СПОСОБ ИНАКТИВАЦИИ ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2023 года по МПК C12N13/00 A61L2/08 

Заявленная группа изобретений относится к области физических способов инактивации мультирезистентных патогенных бактерий и может быть использована в медицине и пищевой промышленности.

Наиболее распространенным способом борьбы с патогенными бактериями является использование антибиотиков, но их длительное воздействие приводит к появлению мультирезистентных штаммов.

Данную проблему предлагается устранить применением альтернативных способов борьбы с патогенными бактериями, в частности, физических способов, которые являются экологически чистыми и не требуют использования химических соединений.

Известен способ разрушения биопленок, заключающийся в облучении их фемтосекундным ультрафиолетовым лазерным излучением с длиной волны 383 нм, частотой следования лазерных импульсов 70 МГц и длительностью импульсов 140 фс (см. UA 104321 С2, опубл. 27.01.2014 [1]).

К недостаткам известного способа можно отнести сложность генерации фемтосекундного ультрафиолетового лазерного излучения, а также возможные повреждения носителей генетической информации для размножения молекул дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) клеток млекопитающих при облучении их тканей, приводящие к мутагенным эффектам.

Известен способ инактивации плесневых грибов, заключающийся в облучении поверхностей, на которых они присутствуют (зерен риса), инфракрасным (ИК) излучением (см. Oduola А.А. et al. Impacts of broadband and selected infrared wavelength treatments on inactivation of microbes on rough rice, J Food Saf, 2020 [2]).

Недостатком известного способа является его низкая интенсивность в результате применения теплового источника ИК-излучения.

Известен способ инактивации патогенных бактерий, заключающийся в облучении поверхности, на которой присутствуют патогенные бактерии в планктонной форме, фемтосекундным лазерным ИК-излучением с длиной волны 3 мкм или 6 мкм и частотой следования импульсов 1 кГц при плотностях мощности в диапазоне 0,2-1,1 ТВт/см² (см. Kompanets V. et al. Spectrally-selective mid-IR laser-induced inactivation of pathogenic bacteria, Biomedical Optics Express, 2021, т. 12, №10, pp. 6317-6325 [3]).

К недостаткам известного способа можно отнести необходимость использования лазерного излучения крайне высоких плотностей мощности и сложность генерации фемтосекундного лазерного излучения данного спектрального диапазона.

Известный способ принят в качестве ближайшего аналога заявленного способа.

Техническая проблема, решаемая заявленной группой изобретением, состоит в создании бесконтактного способа инактивации (дезинфекции или стерилизации) патогенных бактерий на биотических и абиотических поверхностях без использования химических реагентов и индуцирования мутагенных эффектов в ДНК клеток тканей млекопитающих.

При этом достигается технический результат, заключающийся в возможности использования источника лазерного излучения малой плотности мощности, что, в свою очередь, приводит к снижению энергоемкости процесса инактивации и отсутствию избыточно сильного нагрева облучаемых поверхностей, что особенно актуально при облучении кожных покровов млекопитающих, а также позволяет избежать повреждения рабочих абиотических поверхностей в медицинских учреждениях и учреждениях пищевой промышленности и снижения товарного вида пищевой продукции.

Техническая проблема решается, а указанный технический результат достигается в результате создания способа инактивации патогенных бактерий, заключающегося в облучении поверхности, на которой присутствуют патогенные бактерии в планктонной форме, фемтосекундным лазерным ИК-излучением с длиной волны 3 мкм и частотой следования импульсов 10 кГц при плотности мощности 1,2⋅10⁸ Вт/см² в течение 5 мин.

Техническая проблема решается, а указанный технический результат достигается также в результате создания способа инактивации патогенных бактерий, заключающегося в облучении поверхности, на которой присутствуют патогенные бактерии в планктонной форме, фемтосекундным лазерным ИК-излучением с длиной волны 6 мкм и частотой следования импульсов 10 кГц при плотности мощности 8⋅10⁶ Вт/см² в течение 3-5 мин.

При реализации этого варианта также достигается технический результат, заключающийся в возможности инактивации патогенных бактерий, находящихся в замкнутом герметичном пространстве под полиэтиленовой пленкой, что характерно для упакованных пищевых продуктов. Полиэтиленовая пленка может также выступать в качестве защитной при инактивации особо опасных патогенных бактерий.

На фиг. 1 в диапазоне 800-3800 см^-1 показан ИК-спектр оптической плотности бактериальной культуры Pseudomonas aeruginosa, нанесенной на поверхность подложки из фторида кальция (CaF₂) и облученной на длине волны лазерного ИК-излучения 3 и 6 мкм.

На фиг. 2а показано схематичное изображение прямого облучения бактериальной культуры Pseudomonas aeruginosa лазерным ИК-излучением, согласно первому и второму вариантам заявленного способа.

На фиг. 2b показано схематичное изображение облучения бактериальной культуры Pseudomonas aeruginosa лазерным ИК-излучением, через полиэтиленовую пленку, согласно второму варианту заявленного способа.

