Способ преимплантационного генетического тестирования анемии Фанкони Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к преимплантационному генетическому тестированию моногенных заболеваний. В настоящее время в мире насчитывается более 350 миллионов людей, страдающих редким заболеванием (по данным RARE Project). Общее количество таких заболеваний по подсчетам European Organization for Rare Diseases (EURORDIS) варьируется от 5 до 7 тысяч. При этом около 80% редких заболеваний имеют генетическую причину. Известная генетическая основа заболевания позволяет с высокой точностью предсказать не только здоровье уже родившегося ребенка, но и оценить риск рождения такого ребенка при анализе генотипов родителей, а также провести генетическую диагностику на самых ранних этапах. Преимплантационное генетическое тестирование (ПГТ) моногенного заболевания становится мощным инструментом для профилактики таких заболеваний.

Настоящее изобретение относится к способу преимплантационного генетического тестирования анемии Фанкони. Анемия Фанкони - это наследственное генетически гетерогенное аутосомно-рецессивное заболевание, преимущественно поражающее костный мозг. Анемия Фанкони встречается с частотой в среднем 1:130,000, но достигает более высоких значений среди некоторых этнических групп - например среди евреев ашкенази носительство встречается с частотой примерно 1 на 90 человек. Это заболевание приводит к нарушению механизмов репарации ДНК, из-за чего возникает широкий спектр клинических проявлений. Встречаются множественные дефекты развития -микроцефалия, аномалии эндокринных желез, половых органов, почек, скелетные аномалии. Одним из наиболее важных клинических проявлений этого заболевания является поражение костного мозга, ведущее к панцитопении, апластической анемии, миелодиспластическому синдрому и иногда к развитию острой миелоидной лейкемии. Именно гематологические проявления анемии Фанкони зачастую являются причиной гибели таких пациентов. При аутосомно-рецессивном типе наследования заболевания вероятность рождения ребенка с этим заболеванием в семье составляет 25%.

К заболеванию анемия Фанкони могут приводить патогенные генетические варианты в гене FANCA, располагающемся на хромосоме 16 [Joenje, Н. Nat Rev Genet 2,446-458 (2001)]. Этот ген кодирует белок Анемии Фанкони группы А, который, вместе с другими белками, ассоциированными с анемией Фанкони, формирует комплекс, необходимый для репарации ДНК.

ПГТ анемии Фанкони проводится для семей, имеющих подтвержденную молекулярно-генетическую природу заболевания. Важно отметить, что обоснование патогенности и каузативности генетических вариантов происходит до проведения ПГТ моногенного заболевания и не входит ни в цели и задачи ПГТ моногенного заболевания, ни в комплекс мероприятий по проведению ПГТ моногенного заболевания. Оценку патогенности проводят по международному стандарту - по критериям, описанным в 2015 году Американским Колледжем Медицинской генетики и Геномики (American College of Medical Genetics and Genomics-Association for Molecular Pathology (ACMG-AMP)) в ходе поиска молекулярно-генетической причины заболевания. ПГТ рекомендуется семьям с высоким риском рождения ребенка с тяжелым (неизлечимым) наследственным заболеванием с установленными патогенными вариантами, обуславливающими этот риск. ПГТ позволяет выбрать из всех эмбрионов, полученных при ЭКО (экстракорпоральном оплодотворении), эмбрионы без патогенных вариантов в компаунд-гетерозиготе и, следовательно, без риска развития заболевания.

Основной проблемой при генетической диагностике эмбрионов является малое исходное количество биоматериала, так как биоптат содержит от одной до трех клеток. В этом случае для повышения эффективности и точности анализа важно как полностью исключить возможность контаминации, так и нивелировать возможный эффект неравномерной и/или неполной амплификации, а также деградации биоматериала. Это требует разработки тест-системы с особыми характеристиками. При этом тест-система разрабатывается с учетом возможности использовать биоматериал разного типа - тотальную дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), выделенную из разных тканей, продукт полногеномной амплификации (Whole Genome Amplification, WGA), а также единичные клетки. Сочетание универсальности по отношению к биоматериалу с поэтапной амплификацией целевых фрагментов позволяет проводить анализ нескольких патогенных вариантов для одного образца, в том числе на единичных клетках, а также выявить ситуацию неполной амплификации, контаминации или деградации образца. Еще одной особенностью ПГТ является отсутствие информации о биологических особенностях эмбриона: в отличие от взрослого человека, у эмбриона могут быть любые хромосомные аномалии, которые усложняют задачу оценки статуса эмбриона по конкретному генетическому варианту. Поэтому тест-система для ПГТ моногенного заболевания должна давать возможность выявить такие случаи и оценить их влияние на достоверность результата диагностики.

