Способ диагностики рака шейки матки по показателям уровня Е-кадгерина в плазме крови у нелинейных крыс Российский патент 2023 года по МПК G01N33/53 

Описание патента на изобретение RU2800328C1

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к диагностике злокачественных новообразований и клинической биохимии. На модели рака шейки матки, спровоцированного с помощью топического воздействия субстанции с доказанной канцерогенной активностью, у нелинейных крыс, разработан способ диагностики рака шейки матки по показателям уровня Е-кадегрина в плазме крови. При наличии подозрений на рак шейки матки по цитологическому исследованию, у крысы берут плазму крови и проводят анализ уровня экспрессии белка E-кадгерина методом иммуноферментного анализа. Полученный результат сравнивается с эталонным значением, показателем уровня E-кадгерина у крыс, не страдающих раком шейки матки. Если полученный результат уровня экспрессии белка Е-кадгерина в плазме крови превышает эталонные значения, выставляется диагноз рак шейки матки. Предлагаемое изобретение позволяет повысить эффективность диагностики онкологических процессов шейки матки.

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к диагностике злокачественных новообразований и клинической биохимии.

В России РШМ занимает 5 место в структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями среди женщин (5,2% всех злокачественных новообразований) и второе место в структуре заболеваемости злокачественными опухолями репродуктивной системы. Высокая летальность в зависимости от возрастной группы пациенток (от 19,2% в группе 30-34 года до 97,1% в группе 85 лет и старше) свидетельствует о поздней диагностике и не всегда адекватном лечении [Злокачественные новообразования в России в 2018 году (заболеваемость и смертность) / Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой - Москва: МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, 2019. - 250 с.]. Кроме того, в настоящее время четко прослеживается увеличение заболеваемости РШМ у молодых женщин: пик приходится на возрастную группу 40-44 года, тогда как 10 лет назад подобная картина была характерна для группы 50-54 года [Злокачественные новообразования в России в 2008 году (заболеваемость и смертность) / Под ред. В.И. Чиссова, В.В. Старинского, Г.В. Петровой - Москва: ФГУ «МНИОИ им. П.А. Герцена Росмедтехнологий», 2010. - 256 с.]. Таким образом, в последнее десятилетие сложилась крайне неблагоприятная тенденция, свидетельствующая о том, что при относительной стабильности заболеваемости РШМ в целом растет заболеваемость женщин репродуктивного возраста и увеличивается частота запущенных форм РШМ. В связи с этим возникает необходимость проведения широких мероприятий по выявлению предраковых состояний и начальных форм РШМ, при которых, используемые в настоящее время методы лечения, могут приводить к полному выздоровлению.

Диагностика рака шейки матки (РШМ) в начальных стадиях представляет большие трудности. Как правило, на ранних стадиях заболевания клинических симптомов нет или они связаны с сопутствующими воспалительными, фоновыми заболеваниями [Бохман Я.В. Руководство по онкогинекологии. - СПб.: Фолиант, 2002. - 539 с.]. Современная онкологическая наука располагает рядом методов диагностики РШМ, позволяющих судить о наличии или отсутствии опухоли в момент обследования.

В частности, широкое распространение получил цитологический метод исследования мазков (pap-тест), полученных с поверхности шейки матки и цервикального канала. Метод прост и легкодоступен. Вместе с тем, цитологический метод не является совершенным. Согласно обобщенным данным, чувствительность рутинного цитологического метода колеблется от 5% до 83,3%, а специфичность 36-76,9% [Подистов Ю.И. Сопоставление результатов цитологического исследования и данных молекулярно-биологического метода HYBRID CAPTURE II у больных предраком шейки матки / Клиническая лабораторная диагностика. - 2005. - №8. - С.43-45].

К недостаткам цитологического метода относятся: технические ошибки, связанные с нарушением техники получения мазков, субъективность в оценке цитологических результатов, инвазивность метода.

Известен такой способ диагностики рака шейки матки, как кольпоскопия. Данный метод относится к методам визуальной оценки состояния эктоцервикса с выявлением очагов поражения для осуществления прицельной биопсии. Чувствительность и специфичность кольпоскопического метода варьирует в пределах 41,8%-87.8% и 78,8%-93,2%, соответственно [Evangelos P. Agnantis expanded cytological referral criteria for colposcopy in cervical screening: Comparison with human Papillomavirus testing / Gynecologic Oncology. - 2001. - Vol.82, N 2. - P.355-359]. Метод простой, легко доступный, не требует больших материальных затрат.

