Биокомпозиция на основе гуминовых кислот тростникового низинного торфа Российский патент 2023 года по МПК C02F3/34 B09C1/10 B01J20/24 C12N1/20 C12N1/38 C12R1/01 

Изобретение относится к области биотехнологии и производства биопрепаратов-нефтедеструкторов, содержащие природные полимеры -гуминовые кислоты торфа и может быть использовано в технологиях очистки от нефтяного загрязнения водных акваторий (пресных и морских), почвенных сред (песчаный грунт, различные типы нефтезагрязненных почв, галька); щебня и балластного слоя железнодорожного пути при ликвидации разливов нефтепродуктов (мазут, топливо, смазочные материалы) в различных климатических зонах.

Известно изобретение, биопрепарат «Родер» для биодеградации нефти и нефтепродуктов в почвах, почвогрунтах, пресных и высокоминерализованных водах, принятое за аналог, представляющее собой штаммы бактерий рода Rhodococcus, и содержащее R-формы родококков штаммов Rhodococcus ruber ВКМ Ас-1513Д и Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-1514Д, полученные путем селекции R-форм на обедненной питательной среде с концентрацией NaCl 10,0 г/л для биорекультивации загрязненных углеводородами объектов в условиях низкой минерализации или с концентрацией морской соли 30,0-50,0 г/л для биорекультивации в условиях высокой минерализациии (Мурыгина В.П., Войшвилло Н.Е., Калюжный С.В. Биопрепарат «Родер» для очистки почв, почвогрунтов, пресных и минерализованных вод от нефти и нефтепродуктов. Патент РФ МПК⁷ С02 F 3/34, В 09 С 1/10, С12N 1/26 // (С12N 1/26, С12R 1:01), ⁽¹⁹⁾ RU ⁽¹¹⁾2174496 ⁽¹³⁾ С2). Авторы предлагают использовать для биодеградации нефти и нефтепродуктов в почвах, почвогрунтах, пресных и высокоминерализованных водах только R-диссоциантов штаммов Rhodococcus ruber ВКМ Ас-1513Д и Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-1514Д, выращиваемых на средах с высоким содержанием морской соли и способных проводить активный процесс расщепления углеводородов нефти и нефтепродуктов в пресной и морской воде, а также в различных почвогрунтах, и создавать условия для рекультивации почв.

Недостатком данного изобретения является отсутствие важных данных о способности микроорганизмов продуцировать биоэмульгаторы и отсутствие в составе биопрепарата органической матрицы, способной дополнительно связывать нефтезагрязнители и оказывать стимулирующее действие на бактерии, входящие в биопрепарат.

Известна биокомпозиция, принятая за прототип (Герцен М.М., Дмитриева Е.Д. Влияние гуминовых кислот на состояние капель нефтепродуктов в присутствии микроорганизмов-нефтедеструкторов рода Rhodococcus. // Вестник ТвГУ. - Серия: Химия. - 2021. - №2(44). - С. 69-79.). Признаками биокомпозиции, совпадающими с существенными признаками заявленного изобретения, является органическая часть - полимерный природный матрикс биокомпозиции, представляющая собой гуминовые кислоты тростникового низинного торфа (ТНТ), источник гуминовых кислот, из которого выделены ГК - тростниковый низинный торф, способ выделения полимерного природного матрикса и микроорганизмы рода Rhodococcus: штамм Rhodococcus erythropolis S67, заявленной биокомпозиции.

Биокомпозиции «Гуминовые кислоты тростникового низинного торфа + Rhodococcus erythropolis S67» и «Гуминовые кислоты тростникового низинного торфа + Rhodococcus erythropolis Х5», принятые за прототип, проявляют солюбилизирующую способность (значения коэффициента пропускания эмульсии нефти и нефтепродуктов в воде не более 50±2% спустя 26 часов), способны через 48 часов применения уменьшать на 30-40% площадь поверхности, занимаемой нефтепродуктами и на 50% - нефти, полная биодеградация нефти и нефтепродуктов происходит спустя 7 суток. Недостатками прототипа являются невысокая биодеградационная способность и продолжительное время полной деградации углеводородов нефти.

На Фиг. 1 представлено влияние биокомпозиции на состояние пленок нефти спустя 2 часа после начала эксперимента (а - комнатная температура (22°С); б - повышенная соленость (3% NaCl); в - пониженная температура (10°С)). На Фиг. 2 представлено влияние биокомпозиции на состояние пленок нефти спустя 48 часов после начала эксперимента (а - комнатная температура (22°С); б - повышенная соленость (3% NaCl); в - пониженная температура (10°С)).

