СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ РЕФЕРЕНТНЫХ МАТЕРИАЛОВ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА СТАНДАРТНЫХ ОБРАЗЦОВ СОСТАВА ЭТИХ МАТЕРИАЛОВ, СОДЕРЖАЩИХ ТОКСИЧНЫЕ МЕТАЛЛЫ, И БИОЛОГИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ, ПОЛУЧЕННЫЙ ЭТИМ СПОСОБОМ (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2011 года по МПК C12N5/07 

Группа изобретений относится к токсикологии, экологии, гигиене и ветеринарии, а именно к способу получения биологических референтных материалов для производства стандартных образцов состава этих материалов, содержащих токсичные металлы, а также к биологическому материалу, полученному предлагаемым способом, и может быть использована в различных областях для улучшения диагностирования отравлений токсичными металлами и повышения точности определения содержания токсичных металлов.

В изобретении используется следующая принятая в этой области терминология, а также сокращения.

Алиментарный - пищевой, поступающий в организм с пищей, через желудочно-кишечный тракт.

Биосреда - отдельные органы, ткани, клеточные или субклеточные структуры живого организма, обладающие структурно-функциональной гомогенностью.

Биоматериал - часть органов, тканей, клеточных или субклеточных структуры организма.

Декапитация - умерщвление путем отсечения головы.

Стандартный образец (состава) - [термин указан с учетом его определений, приведенных в ГОСТ 8.315-97, а также в международных нормативных документах] образец вещества или материала, химический состав или физические свойства которых:

- типичны для конкретной группы веществ или материалов;

- определены с необходимой точностью;

- отличаются высоким постоянством;

- удостоверены сертификатом.

Референтный материал - «в качестве материала (вещества) стандартного образца может быть использован референтный материал, т.е. материал (вещество), достаточно однородный и стабильный по отношению к одному или нескольким определенным свойствам, применяемый в соответствии с назначением в измерительном процессе [Р.50.2.056-2007.ГСИ. Образцы материалов и веществ стандартные. Термины и определения; ISO VIM: 1993]».

Токсичный - ядовитый, вызывающий негативные изменения в структурах и/или функциях молекулярных, надмолекулярных, клеточных образованиях, тканях, органах и организме в целом.

Токсичные металлы (далее - ТМ) - условная группа металлов, не несущих биологической функции в организме, но склонных к бионакоплению, токсичные даже в небольших количествах [Загрязнение Арктики 2002. Программа по мониторингу и оценке окружающей среды Арктики. АМАП. Осло. - 2002. - 110 с.], к которым относят свинец, ртуть, кадмий, мышьяк, таллий, ванадий, никель, хром, уран и иногда другие металлы.

Лиофилизация = лиофильная сушка - метод обезвоживания биологического материала, заключающийся в его замораживании с последующей сушкой в вакууме… [Энциклопедический словарь медицинских терминов. Под. ред. акад. Петровского Б.В. Т.2. М.: Советская энциклопедия. - 1983. 448 с.].

вл. в. - влажный вес, вес нативного (естественного) материала.

сух. в. - сухой вес, вес лиофилизированного материала.

Действие ТМ (свинец, ртуть, кадмий, висмут и т.д.) на живой организм находится в центре внимания специалистов ряда научных направлений, а именно токсикологов, гигиенистов, ветеринаров и экологов. Актуальность этому интересу придает продолжающаяся индустриализация общества и рост загрязненности окружающей среды этими контаминантами, увеличение числа различного рода инцидентов, сопряженных с попаданием в окружающую среду ТМ, а также обнаружение новых аспектов негативного действия ТМ на организм. Анализ содержания ТМ металлов в биологических средах организма, объектах окружающей среды, продуктах питания - неотъемлемый компонент научных, терапевтических, экологических и санитарно-гигиенических мероприятий при разработке этой проблемы.

При проведении анализа содержания ТМ используют следующие методы: атомно-абсорбционная спектрофотометрия, инверсионная вольтамперометрия, непламенная фотометрия, т.н. метод «холодного пара», атомно-эмиссионная спектрофотометрия, масс-спектрометрия с индуктивно-связанной плазмой и т.д.

Необходимо отметить, что практически каждый из используемых для этих целей методов предполагает применение соответствующих стандартов, т.е. материалов сравнения, содержащих анализируемый металл в определенных количествах, близких к таковому в образцах и в состоянии, также близком к анализируемому образцу.

Применение стандарта дает представление об адекватности используемого метода анализа (в т.ч. пробоподготовки) и, в конечном итоге, является основой количественной характеристики изучаемого компонента в исследуемом материале. Большей частью в работах подобного рода применяют водные растворы солей исследуемых металлов, например Государственный Стандартный Образец Растворов Ртути (ГСО РР) и т.д. Такой подход оправдан, если исследуемый образец также представляет собой водный раствор исследуемого компонента или близок к нему.

