Способ получения мультиэлементного референтного материала для изготовления стандартного образца состава жидких биологических сред и материал, изготовленный этим способом Российский патент 2023 года по МПК C12N5/07 G01N1/28 

Группа изобретений относится к биотехнологии и метрологии, а именно к способу получения биологического мультиэлементного референтного материала для производства стандартных образцов (СО) состава жидких биологических сред (кровь, моча, грудное молоко, плазма крови, сперма и других), содержащих металлы, а также к материалу, полученному предлагаемым способом, и может быть использовано в медицине, токсикологии, ветеринарии, пищевой промышленности, судебной медицине, охране окружающей среды при определении содержания металлов.

Согласно ФЗ №102 «Об обеспечении единства измерений» СО являются составной частью средства измерений, предназначенных для применения в сфере государственного регулирования обеспечения единства измерений. Материальной основой СО являются референтные материалы.

В изобретении используется следующая терминология:

Аналит - исследуемый компонент биосреды.

Биологическая среда (биосреда) - часть или целый орган, ткани или клеточные структуры организма.

ГСО - государственный стандартный образец

Затравка - введение металла тем или иным способом в организм животного.

Композитная биосреда - мультиэлементные моча, кровь, плазма крови и т.д., полученные в результате смешивания моноэлементных нативных биосред.

Лиофилизат - сухой остаток, продукт лиофильной сушки.

Матрица химического состава вещества [материала] (объекта аналитического контроля): Компонент или совокупность компонентов, образующих данное вещество или материал объекта аналитического контроля и являющихся его основой [ГОСТ Р 52361-2005].

Мультиэлементный референтный материал - референтный материал, содержащий несколько металлов.

Нативная биосреда - моча, кровь, плазма крови и т.д., полученные от одного или группы подобных животных в результате их затравки соединениями одного из металлов.

Референтный материал (РМ) - «в качестве материала (вещества) стандартного образца может быть использован референтный материал, т.е. материал (вещество) достаточно однородный и стабильный по отношению к одному или нескольким определенным свойствам, применяемый в соответствии с назначением в измерительном процессе». [Р.50.2.056-2007.ГСИ. Образцы материалов и веществ стандартные. Термины и определения; ISO VIM: 1993].

Стандартный образец (СО) - образец вещества или материала, химический состав или физические свойства которых:

- типичны для конкретной группы веществ или материалов; - определены с необходимой точностью; - отличаются высоким постоянством;

- удостоверены сертификатом.

Термин указан с учетом его определений, приведенных в ГОСТ 8.315-97, а также в международных нормативных документах.

Токсичные металлы (далее - ТМ) - условная группа металлов, не несущих биологической функции в организме, но склонных к бионакоплению, токсичные даже в небольших количествах [Загрязнение Арктики 2002. Программа по мониторингу и оценке окружающей среды Арктики. АМАП. Осло. - 2002-110 с.], к которым относят свинец, ртуть, кадмий, мышьяк, таллий, ванадий, никель, хром, уран и иногда другие металлы.

Для определения содержания ТМ в различного вида материалах используются методы анализа, в частности, такие как нейтронно-активационный, атомно-эмиссионный с дугой постоянного тока, атомно-эмиссионный с индуктивно-связанной плазмой, масс-спектрометрический с индуктивно-связанной плазмой, атомно-абсорбционный с электротермической атомизацией, атомно-абсорбционный с атомизацией в пламени, инверсионный вольтамперометрический, которые требуют применения соответствующих материалов сравнения - стандартных образцов, содержащих анализируемый ТМ в определенных количествах.

Известны стандартные образцы, изготовленные на основе водных растворов солей ТМ [см., например, Государственный Стандартный Образец (далее ГСО) Ртуть 7879-2001, ГСО Кадмий 7874-2000; ГСО Свинец 7877-2000].

Данные стандартные образцы рассчитаны на проверку работоспособности аналитического оборудования, его калибровку и могут обеспечить надежность результатов анализа в тех случаях, когда исследуемый материал также представляет собой водный раствор ТМ или близок к таковому по своим свойствам.

Однако указанные стандартные образцы малопригодны для анализа биоматериалов, которые далеки по свойствам от водных растворов и имеют сложную матричную структуру.

