному образцу. Диета по западному образцу состоит из повышенного содержания жиров и насыщенных жирных кислот, причем жир обеспечивает более 35% от общего количества калорий в рационе, а насыщенные жирные кислоты обеспечивают более 10% от общего количества калорий в рационе. Термин среда, ведущая к развитию ожирения, относится к среде, которая способствует увеличению массы, и к среде, которая не способствует потере массы в доме или на рабочем месте (Swinburn, et al., 1999, Prev Med 29:563-570). Другими словами, под средой, ведущей к развитию ожирения, понимается среда, которая провоцирует, стимулирует, способствует или вызывает ожирение. Факторами, которые способствуют этому, являются урбанизация, часто сопровождаемая снижением физической активности, и легкий доступ к еде. В одном варианте осуществления пищевая композиция является особенно полезной для младенцев, которые находятся в условиях воздействия среды, где обычная диета представляет собой диету по западному типу, которая содержит повышенное или высокое содержание жира и повышенное или высокое содержание насыщенных жирных кислот, при этом жир обеспечивает более 35% от общего количества калорий в рационе, и насыщенные жирные кислоты обеспечивают более 10% от общего количества калорий в рационе, в частности, диету по западному образцу, которая характеризуется тем, что содержит жир, обеспечивающий от 35 до 45% от общего количества калорий в рационе, и содержит насыщенные жирные кислоты, обеспечивающие от 10 до 20% от общего количества калорий в рационе.

В предпочтительном варианте осуществления у субъекта-человека существует риск развития расстройств, связанных с нарушением метаболизма липида или нарушением здоровья печени, в более позднем возрасте. Поэтому субъект-человек предпочтительно выбран из группы, состоящей из недоношенного ребенка, младенца с низкой для своего гестационного возраста массой, крупного для гестационного возраста младенца, младенца, рожденного от матери с избыточной массой или ожирением, младенца, рожденного от матери, страдающей диабетом 2 типа или гестационным диабетом, младенца, родившегося с помощью кесарева сечения, и младенца, которого лечат или которого лечили антибиотиками.

В настоящем документе и в его формуле изобретения глагол "включать" и его формы используют в его неограничивающем значении, указывающем, что объекты, следующие за ним, включены, в рассмотрение, но элементы, конкретно не упомянутые, не исключены. Кроме того, указание на элемент в единственном числе не означает, что исключена возможность присутствия более одного такого элемента, если из контекста ясно не следует, что содержится один и только один из элементов. Поэтому указание на один элемент обычно означает "по меньшей мере один".

Описание фигур

На фиг. 1 показаны маркеры плазмы для метаболизма липидов и параметров печени во взрослом возрасте после вмешательства в питание в раннем возрасте. Данные представляют собой среднее ± SEM. *p≤0,05, **p≤0,01. Системные маркеры для липидного гомеостаза: бета-гидроксибутарат, bHB (A), общий холестерин, TC (B), триглицериды, TG (C). Маркеры печени: масса печени (D), TC печени (E) и TG печени (F).

SYN: группа, которая получала B. breve и неусваиваемые олигосахариды в раннем возрасте, затем диету по западному образцу в день 42-98. G/F: группа, которая получала неусваиваемые олигосахариды в раннем возрасте, затем диету по западному образцу в день 42-98. CTR: группа, которая в раннем возрасте не получала B breve и не получала неусваиваемые олигосахариды, затем диета по западному образцу в день 42-98. REF: контрольная группа, которая получала стандартную пищу без пищевого вмешательства в раннем возрасте или в более позднем возрасте введение диеты по западному образцу.

На фиг. 2 показаны маркеры плазмы гомеостаза глюкозы в зрелом возрасте после пищевого вмешательства в раннем возрасте. Данные представляют собой среднее ± SEM. *p≤0,05, **p≤0,01. Системные маркеры гомеостаза глюкозы: гомеостатическая модель оценки инсулинорезистентности, HOMA-IR (A), глюкозы (B), инсулина (C), амилина (D), желудочного ингибиторного полипептида, GIP (E) и панкреатического полипептида, PP (F).

