Консорциум штаммов бифидобактерий, используемый для приготовления бифидосодержащей продукции Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 A61K35/745 C12R1/01 

Изобретение относится к биотехнологии, пищевой промышленности, медицинской микробиологии и может быть использовано для получения бифидосодержащих продуктов: кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, детского питания, заквасок, гигиенических и косметических средств, биологически активных добавок, бактерийных препаратов.

В связи с неблагоприятными экологическими условиями, стрессами, антибактериальной, лучевой и химиотерапией, дисбиозами, возникающими вследствие перенесенных заболеваний, увеличивается количество людей страдающих нарушениями нормальной микрофлоры организма. Для лечения и профилактики этих нарушений все большее внимание уделяется как препаратам, обладающим пробиотическим действием, так и пищевым продуктам, содержащим представителей нормальной микрофлоры кишечника - бифидо-бактерии и лактобактерии.

Проблема коррекции дисбиозов толстого кишечника человека можно рассматривать как общемедицинскую, поскольку нарушения микробиоценоза существенно в патогенезе большого количества заболеваний различной этиологии, в том числе и патологии висцеральных органов [Бухарин, О.В. Микросимбиоценоз / О.В. Бухарин, Н.Б. Перунова - Екатеринбург: УрО РАН, 2014. - 260 с.].

В настоящее время в мире продолжается поиск консорциумов пробиотических микроорганизмов с высоким лечебно-профилактическим эффектом.

Большинство пробиотических препаратов создается на основе бифидобактерий и лактобактерий, являющихся наиболее значимыми представителями микросимбиоценоза человека и выполняющими многофункциональную роль в поддержании гомеостаза хозяина [Шендеров Б.А. Пробиотики, пребиотики и синбиотики. Общие и избранные разделы проблемы / Б.А. Шендеров // Пищевые ингредиенты. Сырье и добавки. - 2005. - №2. - С. 23-26; Бухарин, О.В. Бифидофлора при ассоциативном симбиозе человека / О.В. Бухарин, Н.Б. Перунова, Е.В. Иванова. - Екатеринбург: УрО РАН, 2014. - 214 с.].

При исследовании видового состава бифидобактерий, выявлено, что бифидофлора в норме (при эубиозе) представлена 7 видами, где в составе вида В. longum определяются 3 подвида: longum, infantis и suis, то есть всего 9 таксонов. Лидирующие позиции в кишечном микробиоценозе занимали четыре вида: В. longum (32,0±0,8%), В. bifidum (28,0±0,9%), В. catenulatum (13,0±0,9%), В. adolescentis (10,0±1,0%). Частота встречаемости остальных шести видов бифидобактерий не превышает 6,0±1,0%. При образовании консорциумов доминирующим видом в 83±1,2% случаев являлся В. longum, в остальных случаях - В. bifidum (Иванова Елена Валерьевна. Роль бифидофлоры в ассоциативном симбиозе кишечной микробиоты человека: диссертация… доктора Медицинских наук: 03.02.03 / Иванова Елена Валерьевна; [Место защиты: ФГБОУ ВО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации], 2018).

Также выявлено, что бифидофлора обладает определенной структурой, в соответствии с которой только консорциум бифидобактерий оказывает доминантное влияние на формирование микробиоты, характерной для здорового кишечника (доказано в 88% исследованных случаев), в то время как наличие одного или двух штаммов всегда приводит к дисбиозу (доказано в 42% случаев дисбиоза 1-2 типа и в 86% дисбиоза 3 типа). (Иванова Е.В. Роль бифидофлоры в ассоциативном симбиозе кишечной микробиоты человека. Автореферат дис. … докт. мед. наук. Челябинск 2009, стр. 13)

Известны консорциумы пробиотических штаммов различных комбинаций, используемые для приготовления пробиотиков, продуктов лечебного питания, кисломолочных продуктов, биологически активных добавок и бифидосодержащих пищевых продуктов зарубежных и отечественных фирм-разработчиков (RU 2109054 C1, RU 2196173 C1, RU 2196174 C1, RU 2264452 C1, RU 2264450 C1, RU 2261909 C1, RU 2491334 C1, RU 2491333 C1, RU 2491332 C1, WO 2014021733, US 7807440 В2, ЕА 017595 В1).

