Способ получения модифицированной гиалуроновой кислоты и ее солей Российский патент 2023 года по МПК C08B37/08 

Настоящее изобретение относится к области фармации, клинической и экспериментальной медицины и ветеринарии, а именно к способу получения нетоксичных составов на основе гиалуроновой кислоты и ее солей путем модифицирования сшивающими агентами из группы замещенных эпоксидных соединений и аминокислотами и использованию их в различных сферах медицины.

Гиалуроновая кислота представляет из себя биополимер, состоящий из дисахаридных звеньев D-глюкуроновой кислоты и N-ацетил-D-глюкозамина, связанных чередующимися гликозидными связями по положениям β-(1→4), при этом мономеры D-глюкуроновой кислоты и N-ацетил-D-глюкозамина связаны между собой гликозидной связью по положениям β-(1→3) (фиг. 1). Такая структура обусловливает наличие у гиалуроновой кислоты вторичной и третичной структуры в растворах [Fallacara, A.; Baldini, E.; Manfredini, S.; Vertuani, S. Hyaluronic Acid in the Third Millennium. // Polymers - 2018 V. 10(7) - P. 701]. Это обусловливается следующим: карбоксильные группы при нейтральной реакции среды в природных средах имеют отрицательный заряд, вследствие чего образуют соли с катионами металлов и являются сильно гидрофильными [Laurent, T. The biology of hyaluronan. Introduction. // Ciba Found. Symp. - 1989 - V. 143 - P. 1-20; Balazs, E. A.; Laurent, T.C.; Jeanloz, R.W. Nomenclature of hyaluronic acid. // Biochem. J. - 1986 - V. 235 - P. 903]. Окружающие молекулы воды связывают карбоксильные группы и ацетамидные группы водородными связями, что приводит к образованию одноцепочечной, левосторонней спиральной структуре, при этом два дисахидных звена приходится на один виток спирали [Heatley, F.; Scott, J.E. A water molecule participates in the secondary structure of hyaluronan. // Biochem J. - 1988 - V. 254 - P. 489-493]. Гидрофобные взаимодействия и межмолекулярные водородные связи приводят к образованию дуплексов, то есть β-листовой третичной структуре, которые приводят к агрегации полимерных цепей с образованием протяженной сети [Scott, J. E.; Cummings, C.; Brass, A.; Chen, Y. Secondary and tertiary structures of hyaluronan in aqueous solution, investigated by rotary shadowing-electron microscopy and computer simulation. Hyaluronan is a very efficient network-forming polymer. // Biochem J. - 1991 - V. 274 - P. 699-705.; Scott, J. E.; Heatley, F. Hyaluronan forms specific stable tertiary structures in aqueous solution: a 13C NMR study. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. - 1999 - V. 96 - P. 4850-4855]. Образование третичной структуры обусловливается молекулярным весом гиалуроновой кислоты и концентрацией; например, при молекулярной массе более 106 Да третичная структура образуется даже при крайне низкой концентрации в 1 мкг/мл [Scott, J. E. Supramolecular organization of extracellular matrix glycosaminoglycans, in vitro and in the tissues. // FASEB J. - 1992 - V. 6 - P. 2639-2645].

Такая структура обусловливает свойства водных растворов гиалуроновой кислоты: с повышением молекулярной массы и концентрации вязкость и реологические свойства раствора увеличиваются [Kobayashi, Y.; Okamoto, A.; Nishinari, K. Viscoelasticity of hyaluronic acid with different molecular weights. // Biorheology. - 1994 V. 31 - P. 235-244]. Однако, так как молекула гиалуроновой кислоты является полиэлектролитом, свойства ее водного раствора сильно зависят от ионной силы раствора, водородного показателя pH и температуры: с повышением данных показателей вязкость раствора значительно падает, что обусловливается ослаблением межмолекулярных взаимодействий [Kobayashi, Y.; Okamoto, A.; Nishinari, K. Viscoelasticity of hyaluronic acid with different molecular weights. // Biorheology. - 1994 V. 31 - P. 235-244.; Knopf-Marques, H.; Pravda, M.; Wolfova, L.; Velebny, V.; Schaaf, P.; Vrana, N.E.; Lavalle, P. Hyaluronic Acid and Its Derivatives in Coating and Delivery Systems: Applications in Tissue Engineering // Regenerative Medicine and Immunomodulation. Adv. Healthc. Mater. - 2016 -V. 5 - P. 2841-2855; Balazs, E. A. The physical properties of synovial fluid and the special role of hyaluronic acid. // Disorders of the Knee. - Philadelphia: J.B. Lippincott Company, 1974. - P. 63-75; Rwei, S. P.; Chen, S.W.; Mao, C.F.; Fang, H.W. Viscoelasticity and wearability of hyaluronate solutions. // Biochem. Eng. J. - 2008 - V. 40 - P. 211-217]. В особенности, гиалуроновая кислота чувствительна к изменению водородного показателя pH: в кислой или щелочной среде происходит изменение баланса между силами межмолекулярного и внутримолекулярного притяжения и отталкивания, и при значении водородного показателя менее 4 и более 11 приводит к гидролизу молекулы [Lapcík, L. J.; Lapcík, L.; De Smedt, S.; Demeester, J.; Chabrecek, P. Hyaluronan: Preparation, Structure // Properties, and Applications. Chem. Rev. - 1998 - V. 98 - P. 2663-2684.; Maleki, A.; Kjøniksen, A.L.; Nystrom, B. Effect of pH on the behavior of hyaluronic acid in dilute and semidilute aqueous solutions. // Macromol. Symp. - 2008 - V. 274 - P. 131–140]. В щелочной среде данный эффект более выражен вследствии разрушения водородных связей, играющих высокую роль при структурной организации молекул гиалуроновой кислоты [Ghosh, S.; Kobal, I.; Zanette, D.; Reed, W.F. Conformational contraction and hydrolysis of hyaluronate in sodium hydroxide solutions. // Macromolecules - 1993 - V. 26 - P. 4685–4693.; Morris, E. R.; Rees, D.A.; Welsh, E.J. Conformation and dynamic interactions in hyaluronate solutions. // J. Mol. Biol. - 1980 - V. 138 - P. 383-400].

