ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМБИНАЦИЯ, ВКЛЮЧАЮЩАЯ ЭПИДЕРМАЛЬНЫЙ ФАКТОР РОСТА И ПЕПТИД GHRP6 В КАЧЕСТВЕ СТИМУЛЯТОРА СЕКРЕЦИИ, ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ПОСЛЕ ПОВРЕЖДЕНИЯ ГОЛОВНОГО МОЗГА Российский патент 2022 года по МПК A61K38/08 A61K38/18 A61P25/28 

Область техники

Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности к области нейрофармакологии. В частности, оно имеет отношение к фармацевтической комбинации для восстановления после повреждения головного мозга посредством усиления и стимуляции механизмов дифференциации и нейронной специализации в недифференцированных клетках, находящихся в центральной нервной системе, или в нейронах, которые приобретают фенотип и функцию, которые позволяет им заменять другие нейроны, которые погибают из-за ишемического повреждения или протеинопатий. Терапевтическая эффективность комбинации не зависит от момента ее применения.

Предпосылки создания изобретения

Фармакологический подход к повреждению тканей (ишемическому, геморрагическому, компрессионному, из-за нехватки трофических факторов или любому другому повреждению) в центральной нервной системе представляет собой область, которая, хотя и хорошо изучена, остается бесплодной в отношении эффективных терапевтических результатов и совершенно безуспешной на стадии его внедрения в клиническую практику. Это обусловлено сложностью и очень высокой специализацией клеточных компонентов нервной системы, что препятствует регенерации и замене погибших нейронов и глиальных клеток.

Большинство событий, повреждающих ткани нервной системы, происходят во всем мире. Например, ишемический инсульт является второй причиной смерти и третьей ведущей причиной инвалидности во всем мире (Krishnamurthi RV, Neuroepidemiology 2015; 45(3):190-202). Он происходит не только у пожилых людей, поскольку молодые люди также подвержены риску развития ишемических инсультов (Krishnamurthi RV, Neuroepidemiology 2015; 45(3):177-89). Кроме того, случаи травм, нарушающих нервную систему, очень часты и являются причиной инвалидности с высокими социальными издержками (Greenwald BD, J Neurotrauma 2015; 32(23):1883-92).

С другой стороны, ряд заболеваний, вызванных морфологическими и функциональными изменениями внутриклеточных белков, известных как протеинопатии, среди которых болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона и боковой амиотрофический склероз, представляют собой серьезную проблему для здоровья во всем мире (Nicholson KA, Neurotherapeutics 2015; 12 (2):376-83). Против последних заболеваний еще нет лечения, направленного на восстановление головного мозга за счет повышения нейропластичности, с целью уменьшения прогрессирующего течения заболевания и/или вызова значительного восстановления. Другие причины нарушения нервной системы, такие как недостатки трофических факторов (Lewis CM, Stem Cell Res Ther 2014; 5(2):32), встречаются не так часто, как вышеупомянутые заболевания и состояния, но они представляют собой огромную проблему для научного сообщества, которому до сих пор не удавалось внедрить терапию, основанную на восстановлении головного мозга, которая была бы важной и повлияла на улучшение качества жизни этих пациентов. Поэтому существует потребность в поиске фармакологических вмешательствах, способствующих восстановлению головного мозга в таких ситуациях, как ишемическое повреждение и протеинопатии, среди прочих. Клиническая оценка рекомбинантных белков с нейротрофической активностью в качестве лекарственных средств-кандидатов для лечения множества заболеваний нервной системы является рациональным подходом к стимуляции восстановления головного мозга. Однако терапевтический эффект указанных белков в клинической практике до сих пор не был продемонстрирован (Henriques A, et al. Frontiers in Neuroscience. 2010; 4:32; Larpthaveesarp A, et al. Brain Sci 2015; 5(2):165-77).

Существует мнение, объективно подкрепленное фактами, что инвалидность по неврологическим нарушениям является необратимой, поскольку ни один из нейропротекторов, которые до сих пор проходили клиническую оценку, не смог аннулировать эту инвалидность (Nicholson KA, Neurotherapeutics 2015; 12 (2):376-83). Эти лекарственные средства не продемонстрировали положительное влияние на годы жизни с поправкой на качество у выживших. Таким образом, поиск терапевтических альтернатив, которые влияют на снижение инвалидности, связанной с нарушениями нервной системы, такими как нарушения, вызванные ишемическим повреждением, протеинопатиями или другими причинами необратимого повреждения нейронов, в настоящее время имеет решающее значение. Указанные терапевтические альтернативы должны способствовать восстановлению головного мозга у пациентов, страдающих нарушением центральной нервной системы.

Другим критерием является то, что терапевтический подход к ишемическому повреждению головного мозга вместе с нейропротекторным подходом, с помощью тромболизиса (Mowla A, et al, J Neurol Sci 2017; 376:102-5) или нетромболитического лечения (Matsuo R, et al. Stroke 2017; 48(11):3049-56), необходимо провести до истечения 4 часов с момента появления симптомов. Это является одним из основных недостатков известных на сегодняшний день нейропротекторных методов лечения.

Важно различать тот факт, что нейропротекторные терапевтические подходы направлены на ингибирование первичных нейродегенеративных событий. Напротив, терапевтические подходы к восстановлению головного мозга направлены на стимуляцию компенсаторных регенеративных механизмов (Francardo V, et al., Exp Neurol 2017; 298 (Pt B):137-47).

