Способ донозологической диагностики стрессорной кардиомиопатии у спортсменов при экспериментальном хроническом физическом перенапряжении Российский патент 2022 года по МПК G09B23/28 G01N33/564 G01N33/573 G01N33/68 

Способ донозологической диагностики стрессорной кардиомиопатии у спортсменов при экспериментальном хроническом физическом перенапряжении. Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической лабораторной диагностике и кардиологии, и может быть использовано для донозологической диагностики стрессорной кардиомиопатии у спортсменов.

Совместным официальным заявлением Европейского общества спортивной науки (the European College of Sport Science) и Американского общества спортивной медицины (the American College of Sports Medicine) в 2013 декларирован унифицированный подход к стадийности развития патологических последствий утомления – функциональное, а затем нефункциональное перенапряжение (Functional and Non-Functional Overreaching – FOR и NFOR, соответственно), а затем перетренированность (OT, либо Overtraining Syndrom – OTS). ( Meeusen R., Duclos M., Foster C., Fry A., GleesonM., Nieman D., Raglin J., Rietjens G., Steinacker J., Urhausen A. Prevention, Diagnosis, and Treatment of the Overtraining Syndrome: Joint Consensus Statement of the European College of Sport Science and the American College of Sports Medicine // Medicine & Science in Sports & Exercised (Official Journal of the American College of Sports Medicine). – 2013. – V.45. – Issue 1. – P. 186-205). В результате перетренированности происходит срыв адаптации сердечно-сосудистой системы, что выражается в явлении миокардиодистрофии на почве физического перенапряжения, частота которой составляет у спортсменов от 6 до 16 %. (Клинические рекомендации по диагностике и лечению общего и частных синдромов перенапряжения центральной нервной системы, сердечно-сосудистой системы, опорно-двигательного аппарата, иммунной системы и переутомления у спортсменов высокой квалификации: Клинические рекомендации под ред. В.В. Уйба ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр спортивной медицины и реабилитации Федерального медико-биологического агентства», Москва 2018). По мнению большинства исследователей, у высококвалифицированных спортсменов признаки хронического перенапряжения ССС, сопровождающиеся изменениями ЭКГ и требующими углубленного кардиологического обследования, составляют до 40%, против 11,8% у лиц, занимающихся массовым спортом (Кардиология. Национальное руководство. Краткое издание / Под ред. Е.В. Шляхто. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2020-800с.). Стрессорная кардиомиопатия (альтернативные обозначения -"миокардиодистрофия", "дистрофия миокарда вследствие физического перенапряжения", "спортивное сердце") является наиболее распространенной патологией сердца у спортсменов, и по международной классификации болезней (МКБ-10) относится к кардиомиопатиям, обусловленным воздействием лекарственных средств и других внешних факторов (код 142.7). (Гаврилова Е.А. Спортивное сердце. Стрессорная кардиомиопатия / Е.А. Гаврилова. - М. Советский спорт, 2007. - 198 с.). Основными методами диагностики являются: Мониторинг ЭКГ показателей, в том числе по Холтеру, биохимический контроль показателей аминотрансфераз, креатинина, КФК, магния в крови (в том числе по соотношению уровней АСТ/АЛТ, АСТ/КФК), компьютерный анализ сердечного ритма (Клинические рекомендации по диагностике и лечению общего и частных синдромов перенапряжения центральной нервной системы, сердечно-сосудистой системы, опорно-двигательного аппарата, иммунной системы и переутомления у спортсменов высокой квалификации: Клинические рекомендации под ред. В.В. Уйба ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр спортивной медицины и реабилитации Федерального медико-биологического агентства», Москва 2018). Однако лабораторные маркеры на сегодняшний день малоинформативны. А изменения на ЭКГ могут отсутствовать вследствие диффузного или очагового характера дистрофии миокарда. Указанные обследования не позволяют выявить стрессорную кардиомиопатию на донозологическом этапе. Ключом к решению проблемы могут стать новые методы ранней диагностики стрессорной кардиомиопатии, которые позволят своевременно выявлять патологию миокарда, когда еще отсутствуют изменения на ЭКГ и сохранена физическая работоспособность.

