КОНСОРЦИУМ БИФИДОБАКТЕРИЙ И ЛАКТОБАЦИЛЛ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ БАКТЕРИЙНЫХ ПРЕПАРАТОВ И БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫХ ДЛЯ КОРРЕКЦИИ МИКРОФЛОРЫ ДЕТЕЙ В ВОЗРАСТЕ ОТ 3-Х ДО 14 ЛЕТ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ, БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНАЯ ДОБАВКА К ПИЩЕ И БАКТЕРИАЛЬНЫЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ДИСБИОТИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА В ВОЗРАСТЕ ОТ 3-Х ДО 14 ЛЕТ Российский патент 2013 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 A23C9/12 A23L1/29 

Изобретение относится к медицине и биотехнологии и может быть использовано для приготовления лечебно-профилактических средств пробиотической направленности, предназначенных для коррекции дисбиотических нарушений микрофлоры желудочно-кишечного тракта и поддержания ее колонизационной резистентности у детей в возрасте от 3-х до 14 лет. Средства для профилактики и лечения конструируются преимущественно на основе двух групп микроорганизмов - бифидобактерий и лактобацилл. Бифидобактерий являются наиболее значимыми представителями микрофлоры человеческого организма - как по удельному весу в составе микробиоценоза, так и по их многофункциональной роли в поддержании гомеостаза организма. У детей на грудном вскармливании они составляют практически 100% микрофлоры толстой кишки. Бифидобактерий оказывают положительное воздействие на становление систем пищеварения, иммунитета, кроветворения ребенка. [1, 2, 3]. Бифидобактерий обеспечивают колонизационную резистентность в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов; обладают иммуномодулирующим действием;

синтезируют аминокислоты, витамины, летучие жирные кислоты, ферменты, участвующие в процессах пищеварения и обмена веществ; способствуют усвоению железа, кальция, поддержанию водно-солевого баланса. [4, 5] Частичная или полная элиминация бифидобактерий приводит к угнетению иммунных сил организма, развитию дисбиоза.

Многофакторное позитивное воздействие на организм ребенка позволяет рассматривать бифидобактерий как эффективный биокорректор и основу для создания препаратов, обладающих регулирующим и стимулирующим воздействием на организм.

В России традиционным подходом к бактериотерапии является назначение больным препаратов на основе культур штаммов бифидобактерий с доказанным пробиотическим действием преимущественно в виде монокультур штаммов Bifidobacterium bifidum 1, В. bifidum 791, В.bifidum ЛВА-3, B.longum B379M, B.adolescentis MC-42. Это, прежде всего, широко применяющийся лечебный препарат "Бифидумбактерин" [6].

При этом следует отметить, что в микробиоценозе кишечника человека бифидобактерий представлены одновременно многими видами - как отдельными, так и в ассоциациях [7]. Это позволяет предположить, что введение в состав пробиотических препаратов сразу нескольких видов бифидобактерий будет способствовать повышению их лечебной и профилактической эффективности.

Подобный подход предлагается в Российском патенте [8], касающемся консорциума на основе 9 штаммов бифидобактерий B.bifidum 791, В.bifidum ЛВА-3, B.longum B379M, B.longum Я-3, В.breve 79-119, B.breve 79-88, B.infantis 73-15, B.infantis 79-43, B.adolescentis Г7513.

Вместе с тем, указанный консорциум не учитывает, что рациональный подход к конструированию и применению новых средств коррекции микрофлоры должен основываться на таком явлении, как аутогенная сукцессия - последовательность смены биоценозов в определенной экологической нише [9, 10]. В ходе этого процесса в видовом сообществе происходит последовательное вытеснение одних видов другими вследствие их биоэкологических преимуществ в определенных условиях. При этом образуется так называемый сукцессионный ряд с образованием конечного - устойчивого биоценоза. Все биоценозы в живой природе развиваются по законам сукцессии. Что касается микроэкологии человеческого организма, данная закономерность прослеживается в смене видового состава бифидофлоры в процессе онтогенеза, совпадающей с критическими периодами развития в детском и подростковом возрасте: становлением иммунной и ферментативной систем, изменением гормонального фона, сменой пищевого рациона. В то же время, видовой состав бифидофлоры взрослых людей относительно стабилен [11, 12].

Таким образом, препараты должны представлять собой ассоциации доминирующих микроорганизмов, которые максимально приближены по составу к естественному микробиоценозу желудочно-кишечного тракта человека в определенный возрастной период. Это является обоснованным подходом, обеспечивающим индивидуализацию бактериотерапии и повышение ее эффективности, способствуя устойчивой локализации или новому заселению биотопа теми видами бифидобактерий, которые преобладают в микробиоценозе конкретного человека.

Помимо бифидобактерий. в биопрепаратах-пробиотиках широко используются лактобациллы. Эти микроорганизмы обладают высокой антагонистической активностью против широкого спектра патогенных и условно-патогенных микробов, стимулируют неспецифическую резистентность организма человека, обладают выраженным воздействием на ферментативную систему. Обладая бета-галактозидазной активностью, нивелируют лактазную недостаточность, которая особенно часто встречается у детей первого года жизни. Применение метода совместного культивирования требует анализа межштаммовых взаимодействий микроорганизмов в условиях in vitro [13]. Пригодными для совместного культивирования считают биосовместимые штаммы, т.е. штаммы, взаимоотношения которых расцениваются как симбиоз.

Совместное культивирование двух и более видов лактобацилл повышает их технологичность и расширяет спектр функциональной активности.

