Способ децеллюляризации гомографта сердечно-сосудистой системы сверхкритическим диоксидом углерода Российский патент 2023 года по МПК A61F2/07 A61F2/24 

Изобретение относится к медицине, в частности к кардиохирургии, касается способа создания биологических протезов, а именно гомографтов, методом децеллюляризации сверхкритическим диоксидом углерода (скСО₂), и может быть использовано при операциях по протезированию на сердечно- сосудистой системе после проведения доклинических исследований на животной модели.

Известен способ получения гомографта сердечно - сосудистой системы (ГССС) в виде участка магистрального сосуда или выходных трактов левого и правого желудочков сердца, в котором гомографт получают химической обработкой биологического тканевого компонента (БТК) средами, содержащими гентамицин, дифлюкан, цефалоспорин, метрогил и стабилизатор рН, а метод криоконсервации применяют для подготовки готового ГССС к хранению в режиме криоконсервации, для чего ГССС помещают в стерильный полимерный пакет с криопротекторной смесью, охлажденной до температуры (2±2°С), содержащей альбумин, диметилсульфоксид и DMEM/F12, пакет герметично запаивают и выдерживают в холодильнике с температурой (-150±2°С) или в криоконтейнере, содержащем пары жидкого азота, в течение не менее 120 минут (RU 2525197, МПК A 61F 2/06, A 01 N 1/02, A 01K 31/7036, A 61 P

43/00, опубл. 10.08.2014. Бюл. №22. Гомографт сердечно-сосудистой системы (варианты). Способ получения гомографта. Среда для воздействия на ткани гомографта (варианты)).

Ниже перечислены недостатки данного способа:

• излишняя кросс-сшивка коллагеновых волокон сосудистой ткани в результате предложенной обработки большим количеством реагентов, содержащих токсичные бактерицидные препараты, что негативно сказывается на долгосрочном функционировании гомографта после имплантации;

• низкая прочность на разрыв ГССС

• длительное время прекондиционирования

• дороговизна детергентов

Задачей, на решение которой направлено изобретение, является разработка более простого и эффективного способа получения ГССС методом децеллюляризации в среде скСО₂.

Результат, который может быть получен при использовании изобретения, заключается в возможности одновременной децеллюляризации и стерилизации ГССС, а также увеличении его срока службы.

Для решения поставленной задачи и достижения указанного результата, при децеллюляризации ГССС использовалась гибридная обработка с прекондиционированием в растворе детергентов 0.5% додецилсульфата натрия и 0.5% дезоксихолата натрия, отмывкой в дистиллированной воде и последующей экстракцией в скСО_2. Процедура сверхкритической флюидной экстракции проводится в термостатируемых условиях: 37±0.2°С, давлении 25 МПа и скорости потока 3±0.5 мл/мин. Влажный корень аорты помещают в реактор высокого давления (рабочий объем 100 мл), СО₂-камеру заполняют при давлении 6-7 МПа, затем включают термостат, устанавливают температуру 37°С и давление 25 МПа (выход на рабочие параметры составляет около 20 мин).

Отличительными от прототипа признаками заявленного способа, обеспечивающими получение результата во всех случаях, являются следующие:

• в качестве децеллюляризирующего агента выступает среда скСО₂,

• обработка производится в условиях определенной температуры и давления

• время цикла не превышает 48 часов

Указанные отличительные признаки, каждый в отдельности и все вместе, направлены на достижение заявленного результата и являются существенными. В предшествующем уровне техники представленная в формуле изобретения совокупность известных и отличительных признаков не известна.

Описание способа.

Выполняют забор БТК: участка магистрального сосуда (артерии или вены) или участка органа сердечно-сосудистой системы: выходного тракта правого или левого желудочков сердца, митрального или аортального клапанов сердца или фрагмента аорты. Забор выполняют с сохранением прилежащего к выбранному БТК нефункционального участка, предназначенного для обеспечения в процессе осуществления способа, бесконтактных с БТК и готовым ГССС, манипуляций путем захвата этого участка инструментом, например пинцетом или зажимом, подходящим для этой цели. Для получения нефункционального участка увеличивают длину участка изымаемого БТК магистрального сосуда и используют участок биологической ткани, прилежащий к БТК органов сердечно-сосудистой системы.

