Твердофазный способ получения фосфорилированной гиалуроновой кислоты для косметических целей Российский патент 2022 года по МПК A61K31/715 A61K8/73 A61J3/02 C08B37/00 C08B37/08 C08J3/12 

Изобретение относится к области косметологии, а именно к твердофазному способу получения гиалуроновой кислоты, модифицированной химически связанным с ней фосфором, используемой в качестве основы гидрогелей для инвазивных косметических препаратов, предназначенных для устранения дефектов кожи, регулирования роста коллагена и биопроцессов в дерме.

Фосфор является одним из важнейших микроэлементом для регулирования процессов метаболизма в коже и подкожных жировых слоях. Фосфор нормализует энергетический обмен и способствует делению клеток, поскольку входит в состав фосфолипидов и фосфопротеинов мембранных структур, а также нуклеиновых кислот, которые принимают участие в процессах роста, деления клеток, хранения и использования генетической информации. Фосфор улучшает обмен веществ и играет в нем ключевую роль. Входя в состав многочисленных органических соединений, он участвует в метаболизме и синтезе белков, углеводов. Соединения фосфора - аденозинтрифосфорная кислота (АТФ) и креатин-фосфат - аккумуляторы и переносчики энергии, которые обеспечивают протекание энергозависимых процессов во всех клетках, в первую очередь нервных и мышечных. С участием фосфорной кислоты осуществляется гликолиз, гликогенез, обмен жиров. Фосфор входит в структуру ДНК, РНК, обеспечивающих синтез белка. Он участвует в окислительном фосфорилировании, в результате которого образуется АТФ, фосфорилировании некоторых витаминов (тиамина, пиридоксина и др.). Фосфор также важен для функционирования мышечной ткани (скелетной и сердечной мышц). Неорганические фосфаты входят в состав буферных систем плазмы и тканевой жидкости. Фосфор участвует во внутриклеточном распаде свободных жирных кислот и последующем использовании энергии, образовавшейся в процессе. Нормализуя, путем изменения концентрации фосфора, метаболические процессы в жировой ткани, возникает возможность воздействовать не только на обмен жиров и углеводов, но и на размер дермальных адипоцитов (ДА). Эти клетки находятся непосредственно под ретикулярным слоем дермы и образуют поверхностный слой подкожно-жировой клетчатки на нижней границе дермы. В нашем случае это та область кожи куда вводится инъекционный гель, содержащий добавки фосфора в той, или иной форме. ДА участвуют в множестве процессов, протекающих к коже: особенность этих клеток - их структурное сходство с фиброластами и исключительно высокая динамика (они очень быстро могут размножаться), а также ощутимо увеличиваться в размерах и, что очень важно, имеют сайт связывания с гиалуроновой кислотой [Зайцева Ю.А. - Фосфор. Его роль в жизни человека, химический состав и норма в крови // Перспективные научные исследования: опыт, проблемы и перспективы развития. - 2019. - С. 23-26; Л.И. Соболева Микроэлементы в программах коррекции эстетических проблем лица и тела. https://www.martinex.ru/articles/use-of-trace-elements-in-meso/]. ДА, формирующие в коже особое депо, активно взаимодействуют с соседними клетками и подвергаются существенным фенотипическим изменениям, которые можно наблюдать как при хроно-, так и при фотостарении кожи. Так, в хронически поврежденной коже происходит уменьшение структур ДА с прогрессивным замещением их объема фиброзной тканью. Предполагается, что в основе этого явления лежит трансформация адипоцитов в миофибробласты при активной роли фосфора. Вовлеченность ДА в старение кожи косвенно подтверждается корреляцией между особенностями гипертрофического рубцевания и проявлением симптомов старения кожи у разных этнических групп. Все эти наблюдения дают основание рассматривать ДА как одну из перспективных мишеней для anti-age программ косметологического ухода за кожей. [I.L. Kruglikov, Ph.Е. Scherer - Skin aging: are adipocytes the next target? // Aging (Albany NY). 2016 Jul; 8(7):1457-69. Кругликов И.Л., Шерер Ф. Старение кожи: адипоциты - новая мишень? Aging 2016; 8(7). 1457-69].