Проведенные эксперименты по изучению биосовместимости различных штаммов, позволили выделить группу лактобацилл, наиболее перспективных в отношении совместного культивирования. Наибольший интерес из этой группы лактобактерий представляют штаммы L. helveticus К₃Ш₂₄, L. helveticus NK-1 и L.casei KHM-12. Они обладают выраженным антагонизмом по отношению к условно-патогенным микроорганизмам и устойчивостью к спектру антибактериальных средств. Кроме того, установлена высокая степень биосовместимости этих штаммов, что определило целесообразность их совместного культивирования [14].

Известен Патент РФ №2180348 «Консорциум бифидобактерий и лактобацилл, используемый для приготовления бактериальных препаратов, заквасок для кисломолочных продуктов, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, биологически активных добавок, предназначенных для коррекции микрофлоры детей в возрасте от 3-х до 12-ти лет» [15].

В данном патенте предлагается консорциум бифидобактерий и лактобацилл следующего состава: Bifidobacterium bifidum 1, B.bifidum 791, В. breve 79-88, B.infantis 79-43, B.longum B379M, Lactobacillus plantarum 8-PA-3, L.fermentum 90-TC-4, Lactobacillus acidophilus К3 ш24.

Характеризуя Патент РФ [15], следует отметить, что недостатком способа получения консорциума, заявленного в нем, является то, что он получается путем объединения инокулятов культур отдельных штаммов бифидобактерий в равных долях, последующим добавлением к нему инокулятов культур лактобацилл в соотношении 10:1 и совместному культивированию в питательной среде в течение 10-12 часов в ферментере или 18-20 часов в стационарных условиях при температуре 37-38°С.

В настоящее время для изучения таксономии представителей микробиоты, в том числе бифидобактерий и лактобацилл, разработаны и широко применяются различные молекулярно-генетические методы, включая секвенирование, мультилокусное генотипирование и другие, что существенно пополнило наши представления о видовом многообразии этих бактерий, позволило реклассифицировать известные и выявить новые виды [16, 17]. Это тесным образом связано с разработкой новых пробиотических препаратов, обладающих иммуномодулирующим действием, широким набором свойств, определяющих метаболическую и антагонистическую активность.

Так, изучение вышеперечисленных штаммов молекулярно-генетическими методами показало несоответствие в видовой принадлежности некоторых штаммов, идентифицированных ранее с помощью биохимических тестов. Так, штамм L. fermentum 90-TC-4 показал себя, как L.plantarum. Штамм B.bifidum 1, широко используемый в производстве пробиотиков, оказался природным рекомбинантом, состоящим из двух клонов: B.bifidum и В.breve. Данная информация говорит о необходимости новых подходов к конструированию мультипробиотических препаратов.

Изучение видового состава бифидофлоры детей старше 3 лет на основе амплификации и секвенирования фрагментов двух генов: 16S рибосомальной РНК (16S) и трансальдолазы (tal) показало, что вид B.infantis отсутствует в микробиоценозе ЖКТ детей. Вид В. breve присутствует в микробиоценозе данной возрастной группы, но при этом данные разных авторов варьируют от 17% до 70% [18, 19]. Виды B.bifidum и В. longum являются преобладающим в микробиоценозе ребенка [20]. Есть наблюдения о высокой частоте выделения видов B.catenulatum и B.pseudocatenulatum - от 72% [20] до 90% [18]. Вместе с тем, по мнению ряда авторов, эти виды ассоциируются с атопической экземой у детей [21, 22]. Reiter [23] причисляет их к подвидам B.adolescentis, который нехарактерен для микробиоценоза детей. Такие виды нефизиологичны для детей и не могут быть использованы в составе средств коррекции микрофлоры данной возрастной группы.

Представленные данные убедительно показывают, что для эффективной коррекции дисбиотических нарушений микробиоценоза детей данной возрастной группы в состав препарата должны входить штаммы с доказанным пробиотическим эффектом и в видовом отношении комплементарных бифидофлоре детей. Важное значение имеет включение в состав средства коррекции микрофлоры штаммов, выделенных от здоровых детей в настоящий период времени, т.к. большинство производственных штаммов имеют происхождение 50-ти и более лет.

Это относится к всесторонне изученным и запатентованным штаммам бифидобактерий, выделенным от здоровых детей на штамм В. breve OV-12 [24], штамм В. bifidum OV-19 [25], штамм В. longum OV-20 [26]. Штамм В. breve OV-12 отличается более высокой антагонистической активностью к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, чем штаммы В. breve 79-88 и В. breve 79-119. Патент РФ №2373274 на штамм В. breve OV-12 отмечендипломом, как вошедший в 100 лучших изобретений 2011 года под №39. Штамм В. longum OV-20 отличается широким спектром антибиотикорезистентности. Штамм В. bifidum OV-19 обладает устойчивым генотипом, в отличие от штамма В. bifidum 1, который является природным рекомбинантом.

Задачей настоящего изобретения является создание консорциума бифидобактерий и лактобацилл, по составу максимально приближенного к микробиоценозу детей в возрасте от 3-х до 14 лет лет, а также разработкой способа его получения, учитывающего биосовместимость штаммов в процессе культивирования и при дальнейшем хранении.

Техническим результатом настоящего изобретения является тот факт, что заявляемый консорциум является высокотехнологичным, накапливает биомассу на питательных средах в короткие сроки с высокой концентрацией пробиотических микроорганизмов, обладает кислотообразующими и антагонистическими свойствами в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры. Синергидный эффект совместного использования штаммов в консорциуме проявляется в повышении всех перечисленных свойств по сравнению с отдельными штаммами.