SYN: группа, которая получала B. breve и неусваиваемые олигосахариды в раннем возрасте, затем диету по западному образцу в день 42-98. G/F: группа, которая получала неусваиваемые олигосахариды в раннем возрасте, затем диету по западному образцу в день 42-98. CTR: группа, которая в раннем возрасте не получала B breve и не получала неусваиваемые олигосахариды, затем диета по западному образцу в день 42-98. REF: контрольная группа, которая получала стандартную пищу без пищевого вмешательства в раннем возрасте или в более позднем возрасте введение диеты по западному образцу.

Пример 1: В более поздние сроки жизни воздействие синбиотиков в раннем возрасте благотворно влияет на показатели плазмы и печени, свидетельствующие о липидном гомеостазе и здоровье печени.

Материал и методы

Мыши содержались в клетках Macrolon типа 2 в контролируемых стандартных условиях содержания, получая пищу и воду ad libitum. Самки и самцы мышей C57BL/6J были получены от Harlan Laboratories B.V., Нидерланды, и спаривались со временем. В послеродовой день (PN)2 пометы отбирали и случайным образом распределяли детенышей четырех самцов и двух самок на самку-производительницу. В период адаптации, беременности и лактации животных кормили облученным стандартным полусинтетическим кормом, подходящим для разведения по рецептуре American Institute of Nutrition (Американского института питания) (AIN-93G; 16,4 ккал% жира, 18,8 ккал% белка; RDS, Нидерланды). На PN2 кормящим самкам назначали различные дополнительные диеты, то есть разные добавки диеты AIN-93G, или с неусваиваемыми олигосахаридами [G/F: 2% масс./масс. ScGOS (галактоолигосахариды с короткой цепью (Vivinal® GOS)):lcFOS (длинноцепочечные фруктоолигосахариды (Inulin HP®)), масс./масс. 9:1], синбиотики [SYN: (2% масс./масс. G/F+10⁹ КОЕ/г Bifidobacterium breve M-16V (Morinaga Milk Industries Ltd.)] или контроль растворителем (CTRL: 2% масс./масс. мальтодекстрина). В дополнение к добавкам к диетам, детеныши ежедневно получали (PN10-15) пероральную дозу (30 мкл) в виде капель соответствующей добавки (G/F и мальтодекстрин, приблизительно 10-15 мг/день, 1×10⁹ КОЕ B. breve M-16V). После отлучения от груди (PN21) потомство самцов содержали парами и продолжали содержать на соответствующей дополненной добавками диете до PN42, периода, соответствующего младенчеству и раннему детству у людей. После PN42 до PN98, в подростковом и взрослом возрасте животных CTRL, G/F и SYN кормили диетой по западному образцу (WSD; диета AIN-93G со скорректированной липидной фракцией, содержащей 20% масс. липида (17% масс. сала, 3% масс. соевого масла, 0,1% масс. холестерина), что представляет собой мягкую диету по западному образцу, обеспечивающую около 40% от общего количества калорий в жире и которая содержит около 14,5% насыщенных жирных кислот в расчете на общее количество калорий) в качестве провокационной нагрузки. Эта диета имеет повышенный уровень жира на основе общей калорийности и увеличенный процент насыщенных жирных кислот по сравнению с тем, что считается здоровой.

Начиная с PN21, потребление пищи определяли через постоянные интервалы путем взвешивания разницы между предоставленной и оставшейся пищей.

На PN98 после 6-часового голодания животных подвергали эвтаназии с помощью анестезии изофлуран/O2 с последующей цервикальной дислокацией. Образцы крови собирали в микропробирки с покрытием K₃EDTA (Greiner Bio-one, Germany). Плазму получали из образцов крови центрифугированием (1350 г, 10 мин, 4°C) и затем замораживали в жидком азоте и хранили при -80°C. Печень извлекали во время вскрытия, взвешивали, быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -80°C до дальнейшего анализа.

