Препарат для биодеградации нефти и нефтепродуктов (Нефтедеструктор) Российский патент 2021 года по МПК B09C1/10 C02F3/34 C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии и экологии, а именно, к композициям для очистки грунта и водных объектов, загрязненных нефтяными и полициклическими ароматическими углеводородами с одновременным восстановлением физико-химических свойств и естественного биоценоза почв и акваторий.

Нефтедеструктор предназначается для обезвреживания нефтесодержащих отходов и изъятых нефтезагрязненных грунтов, прошедших этап очистки механическим, физическим или физико-химическим способами; локализации и ликвидации разливов нефти и нефтепродуктов; рекультивации нефтезагрязненных земель; очистки водных объектов от нефтяной пленки.

Применение биопрепаратов-нефтедеструкторов, включающих в свой состав штаммы углеводородокисляющих микроорганизмов, является самым экологически безопасным способом очистки и восстановления нефтезагрязненных сред ввиду образования нетоксичных продуктов в процессе биодеструкции углеводородной фазы. В настоящее время известно большое количество биопрепаратов-нефтедеструкторов.

Из документа RU 2681831 (МПК C12N 1/20, B09C 1/10, C02F 3/34, C12R 1/01, опубликован 12.03.2019 г.) известен препарат для биодеградации нефтепродуктов, включающий ассоциацию бактерий Bacillus megaterium ВКПМ В-607, Bacillus subtilis ВКПМ В-5328, Pseudomonas putida ВКПМ В-5624, Rhodococcus erythropolis ВКПМ AC-1269 иммобилизованную на глауконитсодержащем носителе в количестве 10⁷ - 10¹⁰ клеток/г.

Из документа RU 2668789 (МПК C12N 1/26, B09C 1/10, C02F 3/34, C12R 1/01, C12R 1/06, C12R 1/40, опубликован 02.10.2018) известен биопрепарат-нефтедеструктор, представляющий собой ассоциацию нефтеокисляющих почвенных микроорганизмов, содержащую в качестве нефтеокисляющих почвенных микроорганизмов бактерии рода Bacillus atrophaeus ARK-81, Pseudomonas putida ARK-1301, Rhodococcus sp. ARK-66, Artrobacter sp. ARK-950, Bacillus megaterium ARK-396, выращенные при раздельном культивировании и смешанные до общего содержания бактерий 15-20×10⁹ кл/мл.

Наиболее близким аналогом изобретения является техническое решение, описанное в патенте РФ RU2516412 (МПК B01J 20/10, B01J 20/283, C02F 3/34, C02F 1/28, B09C 1/10, C12R 1/125, C12R 1/32, C12R 1/38, C12R 1/40, опубликован 20.05.2014 г.). Из прототипа известен препарат для очистки воды и почвы от нефтяных загрязнений, содержащий микроорганизмы - деструкторы нефти, сорбент, микроудобрения, причем в качестве деструкторов нефти он содержит 75-85% от общего количества клеток ассоциацию нефтеокисляющих микроорганизмов: Bacillus subtilis ВКМ В-81, Pseudomonas spp. ВКМ В-892, Pseudomonas putida ВКМ В-1301, Rhodococcus sp. ВКМ Ac-950, Mycobacterium flavescens ВКМ Ac-1415, a также почвенные бактерии Agrobacteium radiobacter ВКМ В-1219 - 15-25% от общего числа клеток, криопротектор - глицерин, сорбент, представляющий собой мелкодисперсный дегидратированный цеолит с размером гранул 0,1-0,5 мм, опудренный наночастицами Аэросила А-300, микроудобрения - азотнокислый натрий 0,5% и фосфорнокислый калий 0,5%, при определенном соотношении компонентов.

Исходя из предшествующего уровня техники, техническая проблема состоит в создании препарата-нефтедеструктора, способного активно и эффективно работать в широком влажностно-температурном диапазоне, что позволит использовать его в разных климатических зонах.

Технический результат заключается в увеличении эффективности консорциума при использовании в более широком влажностно-температурном диапазоне от -10°C до +40°C, в том числе и со значительными суточными перепадами температур, а также в возможности утилизации углеводородной фазы при высокой концентрации солей в почве. Консорциум имеет высокую адаптивность к экстремальным условиям окружающей среды.