Известные полиштаммовые препараты зачастую представляют собой механический набор пробиотических культур без учета их биосовместимости, способности штаммов в составе микробного консорциума в препаратах, развиваться совместно, не подавляя друг друга, и симбиотических свойств бифидобактерий. В связи с этим, производители вынуждены культивировать штаммы бифидобактерий и/или лактобактерий раздельно и смешивают их непосредственно перед лиофилизацией. Это приводит к недостаточной колонизирующей активности, низкой жизнеспособности пробиотических штаммов и слабой устойчивости их к повреждающим факторам агрессивных сред желудочно-кишечного (желчь, желудочный сок, антимикробные факторы защиты и др.) тракта.

Наиболее близким аналогом заявленного консорциума по видовому составу является консорциум штаммов Bifidobacterium bifidum ВКПМ Ас-1875 и Bifidobacterium longum ВКПМ Ас-1876, используемый для получения бифидосодержащей продукции (RU 2467065 С1). Консорциум штаммов обладает биологически и технологически значимыми свойствами, такими как кислотообразующая активность, способность наращивать микробную биомассу в различных питательных средах. Консорциум антагонистически активен по отношению к патогенным и условно-патогенной микроорганизмам.

Недостатком данного консорциума является то, что он представляет собой механический набор пробиотических культур без учета их симбиотических свойств и биосовместимости штаммов, т.е. способности развиваться совместно, не подавляя друг друга. В связи с этим, производители вынуждены культивировать их раздельно и смешивают их непосредственно перед лиофилизацией. Это приводит к низкому пробиотическому действию консорциума и недостаточной колонизирующей активности и жизнеспособности пробиотических штаммов.

Технический результат, на достижение которого направлено изобретение заключается в разработке консорциума двух штаммов, относящихся к видам бифидобактерий, наиболее часто встречающимся в организме человека, Bifidobacterium bifidum и Bifidobacterium longum, имеющего высокую антиоксидантную активность, способного хорошо расти при культивировании в искусственных питательных средах и молоке, устойчивого к условиям внешней среды и обладающего антагонистической активностью по отношению к условно-патогенной и патогенной микрофлоре и иммуномодулирующей активностью (симбиотические свойства). Достижение указанного технического результата позволит расширить арсенал средств для приготовления бифидосодержащей продукции, используемой для коррекции микрофлоры организма человека.

Указанный технический результат достигнут получением нового консорциума двух штаммов Bifidobacterium bifidum ICIS-310 и Bifidobacterium longum ICIS-505. Соотношение штаммов в консорциуме составляет 2:1 соответственно.

Штамм Bifidobacterium bifidum ICIS-310 выделен от здорового человека при обследовании на дисбиоз кишечника, депонирован в ГКНМ, ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора», коллекционный номер 1258.

Штамм Bifidobacterium longum ICIS-505 выделен выделен от здорового человека при обследовании на дисбиоз кишечника, депонирован в ГКНМ, ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора», коллекционный номер 1260.

Культурально-морфологические признаки консорциума.

Клетки представляют собой грамположительные, неподвижные полиморфные палочки с раздвоениями или булавовидными утолщениями на одном или двух концах длиной от 4,0 до 5,0 мкм, располагающиеся в виде отдельных клеток или скоплений. Логарифмическая фаза роста заканчивается к 12-16 часам культивирования.

Физиолого-биохимические признаки консорциума.

В анаэробных условиях на поверхности Schaedler-arap и МРС-5 (38±1°С, 48 часов) образуют круглые мелкие белые колонии. Строгий анаэроб; в анаэробных условиях на поверхности Schaedler-arapa, МРС-5 среды через 48 часов инкубации при температуре (38±1)°С образует круглые мелкие белые колонии; в полужидких средах - печеночной среде Блаурокка, казеиново-дрожжевой (КД-5), гидролизатно-молочной (ГМ), бактерии вырастают в виде рыхлой массы, оставляя прозрачной верхнюю часть среды (зона аэробиоза); отдельные колонии бифидобактерий при росте на печеночной среде Блаурокка имеют форму мелких «гвоздей» белого цвета, образующих при встряхивании крошковатую массу.

