СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БИОСЕНСОРНОЙ СТРУКТУРЫ Российский патент 2023 года по МПК H10K71/12 

Изобретение относится к технологии изготовления сенсорных структур на основе твердотельного полупроводника и функционального органического покрытия и может быть использовано при создании ферментных биосенсоров на основе полевых транзисторов или структур «электролит-диэлектрик-полупроводник», обеспечивая высокую чувствительность и избирательность биосенсора.

Известен способ получения одно - или многослойных пленочных элементов путем послойной адсорбции, заключающийся в осаждении из раствора на заряженные подложки полиионных молекул, то есть полимерных молекул, обладающих эффективным зарядом в растворе (см. патент на изобретение US 5208111, МПК B32B7/04, опубл.04.05.1993). Способ включает модификацию подложки таким образом, чтобы по всей площади поверхности подложки располагались отрицательно заряженные ионы или ионизируемые отрицательно заряженные соединения, приготовление водного раствора поликатионных молекул, адсорбцию поликатионных молекул на подложку, промывку в деионизированной воде и сушку подложки с осажденным слоем в потоке сухого воздуха. Заряд первого органического слоя противоположен заряду подложки. Для осаждения следующего слоя подложку помещают в раствор с молекулами, обладающими зарядом, противоположным заряду последнего осажденного слоя. Если одним или несколькими слоями в таких многослойных полиэлектролитных покрытиях являются размещенные между слоями полиэлектролитов молекулы фермента, имеющие соответствующий электрический заряд, то такие многослойные полиэлектролитные структуры могут быть использованы в качестве чувствительных покрытий биосенсоров.

Однако данный способ не учитывает специфику формирования эффективного заряда полупроводниковой подложки, рассматривая только заряд OH-групп на поверхности диоксида кремния после модификации кремниевой подложки, и тем более не учитываются факторы влияния на знак заряда поверхностных электронных состояний на границах раздела Si/SiO₂ и SiO₂/полиэлектролит. Также в этом способе предусмотрено увеличение количества адсорбированных молекул определенного сорта на единицу площади только за счет изменения количества нанесенных слоев, причем между слоями молекул фермента должен адсорбироваться монослой молекул, имеющих противоположный заряд.

Наиболее близким к предлагаемому является способ изготовления сенсорных структур, включающий модификацию полупроводникового электрохимического преобразователя для создания эффективного отрицательного электростатического заряда, а также послойную адсорбцию слоя поликатионных молекул полимера и слоя полианионных молекул фермента из их водного раствора. При этом используют пластину монокристаллического кремния с электронным типом проводимости, а его модификацию производят путем кипячения полупроводниковой пластины в перекисно-аммиачном растворе NH₄OH/H₂O₂/H₂O=1/1/4, а в процессе адсорбции молекул фермента, либо предварительно непосредственно перед процессом адсорбции, на поверхность структуры «n-Si/SiO₂/полиэтиленимин» осуществляют освещение структуры со стороны раствора с интенсивностью, достаточной для изменения плотности заряда поверхности полупроводниковой структуры за время адсорбции (см. патент на изобретение РФ №2644979, МПК Н01L51/40, опубл. 15.02.18).

Недостатком данного способа изготовления биосенсорной структуры является использование лишь одного типа полупроводникового преобразователя сигнала и фермента, что является недостаточным для расширения диапазона определяемых субстратов. Большинство ферментов являются полиэлектролитами с преобладанием отрицательного или положительного заряда в растворе с нейтральным рН. Поэтому для проведения эксперимента принципиально лишь наличие электрического заряда у фермента в растворе.

Техническим результатом изобретения является увеличение плотности иммобилизованных молекул HRP по сравнению с образцами без буферного слоя и изготовленными без использования освещения. Расширение арсенала средств позволит улучшать технические характеристики практически любых ферментных биосенсоров, работающих на полевом эффекте.

Технический результат достигается тем, что в способе изготовления биосенсорной структуры, включающий модификацию подложки для создания эффективного отрицательного электростатического заряда, приготовление и адсорбцию из водного раствора слоя полиэлектролитных молекул на подложку, приготовление и адсорбцию из водного раствора слоя органических молекул фермента, промывку в деионизированной воде и сушку подложки в потоке сухого воздуха после нанесения каждого слоя, в качестве подложки используют монокристаллический кремний со слоем туннельно прозрачного для электронов диоксида кремния, для приготовления водного раствора полиэлектролитных молекул используют полиэтиленимин, во время адсорбции молекул фермента на подложку осуществляют освещение подложки со стороны раствора белым светом с интенсивностью, достаточной для установившегося во времени изменения плотности заряда поверхности структуры Si/SiO₂ за время адсорбции молекул фермента, согласно изобретению, в качестве полиэлектролитных молекул выбирают поликатионные молекулы, в качестве органических молекул фермента используют пероксидазу хрена, а в качестве подложки используют монокристаллический кремний с дырочным типом проводимости, дополнительно осуществляют освещение кремневой подложки во время адсорбции полиэлектролитных молекул с интенсивностью света, достаточной для изменения плотности заряда поверхности полупроводниковой структуры.