Существенными недостатками этого метода являются: субъективность в оценке результатов, требуется высокая квалификация исследователя, а также невозможность диагностики злокачественных поражений, локализованных в области цервикального канала, составляющих большинство патологий шейки матки [Шуваева Н.И., Коротких И.Н. Клиника, диагностика рака цервикального канала: методические рекомендации. - М., 1984. - 10 с.].

Решающим методом диагностики рака шейки матки является биопсия с последующим гистологическим исследованием [Бохман Я.В. Руководство по онкогинекологии. - СПб.: Фолиант, 2002. - 539 с.]. С целью получения материала для гистологического исследования применяют прицельную биопсию и конизацию шейки матки. При отрицательных результатах биопсии наиболее эффективным методом является конизация шейки матки. Метод является инвазивным и не может быть использован при массовых обследованиях.

Недостатком гистологического исследования является также невозможность многократного применения данного метода диагностики при обследовании одной и той же пациентки [Хмельницкий O.K. Цитологическая и гистологическая диагностика заболеваний шейки и тела матки. - СПб.: Sotis, 2000. - 332 с.].

В настоящее время предполагают, что наиболее перспективными для дифференциальной диагностики цервикальных интраэпителиальных неоплазий и РШМ являются методы, основанные на определении опухолевых биомаркеров в биологическом материале. Наиболее информативными опухолевыми маркерами в диагностике рака шейки матки в настоящее время признаны антигены SCC (антиген плоскоклеточного рака), РЭА (раково-эмбриональный антиген) и CA 125. Определение этих антигенов основано на взаимодействии специфических моно- или поликлональных антител с антигенными детерминантами белковой природы.

Для мониторинга течения заболевания, прогноза и эффективности проводимого лечения применяется антиген плоскоклеточного карциномы (SCC). Диагностическая чувствительность SCC при плоскоклеточном РШМ составляет 60-87%, специфичность 41-91% [Gaarenstroom, K.N. Can initial serum Cyfra 21-1, SCC antigen, and TPA levels in squamous cell cervical cancer predict lymph node metastases or prognosis // Gynecol Oncol. - 2000. - Vol.77. - P.164-170]. Многочисленные исследования показывают повышение уровня SCC в зависимости от стадии процесса, размеров опухоли, глубины инвазии. Считается, что повышение уровня SCC связано со стадией заболевания, но не прогнозирует метастазирование в лимфоузлы, и не является маркерами раннего выявления РШМ [Can initial serum cyfra 21-1, SCC antigen, and TPA levels in squamous cell cervical cancer predict lymph node metastases or prognosis? / Katja N. et.al. // Gynecol. Oncology. - 2000. - Vol.77, N 1. - P.164-170].

РЭА является универсальным опухолевым маркером [СЕА, СА 50 and CA 242 in patients surviving colorectal cancer without recurrent disease / B. Engaras, et. al. // Eur. J. Surgi. Oncology. - 2001. - Vol.27, N 1. - P.43-48]. Широкое использование определения РЭА в диагностике РШМ ограничивается низкой чувствительностью. При высокой специфичности определения РЭА - 98% чувствительность составляет около 33%. Повышение уровня РЭА отмечается при дисплазии тяжелой степени, плоскоклеточном раке шейки матки, при прогрессии опухоли или метастазах [Baaron Т. Increased carcinoembryonic antigen expression in cervical intraepithelial neoplasia grade 3 and in cervical squamous cell carcinoma // Hum. Pathol. - 2000. - Vol.31, N 11. - P.1357-1362]. Использование РЭА в классическом определении (из сыворотки крови) актуально лишь в качестве мониторинга излеченности заболевания.

Известен также способ диагностики РШМ по повышению уровня экспрессии СА 125 в сыворотке крови. Такой метод диагностики также не позволяет подтвердить наличие злокачественного новообразования. Например, повышенный уровень CA 125 в сыворотке крови наиболее часто вызвано воспалением при доброкачественных гинекологических заболеваниях, реже при раке шейки матки и раке половых путей. (e.g., Moore et al., 1998 Infect. Dis. Obstet. Gynecol. 6:182; Sarandakou et al., 1997 Acta Oncol. 36:755). Повышенный уровень CA 125 в сыворотке также может сопровождать нейробластому, а повышенный уровни РЭА и SCC могут сопровождать колоректальный рак.