Задача предлагаемого изобретения заключается в интенсификации процесса расщепления нефти и нефтепродуктов в пресной и морской воде, в различных почвенных средах, повышении биодеградационной способности микроорганизмов-нефтедеструктов, уменьшении времени полной деградации углеводородов нефти и создании условий для рекультивации почв в различных климатических зонах.

В качестве решения поставленной задачи предлагается биокомпозиция для очистки почвы и воды от нефти инефтепродуктов на основе гуминовых кислот тростникового низинного торфа, состоящая из раствора гуминовых кислот тростникового низинного торфа концентрацией 50 мг/л, суспензии из микроорганизмов-нефтедеструкторов рода Rhodococcus штаммов Rhodococcus erythropolis S67 и Rhodococcus erythropolis Х5, в концентрации 10⁵-10⁶ КОЕ/мл, микроорганизмы-нефтедеструкторы рода Rhodococcus взяты в виде ассоциации в соотношении штаммов Rhodococcus erythropolis S67 и Rhodococcus erythropolis Х5 1:1, а соотношение суспензия ассоциации микроорганизмов : гуминовые кислоты тростникового низинного торфа составляет 5:3 (по объему).

Заявленную биокомпозицию получается следующим образом:

Природную органическую матрицу биокомпозиции получают: навеску тростникового низинного торфа (ТНТ) обрабатывают 0,1н NaOH в соотношение торф: щелочь - 1:6, смесь кипятят в течение 2 часов при постоянном перемешивании и оставляют на сутки. Полученный раствор гумата натрия отделяют фильтрованием и подкисляют 5%-ным раствором НСl до рН=2±1. Осадок гуминовых кислот (ГК) отделяют центрифугированием в течение 20 минут при 800 об/мин и промывают дистиллированной водой до нейтрального значения среды (рН=7). Очистку ГК от низкомолекулярных примесей осуществляют путем диализа против дистиллированной воды до отрицательной реакции промывных вод на Сl^- по AgNO₃ в мембранных мешках с размером пор 12-14 кДа. Длительность диализа - 24 часа. Очищенный препарат гуминовых кислот сушат в сушильном шкафу при t=60°C.

Для повышения биодеграционной способности биокомпозиции к гуминовым кислотам тростникового низинного торфа, концентрации 50 мг/л, дополнительно вносят приготовленную суспензию ассоциации микроорганизмов-нефтедеструкторов рода Rhodococcus при концентрации 10⁵-10⁶ КОЕ/мл (в соотношении штаммов Rhodococcus erythropolis S67 : Rhodococcus erythropolis X5=1:1 по объему), а соотношение суспензия ассоциации микроорганизмов: ГК составляет 5:3 (по объему). Маштабирование микроорганизмов проводили в жидких питательных средах в качалочных колбах на 100 мл в среде Эванса, в которую дополнительно вносили 2% н-гексадекана. Микроорганизмы культивировали в орбитальной качалке Excella Е25 при 180 об/мин при 37°С в течение шести суток.

Биокомпозиция на основе гуминовых кислот тростникового низинного торфа представляет собой раствор коричневого цвета. Биокомпозиция способна деградировать нефть и нефтепродукты в диапазоне солености (1-10%) (оптимальная соленость 3-7%) и температур (10-35°С) (оптимальная температура 22-26°С). Предлагаемая биокомпозиция характеризуется повышенной биодеграционной и эмульгирующей способностью по отношению к нефти и нефтепродуктам. Применение биокомпозиции на основе гуминовых кислот ТНТ и ассоциации бактерий рода Rhodococcus (штаммов Rhodococcus erythropolis S67 и Rhodococcus erythropolis Х5) снижает время необходимое для полной деструкции нефти и нефтепродуктов до 48 часов в водных средах (пресных и соленых) и при пониженной температуре (10°С).

Принцип работы изобретения заключается в следующем:

Биокомпозиция на основе гуминовых кислот тростникового низинного торфа проявляет повышенную биодеградабельность углеводородов нефти за счет синергизма действия бактерий-нефтедеструкторов и гуминовых кислот в условиях нефтяного загрязнения. Микроорганизмы окисляют углеводородные соединения, растворяя или их эмульгируя посредством выделения биосурфактантов. Гуминовые кислоты относятся к высокомолекулярными поверхностно-активным веществам и являются эффективными стабилизирующими агентами. Гуминовые кислоты облегчают самопроизвольную адсорбцию микроорганизмов рода Rhodococcus на границе раздела нефть - вода, создавая структурно-механический барьер вокруг капель нефтепродуктов, которые начинают тонуть, переводя нефть и нефтепродукты в водную толщу. Мелкие капли углеводородов нефти, окруженные прочной пленкой адсорбционного слоя из молекул ГК и микроорганизмов, не могут сливаться друг с другом и образуют стойкие, трудно расслаивающиеся эмульсии. Высокопрочный структурно-механический барьер вокруг капель нефтепродуктов, образованный гуминовыми кислотами, предотвращает высвобождение углеводородов из состава ассоциатов. Приобретая отрицательную плавучесть капли нефтепродуктов, переходят с поверхности в толщу воды, где интенсивно разлагаются микроорганизмами-нефтедеструкторами из-за большой поверхности контакта.