Крайне важным для получения точных результатов анализа является обеспечение максимально возможного подобия матрицы стандартного образца и исследуемого материала, за счет чего достигается сходство условий (химические связи, валентности, молекулярные структуры и пр.), в которых находится металл в стандартном образце и в исследуемом материале.

Так, известны биологические референтные материалы (СО состава крови, содержащей свинец, номер в госреестре ГСО 9104 - 2008, номер свидетельства 3677; СО состава крови, содержащей ртуть, номер в госреестре ГСО 9653 - 2010, номер свидетельства 1579), получаемые из крови животного или человека, в которую после отбора добавляют водорастворимые соли ТМ.

Однако введенный в рассматриваемый референтный материал ТМ не проходит естественную ассимиляцию живым организмом, в связи с чем не достигается полнота форм ТМ, его включенность в матрицу стандартных и исследуемых образцов.

Известен способ получения биологического референтного материала и референтный материал, описанные в RU 2567046.

Рассматриваемый способ включает дозированное парентеральное введение в организм животного трех ТМ (кадмия, ртути и свинца) путем инъекций раствора, содержащего водорастворимые соли указанных ТМ, отбор жидкой биологической среды, в частности крови животного, после анализа на содержание в ней каждого из указанных ТМ, а также замораживание отобранной крови и ее лиофилизацию. Рассматриваемый референтный материал представляет собой бурый кристаллический порошок органо-минеральной матрицы (лиофилизат крови) с внедренным в указанную матрицу ртутью, кадмием и свинцом.

Получаемые референтные материалы состава крови имеют матрицу, близкую к матрице исследуемых образцов крови, поскольку ТМ внедрены в референтный материал в результате естественной ассимиляции организмом животного. При этом достигается естественное многообразие форм внедренных в матрицу референтного материала ТМ, например, ртути, которой особенно свойственно такое многообразие.

Достоинством данного способа является также возможность получения мультиэлементного референтного материала, содержащего три указанные ТМ, который пригоден для изготовления стандартных образцов, применяемых при проведении наиболее востребованного в современной токсикологии анализа жидкой биологической среды на содержание ртути, кадмия и свинца.

Однако согласно рассматриваемому способу на базе одной затравки может быть получен мультиэлементный референтный материал только одного состава в слабо контролируемом достаточно широком концентрационном диапазоне металлов, а для приготовления ряда мультиэлементных референтных материалов с разным содержанием ТМ нужно производить каждый раз новую затравку животных.

Это значительно увеличивает трудозатраты и длительность процесса получения мультиэлементных референтных материалов с разным содержанием ТМ.

Известен способ получения биологического мультиэлементного референтного материала и референтный материал, описанные в RU 2646161, выбранные в качестве ближайших аналогов.

Согласно рассматриваемому способу формируют группы животных по числу токсичных металлов, которые требуется ввести в состав получаемого референтного материала. Осуществляют затравку животных разных групп разными токсичными металлами, по окончании затравочного периода анализируют содержание токсичного металла в биологической среде, затем осуществляют отбор от животных разных групп моноэлементных жидких биологических сред с известной концентрацией в каждой из них соответствующего ТМ. Смешивают порции жидких моноэлементных биологических сред с известными концентрациями в них ТМ. Полученную смесь лиофилизуют.

В результате осуществления способа получают биологический мультиэлементный референтный материал, представляющий собой лиофилизат композитной биологической среды, в частности крови или мочи животных, в виде сухого продукта с контролируемым содержанием ТМ.

Достоинством рассматриваемого способа является то, что он обеспечивает получение мультиэлементных референтных материалов различного состава в естественной матрице с использованием простых технологическим приемов и не требует применения нескольких циклов затравки.

Однако в рассматриваемом способе для получения смеси моноэлементных биологических сред используют их жидкие формы, порции которых смешивают в определенном объемном соотношении, при этом смешивание расчетных порций (объемов) моноэлементных биологических сред приводит к снижению объемной концентрации ТМ в смеси по отношению к концентрации его в исходной моноэлементной биосреде из-за увеличения суммарного объема смеси.

Это приводит к тому, что можно получить референтные мультиэлементные материалы только в очень ограниченном диапазоне концентраций каждого из ТМ. Кроме того, невозможно получить мультиэлементный референтный материал с концентрациями ТМ равной или выше концентрации любого из ТМ в исходной (нативной) жидкой биологической среде.