Молекулы гиалуроновой кислоты широко распространены в природе: они присутствуют в организме человека, животных, бактерий, водорослей, дрожжей и моллюсков, однако они отсутствуют в растениях, грибах и у насекомых [Fallacara, A.; Baldini, E.; Manfredini, S.; Vertuani, S. Hyaluronic Acid in the Third Millennium. // Polymers - 2018 V. 10(7) - P. 701]. В среднем, в организме взрослого человека с массой тела 70 кг содержится около 15 грамм гиалуроновой кислоты, которая преимущественно распределена в коже (дерме и эпидермисе), синовиальной жидкости, стекловидном теле глаза, пуповине [Fallacara, A.; Baldini, E.; Manfredini, S.; Vertuani, S. Hyaluronic Acid in the Third Millennium. // Polymers - 2018 V. 10(7) - P. 701; Laurent, T. C.; Fraser, J.R. Hyaluronan. // FASEB J. - 1992 - V. 6 - P. 2397-2404].

В организме человека гиалуроновая кислота синтезируется и распадается самостоятельно, образуя определенный равновесный материальный баланс, однако с возрастом и при определенных заболеваниях это нарушается. Именно поэтому важно понять пути деградации гиалуроновой кислоты в организме человека.

Деградация в организме осуществляется путем трех механизмов: 1) специфичным с использованием ферментов - гиалуронидаз; 2) неспецифичным, путем окислительного повреждения за счет активных форм кислорода; 3) систематическим путем естественного катаболизма в организме, что проявляется преимущественно за счет транспорта лимфой в лимфатические узлы, где она перерабатывается клетками эндотелия лимфатических узлов, и транспорта кровью, где происходит ее разрушение клетками эндотелия печени [Fallacara, A.; Baldini, E.; Manfredini, S.; Vertuani, S. Hyaluronic Acid in the Third Millennium. // Polymers - 2018 V. 10(7) - P. 701; Heldin, P.; Lin, C.Y.; Kolliopoulos, K.; Chen, Y.H.; Skandalis, S.S. Regulation of hyaluronan biosynthesis and clinical impact of excessive hyaluronan production // Matrix Biol - 2018]. На разрушение путем ферментов и активных форм кислорода приходится до 30% от общей массы гиалуроновой кислоты в организме.

Наличие гиалуроновой кислоты в организме обусловливает ее высокую биосовместимость, неиммуногенность, гипоаллергенность и биодоступность. Именно поэтому, в совокупности с физико-химическими свойствами, гиалуроновая кислота имеет широкое применение в медицине, косметологии, ветеринарии.

Особое значение стоит отметить использование гиалуроновой кислоты в качестве имплантата, что обусловливается наличием гиалуроновой кислоты в организме человека. Так, большая часть протезов синовиальной жидкости, интрадермальных филлеров и офтальмологических вискоэластиков, доступных на рынке, производится на основе гиалуроновой кислоты. Однако в зависимости от медицинского назначения и терапевтических целей требуется регулирование степени биодеградации имплантируемых биополимеров. Для того, чтобы регулировать степень биодеградации гиалуроновой кислоты в тканях организма, зачастую используют химические методы модификации, а именно использование сшивающих агентов, которые образуют ковалентные связи между полимерными цепями гиалуроновой кислоты. Такая модификация существенно уменьшает скорость биодеградации, так как поперечно-сшитые производные биополимера менее склонны к гидролизному распаду, воздействию ферментов и активных форм кислорода, в то же время повышая механические свойства материала, что увеличивает продолжительность полезного эффекта от их применения.

Наибольшее распространение в настоящее время получили химические сшивающие агенты, в том числе глутаровый альдегид, дивинилсульфон и замещенные эпоксиды, в том числе 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир и полиэтиленгликольдиглицидиловый эфир. Применение последних обусловлено опытом их практического применения: на протяжении 15 лет клинического использования 1,4-бутандиолдиглицидилового эфира была подтверждена клиническая безопасность при соблюдении остаточного содержания менее 1 ppm [Leonardis M, Palange A. New-generation filler based on cross-linked carboxymethylcellulose: study of 350 patients with 3-year follow-up. // Clin Interv Aging. - 2015. - V. 10 – P. 147-155]. Помимо этого, вследствие большого количества веществ из группы замещенных эпоксидов, их использование вследствие разной молекулярной массы, структуры и реакционной способности позволяет создавать продукты с различной степенью биодеградации, что важно для различных сфер применения.

Известен целый ряд патентов, где используются замещенные эпоксиды в качестве модифицирующего сшивающего агента: US4716224, US4716154.

Наиболее близким аналогом является решение по заявке WO2013021249, опубл. 2013-02-14, где описан биоразлагаемый, но стойкий к деградации продукт, состоящий из нового сшитого низкомолекулярного полутвердого гидрогеля гиалуроновой кислоты, полученного из субстрата гиалуроната натрия с молекулярной массой от 50 000 до 100 000 Да. Продукт обладает высокой устойчивостью к ферментативной деградации и предназначен для использования в биомедицинских, фармацевтических и косметических целях.

В прототипе описан способ получения вязкоупругого, полутвердого и прозрачного сшитого низкомолекулярного гиалуроната натрия, включающий взаимодействие 8-40% раствора субстрата гиалуроната натрия со средней молекулярной массой от 50 000 Да до 100 000 Да в 0,75% -1,5% водном растворе гидроксида натрия с количеством 1,4-бутандиолдиглицидилового эфира, соответствующим от 180 молей до 500 молей на моль субстрата гиалуроната натрия, при температуре от 45 до 60 °С в течение периода времени от от 3 до 8 часов.