Известен способ, согласно которому одним из критериев диагностики стрессорной кардиомиопатии является выявление в сыворотке крови антител к антигену миокарда в реакции пассивной гемагглютинации. (Гаврилова Е. А. Стрессорная кардиомиопатия у спортсменов. Автореф. Докт. Дисс., СПб. - 2001. - 48с.) Задачей данного способа является повышение результативности лечения стрессорной кардиомиопатии за счет более раннего ее диагностирования. Недостатком этого способа является то, что способ выявляет наличие дистрофии миокарда на клинической стадии, но не позволяет выявить ее на доклинической стадии.

Известен также способ, состоящий в том, что в сыворотке крови с помощью реакции торможения пассивной гемагглютинации определяют наличие кардиального антигена, и при снижении титра антимиокардиальной тест-сыворотки в присутствии сыворотки исследуемого лица в два и более раза, диагностируют стрессорную кардиомиопатию. Техническим результатом является выявление стрессорной кардиомиопатии на доклинических стадиях развития (Патент № 2292046 Российская Федерация, МПК G01N 33/53 (2006/01). Способ диагностики стрессорной кардиомиопатии: № 2005109609: заявл. 04.04.2005: опубл. 20.01.2007 / Таймазов В.А., Афанасьева И.А. Левин М.Я., Василенко В.С., Софронов Б.Н., Антонова И.Н., Косицкая Л.С.; заявитель ГОУВПО Санкт-Петербургская государственная академия физической культуры им. Лесгафта ПИНРО). – 8 с.). Недостатком этого способа является то, что изменения не являются строго специфичными для кардиомиопатии при физическом перенапряжении (Е.А. Гаврилова, 2015).

В связи с этим представляется актуальным разработка нового, доступного, специфичного способа донозологической диагностики стрессорной кардиомиопатии.

Известно, что сердечный тропонин I (альтернативные обозначения - cTnI; ген тропонина I; gene troponin I cardiac; TNNI3), альфа-актин 1 сердечной мышцы (альтернативные обозначения - ACTC1; ген актина альфа; gene actin alpha, cardiac muscle; gene ACTC), тяжелая цепь бета-миозина 7В сердечной мышцы (альтернативные обозначения - MYH7B; ген бета тяжелой цепи сердечного миозина; gene myosin, heavy chain 7, cardiac muscle, beta; gene MYH 7; gene myosin, cardiac, heavy chain, beta; gene MYHCB) являются компонентами сократительного аппарата миокардиальных клеток и экспрессируются почти исключительно в сердце, это определяет их высокую специфичность в качестве биомаркера повреждения миокарда (Mogensen J., Kruse T.A., Borglum A.D. Assignment of the human cardiac troponin I gene (TNNI3) to chromosome 19q13.4 by radiation hybrid mapping. - Cytogenet. Cell Genet., 1997, v. 79, p. 272-273; Hamada H., Petrino M.G., Kakunaga T. Molecular structure and evolutionary origin of human cardiac muscle actin gene. - Proc.Natl. Acad.Sci., 1982, v. 79, p. 5901-5905; Matsuoka R., Yoshida M.C., Kanda N., Kimura M., Ozasa H., Takao A. Human cardiac myosin heavy-chain gene mapped within chromosomal region 14q11.2-q13. - Cytogenet.Cell Genet., 1989, v. 51, p. 1040-1041.; Qin H., Kemp J., Yip M.Y., Lamp-Po-Tang P.R.L., Hoh J.F.Y., Morris B.J. Localization of human cardiac beta-myosin heavy chain gene (MYH7) to chromosome 14q12 by in situ hybridization. - Cytogenet.Cell Genet., 1990, v. 54, p. 74-76).

Технической проблемой, на решение которой направлено изобретение, является разработка способа лабораторной диагностики стрессорной кардиомиопатии на донозологическом этапе при экспериментальном хроническом физическом перенапряжении (перетренированности).