В патентном документе WO2002/053167 описывается комбинация эпидермального фактора роста (EGF) и стимулятора секреции в виде гексапептида, известного как GHRP6, для его сокращенного названия на английском языке (Growth Hormone Releasing Hexapeptide, высвобождающий гормон роста гексапептид). Компоненты комбинации могут применяться одновременно или последовательно для предотвращения повреждения клеток из-за недостатка артериальной крови. Хотя в этом документе упоминается применение этой комбинации для регенеративных или трофических целей, ее применение или применение ее отдельные компоненты для восстановления головного мозга не демонстрируется и не предполагается. С другой стороны, в WO 2006/092106 описывается применение комбинации EGF-GHRP6 для лечения аутоиммунных нарушений нервной системы. Однако в указанном патентном документе не демонстрируется и не предполагается способность комбинации к восстановлению после повреждения головного мозга. В этом изобретении количества EGF с терапевтической эффективностью находятся в диапазоне 1-10 мкг/кг веса тела.

Кроме того, исследования in vivo подтвердили, что комбинация EGF-GHRP6 оказывает нейропротекторное действие в экспериментальных моделях обширного и очагового инфаркта мозга (García DB-H., Et al. Restor Neurol Neurosci 2013; 31(2):213-23). В этих моделях комбинация снижает число или тяжесть неврологических симптомов, уменьшает объем инфаркта, сохраняет плотность нейронов и увеличивает выживаемость у животных с инфарктом по сравнению с контрольными животными, которым вводили носитель. Это нейропротекторное действие возникает только в том случае, если лечение начато в пределах 4 часов после ишемического инсульта. Кроме того, оба компонента комбинации вводятся в количестве порядка сотен микрограммов активного ингредиента на килограмм веса (Subiros N, et al. Neurol Res 2015; 38(3):187-195). Эти исследования на моделях на животных показали терапевтическую эффективность фармакологического вмешательства только в пределах очень короткого периода времени, что было похоже на терапевтическое окно, описанное для других нейропротекторных воздействий (Alberts MJ. Circulation 2017; 135(2):140-2) с использованием доз порядка 100 мкг EGF на кг веса тела и 600 мкг GHRP6 на кг веса тела. Предшествующие исследования не продемонстрировали терапевтическую эффективность по показателю восстановления головного мозга. Кроме того, когда введение фармакологической комбинации происходит через 4 часа после инсульта, нет никаких указаний на терапевтическую эффективность, ни клинически, ни гистологически, по показателю уменьшения объема инфаркта мозга. С другой стороны, применение комбинации EGF-GHRP6 для неврологического восстановления также изучалось на модели аксональной патологии на животных, которая имитирует болезни двигательных нейронов (Del Barco DG et al., Neurotox Res 2011; 19(1):195-209). Терапевтический эффект достигался при дозах порядка 200 мкг на килограмм веса для EGF и 660 мкг на килограмм веса для GHRP6. Нейропластичность описывается в литературе как способность центральной нервной системы к адаптации в ответ на изменения в окружающей среде или вследствие повреждений. Более того, нейропластичность представляет собой способность групп нейронов к реагированию, функциональному и неврологическому, на нехватки вследствие инсультов или к приему на себя роли других поврежденных групп нейронов, на основе реорганизации синапсов и возможности формирования новых синапсов от нейрона или от нескольких поврежденных нейронов (Kaas JH. Neural Plasticity A2 - Smelser, Neil J. En: Baltes PB, editor. International Encyclopedia of the Social & Behavioral Sciences.Oxford: Pergamon; 2001. p. 10542-6).

Существует эндогенная физиологическая реакция нейропластичности, которой недостаточно для обеспечения нейронов и глиальных клеток, чтобы заместить утраченные сложные функции. До сих пор нейропластичность, способствующая восстановлению головного мозга, была опробована и достигнута с помощью методов, которые включают физическую тренировку или обучение когнитивным навыкам, но ни в одном случае фармакологическое вмешательство не было успешно использовано для этой цели. Следовательно, существует потребность в фармакологических вмешательствах, способствующих восстановлению головного мозга. Желательно, чтобы эти терапевтические альтернативы оказывали влияние на снижение инвалидности, возникающей в результате таких состояний нервной системы, как те, которые вызваны ишемическим повреждением, протеинопатиями или другими причинами необратимого повреждения нейронов.

Краткое изложение сущности настоящего изобретения

Настоящее изобретение способствует решению вышеупомянутой проблемы, предоставляя фармацевтическую комбинацию для восстановления после повреждения головного мозга, включающую EGF и пептид GHRP6 в качестве стимулятора секрецию гормона роста. Указанная комбинация является эффективной для повышения нейропластичности в связи с предыдущим повреждением, таким как ишемическое повреждение, протеинопатии или другие причины необратимого повреждения нейронов, за исключением аутоиммунных заболеваний.

В контексте настоящего изобретения термин «фармацевтическая комбинация» относится к комбинации двух активных фармацевтических ингредиентов с различными механизмами биологического действия, некоторыми общими и другими исключительными, причем такие ингредиенты или активные вещества вводятся одновременно или последовательно в ходе лечения нуждающемуся пациенту.

Пептид GHRP6 в качестве стимулятора секреции гормона роста хорошо известен специалистам в данной области техники. Он имеет следующую аминокислотную последовательность: His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂. EGF представляет собой фактор роста, открытый в прошлом веке, который применяется в фармацевтике, косметических средствах и тканевой инженерии.