Антагонистические свойства: проявляет активность по отношению к тест-культурам S. zonnei 1776, S. flexneri 337, S. flexneri 170, E.coli 157, S. aureus 209, P. mirabilis 50/10, P. vulgaris 401.

Авторами экспериментально установлена высокая биосовместимость штаммов заявляемого консорциума, Bifidobacterium bifidum ICIS-310 и Bifidobacterium longum ICIS-505, и их синергидное действие: способность увеличивать численность, биопленкобразование, кислотоустойчивость, антиоксидантную активность, антагонистические, иммуномодулирующие (антипептидная активность в отношении цитокинов) свойства друг друга.

Выбор состава штаммов консорциума.

Изучали способность наращивать микробную массу при культивировании в различных питательных средах штаммов Bifidobacterium bifidum ICIS-310 и Bifidobacterium longum ICIS-505 по отдельности и в консорциуме при различном соотношении указанных штаммов.

Из каждой монокультуры Bifidobacterium bifidum ICIS-310 и Bifidobacterium longum ICIS-505 (каждая в отдельности) готовили микробную взвесь мутностью 0,5 McFarland (1*10⁸ КОЕ/мл) и смешивали, полученные микробные взвеси, в соотношениях 1:1, 2:1, 1:2, 3:1, 1:3 соответственно.

Затем полученные микробные взвеси в количестве 1 мл добавляли в 9 мл различных питательных сред: бульон Шадлера, среда Блаурокка, Бифидум-среда, гидролизатно-молочная питательная среда. Далее пробирки инкубировали при температуре 37-38°С при в течение 48 часов в CO2-инкубаторе (BINDER, Германия).

Результаты исследований представлены в таблице 1.

Как видно из таблицы, наибольшая численность бифидобактерий при культивировании в различных питательных средах наблюдается в консорциуме штаммов Bifidobacterium bifidum ICIS-310 и Bifidobacterium longum ICIS-505 в соотношении 2:1.

В этой связи для патентования был принят консорциум штаммов Bifidobacterium bifidum ICIS-310 и Bifidobacterium longum ICIS-505 в соотношении 2:1 соответственно. Были проведены дальнейшие исследования для изучения биологических свойств (образование биопленок, кислотоустойчивость, антагонистическая, антипептидная и антиоксидантная активность) предлагаемого консорциума бифидобактерий.

Изучали у монокультур и консорциума Bifidobacterium bifidum ICIS-310 и Bifidobacterium longum ICIS-505 (соотношении штаммов 2:1 соответственно) способность к образованию биопленок с помощью определения способности к адгезии на поверхности 96-луночного полистеролового стерильного планшета (O'Toole G., Kaplan Н.В., Kolter R. Biofilm formation as microbial development. Annu. Rev. Microbiol. 2000. 54: 49-79.).

Установлено, что заявляемый консорциум штаммов Bifidobacterium bifidum ICIS-310 и Bifidobacterium longum ICIS-505 обладал более выраженной способностью к биопленкообразованию (0,7±0,01 ед.) в сравнении с монокультурой Bifidobacterium bifidum ICIS-310 (0,4±0,01 ед.) и монокультурой Bifidobacterium longum ICIS-505 (0,5±0,01 ед.).

Авторами было проведено тестирование монокультур штаммов и заявляемого консорциума штаммов Bifidobacterium bifidum ICIS-310 и Bifidobacterium longum ICIS-505 на кислотоустойчивость. Исследования проводили в соответствии с МУ 2.3.2.2789-10 Методические указания по санитарно-эпидемиологической оценке безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов (официальное издание / Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. - М., 2011 г.).

