Протез синовиальной жидкости и способ его получения Российский патент 2022 года по МПК A61K31/728 C08B37/08 A61L27/20 A61P19/00 

Изобретение относится к области биодеградируемых гелей и гидрогелей, и касается состава геля, в качестве протеза имитирующего внутрисуставную жидкость (синовиальную жидкость), и способу его получения. Состав используют для замещения дефицита или коррекции синовиальной жидкости методом инъекции при ее патологических изменениях.

Синовиальная жидкость (СЖ) является важным элементом суставов. Основные функции СЖ исследователи определяют следующим образом:

- локомоторная функция - обеспечение вместе с суставным хрящом благодаря упруговязким и эластическим свойствам протеогликана - гиалуроновой кислоты, свободного перемещения контактных поверхностей костей;

- метаболическая функция - участие вместе с тканью синовиальной оболочки и хряща в интенсивных процессах обмена между содержимым сустава и сосудистым руслом организма, участие в перемещении и ферментативном распаде клеток и крупномолекулярных соединений, образующихся в суставном содержимом в процессе жизнедеятельности сустава, что является непременным условием их удаления из полости сустава через лимфатическое русло;

- трофическая функция, особенно по отношению к периферическим бессосудистым слоям суставного хряща, доказательством чего является длительное существование и даже рост свободных хрящевых тел в суставах (суставные «мыши»);

- барьерная (защитная) функция - участие ферментов СЖ, ее живых клеток и иммунокомпетентных агентов (вместе с активными в этом отношении компонентами синовиальной оболочки) в интернировании, растворении, ингибировании чужеродных клеток и веществ, проникающих в сустав из крови или при повреждении суставной капсулы. [А.А. Котелкина, Г.Ю. Стручко, Л.М. Меркулова и др. Характеристика синовиальной жидкости в норме и при некоторых патологических процессах - Acta medica Eurasica. 2017. №4, с 24-30. // Ю.М. Чернякова, Е.А. Сементовская - Синовиальная жидкость: состав, свойства, лабораторные методы исследования. Медицинские новости. - 2005. - №2. - С. 9-14].

Главной компонентой СЖ является гиалуроновая кислота (ГК) (гиалуронан). В здоровом суставе она смазывает подвижное сопряжение костей, служит питательной средой для хряща и защищает его от механических повреждений, амортизируя ударные нагрузки на сустав. При заболеваниях суставов СЖ реагирует на развитие патологического процесса изменениями своего состава и свойств. Асептическое воспаление суставов, например, в случае остеоартрозов, приводит к патологическому изменению параметров внутрисуставной жидкости - ее количества, биохимического и цитологического состава, реологических и смазывающих свойств, протекторных и регенерирующих свойств. Такая СЖ недостаточно выполняет свои функции.

Для восстановления функций и восполнения необходимого количества СЖ чаще всего используют протезы на основе водных растворов ГК. Внутрисуставным введением высокомолекулярных высокоэластичных полисахаридов удается восстановить реологические свойства синовиальной жидкости и биомеханику сустава.

Механизм действия протезов СЖ на базе ГК при восстановлении функций связывают с усилением синтеза протеогликанов, предотвращением их выхода из матрикса хряща, с подавлением образования и снижением активности противовоспалительных медиаторов и протеолитических ферментов, влиянием на функцию иммунокомпетентных клеток. [В.Н. Хабаров, П.Л. Иванов - Биомедицинское применение гиалуроновой кислоты и ее химически модифицированных производных. М., 2020, гл. 7, с. 206-234]. Использование подобных протезов СЖ, которые представляют собой растворы или гели для внутрисуставного введения, позволяет уменьшить трение, а также улучшить амортизационные, вязкоэластические свойства синовиальной жидкости, а в ряде случаев, например, при использовании целевых добавок, выполнить ряд биологических функций: противовоспалительное действие, анальгезирующий эффект, хондропротекторное действие (угнетение апоптоза хондроцитов и стимуляция их пролиферации), стимуляция синтеза протеогликана и глюкозамина и др. [Ю.Ю. Загорулько, Е.Ю. Загорулько. Особенности растворов гиалуроновой кислоты для внутрисуставного введения и современные тенденции в их разработке (обзор). - Разработка и регистрация лекарственных средств. 2020. Т. 9, №2 с. 45-55].

В таблице 1 приведены составы наиболее распространенных, включенных в лечебную практику, протезов СЖ на основе ГК.

[см. https://ozerki.ru/catalog/lekarstvemye-i-profilakticheskie-sredstva/kostno-mv sistema/dlva-ukrepleniya-sustavov/dlva-vvedeniya-v-sustavy/ https://gorzdrav.org/category/preparatv-zameshhaiushhie-sinovialnuiu-zhidkost/]

Функциональные добавки, используемые в протезах СЖ, имеют различное назначение, связанное с целевыми применениями протезов. В ряде случаев именно добавки определяюткачество и эффективность протезов СЖ.