Также было установлено, что важнейшим биохимическим процессом с участием фосфора в клетках кожи и ДА являются реакции фосфорилирования-дефосфорилирования. Многие ферментативные белки могут фосфорилироваться и дефосфорилироваться. Отрицательно заряженные фосфатные группы изменяют конформацию белков и выполняют роль переключателей ферментов из активного состояния в неактивное, и наоборот. Так фермент фосфоглюкомутаза представляет собою обширный класс сериновых ферментов, у которых в активном центре присутствует остаток серина, необходимый для каталитической активности. Гидроксильная группа серина этерифицируется фосфорной кислотой при взаимодействии с кофактром глюкозо-1,6-дифосфатом, при этом энзим становится активным и катализирует превращение глюкозо-1-фосфата в глюкозо-6-фосфат - основное соединение с которого начинается синтез гиалуроновой кислоты в клетке. Фермент пребывает в одной из двух форм - фосфорилированной (активной) и дефосфорилированной (нефосфорилированной, неактивной). Таким образом, от уровня фосфора в клетке зависит эффективность синтеза гиалуроновой кислоты. [Peacock М. Phosphate Metabolism in Health and Disease. Calcif Tissue Int. 2021 Jan; 108(1):3-15].

Известные данные позволяют сделать вывод о роли доставленного в клетку фосфора: регулирование метаболизма веществ, определяющих старение клетки, а также процесса синтеза гиалуроновой кислоты, отвечающей за поддержание нормального уровня жизнеспособности клеток и кожи в целом. Поэтому, вполне реально, организовав доставку фосфора в клетки, активировать процессы оздоровления кожи, что является одной из основных целей создания новых косметических препаратов.

Известные технические решения решают проблему доставки фосфора с использованием инвазивных препаратов полисахаридов, в частности, гиалуроновой кислоты (далее ГК), содержащих фосфор. Известные способы получения таких препаратов представляют собой:

либо смешение компонентов (солей фосфорной кислоты, фосфорсодержащих витаминов, фосфолипидов) с водным гелем ГК,

либо постадийное проведение химической реакции присоединения к ГК органических или неорганических соединений, содержащих фосфор, с последующим получением гидрогеля ГК растворением в воде полученного соединения.

Одним из вариантов известного технического решения получения гелей ГК смесовым методом, содержащих добавки фосфорсодержащих соединений является способ получения смеси сшитой мочевиной ГК с фосфатом аскорбила натрия - натриевой солью аскорбиновой кислоты, с 2 фосфатными группами, в сухом виде, перемешиванием. Смесь может использоваться и в сухом виде, для снятия воспаления на коже, и в виде водного раствора. Сшитая ГК в этом случае может действовать не только как переносчик для фосфата аскорбила натрия, как самого активного ингредиента, но и потенциально повышать противовоспалительную деятельность при действии в комбинации [A. Fallacara, L. Busato, M. Pozzoli, et al. - In vitro characterization of physico-chemical properties, cytotoxicity, bioactivity of urea-crosslinked hyaluronic acid and sodium ascorbyl phosphate nasal powder formulation // Int J Pharm, 2019 Mar 10; 558:341-350].

Известно техническое решение - способ получения инъекционной композиции смесовым методом на основе модифицированной ГК, а именно:

- смешением водного геля химически сшитой ГК с помощью сшивающего агента 1,4-бутандиол диглицидилового эфира со степенью сшивки от 0.1 до 15% молекул, с гелем несшитой или в меньшей степени сшитой ГК с меньшей молекулярной массой; с добавками локального анестетика, отобранного из группы амида и сложного эфира, типа лидокаина или бензокаина с концентрацией от 0.1 до 30 мг/мл; и с водорастворимым производным аскорбиновой кислоты из группы аскорбилфосфатов (натрий аскорбилфосфат, или магний аскорбилфосфат, или их смесь) с концентрацией 0,001-0,01 мг/мл в композиции ГК;

- последующей стерилизацией смеси в автоклаве.

Полученная композиция содержит связанный фосфор в производном аскорбиновой кислоты и используется для подкожных инъекций для устранения дефектов кожи, морщин воспалений [Европатент ЕР 2670447 В9, МПК A61L 27/14, A61L 31/04, A61K 47/42, A61K 47/22, опубл. 27.12.2017].