В PN98 в образцах плазмы общий уровень холестерина в плазме натощак (Plasma TC; cholesterol liquicolor CHOD-PAP, Instruchemie, Delfzijl, The Netherlands), триглицериды (Plasma TG; GPO trinder method, Sigma Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands), бета-гидроксибутират (Plasma bHB; β-Hydroxybutyrate LiquiColor, Stanbio Laboratory, Boerne, TX, USA) и глюкозу (GOD-PAP метод, Roche diagnostics, Almere, The Netherlands) измеряли колориметрическим методом с использованием системы визуализации с помощью микропланшетов (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA). Инсулин в плазме натощак, амилин, глюкозозависимый инсулинотропный полипептид (GIP) и лептин измеряли одновременно с использованием мультиплексного метода (MILLIPLEX MAP Mouse Metabolic Hormone Magnetic Bead Panel, Merck KGaA, Darmstadt, Germany). Образцы, контроли и стандарты получали в соответствии с протоколом производителя и количественно определяли флуоресценцию с помощью прибора (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA). В качестве косвенного показателя чувствительности к инсулину применяли гомеостатическую модель оценки резистентности к инсулину (HOMA-IR; [glu(ммоль/л)*ins(пмоль/л)/22,5]) для глюкозы и инсулина в плазме натощак. В ткани печени из PN98, содержание белка (BCAtm Protein Assay Kit, Thermo scientific, Breda, the Netherlands), триглицерида (Triglycerides liquicolor mono kit, Human Diagnostics, Wiesbaden, Gemany) и холестерина (Cholesterol liquicolor mono kit, Human Diagnostics, Wiesbaden, Germany) оценивали колориметрическим методом с использованием системы визуализации с помощью микропланшетов (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA).

Тотальную РНК из двенадцатиперстной кишки, тощей кишки, подвздошной кишки, толстой кишки, печени и WAT выделяли, очищали и немедленно помещали на хранение при -80ºC. Для этой цели использовали ДНКазу, обработанную TRIzol/хлороформом (Invitrogen, Breda, The Netherlands), и мини-набор RNAeasy (Qiagen, Venlo, The Netherlands) в соответствии с инструкциями производителей. РНК определяли количественно (спектрофотометр NanoDrop ND-1000 UV-vis, Isogen, Maarsen, The Netherlands) и ее целостность проверяли с помощью набора 6000 Nano Kit, используя анализ Eukaryote Total RNA Nano в соответствии с биоанализатором Agilent 2100 (Agilent Technologies, Amsterdam, The Netherlands). Если в образцах были обнаружены интактные полосы 18S и 28S субъединиц рибосомальной РНК, не было хромосомных пиков или продуктов распада РНК, а число целостности РНК (RIN) выше 8,0, их считали пригодными для гибридизации с микрочипом.

Меченую кДНК получали из 100 нг очищенной РНК на образец с использованием набора для экспрессии Ambion Whole Transcript (WT) (Life Technologies, Carlsbad, USA) и набора терминальной маркировки Affymetrix GeneChip WT (Affymetrix, Santa Clara, USA). Все образцы одной ткани были гибридизовали с одним и тем же массивом Affymetrix GeneChip Mouse Gene Gene 1.1 ST в соответствии с протоколами производителя. Пакеты программного обеспечения Bioconductor, интегрированные в онлайновый конвейер, использовали для выполнения этапов контроля качества и нормализации {Lin, 2011 #287}. Применяя робастный алгоритм множественного массива (RMA) из библиотеки Bioconductor AffinePLM с настройками по умолчанию, были вычислены нормализованные оценки выражений наборов зондов {Irizarry, 2003 #275}. Согласно Dai et al. {Dai, 2005 #263}, наборы зондов были переопределены и присвоены уникальным идентификаторам генов (ID) базы данных Entrez Gene, в результате чего было присвоено 21187 ID Entrez