Известно техническое решение, относящееся к составу искусственной синовиальной жидкости, включающему гиалуроновую кислоту животного происхождения и плазму крови пациента, которому вводят протез СЖ, при концентрации ГК 2,5-4,0 г/л состава. Недостатком является короткий период ремиссии воспалительного и болевого синдромов, и относительно высокая стоимость [патент Республики Беларусь №9146, МПК A61K 35/16, 47/36, опублик 30.04.2007].

Известно техническое решение относящееся к стерилизованной водной композиции, размещенной в шприце, предназначенной для применения в качестве биоматериала, заменяющего СЖ, содержащей по меньшей мере одну ГК и, по меньшей мере, анестетик аминоамидного типа - мепивакаин, где массовое соотношение между концентрацией ГК и концентрацией мепивакаина [МПВК] [ГК]/[МПВК] составляет от 0,1 до 50 (0.1<[ГК]/[МПВК]<50). В предпочтительном варианте концентрация мепивакаина [МПВК] составляет от 0,01 до 50 мг/г общей массы указанной композиции. Техническое решение включает также способ получения описанной выше стерилизованной водной композиции, включающий, по меньшей мере, следующие стадии:

- стадию гидратации в буферном растворе волокон по меньшей мере одной ГК, или ее соли в отдельности или в виде смеси при рН, близком к физиологическому рН, такому как 7,4, для получения гидрогеля,

- стадию включения мепивакаина в виде водного раствора в гидрогель, полученный на предыдущем этапе,

- стадию гомогенизации и

- стадию стерилизации.

в предпочтительном варианте способ дополнительно включает по меньшей мере одну стадию перекрестной сшивки гиалуроновой кислоты [Евразийский Патент №036502, МПК A61K 31/728, A61K 31/4458, A61K 9/00, опублик. 17.11.2020].

Известно техническое решение, включающее способ получения инъекционного заменителя синовиальной жидкости, включающего измельчение, экстракцию, протеолиз и осаждение шкуры сельскохозяйственных животных. Сначала готовят лиофилизат комплекса сульфатированных и несульфатированных гликозаминогликанов (аналогов солей ГК) и белков, далее готовят лиофилизат коллагена, на завершающем этапе готовят 2% раствор комплекса сульфатированных и несульфатированных гликозаминогликанов и белков в дистиллированной воде и смешивают его с лиофилизатом коллагена до получения вязкости 8,0-8,2 относительно дистиллированной воды, полученный препарат упаковывают во флаконы и стерилизуют потоком быстрых электронов дозой 18+5 кГр. Изобретение обеспечивает получение целевого продукта с наименьшими затратами на его производство. [Патент RU 2517237 С1, МПК A61K 35/12 A61K 38/39 A61K 41/00 Опубликовано: 27.05.2014 Бюл. №15]

Известно техническое решение, относящееся к составу, имитирующему внутрисуставную жидкость (синовиальную жидкость), содержащему 15%-ный водный раствор среднемолекулярного поливинилпирролидона, (0,5-1,5)⋅10-3 мас. % добавки с антимикробными свойствами и 0,05-2,5% раствора натриевой соли ГК в деионизованной воде при весовом соотношении: раствор поливинилпирролидона: раствор натриевой соли ГК, как 1:(0,2-0,3), где в качестве добавки используют наночастицы кремния, модифицированные серебром, при размере наночастиц 10-40 нм и количестве серебра в добавке 0,8-1,1 мас. %. Отмечается регенеративное воздействие состава. Недостатком является короткий период действия и возможность высаждения осадка в добавке [патент RU 2473352 С2, МПК A61K 31/79 A61K 31/728 A61K 33/38 опублик. 27.01.2013 Бюл. №3].

Известно техническое решение, включающее состав материала для замены СЖ -"МАТРЕКСИН" на основе полиакриламидного геля и ГК, содержащему в мас. %: акриламида - 0,9-8,2, N-N'метилен-бис-акриламида - 0,1-1,8, ГК - 0,1-2,0 и воды - до 100. Способ получения состоит в сополимеризации указанных компонентов в среде инертного газа в присутствии пероксидного инициатора полимеризации при температуре 69-74°С в течение 16-19 часов. В другом варианте - гидрогель ГК смешивают до однородного состояния в среде инертного газа с пригодным для медицинского применения полиакриламидным гелем, полученным из соответствующих количеств акриламида и N-N' метилен-бис-акриламида и воды в присутствии пероксидного инициатора полимеризации.

Способ обеспечивает получение заменителя СЖ, устойчивого к действию ферментов, макрофагов и фагоцитов организма и имеющего достаточно прогнозируемую степень резорбции в организме. Недостатком является невозможность введения геля в синовиальные влагалища и оболочки сухожилий шприцевым методом с тонкой иглой из-за относительно высокой вязкости гидрогеля. [Патент RU 2545806 С1 МПК A61L 27/16 A61L 27/20 A61L 27/26, опублик. 10.04.2015 Бюл. №10].