Известное техническое решение получения фосфорсодержащей композиции на базе ГК методом смешения - способ получения инъектируемой водной фармацевтической композиции на базе водного геля ГК с молекулярной массой 1,0-2,5 МДа в концентрации в геле 1,0-1,5 мас.%, содержащей 2-20 мг/мл кортикостероида - дексаметазона и фосфатов натрия Na₂HPO₄*7H₂O и NaH₂PO₄*4H₂O, предварительным растворением дексаметазона фосфатов в воде, медленным, в течение 10-12 час добавлением к раствору гиалуроната натрия, смешением до состояния геля при комнатной температуре при соотношении фосфатов 5 мг/мл геля [патент США US 11020485 МПК A61K 45/06; A61K 9/08; A61K 47/36; A61K 47/02, опубл. 01.06.2021].

Общим недостатком способа получения инвазивных фосфорсодержащих композиций на базе ГК является низкая устойчивость к расслоению, высокая вероятность осаждения добавок, а также низкая биодоступность фосфора в таких системах - доступность ГК в клетку на порядок выше, в этих условиях влияние оставшихся в растворе добавок малоэффективно.

Известные технические решения фосфорилирования полисахаридов, в том числе ГК, химическим присоединением фосфорных групп, в той или иной форме и типе связи, основаны на использовании фосфорилирующих агентов, или на способности ГК при действии сшивающих агентов связываться с фосфорными соединениями различной природы. Ранее были исследованы способы получения фосфорилированных производных полисахаридов, синтезированных в системах ортофосфорная кислота-трибутилфосфат-оксид фосфора(V) и ортофосфорная кислота-мочевина и их свойства [Юркштович Т.Л. и др. Микрогели на основе фосфатов полисахаридов, получение, свойства и применение в качестве носителей биологически активных веществ. Свиридовские чтения: сб.ст. Вып. 13. - Минск: Изд. центр БГУ, 2017. - С. 336-356. https://elib.bsu.by/handle/123456789/194663].

Известен способ получения гидрогеля фосфата полисахарида - декстрана с молекулярной массой 40-1000 кДа, при котором осуществляют этерификацию исходного декстрана фосфорилирующей смесью, включающей ортофосфорную кислоту и оксид фосфора (V) в присутствии триалкилфосфата, в среде неполярного органического растворителя с низкой температурой кипения, выбранного из углеводородов и их производных, при температуре 30-70°С, продукт этерификации промывают водным раствором этилового спирта, сушат, затем обрабатывают 0,005-0,5 М водным раствором карбоната, гидрокарбоната или гидроксида натрия или их смесью до значения рН 3,0-8,0, высаждают в этиловом спирте и сушат при температуре 20-50°С. Гидрогель используют для приготовления лекарств и косметики [Патент Беларуси BY 15136, МПК С08В 37/02, А61Р 35/00, опубл. 30.12.2011].

Известно техническое решение, относящееся к способу получения фосфорилированной модифицированной ГК для создания косметических гелей, включающий реакцию гиалуроната натрия в растворе с кислотным производным фосфора (V) из группы пятиокись фосфора, галид (пентахлорид) фосфорной(V) кислоты, оксигалид фосфорной(V) кислоты, ангидрид фосфорной(V) кислоты в условиях сшивки с образованием химической сложно-эфирной связи с фосфатом [патент США US 5783691 МПК С07Р 5/04, опубл. 21.07.1998].