На месте изъятия проводят морфометрию изъятого БТК и оценку уровня его инициальной контаминации. Децеллюляризацию проводят не позднее, чем через 4-6 часов после изъятия клапаносодержащих фрагментов аорты, с использованием стеклянных емкостей объемом 250 мл и орбитального шейкера, обеспечивающего максимальное перемешивание жидкости в сосуде. Чтобы исключить риск нежелательной контаминации, перед децеллюляризацией аортальный гомографт (АГ) промывают раствором повидон-йода. Выделенные клапаны прекондиционируют в растворе детергентов 0.5% додецилсульфата натрия и 0.5% дезоксихолата натрия в течение 24 часов и отмывают в дистиллированной воде в течение 12 часов при комнатной температуре в условиях стерильности и постоянного перемешивания со скоростью 200 об/мин. Децеллюляризация проводится в термостатируемых условиях: 37±0.2°С, давлении 25 МПа и скорости потока 3±0.5 мл/мин. Влажный корень аорты помещают в реактор высокого давления (рабочий объем 100 мл), СО₂-камеру заполняют при давлении 6-7 МПа, затем включают термостат, устанавливают температуру 37°С и давление 25 МПа (выход на рабочие параметры составляет около 20 мин). Затем при помощи клапана точной регулировки устанавливают скорость потока 3 мл/мин. В таких условиях образцы выдерживают в течение 3 часов, после чего выключают термостат и медленно, в течение 30 мин, снижают давление, чтобы избежать набухания и выраженных структурных изменений при резком сбросе давления.

Предложенный способ получения ГССС по сравнению с прототипом обладает следующими преимуществами:

1. Разработанная методика заготовки и получения децеллюляризированного АГ является простой и воспроизводимой.

2. Предложенный способ обработки в среде скСО₂ способствует практически полному элиминированию из матрицы аортального клапана маркеров иммуногенности (ДНК, фрагменты клеток) и удалению факторов контаминации (бактерий, вирусов, грибов), сохраняя структурную целостность внеклеточного матрикса.

3. Экстракция в среде скСО₂ позволяет снизить цитотоксичность аортальных клапанов, прекондиционированных в растворе детергентов, то есть способствует репопуляции створок матрицы клетками потенциального реципиента in vitro.

4. Включение скСО₂ в протоколы децеллюляризации не ухудшает механические и гидродинамические свойства створок АГ, что подтверждено результатами механических испытаний и сохранением запирательной функции клапанного аппарата в пульсирующем потоке в ходе стендовых испытаний.

5. Децеллюляризированный по оригинальной методике АГ обладает низкой иммуногенностью и высоким потенциалом регенерации, что подтверждено отсутствием кальцификации и заселением матрицы клетками реципиента в хроническом хирургическом эксперименте.

Примеры экспериментального осуществления заявленного способа.

Имплантацию проводили половозрелым крысам-самцам линии Wistar весом 230±20 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария, по 3-4 особи в клетке, обеспечивали комплексным гранулированным лабораторным кормом и постоянным доступом к воде. Для исследования острого, субхронического и хронического воздействия имплантата на окружающие ткани были определены следующие контрольные временные точки: 14, 60 и 90 дней после имплантации (n=6). Крысам под общим наркозом (золетил 1.5 мг/кг и ксилазин 0.2 мг/кг внутримышечно) в асептических условиях в предварительно выстриженной межлопаточной области скальпелем производили разрез кожи до 2 см длиной. Тупым путем рассекали подкожно-жировую клетчатку по направлению к правой и левой лопатке, формировали 2 кармана глубиной 2-2.5 см. Полость промывали водным раствором хлоргексидина. В карманы помещали стерилизованные в течение 3-х часов в 0.1% надуксусной кислоте комплексы «аорта-створка клапана» размером 0.5×1.5 см и фиксировали к подлежащим тканям парой одинарных швов. Операционную рану ушивали наглухо с захватом мышечного слоя. Послеоперационную рану обрабатывали йодопироном. С целью профилактики гнойно-септических осложнений в течение 7 дней вводили байтрил 0.1 мл внутримышечно, послеоперационную рану обрабатывали мазью левомеколь. В установленные сроки животные были подвергнуты эвтаназии путем передозировки средства для наркоза. В сыворотке крови определяли активность ферментов и концентрацию веществ, рекомендованных к биохимическому анализу согласно ГОСТ Р ИСО 10993.11-2009. Для установления структурных особенностей кальциевых депозитов проводили гистологический анализ эксплантатов.

Первые опыты применения заявленного способа децеллюляризации ГССС с применением скСО2 в качестве децеллюляризирующего агента демонстрируют его перспективность, так как он позволяет упростить и ускорить получение высококачественного ГССС и повысить эффективность его имплантации.

Неоднократное воспроизведение предложенного способа получения гомографтов сердечно-сосудистой системы возможно в целевых лабораториях исследовательских центров, а после клинических испытаний станет возможным во всех отделениях сердечно-сосудистой хирургии.