Для уменьшения количества переменных, для дальнейшего анализа были отобраны только гены со значением интенсивности >20 по крайней мере для 5 массивов и межквартильным диапазоном >0,1, в результате чего было получено 14230 генов для печени, 15574 генов для WAT, 14377 генов для толстой кишки, 15467 генов двенадцатиперстной кишки, тощей кишки и подвздошной кишки. Используя умеренную t-статистику на основе интенсивности (IBMT), реализующую эмпирическую коррекцию Байеса {Sartor, 2006 #313}, отношения 2log сигнала и соответствующие изменения кратности (отношение 2log 1 равняется изменению 2), и соответствующие значения изменения были вычислены от средней интенсивности сигнала четырех групп. Полученные в результате кратные изменения и соответствующие р-значения были применены для описательного биоинформационного анализа и визуализации данных.

Чтобы связать данные о экспрессии генов с биологическими функциями и каноническими путями, был применен анализ путей изобретательности (IPA, IngenuityH Systems, www.ingenuity.com) с использованием p=0,05 в качестве фильтра для генов для выполнения комплексного анализа путей и сетей.

Группа REF представляет контрольную группу, которая не получала дополнительную диету (ранняя фаза жизни) и не получала провокационную диету WSD (поздняя жизнь). В статистическом анализе сравнивали три группы с введением WSD (CTRL, G/F, SYN).

Статистический анализ проводили с использованием IBM SPSS Statistics 19.0 (SPSS Benelux, Gorinchem, The Netherlands) и GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA).

Все переменные были проверены на нормальное распределение с использованием одновыборочного теста Колмогорова-Смирнова. При нормальном распределении переменные анализировали в CTRL vs. G/F vs. SYN с помощью однофакторного дисперсионного анализа. В отношении значительных эффектов был проведен последующий анализ с использованием критерия множественных сравнений Тьюки для сравнения между отдельными группами. В случае негауссовского распределения, log-преобразование было выполнено перед однофакторным дисперсионным анализом. Различия считались достоверными при р≤0,05. Данные представлены как среднее±SEM, если не указано иное.

Результаты

Пищевое вмешательство в раннем возрасте с G/F или SYN по сравнению с контрольной диетой (группа REF и CTRL) не влияло на рост развития во время и непосредственно после периода вмешательства до PN42. Масса тела, масса жира и мышечная масса тела не отличались между экспериментальными группами на данный момент времени. Также масса жира по отношению к массе тела (% жировой массы) была одинаковой во всех группах. После введения провокационной диеты WSD группам CTRL, G/F и SYN от PN42 до PN98 длина животных и мышечная масса тела оставались одинаковыми во всех группах, что указывает на нормальную динамику роста.

Ни в раннем возрасте (PN21-42), ни в более позднем периоде жизни (PN42-93) не было обнаружено различий в потреблении пищи между группами, которые могли бы объяснить наблюдаемые фенотипы.

Результаты по маркерам для системного и липидного обмена печени показаны на фиг. 1. Бета-гидрокси-масляная (bHB) кислота в плазме была значительно увеличена в группе SYN (фиг.1А). bHB является источником энергии во время голодания или физических упражнений, а также сигнальной молекулой в гомеостазе липидов и указывает на образование кетонов. Это также указывает на увеличение расхода жирных кислот в результате бета-окисления, например, в печени. Это свидетельствует об улучшении метаболического перехода к окислению жиров при голодании. Также уровень холестерина в плазме был значительно ниже (р=0,007) в группе SYN, с промежуточным эффектом в группе G/F (фиг. 1В) по сравнению с CTRL. Не было значимого влияния на TG в плазме (фиг. 1С).