При проведении рекультивации нефтезагрязненных земель данный препарат можно использовать с гуматами, что позволяет улучшить качество почвы после очистки.

Для достижения указанного технического результата препарат для биодеградации нефти и нефтепродуктов (нефтедеструктор), включающий ассоциацию бактерий: Bacillus atrophaeus ВКМ B-81, Pseudomonas spp. ВКМ B-892, Pseudomonas putida ВКМ B-1301, Arthrobacter sp. Ac-950, Microbacterium flavescens ВКМ Ac-1415, содержит штамм бактерий Bacillus megaterium ВКМ B-112. Общее содержание клеток бактерий в суспензии не менее 1×10⁹ КОЕ/мл.

В частном случае препарат для биодеградации нефти и нефтепродуктов может дополнительно содержать бактерии Agrobacterium radiobacter ВКМ В-1219 и/или бактерии Pseudomonas turukhanskensis ВКМ В-2935.

Дополнительный штамм бактерий Pseudomonas turukhanskensis ВКМ В- 2935 усиливает фенолокисляющую способность, а также работает при пониженных температурах окружающей среды, что дает перспективу его использования в регионах с коротким тепловым периодом.

В частном случае препарат для биодеградации нефтепродуктов может дополнительно содержать криопротектор - глицерин, азотнокислый натрий и/или фосфорнокислый калий. Причем азотнокислый натрий содержится в количестве 0,5% масс., фосфорнокислый калий содержится 0,5% масс.

Препарат для биодеградации может быть в виде водной суспензии с титром клеток не менее 1×10⁹ КОЕ/мл, предпочтительно (1-3)×10⁹ КОЕ/мл.

Препарат для биодеградации может быть в виде лиофильно высушенной биомассы штаммов с титром клеток обезвоженного продукта не менее 1×10¹¹ КОЕ/г, предпочтительно (1-8)×10¹¹ КОЕ/г.

Препарат для биодеградации может быть в виде сухой формы, иммобилизованной на сорбенте. В качестве сорбента используют цеолиты, или глаукониты, или измельченные остатки древесины или торфа.

Препарат на сорбенте может быть получен методом контактно-сорбционного обезвоживания путем иммобилизации концентрированной суспензии препарата на сорбенте в шнековым смесителе, в соотношении 1:10.

Препарат для биодеградации нефтепродуктов может дополнительно содержать почвоструктуратор, в качестве которого могут быть использованы гуминовые вещества, состоящие из гуминовых кислот и/или их солей.

В препарате штаммы бактерий Bacillus atrophaeus ВКМ B-81, Pseudomonas spp. ВКМ B-892, Pseudomonas putida ВКМ B-1301, Arthrobacter sp. Ac-950, Microbacterium flavescens ВКМ Ac-1415, Bacillus megaterium ВКМ B-112 могут быть в следующих соотношениях 3:1:1:1:1:3; 2:1:1:1:1:2 или в равных соотношениях. При этом отклонение от указанных соотношений до 10% входит в указанные соотношения.

Доля клеток отдельных бактерий каждого штамма в ассоциации составляет 8-15%.

Как известно, фосфор и азот жизненно необходимы бактериям для роста и развития. Технический результат достигается за счет использования штамма бактерий Bacillus megaterium ВКМ B-112. Штамм бактерий Bacillus megaterium ВКМ B-112 является не только нефтеокисляющим, но и способен выщелачивать фосфор (растворять, высвобождать) из объектов литосферы, делая его доступным для растений и других бактерий. Данный штамм Bacillus megaterium ВКМ B-112 является спорообразующим и способен выживать в суровых климатических условиях, а также при больших перепадах температур. Другой почвенный штамм Agrobacterium radiobacter является азотофиксирующей бактерией. Данные штаммы в совокупности являются хорошими структураторами почвы и помогают другим бактериям лучше расти и развиваться в нефтезагрязненной почве.

Ассоциация микроорганизмов может подобрана так, что различные штаммы дополняют друг друга, что обеспечивает эффективность их использования в более широком влажностно-температурном диапазоне от -10°C до +40°C, в том числе и с значительными суточными перепадами температур.

Материалы, поясняющие сущность изобретения:

Таблица 1 - Остаточное содержание нефтепродуктов в почве после обработки препаратом.