Известно техническое решение, относящееся к способу получения впрыскиваемого кожного наполнителя-филлера, композиция которого состоит из сшитой глицидиловым эфиром пентаэритрита или 1,4-бутандиол диглицидиловым эфиром ГК и ковалентно конъюгированой с ГК производной витамина С аскорбил 3-аминопропил фосфата или аскорбил фосфата натрия, при степени конъюгирования 3-40 молекулярных процентов. Способ изготовления включает следующие этапы: подготовка (очистка, взвешивание) гиалуроновой кислоты; проведение химической реакции сшивающего агента, с производной витамина С; добавления прореагировавших сшивающего агента и производной витамина С в гиалуроновую кислоту для получения композиции, включающей поперечно сшитую гиалуроновую кислоту, ковалентно конъюгированную с производной витамина С; гомогенизации; и нейтрализации композиции сшитой гиалуроновой кислоты для получения впрыскиваемого геля. Филлер при введении в кожу пациента высвобождает аскорбиновую кислоту в его тело, по меньшей мере, на протяжении примерно 1 месяца и, самое большее, на протяжении примерно 20 месяцев; используется для устранения обезвоживания кожи, недостатка эластичности кожи, шероховатости кожи, недостатка натянутости кожи, бледности кожи, растяжки кожи и кожных морщин [Патент РФ RU 2624239 МПК A61K 8/67, Опубл. 03.07.2017].

Известен способ получения аналогичной композиции кожного наполнителя, содержащую производное витамина С, ковалентно конъюгированное с компонентом ГК при степени конъюгирования по меньшей мере 3 мол.%, где компонент ГК представляет собой гиалуроновую кислоту, сшитую сшивающим агентом - диглицидиловым эфиром 1,4-бутандиола или глицидным эфиром пентаэритрита (Star-ПЭГ-эпоксид), причем гиалуроновая кислота имеет среднюю молекулярную массу менее 1,0 МДа и где производное витамина С выбрано из группы, состоящей из L-аскорбил-3-аминопропилфосфата и аскорбилфосфата натрия, причем указанная композиция является по существу оптически прозрачной и характеризуется значением модуля упругости G', составляющим по меньшей мере 25 Па и не более 200 Па. Способ включает предварительную гидратацию низкомолекулярной ГК с добавлением L-аскорбил-3-аминопропилфосфата и аскорбилфосфата натрия и с раствором 1 мас.% NaOH; подготовку раствора сшивающего агента с добавлением 10% NaOH раствора до рН>12; слияние растворов ГК с производными аскорбиновой кислоты и сшивающего агента, перемешивание, нейтрализацию раствором HCl до рН 7,4 и фасовку. [Патент РФ RU 2626513 МПК A61K 8/04, Опубл. 28.07.2017].

Аналогичный способ используется в известном техническом решении для получения впрыскиваемого кожного наполнителя на базе ГК с молекулярным весом 300-2500 кДа, конъюгированной с производным аскорбиновой кислоты - аскорбил-3-аминопропил фосфатом и/или аскорбил фосфатом натрия, в ходе реакции сшивания ГК 1,4-бутандиол диглицидиловым эфиром, причем степень конъюгирования 5-40 молекулярных процентов [патент РФ RU 2740454 МПК А61К 8/67, А61К 8/73, A61Q 19/00, 19/08, C08J 3/075, опубл. 14.01.2021].

Недостатком известных технических решений является сложность технологического процесса получения фосфорилированных производных ГК - многостадийность, использование агрессивных химических реактивов, необходимость предварительного синтеза реагентов, как в случае с использованием фосфорпроизводных аскорбиновой кислоты, полученные продукты зачастую нуждаются в дополнительной обработке.

Автором настоящего изобретения ранее уже был использован механохимический способ получения модифицированной солями аскорбиновой кислоты сшитой соли ГК, применимый к получению фосфорсодержащих производных ГК, принятый за прототип. Известный способ основан на сшивке в ходе химического взаимодействия в твердой фазе смеси соли ГК молекулярной массой 1500-2500 кДа с магниевой солью фосфорнокислого эфира аскорбиновой кислоты в присутствии сшивающего агента при одновременном воздействии давления в пределах от 5 до 1000 МПа и деформации сдвига в механохимическом реакторе (наковальни Бриджмена или аппарат шнекового типа) при температуре от 20 до 50°С. Способ прототип включает следующие стадии:

- подготовку (взвешивание) исходных реагентов в виде сухих порошков при соотношении соли ГК: к сшивающему агенту (например, диглицидиловому эфиру 1,4-бутандиола) от 50:1 до 2,5:1, к соли аскорбиновой кислоты от 100:1 до 5:1, выбирая пропорцию соли аскорбиновой кислоты к сшивающему агенту от 1:10 до 1:2;

- предварительную гомогенизацию соединенных порошков реагентов в смесителе типа мельницы при температуре от 20 до 50°С до получения однородной порошкообразной смеси;

- обработку гомогенизированной смеси исходных реагентов одновременному воздействию давления в пределах от 5 до 1000 МПа и деформации сдвига в механохимическом реакторе (наковальне Бриджмена) при температуре от 20 до 50°С.