В процессе изготовления биосенсорной структуры происходит изменение электростатических взаимодействий между ее слоями, сохраняемое в процессе ее эксплуатации. Изменение морфологии и поверхностного потенциала полупроводникового преобразователя сигнала за счет применения освещения приводит к изменению физико-химических параметров органических слоев, перераспределению зарядов в полиионных молекулах фермента, направленному на повышение их биокаталитической активности.

Изобретение поясняется чертежами.

На фиг. 1 показана схема, иллюстрирующая сущность заявляемого изобретения: 1 - этап предварительной подготовки поверхности кремния, 2 - этап нанесения слоя поликатионных молекул, 3 - этап нанесения молекул фермента предлагаемым способом. При проведении этапов происходят процессы: активация отрицательно заряженных OH-групп на поверхности кремния 4 после проведения этапа 1; образование на поверхности положительного заряда за счет адсорбции молекул катионного полиэлектролита полиэтиленимина (ПЭИ) 5 после проведения этапа 2; частичная компенсация отрицательного заряда поверхности зарядом поликатионных молекул фермента пероксидазы хрена 6. 7 - область пространственного заряда (ОПЗ), ширина которой меняется на этапах 1-3 в зависимости от процессов 4-6, 8 - туннельно тонкий слой SiO₂.

На фиг. 2 - приведены два изображения, полученные с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ) и профили поверхности образцов: p-Si/SiO₂/HRP, после темнового (а) и светового (б) нанесения фермента на кремниевую подложку из водного раствора.

На фиг. 3 - средняя шероховатость, наблюдаемая после темнового и светового нанесения HRP на p-Si/SiO₂/ПЭИ из водного раствора, где 9 - p-Si/SiO₂, 10 - p-Si/SiO₂/ПЭИ (при освещении), 11 - p-Si/SiO₂/ПЭИ/HRP (в темноте), 12 - p-Si/SiO₂/ПЭИ/HRP (при освещении).

На фиг. 4 - АСМ изображения и профили поверхности образцов: p-Si/SiO₂/ПЭИ/HRP, после темнового (а) и светового (б) нанесения фермента на кремниевую подложку из водного раствора.

Способ реализуется следующим образом.

Сначала проводят стадию предварительной подготовки поверхности монокристаллического кремния со слоем естественного окисла для удаления органических и неорганических загрязнений и создания однородного отрицательного заряда на поверхности благодаря активизации отрицательно заряженных ОН-групп на поверхности оксида. Предварительная подготовка кремниевых пластин включает перекисно-аммиачную обработку (кипячение при 75°С в течение 10-15 минут в растворе NH₄OH/H₂O₂/H₂O в объемном соотношении 1/1/4 соответственно). После кипячения в перекисно-аммиачном растворе подложки тщательно промываются в деионизированной воде с удельным сопротивлением 18 МΩ·см в течение 20 минут и сушатся в потоке сухого воздуха.

Следующим этапом является нанесение из водного раствора слоя поликатионных молекул на очищенную кремневую пластину, благодаря которому происходит закрепление молекул фермента методом послойной адсорбции. Для этого приготавливают водный раствор катионного полиэлектролита, например, полиэтиленимина концентрацией 1-3 мг/мл. В приготовленный раствор погружают очищенную на предыдущем этапе пластину монокристаллического кремния на 10 минут. Этого времени достаточно для адсорбции одного сплошного монослояполиэлектролитных молекул. Далее пластина кремния промывается в деионизированной воде в течение 10 минут для удаления тех молекул, которые адсорбировались на поверхности кремниевой пластины не из-за электростатического взаимодействия, и сушится в потоке сухого воздуха.

Следующим этапом является нанесение слоя поликатионных молекул фермента, например, пероксидазы хрена (HRP). Заявленный технический результат достигается за счет того, что на данном этапе полупроводниковую подложку, на которую предварительно нанесли слой поликатионных молекул, освещают монохромным или полихромным («белым») светом с длинами волн из области собственного поглощения полупроводника.

Пример конкретного выполнения.

В качестве полупроводникового преобразователя сигнала использовались пластины монокристаллического Sip-типа, которые обрабатывались в перекисно-аммиачном растворе NH₄OH:H₂O₂:H₂O=1:1:4 в течение 10 минут при температуре 75°. Затем образцы промывались в деионизированной воде и сушились в потоке сухого воздуха.

Пероксидаза хрена - фермент, используемый в ходе эксперимента. Молекулы HRP осаждались из водных растворов с концентрацией белка 0,5 мг/мл. Интерес к этому ферменту обусловлен его широким применением, отличием от фермента глюкозооксидазы повышенной амфотерностью свойств и относительно малыми размерами.

Для нанесения органических слоев подготовленные подложки либо сразу погружались в водный раствор пероксидазы хрена, либо сначала в водный раствор ПЭИ (концентрация 1 мг/мл), а затем в раствор HRP. Время адсорбции органических молекул было постоянным и составляло 10 минут. Во время адсорбции часть образцов освещалась. Затем образцы промывались в деионизированной воде в течение 10 минут и сушились в потоке сухого воздуха для удаления незакрепленных молекул.