В исследовании использован искусственный желудочный сок (имитация желудочного сока, ИЖС) следующего состава: NaCl - 2.2 г; соляная кислота - 9.9 (0,11 М); пепсин (свиной) единиц/мг - 3.5. рН: 2.7±0.1 (рН доводили 35% NaOH). Вода дистиллированная до 1 л. Конечный рН 2,8±0,1.

Искусственный желудочный сок перед экспериментом нагревали до температуры (37±1)°С. Затем, к 50 мл искусственного желудочного сока добавляли гомогенную суспензию бактерий и тщательно перемешивали. Первую пробу для посева на питательной среде «Бифилайф М» (ООО «Бифилайф», Москва) отбирали сразу после внесения в искусственный желудочный сок (точка «0 мин») и перемешивали. Последующие пробы отбирали каждые 15 минут (точки «15 мин», «30 мин», «45 мин», «60 мин»). Последний отбор проб производили через 60 минут, после чего термостатирование прекращали. Численность бактерий определяли методом десятикратных разведений на питательной среде «Бифилайф М» (ООО «Бифилайф», Москва).

Результаты исследований представлены в таблице 2.

Как видно из таблицы 2 заявляемый консорциум В. bifidum ICIS-310 и В. longum ICIS-505 обладает более выраженной кислотоустойчивостью в условиях искусственного желудочного сока на протяжении 60 минут эксперимента в сравнении с монокультурами. Это подтверждает синергидное действие штаммов Bifidobacterium bifidum ICIS-310 и Bifidobacterium longum ICIS-505 в консорциуме.

Антагонистическую активность штаммов В. bifidum ICIS-310 и В. longum ICIS-505 по отдельности и в составе заявляемого консорциума бифидобактерий определяли методом отсроченного антагонизма в агаре по Muriana Р. и Klaenhammer Т. (Muriana P.M., Klaenhammer T.R. Conjugal transfer of plasmid-encoded determinants for bacteriocin production and immunity in Lactobacillus acidophilus 88 // Appl. Environ. Microbiol. 1987. V. 53, №3. P. 553-560.). В качестве индикаторных штаммов использовали - тест-культуры условно-патогенных и патогенных микроорганизмов коллекции ГИСК им. Л.А. Тарасевича (S. zonnei 1776, S. flexneri 337, S. flexneri 170, E.coli 157, S. aureus 209, P. mirabilis 50/10, P. vulgaris 401). Антагонистическую активность штаммов В. bifidum ICIS-310 и В. longum ICIS-505 по отдельности и в составе заявляемого консорциума бифидобактерий оценивали по диаметру зон задержки роста тест-культур.

Результаты приведены в таблице 3.

Из таблицы видно, что как штаммы В. bifidum ICIS-310 и В. longum ICIS-505 по отдельности, так и в заявляемый консорциум штаммов проявляют высокую антагонистическую активность по отношению к вышеуказанным тест-культурам. Но надо отметить, что заявляемый консорциум штаммов В. bifidum ICIS-310 и В. longum ICIS-505 проявляет более высокую антагонистическую активность к тест-культурам Е. coli 157, S. aureus 209, P. mirabilis 50/10, P. vulgaris 401 в сравнении с монокультурами.

Заявляемый консорциум штаммов Bifidobacterium bifidum ICIS-310 и Bifidobacterium longum ICIS-505 обладает выраженной иммунорегуляторной активностью, которую оценивали по способности консорциума изменять концентрацию провоспалительных (ИФН-γ, ФНО-α, ИЛ-6) и противовоспалительных(ИЛ-4, ИЛ-10) цитокинов - антипептидная активность (АПА) в среде культивирования бульон Шадлера (Schaedler Broth, «HiMedia», Индия) (Бухарин О.В., Перунова Н.Б., Чайникова И.Н., Смолягин А.И., Иванова Е.В. Антицитокиновая активность микроорганизмов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2011. №4. С. 56-61).