Проблемой, решаемой предлагаемыми изобретениями, является расширение концентрационного диапазона содержания ТМ в мультиэлементном референтном материале.

Сущность изобретения в отношении заявляемого способа заключается в способе получения мультиэлементного референтного материала для изготовления стандартного образца состава жидких биологических сред, включающем формирование групп животных по числу токсичных металлов, которые входят в состав получаемого референтного материала, затравку животных разных групп разными токсичными металлами и отбор от подвергнутых затравке животных разных групп по меньшей мере одного вида моноэлементной жидкой биологической среды с установленной в ней концентрацией соответствующего токсичного металла, отбор порций указанных моноэлементных биологических сред и использование их для получения мультиэлементного референтного материала с требуемой концентрацией каждого из токсичных металлов, согласно изобретению каждую отобранную порцию жидкой моноэлементной биологической среды подвергают лиофильной сушке, определяют массу полученного лиофилизата и содержание в нем токсичного металла, отбирают навески полученных лиофилизатов, смешивают их и растворяют полученную смесь в заданном объеме дистиллированной воды.

Сущность изобретения в отношении мультиэлементного референтного материала заключается в том, что он получен заявляемым способом.

Затравка животных разных групп разными токсичными металлами, отбор от животных разных групп после завершения затравки моноэлементных биологических сред с известной концентрацией токсичного металла и последующее смешивание порций моноэлементных биологических сред с получением мультиэлементной композитной биологической среды позволяет получить мультиэлементные референтные материалы различного состава на базе только одного цикла затравки животных каждой группы.

Принципиально важным является то, что порции моноэлементных жидких биологических сред подвергают обезвоживанию (лиофилизации) и используют полученные лиофилизаты для получения сухой смеси мультиэлементной биологической среды, на основе которой получают мультиэлементный референтный материал.

Указанный прием дает возможность избежать ограничений концентрационного диапазона ТМ в мультиэлементном референтном материале, связанных с получением композитной среды путем смешивания жидких форм моноэлементных биологических сред.

Заявляемый способ позволяет использовать для смешивания навески разной массы с определенным содержанием в них ТМ_i для получения на основе полученной смеси мультиэлементного референтного материала с требуемой концентрацией ТМ_i в нем.

Как показали эксперименты, заявляемый способ позволяет получить мультиэлементный биологический референтный материал с практически любой требуемой концентрацией ТМ и при их самом широком составе.

В качестве используемой в способе биологической среды может быть использована кровь, моча, плазма крови животных.

Таким образом, техническим результатом заявляемых изобретений является получение мультиэлементного референтного биологического материала с обеспечением содержания в нем токсичных металлов в широком концентрационном диапазоне.

При этом возможно получить мультиэлементный референтный материал с практически неограниченном числом необходимых металлов. Способ осуществляют следующим образом.

Формируют несколько групп животных по числу ТМ, которые входят в состав получаемого референтного материала. Количество животных в группе составляет одну особь или более. В качестве животных-доноров для получения референтного материала в соответствии с заявляемым способом могут быть использованы такие животные, как крысы, кролики, козы и др.

Проводят подготовку животных к процессу получения биологического референтного материала, выдерживая животных в карантине в течение времени, необходимого для его адаптации к условиям содержания.

По известной методике осуществляют дозированную затравку животных каждой группы одним из ТМ, выбранных из ряда токсичных металлов, в частности, используют ртуть, кадмий, свинец. Затравку осуществляют путем алиментарного или парентерального введения в организм животного водорастворимой соли одного из указанных ТМ.

В качестве водорастворимых солей ТМ могут быть использованы, в частности, ацетаты или нитраты указанных ТМ, характеризующиеся достаточно высокой определенностью состава и растворимостью в воде.

Анализируют жидкую биологическую среду животных в каждой группе на содержание в ней одного из ТМ и после достижения в ней необходимой концентрации ТМ, соразмеримой с той, которую требуется обеспечить в получаемом референтном материале, осуществляют отбор порций моноэлементной жидкой биологической среды от животных разных групп.

Согласно заявляемому способу можно также осуществлять отбор от животных в каждой группе других жидких биологических сред.