Однако в известных технических решениях существует техническая проблема, связанная с очисткой и дезактивацией модифицированного состава от остатков сшивающих агентов. После проведения химической модификации сшивающими агентами в полученном составе содержатся остатки непрореагировавшего модифицирующего сшивающего агента, и, что особенно важно, остатки сшивающих агентов, которые прореагировали только по одной эпоксидной группе с молекулой гиалуроновой кислоты. В таком случае может происходить реакции изомеризации оставшейся эпоксидной группы с образованием альдегидной группы, которая обладает высокой токсичностью. Именно поэтому важно отметить, что в результате использования модифицирующих сшивающих агентов требуется очистка от остаточного свободного количества сшивающих агентов и дезактивации свободных эпоксидных групп частично прореагировавших сшивающих агентов, что в приведенных аналогах либо не отмечается, либо используется процесс диализа. Однако этого недостаточно, так как свободные эпоксидные группы, которые связаны с молекулой гиалуроновой кислоты, будут оставаться, что обусловливает токсичность изделия.

Именно поэтому при использовании данных прототипов по их способам применения существует вероятность возникновения осложнений, связанная с повышенной токсичностью.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа получения составов на основе гиалуроновой кислоты и ее растворимых солей, которые являются модифицированными химически с использованием сшивающих агентов, но в то же время отличающихся низкой токсичностью, что позволяет получить продукты с разными свойствами в зависимости от их целевого применения.

Техническим результатом настоящего изобретения является получение состава на основе модифицированной поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты путем взаимодействия со сшивающими агентами, который обладает низкой токсичностью за счет наличия технологических стадий очистки и нейтрализации сшивающего агента. Указанные способы получения хорошо масштабируемы и позволяют получить низкотоксичные составы.

Указанный технический результат достигается за счет того, что заявлен способ получения состава модифицированной гиалуроновой кислоты и ее солей, включающий при изготовлении использование сшивающих агентов в виде замещенных эпоксидных соединений, отличающийся тем, что включает:

− стадию модификации гиалуроновой кислоты и ее солей путем ковалентной внутри и межмолекулярной химической сшивки с использованием модифицирующих сшивающих агентов на основе замещенных оксиранов и путем ковалентного связывания остатков свободных эпоксидных групп в составе поперечносшитой гиалуроновой кислоты и/или ее солей с аминокислотой, при этом мольное соотношение сшивающего агента и добавляемой аминокислоты составляет от 1:0,1 до 1:5;

− стадию дезактивацию свободного остаточного сшивающего агента путем реакции с аминокислотами;

− стадию последующей очистки от остатков сшивающего агента путем диализного процесса.

Допустимо, что используется гиалуроновая кислота и ее соли, включающие в себя: натрия гиалуронат, калия гиалуронат, цинка гиалуронат, магния гиалуронат, железа гиалуронат.

Допустимо, что молекулярная масса гиалуроновой кислоты или ее соли составляет от 100 000 Да до 6 000 000 Да; в более конкретных вариантах воплощения изобретения молекулярная масса гиалуроновой кислоты или ее соли составляет от 1 700 000 Да до 2 800 000 Да.

Допустимо, что массовая концентрация гиалуроновой кислоты или ее соли составляет от 0,1 % до 10 %; в более конкретных вариантах воплощения изобретения массовая концентрация гиалуроновой кислоты или ее соли составляет от 1 % до 3 %.

Допустимо, что массовая концентрация модифицирующего сшивающего агента составляет от 0,1 % до 10 %; в более конкретных вариантах воплощения изобретения массовая концентрация модифицирующего сшивающего агента составляет от 0,5 % до 5 %.

Допустимо, что стадию создания поперечных ковалентных связей осуществляют в основной среде и при температуре в диапазоне от 4°С до 60°С.

Допустимо, что стадию создания поперечных межмолекулярных и внутримолекулярных ковалентных связей осуществляют в течение от 10 минут до 72 часов, в более конкретных вариантах воплощения изобретения - в течение от 1 часа до 24 часов.

Допустимо, что после стадии создания поперечных межмолекулярных и внутримолекулярных ковалентных связей состав нейтрализуют до значения водородного показателя pH 6,0-8,5 с использованием любой неорганической или органической кислоты; в более конкретных вариантах воплощения изобретения нейтрализация может происходить с использованием хлороводородной кислоты, или уксусной кислоты, или лимонной кислоты, или молочной кислоты.

Допустимо, что в качестве аминокислоты может использоваться: глицин, аланин, валин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, триптофан, серин, треонин, цистеин, аспарагин, глутамин, тирозин, аспартат, глутамат, лизин, аргинин, гистидин, таурин.

Допустимо, что после стадии добавления аминокислоты реакционную смесь перемешивают при температуре от плюс 4°C до плюс 60°C в течение от 1 часа до 24 часов.

Допустимо, что полученный состав подвергают диализу в растворе осмотического агента, либо в воде для инъекций.

Допустимо, что полученный после диализа состав стерилизуют влажным теплом для достижения уровня стерильности 10^-6.

Допустимо, что полученный после диализа состав асептически фильтруют для получения стерильного изделия.

Также заявлен состав на основе модифицированной гиалуроновой кислоты и ее производных, содержащий остатки сшивающего агента на основе замещенных эпоксидных соединений в качестве поперечной химической ковалентной сшивки, отличающийся тем, что содержит в своем составе аминокислотный остаток, полученный по заявленному способу.