«Восстановление после повреждения головного мозга» в контексте настоящего изобретения требует регенерации нейронных и глиальных компонентов, поддерживаемой активацией механизмов нейропластичности. Пути активации таких механизмов стимулируются, когда, например, подавляется экспрессия гена, кодирующего галектин-3, одновременно с увеличением экспрессии гена, кодирующего гемопексин, экспрессию которого можно определить с помощью nanoLC-MS (нанофлюидно-жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией), как описано Martinez и другими (Biochemistry and Biophysics Reports 5 (2016) 379-387). Галектин-3 представляет собой лектин, который способствует активации микроглии и, следовательно, помогает увеличить и расширить воспаление в головном мозге, что препятствует эндогенной или стимулированной регенерации. Он был связан с худшим прогнозом у пациентов (Denes, A., y otros, Brain Behav. Immun. 2010; 24: 708-723). Гемопексин, с другой стороны, представляет собой белок, нейрорегенеративная функция которого связана со стимуляцией ангиогенеза после повреждения в результате ишемии головного мозга и/или реперфузии (Dong B y otros, BMC Anesthesiol 2018; 18:2).

В настоящем изобретении термин «пластичность мозга», также известный как «нейропластичность», описывается как способность к установлению новых нейронных цепей (другими нейронами или клетками, которые дифференцируются в направлении нейронного фенотипа), которые позволяют выполнять сложные функции нервной системы, утраченные или нарушенные вследствие ишемических, токсических, хирургических повреждений, травм, протеинопатий, генетических нарушений или других причин необратимого повреждения нейронов, за исключением аутоиммунных заболеваний. Эта способность вносит вклад в восстановление головного мозга.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая комбинация включает от 0,3 мкг до 0,9 мкг EGF на кг веса тела и от 30 мкг до 80 мкг GHRP6 на кг веса тела, эти компоненты проявляют синергетическое действие. Совместное введение этих активных ингредиентов в конкретной схеме введения доз и в течение определенного периода времени показало терапевтическую эффективность, превосходящую таковую, описанную в литературе, предшествующей настоящему изобретению. Восстановление головного мозга, достигаемое с помощью вышеупомянутой фармацевтической комбинации, подтверждается сохранением сложных функций, таких как память и способность к обучению, а также несомненным и быстрым восстановлением двигательных, сенсорных и когнитивных способностей у подвергнутых лечению пациентов. Удивительно, но результаты показали, что при очень неблагоприятных сценариях неврологического нарушения с более чем 80% поврежденных двигательных нейронов, как это происходит при боковом амиотрофическом склерозе, восстановление головного и спинного мозга возможно за счет стимуляции и повышения физиологической нейропластичности и, следовательно, возможно переломить характерное вялое течение этого заболевания.

Указанная фармацевтическая комбинация в некоторой степени способствует замещению утраченной трофики вследствие первичного повреждения. Преимущественно, это усиление механизмов нейропластичности приводит к терапевтической эффективности, не ограничиваясь фармакологическим вмешательством, проводимым в первые часы после повреждения головного мозга. Это является заметным отличием от нейропротекторных вмешательств предшествующего уровня техники. Более того, это усиление механизмов нейропластичности имеет решающее значение для восстановления головного мозга, поскольку физиологическая реакция нейропластичности, запускаемая сразу после инсульта, недостаточна для возращения трофики, утраченной в результате первичного повреждения, и не оказывает значительное влияние на неврологическое восстановление у нуждающегося пациента.

Фармацевтическая комбинация по настоящему изобретению способствует восстановлению головного мозга при заболеваниях нервной системы, которые проявляются двигательными, сенсорными, вегетативными и когнитивными нарушениями, вызванными ишемическими, токсическими, хирургическими повреждениями, травмами, протеинопатиями, генетическими нарушениями или другими причинами необратимого повреждения нейронов, к которым не относятся аутоиммунные заболевания.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения компоненты комбинации EGH-GHRP6 вводятся парентерально либо последовательно, либо одновременно. Пути парентерального введения компонентов комбинации включают внутривенный, интратекальный, интрацеребровентрикулярный путь, в мозжечково-мозговую цистерну или интраназальный путь. В частности, без ограничения, интратекальное введение выполняется посредством люмбальной пункции и/или с использованием устройства, предназначенного для такого рода введения. В случае интраназального пути введение комбинации направлено на удлинение обонятельных луковиц. В одном варианте осуществления настоящего изобретения комбинация состоит из набора, включающего: a) контейнер или флакон, содержащий EGF и фармацевтически приемлемые наполнители или носители, и b) контейнер или флакон, содержащий GHRP6 и фармацевтически приемлемые наполнители или носители. В конкретном варианте осуществления EGF в наборе находится в диапазоне от 5 мкг до 80 мкг на контейнер, а GHRP6 находится в диапазоне от 0,5 мг до 6 мг на контейнер.