Предлагаемый консорциум имеет следующий видовой состав:

Консорциум бифидобактерий и лактобацилл для препаратов и БАД, предназначенных для для детей от 3-х до 14 лет:

1. Bifidobacterium bifidum OV-19 - ГКНМ МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского №216, выделен из содержимого кишечника здорового ребенка. RU 2375444

2. Bifidobacterium В.bifidum 791- ВНИИгенетика в ЦМПМ №В-3300, ГКНМ МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского №80, выделен из содержимого кишечника здорового ребенка.

3. Bifidobacterium longum В379М- ВНИИгенетика в ЦМПМ №…, ГКНМ МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского №79., выделен из содержимого кишечника здорового человека.

4. Bifidobacterium longum OV-20 - ГКНМ МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского №214, выделен из содержимого кишечника здорового человека. RU 2375445

5 Bifidobacterium breve OV-12 - ГКНМ МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского №217, выделен из содержимого кишечника здорового ребенка. RU 2373274

6. Lactobacillus helveticus К₃Ш₂₄ - ГКНМ МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского №42, выделен из содержимого кишечника здорового человека, ВНИИгенетика №ВКПМ В-3190.

7. Lactobacillus helveticus NK-1 - ГКНМ МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского №54, выделен из содержимого кишечника здорового человека.

8. Lactobacillus casei KHM-12 - ГКНМ МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского №12, выделен из молочного продукта.

Задачей настоящего изобретения является также разработка определенной схемы совместного культивирования отдельных культур для получения консорциума.

Техническим результатом предлагаемой схемы культивирования отдельных штаммов для получения консорциума является отсутствие взаимного ингибирования штаммов и расширение спектра ферментативной и антагонистической активности.

Способ получения консорциума основан на предварительном изучении и подборе для совместного культивирования штаммов по принципу биосовместимости и с учетом кинетики роста каждого из них.

Алгоритмом к созданию консорциума бифидобактерий и лактобацилл является совместное культивирование определенных штаммов с учетом длительности экспоненциальной фазы роста каждого из них и численного соотношения в микробиоценоза кишечника бифидобактерий и лактобацилл, на основании чего определяется временная точка засева питательной среды при поэтапном внесении инокулятов монокультур.

По оптическому стандарту мутности устанавливают концентрацию ОЕ/мл, соответствующую 1 млрд клеток бифидобактерий. Лактобациллы, являясь микроаэрофиллами, поглощая остаточный кислород из среды, создают благоприятные условия для развития бифидобактерий. По оптическому стандарту мутности устанавливают концентрацию ОЕ/мл, соответствующую 1 млрд клеток. При подборе дозы инокулята необходимо учитывать также соотношение бифидобактерий и лактобацилл в микробиоценозе человека (100:1) и более высокую кинетику роста лактобацилл.

Посев каждой из культур бифидобактерий в ферментер, по 2% к объему среды культивирования, проводят поэтапно, с периодичностью в 30 минут, коррегируя рН культуральной жидкости 20% NaOH перед засевом нового штамма до 6,8. При засеве лактобацилл % инокулята составляет 0,1%; рН среды перед засевом должен быть более кислым - 6,0.

Очередность внесения инокулята для получения данного консорциума является следующей:

1) Bifidobacterium bifidum OV-19 - 2%;

2) Bifidobacterium bifidum 791 - 2%:

3) Bifidobacterium longum OV-20 - 2%;

4) Bifidobacterium longum B379M - 2%;

5) Bifidobacterium breve OV-12 - 2%;

6) Lactobacillus helveticus К₃Ш₂₄ - 2%;

7) Lactobacillus casei KHM-12 - 0,1%;

8) Lactobacillus helveticus NK-1 - 0,1%.

Консорциум культивируют при 37°C при периодическом перемешивании в течение 8-10 часов; рН культуральной жидкости после окончания процесса составляет 3,9-4,3.

Культурально-морфологические признаки консорциума.

Клетки представляют Грам+ полиморфные палочки: бифидобактерии расположенны преимущественно в виде скоплений; в стационарной фазе роста часто отмечаются клетки с раздвоениями на концах или булавовидными утолщениями. Лактобациллы - цепочками из крупных клеток с закругленными концами.

При выращивании в ферментере в экспоненциальной фазе роста при микроскопии культура имеет вид ровных палочек разной величины, расположенных цепочками или скоплениями.

В полужидких питательных средах биомасса консорциума бифидобактерии и лактобацилл растет по всему объему питательной среды, кроме зоны аэробиоза. Морфология колоний неоднородна и зависит от входящих в консорциум штаммов, сохраняя признаки каждого из них в совокупной культуре.

Физиолого-биохимические признаки микроорганизмов, входящих в консорциум.

Бифидобактерии - облигатные анаэробы, лактобациллы -микроаэрофиллы. На агаризованной поверхности образуют прозрачные колонии. Оптимальная температура выращивания составляет 37,0-38°С, рН питательных сред 7,2-7,4. Каталазу не образуют, желатин не разжижают, газообразование отсутствует.Сбраживают глюкозу с образованием кислоты без образования газа, закисляя среду выращивания до рН 4,3-5,1.

Результаты культивирования монокультур бифидобактерий и лактобацилл и их совместного культивирования представлены в таблице 1.