Допустимо, что аминокислотный остаток является остатком следующих аминокислот и сульфокислот: глицин, аланин, валин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, триптофан, серин, треонин, цистеин, аспарагин, глутамин, тирозин, аспартат, глутамат, лизин, аргинин, гистидин, таурин.

Допустимо, что используется гиалуроновая кислота и ее соли, включающие в себя: натрия гиалуронат, калия гиалуронат, цинка гиалуронат, магния гиалуронат, железа гиалуронат.

Краткое описание чертежей

На Фиг. 1 – Структурная формула молекулы гиалуроната натрия.

На Фиг. 2 – Химическая схема реакции поперечного сшивания гиалуроната натрия посредством использования модифицирующего сшивающего агента на основе полиэтиленгликольдиглицидилового эфира.

На Фиг. 3 – Химическая схема реакции поперечного сшивания гиалуроната натрия посредством использования модифицирующего сшивающего агента на основе 1,4-бутандиодиглицидилового эфира.

На Фиг. 4 – Химическая схема реакции одной молекулы гиалуроната натрия со сшивающим агентом на примере полиэтиленгликольдиглицидилового эфира в качестве модифицирующего сшивающего агента без поперечного сшивания.

На Фиг. 5 – Химическая схема реакции нейтрализации аминокислотой эпоксидных групп в модифицированном сшитым агентом гиалуронате натрия на примере взаимодействия с глицином и полиэтиленгликольдиглицидиловом эфире в качестве модифицирующего сшивающего агента.

На Фиг. 6 – Химическая схема реакции нейтрализации аминокислоты на примере глицина со сшивающим агентом на примере полиэтиленгликольдиглицидилового эфира.

На Фиг. 7 – Градуировочная зависимость площади пика 1,4-бутандиолдиглицидилового эфира от его концентрации.

На Фиг. 8 – Хроматограммы ВЭЖХ-МС (ESI+), записанные по избранному иону с m/z=220 (аддукт 1,4-бутандиолдиглицидилового эфира с NH₄⁺), стандартного раствора 1,4-бутандиолдиглицидилового эфира (фиолетовая) и образца, приготовленного по Примеру 1 настоящего изобретения (зеленый).

На Фиг. 9 – Спектр МС/МС (ESI+) компонента образца, приготовленного по Примеру 1 настоящего изобретения, с t_R = 8,2 мин соответствует 1,4-бутандиолдиглицидиловому эфиру.

На Фиг. 10 – Хроматограмма ВЭЖХ-МС (ESI+) образца, приготовленного по Примеру 1 настоящего изобретения, записанная в режиме полного ионного тока.

Определения и термины

Для лучшего понимания изобретения ниже приведены термины, использованные в настоящем описании изобретения.

Термины «включает» и «включающий» означают в описании данного изобретения «включает, помимо всего прочего», то есть указанные термины не истолковываются как «состоит только из».

Термин «фармацевтически применимые» означает, что относящееся к данному определению вещество и/или группа веществ не вызывают побочных, аллергических и нежелательных реакций при медицинском/ветеринарном применении у млекопитающих.

Термины «поперечно-сшитый», «поперечная сшивка» означает ковалентное связывание двух полимерных цепей гиалуроновой кислоты и/или ее солей вместе с использованием химических сшивающих агентов.

Термин «сшивающий агент» означает химический агент, модифицирующий агент, который используется при ковалентном химическом связывании двух полимерных цепей гиалуроновой кислоты и/или ее солей друг к другу.

Термин «Дальтон» или «Да» означает внесисистемную единицу измерения молекулярной массы, рекомендованную к применению ИЮПАК, эквивалентную молярной массе вещества, выраженной в граммах на моль.

Замещенный эпоксид, или замещенный оксиран, или эпоксидное соединение – группа химических веществ, относящихся к сшивающим агентам, имеющая в своем составе функциональную группу в виде насыщенного трехчленного гетероцикла, циклического эфира, в котором к двум соседним атомам углерода присоединяется атом кислорода.

1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир или 1,4-бис(2,3-эпоксипропилокси)бутан – сшивающий агент, замещенный эпоксид, с брутто-формулой C₁₀H₁₈O₄.

Полиэтиленгликольдиглицидиловый эфир – сшивающий агент, замещенный эпоксид, общей формулой C₃H₅O₂-(C₂H₄O)_n-C₃H₅O, молекулярная масса которого может находиться в диапазоне от 500 до 8000 Да.

Осуществление изобретения

Способ получения нетоксичного состава на основе гиалуроновой кислоты и ее замещенных, модифицированной химически путем реакции со сшивающими агентами на основе замещенных эпоксидов и аминокислоты, согласно изобретению, заключается в создании поперечных ковалентных эфирных связей между мономерами гиалуроновой кислоы в результате введения сшивающих агентов в виде замещенных эпоксидов и далее путем ковалентного связывания остатков свободных эпоксидных групп в составе поперечносшитой карбоксиметилцеллюлозы с аминокислотой, после чего полученный гель проходит стадию дезактивации и удаления остаточного количества сшивающего агента за счет реакции с аминокислотой и диализного процесса. Создание поперечных ковалентных связей между мономерами гиалуроновой кислоты и ее производных посредством введения модифицирующих сшивающих агентов, выполняется на основе замещенных эпоксидных соединений в основной среде, а именно: 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир; полиэтиленгликольдиглицидиловый эфир (см. фиг. 2, 3, 4). Модификация поперечносшитой гиалуроновой кислоты и ее производных путем ковалентного связывания остатков свободных эпоксидных групп в составе поперечносшитой гиалуроновой кислоты с аминокислотами показана на фиг. 5.