Наиболее близким техническим решением является проведение ПГТ Анемии Фанкони предложенное Svetlana Rechitsky и коллегами [Svetlana Rechitsky et al, 2006] для детекции мутаций в гене FANCA с помощью мультплексной гнездовой ПЦР в 2 раунда на биопсийном материале эмбрионов, с применением прямой и косвенной диагностики с помощью анализа наследования аллелей полиморфных маркеров, сцепленных с патогенным вариантом. При использовании такой тест-системы у наших пациентов, со стороны теломеры от мутации не оказалось бы ни одного информативного маркера. Кроме того, один из трех оставшихся маркеров находится более чем в 3 мегабазах (Мб) от гена, что повышает вероятность рекомбинации между геном и данным маркером. Важным отличием предлагаемого нами подхода является использование большего количества находящихся на расстоянии менее 3 Мб от гена полиморфных маркеров с обеих сторон от мутаций для косвенной диагностики, что снижает вероятность недостоверного результата из-за выпадения аллеля или рекомбинации.

Представленный нами метод ПГТ анемии Фанкони решает задачу разработки более точного способа преимплантационного генетического тестирования этого моногенного заболевания без использования дорогостоящих приборов и реагентов, который можно было бы применять на биоматериале различного типа: ДНК, выделенную из разных тканей, продукт полногеномной амплификации (WGA), единичные клетки.

Техническим результатом стало создание тест-системы для диагностики патогенных вариантов (номер нуклеотида в референсной последовательности геномной ДНК обозначен префиксом NC, номер нуклеотида в референсной последовательности кодирующего транскрипта обозначен префиксом NM): в гене FANCA с двойной системой детекции - прямой и косвенной, и делеция экзонов 2-3 в гене FANCA с косвенной детекцией варианта. Вариант имеется в базе гетенических вариантов ClinVar и оценивается как патогенный. [Internet. NCBI ClinVar https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/variation/1069968/ (дата обращения: 02.12.2021)] Он приводит к преждевременной терминации трансляции и нарушает синтез полноразмерного белка. Делеции участков гена FANCA, в том числе экзонов 2-3, описаны у многих пациентов с анемией Фанкони [Morgan NV et. al. Am J Hum Genet. 1999 Nov; 65(5):1330-41, Madjunkova S, et. al. Acta Haematol. 2014; 132(1):15-21.] Двойная система детекции необходима при работе с малым количеством биоматериала, так как нестабильная амплификация может привести к потере информации или сниженной точности анализа. Прямая диагностика подразумевает анализ непосредственно наличия-отсутствия патогенного варианта. В данном случае для генетического варианта типа однонуклеотидный полиморфизм (ОНП, англ. Single nucleotide polymorphism SNP) были подобраны эндонуклеазы рестрикции, которые позволяют произвести детекцию патогенного варианта методом ПЦР-ПДРФ (полиморфизм длин рестриктных фрагментов), основанным на разнице последовательности в сайте рестрикции у различных аллелей. Прямая детекция делеции экзонов 2-3 в гене FANCA (протяженная делеция, отсутствие большого количества нуклеотидов, англ. Deletion del) невозможна из-за ограничения длины фрагментов, нарабатываемых при полногеномной амплификации. Косвенная диагностика заключается в анализе наследования молекулярно-генетических маркеров, сцепленных с мутацией, т.е. наследуемых вместе с ней. Для этого на расстоянии не более 3 мБ (что соответствует 3% кроссинговера в среднем) от гена FANCA в каждую сторону были выбраны полиморфные локусы, называемые STR (short tandem repeat - короткий тандемный повтор), с гетерозиготностью не менее 0,70 для обеспечения максимальной информативности косвенной диагностики, а также доброкачественные ОНП. STR представляют собой повторы 2х и более нуклеотидов расположенные друг за другом (например пара аденин-цитозин (АЦ), повторяющаяся несколько раз подряд: АЦАЦАЦАЦ) и в большом количестве присутствуют в геноме человека. Количество повторов в каждом из них может варьироваться от индивидуума к индивидууму, а также может быть разным у одного и того же человека на 2х гомологичных хромосомах. Гетерозиготность выше 0,70 означает, что высока вероятность того, что у одного и того же человека количество повторов нуклеотидов в данном STR на одной хромосоме будет отличаться от количества повторов в этом же STR на гомологичной хромосоме, другими словами, аллели данного маркера у этого человека будут отличаться между собой по длине. При амплификации фрагмента, содержащего такой маркер, будут получены ампликоны двух разных длин. Проанализировав количество повторов в нескольких маркерах, окружающих патогенный вариант, и варианты ОНП у членов семьи, и изучив то, как они наследуются в тестируемой семье, можно установить сцепление между аллелями маркеров и патогенным вариантом. Диагностическая ценность исследования количества повторов в данных маркерах у эмбрионов состоит в том, что по тому, какой аллель каждого из маркеров был унаследован эмбрионом, можно судить о том, унаследовал ли эмбрион ген FANCA, несущий патогенный вариант, или же он унаследовал ген FANCA с другой, гомологичной хромосомы, не содержащий патогенный вариант.