Таблица 1 Сравнительные данные культивирования монокультур и консорциума бифибактерий и лактобацилл Наименование культуры совместное культивирование раздельное культивирование   Число КОЕ/ мл °T Число КОЕ/ мл °T В. bifidum OV-19 1,6±0,1×10⁹ - 1,7±0,2×10⁹ 90° В. bifidum 791 1,5±0,3×10⁹ - 1,8±0,1×10⁹ 100° B.longum B379 1,1±0,2×10⁹ - 1,5±0,3×10⁹ 120° B.longum OV-20 1,5±0,3×10⁹ - 1,8±0,4×10⁹ 120° В. breve OV-12 1,5±0,3×10⁹ - 1,8±0,4×10⁹ 120° L. helveticus К₃Ш₂₄ 1,0±0,1×10⁹ - 1,1±0,1×10⁹ 40° Lhelveticus NK-1 0,3±0,2×10⁹ - 0,4±0,1×10⁹ 180° L.casei KHM-12 0,1±0,1×10⁹ - 0,1±0,1×10⁹ 170° Консорциум 8,6±0,2×10⁹ 210° - -

Консорциум возможно культивировать на различных питательных средах со стабильно высокими показателями КОЕ/мл пробиотических микроорганизмов и продуцируемых органических кислот (таблица 2).

Таблица 2 Результаты культивирования консорциумов на разных питательных средах Среда выращивания Консорциум бифидобактерий и лактобацилл Число КОЕ/мл °T Блаурокка 7,6±0,6×10⁹ 200° Гидролизатно-молочная 6,9±0,2×10⁹ 190° Среда для культивирования бифидобактерий и лактобацилл согласно изобретению 8,2±0,3×10⁹ 210°

Как видно из результатов, представленных в таблицах 1 и 2, не происходит взаимного ингибирования культур. При этом отмечается тенденция к синергидному эффекту.

Наиболее перспективной в производстве препаратов и БАД для детей является гидролизатно-молочная среда. В настоящее время среди детей широко распространена непереносимость коровьего молока. Данная среда гипоаллергенна, так как ее основой является гидролизат молока, состоящий из низкомолекулярных пептидов и аминокислот, которые легко усваиваются детским организмом. Среда, изготовленная на основе гидролизата молока, имеет следующий состав (в расчете на 100 л):

Таблица 3 Состав гидролизатно-молочной среды Гидролизат молока 50 л Цистеин солянокислый 20 г Лактоза 1000 г Пептон ферментативный 200 г Агар-агар микробиологический 100 г Хлористый натрий 400 г Вода водопроводная очищенная до 100 л

Среда проста в приготовлении, экономически выгодна; вместе с тем, как видно из результатов, представленных в таблице 2, по ростовым свойствам уступает остальным средам.

Для устранения данного недостатка в нее были дополнительно включены добавки, стимулирующие рост пробиотических микроорганизмов - пребиотики инулин и олигофруктоза и дрожжевой аутолизат, содержащий витамины группы В, необходимые для их развития и аскорбиновая кислота, как антиоксидант. Состав усовершенствованной таким образом среды представлен в таблице 4.

Таблица 4 Состав заявляемой среды (в расчете на 100 л): Гидролизат молока 50 л Аутолизат дрожжей 500 г Цистеин солянокислый 20 г Лактоза 1000 г Пептон ферментативный 200 г Агар-агар микробиологический 100 г Хлористый натрий 400 г Аскорбиновая кислота 250 г Инулин 500 г Олигофруктоза 500 г Вода водопроводная очищенная до 100 л

При изучении ростовых свойств заявляемой среды было показано, что они превосходят ростовые свойства гидролизатно-молочной среды, т.е. желаемый результат был достигнут. Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5 Сравнительные результаты культивирования консорциумов на гидролизатно-молочной и заявляемой средах Среда выращивания Консорциум бифидобактерий и лактобацилл Число КОЕ/мл °Т Гидролизатно-молочная 7,9±0,2×10⁹ 180° Заявляемая среда 8,8±0,3×10⁹ 210°

Таким образом, заявляемая среда является перспективной в производстве препаратов и БАД для детей данной возрастной группы.

Синергидный эффект, который был отмечен при культивировании консорциума, проявляется также при определении спектра биохимической активности.

В качестве иллюстрации в таблице 6 представлено, как расширяется спектр ферментативной активности штаммов при совместном культивировании - увеличивается число усвоенных субстратов.

Таблица 6 Ферментативная активность штаммов при раздельном и совместном культивировании по данным ANAEROtest-23 Активный ингредиент B.bifdum 791 B.bifdum OV-19 B.longum B 379M B.longum OV-20 B.breve OV-12 L.casei КНМ-12 L.helveticus NK-1 L.helveticus К3Щ24 Консорциум L-рамноза 0 ± 0 0 0 ± 0 0 + Дульцитол 0 0 0 0 0 0 ± 0 + Эритрол 0 0 0 0 0 0 ± 0 ± D-галактоза + + + + + + + + + D-глюкоза + + + + + + + + + D-фруктоза + 0 + + + + + + + D-лактоза + 0 + + + + + + + D-сахароза 0 0 + 0 + + + + + D-мальтоза 0 0 + 0 + + 0 + + D-раффиноза ± 0 + + ± ± ± ± + L-арабиноза ± 0 + ± ± + ± ± + D-ксилоза ± 0 0 ± 0 ± ± ± ± Салицин 0 0 0 0 0 0 0 + + D-целлобиоза 0 0 0 0 0 + 0 ± + D-манноза 0 0 0 0 0 + + ± + D-трегалоза ± 0 0 0 0 + + + +

D-мелецитоза 0 0 0 0 0 + + + + Инулин 0 0 0 0 0 0 0 0 0 D-манит 0 0 0 0 0 0 0 + + D-сорбитол 0 0 + + 0 + 0 ± + Инозит 0 0 0 0 0 0 0   +

Синергидный эффект консорциума проявляется также в большей антагонистической активности консорциума по сравнению с монокультурами, что повышает пробиотическую значимость препарата. Данный эффект можно наблюдать по зонам задержки роста тест-культур (табл.7).