На всем протяжении технологического процесса производства модифицируемый состав доводится до требуемых показателей по параметрам ионной силы раствора, осмоляльности, водородного показателя pH. Так, после стадии сшивки в основной среде идет стадия нейтрализации раствором кислоты; стадия диализа в физиологическом фосфатном буфере или воде для инъекций помимо очистки способствует достижению данных показателей до физиологических значений либо тех значений, которые необходимы для конкретного медицинского применения. Нейтрализация остаточного количества сшивающего агента путем ковалентного связывания свободных эпоксидных групп с аминокислотами показана на фиг. 6.

Основным сырьем для получения модифицируемого состава является гиалуроновая кислота и ее соли, включающие в себя: натрия гиалуронат, калия гиалуронат, цинка гиалуронат, магния гиалуронат, железа гиалуронат, которая, согласно данному изобретению, может использоваться в диапазоне массовых концентраций от 0,1 % до 10 %, либо в диапазоне массовых концентраций от 1 % до 3 %; молекулярная масса может быть в диапазоне от 100 000 Да до 6 000 000 Да; в более конкретных вариантах воплощения изобретения молекулярная масса гиалуроновой кислоты или ее соли составляет от 1 700 000 Да до 2 800 000 Да.

Сшивающими агентами могут выступать любые соединения из группы замещенных эпоксидов, включая следующие: 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир; полиэтиленгликольдиглицидиловый эфир. Использование сшивающих агентов, согласно данному изобретению, возможно в диапазоне от 0,1 % до 10 % либо в диапазоне от 0,5 % до 5 %. Молекулярная масса некоторых соединений из группы замещенных эпоксидов, включая полиэтиленгликольдиглицидиловый эфир, вследствие химических особенностей может варьироваться; в частности, согласно данному изобретению, для изготовления изделий может быть использован полиэтиленгликольдиглицидиловый эфир с молекулярной массой в диапазоне от 500 Да до 8000 Да.

В качестве основания может использоваться любое неорганическое основание, в частности гидроксид натрия или гидроксид калия, с массовой концентрацией в диапазоне от 0,01% до 10%.

В общем случае для производства модифицированного состава, согласно данному изобретению, предварительно взвешенная масса гиалуроновой кислоты и/или ее солей добавляется в емкость с основным раствором гидроксида натрия и перемешивается до полного растворения при температуре не выше плюс 60°С. После этого к полученному раствору добавляется предварительно взвешенная/отмеренная масса/объем сшивающего агента при постоянном перемешивании до получения гомогенной смеси. После процесса химической сшивки полученная смесь нейтрализуется путем добавления кислоты до значения водородного показателя pH в диапазоне значений от 6,0 до 8,5.

В качестве нейтрализующей кислоты может быть использована любая неорганическая или органическая кислота, в частности хлороводородная кислота, или уксусная кислота, или лимонная кислота, или молочная кислота.

После этого добавляется аминокислота и осуществляется перемешивание. Мольное соотношение сшивающего агента к аминокислоте составляет от 1:0.5 до 1:5. Время перемешивания смеси с аминокислотой должно составлять не менее 1 часа; температура не должна превышать 60°С.

Затем полученная смесь помещается подвергается процессу диализа в фосфатном физиологическом буферном растворе, либо в воде для инъекций, таким образом итоговое значение водородного показателя pH, ионной силы раствора и осмоляльности принимают физиологические значения либо те значения, которые необходимы для конкретного медицинского применения.

После процедуры диализа полученный гель гомогенизируется путем перемешивания, при необходимости добавляется требуемое количество воды для инъекции согласно целевому показателю концентрации карбоксиметилцеллюлозы в готовом изделии, и перемешивается или гомогенизируется до однородного состояния. Далее полученный модифицированный состав поступают на стадию фасовки, где он разливается в фасовочную емкость в зависимости от целевого назначения, включающую в себя первичную упаковку системы «контейнер-укупорка», и подвергается процессу стерилизации влажным теплом или асептической фильтрацией через стерилизующие микрофильтры.

Очистка полученного модифицированного сшитого состава путем использования диализного процесса осуществляется с целью дополнительной очистки от остатков сшивающих агентов.

Использование аминокислот в модифицирующем составе обосновано тем, что аминокислоты являются нуклеофильными агентами за счет наличия аминогруппы, в результате чего присоединяются к свободным эпоксидным группам остаточного сшивающего агента и модифицированного состава, таким образом блокируя их дальнейшую изомеризацию; выбор аминокислот в качестве нуклеофильных агентов обусловлен их биологической совместимостью, вследствие чего они не проявляют токсичности; выбор конкретной аминокислоты для воплощения изобретения обусловливается методом стерилизации изделия, медицинским применением и экономической себестоимостью.

В частных вариантах воплощения изобретения сшивающие агенты представляет собой замещенные эпоксидные соединения; в более конкретных вариантах воплощения изобретения используются сшивающие агенты со следующими характеристиками:

− 1,4-бутандиодиглицидиловый эфир с молекулярной массой 202,25 Да;

− полиэтиленгликольдиглицидиловый эфир с молекулярной массой от 500 Да до 8000 Да.

В частных вариантах воплощения изобретения используется гиалуроновая кислота и ее соли, включающие в себя: натрия гиалуронат, калия гиалуронат, цинка гиалуронат, магния гиалуронат, железа гиалуронат.

В частных вариантах воплощения изобретения молекулярная масса гиалуроновой кислоты или ее соли составляет от 100 000 Да до 6 000 000 Да; в более конкретных вариантах воплощения изобретения молекулярная масса гиалуроновой кислоты или ее соли составляет от 1 700 000 Да до 2 800 000 Да.

В частных вариантах воплощения изобретения массовая концентрация гиалуроновой кислоты или ее соли составляет от 0,1% до 10%; в более конкретных вариантах воплощения изобретения массовая концентрация гиалуроновой кислоты или ее соли составляет от 1% до 3%.