Пример 1. Влияние биокомпозиции на основе гуминовых кислот тростникового низинного торфа на состояние пленок нефти.

Готовили биокомпозицию, состоящую из суспензии ассоциации микроорганизмов-нефтедеструкторов рода Rhodococcus (штаммы Rhodococcus erythropolis S67 и Rhodococcus erythropolis Х5) в концентрации 10⁵-10⁶ КОЕ/мл (в соотношении штаммов Rhodococcus erythropolis S67 : Rhodococcus erythropolis X5=1:1 по объему) и гуминовых кислот ТНТ (50 мг/л) а соотношение ассоциация микроорганизмов : ГК составляет 5:3 (по объему). На полученную нефтяную пленку вносили предварительно приготовленную биокомпозицию (500 мкл). Состояние пленок нефти оценивали через 2 (Фиг. 1) и 48 (Фиг. 2) часов.

Не зависимо от условий проведения эксперимента спустя 2 часа происходит практически полная деструкция нефтяной пленки биокомпозицией, так на поверхности воды отсутствуют даже мелкие нефтяные капли. Наблюдаются неструктурированные ансамбли, состоящие из гуминовых кислот, остатков солюбилизированной нефти и биопленки микроорганизмов. Полная деструкция углеводородов нефти происходит через 48 часов, биодеструкции не подвергается только ароматический каркас гуминовых кислот. Применение предлагаемой биокомпозиции на основе гуминовых кислот ТНТ и ассоциации бактерий рода Rhodococcus снижает время необходимое для полной деструкции нефти и нефтепродуктов до 48 часов, что обусловлено образованием и развитием более сложной по структуре биопленки из сообщества штаммов микроорганизмов, позволяющей оптимально использовать все доступные источники питания и энергии (гуминовые кислоты) и обеспечивать лучшую защищенность от воздействия токсикантов.

Пример 2. Ремедиационная способность предлагаемой биокомпозиции в условиях нефтезагрязненных почв.

Ремедиационная эффективность предлагаемой биокомпозиции, состоящей из суспензии ассоциации микроорганизмов-нефтедеструкторов рода Rhodococcus (штаммы Rhodococcus erythropolis S67 и Rhodococcus erythropolis Х5) в концентрации 10⁵-10⁶ КОЕ/мл (в соотношении штаммов Rhodococcus erythropolis S67 : Rhodococcus erythropolis X5=1: 1 по объему) и гуминовых кислот ТНТ (50 мг/л), а соотношение ассоциация микроорганизмов : ГК составляет 5:3 (по объему), проанализирована на двух образцах нефтезагрязненных почв с территорий нефтеперерабатывающего завода (НПЗ) и металлургического предприятия. Исходное (Таблица 1) и остаточное (Таблица 2) содержание нефтепродуктов по окончании ремедиационных мероприятий определяли на анализаторе жидкости «Флюорат 02-3М» по методике ПНД Ф 16.1:2.21-98.

По содержанию углеводородов нефти в исходных образцах почва с территории металлургического предприятия по уровню загрязнения соответствует почве с очень высоким уровнем загрязнения (>5000 мг/кт), с территории нефтеперерабатывающего завода - почве с высоким уровнем загрязнения (3000-5000 мг/кг) (Шагидуллин P.P. Нормирование допустимого остаточного содержания нефти и продуктов ее трансформации в почвах. / P.P. Шагидуллин [и др.] // Георесурсы. - 2011. - №5 (41). - С. 2-5). Для снижения уровня нефтяного загрязнения образцы почв обрабатывали раствором гуминовых кислот тростникового низинного торфа при концентрации 50 мг/л (почва (г): ГК (мл)=10:5) и оставляли на сутки. Затем вносили приготовленную биокомпозицию в соотношении почва (г): биокомпозиция (мл) 10:5. Образцы почв обрабатывали предлагаемой биокомпозицией, внося по 5 мл, дважды с интервалом 5 дней. Эффективность применяемой биотехнологии оценивали спустя 14 суток.