Наиболее близким по технической сути к заявляемому способу, который и принят в качестве прототипа, является метод диагностики рака шейки матки по уровню экспрессии белка HE4 в образце, полученном от пациента (patent US20200292549A1 publication 17.09.2020). Недостатком данного метода диагностики является его низкая специфичность, повышение уровня экспрессии может указывать не только на рак шейки матки, но и на другие онкологические процессы (рак яичников, рак легкого, почек, молочной железы).

Существует острая необходимость в дополнительных маркерах, которые были бы полезны при диагностическом исследовании.

Задачей, на решение которой направлено заявленное изобретение является, подтверждение возможности использования белка E-кадгерина для диагностики рака шейки матки у нелинейных крыс.

Данная задача решается за счет того, что заявленное изобретение включает в себя измерение уровня экспрессии мембранного белка Е-кадгерина в плазме крови, полученной от животного. Уровень экспрессии Е-кадгерина сравнивается со значениями данного белка у крыс, не страдающих раком шейки матки, которые принимаются за эталонные.

Полученный результат сравнивается с эталонным значением, показателем уровня E-кадгерина у крыс, не страдающих раком шейки матки. Если полученный результат уровня экспрессии белка Е-кадгерина в плазме крови превышает эталонные значения, выставляется диагноз рак шейки матки. Предлагаемое изобретение позволяет повысить эффективность диагностики онкологических процессов шейки матки.

Способ включает забор крови, получение плазмы центрифугированием, количественную оценку уровня экспрессии мембранного белка E-кадгерина методом иммуноферментного анализа, сопоставление полученных значений с эталонными, постановку диагноза.

Способ осуществляется следующим образом:

В полученной плазме крови крыс оценивают содержание мембранного белка Е-кадгерина с помощью использования “сэндвич”-варианта твердовазного иммуноферментного анализа. Для реализации этого варианта используют два моноклональных антитела с различной эпитопной специфичностью к E-кадгерину. Одно из них иммобилизовано на твердой фазе (внутренняя поверхность лунок), второе конъюгировано с пероксидазой хрена.

Исследуемый материал помещается в лунки, в которых при добавлении конъюгата анти-Е-кадгерин-пероксидаза, во время инкубации одновременно происходит иммобилизация Е-кадгерина, содержащегося в исследуемом образце, и связывание его с конъюгатом. При удалении содержимого лунки и промывке происходит удаление избытка конъюгата анти-E-кадгерин-пероксидазы, не связавшегося с иммобилизованным в ходе инкубации Е-кадгерином. Количество связавшегося конъюгата прямо пропорционально количеству Е-кадгерина в исследуемом образце.

Во время инкубации с окрашивающим субстратом происходит окраска раствор в тех лунках, где есть Е-кадгерин. Степень окраски прямо пропорциональна количеству E-кадгерина в исследуемом образце. После измерения оптической плотности раствора в лунках, на основании калибровочного графика, рассчитывают концентрацию E-кадгерина в исследуемом образце.

Были исследованы плазмы крови 40 крыс, средний возраст, которых составлял 9 месяцев. Было две группы, эталонный контроль - 20 крыс и опытная группа, с предполагаемым раком шейки матки - 20 крыс. Для оценки морфологической структуры клеточных элементов с целью установления опухолевого поражения брались влажные мазки-отпечатки эпителия влагалища и шейки матки.

После появления подозрений на наличие рака шайки матки, был осуществлен забор крови с последующим получением плазмы и проведением иммуноферментного анализа. Согласно результатам проведенного исследования концентрация Е-кадгерина, выраженная в пг/мл, в плазме крови здоровых крыс в среднем составляет 2,24±0,08 пг/мл. Среднее значение концентрации Е-кадгерина в плазме крови крыс с предполагаемым раком шейки матки составляет 3,43±0,85 пг/мл. Установлены статистически достоверные различия значений E-кадгерина между здоровыми крысами и крысами с диагнозом рака шейки матки (p<0,05). Наличие онкологического заболевания, в группе животных, с повышенным уровнем E-кадгерина, в дальнейшем было подтверждено гистологическим исследованием.