В другом аспекте настоящим изобретением предусматривается применение EGF и GHRP6 для производства фармацевтической комбинации для восстановления после повреждения головного мозга. Применение этой фармацевтической комбинации для восстановления головного мозга особенно выгодно. Синергизм между обоими компонентами стимулирует дифференциацию стволовых клеток или недифференцированных нейронов, или клеток на стадии G0, чтобы они становились клетками с нейронным и/или глиальным фенотипом, с возможностью приобретения функций нейронов и глии, которые были утрачены в результате предыдущего повреждения иного характера. Применение этой фармацевтической комбинации, предпочтительно в дозах, предусмотренных настоящим изобретением, имеет особые преимущества, поскольку оно не связано с умеренными или тяжелыми побочными эффектами. Этот терапевтический метод не представляет никакого риска для пациентов.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения комбинация применяется для восстановления после повреждения головного мозга в виде инфаркта мозга. Удивительно, но эта фармацевтическая комбинация приводит к аннулированию нарушения двигательной активности, вызванному инфарктом мозга, как геморрагическим, так и ишемическим. Синергизм, который существует между компонентами фармацевтической комбинации настоящего изобретения, выражается в восстановлении головного мозга, что объективно представляется в виде снижения инвалидности, существенного улучшения качества жизни и выживаемости подвергнутых лечение пациентов. Эти результаты, относящиеся к эффективности, не зависели от времени первого введения, т.е. они не были связаны с узким терапевтическим окном. Это ломает существующую парадигму в отношении нейропротекторных вмешательств. Кроме того, это является неожиданным в свете результатов, полученных с использованием комбинации EGF и GHRP6 на моделях ишемии головного мозга на животных, и тех, которые были описаны в случае других подобных клинических вмешательств (Mowla A, et al., J Neurol Sci 2017; 376:102-5), когда терапевтическая эффективность демонстрируется только тогда, когда лечение начинается до 4 часов после ишемического инсульта.

Напротив, введение фармацевтической комбинации по настоящему изобретению не ограничивается характеристическим терапевтическим окном, составляющим приблизительно от 4 до 6 часов (для нейропротекторных, тромболитических или нетромболитических вмешательств) в случае ишемических нарушений. Таким образом, в клиническом исследовании настоящего изобретения первое применение комбинации имело место между начальным моментом диагностирования инфаркта мозга и 24 часами после постановки диагноза.

Кроме того, фармацевтическую комбинацию по настоящему изобретению применяли, иногда, для новорожденных, серьезно пораженных тяжелой гипоксией у новорожденных. Был получен очень благоприятный результат не только в отношении выживаемости этих новорожденных, но и в плане восстановления головного мозга за счет повышения нейропластичности. Оценка этих младенцев в конце первого года жизни показала меньшее, чем ожидалось, число неврологических осложнений, учитывая величину и тяжесть гипоксии у новорожденных. Подобным образом и неожиданно было установлено, что фармацевтическая комбинация по настоящему изобретению повышает мышечную силу и улучшает глотательный рефлекс, и снижает прогрессирование дизартрии у подвергнутых экспериментальному лечению пациентов с боковым амиотрофическим склерозом, у которых его начало проявилось в продолговатом мозге.

Следовательно, настоящим изобретением также предусматривается способ восстановления после повреждения головного мозга, в котором терапевтически эффективное количество фармацевтической комбинации, включающей EGF и GHRP6, вводится пациентам, нуждающимся в этом. В одном варианте осуществления настоящего изобретения терапевтически эффективное количество EGF составляет от 0,3 мкг до 0,9 мкг этого фактора роста на кг веса тела, а терапевтически эффективное количество GHRP6 составляет от 30 мкг до 80 мкг GHRP6 на кг веса тела пациента. Этот подход настоящего изобретения применим, когда повреждение имеет ишемический, токсический, хирургический, травматический характер, вызвано протеинопатиями, генетическими нарушениями или другими причинами необратимого повреждения нейронов, за исключением аутоиммунных заболеваний.

В конкретном варианте осуществления способ по настоящему изобретению применяется, когда повреждения головного мозга вызвано инфарктом мозга или тяжелой гипоксией головного мозга у новорожденного. В другом варианте осуществления способ по настоящему изобретению применяется в связи с обширным и хроническим повреждением двигательных нейронов, как в случае бокового амиотрофического склероза, поскольку он снижает скорость прогрессирования указанного заболевания, а также уменьшает тяжесть характерных неврологических симптомов. Комбинацию вводят при лечении болезни двигательного нейрона прогрессирующего и вялого течения, для повышения мышечной силы, глотательного рефлекса и уменьшения дизартрии.

Терапевтическая комбинация, которую вводят в способе восстановления головного мозга по настоящему изобретению, помимо повышения нейропластичности, сама по себе представляет трофическую поддержку, аналогичную той, которая создается физиологически на стадиях эмбриона и плода. Это благоприятствует не только нейронам и/или глиальным клеткам, но и всем компонентам нейроваскулярной единицы. Следовательно, трофическая поддержка, предоставляемая указанной фармацевтической комбинацией, имитирует физиологическую среду тканей нервной системы.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Графическое представление результатов протеомных экспериментов. На фиг. 1А представлена тепловая карта всех белков, идентифицированных в каждом хроматографическом цикле, демонстрирующая различный профиль экспрессии через 24 часа после лечения крыс комбинацией 0,6 мкг EGF/кг веса тела и 40 мкг GHRP6/кг веса тела (A), по сравнению с лечением носителем (C), у крыс с очаговым инфарктом мозга, а также по сравнению с контрольной группой, подвергнутой псевдооперации (B). На фиг. 1B представлены вулканные диаграммы, показывающие дифференциально экспрессируемые белки в экспериментальной группе, подвергнутой лечению комбинацией (0,6 мкг EGF/кг веса тела и 40 мкг GHRP6/кг веса тела), по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель.

Фиг. 2. Стратификация пациентов с инфарктом мозга в соответствии с клинической оценкой тяжести неврологического состояния на момент постановки диагноза. Пациенты были случайным образом расчленены на три группы лечения. Клиническая оценка тяжести неврологического состояния осуществлялась в соответствии с критериями шкалы NIHSS.