Введение в протезы СЖ на основе ГК функциональных биоактивных добавок- явно выраженная тенденция совершенствования заменителей СЖ.

Известен Гидрогель для использования в качестве протеза СЖ, образуемый путем реакции ГК, имеющей 1-10% гидроксильных групп, дериватизированных путем реакции с дивинилсульфоном ("2-(винилсульфонил)этокси)1-10%гиалуроновой кислотой"), с сшивающим реагентом, представляющим собой тиол-функционализированный полиэтиленгликоль, имеющий 2 или 4 тиольные группы, содержащий в качестве биоактивной добавки кортикостероид ацетонид триамцинолона. Способ получения Гидрогеля, имеющего низкую степень сшивания, включает реакцию (2-(винилсульфонил)этокси) с 1-10% ГК и с сшивающим реагентом, представляющим собой тиол-функционализированный полиэтиленгликоль, имеющий 2 или 4 тиольные группы, в водном растворе при температуре в интервале от 20°С до 45°С. Декларируется обезболивающее и репаративное действие Гидрогеля, [патент RU 2539395 С2 МПК A61L 27/20 A61L 27/52 С08 В 37/08 Опублик. 20.01.2015 Бюл. №2].

В качестве одной из биоактивных добавок в составе заменителей СЖ известно использование цинковых солей ГК, получаемых ионным обменом ионов натрия в гиалуронане на ионы цинка из соли в водном растворе, что было реализовано ранее одним из авторов данной заявки.

Цинк - незаменимый микроэлемент в антивозрастных программах, например, в качестве компонента биоревитализирующих препаратов. Цинк улучшает состояние суставов и связок. Цинк обеспечивает нормальное функционирование сухожилий, стимулирует синтез коллагена, костной и хрящевой ткани, обладает противовоспалительным действием. Цинк активирует ферменты (металопротеазы матрикса), которые разбирают молекулы межклеточного вещества; способствует образованию фагоцитов и усиливает активность макрофагов, чем способствует очищению от некротических тканевых элементов; способствует привлечению клеток-фибробластов в пораженную область; восполняет дефицит гиалуроновой кислоты; активирует ферменты, отвечающие за синтез коллагена [В. Хабаров, И. Жукова, И. Кветной Изучение физиологической роли кремния и цинка в составе инъекционных гидрогелей гиалуроновой кислоты. Эстетическая медицина, том XIX, №2, 2020, с. 1-7]. Задача доставки цинка в синовинальную жидкость является до сих пор актуальной задачей.

Известно техническое решение включающее получение и применение ассоциатов депротонированной гиалуроновой кислоты с молекулярной массой 100-1850 кДа, в виде композиции, содержащей ассоциаты ГК с цинком или кобальтом, используемых в качестве фармацевтических и косметических средств, в частности, для ускорения процесса эпитализации участков тела, заживления бедренных язв, пролежней, главным образом незаживающих ран, ожогов, последствий радиации и теплового воздействия, воспалений сальной железы. Способ получения ассоциатов депротонированной гиалуроновой кислоты с ионами цинка или кобальта, состоит во взаимодействии водного раствора с концентрацией 0,100 моль/л галогенида цинка или кобальта с рН раствора равным 5, при эквимольном соотношении реагентов с последующим осаждением ассоциата с применением алканола (обычно бутанола) или алканона, введением четвертичной аммониевой соли и отделением осадка от раствора. Отмечается наличие избытка хлорида цинка в композиции. Полученная композиция рассматривается также как фармацевтически приемлемый носитель целевых добавок; способ получения фармацевтической композиции смешением ее компонентов. [Патент RU 2099350 С1, МПК С08В 37/08, A61K 31/73, опублик. 20.12.1997 г.].

.На основе цинковых солей ГК ранее получили известный водосодержащий гелевый материал на базе модифицированной аскорбиновой кислотой и/или ее солями 0,8% ГК с молекулярной массой 1500 кДа, путем химического взаимодействия цинковой соли ГК с солью аскорбиновой кислоты- аскорбилфосфатом, вместе с сшивающим агентом и добавками L-цистеина и L-глутатиона или глицина, подвергая исходные реагенты одновременному воздействию давления в пределах от 5 до 1000 МПа и деформации сдвига в механохимическом реакторе при температуре от 20 до 50°С. Таким образом получают хондрорепарант Гиалрипайер-10, см. табл. 1 [патент RU 2382050 С1, МПК С08В 37/00 Опублик. 20.02.2010 Бюл. №5].