Соинкубирование супернатантов Bifidobacterium bifidum ICIS-310 и Bifidobacterium longum ICIS-505 каждого по отдельности и заявляемго консорциума проводили с рекомбинантными цитокинами («Sigma», ИФН-γ - 13265-1MG, ФНО-α - T6674-10UG, ИЛ-6 - I1395-10UG, ИЛ-4 - I4269-5UG, ИЛ-10 - I9276-5UG). Определение концентрации цитокинов в опытных и контрольных пробах проводили иммуноферментным анализом с использованием реагентов «Цитокин» (СП-б, Россия), учет результатов проводили на фотометре Multiskan Labsystems (Финляндия) при длине волны 492 нм. Антипептидную активность выражали в условных единицах инактивации цитокинов в опыте по сравнению с контролем (ед.) (Таблица 4).

Как видно таблицы 4 заявляемый консорциум штаммов Bifidobacterium bifidum ICIS-310 и Bifidobacterium longum ICIS-505 обладает более выраженной антипептидной активностью в отношении ФНОα, ИНФγ, ИЛ1-Ra и ИЛ-17 в сравнении с моноштаммами.

Авторами экспериментальнго установлено, что заявляемый консорциум штаммов Bifidobacterium bifidum ICIS-310 и Bifidobacterium longum ICIS-505 обладает высокой антиоксидантной активностью.

Об антиоксидантной активности судили по способности ингибировать аутоокисление адреналина in vitro и тем самым предотвращать образование активных форм кислорода. Антиоксидантную активность выражали в процентах ингибирования аутоокисления адреналина [Рябинина Е.И., Зотова Е.Е., Ветрова Е.Н. и др. Новый подход в оценке антиоксидантной активности растительного сырья при исследовании процесса аутоокисления адреналина // Химия растительного сырья. - 2011. - №3. - С. 117-121].

Антиоксидантная активность заявляемого консорциума штаммов Bifidobacterium bifidum ICIS-310 и Bifidobacterium longum ICIS-505 составляет 42,12%. Выявленная антиоксидантная активность свидетельствует о том, что консорциум: 1) обладает пробиотической активностью, оказывая протекторное действие на клетки человека в условиях действия активных форм кислорода; 2) характеризуется высокой устойчивостью к стрессовым факторам в условиях технологического процесса и организма хозяина, что обеспечивает высокую численность штамма в препарате, продукте или организме человека.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Получение консорциума.

1-й пассаж

Лиофилизированные штаммы монокультур Bifidobacterium bifidum ICIS-310 и Bifidobacterium longum ICIS-505 в количестве 0,1 г сухой биомассы (1 доза) каждый в отдельности вносят в среду бульон Шадлера (Schaedler Broth, «HiMedia», Индия) и титруют методом десятикратных разведений до 10^-7-8. Выращивают 48-72 ч при 37,5-38°С.

2-й пассаж

Выросшую культуру каждого из штаммов в объеме 5-10% вносят в среду накопления и раздельно культивируют в течение 16-18 ч при 37,5-38°С.

Затем биомассу каждого из штаммов смешивают в следующем соотношении: 2 ч. биомассы бифидобактерий Bifidobacterium bifidum ICIS-310 и 1 ч. биомассы Bifidobacterium longum ICIS-505.

Полученную совокупную биомассу в объеме 5-10% вносят в среду выращивания и культивируют при 37,5-38°С, регулируя процесс в течение 6-8 ч в ферментере. Получают консорциум в жидком виде. Содержание пробиотических микроорганизмов в полученной биомассе симбиотической ассоциации составляет не менее 1*10⁸ КОЕ/мл.

Пример 2. Получение лиофилизированного бактерийного препарата.

К консорциуму, приготовленному по примеру 1, добавляют защитные среды (сахарозожелатиновую, обезжиренное молоко), суспензию замораживают при температуре 40-45°С лиофилизируют.

Полученный препарат содержит в 1 г сухой биомассы не менее 1*10⁸ КОЕ/г.

Полученный лиофилизированный бактерийный препарат хорошо хранится при температуре 6-8°С без потери активности в течение одного года.

Пример 3. Получение жидкого концентрата бифидобактерий.