Для каждого из этих локусов были подобраны праймеры для амплификации по типу гнездовой или полугнездовой ПЦР в 2 раунда, позволяющей повысить точность и эффективность амплификации. В тест-систему были включены 11 STR и 2 ОНП локусов для гена FANCA: D16S539, D16S3048, D16S3123, D16S413, D16S2621, D16S3023, D16S3026, D16S3121, D16S89.5, D16S90.1, D16S303, rs1800337, rs6500452. Праймеры для амплификации находятся на 16 хромосоме в районе координат 86386033-89498386 (в соответствии с hg19). Последовательности праймеров представлены в формуле изобретения в перечне SEQ ID NO 1-47. Важно отметить, что при подборе праймеров соблюдали ряд особенных требований: длина продукта с внешними праймерами для первого раунда ПЦР не должна превышать 500 п. н. (для наработки с фрагментов, получаемых при полногеномной амплификации), длина продукта с внутренних праймеров для второго раунда ПЦР от 120 до 350 п. н., высокая специфичность внешних праймеров, температура отжига не отличается более, чем на 1°С.

Подготовительный этап ПГТ

На подготовительном этапе проводится отработка тест-системы: подбор условий амплификации, оптимальных для работы праймеров, анализ эффективности и специфичности ПЦР-амплификации в обоих раундах, оценки универсальности тест-системы для биообразцов различного типа (ДНК, продукт WGA, единичные клетки). При отработке тест-системы были приготовлены стоковые разведения праймеров с концентрацией 100mM, и рабочие разведения комбинаций праймеров (комбинация пар праймеров для 1 и 2 раунда ПЦР) с концентрацией 10mM каждого праймера в растворе. Последовательности праймеров представлены в формуле изобретения в перечне SEQ ID NO 1-47. Так как в рамках диагностики клинического материала могут быть использованы различные типы матриц, при отработке тест-системы были использованы две биопсии единичных клеток, находящихся в специальном лизирующем буфере (1×PCR Buffer, 0,1% Tween-20, 0,1% Triton X-100, 1 мкг Proteinase К), два образца продуктов полногеномной амплификации биопсиий эмбриона (WGA), а также тотальной ДНК членов семьи, выделенной из крови, для составления родословной и выявления сцепления патогенного варианта с аллелями полиморфных маркеров.

В рамках гнездовой и полугнездовой ПЦР амплификация проводится в два этапа. На первом этапе проводится мультиплексная ПЦР со всеми внешними праймерами для всех локусов, входящих в тест-систему, для обогащения образца всеми целевыми фрагментами. На втором этапе проводится индивидуальная амплификация каждого фрагмента с внутренними праймерами.