Авторами данной заявки ранее был усовершенствован способ получения гидрогелевых композиций на основе сшитых цинковых солей ГК и ранее предложенного ими принципа механохимического синтеза ионных солевых комплексов переходных металлов с полисахаридами солевого типа, в частности, с ГК. Было показано наличие эффекта сшивки звеньев ГК цинком. Это известное техническое решение условно можно отнести к прототипу данного изобретения [патент RU 2710074 МПК С08В 37/08 A61K 31/728 Опублик.: 24.12.2019 Бюл. №36].

Способ включает следующие этапы:

- приготовление 1-2% водного раствора натриевой соли высокомолекулярной ГК с молекулярной массой 1500-1800 кДа в деионизованной воде;

- получение низкомолекулярной ГК с молекулярной массой 20-60 кДа при облучении водного раствора гиалуроната натрия в течение 100-120 минут УФ-излучением;

- получение раствора комплексного соединения низкомолекулярной ГК с молекулярной массой 20-60 кДа с катионами цинка, при смешивании полученного облученного раствора гиалуроната натрия с водным раствором соли хлорида цинка, с последующим перемешиванием раствора в течение 2-3 часов при комнатной температуре;

- получение порошка комплексного соединения низкомолекулярной ГК с молекулярной массой 20-60 кДа с катионами цинка, путем фильтрации из полученного раствора, с последующей лиофильной сушкой полученного осадка при 40-60°С при пониженном давлении 0,1 Па и дальнейшим отделением от фильтра сухого субстрата;

- предварительное получение однородной смеси порошков при смешивании сухого порошка натриевой соли высокомолекулярной ГК с молекулярной массой 1500-1800 кДа с полученным сухим порошком комплексного соединения низкомолекулярной ГК с молекулярной массой 20-60 кДа с катионами цинка в соотношении 10:1 по массе;

- механохимическая обработка полученной однородной смеси порошков путем одновременного воздействия давления и деформации сдвига в механохимическом реакторе типа наковальни Бриджмена или экструдере при температуре 20-50оС и при давлении от 5 до 1000 МПа в течение 0,1-10 минут для получения порошка гелеобразователя, содержащего матрицу из высокомолекулярной ГК с молекулярной массой 1500-1800 кДа и равномерно распределенными и химически связанными с матрицей частицами комплексного соединения низкомолекулярной ГК с молекулярной массой 20-60 кДа с катионами цинка;

- получение гидрогелевой водорастворимой композиции, представляющей стабильную систему гелевых глобул в деионизированной воде, содержащую гелеобразователь из матрицы высокомолекулярной ГК с молекулярной массой 1500-1800 кДа с равномерно распределенными и связанными химически с матрицей частицами комплексного соединения низкомолекулярной ГК с молекулярной массой 20-60 кДа (соотношение 10:1) с катионами цинка (содержание металла 0,001-0,01 мас. %,) при растворении 1,5-2,5 мас. % полученного порошка гелеобразователя в деионизированной воде.

Одним из основных недостатков известных технических решений - составов протезов СЖ на основе ГК, включающих функциональные или технологические добавки, является потенциальная деградация реологических и/или вязкоупругих свойств конечных гелей или их стабильности напрямую в течение добавления, или в течение фаз стерилизации при производстве, или с течением времени, например, хранения. Также одним из рисков включения добавок является их склонность к осаждению по мере деградации гидрогеля. Фактически, основная форма добавок в известных технических решениях является либо солевой, либо жирорастворимой, и, таким образом, при их включении в водный гель, как правило, составляемый при рН, близком к физиологическому рН, т.е. 7,4, они будут иметь высокую склонность к осаждению.

Фактически, крайне важно, чтобы в гелях, инъецируемых с помощью тонких игл для восполнения синовиальной жидкости, не происходило осаждение. Осадок будет вызывать те же эффекты, что и инородное тело, и, таким образом, будет приводить к риску воспаления.

Анализ известных технических решений выявил два пути устранения указанных недостатков в протезах СЖ с содержанием цинка;

использование препаратов ГК с низкой молекулярной массой, и использование не солевых форм соединений цинка с ГК.

Ранее было показано, что препараты ГК с низкой молекулярной массой довольно хорошо переносятся пациентами при внутрисуставном введении. Низкая молекулярная масса обусловливает быстрое расщепление молекул ГК в суставе и тканях, что дает основания намеренно использовать низкомолекулярные препараты ГК (500-750 кДа) животного происхождения для внесуставных инъекций. Речь идет о таких локализациях, где имеется синовиальная ткань и ГК природно вырабатывается для осуществления метаболических процессов, в частности о синовиальных влагалищах и синовиальных оболочках сухожилий при хроническом воспалении в этой зоне (тендиниты, теносиновиты, бурситы) [М.А. Страхов, А.В. Скороглядов - Современные тенденции использования средств, замещающих синовиальную жидкость, на основе связанной гиалуроновой кислоты в лечении пациентов с травмами и заболеваниями опорно-двигательного аппарата. Вестник травматологии и ортопедии им. Н.Н. Приорова»; №4; 2013; стр. 2-6].