Дисрегуляция метаболического гомеостаза, такая как изменения в метаболизме липидов, связано с развитием жировой болезни печени (ЖБП), обратимого состояния эктопического накопления жира в печени. Таким образом, были измерены соответствующие параметры печени. Средняя масса печени у животных SYN при вскрытии была значительно ниже по сравнению с животными CTRL и G/F (фиг.1D). Различия в общем холестерине печени по отношению к белку печени были ниже (р=0,08) и соответствовали визуальной ступенчатой схеме (фиг. 1Е). Содержание триглицеридов в печени в SYN было значительно ниже, чем в CTRL и G/F (фиг. 1F).

На фиг. 2 показано влияние метаболизма глюкозы, так как это может повлиять на метаболизм липидов и здоровье печени. Расчет HOMA-IR основывался на уровнях глюкозы и инсулина в плазме натощак, из которых первые - что неудивительно - были одинаковыми во всех группах, а последние значительно различались (p=0,039), при этом CTRL, G/F и SYN демонстрировали ступенчатый нисходящий паттерн. HOMA-IR был ниже в SYN, чем в CTRL и, следовательно, указывал на более чувствительную реакцию организма на инсулин. HOMA-IR был ниже в SYN, чем в CTRL и, следовательно, указывал на более чувствительную реакцию организма на инсулин. Хотя уровни глюкозы в плазме натощак (фиг. 2B) одинаковы во всех группах, HOMA-IR (фиг. 2A), который является показателем чувствительности к инсулину, и различные сигнальные молекулы, относящиеся к гомеостазу глюкозы, включая инсулин (фиг. 2C), амилин (Фиг.2D), GIP (фиг.2E) и PP (фиг.2F) показывают улучшенные (трендообразные) уровни в плазме в SYN после введения WSD на PN98, причем уровень инсулина в плазме в SYN значительно ниже, чем в CTRL. GIP в плазме, высокоактивный инкретин, который также, как известно, влияет на поглощение глюкозы и синтез липидов, был одинаково высок во всех группах, ожидаемых для SYN, который был значительно ниже, чем G/F (p=0,014).

Эффекты на липидный гомеостаз указывают на то, что группа CTRL склоняется к фенотипу НАЖБП, и это дополнительно подтверждается влиянием на гомеостаз глюкозы. Кроме того, слабовыраженное хроническое воспаление является основополагающим фактором в прогрессировании НАЖБП в сторону более высокого риска цирротических состояний. Следовательно, фенотип НАЖБП и жировая болезнь печени были предотвращены/устранены в SYN.

Для выявления потенциальных молекулярных механизмов, лежащих в основе благоприятного влияния синбиотических добавок на раннем этапе жизни, авторы изобретения провели микроматричный анализ шести соответствующих тканей; двенадцатиперстной кишки, тощей кишки, подвздошной и толстой кишки, печени и белой жировой ткани (WAT). Для SYN vs. CTRL авторы изобретения наблюдали наиболее сильный эффект, определяемый как число достоверно (p<0,05) дифференциально экспрессированных генов в подвздошной кишке (n=1592), за которой следуют тощая кишка (n=1307) и двенадцатиперстная кишка (n=1227). 1191 генов значительно регулировался в печени, в то время как экспрессия только 315 и 285 генов значительно отличалась в WAT и толстой кишке, соответственно. Во всех анализируемых тканях сходное количество генов с абсолютным кратным изменением выше, чем 1,2 при сравнении SYN и CTRL, было либо повышенным, либо понижающим, с учетом тонкой кишки и толстой кишки для большей части регулируемых генов. Однако в печени и WAT экспрессия большинства генов регулировалась с абсолютным кратным изменением менее 1,2, что указывает на то, что добавление синбиотика по сравнению с CTRL вызывает более слабую регуляцию в печени и WAT.