Таблица 2 - Результаты лабораторных исследований.

Препарат получают следующим образом. Микроорганизмы биопрепарата Bacillus atrophaeus ВКМ B-81, Pseudomonas spp. ВКМ B-892, Pseudomonas putida ВКМ B-1301, Arthrobacter sp. Ac-950, Microbacterium flavescens ВКМ Ac-1415, Bacillus megaterium ВКМ B-112 выращиваются раздельно в биореакторе известными способами, затем готовят микробную ассоциацию смешиванием в одной емкости расчетных долей культуральных жидкостей.

Препарат может быть в виде однородной жидкой суспензии, сухой формы на сорбенте и сублимированного порошка.

Количество клеток микроорганизмов в зависимости от агрегатной формы препарата: однородная жидкая суспензия - (1-3)×10⁹ КОЕ/мл; сублимированная форма - (1-8)×10¹¹ КОЕ/г; сухая форма на сорбенте - (5-7)×10⁹ КОЕ/г.

Возможна адаптация консорциума под конкретный регион путем внесения аборигенных микроорганизмов, выделенных из образцов почвы нефтезагрязненного участка, на котором планируется проведение рекультивационных работ, в основной состав.

Готовый препарат в виде однородной жидкой суспензии и сублимированного порошка в активированном состоянии представляет собой жидкость от светло-коричневого и желтого до насыщенного темно-коричневого цвета со специфическим запахом, свойственным данному продукту.

Изобретение подтверждается следующими примерами:

Пример 1. Препарат получают следующим образом:

Микроорганизмы биопрепарата культивируют раздельно в промышленных ферментерах на 70-300 литров. В качестве питательной среды используется глюкозо-пептонно-дрожжевая среда. Для адаптации бактерий к деструкции углеводородов на заключительной стадии культивирования добавляется 0,5 л солярки. Ферментер и питательную среду стерилизуют при температуре 120°C в течение 30 минут. рН поддерживается на уровне 7,2 при помощи аммиачной воды.

Выращивание микробных культур в ферментере проводят при температуре 32+1°C с постоянной подачей воздуха для аэрации и вращением мешалки 250 об*мин^-1 в течение 35+2 ч. Контроль за температурой, расходом воздуха, разрежением в полости ферментера и рН осуществляют по ротаметру, мановакуумметру и уравновешенному мосту. Культивирование прекращают при достижении рН (7,5±0,5) ед. рН.

Для приготовления жидкой формы препарата все микроорганизмы смешиваются в отдельной емкости в необходимых соотношениях. Общее количество контролируется методом высева на плотной питательной среде (ГРМ-агар). Количество живых клеток составляет (1-3)×10⁹ КОЕ/мл.

В готовую смесь могут быть внесены необходимые добавки: азотнокислый натрий и фосфорнокислый калий, а также глицерин. Жидкую форму препарата расфасовывают в полиэтиленовые емкости с дыхательным клапаном объемом от 1 до 25 литров.

Сухую форму препарата получают методом контактно-сорбционного обезвоживания с иммобилизацией концентрированной суспензии на структурированных подготовленных сорбентах, имеющих пористую структуру, в шнековом смесителе. Сорбенты предварительно прокаливаются при температуре 350-400°C. Количество клеток в форме на сорбенте - (5-7)×10⁹ КОЕ/г. При указанной технологии приготовления препарата влажность продукта составляет 8-10%.

Сублимированная форма производится на промышленной сублимационной сушильной установке ТГ-50. Количество клеток в готовом продукте составляет не менее 1×10¹¹ КОЕ/г.

Форма, марка и вид применяемых препаратов варьируется в зависимости от агрегатной формы загрязненной среды, удаленности региона, вида и степени загрязнения.

Пример 2.

Апробация Нефтедеструктора осуществлялась в районе с коротким вегетационным периодом. В ходе проведения испытаний исследовалось совместное применение препарата и почвоструктуратора - гумино-минерального комплекса «Био-ГМК». Местом проведения являлась территория с антропогенным рельефом на территории одного из месторождений, находящегося на территории Ханты-Мансийского округа - Югры, на поверхности которой были отмечены нефтяные загрязнения и разливы, а также нарушенные нефтезагрязненные земли с повышенным содержанием солей. Под проведение мероприятий был выделен участок площадью 900 м².