В смесь перед обработкой в механохимическом реакторе может быть введена функциональная добавка - например, антиоксидант, пищевая, стабилизирующая, модифицирующая, лекарственная при мольном соотношении компонентов: модифицированная соль ГК к функциональной добавке в пределах от 100:1 до 1:1.

Известное техническое решение позволило создать универсальный экологически безопасный способ, предусматривающий получение сшитых солей гиалуроновой кислоты, химически модифицированной фосфорными солями аскорбиновой кислоты в отсутствии жидкой среды [Патент РФ RU 2382050 С1, МПК С08В 37/00, опубл. 20.02.2010].

Вышеприведенные известные технические решения не имеют универсальной функциональности в использовании: способ получения фосфорилированных сшитых солей высокомолекулярной ГК достаточно сложен, многостадийный, требует предварительного синтеза солей фосфорных солей аскорбиновой кислоты, в некоторых случаях - отдельной реакции этих солей с сшивающим агентом, а также нескольких видов оборудования для проведения технологического процесса. Получаемые фосфорилированные соли ГК имеют дополнительные химические остатки сшивающих агентов и аскорбиновой кислоты, что не способствует высокой биодоступности фосфора по отношению к клеткам структур кожи.

Задачей заявленного изобретения является разработка одностадийного способа получения устойчивых при хранении сухих твердофазных фосфорилированных производных низкомолекулярной ГК, используемых в дальнейшем либо в качестве самостоятельного препарата, либо в качестве водорастворимой добавки для приготовления более сложных гидрогелевых систем с повышенной биодоступностью микроэлемента фосфора, используемых для медицинских и косметологических целей, химически стабильного и сохраняющего устойчивость эффекта во времени, с минимальным количеством неконтролируемых примесей, проникающих в ткани организма.

В ходе экспериментов по поиску условий синтеза фосфорилированных модификаций ГК авторами изобретения был выбран механохимический способ реакции их синтеза. При этом неожиданно было найдено, что использование исходной низкомолекулярной ГК с молекулярно-весовым распределением 20-60 кДа, соли фосфорной кислоты дигидрофосфата натрия дигидрата NaH₂PO₄⋅2H₂O и проведение реакции в относительно «мягких» по температуре и давлении условиях, позволяет провести механохимический синтез эфира ГК с остатком фосфорной кислоты в дигидрофосфате натрия, получив фосфорилированную ГК. При этом механохимический синтез можно провести в одну стадию.

Экспериментально было установлено, что указанные фосфорсодержащие соединения ГК образуются при определенных условиях обработки сухой смеси дигидрофосфата натрия дигидрата с ГК с молекулярной массой от 20 до 60 кДа в механохимическом реакторе - двухшнековом экструдере при последовательном прохождении смеси через три зоны цилиндра реактора с обрабатывающими шнеками при угле деформации суммарного сдвига обрабатывающих кулачков 180°.

Техническим результатом изобретения является твердофазный способ получения фосфорилированной ГК. Способ включает обработку смеси сухих порошков ГК и дигидрофосфата натрия дигидрата в механохимическом реакторе типа двухшнекового экструдера с зоной питания и двумя реакционными зонами при соотношении длин зон соответственно, %: 20:40:40 с последовательным в одном цикле непрерывным проведением операций:

- загрузку сухого порошка низкомолекулярной гиалуроновой кислоты с молекулярной массой 20-60 кДа и сухого порошка дигидрофосфата натрия дигидрата, при соотношении по массе 1:0,015-0,030 соответственно, в зону питания механохимического реактора и гомогенизацией перемешиванием в этой зоне в течение 2-3 минут при 5-10°С;

- дальнейшее последовательное автоматическое перемещение гомогенизированной смеси во вторую и третью зоны механохимической обработки, где механохимическая обработка проводится с одновременным воздействием давления в пределах 200-300 МПа и деформации сдвига на кулачковых механизмах с углом сдвига суммарно 180° в течение 1-2 минут в токе азота при температуре во второй механохимической зоне 70-80°С, в третьей механохимической зоне 5-7°С.