Сравнение дифференциально экспрессированных генов в подвздошной кишке, тощей кишке и двенадцатиперстной кишке показало, что только 84 гена, на которые приходится менее 10% дифференциально экспрессированных генов на сегмент, были распределены между тканями. Это указывает на то, что добавление синбиотиков в раннем возрасте вызывает долгосрочные тканеспецифические транскрипционные реакции в сегментах кишечника по сравнению с CTRL. Примечательно, что все перекрывающиеся гены изменили экспрессию генов в одном и том же направлении во всех сегментах тонкой кишки, причем 69 были активированы, а остальные подавлены. Аннотация 84 генов с использованием описания GO идентифицировала 17 и 12 генов, указанных в метаболических и иммунных функциях, соответственно.

Для выявления биологических функций и канонических путей, которые специфически нацелены на дифференциальную регуляцию генов, авторы изобретения использовали анализ путей изобретательности (IPA). В IPA значение регуляции основано на количестве и изменении регулируемых генов по отношению к общему количеству генов, приписанных функции. В подвздошной кишке биологические функции и канонические пути были строго отрегулированы с топ-5, имеющим -log(p-значения) между 14,25-11,98 и 12,80-5,27, соответственно. В печени регуляция биологических функций и путей имела максимальное -log(p-значение) 7,49 и 3,04. В подвздошной кишке самой сильной регулируемой биологической функцией был «метаболизм липидов», а самым сильным регулируемым каноническим путем был «биосинтез холестерина». При увеличении метаболизма холестерина было обнаружено, что наборы генов, связанные с биосинтезом (мевалонатный путь, биосинтез стероидов), поглощение холестерина в клетку и регуляцией гомеостаза, повышены у мышей с добавлением SYN в раннем возрасте, в то время как наборы генов, связанные с хранением, выведением и распределением холестерина были скорее понижены, что может указывать на более высокую потребность клеток в холестерине. Эти регуляции в основном соответствовали группе REF. Однако в группе G/F этих эффектов не было или в меньшей степени присутствовали, и результаты были более сопоставимы с группой CTRL.

Пример 2: Одна только модуляция микробиоты не приводит к долгосрочному влиянию на метаболическое здоровье

Для трансплантации использовали стерильных самцов мышей C57/Bl6, которых кормили стандартным кормом, обработанным в автоклаве. На 5 неделе все мыши были акклиматизированы на стерильный WSD в течение 1 недели. Замороженное содержимое слепой кишки от мышей с добавлением пищи (CTRL) и синбиотика (SYN) (собранных в PN42 из эксперимента по кормлению) гомогенизировали в буфере PBS, дополненном восстановительным раствором (0,02 М Na2S и 1% цистеина, растворенного в буфере NaHCO3). Были отобраны два отдельных донора из каждой группы. После одной недели акклиматизации мышам (6 недель, PN42, 4-5 мышей на группу) не давали есть в течение 4 часов и вводили в желудок полученную суспензию (200 мкл). Трансплантированных мышей содержали в автоклавированных индивидуальных вентилируемых клетках со стерильной подстилкой и кормили стерильным WSD и автоклавированной водой ad libitum в течение 14 недель. Измеряли массу тела и проводили магнитно-резонансную томографию всего тела (МРТ) на PN 42, 43, 70 и 98.

Во время переноса (PN42) не было различий в массе тела, массе жира и мышечной массе тела у мышей-реципиентов GF. После переноса микробиоты авторы изобретения не наблюдали существенных различий в массе тела, массе жира и мышечной массе тела между группами CTRL и SYN для взаимосвязи диета*время. Таким образом, измененная микробиота после добавления синбиотика недостаточна для передачи полезного фенотипа мышам с добавкой синбиотика реципиентам. Это указывает на то, что это скорее фактический процесс модуляции микробиоты в раннем возрасте благодаря присутствию неусваиваемых олигосахаридов и B. breve в раннем возрасте в кишечнике, который можно считать необходимым для того, чтобы вызвать долгосрочный метаболический эффект для здоровья.