Заявленный способ основан на колебательном возбуждении основных структурных компонентов бактериальной клетки (белков, нуклеиновых кислот) лазерным ИК-излучением с фемтосекундной длительностью импульсов и длиной волны, соответствующей резонансному поглощению излучения этими структурами. Возбуждение колебаний C-N связей амидных групп белков и нуклеиновых кислот осуществляется лазерным ИК-излучением с длиной волны 6 мкм, возбуждение С-Н связей углеродного скелета бактериальной клетки - лазерным ИК-излучением с длиной волны 3 мкм (см. [3]).

Лазерное излучение с фемтосекундной длительностью импульсов и длиной волны 3 и 6 мкм получают путем параметрической генерации излучения волоконного иттербиевого лазера с длиной волны 1030 или 1050 нм и последующей генерации разностной частоты ИК-диапазона.

Характеристики полученного лазерного излучения приведены в табл. 1.

Возможность реализации заявленного способа подтверждается следующими примерами.

Пример 1.

Суточную культуру бульона в 1 мл центрифугировали и удаляли супернатант, затем добавляли 1 мл дистиллированной воды и интенсивно встряхивали. Полученную суспензию разбавляли последовательным десятичным разбавлением до 10⁵ КОЕ/мл. Бактериальную культуру капельно наносили на подложки 1 из CaF₂ в объеме 5 мкл и высушивали в течение 10-15 минут. В высушенном виде бактериальная культура представляла пятно 2 диаметром 3 мм и средней толщиной ~ 2 мкм. Далее, как показано на фиг.2а, производилось облучение полученного бактериального пятна 2 лазерным ИК-излучением с характеристиками, приведенными в табл.1, в течение 3, 5 и 7 минут. Облучение лазерным ИК-излучением производилось по нормали к поверхности образца с бактериальной культурой расфокусированным лазерным пучком 3, диаметр которого превышал диаметр пятна 2. Затем облученные лазерным излучением и контрольные образцы перемещали в отдельные стерильные пробирки с физиологическим раствором и интенсивно встряхивали в течение 30 минут. Полученную суспензию высевали на плотную питательную среду и помещали в термостат на один день при 37°С. Через день подсчитали бактериальные колонии для определения количества колониеобразующих единиц (КОЕ) и пересчитали в значения КОЕ/мл.

Пример 2.

Образцы с бактериальной культурой по примеру 1 во время облучения были накрыты полиэтиленовой пленкой 4 (см. фиг. 2b). После облучения образцы с бактериальной культурой помещали в пробирку с физиологическим раствором, полиэтиленовую пленку 4 утилизировали отдельно.

Использовалось только лазерное ИК-излучение с длиной волны 6 мкм, выбор которого был обусловлен высоким пропусканием полиэтиленовой пленки 4 на данной длине волны. Лазерное излучение с длиной волны 3 мкм не может быть использовано, поскольку в спектральной области вблизи 3 мкм полиэтиленовая пленка 4 обладает полосами сильного поглощения, что приводит к поглощению лазерного излучения в самой пленке и не позволяет достичь инактивации бактерий. Плотности мощности лазерного излучения, используемого в [3], также не позволяют достичь инактивации бактерий ввиду возникновения нелинейного поглощения излучения в полиэтиленовой пленке 4.

Микробиологические исследования показали сокращение КОЕ/мл на 1-2 порядка, что соответствует дезинфекции. Результаты сокращения КОЕ/мл в зависимости от времени облучения образцов с бактериальной культурой лазерным излучением приведены в табл. 2 и 3. Результаты подтверждаются при количестве повторений 5 раз.

Заявленная группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен способ бесконтактной инактивации патогенных бактерий, заключающийся в облучении поверхности, на которой присутствуют патогенные бактерии в планктонной форме, фемтосекундным лазерным ИК-излучением с длиной волны 3 мкм, с частотой следования импульсов 10 кГц при плотности мощности 1,2⋅10⁸ Вт/см² в течение 5 мин или с длиной волны 6 мкм с частотой следования импульсов 10 кГц при плотности мощности 8⋅10⁶ Вт/см² в течение 3-5 мин (варианты). Изобретения обеспечивают сокращение колониеобразующих единиц патогенных бактерий в планктонной форме на облучаемых поверхностях без использования химических реагентов. 2 н.п. ф-лы, 3 ил., 3 табл., 2 пр.

1. Способ бесконтактной инактивации патогенных бактерий, заключающийся в облучении поверхности, на которой присутствуют патогенные бактерии в планктонной форме, фемтосекундным лазерным ИК-излучением с длиной волны 3 мкм, отличающийся тем, что облучение производят лазерным излучением с частотой следования импульсов 10 кГц при плотности мощности 1,2⋅10⁸ Вт/см² в течение 5 мин.

2. Способ бесконтактной инактивации патогенных бактерий, заключающийся в облучении поверхности, на которой присутствуют патогенные бактерии в планктонной форме, фемтосекундным лазерным излучением с длиной волны 6 мкм, отличающийся тем, что облучение производят лазерным излучением с частотой следования импульсов 10 кГц при плотности мощности 8⋅10⁶ Вт/см² в течение 3-5 мин.