Далее отделяют полученный порошок фосфорилированной ГК.

Согласно заявленному способу для синтеза используется гиалуроновая кислота, полученная методом бактериального синтеза с молекулярной массой 20-60 кДа.

Согласно заявленному способу для синтеза используется дигидрофосфат натрия дигидрат (синоним - натрий фосфорнокислый 1-замещенный 2-водный) с содержанием основного вещества ≥98%, чда, например, по ГОСТ 245-76.

Результатом реализации способа является получение фосфорилированной ГК в виде ее эфира с остатком фосфорной кислоты в дигидрофосфате натрия (фиг. 1а) общей формулы R-O-PO-(OH)₂, где R - остаток полисахарида - ГК. Предположительная структура образующегося эфира приведена на фиг. 1б).

Выход модифицированных сшитых солей ГК определяли по результатам экстракции водным или спиртовым раствором конечных продуктов реакции при 50°С. Наличие эфиров ГК с фосфатами определяли по характеристическим полосам в ИК-спектрах, по полосам и их расшифровкам, отнесенным к эфирам фосфорилированных производных полисахаридов, приведенных в известных ранних исследованиях [смотри, например, Н.К. Юркштович, Н.В. Голуб и др. Исследование кинетики процесса фосфорилирования регенерированной целлюлозы …- Журн. Белорусского гос. ун-та. Химия. 2017. №1. С. 16; Н.К. Юркштович, Н.В. Голуб и др. Влияние состава этерифицирующей смеси на кислотные свойства фосфорилированных полисахаридов - Журнал физической химии, том 93 №9 2019 с. 1401-1409; Т.Л. Юркштович, Н.В. Голуб, Н.К Юркштович, и др.. Микрогели на основе фосфатов полисахаридов: получение, свойства и применение в качестве носителей биологически активных веществ. - Свиридовские чтения: сб. ст. Вып. 13. - Минск: Изд. центр БГУ, 2017. с. 336-356].

В ИК-спектре фосфорнокислых соединений появляются полосы поглощения в области 955-1055 см-1 (симметричные и асимметричные валентные колебания групп С-Р-О), полосы поглощения при 1220 см-1 (валентные колебания группы Р=O) и 760 см-1 (валентные колебания связи -Р-О-Р-), которые свидетельствуют о присутствии в составе продукта фосфатов и полифосфатов В спектрах всех экстрактов проявляется сложная полоса с ν_max 1000 см-1, принадлежащая деформационному колебанию группы P-O-R. Интенсивная полоса поглощения при 1715 см-1 в ИК-спектрах, отнесена к системе: остаток ортофосфорной кислоты-гидроксильных групп ГК, обусловлена асимметричными валентными колебаниями связей С=O групп. Колебание фосфорильной группы Р=O, имеющей ν_max при 1275 см-1, не проявляется в виде индивидуальной полосы. Однако поглощение в этой области в экстрактах существенно больше, чем в спектрах чистых фосфатов. [Атлас инфракрасных спектров фосфатов. Ортофосфаты. - М.: Наука, 1981. - 247 с.].

Использование продукта, полученного согласно заявленному изобретению, предусматривает применение его водного 1,5-2,0 мас.% раствора либо в качестве самостоятельного инвазивного препарата для кожи, либо в качестве добавки к водным гелям высокомолекулярной (с молекулярной массой 1800-2500 кДа) ГК.

Фиг. 1. Предположительная структурная формула фосфорилированного производного ГК.

А) Структурные формулы дигидрофосфата натрия (I) и звена ГК.