Применение биокомпозиции позволило снизить уровень загрязнения в почве с нефтеперерабатывающего завода на 76% при этом количество нефтепродуктов в образце соответствует допустимому уровню загрязнения. В почве с металлургического предприятия уровень нефтяного загрязнения снижается на 89%, количество нефтепродуктов соответствует низкому уровню загрязнения. Эффективность заявленной биокомпозиции превышает эффективность очистки загрязненного грунта аборигенной микрофлорой (53%) и коммерческого биопрепарата «Родер» (81%).

Компиляция в составе биокомпозиции гуминовых кислот тростникового низинного торфа с микроорганизмами-нефтедеструкторами рода Rhodococcus путем введения штаммов Rhodococcus erythropolis S67 и Rhodococcus erythropolis Х5 позволяет увеличить эмульгирующую, солюбилизирующую и биодеграционную способность биокомпозиции. Предлагаемый препарат обладает повышенной биодеградационной способностью по отношению к нефти и нефтепродуктам.

Заявленное изобретение может быть использовано в форме водной суспензии с концентрацией гуминовых кислот концентрации 50 мг/л и ассоциации микроорганизмов рода Rhodococcus штаммов Rhodococcus erythropolis S67 и Rhodococcus erythropolis Х5, способных продуцировать биоэмульгаторы, в концентрации 10⁵-10⁶ КОЕ/мл, взятых в соотношении штаммов Rhodococcus erythropolis S67 : Rhodococcus erythropolis X5 1:1 (по объему), а соотношение суспензия ассоциации микроорганизмов : гуминовые кислоты составляет 5:3 (по объему) в области охраны окружающей среды и природоохранных технологий, в частности очистки пресных и морских акваторий, а также различных почвенных сред (песчаный грунт, различные типы нефтезагрязненных почв, галька); щебня и балластного слоя железнодорожного пути при ликвидации разливов нефтепродуктов (мазут, топливо, смазочные материалы) в различных климатических зонах.

Технический результат заявляемого решения заключается в улучшении солюбилизирующей и эмульгирующей способности гуминсодержащих продуктов на основе торфа, за счет образования активной биопленки с микроорганизмами-нефтедеструкторами рода Rhodococcus, что сопровождает увеличение биологической активности и повышение детоксицирующих свойств по отношению к нефти и нефтепродуктам.

Изобретение может быть использовано в технологиях очистки от нефтяного загрязнения водных акваторий (пресных и морских), почвенных сред (песчаный грунт, различные типы нефтезагрязненных почв, галька); щебня и балластного слоя железнодорожного пути при ликвидации разливов нефтепродуктов (мазут, топливо, смазочные материалы) в различных климатических зонах. Биокомпозиция для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов состоит из раствора гуминовых кислот тростникового низинного торфа концентрацией 50 мг/л и суспензии из микроорганизмов-нефтедеструкторов рода Rhodococcus штаммов Rhodococcus erythropolis S67 и Rhodococcus erythropolis Х5 в концентрации 10⁵-10⁶ КОЕ/мл, причем микроорганизмы-нефтедеструкторы рода Rhodococcus взяты в виде ассоциации в соотношении штаммов Rhodococcus erythropolis S67 и Rhodococcus erythropolis Х5 1:1, а соотношение суспензия ассоциации микроорганизмов:гуминовые кислоты тростникового низинного торфа составляет 5:3 по объему. Обеспечивается улучшение солюбилизирующей и эмульгирующей способности гуминсодержащих продуктов на основе торфа за счет образования активной биопленки с микроорганизмами-нефтедеструкторами рода Rhodococcus, что сопровождается увеличением биологической активности и повышением детоксицирующих свойств по отношению к нефти и нефтепродуктам. Биокомпозиция способна деградировать нефть и нефтепродукты в диапазоне солености 1-10% (оптимальная соленость 3-7%) и температур 10-35°С (оптимальная температура 22-26°С). 2 ил., 2 табл., 2 пр.

Биокомпозиция для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов на основе гуминовых кислот тростникового низинного торфа, состоящая из раствора гуминовых кислот тростникового низинного торфа концентрацией 50 мг/л, суспензии из микроорганизмов-нефтедеструкторов рода Rhodococcus штаммов Rhodococcus erythropolis S67 и Rhodococcus erythropolis Х5 в концентрации 10⁵-10⁶ КОЕ/мл, отличающаяся тем, что микроорганизмы-нефтедеструкторы рода Rhodococcus взяты в виде ассоциации в соотношении штаммов Rhodococcus erythropolis S67 и Rhodococcus erythropolis Х5 1:1, а соотношение суспензия ассоциации микроорганизмов:гуминовые кислоты тростникового низинного торфа составляет 5:3 (по объему).