Для анализа твердых, вязких и других материалов со сложной матрицей (структурой), например биосреды, почвы, продукты питания и пр., приходится применять процедуру пробоподготовки, иногда достаточно сложную, с целью перевода искомого компонента в жидкую водную фазу. Стандарты для некоторых задач подобного рода созданы и применяются для анализа соответствующих материалов на содержание в них ТМ. Например, стандарты цельной крови - [NIST-966 - Toxic metals in blood]; или стандарт [AMIB-1701 - toxic metals in human blood, 1 LGC. Setting standards in analytical science (http://www.lgc.co.uk)]; или стандарты - зерно ржи ЗРЖ-01 (высокое содержание Рb и Cd) - [ГСО 8636-2004 (НПО «Эколан», http://ecolan.com.ru); ГСО состава почвы - ГСО 2498-2500-83].

При анализе такого рода материалов ключевой проблемой, решение которой обеспечивает надежность получаемых данных, является адекватность матрицы стандарта и исследуемого материала, т.е. максимальная схожесть структуры стандартного и исследуемого материала, в которых искомый компонент находится также в одинаковых условиях (химические связи, окружение, валентности, лиганды и пр.).

Одним из наиболее токсичных из группы ТМ, включенных в списки приоритетных загрязнителей рядом международных организаций, в том числе ВОЗ и ЮНЕП, является свинец. Высокая потребность хозяйства в этом металле, относительная простота его получения и большая распространенность в земной коре (16 мг/кг) поставили его одним из первых в ряду промышленных ядов и глобальных экотоксикантов. Антропогенная свинцовая нагрузка, превышающая геогенную в 10-40 раз, способна индуцировать нарушения практически на всех уровнях биологической организации, включая экосистемы [Летувнинкас А.И. Антропогенные геохимические аномалии и природная среда. - Томск: Изд-во НТЛ, 2002. - C.122-221].

Необходимо отметить, что показатель количества свинца в биосредах организма, в крови прежде всего, является важнейшим критерием токсического действия этого токсиканта и основой диагноза [Ливанов Г.А., Соболев М.Б., Ревич Б.А. Свинцовая опасность и здоровье населения: клиника, диагностика и лечение токсического действия. - В сб. статей: Свинец и здоровье детей: диагностика, лечение, профилактика / Под ред. С.П.Нечипоренко. - СПб.: Издательско-полиграфический центр «Каро», 1999. - С.18-26].

Известны и используются методы определения свинца в биологических материалах, продуктах питания и объектах окружающей среды - [МУК 4.11482-03 и МУК 4.11483-03 «Определение химических элементов в биологических средах и препаратах методами эмиссионной спектрометрии с ионизационно-связанной плазмой и масс-спектрометрии с ионизационно-связанной плазмой»; Templeton D.M. Qualifying cadmium and lead in whole blood // dim. Chem., v. 38, 1992. - P.1927-1929; Christensen J.M., Kristiansen J. // Lead, in Handbook on metals in clinical and analytical chemistry, Seiler H.G, Siegel A., Siegel H (eds.) N.Y. Dekker. - 1994].

Другим, чрезвычайно опасным загрязнителем окружающей среды является ртуть (и ее соединения). Промышленная добыча ртути, увеличивающаяся в последние десятилетия, и широкое ее применение в различных сферах деятельности человека приводят к повышению ее уровня в окружающей среде, организме человека и животных, развитию тяжелых состояний, связанных с избыточным проникновением и накоплением ртути в организме. В связи с этим возникла насущная необходимость создания и разработки способов надежного определения содержания ртути в биологических материалах, продуктах питания, объектах окружающей среды.

Известны методы определения содержания ртути в биологических материалах, продуктах питания и объектах окружающей среды [Методические указания. МУК 4.1.005 - 4.1.008 - 94, Госкомсанэпиднадзор России. - М., 1994, 29 с.]. Например, определение содержания ртути в почве и грунтах - [Государственный комитет Российской Федерации по охране окружающей среде. ПНД Ф 16.1:2.23-2000]; в продуктах питания и объектах окружающей среды - [Рапопорт В.Д. Применение ртутного анализатора типа «Юлия-2» для анализа продуктов питания и объектов окружающей среды //Лабораторные новости Дальнего Востока. Электронная версия журнала. №2-99. www.primer.ru/dvlab/dvlab_2/magazine.2htm]; в биологических материалах - [Хомик Л.И., Ковальский Ю.Г., Таловская B.C. Определение ртути в биоматериалах человека // Лабораторные новости Дальнего Востока. Электронная версия журнала. №2-99. www.primer.ru/dvlab/dvlab_2/magazine.2htm].

Кадмий также признается одним из приоритетных загрязнителей окружающей среды. Кадмий, как и все ТМ, понижает общую сопротивляемость организма, его защитно-приспособительные возможности, ослабляет иммунную систему, нарушает биохимический баланс в организме. Перед токсикологами и экологами стоят задачи объективной оценки и прогноза степени загрязненности среды обитания кадмием, а также большая работа по ограничению его поступления во внешнюю и внутреннюю среду [Сает Ю.Е., Ревич Б.А., Янин Е.П. и др. Геохимия окружающей среды. М.: Недра. 1990. - 333 с.; Лимин Б.В., Маймулов В.Г., Мясников И.О., Пацюк Н.А., Скальный А.В., Чернякина Т.С. Гигиеническая диагностика загрязнения среды обитания солями тяжелых металлов. СПб.: СПбГМА им. И.И.Мечникова. 2003. - 123 с.].