Для дальнейшей оценки влияния полевого эффекта и освещения на адсорбцию полиэлектролитов был измерен уровень фоточувствительности используемых пластин Si. Во всех экспериментах использовался волоконный осветитель фирмы Schott с галогенной лампой, спектр излучения которой содержит длины волн из спектра поглощения Si. Освещенность в центре светового пятна была примерно 20000 лк.

Следуя технологическому алгоритму, были получены покрытия с воспроизводимыми параметрами, что подтвердилось измерениями полученных образцов с помощью установки ИНТЕГРА Спектра.

Результаты адсорбции HRP из водного раствора при освещении и в темноте на чистую подложку Sip-типа и на подложку с буферным слоем ПЭИ

Буферный полиэлектролитный слой ПЭИ наносился при освещении на кремниевую подложку из водного раствора (pH≈6,5).

По величине изменения средней высоты неровностей (H_ср)и шероховатости(Sa), можно судить об успешности иммобилизации молекул HRP(фиг. 2). Нанесение органических молекул приводит к увеличению средней высоты неровностей, при этом изменение H_ср коррелирует с размерами наносимых молекул. Изменение шероховатости, которая является по сути среднекваратичным отклонением вероятностного распределения высот на скане, зависит как от количества адсорбировавших частиц, так и от однородности (равномерности) поверхностного слоя.

На фиг. 3 приведены абсолютные изменения средней шероховатости после нанесения HRP поверх предварительно нанесенного слоя ПЭИ. Средняя шероховатость изменилась сильнее при фотостимулированном нанесении HRP.

Слой ПЭИ наносился при освещении, поэтому очень несущественно повлиял на среднюю высоту неровностей и среднюю шероховатость. Очевидно, что слой ПЭИ увеличил адсорбцию HRP - увеличилось количество иммобилизованных молекул HRP, но их распределение по поверхности подложки стало более неоднородным. Фотостимулированная адсорбция (ФСА) HRP увеличила шероховатость. Освещение в этом случае (при наличии подслоя ПЭИ) увеличивает как среднюю высоту неровностей, так и среднюю шероховатость.

Также из фиг. 4 видно, что когда наносится предварительно слой ПЭИ, то получаем при тех же условиях адсорбции гораздо большую плотность иммобилизованных молекул HRP по сравнению с образцами без буферного слоя.

Таким образом, увеличивается чувствительность к аналиту из-за увеличения количества молекул в монослое (плотность) фермента на модифицированной поверхности полупроводникового преобразователя.

Изобретение относится к технологии изготовления сенсорных структур на основе твердотельного полупроводника и функционального органического покрытия и может быть использовано при создании ферментных биосенсоров на основе полевых транзисторов или структур «электролит-диэлектрик-полупроводник». Способ изготовления биосенсорной структуры включает модификацию полупроводникового электрохимического преобразователя для создания эффективного отрицательного электростатического заряда, а также послойную адсорбцию слоя поликатионных молекул полимера и слоя поликатионных молекул фермента из их водного раствора. При этом используют пластину монокристаллического кремния с дырочным типом проводимости, а его модификацию производят путем кипячения полупроводниковой пластины в перекисно-аммиачном растворе NH₄OH/H₂O₂/H₂O=1/1/4, а в процессе адсорбции молекул фермента либо предварительно непосредственно перед процессом адсорбции на поверхность структуры «Si/SiO₂/полиэтиленимин» осуществляют освещение структуры со стороны раствора с интенсивностью, достаточной для изменения плотности заряда поверхности полупроводниковой структуры за время адсорбции. Техническим результатом изобретения является увеличение чувствительности к аналиту из-за увеличения количества молекул в монослое фермента на модифицированной поверхности полупроводникового преобразователя. 1 пр., 4 ил.

Способ изготовления биосенсорной структуры, включающий модификацию подложки для создания эффективного отрицательного электростатического заряда, приготовление и адсорбцию из водного раствора слоя полиэлектролитных молекул на подложку, приготовление и адсорбцию из водного раствора слоя органических молекул фермента, промывку в деионизированной воде и сушку подложки в потоке сухого воздуха после нанесения каждого слоя, в качестве подложки используют монокристаллический кремний со слоем туннельно прозрачного для электронов диоксида кремния, для приготовления водного раствора полиэлектролитных молекул используют полиэтиленимин, во время адсорбции молекул фермента на подложку осуществляют освещение подложки со стороны раствора белым светом с интенсивностью, достаточной для установившегося во времени изменения плотности заряда поверхности структуры Si/SiO₂ за время адсорбции молекул фермента, отличающийся тем, что в качестве полиэлектролитных молекул выбирают поликатионные молекулы, в качестве органических молекул фермента используют пероксидазу хрена, а в качестве подложки используется монокристаллический кремний с дырочным типом проводимости, дополнительно осуществляют освещение кремниевой подложки во время адсорбции полиэлектролитных молекул с интенсивностью света, достаточной для изменения плотности заряда поверхности полупроводниковой структуры.