Таблица 7 Зоны задержки роста тест-культур (в мм) в присутствии консорциума и отдельных штаммов бифидо- и лактобактерий Объект исследования Sh. sonnel 5063 Sh. flexneri l70 E..coli 157 Staph. aureus 209 Proteus vulgaris 177 В. bifidum OV-19 19±2 16±1 17±3 14±2 18±2 В. bifidum 791 17±3 15±2 15±3 15±1 17±2 В. longum В379М 24±2 20±2 23±2 18±3 26±3 В. longum OV-20 25±2 23±1 25±2 24±3 25±2 B.breve OV-12 29±2 25±2 27±3 25±3 31±1 L. helveticus К₃Ш₂₄ 18+1 19+3 20±1 27±2 21±2 L.acidophilus NK-1 27±4 29±1 29±3 22±1 30±2 L.casei KHM-12 28±2 25±4 31±3 30±3 31±1 Консорциум бифидо- и лактобактерий 34±2 31±2 33±3 31±2 35±1

Как показывают данные, представленные в таблице 7, по антагонистической активности в отношении тест-штаммов патогенных микроорганизмов консорциум превосходит отдельные штаммы, входящие в его состав.

Таким образом, полученные результаты говорят не только о возможности совместного культивирования различных видов бифидобактерий и лактобацилл, но и синергидном эффекте консорциума штаммов, что позволяет решить сложную биотехнологическую задачу получения многокомпонентных пробиотических препаратов, имеющих определенный состав и назначение.

В предлагаемом консорциуме помимо определенного видового состава бифидобактерий и лактобацилл, отмечается определенное количественное соотношение микробных культур после культивирования. Количественный учет долевого участия отдельных штаммов производится путем подсчета числа колоний, выросших в полужидкой среде. Культура каждого штамма имеет колонии определенной морфологии и размера, что позволяет их различать. Соотношение отдельных видов бифидобактерий и лактобацилл в консорциуме представлено в таблице 8.

Таблица 8 Соотношение отдельных видов бифидобактрий и лактобацилл в консорциуме №п/п Штамм микроорганизма Число КОЕ/г Массовая доля микроорганизмов, % 1. В. bifidum OV-19 10⁹-10¹⁰ 18,0-20,0 2. В. bifidum 791 10⁹-10¹⁰ 20,0-18,0 3. В. longum B379M 10⁹-10¹⁰ 14,5-12,0 4. В. longum OV-20 10⁹-10¹⁰ 23,5-23,0 5. В. breve OV-12 10⁹-10¹⁰ 24,0-27,0 6. L. helveticus К₃Ш₂₄ 10⁸-10⁹ 3,0-3,5 7. L. helveticus NK-1 10⁸-10⁹ 3,0-3,5 8. L. casei КНМ-12 10⁸-10⁹ 3,0-3,5

При составлении рецептуры препаратов для коррекции микрофлоры необходимо учитывался тот факт, что наиболее целесообразным является сочетанное использование консорциума пробиотических микроорганизмов совместно с пребиотиками инулином и олигофруктозой, стимулирующими рост как индигенной, так и микрофлоры, входящей в состав препарата. Кроме того, пребиотики, инкапсулируя микробные клетки, защищают их при прохождении желудочно-кишечного тракта от агрессивного действия окружающей среды. Техническим результатом данного изобретения является использование консорциума в качестве активного вещества в сочетании с пребиотиками - инулином и олигофруктозой. Присутствие питательных субстратов способствует эффективной колонизации биотопа. Сахаролитические микроорганизмы, увеличивая при этом продукцию органических кислот, способствуют лучшему усвоению кальция, железа, магния. Помимо этого, инулин ускоряет очищение организма от шлаков и непереваренной пищи вследствие стимулирования сократительной способности кишечной стенки, отмечается хороший слабительный эффект, он оказывает антитоксическое и защитное действие. Инулин обладает «обволакивающим действием», защищая слизистые оболочки желудка и частично кишечника от механического раздражения пищей. Использование диеты с добавлением инулина ингибирует развитие опухолей и уменьшает в кишечнике количество аммиака, повышенная концентрация которого способствует росту опухолей. Инулин улучшает углеводный и липидный метаболизм и нормализует уровень сахара в крови у больных сахарным диабетом. Олигофруктоза обладает выраженным желчегонным действием, которое усиливается в связи с облегчением оттока желчи из печени и желчного пузыря в двенадцатиперстную кишку, обусловленным улучшением опорожнения кишечника.

Помимо описанных эффектов данные ингредиенты обладают высокой сорбционной емкостью.

Еще одним вариантом рационального подхода к коррекции дисбиотических состояний является сочетанное применение микронутриентов и пробиотических микроорганизмов. При введении в организм человека такого комплекса происходит восполнение нарушенной индигенной микрофлоры. Пробиотическая микрофлора повышает биодоступность микронутриентов и снижает дефицит витаминов и минералов. Это, в свою очередь, должно способствовать более эффективному восстановлению индигенной микрофлоры и метаболитного баланса в организме.

Примеры

1. Консорциум бифидобактерий и лактобацилл для нормализации микрофлоры желудочно-кишечного тракта детей от 3-х до 14 лет и способ его получения

1-й пассаж - лиофилизированный материал штаммов В.bifidum OV-19, В.bifidum 791, В.longum В379М, В.longum OV-20, В.breve OV-12, L. helveticus К₃Ш₂₄, L.casei KHM-12, L.helveticus NK-1 по отдельности регидратируют физиологическим раствором в объеме 1 мл и титруют методом десятикратных разведении в питательной среде до 10^7-8. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 36 ч.

2-й пассаж - каждую из выросших культур из разведения 10^6-8 в объеме 3% вводят в среду накопления заявляемого состава (30 мл) и культивируют 7 ч при 37-38°С.