Известны методики определения содержания кадмия в биологических материалах и объектах окружающей среды - [Иваненко А.А., Ганеева А.А., Иваненко Н.Б. и др. // Прямое определение кадмия в крови и плазме человека методом атомной абсорбции с электротермической атомизацией // Тез. докл. на II Всероссийской конф. «Аналитические приборы». СПб., 2005, с.245-246; МУК 4.11482-03 и МУК 4.11483-03 «Определение химических элементов в биологических средах и препаратах методами эмиссионной спектрометрии с ионизационно-связанной плазмой и масс-спектрометрии с ионизационно-связанной плазмой»].

Известен способ получения биологических материалов для производства стандартных образцов состава этих материалов, содержащих ТМ, принятый в качестве прототипа способа [http:/www.nist.gov/srm - SRM 966, National Institute of Standards & Technology, Certificate of Analysis, Standard Reference Material® 966, Toxic Metals in Bovine Blood], согласно которому стандартный материал приготовляют на основе биологического материала - крови, полученной от крупного рогатого скота (быка), после алиментарного введения нитрата свинца; собранную кровь анализируют на наличие ТМ.

Известно использование биологических материалов в процессе диагностики интоксикаций ТМ [патент США №5217594; патент США №5368707; патент США №5873990; патент США №5468366].

Материал для стандарта, упомянутый в патенте США №5468366, который принят в качестве прототипа биологического референтного материала, получен из биологического сырья, а именно из бычьей крови, и имеет диапазон содержания свинца 70±30 и 258±40 мкг/дм³ (в зависимости от условий приготовления), обладает высокой вязкостью из-за значительного содержания белков и других компонентов крови и содержит в качестве консерванта вещество isothizolone (<0.002%). В жидком виде материал дозируется пипеткой. Условия хранения определяют срок годности этого контрольного материала - от одной недели при комнатной температуре, т.е. не выше 24°С, до года в замороженном виде при -20°С.

Проведенный информационный поиск, а также данные, полученные в процессе экспериментальных исследований, позволяют сделать вывод о том, что создание биологических материалов, содержащих ТМ, и разработка способа получения биологических материалов для производства стандартных образцов состава этих материалов, содержащих ТМ, является актуальной проблемой.

Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является разработка способа получения биологических референтных материалов для производства стандартных образцов состава этих материалов, содержащих ТМ.

Техническим результатом, проявляющимся при использовании изобретения, является получение биологического референтного материала, содержащего заданные концентрации ТМ, для производства стандартных образцов состава этих материалов с заданным содержанием ТМ.

Для решения поставленной задачи и достижения указанного технического результата предложена группа изобретений, объединенных общим изобретательским замыслом.

Одним из аспектов предлагаемой группы изобретений является способ получения биологических референтных материалов для производства стандартных образцов крови, содержащих токсичный металл ртуть, предусматривающий приготовление биологического референтного материала на основе биологического материала, полученного из животных, после алиментарного дозированного введения им водорастворимых солей токсичного металла с последующим проведением анализа собранного биологического материала на наличие токсичного металла, при этом в качестве животных используют лабораторных белых беспородных крыс, которым дозированно вводят водорастворимые соли ртути до достижения в биологическом материале заданной концентраций ртути от 41 мкг/дм³ до 206 мкг/дм³ (вл.в.), затем осуществляют умерщвление лабораторных белых беспородных крыс путем декапитации и забор биологического материала в виде крови, аликвоту которой подвергают анализу на заданную концентрацию ртути, после чего биологический материал расфасовывают и лиофилизируют.

Другим аспектом изобретения является биологический референтный материал для производства стандартных образцов крови, содержащий токсичный металл ртуть, полученный вышеописанным способом и представляющий собой лиофилизат крови с содержанием ртути от 256 мкг/кг до 1287.5 мкг/кг (сух.в.), предназначенный для создания СО крови, содержащей ртуть.

Следующий аспект настоящего изобретения относится к способу получения биологических референтных материалов для производства стандартных образцов почки, содержащих токсичный металл ртуть, предусматривающему приготовление референтного материала на основе биологического материала, полученного из животных, после алиментарного дозированного введения им водорастворимых солей токсичного металла с последующим проведением анализа собранного биологического материала на наличие токсичного металла, при этом в качестве животных используют лабораторных белых беспородных крыс, которым дозированно вводят водорастворимые соли ртути до достижения в биологическом материале концентрации ртути от 7.72 мкг/кг до 264 мкг/кг (вл.в.), затем осуществляют умерщвление лабораторных белых беспородных крыс путем декапитации и забор биологического материала в виде тканей или органов, аликвоту которого подвергают анализу на заданную концентрацию ртути, после чего биологический материал расфасовывают и лиофилизируют.

Следующий аспект настоящего изобретения относится к биологическому референтному материалу для производства стандартных образцов почки, содержащему токсичный металл ртуть, полученному вышеописанным способом из почки и представляющему собой лиофилизат почки с содержанием ртути в ней от 1020 мкг/кг до 1320 мкг/кг (сух.в.), предназначенному для создания СО почки, содержащей ртуть.