Консорциум, приготовленный по примеру 1, в объеме не более 5% вносят в казеиново-дрожжевую питательную среду в объеме 10 литров и культивируют термостатным способом в стеклянных бутылях при 37,5-38°С, без регулирования процесса по кислотности в течение 15-18 ч. Получают жидкий концентрат - закваску бифидобактерий консорциума, который может быть использован в качестве биологически активной добавки для самостоятельного применения или для обогащения неферментированных продуктов, детского питания и/или кормовых добавок.

Пример 4. Использование консорциума в составе закваски для приготовления кисломолочных продуктов.

Полученную биомассу консорциума, приготовленного по примеру 1, в объеме не более 5% (от объема молока) вносят в стерильное молоко и культивируют до образования сгустка, который разливают в емкости и охлаждают.

Пример 5. Использование консорциума для получения косметического средства.

Биомассу консорциума бифидобактерий, приготовленную по примеру 1, разрушают нагреванием в автоклаве или осуществляют мембранную фильтрацию. Полученные биологически активные компоненты охлаждают и смешивают с кремовой основой или мылом в соотношении 1:2-1:20 в зависимости от назначения изготовляемого крема или мыла.

Пример 6. Использование консорциума для производства обогащенной сухой детской молочной смеси.

Небольшое количество сухой молочной смеси тщательно перемешивают с сухим концентратом консорциума, приготовленным согласно примеру 2, с содержанием бифидобактерий не менее 1*10⁸ КОЕ/г из расчета не менее 100 г концентрата на 1 т сухой молочной смеси. Затем всю оставшуюся партию молочной смеси тщательно перемешивают с обогащенной сухой молочной смесью для достижения содержания бифидобактерий не менее 1*10⁷ КОЕ/г.

Пример 7. Использование консорциума для производства кормовой добавки в животноводстве и птицеводстве.

Для приготовления 100 кг биологически активной кормовой добавки сухой бактериальный концентрат консорциума бифидобактерий, полученный согласно примеру 2, с содержанием бифидобактерий не менее 1*10⁸ КОЕ/г добавляют в количестве 0,01% - 1% к массе основного корма и тщательно перемешивают.

Пример 8. Использование консорциума для производства зубной пасты.

Сухой бактериальный концентрат консорциума бифидобактерий, полученный согласно примеру 2, с содержанием бифидобактерий не менее 1*10⁸ КОЕ/г, вводят в состав зубной пасты из расчета 0,01 г бактериального концентрата на 100 г пасты.

Способность завляемого консорциума активно размножается в питательных средах с накоплением производственной биомассы, проявлять высокую антиоксидантную, иммуномодулирующую, антимикробную активность и кислотоустойчивость делает возможным его использование в приготовлении бактерийных препаратов, заквасок для приготовления жидкого концентрата бифидобактерий, биологически активных добавок, кисломолочных лечебно-диетических продуктов, продуктов детского питания, гигиенических и косметических средств. Изобретение обеспечивает расширение арсенала средств для приготовления бифидосодержащей продукции, используемой для коррекции микрофлоры организма человека.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен консорциум штаммов Bifidobacterium bifidum ICIS-310, коллекционный номер 1258 в ГКНМ ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора», и Bifidobacterium longum ICIS-505, коллекционный номер 1260 в ГКНМ ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора», обладающий антиоксидантной и иммуномодулирующей активностью, способностью роста в искусственных питательных средах и в молоке, обладающий антагонистической активностью по отношению к условно-патогенной и патогенной микрофлоре. Изобретение обеспечивает расширение арсенала средств для приготовления бифидосодержащей продукции, используемой для коррекции микрофлоры организма человека. 1 з.п. ф-лы, 4 табл., 8 пр.

1. Консорциум штаммов Bifidobacterium bifidum ICIS-310, коллекционный номер 1258 в ГКНМ ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора», и Bifidobacterium longum ICIS-505, коллекционный номер 1260 в ГКНМ ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора», используемый для приготовления бифидосодержащей продукции.

2. Консорциум по п. 1, отличающийся тем, что содержит вышеперечисленные штаммы в соотношении 2:1 соответственно.