Активация жидкой концентрированной формы Нефтедеструктора происходила в течение 48 часов в двухкубовой емкости с использованием местной болотной воды, включающей в себя аборигенные нефтеокисляющие микроорганизмы. Было осуществлено поддержание непрерывной аэрации с помощью компрессора и температуры воды на уровне 24-27°C. В качестве элементов минерального питания были использованы аммиачная селитра (3 кг), монокалийфосфат (2 кг) и «Азофоска» (3 кг). В качестве источника углерода был внесен сахар в количестве 10 кг.

Биологический этап рекультивации включал в себя внесение Нефтедеструктора и почвоструктуратора «Био-ГМК» на характерные загрязненные участки и последующий посев фитоэталонной смеси.

Результаты лабораторных исследований по остаточному нефтесодержанию представлены в таблице 1.

Помимо отслеживания динамики на двух маркированных участках, был выбран третий объект (вход на 1 участок), имеющий высокую концентрацию углеводородов, который также был обработан Нефтедеструктором.

Проведенные испытания доказали эффективность применения биопрепарата Нефтедеструктор на нефтезагрязненных и нарушенных землях, а также синергетический эффект при его совместном применении с почвоструктуратором «Био-ГМК». Было достигнуто значение показателя нефтесодержания на нефтезагрязненных и нарушенных землях на уровне ниже установленных нормативов для территорий Ханты-Мансийского автономного округа - Югры, а также обеспечен устойчивый растительный покров. Было доказано, что входящий в состав консорциум способен утилизировать углеводородную фазу при высокой концентрации солей в почве, что подтверждает его адаптивность к экстремальным условиям окружающей среды.

Анализ полученных экспериментальных данных на одном из действующих месторождений Ханты-Мансийского автономного округа - Югры показал высокую нефтеокисляющую способность Нефтедеструктора (более 85% деструкции углеводородов), что дает перспективу его дальнейшего использования в условиях Западной Сибири.

Пример 3.

Местом проведения испытаний являлась территория с антропогенным рельефом на территории свалки, на поверхности которой были отмечены отвалы отходов и определено наличие нефтепродуктов в почве (земельный участок, занятый свалкой промышленных и бытовых отходов, расположенной за кладбищем «Красная Этна» на территории Шуваловской промзоны в Ленинском районе города Нижнего Новгорода).

Территория Шуваловской промзоны более чем 20 лет использовалась в качестве полигона захоронения твердых коммунальных и строительных отходов. На протяжении нескольких последних лет были отмечены случаи очагового горения на данной территории.

Было принято решение провести рекультивацию данного участка и в дальнейшем использовать его для нужд города. После удаления отходов с территории свалки было необходимо проведение комплекса рекультивационных мероприятий, позволяющих уменьшить негативное воздействие на окружающую среду, а также улучшить ландшафт территории и подготовить ее для возможного строительства.

С учетом наличия на территории нефтезагрязненных грунтов было предложено использовать биологические методы деструкции углеводородов с использованием микроорганизмов-нефтедеструкторов.

На Шуваловской промзоне была оборудована и предоставлена тестовая площадка с изоляцией для проведения опытно-промышленных испытаний.

Последовательность проведения опытно-промышленных испытаний:

1) Активация Биопрепарата в сухой форме на сорбенте в течение 3 часов (аэрирование с помощью компрессора) с добавлением удобрений;

2) Приготовление раствора гумино-минерального комплекса «Био-ГМК», 1%;

3) Внесение необходимого количества препарата на каждую площадку.

Были отобраны пробы в день постановки эксперимента с площадок без внесенных препаратов и в день окончания эксперимента (через 45 суток) со всех площадок.

В течение всего периода проведения опытно-промышленных испытаний проводились работы по рыхлению (аэрированию) и поливу (при необходимости) почвы для лучшего развития и жизнедеятельности нефтеокисляющих микроорганизмов.

В таблице 2 представлены результаты исследований, полученные с помощью аккредитованной лаборатории промышленной и экологической токсикологии отдела биологических исследований НИИ химии ННГУ им. Н.И. Лобачевского.