Фиг. 3. Процент выживаемости пациентов с инфарктом мозга, получавших два уровня доз комбинации EGF и GHRP6 или традиционную терапию.

Фиг. 4. Распределение результатов, наблюдаемых у пациентов, согласно неврологической оценке на основе модифицированной шкалы Ренкина, через 90 дней после появления симптомов инфаркта мозга. Пациенты получали два уровня доз комбинации EGF-GHRP6 или традиционную терапию. Панели A-C соответствуют степени тяжести инфаркта мозга, оцененной по шкале NIHSS на момент постановки диагноза. Разные буквы указывают на значимые различия, p<0,001, во всех случаях, согласно критерию хи-квадрат для сравнения долей.

Фиг. 5. Сравнение уровней галектина-3 в сыворотке пациентов, получавших традиционную терапию или два уровня доз комбинации EGF-GHRP6, с использованием диаграмм в виде блоков с усами. Различия между тремя группами сравнивали, используя критерий Краскела-Уоллиса, а затем критерия Данна. Одинаковые буквы указывают на отсутствие значимых различий, разные буквы указывают на статистически значимые различия.

Фиг. 6. Линейный регрессионный анализ, демонстрирующий, что в случае группы пациентов, подвергнутой лечению фармацевтической комбинацией 0,8 мкг EGF/кг веса тела и 50 мкг GHRP6/кг веса тела, нет значимой корреляции между временем начала лечения и клиническим развитием за 90 дней, по шкале Ренкина (0-5) (A). В случае группы, получавшей комбинацию 10 мкг EGF/кг теса тела и 5 мкг GHRP6/кг веса тела, демонстрируется положительная и значимая корреляция между временем начала лечения и клиническим развитием по шкале Ренкина (0-5) (В).

Фиг. 7. Анализ оценки когнитивной функции по монреальской шкале (MoCA) через 2 и 6 месяцев после инфаркта мозга у пациентов, получавших комбинированную терапию, с использованием двух уровней доз комбинации EGF-GHRP6, или традиционную терапию. В него также входит контрольная группа из 30 пациентов с неневрологическими заболеваниями. Звездочки указывают на статистически значимые различия согласно критерию Краскела-Уоллиса, а затем критерию Данна.

Подробное описание вариантов осуществления/примеры вариантов осуществления

Пример 1. Анализ дифференциальной экспрессии белков, приводящих к лечению с использованием EGF и GHRP6, в зоне ишемической полутени у крыс с очаговым инфарктом мозга

Чтобы иметь представление об эффекте лечения комбинацией EGF-GHRP6 в зоне ишемии полутени, был проведен эксперимент на крысах с очаговым инфарктом мозга, вызванным внутримозговым введением эндотелина 1. Через два часа после внутримозгового введения эндотелина 1 крыс подвергали лечению комбинацией EGF-GHRP6 (0,6 мкг/кг веса тела EGF и 40 мкг/кг веса тела GHRP6, n=9) или носителем (n=10). За обеими экспериментальными группами наблюдали, и животных каждой группы умерщвляли вместе с животными из группы, подвергнутой псевдооперации, через 3, 5 и 24 часа после лечений указанной фармацевтической комбинацией. Гомогенаты тканей головного мозга всех животных были приготовлены и объединены в три группы. Были выполнены следующие процедуры: общие белки, ферментативное расщепление, анализ смеси пептидов с помощью жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (ЖХ-МС/МС) и идентификация белков. Последнее было выполнено в базах данных о последовательностях на основе спектров МС/МС, что сократило поиск до таксономии Rattus norvegicus в базе данных Swissprot (29982 белка, апрель 2016 г.). Для безмаркерной количественной оценки в качестве статистического инструмента использовалась программа Perseus v.1.5.2.6. Рассматривали не менее трех копий, определенных количественно для каждого белка. Парный тест проводили для каждого представляющего интерес состояния относительно контрольных животных, подвергнутых псевдооперации, или между животными, получавшими комбинацию EGF-GHRP6, и не подвергнутыми лечению животными. Нулевая гипотеза была отвергнута для белков с коэффициентом изменения ≥1,5 и р-значением, составляющим менее 0,05. Для группы белков со значительными изменениями также учитывался уровень ложноположительных результатов (FDR), составляющий 5%.

Количественный анализ каждого ишемического образца от животного выполняли путем сравнения с подвергнутыми псевдооперации животными одновременно. Кроме того, животных с очаговым инфарктом мозга, подвергнутыми лечению комбинацией EGF-GHRP6, сравнивали с животными, получавшими носитель. Наибольшее количество белков, изменяющих уровень своей экспрессии, было выявлено под действием комбинации через 24 часа после лечения. 97 белков увеличивали уровни своей экспрессии, и 124 белка снижали их. Результаты протеомных экспериментов можно увидеть на фиг. 1.

Среди белков, которые значительно снижали уровни своей экспрессии в зоне ишемической полутени, благодаря эффекту комбинированного лечения EGF-GHRP6, находятся галектин-3 и переносчик возбуждающих аминокислот типа 2. Напротив, белки гемопексин, неудезин, цитоглобин, парвальбумин и кальбиндин значительно увеличивали уровни своей экспрессии.