Полу гнездовая ПЦР

Для первого этапа были подобраны внешние высокоспецифичные праймеры для амплификации фрагментов от 180 до 500 п. н. Для второго этапа были подобраны праймеры для амплификации фрагментов длиной не более 350 пар оснований, а также были введены метки для детекции методом фрагментного анализа. ПЦР-смесь для первого раунда амплификации содержала 1хПЦР буфер с Mg2+ (Евроген, Россия), 0.1 mM каждого деоксинуклеотида, 0.15 μМ каждого праймера, 2,5 U/μl ДНК полимеразы HsTaq (Евроген, Россия), 6% диметилсульфоксида (DMSO) и 1 мкл тотальной ДНК или 2,5 мкл WGA или 5 мкл лизирующего буфера с образцом в качестве матрицы. Первый этап амплификации проводился по следующему протоколу: этап денатурации 94°С в течение 2 минут, 30 циклов с понижением температуры отжига праймеров с 62 до 45°С в каждом, этап достройки всех матриц 72°С 10 минут. Далее продукты 1-ого этапа были разнесены в индивидуальные пробирки с одной парой праймеров на определенный локус.

В состав ПЦР смеси для второго этапа входили 1xPCR буфер с Mg2+ (Евроген, Россия), 0.5xRediLoad™ загрузочный буфер (Thermo Fisher Scientific, USA), 0.2 mM каждого деоксинуклеотида, 0.2 μМ каждого праймера, 1U/μl ДНК полимеразы HsTaq (Евроген, Россия), 6% диметилсульфоксида (DMSO) и 1 μl ПЦР-продукта первого этапа амплификации в качестве матрицы. Второй этап амплификации проводился по следующему протоколу: этап денатурации 95°С в течение 2 минут, 35 циклов: денатурация 95°С 30 секунд, отжиг праймеров - 57°С 30 секунд, синтез матрицы - 72°С 1 минута, этап достройки всех матриц 72°С 5 минут. Оценку эффективности и специфичности амплификации проводили с помощью электрофореза в 2% агарозном геле. Результат электрофореза в агарозном геле позволяет определить необходимую степень разведения продуктов амплификации для нанесения на фрагментный анализ (продукты амплификации ДНК членов семьи).

Фрагментный анализ продуктов амплификации проводили с помощью капиллярного электрофореза на приборе 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). По результатам фрагментного анализа составляется родословная и отмечаются информативные полиморфные STR-локусы для каждой семьи, которые в дальнейшем будут использованы в клинической диагностике. Локусы делятся на неинформативыне (носитель патогенного варианта гомозиготен по этому локусу), полуинформативные (на некоторых и родительских хромосом аллели по этому маркеру совпадают), информативные (на всех хромосомах родителей аллели этого маркера разные, что дает возможность отличить каждую из них при анализе генотипа эмбриона).

Полимеразная цепная реакция - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ)

Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (Restriction fragment length polymorphism, RFLP)- это способ исследования геномной ДНК, путем специфичного расиципления ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции и дальнейшего анализа размеров образующихся фрагментов (рестриктов) путем гель-электрофореза. При использовании данного метода наблюдаются фрагменты различной длины в зависимости от различий в последовательности нуклеотидов в сайте рестрикции, что позволяет детектировать однонуклеотидные варианты, если они располагаются в сайте рестрикции. Более точную детекцию патогенного варианта может обеспечить секвенирование по методу Сэнгера, однако в условиях ПГТ метод ПЦР-ПДРФ оказывается более эффективным из-за сниженной вероятность выпадения аллеля (allele drop out, ADO) и, как следствие, ошибочного результата по оценке статуса эмбриона по патогенному варианту. Для детекции патогенного варианта была разработана тест-система на основе ПЦР-ПДРФ. Стадия амплификации подробно описана в предыдущем разделе. Были использованы следующие праймеры:

Внешние:

Прямой:

Обратный:

Внутренние для рестрикции аллеля дикого типа:

Обратный: в паре с внешним прямым

Внутренние для рестрикции мутантного аллеля:

Обратный: в паре с внешним прямым

Далее продукты амплификации с внутренних праймеров для детекции патогенного варианта использовали в реакции рестрикции. Эндонуклеаза Smol разрезает только аллель дикого типа, эндонуклеаза FspBI разрезает только мутантный аллель варианта Детекция проводилась с помощью электрофореза в 12% полиакриламидном геле.