Изобретение может быть использовано для предупреждения и/или снижения риска возникновения жировой болезни печени в более позднем возрасте после приема синбиотиков в раннем возрасте. Предложено применение комбинации Bifidobacterium breve и неусваиваемых олигосахаридов для изготовления пищевой композиции для предупреждения и/или снижения риска возникновения жировой болезни печени в более позднем возрасте у субъекта-человека путем введения пищевой композиции субъекту-человеку в раннем возрасте, где композиция содержит смесь галактоолигосахаридов и фруктоолигосахаридов и где ранний возраст соответствует возрасту субъекта-человека от 0 до 36 месяцев, а более поздний возраст соответствует возрасту субъекта-человека старше 5 лет. При этом пищевая композиция представляет собой детскую смесь первого уровня, или молочную смесь второго уровня, или молочную смесь для ребенка младшего возраста. Обеспечивается улучшение метаболизма липидов в более позднем возрасте и предупреждение и/или снижение риска возникновения жировой болезни печени в более позднем возрасте после приема синбиотиков в раннем возрасте. 9 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 пр.

1. Применение комбинации Bifidobacterium breve и неусваиваемых олигосахаридов для изготовления пищевой композиции для предупреждения и/или снижения риска возникновения жировой болезни печени в более позднем возрасте у субъекта-человека путем введения пищевой композиции субъекту-человеку в раннем возрасте, где пищевая композиция представляет собой детскую смесь первого уровня, или молочную смесь второго уровня, или молочную смесь для ребенка младшего возраста, и где композиция содержит смесь галактоолигосахаридов и фруктоолигосахаридов, и где ранний возраст соответствует возрасту субъекта-человека от 0 до 36 месяцев, и где более поздний возраст соответствует возрасту субъекта-человека старше 5 лет.

2. Применение по п. 1, которое предназначено для предупреждения и/или снижения риска возникновения неалкогольной жировой болезни печени в более позднем возрасте.

3. Применение по любому из предшествующих пунктов, где ранний возраст соответствует возрасту субъекта-человека от 0 до 12 месяцев.

4. Применение по любому из предшествующих пунктов, где более поздний возраст соответствует возрасту субъекта-человека старше 18 лет.

5. Применение по любому из предшествующих пунктов, где указанный субъект-человек подвержен ожирению или вырос в условиях, ведущих к развитию ожирения, и/или употребляет после младенчества диету по западному образцу, которая включает повышенное содержание жира и повышенное содержание насыщенных жирных кислот, причем жир обеспечивает более 35% от общей калорийности диеты, а насыщенные жирные кислоты обеспечивают более 10% от общей калорийности диеты.

6. Применение по любому из предшествующих пунктов, где указанным субъектом-человеком является ребенок из группы риска, выбранный из группы, состоящей из недоношенного ребенка, младенца с низкой для своего гестационного возраста массой, крупного для гестационного возраста младенца, младенца, рожденного от матери с избыточной массой или ожирением, младенца, рожденного от матери, страдающей диабетом 2 типа или гестационным диабетом, младенца, родившегося с помощью кесарева сечения, и младенца, которого лечат или которого лечили антибиотиками.

7. Применение по любому из предшествующих пунктов, где Bifidobacterium breve представляет собой Bifidobacterium breve M-16V.

8. Применение по любому из предшествующих пунктов, где пищевая композиция представляет собой детскую смесь первого уровня или молочную смесь второго уровня.

9. Применение по любому из предшествующих пунктов, где пищевая композиция содержит от 10⁴ до 10¹² КОЕ Bifidobacterium breve на грамм сухой массы пищевой композиции и 0,25-20% масс. неусваиваемых олигосахаридов в расчете на сухую массу пищевой композиции.

10. Применение по любому из предшествующих пунктов, где пищевая композиция содержит от 10⁴ до 10¹² КОЕ Bifidobacterium breve на грамм сухой массы пищевой композиции и 0,25-20% масс. неусваиваемых олигосахаридов, выбранных из группы, состоящей из галактоолигосахаридов, фруктоолигосахаридов и их смесей, в расчете на сухую массу пищевой композиции.