Задачей заявленного изобретения является разработка протеза синовиальной жидкости в виде гидрогелевых систем на базе модифицированной ГК определенной молекулярной массы и высокочистых полностью водорастворимых цинксодержащих агломератов хелатного типа, исключающих диссоциацию в водной фазе и высаждение по солевому типу, обеспечивающих доставку необходимого количества цинка в синовиальную полость и повышающих эффективность лечения, а также способа их получения. При этом, за счет частичной сшивки звеньев ГК обеспечивается необходимая вязкость протеза (динамическая язкость в пределах 150-300 мПа⋅с).

В ходе экспериментов по поиску условий синтеза хелатных комплексов цинка с ГК авторами изобретения был выбран механохимический способ реакции синтеза цинксодержащих хелатных соединений ГК. При этом неожиданно было найдено, что использование исходной низкомолекулярной ГК с молекулярно-весовым распределением 15-50 кДа, хлорида цинка и проведение реакции в относительно «мягких» по температуре и давлении условиях, позволяет провести механохимический синтез хелатных комплексов ГК+Zn в одну стадию. Экспериментально было установлено, что хелаты образуются при определенных условиях обработки сухой смеси хлорида цинка с ГК с молекулярной массой от 15 до 50 кДа в механохимическом реакторе -двухшнековом экструдере при последовательном прохождении смеси через три зоны цилиндра реактора с обрабатывающими шнеками при угле деформации суммарного сдвига обрабатывающих кулачков 180°.

Техническим результатом изобретения является протез синовиальной жидкости с повышенной устойчивостью гидрогелевой композиции и ее основы - хелатных комплексов ГК с цинком, снижение количества неконтролируемых примесей, проникающих в суставную сумку, повышенная биодоступность цинка, а также способ получения протеза.

Способ включает на первой стадии синтез основы протеза синовиальной жидкости

- хелата Zn с ГК. Для этого проводят обработку смеси сухих порошков ГК и хлорида цинка в механохимическом реакторе типа двухшнекового экструдера с зоной питания и двумя реакционными зонами при соотношении длин зон соответственно, %: 20:40:40 с последовательным в одном цикле непрерывным проведением операций:

- загрузку сухого порошка низкомолекулярной гиалуроновой кислоты с молекулярной массой 15-50 кДа и сухого порошка хлорида цинка, при соотношении по массе 1: 0,015-0,030 соответственно, в зону питания механохимического реактора и гомогенизацией перемешиванием в этой зоне в течение 2-3 минут при 5-10оС;

- дальнейшее последовательное автоматическое перемещение гомогенизированной смеси во вторую и третью зоны механохимической обработки, где механохимическая обработка проводится с одновременным воздействием давления в пределах 200-300 МПа и деформации сдвига на кулачковых механизмах с углом сдвига суммарно 180° в течение 1-2 минут в токе азота при температуре во второй механохимической зоне 70-80°С, в третьей механохимической зоне 5-7°С.

Далее отделяют полученный порошок хелата и растворяют его в деионизированной воде, концентрация хелата в растворе 2,0-2,5% масс. Получают гелевую композицию, содержащую 0,015-0,030% масс, связанного с ГК цинка.

Согласно заявленному способу для получения хелатов цинка используется гиалуроновая кислота, полученная методом бактериального синтеза с молекулярной массой 15-50 кДа (например, низкомолекулярная с молекулярно-весовым распределением 15-50 кДа, производства фирмы RUNXINBIOTECH (Китай)).

Согласно заявленному способу для получения хелатов цинка с ГК используется цинк хлористый ZnCl₂, чда, например, по ГОСТ 4529-78;

Результатом реализации способа является получение хелатного комплекса цинка с гиалуроновой кислотой, где она выполняет функцию лиганда. Предварительная структура хелатного комплекса включает в среднем два дисахаридных звена цепи ГК, связывающих один двухвалентный катион Zn⁺². Ион цинка взаимодействует с шестью атомами кислорода, которые относятся к двум N-ацетильным группам и двум карбоксильным группам противоположных участков цепи. Схематически строение общей структуры таких хелатов представлено на фиг. 1. [В.Н. Хабаров, П.Л. Иванов Биомедицинское применение гиалуроновой кислоты и ее химически модифицированных производных. М., 2020, Гл.1, с. 17-18]. В полученных хелатных соединениях значительно изменена структура полисахаридной цепи, что проявляется в изменении характера и интенсивности колебаний -С=O-, -С-ОН, -С-О- групп, смещении соответствующих линий ИК- Фурье спектров.