3-й пассаж- каждую из выросших культур засевают в заявляемую полужидкую среду и выращивают в течение 17 ч при 37-38°С.

Выращивание консорциума.

Консорциум бифидобактерий получается путем совместного культивирования вышеперечисленных штаммов. Для этого подбирают строго количественное соотношение посевного материала каждого из штаммов согласно разработанной схеме. По оптическому стандарту мутности устанавливают концентрацию ОЕ/мл, соответствующую 1 млрд клеток бифидобактерий.

Процесс культивирования ведут 9 ч при 37-38°С.

Состав среды выращивания (в расчете на 100):

Гидролизат молока 50 л Аутолизат дрожжей 500 г Цистеин солянокислый 20 г Лактоза 1000 г Пептон ферментативный 200 г Агар-агар микробиологический 100 г Хлористый натрий 400 г Аскорбиновая кислота 250 г Инулин 500 г Олигофруктоза 500 г Вода водопроводная очищенная до 100 л

2. Биологически активная добавка к пище для детей от 3-х до 14 лет и способ ее получения

БАД изготавливают на основе консорциума сухой биомассы бифидобактерий и лактобацилл с добавлением функционально значимых ингредиентов.

Выращивание консорциума.

1-й пассаж - лиофилизированный материал штаммов В.bifidum OV-19, В.bifidum 791, В.longum B379M, В. longum OV-20, В.breve OV-12, L.helveticus К₃Ш₂₄, L.casei KHM-12, L.helveticus NK-1 по отдельности регидратируют физиологическим раствором в объеме 1 мл и титруют методом десятикратных разведении в питательной среде до 10. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 36 ч.

2-й пассаж.- каждую из выросших культур из разведения 10^6-8 в объеме 3% вводят в среду накопления (30 мл) и культивируют 7 ч при 37-38°С.

3-й пассаж - каждую из выросших культур засевают в питательную полужидкую среду и выращивают в течение 17 ч при 37-38°С.

Консорциум бифидобактерий и лактобацилл получают путем совместного культивирования вышеперечисленных штаммов. Для этого подбирают строго количественное соотношение посевного материала каждого из штаммов в соответствии. По оптическому стандарту мутности устанавливают концентрацию ОЕ/мл, соответствующую 1 млрд клеток бифидобактерий. Посев культур в ферментер проводят поэтапно, с периодичностью в 30 минут по разработанной схеме, коррегируя рН культуральной жидкости 20% NaOH перед засевом нового штамма до 6,0. Процесс культивирования ведут 8 ч при 37-38°С.

К выращенной биомассе добавляют защитную сахарозо-желатиновую среду и обезжиренное 10%-ное молоко по 10% к объему биомассы бифидобактерий и лиофильно высушивают.

Техническиским результатом, достигаемым при получении биологически активной добавки с использованием заявляемого консорциума, является более эффективная и быстрая коррекция микрофлоры ЖКТ детей.

После помола биомассу смешивают с витаминно-минеральным премиксом, инулином, олигофруктозой и фасуют в капсулы по 0,25 г, по 20-60 штук в стерильные пластиковые баночки с герметично закрывающимися крышками. Банка вкладывается в картонный пенал вместе с инструкцией по применению.

Рецептура биологически активной добавки представлена в таблице 9 (а, б).

а) Рецептура БАД к пище для детей до 3-х лет (состав 1 упаковки 25

Таблица 9 №п/п Наименование сырья (материала) Масса, г (кол-во, шт.) 1. Сухая биомасса консорциума бифидо- и лактобактерий 4,5 2. В итаминно-минеральный премикс 1,5 3. Инулин 3,0 4. Олигофруктоза 3,0

б) Соотношение частей сырья по массе в одной ложечке (0,5 г)

Наименование сырья Масса в кг Сухая биомасса консорциума бифидо- и лактобактерий 0,1 Инулин 0,05 Олигофруктоза 0,05 Витаминно-минеральный премикс 0,05 Итого: 0,5 г

Процентное соотношение ингредиентов в 1 капсуле:

Биомасса консорциума бифидо- и лактобактерий - 40% Инулин- - 20% Олигофруктоза - 20% Витаминно-минеральный премикс - 20%

Таблица 10 Состав витаминно-минерального премикса в пересчете на одну дозу (0,5 г) БАД: компонент Содержание витаминов и минералов в готовом БАД (мг в Суточное поступление (мг, в 2-х ложках-дозах) % от рекомендуемого суточного уровня поступления детей

  1 ложке-дозе)   1-3 лет Витамин Е 1.65 3,3 66 Витамин В 1 275 мкг 550 мкг 69 Рибофлавин 0,31 0,62 69 Витамин В6 0,36 0,72 80 Витамин В12 195 мкг 390 мкг 39 Фолиевая кислота 51,5 мкг 130 мкг 130 Пантотеновая кислота 1,71 3,42 171 Ниацинамид 2.97 5,94 59 Биотин 25 мкг 50 мкг 625 Витамин С 11.7 23,4 52 Цинк 2.25 4,5 45 Селен 8,5 мкг 17 мкг 31 ** Витаминно-минеральный премикс "CustoMix IMMUNITY" изготавливается компанией "DSM Nutritional Products Europe Ltd"(CH - 4002 Basel),для использования в пищевой промышленности для обогащения пищевых прдуктов. Свидетельство о государственной регистрации №77.99.11.9.У.2471.9.04 от 07.09.2004 года

3. Бактериальный препарат для лечения дисбиотических состояний ЖКТ у детей от 3 до 14 лет и способ его производства 1-й пассаж - лиофилизированный материал штаммов В.bifidum OV-19, В.bifidum 791, В.longum B379M, В.longum OV-20, В.breve OV-12, L..helveticus К₃Ш₂₄, L.casei KHM-12, L.helveticus NK-1 по отдельности регидратируют физиологическим раствором в объеме 1 мл и титруют методом десятикратных разведении в питательной среде до 10^7-8. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 24 ч.