Пример 2. Эффект введения комбинации EGF-GHRP6 на восстановление головного мозга у пациентов, перенесших инфаркт мозга

Пятьдесят пациентов, перенесших инфаркт мозга ишемической этиологии, получали лечение комбинацией EGF-GHRP6 с момента постановки диагноза. Диагностика включала временной интервал до 24 часов после появления симптомов. Лечение проводилось в течение недели и состояло из парентерального последовательного введения 0,8 мкг/кг веса тела EGF и 50 мкг/кг веса тела GHRP6 каждые 12 часов. Вторую группу из 35 пациентов подвергали лечению комбинацией EGF-GHRP6: 10 мкг/кг веса тела EGF и 5 мкг/кг веса тела GHRP6, следуя той же схеме введения. Другая группа из 42 пациентов с инфарктом мозга ишемической этиологии получала традиционную терапию, которая в основном заключалась в лечении симптомов и осложнений.

Все пациенты подвергались экспертизе и оценивались по шкале оценки инфаркта мозга Национального института здравоохранения США (NIHSS), которая отражала их неврологическое состояние на момент постановки диагноза. Эта оценка позволила расчленить пациентов на три группы: инфаркт мозга легкой степени (NIHSS 0-7), инфаркт мозга средней степени (NIHSS 8-14) и инфаркт мозга тяжелой степени (NIHSS более 14). Это неврологическое состояние пациентов на момент постановки диагноза, в отправной точке, в соответствии с группой исследования, представлено на фиг. 2, где можно увидеть, что не было различий в средней неврологической оценке каждой группы. Впоследствии, в день 90, исходная оценка по NIHSS была началом отсчета (в качестве отправной точки) для сравнения с неврологическим состоянием в результате лечений, оцененным по модифицированной шкале Ренкина. Анализ выживаемости показал, что 96% пациентов выжили в группе, подвергнутой лечению комбинацией EGF-GHRP6: 0,8 мкг/кг веса тела EGF и 50 мкг/кг веса тела GHRP6, и 60% пациентов выжили в группе, получавшей традиционную терапию (p=0,0001, согласно логарифмическому ранговому критерию Мантеля-Кокса). По сравнению с группой, подвергнутой лечению другой фармацевтической комбинацией (10 мкг/кг веса тела EGF и 5 мкг/кг веса тела GHRP6), разница также была значимой (p=0,02, согласно тому же статистическому критерию). Эти результаты представлены на фиг. 3.

Через 90 дней после диагностирования инфаркта мозга пациентов оценивали по модифицированной шкале Ренкина (фиг. 4). Пациенты с оценкой от 0 до 2 имели удовлетворительные изменения, с меньшим числом неврологических последствий и меньшей инвалидностью вследствие функциональных нарушений. Напротив, пациенты с оценкой выше 3 имели худшее неврологическое состояние и большую инвалидностью вследствие функциональных нарушений. Наивысшая оценка по шкале Ренкина эквивалентна худшему состоянию; в случае этой оценке умершим пациентам присваивалась оценка 5 по шкале Ренкина. Группа пациентов, получавших терапию с использованием 0,8 мкг/кг веса тела EGF и 50 мкг/кг веса тела GHRP6, продемонстрировала улучшение неврологического состояния по сравнению с группой, подвергнутых лечению другой комбинацией (10 мкг/кг веса тела EGF и 5 мкг/кг веса тела GHRP6), а также по сравнению с группой, получавшей традиционную терапию (критерий хи-квадрат для сравнения долей). Эта разница заметна даже у пациентов с наихудшим неврологическим состоянием на момент постановки диагноза (NIHSS>15).

В дополнение к клинической оценке через 90 дней после инфаркта мозга определяли уровни галектина-3 в сыворотке. Концентрацию этого лектина измеряли с помощью имеющегося в продаже иммуноанализа ELISA (R&D Systems, Minneapolis, США). Три группы сравнивали с помощью критерия Краскела-Уоллиса, а затем критерия Данна. Значимое снижение этого биомаркера было продемонстрировано у пациентов, подвергнутых лечению фармацевтической комбинацией 0,8 мкг/кг веса тела EGF и 50 мкг/кг веса тела GHRP6, по сравнению с пациентами, получавшими традиционную терапию или другую комбинацию EGF и GHRP6 (фиг. 5).

Последний результат, помимо подтверждения данных протеомного исследования, проведенного при доклинических оценках (пример 1), показывает, что лечение фармацевтической комбинацией 0,8 мкг/кг веса тела EGF и 50 мкг/кг веса тела GHRP6 снижает уровни галектина-3 в сыворотке. Это один из лектинов, которые активируют микроглию через toll-подобный рецептор (а именно, TLR4) и, следовательно, способствует снижению и сдерживанию воспалительной реакции в головном мозге, которая связана с наихудшим прогнозом. Это снижение галектина-3 в сыворотке связано с более благоприятным восстановлением головного мозга, вызванным фармацевтической комбинацией по настоящему изобретению.