При обработке нефтезагрязненного грунта с различной концентрацией нефтепродуктов (от 10% до 15%) Нефтедеструктором в сочетании с гумино-минеральным комплексом отмечается снижение концентрации токсиканта в грунте на 54-76% за 45 суток, что говорит об эффективности применяемой комбинации препаратов и стимулирующем действии гуматов при разложении углеводородов.

Лабораторный анализ на содержание в грунте подвижных форм тяжелых металлов показал, что в обработанном грунте их количество значительно снизилось, что говорит способности гуминовых веществ к иммобилизации суперэкотоксикантов.

Содержание в почве бенз(а)пирена, канцерогенного вещества, значительно снизилось после обработки нефтезагрязненного грунта Биопрепаратом в сочетании с органоминеральным комплексом.

Пример 4.

В ноябре 2019 года были проведены испытания Нефтедеструктора в поселении Вороновское на территории НПО «Волга-Экология» в Троицком районе города Москвы. Планировалась закладка эксперимента на зиму и отбор проб весной 2020 года для проверки эффективности действия биопрепарата в межсезонный период, а также жизнеспособности микроорганизмов в условиях пониженных температур.

В ходе подготовки к проведению опытно-промышленных испытаний была оборудована площадка для проведения исследований.

Порядок проведения опытно-промышленных испытаний:

1) Активация сублимированной формы Нефтедеструктора в течение 1 часа (аэрирование с помощью компрессора) с добавлением удобрений;

2) Создание модельного загрязнения на площадках (дизельное топливо + мазут = 1:2 в качестве загрязнителя)

3) Разравнивание загрязненного грунта;

4) Внесение необходимого количества препарата на каждую площадку.

В лаборатории РГУ нефти и газа им. И.М. Губкина были проведены исследования на остаточное содержание нефтепродуктов в почве гравиметрическим методом при помощи экстрактора.

При использовании Нефтедеструктора было отмечено снижение модельного загрязнения с 14,8 до 2,9%, что составляет более 80% эффективности.

Проведены опытно-промышленные испытания препарата для определение деградирующей способности, экономической целесообразности и надежности применения биопрепарата для снижения времени рекультивации земель и сокращения затрат на эколого-восстановительные мероприятия. Препарат был испытан на восьми площадках в разных регионах России и показал высокую эффективность. Промышленные испытания на объектах нефтедобычи продемонстрировали оперативность действия технологии - в течение 72 часов степень очистки достигла 94%.

Область применения препарата велика - от обеззараживания нефтезагрязненных природных водоемов и почв до обезвреживания отходов химической промышленности. Препарат-нефтедеструктор способен активно и эффективно работать в широком влажностно-температурном диапазоне, что позволяет его использовать в разных регионах мира.

Таблица 1 - Остаточное содержание нефтепродуктов в почве

Наименование пробы Остаточное содержание нефтепродуктов в почве, г/кг Эффект, % Постановка ОПИ 10 суток 30 суток 45 суток Нефтезагрязненный участок (1) 218,6 57,1 35,8 32,2 85,27 Нефтезагрязненный участок с повышенным содержанием солей 92,2 42,2 21,4 12,1 86,88 Вход на участок 1 415,4 351,3 242,4 55,5 86,64

Таблица 2 - Результаты лабораторных исследований

Входной контроль Выходной контроль № пробы Содержание нефтепродуктов, мг/кг Результат биотестирования и фитотестирования № пробы Содержание нефтепродуктов, мг/кг Результат биотестирования и фитотестирования 1.1* 24150 - Не оказывает острое и хроническое токсическое действие
- «практически неопасный»
- относятся к V классу опасности 1.2 5883 - Не оказывает острое и хроническое токсическое действие
- «практически неопасный»
- относятся к V классу опасности 2.1 41859 -Не оказывает острое и хроническое токсическое действие
- «практически неопасный»
- относятся к V классу опасности 2.2 18958 - Не оказывает острое и хроническое токсическое действие
- «практически неопасный»
- относятся к V классу опасности

* Прим. 1.1, 2.1 - необработанные биопрепаратом площадки с концентрацией нефтепродуктов 10% и 15% соответственно; 1.2, 2.2 - обработанные Нефтедеструктором и «Био-ГМК» площадки с концентрацией нефтепродуктов 10% и 15% соответственно

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен препарат для биодеградации нефти и нефтепродуктов (нефтедеструктор), включащий ассоциацию бактерий: Bacillus atrophaeus ВКМ B-81, Pseudomonas spp. ВКМ B-892, Pseudomonas putida ВКМ B-1301, Arthrobacter sp. Ac-950, Microbacterium flavescens ВКМ Ac-1415, Bacillus megaterium ВКМ B-112 в заданном соотношении. Изобретение позволяет повысить эффективность очистки почвы и акватории при температурном диапазоне от -10°C до +40°C, а также возможность утилизации углеводородной фазы при высокой концентрации солей в почве. 15 з.п. ф-лы, 2 табл., 4 пр.