Техническим результатом, на достижение которого направлено заявленное изобретение, является обеспечение донозологической диагностики стрессорной кардиомиопатии при экспериментальном хроническом физическом перенапряжении(перетренированностью) путем количественного определения аутоантител к cTnI, ACTC1 и MYH7В в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа. Технический результат достигается за счет реализации способа, включающего определение концентрации аутоантител к cTnI, ACTC1 и MYH7В в сыворотке крови крыс с экспериментальной перетренированностью, и при значениях концентрации аутоантител к cTnI 13,3 -25,3 нг/мл, к ACTC1 33,4-89 нг/мл, к MYH7В 12,3-28,9 диагностируют доклиническую форму стрессорной кардиомиопатии. Возможность диагностики стрессорной кардиомиопатии с помощью определения концентрации аутоантител к cTnI, ACTC1 и MYH7В была подтверждена экспериментально на взрослых крысах-самцах линии Wistar со смоделированным хроническим физическим перенапряжением.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Объектом исследования является сыворотка крови животных со смоделированной перетренированностью. Эксперимент был проведен на 150 взрослых крысах-самцах линии Wistar, которые были разделены на три группы: 30 - контрольная, по 60 - первая и вторая экспериментальные. Состояние перетренированности моделировалось путем бега на тредбане в 2 этапа. На первом этапе обе экспериментальные группы проходили общий 9-недельный курс тренировок для моделирования состояния тренированности, в результате которого физическая работоспособность возросла на 95,6%. На втором этапе у одной из экспериментальных групп в результате дополнительного 30-дневного курса тренировок смоделировано состояние перетренированности (Таблица 1).

Таблица 1 - Динамика работоспособности самцов крыс в процессе моделирования перетренированности

Параметры бега Дни наблюдений 1 5 10 15 19 20 25 30 Продолжительность, мин 40 80 130 180 215±6,4 200,6±8,4 96,6±6,2 40,1±2,9 Скорость, м/мин 21 25 30 35 39 30 30 25

Согласно данным таблицы 1, падение работоспособности животных фиксируется с 20-го дня тренировок.

Подтверждением развившейся дезадаптации является снижение на 31% веса животных, невозможность поддерживать моделируемый темп беговой нагрузки, пассивное поведение, раздражительность и приступы агрессии и ряд морфологических и физиологических изменений в организме.

Для исследования кардиоспецифических белков использовали стандартизированные наборы для определения антител методом ИФА, (организм крыса): AEВ341Ra - для определения антител к альфа-актину 1 сердечной мышцы (Anti-ACTC1), AEP164Ra - для определения антител к тяжелой цепи бета-миозина 7В сердечной мышцы (Anti-MYH7B), AEA478Ra - для определения антител к сердечному тропонину I (Anti-cTnI) производства Cloud-Clone Corp.,США с минимальной определяемой концентрацией Anti-ACTC1 - 0,062 нг/мл, Anti-MYH7B – 0,62 нг/мл, Anti-cTnI-1,14 нг/мл и диапазоном обнаружения Anti-ACTC 11,56-100 нг/мл, Anti-cTnI 3,12-200 нг/мл, Anti-MYH7B 1,56-100 нг/мл.

Пробы крови брались на этапе моделирования перетренированности - после 5, 10, 15, 20, 25, 30 дней тренировки, спустя 1-2 дня отдыха. Образцы сыворотки хранились при -20 С. Анализ производился согласно инструкции производителя наборов.

По мере усиления физической нагрузки в отсутствие адекватного отдыха концентрации аутоантител увеличивалась (Таблица 2). При этом, в то время, когда у животных еще сохранялась высокая работоспособность (10-19 дни тренировок), было в норме ЭКГ и гистологические показатели кардиомиоцитов, концентрация аутоантител была уже значительно увеличена.

Таблица 2 - Результаты средних значений показателей ауто-антител на разных этапах моделируемого хронического физического перенапряжения

Дни наблюдений Исследуемые показатели Тропонин I Актин Миозин I 2,0±0,04 12,1±1,6 9,6±0,9 5
Р 2,6±0,05
>0,1 5,1±0,8
>0,1 5,9±1,1
>0,1 10
Р 15,7±0,8
<0,001 10,4±1,2
<0,001 9,7±1,4
<0,001 15
Р 3,5±0,2
>0,1 36,1±2,7
<0,001 15,6±8,3
<0,001 20
Р 7,1±1,4
<0,001 35,2±2,9
<0,001 15,6±2,1
<0,001 25
Р 6,5±0,35
<0,001 81,2±2,7
<0,001 23,1±4,4
<0,001 30
Р 12.65±9,6
<0,001 86,2±2,8
<0,001 26,5±2,4
<0,001