Следующий аспект настоящего изобретения относится к биологическому референтному материалу для производства стандартных образцов ткани мозга, содержащему токсичный металл ртуть, полученному вышеописанным способом из ткани головного мозга и представляющему собой лиофилизат ткани мозга с содержанием ртути от 15.4 мкг/кг до 103.6 мкг/кг (сух.в.), предназначенному для создания СО ткани головного мозга, содержащей ртуть.

Следующий аспект настоящего изобретения относится к биологическому референтному материалу для производства стандартных образцов мышечной ткани, содержащему токсичный металл ртуть, полученному вышеописанным способом из мышечной ткани и представляющему собой лиофилизат мышечной ткани с содержанием ртути от 41.2 мкг/кг до 176.6 мкг/кг (сух.в.), предназначенному для создания СО мышечной ткани, содержащей ртуть.

Следующий аспект настоящего изобретения относится к биологическому референтному материалу для производства стандартных образцов жировой ткани, содержащему токсичный металл ртуть, полученному вышеописанным способом из жировой ткани и представляющему собой лиофилизат жировой ткани с содержанием ртути от 25.2 мкг/кг до 118.8 мкг/кг (сух.в.), предназначенному для создания СО жировой ткани, содержащей ртуть.

Следующий аспект настоящего изобретения относится к биологическому референтному материалу для производства стандартных образцов ткани печени, содержащему токсичный металл ртуть, полученному вышеописанным способом из ткани печени и представляющему собой лиофилизат печени с содержанием ртути от 122 мкг/кг до 651 мкг/кг (сух.в.), предназначенному для создания СО ткани печени, содержащей ртуть.

Следующий аспект настоящего изобретения также относится к биологическому референтному материалу для производства стандартных образцов костной ткани, содержащему токсичный металл ртуть, полученному вышеописанным способом из костной ткани и представляющему собой лиофилизат костной ткани с содержанием ртути от 30.9 мкг/кг до 137.6 мкг/кг (сух.в.), предназначенному для создания СО костной ткани, содержащей ртуть.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к способу получения биологических референтных материалов для производства стандартных образцов крови, содержащих токсичный металл кадмий, предусматривающий приготовление референтного материала на основе биологического материала, полученного из животных, после алиментарного дозированного введения им водорастворимых солей токсичных металлов с последующим проведением анализа собранного биологического материала на наличие токсичных металлов, при этом в качестве животных используют лабораторных белых беспородных крыс, которым дозированно вводят водорастворимые соли кадмия до достижения в биологическом материале концентраций кадмия от 39 мкг/дм³ до 64 мкг/дм³ (вл.в.), затем осуществляют умерщвление лабораторных белых беспородных крыс путем декапитации и забор биологического материала в виде крови, аликвоту которой подвергают анализу на заданное содержание кадмия, после чего биологический материал расфасовывают и лиофилизируют.

Еще одни аспект настоящего изобретения относится к биологическому референтному материалу для производства стандартных образцов крови, содержащему токсичный металл кадмий, полученному вышеописанным способом и представляющему собой лиофилизат крови с содержанием кадмия от 243.8 мкг/кг до 400 мкг/кг (сух.в.), предназначенный для создания СО крови, содержащей ртуть.

Таким образом, предлагаемая группа изобретений относится к объектам одного вида, одинакового назначения, обеспечивающих получение одного и того же технического результата.

Возможность объективного проявления технического результата при использовании изобретения подтверждена достоверными данными, приведенными в примерах, содержащих сведения экспериментального характера, полученные по методикам, принятым в данной области.

Сущность изобретения поясняется таблицами.

В таблице 1 представлены данные, демонстрирующие влияние дозы затравки ртутью на содержание этого ТМ в крови экспериментального животного.

В таблице 2 представлены данные о влиянии дозы затравки ртутью на содержание этого токсиканта в некоторых органах и тканях крысы.

В таблице 3 представлены данные, демонстрирующие влияние дозы затравки кадмием на содержание этого ТМ в крови экспериментального животного.

Изобретение иллюстрируется примерами осуществления способа получения биологических референтных материалов для производства стандартных образцов состава этих материалов, содержащих ТМ, а именно:

пример 1 - получение биологического референтного материала для производства стандартных образцов состава крови, содержащих ртуть;

пример 2 - получение биологического референтного материала для производства стандартных образцов состава почек, ткани головного мозга, мышечной ткани, жировой ткани, ткани печени и костной ткани, содержащих ртуть;

пример 3 - получение биологического референтного материала для производства стандартных образцов состава крови, содержащих кадмий.

Пример 1. Получение биологического референтного материала для производства стандартных образцов состава крови, содержащих ртуть.

Перед проведением эксперимента осуществляли подготовку животных к эксперименту - выдерживание в течение двух недель в карантине для адаптации и определения суточного водопотребления, взвешивания. Из возможных солей токсичных металлов выбирали водорастворимые, дающие в приемлемых условиях эксперимента стойкие растворы - как правило, ацетаты и нитраты, квалификации не ниже «чда». В результате проведения исследований был использован нитрат ртути - Hg(NO₃)₂.