Пример 1

Крыса номер 1 из опытной группы. При цитологическом исследовании отмечается предположительное нарушение межклеточных контактов (Фиг.1). После проведения иммуноферментного анализа было установлено, что концентрация Е-кадгерина в плазме крови у данного животного составляет 4,48 пг/мл, что на 2,24 пг/мл больше эталонного значения, полученного от животных, без рака шейки матки. Установлен диагноз рак шейки матки, который был подтвержден гистологически (Фиг.3). Дополнительно был проведен иммуногистохимический анализ, на котором отмечалось значительное снижение уровня мембранной экспрессии белка Е-кадгерина в эпителии шейки матки (Фиг.4).

Пример 2

Крыса 1 из контрольной группы. Цитограмма в норме, измененные клетки отсутствуют (Фиг 2). После проведения иммуноферментного анализа было установлено, что концентрация Е-кадгерина в плазме крови у данного животного составляет 2,11 пг/мл, что соответствует эталонному значению. Признаки рака шейки матки не обнаружены, данный результат был подтвержден гистологически. Иммуногистохимический анализ также подтвердил отсутствие снижения уровня экспрессии белка Е-кадгерина в цилиарном эпителии маточной трубы (Фиг.5).

Разработанный метод диагностики, основанный на определении уровня экспрессии Е-кадгерина в плазме крови у нелинейных крыс, является перспективным и представляет интерес для практической онкологии. В дальнейшим данный метод может быть использован для диагностики онкологических заболеваний матки у людей.

Преимуществами заявленного способа связано с тем, что не является инвазивным. Он может быть использован для массового скрининга (на одном микропланшете одновременно анализируется 96 образцов).

Литература

Ljubojevic S, Skerlev M (2014). "HPV-associated diseases". Clinics in Dermatology. 32 (2): 227-34. doi:10.1016/j.clindermatol.2013.08.007

Гурцевич, В. Э. Рак шейки матки: Причины, следствия, профилактика. Журнал «СПИД, рак и общественное здоровье». Т. 11, № 1 (2007).

Патент US20200292549A1 United States Use of HE4 and other biochemical markers for assessment of endometrial and uterine cancers

https://patents.google.com/patent/US20200292549A1/en?q=Method+for+diagnosing+cervical+cancer&oq=Method+for+diagnosing+cervical+cancer

Патент RU 234 485 C1 Способ диагностики рака шейки матки

Похожие патенты RU2800328C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ЦЕРВИКАЛЬНОЙ ИНТРАЭПИТЕЛИАЛЬНОЙ НЕОПЛАЗИИ III СТЕПЕНИ И ПРЕИНВАЗИВНОГО РАКА ШЕЙКИ МАТКИ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ВИРУСОМ ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА 2012
  • Орнер Ирина Юрьевна
  • Абрамовских Ольга Сергеевна
  • Зотова Мария Александровна
  • Батурина Ирина Леонидовна
  • Никушкина Карина Викторовна
  • Телешева Лариса Федоровна
  • Жаров Александр Владимирович
RU2506892C1
СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ЦЕРВИКАЛЬНОЙ ИНТРАЭПИТЕЛИАЛЬНОЙ НЕОПЛАЗИИ III СТЕПЕНИ И МИКРОИНВАЗИВНОГО РАКА ШЕЙКИ МАТКИ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ВИРУСОМ ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА 2019
  • Волкова Татьяна Олеговна
  • Курмышкина Ольга Вадимовна
  • Ковчур Павел Иванович
RU2735660C1
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РАКА ШЕЙКИ МАТКИ 2007
  • Булгаков Александр Александрович
  • Родионова Ольга Михайловна
  • Апанасевич Владимир Иосифович
  • Петрова Ирина Юрьевна
  • Елисейкина Марина Геннадьевна
RU2343485C1
СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ЦЕРВИКАЛЬНЫХ ДИСПЛАЗИЙ И РАКА ШЕЙКИ МАТКИ 2012
  • Волкова Татьяна Олеговна
  • Курмышкина Ольга Вадимовна
  • Бахлаев Иван Егорович
  • Ковчур Павел Иванович
  • Полторак Александр Николаевич
RU2538618C2
Способ ранней диагностики цервикальных интраэпителиальных неоплазий (ЦИН) на основе изучения метаболических маркеров 2016
  • Хлебкова Юлия Сергеевна
  • Вишнякова Полина Александровна
  • Межевитинова Елена Анатольевна
  • Высоких Михаил Юрьевич
RU2629632C1
СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ НЕБЛАГОПРИЯТНОГО ТЕЧЕНИЯ МЕСТНОРАСПРОСТРАНЕННЫХ ФОРМ РАКА ШЕЙКИ МАТКИ, АССОЦИИРОВАННОГО С ВИРУСОМ ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА 2012
  • Батурина Ирина Леонидовна
  • Орнер Ирина Юрьевна
  • Абрамовских Ольга Сергеевна
  • Зотова Мария Александровна
  • Телешева Лариса Федоровна
  • Жаров Александр Владимирович
RU2504326C1
Способ диагностики степени дисплазии шейки матки 2019
  • Бурцев Дмитрий Владимирович
  • Димитриади Татьяна Александровна
  • Холодная Татьяна Олеговна
RU2704966C1
СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ВЕРОЯТНОСТИ ВЫЯВЛЕНИЯ РАКА ШЕЙКИ МАТКИ НА ОСНОВЕ РУТИННЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ КРОВИ 2023
  • Каприн Андрей Дмитриевич
  • Сушинская Татьяна Валентиновна
  • Кузнецов Антон Игоревич
  • Щепкина Елена Викторовна
  • Стуклов Николай Игоревич
  • Епифанова Светлана Викторовна
RU2802395C2
Способ динамического контроля эффективности лечения цервикальных интраэпителиальных поражений шейки матки с помощью суппозиториев на основе дииндолилметана 2015
  • Киселев Всеволод Иванович
  • Друх Вадим Михайлович
  • Кузнецов Игорь Николаевич
RU2618427C1
СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ СТЕНОЗА ШЕЙКИ МАТКИ ПОСЛЕ ХИРУРГИЧЕСКОГО ЛЕЧЕНИЯ 2023
  • Мкртчян Лиана Сирекановна
  • Иваненко Кирилл Викторович
  • Крикунова Людмила Ивановна
  • Беспалов Павел Дмитриевич
  • Алексеева Галина Сергеевна
  • Иванов Сергей Анатольевич
  • Каприн Андрей Дмитриевич
RU2797111C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 800 328 C1