2-й пассаж - каждую из выросших культур из разведения 10^6-8 в объеме 3% вводят в заявляемую среду накопления (30 мл) и культивируют 7 ч при 37-38°С.

3-й пассаж - каждую из выросших культур засевают в заявляемую полужидкую среду и выращивают в течение 17 ч при 37-38°С.

Выращивание консорциума.

Консорциум бифидобактерий получается путем совместного культивирования вышеперечисленных штаммов. Для этого подбирают строго количественное соотношение посевного материала каждого из штаммов согласно разработанной схеме. По оптическому стандарту мутности устанавливают концентрацию ОЕ/мл, соответствующую 1 млрд клеток бифидобактерий.

Процесс культивирования ведут 10 ч при при 37-38°С. Состав среды выращивания (в расчете на 100):

Гидролизат молока 50 л Аутолизат дрожжей 500 г Цистеин солянокислый 20 г Лактоза 1000 г Пептон ферментативный 200 г Агар-агар микробиологический 100 г Хлористый натрий 400 г Аскорбиновая кислота 250 г Инулин 500 г Олигофруктоза 500 г Вода водопроводная очищенная до 100 л

Процесс культивирования ведут 10 ч при при 37-38°С. К выращенной комплексной биомассе бифидобактерий и лактобацилл добавляют защитную сахарозо-желатиновую среду и обезжиренное 10%-ное молоко по 10% к объему биомассы, разливают в асептических условиях по 5 мл в стеклянные пенициллиновые флаконы и лиофильно высушивают.

Техническим результатом, достигаемым при получении бактериального препарата с использованием заявляемого консорциума в качестве активного вещества, является более эффективная и быстрая коррекция дисбиотических нарушений ЖКТ детей в возрасте от 3-х до 14 лет.

*Содержание КОЕ/г бифидобактерий и лактобацилл в готовом препарате не менее 10⁸.

Список цитируемой литературы

1. Mitsuoka Т. Intestinal Flora and Host. // Asian. Med. J. - 1989 - V.31. - N7. - P.400-409.

2. Гончарова Г.И., Лянная A.M., Козлова Э.П., Семенова Л.П. Роль бифидофлоры в повышении устойчивости организма к инфекции. // В сб. материалов международной конференции «Гнотобиология в теоретической и практической медицине». - М., - 1987. - С.62.

3. Шендеров Б.А. Микрофлора пищеварительного тракта - важнейший фактор поддержания микроэкологического гомеостаза хозяина. // Клиническое питание. - 2005. - №2. - С.2-5.

4. Гончарова Г.И. Бифидофлора человека, ее защитная роль в организме и обоснование сфер применения препарата бифидумбактерин // Автореф.дис…д-рабиол..наук. - M., - 1982. - 48С.

5. Шендеров Б.А. Функциональное питание и его роль в профилактике метаболического синдрома // М.: Дели принт. - 2008. - С.317.

6. Гончарова В.В. Изучение бифидобактерий, разработка препарата «сухой бифидумбактерин» и его эффективность при кишечных заболеваниях детей первого года жизни. // Автореф.дисс…канд.биол.наук. - М.: 1970. - С.15.

7. Mitsuoka Т., Hayakawa К., Kimura N.. The fecal flora of man. II. Communication: the composition of bifldobacterium flora of different age groups. // Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. 1 Abt. Orig. - A 1974. - V.226 / - P.469-478.

8. Патент РФ №2196174.

9. Сукачев В.Н., Дылиса Н.В. Лесной биогеоценоз // М.: Наука. - 1964. - С.574.

10. Рыбальченко О.В., В.М.Бондаренко, Добрица В.П. Атлас ультраструктуры микробиоты кишечника человека. // С-Петербург. - 2008. - С.109.

11. Бифидобактерии и их использование в клинике, медицинской промышленности и сельском хозяйстве. // Сб. научных трудов. - М., - 1986. - С.208.

12. Леванова Л.Л., Алешкин В.А., Воробьев А.Л., и др. Возрастные особенности микробиоценоза кишечника у жителей г.Кемерово. // Журн. Микробиол. - 2001. - №3. - С.72-75.

13. Глушанова Н.А., Шендеров Б.А. Взаимоотношения пробиотических и индигенных лактобацилл в условиях совместного культививрования in vitro. // Журнал микроб., эпидемиол., и иммунобиол. - 2005. - №2. - С.56-61.

14. Lewis J.D.N. et al. Development of an ELISA to detect Lactobacillus casei Shirota in human stool samples. // Brit. J. Nutr. - 2002. - V.88. - N.3 (suppl). - P.S113-S114.

15. Патент РФ №2180348 «Консорциум бифидобактерий и лактобацилл, используемый для приготовления бактериальных препаратов, заквасок для кисломолочных продуктов, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, биологически активных добавок, предназначенных для коррекции микрофлоры детей в возрасте от 3-х до 12-ти лет». Заявка №2001111552 от 28.04.2001 г. Опубл. 10.03.2002 г.

16. Карзанова М.В., Воронина О.Л., Лунин В.Г., Жиленкова О.Г., Амерханова A.M. Определение видовой принадлежности штаммов бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы. // Сборник докладов Россельхозакадемии. - М., - 2006. - №5. - С.9-12.

17. Namba К., Hatano М. at all. Method of detecting Bifidobacterium infantis // United States Patent.- Prior Publication data 14.12.2006. - 22 P.