Эксперименты проводились на лабораторных белых беспородных крысах с массой тела от 180 до 200 г, которым в поилки добавляли рассчитанное количество раствора солей ртути, которые они потребляли с питьевой водой и количество которых было определено на основе предварительно полученных данных о водопотреблении животных.

Для приготовления этого раствора использовался нитрат ртути, м.в. 324.6, чда. После расчета, проведенного с учетом веса катиона ртути (Hg⁺²), готовился водный раствор нитрата ртути, добавление которого в поилки четырех групп животных с учетом установленных массы тела и водопотребления крыс обеспечивало поступление в их организм катиона ртути соответственно: 0.06 мг/кг (1 группа); 0.3 мг/кг (2 группа); 0.6 мг/кг (3 группа) и 1.8 мг/кг (4 группа) в сутки. Затравка животных производилась следующим образом. В поилки (стеклянные бутылки объемом 0.5 дм³) для группы крыс ежедневно в течение 30 дней подряд добавляли раствор нитрата ртути в объеме, который рассчитывался по уравнению: X=(m×d×0.45)/c×v, где:

Х - количество раствора ртути (дм³), вносимого в поилку объемом 0.450 дм³;

m - масса одного животного (кг) (из группы животных - средняя);

d - суточная доза катиона металла (мг/кг);

v - среднее суточное водопотребление одного животного (дм³), рассчитанное на основании водопотребления всех крыс группы в предыдущий день;

с - концентрация катиона металла (мг/дм³) в растворе;

0.45 - конечный объем раствора (дм³).

После внесения раствора нитрата ртути в поилки наливали водопроводную воду до метки 0.45 дм³. В этом случае потребление воды с добавлением указанного объема раствора нитрата ртути должно обеспечить поступление в организм каждой крысы в сутки в среднем 0.06 мг/кг, 0.3 мг/кг, 0.6 мг/кг и 1.8 мг/кг Hg⁺².

По окончании затравочного периода животных умерщвляли и осуществляли забор биологического материала.

Рассчитанные суточные дозы ртути и фактически полученные количества ртути в течение эксперимента представлены в таблице 1. Данные, представленные в таблице 1, демонстрируют влияние дозы затравки на содержание ТМ в крови экспериментального животного. При проведении эксперимента были использованы следующие методы анализа: атомно-абсорбционная спектроскопия методом «холодного пара»; атомно-абсорбционная спектроскопия методом холодного пара с зеемановской коррекцией; атомно-абсорбционная спектроскопия с электротермической атомизацией.

Таблица 1   Заданные дозы за- травки, мг/кг Экспериментально введенные дозы, мг/кг Содержание Hg²⁺ в цельной крови группы крыс, мкг/дм³ (вл.в.)       Методы определения ртути №     Атомно-абсорбционная спектроскопия методом «холодного пара» Атомно-абсорбционная
спектроскопия методом холодного пара с зеемановской коррекцией Атомно-абсорбционная
спектроскопия с электротермической атомизацией групп крыс             по Hg²⁺ по Hg²⁺       1 1.8 1.82±0.04 - 206 (1287.5) 194 (1212.5) 2 0.6 0.61±0.01 96 (600) 96 (600) 120 (759) 3 0.3 0.29±0.005 60 (375) 75 (469) 62 (388) 4 0.06 0.06±0.001 44 (275) 59 (369) 41 (256) Примечание: В скобках указаны значения содержания ртути в соответствующем референтном биологическом материале на сухой вес последнего (сух.в.), т.е. в мкг/кг

Из данных, представленных в таблице 1, прослеживается четкая зависимость содержания токсиканта в крови экспериментального животного от дозы токсиканта, так же как наблюдается практическое совпадение данных, полученных тремя различными методами.

Флаконы с расфасованной кровью укупоривали резиновыми пробками и помещали в низкотемпературный холодильник (t<-15°C) не менее чем на 10 часов. Флаконы с замороженной кровью подключают для вакуум-сушки к лиофилизатору "Freeze Dryer 3" фирмы Labconco (США) на 8 часов при давлении менее 10^-4 мм рт. ст. и температуре ниже -50°С до постоянного веса. За это время происходит вакуум-сушка материала, кровь превращается в красно-бурую кристаллическую массу, которая легко разрушается в порошок при легком постукивании по флакону.

Таким образом, полученный вышеописанным способом биологический референтный материал представляет собой бурый кристаллический порошок органно-минеральной матрицы (лиофилизат) крови с содержанием ртути от 256 мкг/кг до 1287.5 мкг/кг (сух.в.).

Пример 2. Получение биологического референтного материала для производства стандартных образцов состава почек, ткани головного мозга, мышечной ткани, жировой ткани, ткани печени и костной ткани, содержащих ртуть.

Перед проведением эксперимента осуществляли подготовку животных к эксперименту - выдерживание в течение двух недель в карантине для адаптации и определения суточного водопотребления, взвешивания. Из возможных солей токсичных металлов выбирали водорастворимые, дающие в приемлемых условиях эксперимента стойкие растворы - как правило, хлориды, ацетаты и нитраты, квалификации не ниже «чда». В результате проведения исследований были использован ацетат ртути - Hg(CH₃COO)₂.