В ГОСТ 58484-2019 «Имплантаты на основе гиалуроновой кислоты. Стандартное руководство по определению характеристик гиалуроновой кислоты как основы медицинских изделий» представлен (Фиг. 2 А) стандартизованный ИК-спектр натриевой соли гиалуроновой кислоты с преобразованием Фурье с использованием нарушенного полного внутреннего отражения. Типичные частоты спектра, см-1, для натриевой соли гиалуроновой кислоты: 3275-3390, 1615, 1405, 1377, 1150, 1077, 1045, 946, 893. Авторами был снят ИК-Фурье спектр ГК, используемой в заявленном способе (Фиг. 2 Б). На этом спектре можно увидеть полосы 1616 (с), 1411(ср) и 612 см-1 отвечающие характеристическим колебаниям амида; 1150, 1078, 1044(c), 947(ср), 890 (сл).-соответствующие колебаниям О-Н-групп; полосы 1617 и 1377 отвечают колебания карбоксилов. Пик при 3412 см-1, приписываемый ОН- связей карбинола, более узкий в спектре стандарта.

Полученный согласно заявленному способу хелат цинка с ГК смещает в ИК-спектре положения основных полос -О-Н групп, карбоксильных и карбинольных групп. Поскольку концентрации цинка малы, концентрация хелатных колец в общей массе ГК также мала, изменения спектров приведены после цифровой обработки ИК-спектров полученных конъюгатов. Изменения в спектре ГК для хелата Zn приведены в таблице 2.

Приведенные в табл.2 данные свидетельствуют об участии в образовании хелатов цинка атомов кислорода двух монодентатно-связанных карбоксилатанионов, трех атомов О одного монодентатно и одного хелатносвязанного карбоксилат-аниона, либо четырех атомов О двух хелатно-связанных карбоксилат-анионов. Это соответствует в общем плане предполагаемой структуре хелатов, приведенной на фиг. 1.

Проверка эффективности предложенного протеза СЖ была проведена на модели в эксперименте на лабораторных животных патологии коленного сустава, а именно воспаления и травмы, с последующим изучением эффекта введенного инъекционным методом предложенного протеза на процессы в суставах. Контрольная группа животных - без травм и воспаления. Травму коленного сустава у крыс ланцетом для взятия крови наносили в центр коленного сустава правой лапы крысы медиальнее коленной чашечки. Воспалительный процесс коленного сустава у крыс вызывали путем однократного введения 0,02 мл стерильного раствора лиофилизированного липополисахарида E.coli штамм 026:В6, приготовленного на 0,9% физрастворе в концентрации 15 мг/мл в полость сустава. Воспаление моделировали так же на правом коленном суставе. После нанесения травмы и моделирования воспаления животные наблюдались в течение недели. На фиг. 3 приведены микроскопические фото суставов травмы (фиг. 3А) и воспаления (фиг. 3Б) у забитых животных без лечения. В модели травмы (фиг. 3А) определяется зона деструкции хондроцитов, нарушение организации хряща, отсутствие четкого разграничения слоев суставного хряща, дистрофическими и некробиотическими изменениями (лизис ядра, кариопикноз, вакуолизация цитоплазмы, формирование пузырьковидных клеток). В данной группе повреждение затрагивало поверхностный и промежуточный слой хряща. При этом дистрофические изменения в данной группе превалируют над воспалительными. В модели артроза (фиг. 3Б) воспалительные и поствоспалительные изменения в данной группе превалируют над дистрофическими и некробиотическими. При этом, четко определяется зона деструкции (изъязвления хряща), нарушение полярности и свойств коллегановых волокон, резкое полнокровие сосудов, и расширение и застойные явления в лимфатических сосудах. В местах погибших хондроцитов определяются пучки соединительнотканных элементов.

Далее в пораженные суставные сумки инъекцией (игла СФМ 30 G) вводилась терапевтическая доза протеза СЖ по примеру 1. После инъекции через неделю была проведена микроскопия суставов с травмой (фиг. 3В) и воспалением (фиг. 3Г) у забитых животных.

В модели травмы после инъекции (фиг. 3В) происходит полное восстановление хрящевой поверхности, полярность и рядность хондроцитов практически сохранена, ядра четкие, средние, сосуды микроциркуляторного русла сужены, фиброз не визуализируется. Рыхлая соединительная ткань с мелкими сосудами, с основном суженными. Соединительная и мышечная ткань околосуставной капсулы без патологических изменений. В модели воспаления после инъекции (фиг. 3Г) наблюдали практически полное восстановление целостности хряща, очаговая пролиферация хондроцитов, формирование и восстановление полярности и рядности хряща, сужение сосудов, межклеточной вещество компактно, более базофильно. Параартрикулярные ткани без грубых патологических изменений. Костные балки целые, без дистрофических изменений.

Фигура 1. Предположительная структурная формула хелата цинка с двумя дисахаридными звеньями ГК.

Фигура 2. ИК-спектры стандартной и используемой натриевых солей гиалуроновой кислоты

А) Стандартизованный ИК-спектр натриевой соли гиалуроновой кислоты с преобразованием Фурье с использованием нарушенного полного внутреннего отражения по ГОСТ 58484-2019

Б) ИК-спектр натриевой соли гиалуроновой кислоты с преобразованием Фурье с использованием нарушенного полного внутреннего отражения, используемой в заявленном способе

Фигура 3. Микроскопия (фото) суставов лабораторных животных через неделю после процедур.