В этом клиническом исследовании было установлено время включения пациентов до 24 часов после появления неврологических симптомов для определения того, можно ли увидеть эффект этой комбинации за пределами классического терапевтического окна, установленного для вмешательств у пациентов с инфарктом мозга (Mowla A, et al., J Neurol Sci 2017; 376:102-5). Удивительно, но группа пациентов, подвергнутых лечению фармацевтической комбинацией 0,8 мкг/кг веса тела EGF и 50 мкг/кг веса тела GHRP6, не продемонстрировала значимой корреляции между временем начала лечения и клиническим исходом через 90 дней, определяемой по шкале Ренкина (с использованием линейного регрессионного анализа и коэффициента ранговой корреляции Спирмана r = -0,1, p=0,45) (фиг. 6А). Напротив, в группе, которая получала другую комбинацию (10 мкг/кг веса тела EGF и 5 мкг/кг веса тела GHRP6), была продемонстрирована положительная и значимая корреляция между отсроченным началом лечения и наихудшим клиническим исходом по шкале Ренкина (с использованием линейного регрессионного анализа и коэффициента Спирмана r=0,36, p=0,03) (фиг. 6B). Этот результат очень важен, поскольку он означает, что назначение лечения в любое время в течение 24-часового периода после появления симптомов связано с терапевтическим эффектом. Кроме того, этот результат расширяет критерии отбора на пациентов, нуждающихся в восстановлении головного мозга, и контрастирует с результатами, достигнутыми с помощью нейропротекторных терапевтических вмешательств, предшествующих настоящему изобретению.

Когнитивная функция часто ухудшаются у пациентов, перенесших инфаркт мозга. Таким образом, когнитивная функция является одной из наиболее важных мишеней механизмов нейропластичности, и допускается ее восстановление, когда будет успешным восстановление головного мозга. В настоящем исследовании тест для оценки когнитивной функции (монреальская шкала оценки когнитивной функции, MoCA) применялся через 2 и 6 месяцев после эпизода инфаркта мозга для пациентов, подвергнутых лечению фармацевтической комбинацией 0,8 мкг/кг веса тела EGF и 50 мкг/кг веса тела GHRP6, для пациентов, получавших лечение комбинацией 10 мкг/кг веса тела EGF и 5 мкг/кг веса тела GHRP6, а также для группы, получавшей традиционную терапию. Также была включена контрольная группа из 30 пациентов с неневрологическими заболеваниями, сопоставленную по возрасту и полу с пациентами с инфарктом мозга, участвовавшими в этом исследовании. Результаты этого исследования показали, что пациенты, подвергнутые лечению фармацевтической комбинации 0,8 мкг/кг веса тела EGF и 50 мкг/кг веса тела GHRP6, после двух месяцев указанного лечения имели заметное улучшение когнитивной функции по сравнению с пациентам, которые получали традиционную терапию или терапию с использованием другой комбинации (10 мкг/кг веса тела EGF и 5 мкг/кг веса тела GHRP6). Через 6 месяцев эта различие в когнитивной функции не только сохраняется в группе, подвергнутой лечению комбинацией 0,8 мкг/кг веса тела EGF и 50 мкг/кг веса тела GHRP6 (статистически значимо), но, что удивительно, когнитивная функция в этой группе была схожа с таковой у пациентов с неневрологическими заболеваниями (в контрольной группе) (фиг. 7).

Пример 3. Эффект введения комбинации EGF и средства, стимулирующего секрецию, в виде гексапептида на восстановление головного мозга у пациентов с боковым амиотрофическим склерозом

Сорок пациентов с точным диагностированием бокового амиотрофического склероза подвергали лечению 0,6 мкг/кг веса тела EGF и 60 мкг/кг веса тела GHRP6, внутривенно, через день в течение 6 месяцев, вместе с Rilutek® (Рилузолом). Ранее эти пациенты были расчленены на группы в соответствии с происхождением заболевания: спинномозговым (n=25) или бульбарным (n=15). Другую группу из 30 пациентов с точным диагностированием бокового амиотрофического склероза, также расчлененную в соответствии с происхождением, спинномозговым (n=21) или бульбарным (n=9), подвергали лечению только Rilutek®.

Перед началом и после окончания исследования всех пациентов оценивали, используя функциональную шкалу для бокового амиотрофического склероза (ALSFRS-R). Шкала ALSFRS-R обычно используется для неврологической и функциональной оценки пациентов с указанным заболеванием. Эта шкала включает различные функциональные элементы, например, связанные с языком, слюноотделением, глотанием, умением писать, обращением со столовыми принадлежностями, одеванием и санитарной обработкой, поворотом в постели, подъемом по лестнице и дыханием.

После 6 месяцев лечения пациенты, одновременно получавшие 0,6 мкг/кг веса тела EGF и 60 мкг/кг веса тела GHRP6 и Rilutek®, продемонстрировали некоторое клиническое улучшение, как показано в таблице 1. Это улучшение было обнаружено у пациентов с началом проявления заболевания как в спинном мозге, так и в продолговатом мозге, и заключались в снижении слюноотделения, улучшении глотания и дыхания и небольшом улучшении дизартрии. Ничто из последнего не наблюдалось в группе пациентов, подвергнутых лечению только Rilutek®.

Таблица 1. Сравнение ALSFRS-R до и после лечения комбинацией EGF-GHRP6 и Rilutek® или только Rilutek®

Группа Происхождение симптомов заболевания ALSFRS-R
До лечения ALSFRS-R
после лечения EGF 0,6 мкг/кг, GHRP6 60 мкг/кг,
+ Rilutek^® спинной мозг 38,4±6,2 39,4±3,3 продолговатый мозг 35,3±7,1 36,9±3,1 Rilutek^® спинной мозг 38,7±4,4 38,2±3,34 продолговатый мозг 35,1±6,2 33,1±8,32

Пример 4. Эффект введения комбинации EGF-GHRP6 на восстановление головного мозга у новорожденных с тяжелой гипоксией мозга

Группа новорожденных, у которых по разным перинатальным причинам была тяжелая гипоксия головного мозга, получала экспериментальное лечение с использованием 0,3 мкг/кг веса тела EGF и 30 мкг кг веса тела GHRP6 (n=9). Лечение проводилось в течение недели и заключалось в парентеральном введении комбинации EGF-GHRP6 каждые 12 часов.