Эксперименты проведены на лабораторных белых беспородных крысах с массой тела от 180 до 200 г, которым в поилки добавляли рассчитанное количество раствора ацетата ртути, которое они потребляли с питьевой водой и количество которых было определено на основе предварительно полученных данных о водопотреблении животных.

Для приготовления этого раствора использовался ацетат ртути, м.в. 318.7, чда. После расчета, проведенного с учетом веса катиона ртути (Hg⁺²), готовился водный раствор ацетата ртути, добавление которого в поилки трех опытных групп животных с учетом установленных массы тела и водопотребления крыс обеспечивало поступление в их организм катиона ртути соответственно: 0.06 мг/кг (1 группа); 0.32 мг/кг (2 группа); 0.65 мг/кг (3 группа) в сутки.

Методы расчета дозы токсиканта для получения заданной концентрации ртути в крови были рассчитаны по уравнению: X=(m×d×0.45)/c×v, приведенному в примерах 1 и 2.

Методом атомно-абсорбционной спектроскопии «холодного пара» определяли содержание ртути в биологических материалах - почки, ткани головного мозга, мышечной ткани, жировой ткани, ткани печени и костной ткани и влияние дозы затравки ртутью на содержание этого токсиканта в биологическом референтном материале (ткани и органы крысы). Данные представлены в таблице 2.

Таблица 2     Содержание ртути в нативном материале, мкг/кг (вл.в.) Доза             ртути             (мг/кг) Почки Ткани головного мозга Мышечная ткань Жировая ткань Ткани печени Костная ткань   204           0.06 (1020) 7.72 (15.4) 20.6 (41.2) 12.6 (25.2) 24.4 (122) 26.3 (30.9)   249           0.32 (1245) 24.5 (49) 39.9 (79.8) 23.8 (47.6) 104 (520) 53.1 (62.5)   264           0.65 (1320) 51.8 (103.6) 88.3 (176.6) 59.4 (118.8) 130.2 (651) 117 (137.6) Примечание: В скобках указаны значения содержания ртути в соответствующем референтном биологическом материале на сухой в ее последнего (сух.в.), т.е. в мкг/кг.

По окончании затравочного периода животных умерщвляют, иссекают биологический материал - почки и 2 г этого органа помещают в стеклянный флакон, затем этот флакон с биологическим материалом в нативном виде подвергают замораживанию в течение не менее 10 часов при температуре не выше -15°С и далее проводят лиофилизацию при давлении менее 10^-4 мм рт. ст. и температуре ниже -50°С до постоянного веса.

В результате получают высушенную органо-минеральную матрицу (лиофилизат) почки с заданным содержанием ртути от 1020 мкг/кг до 1320 мкг/кг (сух.в.).

По окончании затравочного периода животных умерщвляют, иссекают биологический материал - головной мозг, затем 2 г ткани головного мозга помещают в стеклянный флакон, затем этот флакон с биологическим материалом в нативном виде подвергают замораживанию в течение не менее 10 часов при температуре не выше -15°С и далее проводят лиофилизацию при давлении менее 10^-4 мм рт. ст. и температуре ниже -50°С до постоянного веса.

В результате получают органо-минеральную матрицу (лиофилизат) тканей головного мозга с заданным содержанием ртути от 15.4 мкг/кг до 103.6 мкг/кг (сух.в.).

По окончании затравочного периода животных умерщвляют, иссекают биологический материал - мышцы, затем 2 г скелетных мышц помещают в стеклянный флакон, затем этот флакон с биологическим материалом в нативном виде подвергают замораживанию в течение не менее 10 часов при температуре не выше -15°С и далее проводят лиофилизацию при давлении менее 10^-4 мм рт. ст. и температуре ниже -50°С до постоянного веса.

В результате получают органо-минеральную матрицу (лиофилизат) мышечной ткани с заданным содержанием ртути от 41.2 мкг/кг до 176.6 мкг/кг (сух.в.).

По окончании затравочного периода животных умерщвляют, иссекают биологический материал - жировую ткань брыжейки, затем 2 г жировой ткани брыжейки помещают в стеклянный флакон, затем этот флакон с биологическим материалом в нативном виде подвергают замораживанию в течение не менее 10 часов при температуре не выше -15°С и далее проводят лиофилизацию при давлении менее 10^-4 мм рт. ст. и температуре ниже -50°С до постоянного веса.

В результате получают органо-минеральную матрицу (лиофилизат) жировой ткани с заданным содержанием ртути от 25.2 мкг/кг до 118.8 мкг/кг (сух.в.).

По окончании затравочного периода животных умерщвляют, иссекают биологический материал - печень, затем 2 г печени помещают в стеклянный флакон, затем этот флакон с биологическим материалом в нативном виде подвергают замораживанию в течение не менее 10 часов при температуре не выше -15°С и далее проводят лиофилизацию при давлении менее 10^-4 мм рт. ст. и температуре ниже -50°С до постоянного веса.