В частных вариантах воплощения изобретения массовая концентрация модифицирующего сшивающего агента составляет от 0,1% до 10%; в более конкретных вариантах воплощения изобретения массовая концентрация модифицирующего сшивающего агента составляет от 0,5% до 5%.

В частных вариантах воплощения изобретения стадию образования поперечных ковалентных связей осуществляют в основной среде при температуре в диапазоне от плюс 4°С до плюс 60°С.

В частных вариантах воплощения изобретения стадию создания поперечных межмолекулярных и внутримолекулярных ковалентных связей осуществляют в течение от 10 минут до 72 часов, в более конкретных вариантах воплощения изобретения – в течение от 1 часа до 24 часов.

В частных вариантах воплощения изобретения полученный модифицированный состав нейтрализуют до значения водородного показателя pH от 6,0 до 8,5 с использованием любой неорганической или органической кислоты; в более конкретных вариантах воплощения изобретения нейтрализация может происходить с использованием водных растворов хлороводородной кислоты, или уксусной кислоты, или лимонной кислоты, или молочной кислоты.

В частных вариантах воплощения изобретения после стадии нейтрализации добавляется аминокислота, при этом мольное соотношение сшивающего агента к аминокислоте составляет от 1:0.5 до 1:5.

В частных вариантах воплощения изобретения в качестве аминокислоты используется любая из аминокислот (за исключением пролина, который химически относится к иминокислотам, но который часто приписывают к аминокислотам), в т.ч. сульфоаминокислоты. В более конкретных вариантах воплощения изобретения в качестве аминокислоты могут использоваться: глицин, аланин, валин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, триптофан, серин, треонин, цистеин, аспарагин, глутамин, тирозин, аспартат, глутамат, лизин, аргинин, гистидин, таурин.

В частных вариантах воплощения изобретения после стадии добавления аминокислоты модифицируемый состав перемешивают при температуре от плюс 4°C до 60°C в течение от 1 часа до 24 часов.

В частных вариантах воплощения изобретения полученный модифицированный состав подвергают диализу в растворе осмотического агента, например, физиологического буферного раствора, либо в воде для инъекций, таким образом конечное значение водородного показателя pH, ионной силы раствора и осмоляльности принимают физиологически применимые значения либо те значения, которые необходимы для конкретного медицинского применения.

В частных вариантах воплощения изобретения могут использоваться дополнительные фармацевтически применимые вещества, используемые при создании фармацевтических композиций, без ограничений, таких как: консерванты, антиоксиданты, эмульгаторы, изотонические и осмотические агенты, ароматизаторы, красители, отдушки и т.д.

В частных вариантах воплощения изобретения полученный модифицируемый состав стерилизуют влажным теплом. Режим стерилизации (а именно показатели продолжительности стерилизации и температуры стерилизации) подбирается таким образом, чтобы допустимый уровень обеспечения стерильности был не менее 10^-6.

В частных вариантах воплощения изобретения полученный модифицируемый состав стерилизуют асептически путем фильтрации через микрофильтр.

Полученным таким модифицируемый состав является нетоксичным и биосовместимым, что позволяет использовать его в различных областях медицины и ветеринарии, включающих в себя:

1) в качестве вещества-носителя при использовании систем доставки лекарственных средств и систем контролирования высвобождения лекарственных средств, в том числе при доставке токсичных веществ в химиотерапии;

2) в качестве лубриканта и/или антиадгезионного барьера при хирургических вмешательствах;

3) в качестве противоспаечного геля при хирургических вмешательствах;

4) в качестве интрадермального филлера для коррекции косметических дефектов;

5) в качестве протеза синовиальной жидкости при внутрисуставных инъекций;

6) в качестве протектора межклеточного вещества уротелия, в том числе при облегчении симптомов заболеваний и операционных вмешательствах;

7) в качестве офтальмологического вискоэластика и растворов при офтальмологических заболеваниях;

8) в качестве материала для регенерации кожи при лечении трофических язв и длительно незаживающих ран, в том числе вызванных диабетом.

Реализацию способа получения геля модифицированной гиалуроновой кислоты можно проиллюстрировать на следующих примерах.

Пример 1. В круглодонную колбу (100 мл), снабженную верхнеприводной мешалкой с редуктором, поместили 1 г натриевой соли гиалуроновой кислоты (молекулярная масса 2 800 000 Да). Затем в колбу добавили 1%-ный раствор по массе гидроксида натрия в воде для инъекций в количестве 25 мл. Проводили растворение гиалуроновой кислоты в щелочном растворе в течение 1 часа при температуре 20°С и перемешивании при 50-60 об/мин. После полного растворения добавили 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир (молекулярная масса 202,4 Да) массой 2,5 г. Полученную смесь перемешивали при температуре 20°С в течение 19 часов при скорости перемешивания 40 об/мин. После проведения реакции смесь нейтрализовали раствором соляной кислоты молярной концентрацией 1 М до значений показателя pH от 6,0 до 8,5, и затем добавили 900 мг глицина. Смесь перемешивали в течение часа при температуре 20°С при скорости перемешивания 40 об/мин. После этого гель был помещен в стерильный диализный мешок соответствующего размера (размер пор соответствует пределу отсечения в 12000 Да) и поместили в емкость объемом 1 л. Емкость заполнили фосфатно-солевым буфером. Диализ вели при температуре плюс 20°С, общее время диализа составило 24 часа. После диализа модифицированный состав довели до объема 50 мл фосфатно-солевым физиологическим буферным раствором и расфасовали по шприцам, предназначенным для предварительного наполнения, и укупорили, после чего простерилизовали влажным теплом с режимом стерилизации 20 мин при температуре 121°С.