Б) Предположительная структурная формула образовавшегося эфира ГК с остатком дигидрофосфата натрия

Заявленное изобретение иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1

5,0 г порошкообразной натриевой соли ГК с молекулярной массой с распределением 20-60 кДа и 0,075 г сухого порошка дигидрофосфата (V) натрия дигидрата NaH₂PO₄⋅2H₂O, чда, соотношение 1:0,015 по массе соответственно, подают в зону питания двухшнекового экструдера, где смесь гомогенизируют перемешиванием в токе азота в этой зоне в течение 2-3 минут при 5-10°С. Далее смесь захватывают транспортирующие элементы и перемещают ее по длине цилиндра при вращении. Соотношение зон по длине цилиндра с обрабатывающими шнеками: первая зона питания, где происходит гомогенизация смеси -20% от общей длины, вторая зона механохимической обработки - 40% и третья зона механохимической обработки -40%. Во второй и третьей зоне механохимической обработки смесь подвергается деформации сдвига, благодаря смесительным элементам, состоящим из кулачков, набранных по пять штук с углом поворота между кулачками 45°, 90°, 45° (обратный) в сумме 180°. Размещение элементов под разными углами способствует образованию запоров в движении смеси и вследствие этого его лучшему перемешиванию и большим физическим воздействиям. Процесс проводят при автоматической загрузке смеси в зоны механохимической обработки в токе азота, скорость подачи реакционной смеси поддерживалась при скорости вращения шнеков в пределах 20-100 об*мин-1; нагрузка, определяемая по величине тока привода шнеков экструдера в пределах 5-10 А, соответствует давлению 200 МПа. Температура в первой зоне 5-10°С, во второй 70°С, в третьей зоне 5°С. Продолжительность процесса в целом 4 минуты. Выход продукта- сухого порошка белого цвета составляет 4,95 г (98,9%). Содержание фосфора (расчетное) в смеси 0,016 г (до 0,35% мас.) В ИК-спектре экстракта продукта реакции отчетливо наблюдаются полосы 955-1055 см-1 (симметричные и асимметричные валентные колебания групп С-Р-О), полосы поглощения при 1220 см-1 (валентные колебания группы Р=O), сложная полоса с ν_max 1000 см-1, принадлежащая деформационному колебанию группы P-O-R, гипохромный сдвиг полос 1050 см-1 до 1040 см-1 (С-О-валентные колебания карбинола), 946 см-1 до 938 см-1 (внеплоскостные колебания О-Н связи) и ослабление полосы 1616 см-1 (С=O валентные колебания карбоксилата), что свидетельствует о наличии химической связи Р и ГК.

Пример 2

Аналогично примеру 1 5,0 г порошкообразной натриевой соли ГК с молекулярной массой с распределением 20-60 кДа и 0,10 г сухого порошка дигидрофосфата (V) натрия дигидрата NaH₂PO₄⋅2H₂O, чда, соотношение 1:0,02 по массе соответственно, подают в зону питания двухшнекового экструдера, где смесь гомогенизируют перемешиванием в токе азота в этой зоне в течение 2-3 минут при 5-10°С. Далее смесь захватывают транспортирующие элементы и перемещают ее по длине цилиндра при вращении. Соотношение зон по длине цилиндра с обрабатывающими шнеками: первая зона питания, где происходит гомогенизация смеси -20% от общей длины, вторая зона механохимической обработки - 40% и третья зона механохимической обработки -40%. Во второй и третьей зоне механохимической обработки смесь подвергается деформации сдвига, благодаря смесительным элементам, состоящим из кулачков, набранных по пять штук с углом поворота между кулачками 45°, 90°, 45° (обратный) в сумме 180°. Процесс проводят при автоматической загрузке смеси в зоны механохимической обработки в токе азота, скорость подачи реакционной смеси поддерживалась при скорости вращения шнеков в пределах 20-100 об*мин-1; нагрузка, определяемая по величине тока привода шнеков экструдера в пределах 8-10 А, соответствует давлению 250 МПа. Температура в первой зоне 5-10°С, во второй 75°С, в третьей зоне 6°С. Продолжительность процесса в целом 4 минуты. Выход продукта - сухого порошка белого цвета составляет 4,93 г (98,8%). Содержание фосфора в смеси 0,02 г (до 0,45 мас.%). В ИК-спектре экстракта продукта реакции отчетливо наблюдаются полосы 955-1055 см-1 (валентные колебания групп С-Р-О), полосы поглощения при 1220 см-1 (валентные колебания группы Р=O), сложная полоса с ν_max 1000 см-1, принадлежащая деформационному колебанию группы P-O-R, гипохромный сдвиг полос 1050 см-1 до 1038 см-1 (С-О-валентные колебания карбинола), 946 см-1 до 935 см-1 (внеплоскостные колебания О-Н связи) и ослабление полосы 1616 см-1 что свидетельствует о наличии химической связи Р и ГК.