A) С травмой без лечения

Б) С воспалением без лечения

B) С травмой после инъекции протеза СЖ по примеру 1

Г) с воспалением после инъекции протеза СЖ по примеру 1

Заявленное изобретение иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1

На первой стадии готовят основу протеза синовиальной жидкости - хелат цинка с гиалуроновой кислотой.

5,0 г порошкообразной натриевой соли ГК с молекулярной массой с распределением 15-50 кДа и 0,075 г сухого порошка цинка хлористого (II), чда (загрузку хлористого цинка проводят, предохраняя от попадания влаги), соотношение 1:0,015 по массе соответственно, подают в зону питания двухшнекового экструдера, где смесь гомогенизируют перемешиванием в токе азота в этой зоне в течение 2-3 минут при 5-10°С. Далее смесь захватывают транспортирующие элементы и перемещают ее по длине цилиндра при вращении. Соотношение зон по длине цилиндра с обрабатывающими шнеками: первая зона питания, где происходит гомогенизация смеси -20% от общей длины, вторая зона механохимической обработки - 40% и третья зона механохимической обработки -40%. Во второй и третьей зоне механохимической обработки смесь подвергается деформации сдвига, благодаря смесительным элементам, состоящим из кулачков, набранных по пять штук с углом поворота между кулачками 45°, 90°, 45° (обратный) в сумме 180°. Размещение элементов под разными углами способствует образованию запоров в движении смеси и вследствие этого его лучшему перемешиванию и большим физическим воздействиям. Процесс проводят при автоматической загрузке смеси в зоны механохимической обработки в токе азота, скорость подачи реакционной смеси поддерживалась при скорости вращения шнеков в пределах 20-100 об⋅мин^-1; нагрузка, определяемая по величине тока привода шнеков экструдера в пределах 5-10 А, соответствует давлению 200 МПа. Температура в первой зоне 5-10°С, во второй 70°С, в третьей зоне 5°С. Продолжительность процесса в целом 4 минуты. Выход продукта-сухого порошка белого цвета составляет 4,93 г (98,8%). Содержание цинка в смеси до 0,75% мае. В ИК-спектре раствора продукта реакции отчетливо наблюдается гипохромный сдвиг полос 1044 см-1 до 1038 см-1 (С-О-валентные колебания карбинола), 946 см-1 до 935 см-1 (внеплоскостные колебания О-Н связи), ослабление полосы 1616 см^-1 (С=O валентные колебания карбоксилата), что свидетельствует о наличии химической связи Zn и ГК.

Для изготовления протеза синовиальной жидкости готовят 2,5% масс, раствор полученного хелата цинка в деионизированной воде перемешиванием в течение 2 часов при комнатной температуре. Получают прозрачный маловязкий гель, динамическая вязкость 200 мПа*с. Содержание цинка в протезе -0,015 масс. %.

Пример 2

Аналогично примеру 1 5,0 г порошкообразной натриевой соли ГК с молекулярной массой с распределением 15-50 кДа и 0,10 г сухого порошка цинка хлористого (II), чда (загрузку хлористого цинка проводят, предохраняя от попадания влаги), соотношение 1:0,02 по массе соответственно, подают в зону питания двухшнекового экструдера, где смесь гомогенизируют перемешиванием в токе азота в этой зоне в течение 2-3 минут при 5-10°С. Далее смесь захватывают транспортирующие элементы и перемещают ее по длине цилиндра при вращении. Соотношение зон по длине цилиндра с обрабатывающими шнеками: первая зона питания, где происходит гомогенизация смеси -20% от общей длины, вторая зона механохимической обработки - 40% и третья зона механохимической обработки -40%. Во второй и третьей зоне механохимической обработки смесь подвергается деформации сдвига, благодаря смесительным элементам, состоящим из кулачков, набранных по пять штук с углом поворота между кулачками 45°, 90°, 45° (обратный) в сумме 180°. Размещение элементов под разными углами способствует образованию запоров в движении смеси и вследствие этого его лучшему перемешиванию и большим физическим воздействиям. Процесс проводят при автоматической загрузке смеси в зоны механохимической обработки в токе азота, скорость подачи реакционной смеси поддерживалась при скорости вращения шнеков в пределах 20-100 об⋅мин^-1; нагрузка, определяемая по величине тока привода шнеков экструдера в пределах 8-10 А, соответствует давлению 250 МПа. Температура в первой зоне 5-10°С, во второй 75°С, в третьей зоне 6°С. Продолжительность процесса в целом 4 минуты. Выход продукта-сухого порошка белого цвета составляет 4,93 г (98,8%). Содержание цинка в смеси до 1,00% мас. В ИК-спектре раствора продукта реакции отчетливо наблюдается гипохромный сдвиг полос 1044 см-1 до 1038 см-1 (С-О-валентные колебания карбинола), 946 см-1 до 935 см-1 (внеплоскостные колебания О-Н связи), ослабление полосы 1616 см-1 (С=0 валентные колебания карбоксилата), что свидетельствует о наличии химической связи Zn и ГК.