18. Matsuki Т. et al. Use of 16S rRNA-genr-targeted group-specific primers for reai-time PCR analysis of predominant bacteria in human feses.// Appl.Environ.Microbiol. - 2004. - 70 (12). - 7220-7228.

19. Жиленкова О.Г.Селекция производственно перспективных штаммов бифидобактерий, выделенных от детей // Автореф. дисс…канд.биол.наук, Москва, 2011. С.16.

20. Шкопоров А.Н., Кафарская Л.И., Афанасьев С.С. и др. Молекулярно-генетический анализ видового и штаммового разнообразия бифидобактерий у детей раннего возраста. // Вестник Российской АМН. - 2006. - №1. - С.45-50.

21. Smehilova M., Vilkova E., Nevoral J. Comparison of intestinal microflora in healthy infants and infants with allergic colitis. Folia Microbiol (Praha) 2008. - 53(3). - P.255-258

22. Ezendam J., de Klerk A., Gremmer E.R., van Loveren H. Effects of Bifidobacterium animalis administered during lactaion on allergic and autoimmune responses in rodents. // Clinical and Experimental Immunology. - 2008. - V.154. - P.424-155.

23. Reuter G The Lactobacillus and Bifidobacterium microflora of the human intestine: Composition and succession. Current Issues in Intestinal Microbiology 2001. - V.2(2). - P.43-53.

24. Патент РФ №2373274 от 20.11.2009. Штамм Bifidobacterium breve OV-12, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств. Заявка №2008128539 от 15.07.2008.

25. Патент РФ №2375444 от 10.12.2009. Штамм Bifidobacterium bifidum OV-19, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств. Заявка №2008128540 от 15.07.2008.

26. Патент РФ №2375445 от 10.12.2009. Штамм Bifidobacterium longum OV-20, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств. Заявка №2008128542 от 15.07.2008.

Консорциум бифидобактерий и лактобацилл содержит Bifidobacterium bifidum 19, В.bifidum 791, В.longum B379M, В.longum OV-20, В.breve OV-12, L.helveticus КЗШ24, L.helveticus NK-1, L.casei KHM-12, используется для приготовления бактерийных препаратов, биологически активных добавок, предназначенных для коррекции микрофлоры детей в возрасте от 3-х до 14 лет. Консорциум высокотехнологичен, накапливает биомассу на питательных средах в короткие сроки с высокой концентрацией пробиотических микроорганизмов, обладает кислотообразующими и антагонистическими свойствами в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры. Получают консорциум совместным культивированием штаммов с учетом длительности экспоненциальной фазы роста каждого из них. На основании чего устанавливают очередность засева питательной среды заданного состава. Использование консорциума в составе бактерийного препарата для лечения дисбиотических состояний желудочно-кишечного тракта детей и биологически активных добавок к пище обеспечивает более эффективную и быструю коррекцию микрофлоры ЖКТ ребенка. 4 н.п. ф-лы, 10 табл., 3 пр.

1. Консорциум бифидобактерий и лактобацилл Bifidobacterium bifidum OV-19, В.bifidum 791, В.longum B379M, В.longum OV-20, В.breve OV-12, L.helveticus К₃Ш₂₄, L.helveticus NK-1, L.casei KHM-12, используемый для приготовления бактерийных препаратов и биологически активных добавок, предназначенных для коррекции микрофлоры детей в возрасте от 3-х до 14 лет.

2. Способ получения консорциума по п.1, предусматривающий совместное культивирование в питательной среде входящих в него штаммов, отличающийся тем, что проводят посев каждого из штаммов бифидобактерий в ферментер по 2% к объему питательной среды культивирования поэтапно с периодичностью в 30 мин, коррегируя рН культуральной жидкости 20% NaOH перед засевом каждого штамма до 6,8, а при посеве штаммов лактобацилл процент каждого штамма в ферментер проводят по 0,1% к объему питательной среды культивирования, коррегируя рН культуральной жидкости перед засевом каждого штамма лактобацилл до 6,0, при этом очередность засева каждого штамма устанавливают в зависимости от длительности экспоненциальной фазы его роста в питательной среде, содержащей следующие ингредиенты в расчете на 100 л:
Гидролизат молока 50 л Аутолизат дрожжей 500 г Цистеин солянокислый 20 г Лактоза 1000 г Пептон ферментативный 200 г Агар-агар микробиологический 100 г Хлористый натрий 400 г Аскорбиновая кислота 250 г Инулин 500 г Олигофруктоза 500 г Вода водопроводная очищенная До 100 л

3. Биологически активная добавка к пище для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта детей от 3-х до 14 лет, характеризующаяся тем, что содержит сухую биомассу консорциума Bifldobacterium bifidum OV-19, B.bifidum 791, В.longum B379M, В.longum OV-20, В.breve OV-12, L.helveticus К₃Ш₂₄, L.helveticus NK-1, L.casei KHM-12, инулин, олигофруктозу, витаминно-минеральный премикс в следующем процентном соотношении:
Биомасса консорциума бифидо- и лактобактерий 40% Инулин 20% Олигофруктоза 20% Витаминно-минеральный премикс 20%

4. Бактериальный препарат для лечения дисбиотических состояний желудочно-кишечного тракта детей в возрасте от 3-х до 14 лет, отличающийся тем, что содержит содержит сухую биомассу консорциума Bifldobacterium bifidum OV-19, B.bifidum 791, В.longum B379M, В.longum OV-20, B.breve OV-12, L.helveticus К₃Ш₂₄, L.helveticus NK-1, L. casei KHM-12 с содержанием КОЕ/г не менее 10⁸.