Отобранные порции жидких моноэлементных биологических сред подвергают сушке путем лиофилизации.

Далее определяют массу каждого из полученных моноэлементных лиофилизатов путем его взвешивания и рассчитывают концентрацию ТМ в нем по формуле:

где К_i - концентрация TM_i в лиофилизате;

c_i - концентрация i-го ТМ в моноэлементной жидкой биологической среде;

v_i - объем порции моноэлементной жидкой биологической среды;

m_i - масса моноэлементного лиофилизата, содержащего TM_i.

Далее отбирают навески моноэлементных лиофилизатов, смешивают их и полученную смесь растворяют в дистиллированной воде, доводя объем V до нужной величины с получением жидкого биологического мультиэлементного референтного материала.

Величину навески каждого из моноэлементных лиофилизатов рассчитывают, исходя из условия получения заданного объема мультиэлементного биологического референтного материала с требуемой концентрацией TM_i в нем, пользуясь соотношением:

где Н - величина навески;

V - заданный объем раствора;

C_i - требуемая концентрация TM_i в мультиэлементном референтном материале;

Ki - концентрация TM_i в моноэлементном лиофилизате.

Полученный жидкий мультиэлементный референтный материал можно подвергнуть лиофилизации, что дает возможность его получения и длительного хранения в виде сухого продукта.

Ниже приведены примеры осуществления изобретений.

Пример 1

Получали биологический мультиэлементный референтный материал для приготовления стандартных образцов состава мочи, содержащих свинец, ртуть, кадмий.

Были сформированы три группы лабораторных крыс массой 180-210 г по 5 особей в каждой.

В каждой группе осуществляли парентеральную (внутримышечно) затравку крыс путем введения в организм животных ацетатной соли одного из ТМ.

Животным первой группы вводили ацетат свинца в суточной дозе 45 мг/кг, животным второй группы вводили ацетат ртути в суточной дозе 0,5 мг/кг, животным третьей группы вводили ацетат кадмия в суточной дозе 3 мг/кг.

По окончании затравочного периода отбирали мочу животных разных групп и получали мочу трех видов, в которой известными аналитическими методами была определена концентрация соответствующего ТМ:

Моча «а» с концентрацией свинца 538 мкг/дм³

Моча «б» с концентрацией ртути 79 мкг/дм³

Моча «в» с концентрацией кадмия 7 мкг/дм³.

Отбирали порции полученных видов мочи для приготовления моноэлементных лиофилизатов, определяли их массу путем взвешивания и рассчитывали концентрацию ТМ в каждом из лиофилизатов по формуле (1).

Технологические показатели (объемы, массы, концентрации) процесса получения лиофилизатов трех видов мочи представлены в таблице 1.

Смешивали навески полученных моноэлементных лиофилизатов с использованием для расчета величины навески выражения (2). Полученные смеси растворяли в заданном объеме дистиллированной воды.

В таблицах 2 и 3 представлены технологические показатели (объемы, массы, концентрации) процесса приготовления двух вариантов референтного материала состава мочи, содержащие необходимые заданные концентрации свинца, ртути и кадмия.

На основе трех вышеуказанных моноэлементных лиофилизатов было получено два варианта мультиэлементного референтного материала состава мочи, с концентрацией, свинца 250 и 600 мкг/дм³, ртути 1,5 и 9,0 мкг/дм³ и кадмия 3,0 и 24,0 мкг/дм³, соответственно.

Пример 2

Получали биологический мультиэлементный референтный материал для приготовления стандартных образцов состава крови, содержащих свинец, ртуть, кадмий.

Были сформированы три группы лабораторных крыс массой 180-210 г по 5 особей в каждой.

В каждой группе осуществляли парентеральную (внутримышечно) затравку крыс путем введения в организм животных ацетатной соли одного из ТМ.

Животным первой группы вводили ацетат свинца в суточной дозе 45 мг/кг, животным второй группы вводили ацетат ртути в суточной дозе 0,5 мг/кг, животным третьей группы вводили ацетат кадмия в суточной дозе 3 мг/кг.