Реферат патента 2023 года Способ диагностики рака шейки матки по показателям уровня Е-кадгерина в плазме крови у нелинейных крыс

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к диагностике злокачественных новообразований и клинической биохимии. Способ диагностики рака шейки матки по показателям уровня E-кадгерина в плазме крови у нелинейных крыс включает забор крови с последующим получением плазмы и проведением иммуноферментного анализа. Определяют концентрацию Е-кадгерина, выраженную в пг/мл. При концентрации Е-кадгерина больше 3,43 пг/мл диагностируют рак шейки матки. Изобретение позволяет повысить эффективность диагностики онкологических процессов шейки матки. 5 ил., 2 пр.

Формула изобретения RU 2 800 328 C1

Способ диагностики рака шейки матки по показателям уровня E-кадгерина в плазме крови у нелинейных крыс, включающий забор крови с последующим получением плазмы и проведением иммуноферментного анализа, определение концентрации Е-кадгерина, выраженной в пг/мл, и при концентрации Е-кадгерина больше 3,43 пг/мл диагностируют рак шейки матки.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2023 года RU2800328C1

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РАКА ШЕЙКИ МАТКИ 2007
  • Булгаков Александр Александрович
  • Родионова Ольга Михайловна
  • Апанасевич Владимир Иосифович
  • Петрова Ирина Юрьевна
  • Елисейкина Марина Геннадьевна
RU2343485C1
RU 2728675 C1, 31.07.2020
КОРОЛЕНКОВА Л.И
и др
Экспрессия е-кадгерина - биохимический маркер прогрессии заболевания при цервикальных интраэпителиальных неоплазиях / ВЕСТН
МОСК
УН-ТА
СЕР
Аппарат для очищения воды при помощи химических реактивов 1917
  • Гордон И.Д.
SU2A1
ХИМИЯ, 2012, т
Веникодробильный станок 1921
  • Баженов Вл.
  • Баженов(-А К.
SU53A1
Паровоз с приспособлением для автоматического регулирования подвода и распределения топлива в его топке 1919
  • Шелест А.Н.
SU272A1
ШАМАРАКОВА М.В
и др
СОВРЕМЕННЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ В

RU 2 800 328 C1

Авторы

Шестакова Валерия Геннадьевна

Слюсарь Николай Николаевич

Павлов Роман Дмитриевич

Нигматуллина Лейла Ильдаровна

Атаджанов Ильяс

Даты

2023-07-20Публикация

2022-09-21Подача