Также с помощью ПЦР-ПДРФ исследовались ОНП rs1800337 и rs6500452. Праймеры для амплификации фрагментов, содержащих эти ОНП, могут быть найдены в формуле изобретения. Стадия амплификации подробно описана в предыдущем разделе. Продукты амплификации с внутренних праймеров так же использовали в реакции рестрикции. Для rs1800337: эндонуклеаза Bce Al разрезает только аллель G, эндонуклеаза Taal разрезает только аллель А. Для rs6500452: эндонуклеаза Foki разрезает только аллель С, аллель Т не подвергается рестрикции. Детекция проводилась с помощью электрофореза в 12% полиакриламидном геле.

Пример 1

Пациенты А

В ЦГРМ Генетико обратилась семья А, в которой родился ребенок с заболеванием анемия Фанкони с компаунд-гетерозиготным носительством патогенных вариантов и делеция экзонов 1-3 в гене FANCA. Паре было рекомендовано проведение ПГТ заболевания анемия Фанкони в рамках ЭКО для отбора эмбрионов, не унаследовавших заболевание.

Гаплотипирование семьи

На первом этапе был получен биоматериал (периферическая кровь) членов семьи для детекции патогенного варианта и выявления групп сцепления аллелей полиморфных маркеров. Было проанализировано 11 STR локусов и 2 ОНП. Последовательности праймеров, использованных для амплификации фрагментов ДНК, содержащих полиморфные маркеры, представлены в формуле изобретения в перечне SEQ ID NO 1-47. Из них 9 STR и 2 ОНП оказались информативными по матери и/или отцу. Таким образом, образцы эмбрионов тестировались только на информативные маркеры. Аллели полиморфных маркеров, совпадающие у ребенка с заболеванием анемия Фанкони и его родителя-носителя патогенного варианта в гене FANCA, признаются сцепленными друг с другом и с соответствующим патогенным вариантом. Аллели полиморфных маркеров, не совпадающие каждого из родителей с аллелями полиморфных маркеров ребенка, признаются сцепленными друг с другом и с нормальным аллелем гена FANCA.

В результате гаплотипирования и определения групп сцепления для семьи А из примера были получены результаты, представленные в таблице 1. Аллели, указанные на одной строке, располагаются на одной хромосоме, то есть, представляют группу сцепления. Таким образом для каждого члена семьи представлено 2 группы сцепления, соответствующие каждой из двух шестнадцатых хромосом. N в таблице обозначает аллель дикого типа. Цифрами записаны длины ампликонов в парах нуклеотидов; их длины зависят от количества повторов в маркере STR. Патогенные варианты в таблице обозначены коротко - del_ex1-3 (делеция экзонов 1-3 гена FANCA) и с. 731Т>А

В результате гаплотипирования был сделан вывод, что у партнера пациентки с патогенным вариантом делеция экзонов 1-3 в гене FAMCA были сцеплены следующие аллели STR-маркеров: D16S3048 - 263; D16S413 - 129; D16S2621 - 236; D16S3023 - 100; D16S88.6 - 240; D16S89.4 - 285; D16S3026 - 210; D16S89.5 - 256; rs1800337-A; rs6500452 - Т; D16S90.1 - 300; у пациентки с патогенным вариантом были сцеплены следующие аллели STR-маркеров: D16S3048 - 255; D16S413 - 131; D16S2621 - 236; D16S3023 - 92; D16S88.6 - 234; D16S89.4 - 289; D16S3026 - 210; D16S89.5 - 256; rs1800337 - G; rs6500452 - Т; D16S90.1 - 300.

Преимплантационное генетическое тестирование

В цикле ЭКО было получено 2 эмбрионов, проведена биопсия на 5 день развития (в клинике ЭКО), биоптат в буфере для WGA (1xPBS (Invitrogen, США), 1% поливинилпирролидона (PVP) (Fertipro, Бельгия)) направлен в лабораторию «Генетико». Для контроля контаминации на разных этапах работы с образцом в лаборатории разработана система контролен: контроль контаминации буфера для биопсии, контроль контаминации при транспортировке (одна пробирка с буфером не открывается эмбриологом), контроль контаминации каждого образца (проба среды из последней отмывочной капли биопсиийного материала). Все эти контроли вместе с образцами проходят этап полногеномной амплификации, после которого будет заметно малейшее количество ДНК, контаминировавшей контроли. Полногеномную амлификацию проводили с помощью коммерческого набора SurePlex (Illumina, США).