По окончании затравочного периода отбирали кровь животных разных групп и получали кровь трех видов, в которой известными аналитическими методами была определена концентрация соответствующего ТМ:

Кровь «а» с концентрацией свинца 211,7 мкг/дм³

Кровь «б» с концентрацией ртути 11,9 мкг/дм³

Кровь «в» с концентрацией кадмия 86,7 мкг/дм³.

Отбирали порции полученных видов крови для приготовления моноэлементных лиофилизатов, определяли их массу путем взвешивания и рассчитывали концентрацию TM_i в каждом из лиофилизатов по формуле (1).

Технологические показатели (объемы, массы, концентрации) процесса получения лиофилизатов трех видов крови представлены в таблице 4.

Смешивали навески полученных моноэлементных лиофилизатов с использованием для расчета величины навески выражения (2). Полученные смеси растворяли в заданном объеме дистиллированной воды.

В таблицах 5 и 6 представлены технологические показатели (объемы, массы, концентрации) процесса приготовления двух вариантов референтного материала состава крови, содержащие необходимые заданные концентрации свинца, ртути и кадмия.

На основе трех вышеуказанных моноэлементных лиофилизатов крови было получено два варианта жидких мультиэлементных референтных материалов состава крови с концентрацией свинца 300 и 750 мкг/дм³, ртути 2,5 и 8,0 мкг/дм³ и кадмия 5,5 и 11,0 мкг/дм³, соответственно.

Полученные жидкие мультиэлементные материалы расфасовывали по 5 см³, замораживали и подвергали лиофильной сушке.

Получали мультиэлементные референтные материалы состава крови в виде лиофилизатов.

Данные контроля показали близость концентраций ТМ в полученных материалах к их расчетным значениям.

Группа изобретений относится к биотехнологии и метрологии, а именно к способу получения биологического мультиэлементного референтного материала для производства стандартных образцов состава жидких биологических сред, содержащих металлы, а также к материалу, полученному предлагаемым способом. Может использоваться в медицине, токсикологии, ветеринарии, пищевой промышленности, судебной медицине, охране окружающей среды при определении содержания металлов. Способ включает формирование групп животных по числу токсичных металлов, которые входят в состав получаемого референтного материала, затравку животных разных групп разными токсичными металлами и отбор от подвергнутых затравке животных разных групп по меньшей мере одного вида моноэлементной жидкой биологической среды с установленной в ней концентрацией соответствующего токсичного металла, отбор порций моноэлементных биологических сред и использование их для получения мультиэлементного референтного материала с требуемой концентрацией каждого из токсичных металлов. Каждую порцию жидкой моноэлементной биологической среды подвергают лиофильной сушке, определяют массу полученного лиофилизата и содержание в нем токсичного металла. Отбирают навески полученных лиофилизатов, смешивают их и растворяют полученную смесь в заданном объеме дистиллированной воды. Группа изобретений позволяет получить мультиэлементный референтный биологический материал с широким концентрационном диапазоном содержания в нем токсичных металлов. 2 н.п. ф-лы, 6 табл., 2 пр.

1. Способ получения мультиэлементного референтного материала для изготовления стандартного образца состава жидких биологических сред, включающий формирование групп животных по числу токсичных металлов, которые входят в состав получаемого референтного материала, затравку животных разных групп разными токсичными металлами и отбор от подвергнутых затравке животных разных групп по меньшей мере одного вида моноэлементной жидкой биологической среды с установленной в ней концентрацией соответствующего токсичного металла, отбор порций указанных моноэлементных биологических сред и использование их для получения мультиэлементного референтного материала с требуемой концентрацией каждого из токсичных металлов, отличающийся тем, что каждую отобранную порцию жидкой моноэлементной биологической среды подвергают лиофильной сушке, определяют массу полученного лиофилизата и содержание в нем токсичного металла, отбирают навески полученных лиофилизатов, смешивают их и растворяют полученную смесь в заданном объеме дистиллированной воды.

2. Мультиэлементный референтный материал для изготовления стандартного образца состава жидких биологических сред, полученный способом по п.1 и представляющий собой композитную биологическую среду, полученную путём смешивания порций моноэлементных биологических сред с известной концентрацией в них токсичного металла, полученных от животных после затравки их одним из токсичных металлов, при этом материал представляет собой раствор в дистиллированной воде смеси лиофилизатов порций моноэлементных биологических сред с известной концентрацией в них токсичных металлов.