Изобретение относится к медицине, в частности к кардиохирургии, касается способа создания биологических протезов, а именно гомографтов. Способ децеллюляризации гомографта сердечно-сосудистой системы методом гибридной обработки с прекондиционированием в растворе детергентов, отмывкой в дистиллированной воде и последующей экстракцией в сверхкритическом СО₂ в термостатируемых условиях: 37±0.2°С, давлении 25 МПа и скорости потока 3±0.5 мл/мин с помещением влажного корня аорты в реактор высокого давления, заполнением СО₂-камеры при давлении 6-7 МПа, последующим включением термостата, с устанавкой и поддержанием среды с температурой 37°С и давлением 25 МПа. В качестве децеллюляризирующего агента используют сверхкритический диоксид углерода, участок выходного тракта правого или левого желудочка сердца, митрального или аортального клапана сердца или фрагмент аорты, забор компонента выполняют с сохранением прилежащего к нему нефункционального участка, предназначенного для обеспечения в процессе осуществления способа, бесконтактных с компонентом и готовым гомографтом, манипуляций путем захвата этого участка пинцетом, децеллюляризацию проводят не позднее чем через 4-6 часов после изъятия клапаносодержащих фрагментов аорты с использованием стеклянных емкостей объемом 250 мл и орбитального шейкера, перед децеллюляризацией аортальный гомографт промывают раствором повидон-йода, выделенные клапаны прекондиционируют в растворе детергентов 0,5 об.% додецилсульфата натрия и 0,5 об.% дезоксихолата натрия в течение 24 часов и отмывают в дистиллированной воде в течение 12 часов при комнатной температуре в условиях стерильности и постоянного перемешивания со скоростью 200 об/мин, проводят децеллюляризацию в термостатируемых условиях: 37±0.2°С, давлении 25 МПа и скорости потока 3±0.5 мл/мин с помещением влажного корня аорты в реактор высокого давления, и последующим заполнением СО₂-камеры при давлении 6-7 МПа, затем включают термостат, устанавливают температуру 37°С и давление 25 МПа, при помощи клапана точной регулировки устанавливают скорость потока 3 мл/мин, и в таких условиях образцы выдерживают в течение 3 часов, после чего выключают термостат и медленно, в течение 30 мин, снижают давление. Изобретение обеспечивает возможность одновременной децеллюляризации и стерилизации гомографта сердечно-сосудистой системы, а также увеличения его срока службы.

Способ децеллюляризации гомографта сердечно-сосудистой системы методом гибридной обработки с прекондиционированием в растворе детергентов, отмывкой в дистиллированной воде и последующей экстракцией в сверхкритическом СО₂ в термостатируемых условиях: 37±0.2°С, давлении 25 МПа и скорости потока 3±0.5 мл/мин с помещением влажного корня аорты в реактор высокого давления, заполнением СО₂-камеры при давлении 6-7 МПа, последующим включением термостата, с устанавкой и поддержанием среды с температурой 37°С и давлением 25 МПа, отличающийся тем, что в качестве децеллюляризирующего агента используют сверхкритический диоксид углерода, участок выходного тракта правого или левого желудочка сердца, митрального или аортального клапана сердца или фрагмент аорты, забор компонента выполняют с сохранением прилежащего к нему нефункционального участка, предназначенного для обеспечения в процессе осуществления способа, бесконтактных с компонентом и готовым гомографтом, манипуляций путем захвата этого участка пинцетом, децеллюляризацию проводят не позднее чем через 4-6 часов после изъятия клапаносодержащих фрагментов аорты с использованием стеклянных емкостей объемом 250 мл и орбитального шейкера, перед децеллюляризацией аортальный гомографт промывают раствором повидон-йода, выделенные клапаны прекондиционируют в растворе детергентов 0,5 об.% додецилсульфата натрия и 0,5 об.% дезоксихолата натрия в течение 24 часов и отмывают в дистиллированной воде в течение 12 часов при комнатной температуре в условиях стерильности и постоянного перемешивания со скоростью 200 об/мин, проводят децеллюляризацию в термостатируемых условиях: 37±0.2°С, давлении 25 МПа и скорости потока 3±0.5 мл/мин с помещением влажного корня аорты в реактор высокого давления и последующим заполнением СО₂-камеры при давлении 6-7 МПа, затем включают термостат, устанавливают температуру 37°С и давление 25 МПа, при помощи клапана точной регулировки устанавливают скорость потока 3 мл/мин и в таких условиях образцы выдерживают в течение 3 часов, после чего выключают термостат и медленно, в течение 30 мин, снижают давление.