В результате получают органо-минеральную матрицу (лиофилизат) ткани печени с заданным содержанием ртути от 25.2 мкг/кг до 118.8 мкг/кг (сух.в.).

По окончании затравочного периода животных умерщвляют, иссекают биологический материал - кости скелета, затем 2 г костей скелета помещают в стеклянный флакон, затем этот флакон с биологическим материалом в нативном виде подвергают замораживанию в течение не менее 10 часов при температуре не выше -15°С и далее проводят лиофилизацию при давлении менее 10^-4 мм рт. ст. и температуре ниже -50°С до постоянного веса.

В результате получают органо-минеральную матрицу (лиофилизат) костной ткани с заданным содержанием ртути от 30.9 мкг/кг до 137.6 мкг/кг (сух.в.).

Пример 3. Получение биологического референтного материала для производства стандартных образцов состава крови, содержащих кадмий.

Перед проведением эксперимента осуществляли подготовку животных к эксперименту - выдерживание в течение двух недель в карантине для адаптации и определения суточного водопотребления, взвешивания. Из возможных солей токсичных металлов выбирали водорастворимые, дающие в приемлемых условиях эксперимента стойкие растворы - как правило, нитраты и ацетаты, квалификации не ниже «чда». В результате проведения исследований был использован нитрат кадмия - Cd(NО₃)₂.

Эксперименты проведены на лабораторных белых беспородных крысах с массой тела 180-200 г, которым в поилки добавляли рассчитанное количество раствора нитрата кадмия, который они потребляли с питьевой водой и количество которого было определено на основе предварительно полученных данных о водопотреблении животных.

Для приготовления этого раствора использовался нитрат кадмия (нейтральный) Cd(NO₃)₂·4Н₂O, м.в. 309.47, квалификации «чда».

После расчета, проведенного с учетом молекулярного веса катиона кадмия (112.4), готовился водный рабочий раствор нитрата кадмия, добавление которого в поилки животных с учетом установленных массы тела и водопотребления крыс обеспечивало поступление в их организм катиона кадмия 0.06 мг/кг и 0.031 мг/кг в сутки.

Затравка животных производилась следующим образом. В поилки (стеклянные бутылки объемом 0.5 дм³) для группы крыс ежедневно в течение 30 дней подряд добавляли раствор ацетата свинца в объеме, который рассчитывался по уравнению:

X=(m×d×0.45)/c×v, приведенному в примере 2.

После внесения раствора нитрата кадмия в поилки наливали водопроводную воду до метки 0.45 дм³. В этом случае потребление воды с добавлением указанного объема основного раствора нитрата кадмия должно обеспечить поступление в организм каждой крысы в сутки необходимое количество Cd⁺² (см. таблицу 3).

Содержание кадмия в крови крыс определяли методом атомно-абсорбционной спектроскопии с электротермической атомизацией (см. таблицу 3).

Таблица 3   Содержание Cd²⁺ в крови   Доза Cd²⁺,   Метод определения мг/кг     кадмия   мкг/дм³ (вл.в.) мкг/кг (сух.в.)   0.06 39 243.8 Атомно-абсорбционной       спектроскопии с электро- 0.31 64 400 термической атомизацией

По достижении заданных концентраций кадмия в крови крыс их умерщвляли путем декапитации и собирали вытекающую кровь. Кровь расфасовывали по флаконам - по 2 г, замораживали при <-15°С.

Флаконы с замороженной кровью подключают для вакуум-сушки к лиофилизатору "Freeze Dryer 3" фирмы Labconco (США) при давлении менее 10^-4 мм рт. ст. и температуре ниже -50°С на 8 часов. За это время происходит вакуум-сушка материала, кровь превращается в красно-бурую кристаллическую массу, которая легко разрушается в порошок при легком постукивании по флакону.

Таким образом, полученный вышеописанным способом биологический референтный материал представляет собой бурый кристаллический порошок органо-минеральной матрицы (лиофилизат) крови с содержанием кадмия от 243.8 мкг/кг до 400 мкг/кг (сух.в.).

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения биологических референтных материалов для производства стандартных образцов состава этих материалов, содержащих токсичные металлы, а также к биологическому материалу, полученному предлагаемым способом. Способ включает приготовление биологического референтного материала на основе биологического материала, полученного из животных, после алиментарного введения животным водорастворимых солей свинца, или ртути, или кадмия до достижения в биологическом материале определенных концентраций свинца, или ртути, или кадмия с последующим умерщвлением животных путем декапитации. Далее осуществляют забор биологического материала, аликвоту которого подвергают анализу на заданное содержание в нем токсичных металлов, после чего биологический материал расфасовывают и лиофилизирут. Изобретение позволяет улучшать диагностирование отравлений токсичными металлами и повысить точность определения содержания токсичных металлов. 11 н.п. ф-лы, 3 табл.