1. Препарат для биодеградации нефти и нефтепродуктов, включающий ассоциацию бактерий: Bacillus atrophaeus ВКМ B-81, Pseudomonas spp. ВКМ B-892, Pseudomonas putida ВКМ B-1301, Arthrobacter sp. Ac-950, Microbacterium flavescens ВКМ Ac-1415, отличающийся тем, что содержит штамм бактерий Bacillus megaterium ВКМ B-112.

2. Препарат для биодеградации нефти и нефтепродуктов по п. 1, отличающийся тем, что дополнительно содержит бактерии Agrobacterium radiobacter ВКМ В-1219.

3. Препарат для биодеградации нефти и нефтепродуктов по п. 1 или 2, отличающийся тем, что дополнительно содержит штамм бактерий Pseudomonas turukhanskensis ВКМ В- 2935.

4. Препарат для биодеградации нефти и нефтепродуктов по п. 1, отличающийся тем, что дополнительно содержит криопротектор – глицерин.

5. Препарат для биодеградации нефти и нефтепродуктов по п. 1, отличающийся тем, что дополнительно содержит азотнокислый натрий и/или фосфорнокислый калий.

6. Препарат для биодеградации нефти и нефтепродуктов по п. 5, отличающийся тем, что дополнительно содержит азотнокислый натрий в количестве 0,5% масс. и/или фосфорнокислый калий 0,5% масс.

7. Препарат для биодеградации нефти и нефтепродуктов по п. 1, отличающийся тем, что общее содержание клеток бактерий не менее 1×10⁹ КОЕ/мл.

8. Препарат для биодеградации нефти и нефтепродуктов по п. 1, отличающийся тем, что представляет собой водную суспензию с титром клеток (1-3)×10⁹ КОЕ/мл.

9. Препарат для биодеградации нефти и нефтепродуктов по п. 1, отличающийся тем, что выполнен иммобилизованным на сорбенте, с количеством клеток (5-7)×10⁹ КОЕ/г.

10. Препарат для биодеградации нефти и нефтепродуктов по п. 9, отличающийся тем, что в качестве сорбента используют цеолиты или глаукониты или измельченные остатки древесины или торфы.

11. Препарат для биодеградации нефти и нефтепродуктов по п. 9, отличающийся тем, что препарат на сорбенте получен методом контактно-сорбционного обезвоживания путем иммобилизации концентрированной суспензии препарата на сорбенте в шнековом смесителе.

12. Препарат для биодеградации нефти и нефтепродуктов по п. 1, отличающийся тем, что представляет собой сублимированную форму с титром клеток (1-8)×10¹¹ КОЕ/г.

13. Препарат для биодеградации нефти и нефтепродуктов по п. 1, отличающийся тем, что дополнительно содержит почвоструктуратор.

14. Препарат для биодеградации нефти и нефтепродуктов по п. 13, отличающийся тем, что в качестве почвоструктуратора используются гуминовые вещества, состоящие из гуминовых кислот и/или их солей.

15. Препарат для биодеградации нефти и нефтепродуктов по п. 1, отличающийся тем, что штаммы бактерий Bacillus atrophaeus ВКМ B-81, Pseudomonas spp. ВКМ B-892, Pseudomonas putida ВКМ B-1301, Arthrobacter sp. Ac-950, Microbacterium flavescens ВКМ Ac-1415, Bacillus megaterium ВКМ B-112 в следующих соотношениях 3:1:1:1:1:3 или 2:1:1:1:1:2 или в равных соотношениях.

16. Препарат для биодеградации нефти и нефтепродуктов по п. 1, отличающийся тем, что бактерий каждого штамма в ассоциации содержится не менее 10%.