На момент постановки диагноза у всех новорожденных были выявлены электроэнцефалографические изменения медленноволнового типа, а при ультразвуковом исследовании наблюдались признаки отека и эхогенности в перивентрикулярных областях. С клинической точки зрения наблюдались признаки легкой легочной гипертензии, артериальной гипотонии, трудности с поддержанием температуры тела, гипогликемия и диурез менее 1 мл в час. Во всех случаях в течение первых 24 часов регистрировались судороги, и в большинстве случаев наблюдались слабый сосательный рефлекс и миоз.

Младенцы наблюдались в течение одного года с ежеквартальными консультациями. При оценке первого триместра у 7 детей, получавших указанные дозы EGF и GHRP6, электроэнцефалограмма характеризовалась наличием периодических мультифокальных разрядов, но менее частых, чем те, которые определялись ранее перинатально, и во всех случаях дети реагировали на прерывистую световую стимуляцию. Ультрасонографическое исследование показало, что перивентрикулярные кистозные очаги в головном мозге явно регрессируют. Физикальное обследование, в частности неврологическое обследование, по шкале Амьмели-Тисона, выявило легкую дисфункцию центральной нервной системы, состоящую из небольших нарушений мышечного тонуса и рефлексов, нарушений двигательной активности и, в целом, задержки психомоторного развития, с легким нарушением зрения и слуха. Через шесть месяцев у 8 из 9 детей, подвергнутых лечению комбинацией EGF-GHRP6, электроэнцефалограмма была нормальной. В состоянии бодрствования отмечались ритмичность и реактивность на прерывистую световую стимуляцию в тета-диапазоне. В состоянии сна наблюдалась гипнагогическая гиперсинхрония с пароксизмальными элементами, но не эпилептиформная. Магнитно-резонансные томограммы показали, что перивентрикулярные кистозные очаги исчезли, а нормальный вид базальных ядер был подтвержден компьютерной томографией. При неврологическом обследовании не выявлено ни нарушений мышечного тонуса и рефлексов, ни двигательной активности. Было подтверждено нормальное психомоторное развитие в соответствии с возрастом. Расстройств зрения и слуха не обнаружено. В целом младенцы хорошо реагировали на социальную среду.

В возрасте одного года у 8 из 9 подвергнутых лечению детей картина энцефалограммы была нормальной, во время бодрствования основной ритм задних отделов 6-7 Гц, двухфазные от средних до высоких потенциалы, и двусторонняя синхронность в затылочных областях была подтверждена на мигание. Способность реагировать на прерывистую световую стимуляцию отмечалась на низких частотах. Запись сна не выявила нерегулярной активности парадоксального сна, но были подтверждены симметричные и синхронные веретена сна. Экспериментальное вначале лечение комбинацией EGF-GHRP6 показало, что это фармакологическое вмешательство у новорожденных с тяжелой гипоксией было терапевтически эффективным, поскольку развитие этих младенцев было намного более благоприятным, чем развитие новорожденных с тяжелой гипоксией, получавших только традиционную терапию, которые продемонстрировали значительную задержку неврологического развития в соответствии с возрастом.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к применению эпидермального фактора роста (EGF) и пептида GHRP6, усиливающего секрецию гормона роста для изготовления фармацевтической комбинации для восстановления повреждения головного мозга после инфаркта мозга или гипоксии мозга. Указанная комбинация включает 0,3 - 0,9 мкг EGF на кг веса тела и 30 - 80 мкг GHRP6 на кг веса тела Изобретение эффективно для восстановления повреждения головного мозга после инфаркта мозга или гипоксии мозга. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 7 ил., 1 табл., 4 пр.

1. Применение эпидермального фактора роста (EGF) и пептида GHRP6, усиливающего секрецию гормона роста для изготовления фармацевтической комбинации для восстановления повреждения головного мозга после инфаркта мозга или гипоксии мозга, где комбинация включает 0,3 - 0,9 мкг EGF на кг веса тела и 30 - 80 мкг GHRP6 на кг веса тела.

2. Применение по п. 1, где первое введение комбинации осуществляется между начальным моментом диагностирования инфаркта мозга и 24 часами после постановки диагноза.

3. Способ восстановления повреждения головного мозга после инфаркта головного мозга, в котором терапевтически эффективное количество фармацевтической комбинации, включающей эпидермальный фактор роста (EGF) и пептид GHRP6, усиливающий секрецию гормона роста, где комбинация включает 0,3 - 0,9 мкг EGF на кг веса тела и 30 - 80 мкг GHRP6 на кг веса тела вводят пациенту, нуждающемуся в этом.

4. Способ по п. 3, в котором повреждение головного мозга вызвано инфарктом мозга, тяжелой гипоксией головного мозга у новорожденных или боковым амиотрофическим склерозом.

5. Способ по п. 3, в котором комбинацию вводят при лечении болезней двигательных нейронов прогрессирующего и вялого течения для повышения мышечной силы, глотательного рефлекса и для уменьшения дизартрии.

6. Способ по п. 3, в котором комбинацию вводят для сохранения сложных функций, таких как память, способности к обучению, восстановления двигательных, сенсорных и когнитивных способностей у людей.