Продукт полногеномной амплификации, а также ДНК всех членов семьи амплифицировали на 1 этапе в мультиплексной ПЦР с праймерами для детекции патогенного варианта и праймерами для информативных для семьи А полиморфных маркеров в соответствии с разработанным в рамках подготовительного этапа протоколом для тест-системы. На 2 этапе амплификацию проводили для каждого маркера отдельно в соответствии с разработанным протоколом для тест-системы. Таким образом были установлены группы сцепления, унаследованные каждым эмбрионом. Полученные результаты отображены в таблице 2.

По результатам прямой и косвенной диагностики оба эмбриона не унаследовали заболевание. У эмбриона 2 выявлен гаплотип, соответствующий носительству варианта в гене FANCA. По запросу родителей для эмбрионов провели преимплантационный генетический скрининг хромосомных аномалий. По результатам всех проведенных анализов оба эмбриона были рекомендованы к переносу.

Перечень последовательностей праймеров:

D16S539
SEQ ID NO 1: 5’-CAAGTGCCAGATGCTCGTTG-3’ (Fout);
SEQ ID NO 2: 5’-AGCGAAAGTGATGCCATAGAC-3’ (Rout)
SEQ ID NO 3: 5’-GATCCCAAGCTCTTCCTCTT-3’ (Fin);
SEQ ID NO : 4 5’-ACGTTTGTGTGTGCATCTGT-3’ (Rin),
D16S3048
SEQ ID NO 5: 5’-ATCACTGGAAGTCAAGGCCG-3’ (Fout);
SEQ ID NO 6: 5’-TGTCTGTCGGCTCAGCTTTT-3’ (Rout)
SEQ ID NO 7: 5’-AGCAAGCCGTGACTGGGT-3’ (Fin);
SEQ ID NO 8: 5’-CATGAGTAGTGTCCTGGGGG-3’ (Rin),
D16S3123
SEQ ID NO 9 5’-CCGGGAACGACATTGTCTGA-3’ (Fout);
SEQ ID NO 10 5’-GTGGAGCCTGTAGTGAGCTG-3’ (Rout)
SEQID NO 11 5’-GCCTGGGCAATAGAACAAGACTCTG-3’ (Fin);
SEQ ID NO 12 5’-TTTAAGCAGAACAGCAACGCAATC-3’ (Rin),
D16S413
SEQ ID NO 13 5’-TGGTGGTGCATGCCTGTAG-3’ (Fout);
SEQ ID NO 14 5’-CCTATTCTGGGCCTTGGAGC-3’ (Rout)
SEQ ID NO 15 5’-ACTCCAGCCCGAGTAA-3’ (Fin);
SEQ ID NO 16 5’-GGTCACAGGTGGGTTC-3’ (Rin),
D16S2621
SEQ ID NO 17 5’-AGTGGAGGCTTCTGTTCTGT-3’ (Fout);
SEQ ID NO 18 5’-CGCTTCCTCTCCTTCCCTTG-3’ (Rout)
SEQ ID NO 19 5’-GTCATATGGGCCAATTCCC-3’ (Fin);
SEQ ID NO 20 5’-ACCGCAGTAGTGAGACTGTG-3’ (Rin),
D16S3023
SEQ ID NO 21: 5’-CCTGTTTTCCGAAAGTCGCC-3’ (Fout);
SEQ ID NO 22: 5’-ATCGGTTTCCAACCTGCGAT-3’ (Rout)
SEQ ID NO 23: 5’-CTGCATTTCTCATCACAGTG-3’ (Fin);
SEQ ID NO : 24 5’-GAGCGCCTATGTTCGG-3’ (Rin),
D16S3026
SEQ ID NO 25: 5’-TCCACAAGACCCCAACCAG-3’ (Fout);
SEQ ID NO26: 5’-CAGTGTCCATGACGCCGAT-3’ (Rout)
SEQ ID NO 27: 5’-CTCCCTGAGCAACAAACACC-3’ (Fin);
SEQ ID NO : 28 5’-GGTCATTTATATGCGCCTGA-3’ (Rin),
D16S3121
SEQ ID NO 29: 5’-CAGCCACACACACCATCAAC-3’ (Fout);
SEQ ID NO 30: 5’-TGGGTCCTGAGGTCACAAAC-3’ (Rout)
SEQ ID NO 31: 5’-CATGTTGTACATCGTGATGC-3’ (Fin);
SEQ ID NO 32: 5’-AGCTTTTATTTTCCAGGGGT-3’ (Rin),
rs1800337
SEQ ID NO 33: 5’-ACAAATTTCTCTACAGAAGATCCACA-3’ (Fout);
SEQ ID NO 34: 5’-GAATTGCCTTCTCGCTGC-3’ (Rout)
SEQ ID NO 35: 5’-CTCGAGTGGTCAGTATGCGT-3’ (Rin)
rs6500452
SEQ ID NO 36: 5’-CAGTGAACCTCCTGCGTTT-3’ (Fout);
SEQ ID NO 37: 5’-CCTCATCAAGGCCACCA-3’ (Rout)
SEQ ID NO 38: 5’-GTCACAGCTCCATGTGTTACC-3’ (Rin)