Примечание: I - данные на начало моделирования хронического физического перенапряжения; Р - достоверность отличий по сравнению с данными на начало эксперимента

Проведенные морфологические и гистологические исследования сердца экспериментальных животных по окончании 30-ти дней моделирования экспериментальной перетренированности подтвердили начальные признаки развития патологии. В то время как у крыс контрольной группы оболочки сердца эпикард, миокард и эндокард имели классическое строение, у животных второй экспериментальной группы обнаруживаются отдельные кардиомиоциты в состоянии гипертрофии, местами неравномерно прокрашенные, плохо визуализируется поперечная исчерченность. Толщина адвентиции некоторых сосудов миокарда составляет больше 50% медии, интима без изменений. У отдельных сосудов миокарда визуализируется фиброз периваскулярной области, переходящий в интерстициальное поле между миофибрилл. Местами обнаруживаются сетчатые структуры соединительнотканных волокон между кардиомиоцитами. При этом только у 10% из этих животных на ЭКГ-исследовании появились отклонения от норы: синусовая тахикардия с ЧСС в 544 мин, нарушение процессов реполяризации левого желудочка по типу субэпикардиальной ишемии с ЧСС в 472 мин.

Была показана возможность использовать количественные показатели аутоантител к специфическим белкам кардиомиоцитов (ACTC1, MYH7B, cTnI) для донозологической диагностики начинающихся патологических процессов миокарда до того, как это отразится на физической работоспособности, а в сердце разовьются деструктивные изменения.

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике и кардиологии, и может быть использовано для донозологической диагностики стрессорной кардиомиопатии при экспериментальном физическом перенапряжении у крыс. В сыворотке крови определяют концентрацию аутоиммунных антител к актину Альфа-1 сердечной мышцы (ACTC1), и/или к тяжелой цепи Бета-миозин 7В сердечной мышцы (MYH7В), и/или к сердечному тропонину I (cTnI) с помощью непрямой иммуноферментной реакции ферментного иммуносорбентного анализа, результаты которой оценивают инструментально спектрофотометрически при длине волны 450 нм по интенсивности окраски исследуемого образца. При концентрации аутоантител к cTnI 13,3 - 25,3 нг/мл; к ACTC1 33,4 - 89 нг/мл; к MYH7В 12,3 - 28,9 нг/мл диагностируют донозологическую форму стрессорной кардиомиопатии. Способ обеспечивает возможность донозологической диагностики стрессорной кардиомиопатии при экспериментальном хроническом физическом перенапряжении (перетренированностью) путем количественного определения аутоантител к cTnI, ACTC1 и MYH7В в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа. 5 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ донозологической диагностики стрессорной кардиомиопатии при экспериментальном физическом перенапряжении у крыс, отличающийся тем, что в сыворотке крови определяют концентрацию аутоиммунных антител к актину Альфа-1 сердечной мышцы (ACTC1), и/или к тяжелой цепи Бета-миозин 7В сердечной мышцы (MYH7В), и/или к сердечному тропонину I (cTnI) с помощью непрямой иммуноферментной реакции ферментного иммуносорбентного анализа, результаты которой оценивают инструментально спектрофотометрически при длине волны 450 нм по интенсивности окраски исследуемого образца, и при концентрации аутоантител к cTnI 13,3 - 25,3 нг/мл; к ACTC1 33,4 - 89 нг/мл; к MYH7В 12,3 - 28,9 нг/мл диагностируют донозологическую форму стрессорной кардиомиопатии.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что определяют концентрацию аутоиммунных антител к актину Альфа-1 сердечной мышцы (ACTC1) и к сердечному тропонину I (cTnI).

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что определяют концентрацию аутоиммунных антител к тяжелой цепи Бета-миозин 7В сердечной мышцы (MYH7В) и к сердечному тропонину I (cTnI).

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что определяют концентрацию аутоиммунных антител к актину Альфа-1 сердечной мышцы (ACTC1) и к тяжелой цепи Бета-миозин 7В сердечной мышцы (MYH7В).

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что определяют концентрацию аутоиммунных антител к актину Альфа-1 сердечной мышцы (ACTC1).

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что определяют концентрацию аутоиммунных антител к тяжелой цепи Бета-миозин 7В сердечной мышцы (MYH7В).