Пример 2. В круглодонную колбу (100 мл), снабженную верхнеприводной мешалкой с редуктором, поместили 3 г натриевой соли гиалуроновой кислоты (молекулярная масса 1 700 000 Да). Затем в колбу добавили 1%-ый раствор по массе гидроксида натрия в воде для инъекций в количестве 25 мл. Проводили растворение гиалуроновой кислоты в щелочном растворе в течение 1 часа при температуре 20°С и перемешивании при 50-60 об/мин. После полного растворения добавили 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир (молекулярная масса 202,4 Да) массой 0,25 г. Полученную смесь перемешивали при температуре 20°С в течение 19 часов при скорости перемешивания 40 об/мин. После проведения реакции смесь нейтрализовали раствором соляной кислоты молярной концентрацией 1 М до значений показателя pH от 6,0 до 8,5, и затем добавили 500 мг глутамина. Смесь перемешивали в течение часа при температуре 20°С при скорости перемешивания 40 об/мин. После этого гель был помещен в стерильный диализный мешок соответствующего размера (размер пор соответствует пределу отсечения в 12000 Да) и поместили в емкость объемом 1 л. Емкость заполнили фосфатно-солевым буфером. Диализ вели при температуре плюс 20°С, общее время диализа составило 24 часа. После диализа модифицированный состав довели до объема 50 мл фосфатно-солевым физиологическим буферным раствором и расфасовали по шприцам, предназначенным для предварительного наполнения, и укупорили, после чего простерилизовали влажным теплом с режимом стерилизации 20 мин при температуре 121°С.

Пример 3. В круглодонную колбу (100 мл), снабженную верхнеприводной мешалкой с редуктором, поместили 2 г натриевой соли гиалуроновой кислоты (молекулярная масса 2 400 000 Да). Затем в колбу добавили 1%-ный раствор по массе гидроксида натрия в воде для инъекций в количестве 25 мл. Проводили растворение гиалуроновой кислоты в щелочном растворе в течение 1 часа при температуре 20°С и перемешивании при 50-60 об/мин. После полного растворения добавили полиэтиленгликольдиглицидиловый эфир (молекулярная масса 8000 Да) массой 0,5 г. Полученную смесь перемешивали при температуре 20°С в течение 19 часов при скорости перемешивания 40 об/мин. После проведения реакции смесь нейтрализовали раствором соляной кислоты молярной концентрацией 1 М до значений показателя pH от 6,0 до 8,5, и затем добавили 2,5 г глицина. Смесь перемешивали в течение часа при температуре 20°С при скорости перемешивания 40 об/мин. После этого гель был помещен в стерильный диализный мешок соответствующего размера (размер пор соответствует пределу отсечения в 12000 Да) и поместили в емкость объемом 1 л. Емкость заполнили фосфатно-солевым буфером. Диализ вели при температуре плюс 20°С, общее время диализа составило 24 часа. После диализа модифицированный состав довели до объема 50 мл фосфатно-солевым физиологическим буферным раствором и расфасовали по шприцам, предназначенным для предварительного наполнения, и укупорили, после чего простерилизовали влажным теплом с режимом стерилизации 20 мин при температуре 121°С.

Пример 4. В круглодонную колбу (100 мл), снабженную верхнеприводной мешалкой с редуктором, поместили 2 г натриевой соли гиалуроновой кислоты (молекулярная масса 2 400 000 Да). Затем в колбу добавили 1%-ный раствор по массе гидроксида натрия в воде для инъекций в количестве 25 мл. Проводили растворение гиалуроновой кислоты в щелочном растворе в течение 1 часа при температуре 20°С и перемешивании при 50-60 об/мин. После полного растворения добавили полиэтиленгликольдиглицидиловый эфир (молекулярная масса 500 Да) массой 2,00 г. Полученную смесь перемешивали при температуре 20 °С в течение 19 часов при скорости перемешивания 40 об/мин. После проведения реакции смесь нейтрализовали раствором соляной кислоты молярной концентрацией 1 М до значений показателя pH от 6,0 до 8,5, и затем добавили 10 г лизина. Смесь перемешивали в течение часа при температуре 20°С при скорости перемешивания 40 об/мин. После этого гель был помещен в стерильный диализный мешок соответствующего размера (размер пор соответствует пределу отсечения в 12000 Да) и поместили в емкость объемом 1 л. Емкость заполнили фосфатно-солевым буфером. Диализ вели при температуре плюс 20°С, общее время диализа составило 24 часа. После диализа модифицированный состав довели до объема 50 мл фосфатно-солевым физиологическим буферным раствором и расфасовали по шприцам, предназначенным для предварительного наполнения, и укупорили, после чего простерилизовали влажным теплом с режимом стерилизации 20 мин при температуре 121°С.

Пример 5. В круглодонную колбу (100 мл), снабженную верхнеприводной мешалкой с редуктором, поместили 2 г натриевой соли гиалуроновой кислоты (молекулярная масса 2 400 000 Да). Затем в колбу добавили 1%-ный раствор по массе гидроксида натрия в воде для инъекций в количестве 25 мл. Проводили растворение гиалуроновой кислоты в щелочном растворе в течение 1 часа при температуре 20°С и перемешивании при 50-60 об/мин. После полного растворения добавили полиэтиленгликольдиглицидиловый эфир (молекулярная масса 500 Да) массой 2,00 г и 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир (молекулярная масса 202,4 Да) массой 0,25 г. Полученную смесь перемешивали при температуре 20°С в течение 19 часов при скорости перемешивания 40 об/мин. После проведения реакции смесь нейтрализовали раствором соляной кислоты молярной концентрацией 1 М до значений показателя pH от 6,0 до 8,5, и затем добавили 300 мг аргинина. Смесь перемешивали в течение часа при температуре 20°С при скорости перемешивания 40 об/мин. После этого гель был помещен в стерильный диализный мешок соответствующего размера (размер пор соответствует пределу отсечения в 12000 Да) и поместили в емкость объемом 1 л. Емкость заполнили фосфатно-солевым буфером. Диализ вели при температуре плюс 20°C, общее время диализа составило 24 часа. После диализа модифицированный состав довели до объема 50 мл фосфатно-солевым физиологическим буферным раствором и расфасовали по шприцам, предназначенным для предварительного наполнения, и укупорили, после чего простерилизовали влажным теплом с режимом стерилизации 20 мин при температуре 121°С.