D16S89.5
SEQ ID NO 39: 5’-ACGCAGACGTACTTTCGTTC-3’ (Fout);
SEQ ID NO 40: 5’-GTTGGAAGAATGTGTGACCC-3’ (Rout)
SEQ ID NO 41: 5’-GCTGTTCTTGAAACTTGCG-3’ (Rin)

D16S90.1
SEQ ID NO 42: 5’-CGAGCCTTGGAAGAGCA-3’ (Fout);
SEQ ID NO 43: 5’-GTCAAAGTCCATCAAGCACG-3’ (Rout)
SEQ ID NO 44: 5’-AGGCGGACATTTGGTGTC-3’ (Fin)

D16S303
SEQ ID NO 45: 5’-TGGTACCGGGAGAGGAGAC-3’ (Fout);
SEQ ID NO 46: 5’-TGGCGGGTCCCTGTAAT-3’ (Rout)
SEQ ID NO 47: 5’-GCAGTAGACTCGCTTGAACCT-3’ (Rin)

Изобретение относится к молекулярной биологии, а именно к способу диагностики моногенного заболевания анемия Фанкони в условиях преимплантационного генетического тестирования (ПГТ). Разработана тест-система для диагностики патогенных вариантов и делеция экзонов 1-3 в гене FANCA для использования в рамках ПГТ моногенного заболевания анемия Фанкони с возможностью прямой и косвенной диагностики. В рамках отработки тест-системы были показаны высокая специфичность и эффективность, а также универсальность в отношении биообразцов различного типа: единичные клетки, продукт полногеномной амплификации, тотальной ДНК, выделенной из разных тканей. Технический результат заключается в создании тест-системы для диагностики патогенных вариантов в гене FANCA с двойной системой детекции - прямой и косвенной, и делеции экзонов 2-3 в гене FANCA с косвенной детекцией варианта. 2 табл., 1 пр.

Способ преимплантационного генетического тестирования анемии Фанкони, предусматривающий выявление наследования патогенных вариантов и делецию экзонов 1-3 в гене FANCA, включающий двойную систему детекции - прямую и косвенную, где прямую детекцию осуществляют с помощью праймеров для амплификации:

внешние:

прямой: ,

обратный: ,

внутренние для рестрикции аллеля дикого типа:

обратный: в паре с внешним прямым,

внутренние для рестрикции мутантного аллеля:

обратный: в паре с внешним прямым, а косвенную детекцию осуществляют с помощь праймеров для анализа наследования молекулярно-генетических маркеров типа STR, сцепленных с патогенным вариантом, выбранных из SEQ ID NO 1-47, при этом используют праймеры, направленные на те STR, аллели которых разные на хромосомах хотя бы одного из родителей, где внешние праймеры обозначены как Fout (прямой праймер) и Rout (обратный праймер), а внутренние праймеры обозначены как Fin (прямой праймер) и Rin (обратный праймер), при этом диагностику проводят в два этапа полугнездовой ПЦР: на первом этапе проводят мультиплексную ПЦР с внешними праймерами, на втором этапе проводят индивидуальную ПЦР каждого фрагмента с внутренними праймерами для STR, а также метод ПЦР-ПДРФ для определения патогенного варианта в гене FANCA.