1. Способ получения биологических референтных материалов для производства стандартных образцов крови, содержащих токсичный металл ртуть, предусматривающий приготовление биологического референтного материала на основе биологического материала, полученного из животных, после алиментарного дозированного введения им водорастворимых солей токсичного металла, с последующим проведением анализа собранного биологического материала на наличие токсичного металла, отличающийся тем, что в качестве животных используют лабораторных белых беспородных крыс, которым дозированно вводят водорастворимые соли ртути до достижения в биологическом материале заданной концентрации ртути от 41 до 206 мкг/дм³ (вл.в.), затем осуществляют умерщвление лабораторных белых беспородных крыс путем декапитации и забор биологического материала в виде крови, аликвоту которой подвергают анализу на заданную концентрацию ртути, после чего биологический материал расфасовывают и лиофилизируют.

2. Биологический референтный материал для производства стандартных образцов крови, содержащих токсичный металл ртуть, характеризующийся тем, что он получен способом по п.1 и представляет собой лиофилизат крови с содержанием ртути от 256 до 1287,5 мкг/кг (сух.в.), предназначенный для создания стандартного образца крови, содержащей ртуть.

3. Способ получения биологических референтных материалов для производства стандартных образцов почки, содержащих токсичный металл ртуть, предусматривающий приготовление референтного материала на основе биологического материала, полученного из животных, после алиментарного дозированного введения им водорастворимых солей токсичного металла, с последующим проведением анализа собранного биологического материала на наличие токсичного металла, отличающийся тем, что в качестве животных используют лабораторных белых беспородных крыс, которым дозированно вводят водорастворимые соли ртути до достижения в биологическом материале концентрации ртути от 7,72 до 264 мкг/кг (вл.в.), затем осуществляют умерщвление лабораторных белых беспородных крыс путем декапитации и забор биологического материала в виде тканей или органов, аликвоту которого подвергают анализу на заданную концентрацию ртути, после чего биологический материал расфасовывают и лиофилизируют.

4. Биологический референтный материал для производства стандартных образцов почки, содержащей токсичный металл ртуть, характеризующийся тем, что он получен способом по п.3 из почки и представляет собой лиофилизат почки с содержанием ртути в ней от 1020 до 1320 мкг/кг (сух.в.), предназначенный для создания стандартного образца почки, содержащей ртуть.

5. Биологический референтный материал для производства стандартных образцов ткани мозга, содержащих токсичный металл ртуть, характеризующийся тем, что он получен способом по п.3 из ткани головного мозга и представляет собой лиофилизат ткани мозга с содержанием ртути от 15,4 до 103,6 мкг/кг (сух.в.), предназначенный для создания стандартного образца ткани головного мозга, содержащей ртуть.

6. Биологический референтный материал для производства стандартных образцов мышечной ткани, содержащих токсичный металл ртуть, характеризующийся тем, что он получен способом по п.3 из мышечной ткани и представляет собой лиофилизат мышечной ткани с содержанием ртути от 41,2 до 176,6 мкг/кг (сух.в.), предназначенный для создания стандартного образца мышечной ткани, содержащей ртуть.

7. Биологический референтный материал для производства стандартных образцов жировой ткани, содержащих токсичный металл ртуть, характеризующийся тем, что он получен способом по п.3 из жировой ткани и представляет собой лиофилизат жировой ткани с содержанием ртути от 25,2 до 118,8 мкг/кг (сух.в.), предназначенный для создания стандартного образца жировой ткани, содержащей ртуть.

8. Биологический референтный материал для производства стандартных образцов ткани печени, содержащих токсичный металл ртуть, характеризующийся тем, что он получен способом по п.3 из ткани печени и представляет собой лиофилизат печени с содержанием ртути от 122 до 651 мкг/кг (сух.в.), предназначенный для создания стандартного образца ткани печени, содержащей ртуть.

9. Биологический референтный материал для производства стандартных образцов костной ткани, содержащих токсичный металл ртуть, характеризующийся тем, что он получен способом по п.3 из костной ткани и представляет собой лиофилизат костной ткани с содержанием ртути от 30,9 до 137,6 мкг/кг (сух.в.), предназначенный для создания стандартного образца костной ткани, содержащей ртуть.

10. Способ получения биологических референтных материалов для производства стандартных образцов крови, содержащих токсичный металл кадмий, предусматривающий приготовление референтного материала на основе биологического материала, полученного из животных, после алиментарного дозированного введения водорастворимых солей токсичных металлов, с последующим проведением анализа собранного биологического материала на наличие токсичных металлов, отличающийся тем, что в качестве животных используют лабораторных белых беспородных крыс, которым дозированно вводят водорастворимые соли кадмия до достижения в биологическом материале концентраций кадмия от 39 до 64 мкг/дм³ (вл.в.), затем осуществляют умерщвление лабораторных белых беспородных крыс путем декапитации и забор биологического материала в виде крови, аликвоту которого подвергают анализу на заданное содержание кадмия, после чего биологический материал расфасовывают и лиофилизируют.

11. Биологический референтный материал для производства стандартных образцов крови, содержащих токсичный металл кадмий, характеризующийся тем, что он получен способом по п.10 и представляет собой лиофилизат крови с содержанием кадмия от 243,8 до 400 мкг/кг (сух.в.), предназначенный для создания стандартного образца крови, содержащей кадмий.