Для изготовления протеза синовиальной жидкости готовят 2% масс, раствор полученного хелата цинка в деионизированной воде при комнатной температуре. Получают прозрачный маловязкий гель, вязкость - 150 мПа*с. Содержание цинка в протезе -0,020 масс. %.

Пример 3

Аналогично примеру 1 5,0 г порошкообразной натриевой соли ГК с молекулярной массой с распределением 15-50 кДа и 0,150 г порошка хлористого цинка (II), чда (загрузку хлористого цинка проводят, предохраняя от попадания влаги), соотношение 1:0,030 по массе соответственно, подают в зону питания двухшнекового экструдера, где смесь гомогенизируют перемешиванием в токе азота в этой зоне в течение 2 минут при 5-8°С.Далее смесь обрабатывается аналогично примеру 1 во второй и третьей зонах Процесс проводят при автоматической загрузке смеси в зоны механохимической обработки в токе азота, скорость подачи реакционной смеси поддерживалась при скорости вращения шнеков в пределах 20-80 об*мин-1; нагрузка, определяемая по величине тока привода шнеков экструдера в пределах 7-12 А, соответствует давлению 300 МПа. Температура в первой зоне 5-10°С, во второй 80°С, в третьей зоне 7°С. Продолжительность процесса в целом 4 минуты. Выход продукта- сухого порошка белого цвета с оттенком составляет 4,95 г (95,7%). В ИК-спектре отмечены изменения характерных полос, аналогично примеру 1, но ослабление полосы 1616 см-1 выражено более отчетливо. Это свидетельствует о наличии химической связи Zn и ГК. Содержание цинка в продукте до 1,5% масс.

Для изготовления протеза синовиальной жидкости готовят 2% масс, раствор полученного хелата цинка в деионизированной воде при комнатной температуре. Получают прозрачный маловязкий гель, динамическая вязкость - 210 мПа*с. Содержание цинка в протезе -0,030 масс. %.

Группа изобретений относится к области биодеградируемых гелей и гидрогелей. Протез синовиальной жидкости в виде гидрогелевой водорастворимой композиции на основе модифицированной гиалуроновой кислоты представляет собой 2,0-2,5 мас.% раствор в деионизированной воде хелатного комплекса цинка с гиалуроновой кислотой, имеющей молекулярную массу 15-50 кДа, и с содержанием цинка в хелатном комплексе 0,015-0,030%. Также раскрыт способ получения протеза. Группа изобретений обеспечивает повышенную устойчивость гидрогелевой композиции и ее основы - хелатных комплексов ГК с цинком, снижение количества неконтролируемых примесей, проникающих в суставную сумку, повышенную биодоступность цинка. 2 н.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл., 3 пр.

1. Протез синовиальной жидкости в виде гидрогелевой водорастворимой композиции на основе модифицированной гиалуроновой кислоты, представляющий собой 2,0-2,% мас.% раствор в деионизированной воде хелатного комплекса цинка с гиалуроновой кислотой, имеющей молекулярную массу 15-50 кДа, и с содержанием цинка в хелатном комплексе 0,015-0,030 мас.%.

2. Способ получения протеза синовиальной жидкости по п. 1, включающий:

- синтез хелатного соединения цинка с гиалуроновой кислотой методом твердофазной механохимической реакции, обработкой порошкообразной смеси гиалуроновой кислоты с молекулярной массой 15-50 кДа с хлоридом цинка при соотношении по массе 1:0,015-0,030 соответственно в двухшнековом механохимическом экструдере с зоной питания и двумя реакционными зонами при соотношении длин зон соответственно 20:40:40%, последовательным проведением в одном цикле обработки загрузки сухого порошка гиалуроновой кислоты и сухого порошка хлорида цинка, в зону питания и гомогенизацию перемешиванием в этой зоне в течение 2-3 минут при 5-10°С, перемещением гомогенизированной смеси во вторую и третью зону механохимического экструдера, где смесь обрабатывается с одновременным воздействием давления в пределах 200-300 МПа и деформации сдвига на кулачковых механизмах с углом сдвига суммарно 180° в течение 1-2 минут в токе азота при температуре 70-80°С во второй механохимической зоне, при температуре 5-7°С в третьей механохимической зоне;

- выделение из экструдера сухого порошка хелата цинка с гиалуроновой кислотой;

- получение 2,0-2,5 мас.%, раствора порошка хелата цинка с гиалуроновой кислотой в деионизированной воде растворением его при перемешивании при комнатной температуре.