Пример 3

Аналогично примеру 1 5,0 г порошкообразной натриевой соли ГК с молекулярной массой с распределением 20-60 кДа и 0,150 г порошка дигидрофосфата (V) натрия дигидрата NaH₂PO₄⋅2H₂O, чда, соотношение 1:0,030 по массе соответственно, подают в зону питания двухшнекового экструдера, где смесь гомогенизируют перемешиванием в токе азота в этой зоне в течение 2 минут при 5-8°С. Далее смесь обрабатывается аналогично примеру 1 во второй и третьей зонах. Процесс проводят при автоматической загрузке смеси в зоны механохимической обработки в токе азота, скорость подачи реакционной смеси поддерживалась при скорости вращения шнеков в пределах 20-80 об*мин-1; нагрузка, определяемая по величине тока привода шнеков экструдера в пределах 7-12 А, соответствует давлению 300 МПа. Температура в первой зоне 5-10°С, во второй 80°С, в третьей зоне 7°С. Продолжительность процесса в целом 4 минуты. Выход продукта - сухого порошка белого цвета с оттенком составляет 4,95 г (95,7%). В ИК-спектре отмечены изменения характерных полос, аналогично примеру 1, но ослабление полосы 1616 см-1 выражено более отчетливо. Это свидетельствует о наличии химической связи Р и ГК. Содержание фосфора в продукте 0,03 г (до 0,60 мас.%).

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ получения фосфорилированной гиалуроновой кислоты для косметических целей. Способ включает твердофазный механохимический синтез фосфорного эфира остатка фосфорной кислоты с гиалуроновой кислотой, реакцию гиалуроновой кислоты и дигидрофосфата натрия дигидрата при соотношении по массе 1: 0,015-0,030, проводимой в механохимическом реакторе, имеющем зону загрузки для гомогенизации смеси и две реакционных зоны, в следующей последовательности: загрузка сухого порошка низкомолекулярной гиалуроновой кислоты и сухого порошка дигидрофосфата натрия дигидрата, соответственно, в зону питания механохимического реактора и гомогенизацией перемешиванием в этой зоне в течение 2-3 минут при 5-10°С; дальнейшее последовательное автоматическое перемещение гомогенизированной смеси во вторую и третью зоны механохимической обработки, где механохимическая обработка проводится с одновременным воздействием давления в пределах 200-300 МПа и деформации сдвига на кулачковых механизмах с углом сдвига суммарно 180° в течение 1-2 минут в токе азота при температуре во второй механохимической зоне 70-80°С, в третьей механохимической зоне 5-7°С. Изобретение расширяет арсенал средств получения фосфорилированных соединений гиалуроновой кислоты. 3 пр., 1 ил.

Твердофазный способ получения фосфорилированной гиалуроновой кислоты для косметических целей, включающий обработку смеси сухих порошков ГК и дигидрофосфата натрия дигидрата, соответственно, в механохимическом реакторе типа двухшнекового экструдера с зоной питания и двумя реакционными зонами при соотношении длин зон соответственно, %: 20:40:40 с последовательным в одном цикле непрерывным проведением операций:

- загрузку сухого порошка низкомолекулярной гиалуроновой кислоты с молекулярной массой 20-60 кДа и сухого порошка дигидрофосфата натрия дигидрата, при соотношении по массе 1:0,015-0,030 соответственно, в зону питания механохимического реактора и гомогенизацией перемешиванием в этой зоне в течение 2-3 минут при 5-10°С;

- дальнейшее последовательное автоматическое перемещение гомогенизированной смеси во вторую и третью зоны механохимической обработки, где механохимическая обработка проводится с одновременным воздействием давления в пределах 200-300 МПа и деформации сдвига на кулачковых механизмах с углом сдвига суммарно 180° в течение 1-2 минут в токе азота при температуре во второй механохимической зоне 70-80°С, в третьей механохимической зоне 5-7°С.