Исследование остаточного количества сшивающего агента

Для того чтобы определить остаточное содержание сшивающего агента, на исследование был направлен образец, полученный в соответствии с Примером 1 настоящего изобретения.

Определение содержания 1,4-бутандиолдиглицидилового эфира проводили методом ВЭЖХ-МС с помощью градуировочной зависимости площади пика 1,4-бутандиолдиглицидилового эфира от его концентрации, общий вид которой приведен на фиг. 7.

Пробоподготовка образца заключалась в его фильтрации. Объем вводимой пробы полученного фильтрата 20 мкл.

На основании полученных данных было установлено, что концентрация остаточного 1,4-бутандиолдиглицидилового эфира в образце, полученном в соответствии с Примером 1 настоящего изобретения, составляет 0,11 м.д., что существенно ниже требуемых 2 м.д. для безопасного клинического использования.

Таким образом, подтверждается достижение технического результата данного изобретения, а именно получение состава на основе модифицированной поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты путем взаимодействия со сшивающими агентами, который обладает низкой токсичностью за счет наличия технологических стадий очистки и нейтрализации сшивающего агента.

Хроматограммы ВЭЖХ-МС образцов «ГК филлер 3» и стандартного раствора БДДЭ, спектр МС/МС БДДЭ, полученный в режиме ионизации электрораспылением в положительных ионах, приведены на фиг. 2 - фиг.6.

Изобретение относится к технологии производных гиалуроновой кислоты. Предложенный способ получения модифицированной гиалуроновой кислоты и ее солей включает модификацию гиалуроновой кислоты и ее солей путем ковалентной внутри- и межмолекулярной химической сшивки с использованием сшивающих агентов на основе замещенных оксиранов, выбранных из 1,4-бутандиолдиглицидилового эфира, полиэтиленгликольдиглицидилового эфира и их комбинации. Затем проводят нейтрализацию до pH 6,0-8,5 с использованием соляной кислоты, ковалентное связывание остатков свободных эпоксидных групп в составе поперечносшитой гиалуроновой кислоты и/или ее солей с аминокислотой и дезактивацию свободного остаточного сшивающего агента путем добавления аминокислот, при этом мольное соотношение сшивающего агента и добавляемой аминокислоты составляет от 1:0,1 до 1:5. После чего осуществляют очистку от остатков дезактивированного сшивающего агента путем диализного процесса. Изобретение направлено на получение состава на основе модифицированной поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты путем взаимодействия со сшивающими агентами, который обладает низкой токсичностью. 11 з.п. ф-лы, 10 ил., 5 пр.

1. Способ получения модифицированной гиалуроновой кислоты и ее солей, включающий следующие стадии:

- модификацию гиалуроновой кислоты и ее солей путем ковалентной внутри- и межмолекулярной химической сшивки с использованием сшивающих агентов на основе замещенных оксиранов, выбранных из 1,4-бутандиолдиглицидилового эфира, полиэтиленгликольдиглицидилового эфира и их комбинации;

- нейтрализацию до pH 6,0-8,5 с использованием соляной кислоты;

- ковалентное связывание остатков свободных эпоксидных групп в составе поперечносшитой гиалуроновой кислоты и/или ее солей с аминокислотой и дезактивацию свободного остаточного сшивающего агента путем добавления аминокислот, при этом мольное соотношение сшивающего агента и добавляемой аминокислоты составляет от 1:0,1 до 1:5;

- очистку от остатков дезактивированного сшивающего агента путем диализного процесса.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используется гиалуроновая кислота и ее соли, включающие в себя: натрия гиалуронат, калия гиалуронат, цинка гиалуронат, магния гиалуронат, железа гиалуронат.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что молекулярная масса гиалуроновой кислоты или ее соли составляет от 100 000 Да до 6 000 000 Да; в более конкретных вариантах воплощения изобретения молекулярная масса гиалуроновой кислоты или ее соли составляет от 1 700 000 Да до 2 800 000 Да.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что массовая концентрация гиалуроновой кислоты или ее соли составляет от 0,1% до 10%; в более конкретных вариантах воплощения изобретения массовая концентрация гиалуроновой кислоты или ее соли составляет от 1% до 3%.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что массовая концентрация модифицирующего сшивающего агента составляет от 0,1% до 10%; в более конкретных вариантах воплощения изобретения массовая концентрация модифицирующего сшивающего агента составляет от 0,5% до 5%.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что стадию создания поперечных ковалентных связей осуществляют в основной среде и при температуре в диапазоне от 4°С до 60°С.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что стадию создания поперечных межмолекулярных и внутримолекулярных ковалентных связей осуществляют в течение от 10 минут до 72 часов, в более конкретных вариантах воплощения изобретения - в течение от 1 часа до 24 часов.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве аминокислоты может использоваться: глицин, аланин, валин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, триптофан, серин, треонин, цистеин, аспарагин, глутамин, тирозин, аспартат, глутамат, лизин, аргинин, гистидин, таурин.

9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что после стадии добавления аминокислоты реакционную смесь перемешивают при температуре от плюс 4°C до плюс 60°C в течение от 1 часа до 24 часов.

10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что полученный состав подвергают диализу в растворе осмотического агента либо в воде для инъекций.

11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что полученный после диализа состав стерилизуют влажным теплом для достижения уровня стерильности 10^-6.

12. Способ по п. 1, отличающийся тем, что полученный после диализа состав асептически фильтруют для получения стерильного изделия.