СПОСОБ ОЦЕНКИ И ОТБОРА МОЛОЧНОГО СКОТА НА СТРЕССОУСТОЙЧИВОСТЬ ПО ПОЛИМОРФИЗМУ ГЕНА БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА HSP Российский патент 2023 года по МПК A01K67/02 C12Q1/686 

Изобретение относится к области животноводства, а именно к способам оценки стрессоустойчивости, и может быть использовано при отборе молочных коров.

Бесстрессовое содержание крупного рогатого скота - это основа рационального и эффективного разведения животных в условиях высокотехнологичных молочных комплексов. Применение на современных предприятиях высокоинтеллектуальных технологий на основе автоматизации производственных процессов влечет за собой повышение уровня влияния некоторых факторов, что приводит к стрессовым состояниям у коров. Животные вынуждены постоянно приспосабливаться к условиям существования, которых в современных молочных фермах и комплексах огромное количество. Стресс отрицательно сказывается на здоровье и продуктивном долголетии крупного рогатого скота. Поэтому чрезвычайно важно выявлять животных с высоким уровнем стрессоустойчивости, чтобы впоследствии получить максимальное количество высококачественной продукции. По причине стрессового состояния ежегодно выбывают из стада до 30 % высокопродуктивных коров [1].

В ответ на воздействие стресс-фактора в клетках организма наблюдается повышение экспрессии определенного класса белков, названных белками теплового шока (англ. HSP, Heat shock proteins).

Впервые HSP были обнаружены у Drosophila melanogaster после инкубации в условиях повышенной температуры. Поэтому синтез этих белков первоначально считался температурно-зависимым процессом [2].

HSP действуют как шапероны (от англ. chaperon - сопровождать) и уборщики, обеспечивающие защиту и восстановление белков, которые несовместимы или изменены из-за повышенных температур. Они образуются через 2-4 ч после термического воздействия [3].

Взаимодействуя с рецепторами стероидных гормонов, HSP предотвращают включение стрессорных программ клетки до наступления стресса. В условиях же его развития - смягчают избыточную стимуляцию данными гормонами. Таким образом, HSP является своеобразным связующим звеном сопряжения стресса на уровне целостного организма и стрессового ответа отдельных клеток. Отсюда их другое название - «стрессовые белки» [4].

За синтез белков теплового шока у крупного рогатого скота отвечает соответствующий ген - HSP70.1. Установлено, что он оказывает влияние на уровень удоя коров и качество молока [5].

Таким образом, генотип коров по гену белков теплового шока (HSP70.1) можно рассматривать как оптимальный индикатор стрессоустойчивости коров в целом.

Обзор литературы показал, что способов оценки стрессоустойчивости, основанных на использовании генетических маркеров, не имеется.

Известно, что для идентификации у коров гена HSP70.1 имеются две пары специфических праймеров:

первая - 5^′-GTCGCCAGGAAACCAGAGAC-3^′ и 5^′-GGAACACCCCTACGCAGGAG-3^′ (позиции 181-200 и 712-731, соответственно, GenBank № M98823);

вторая - 5^′-GTTCTGGGAGGAGAGGCATTCAG-3^′ и 5^′-CTGCCATGTCGGGAATATTCAAGG-3^′ (позиции 284-306 и 356-379, соответственно, GenBank № M98823).

На фиг. 1 показана электрофореграмма результата проведенной MspR9I-ПЦР-ПДРФ-идентификации аллелей «А» и «В» гена белка теплового шока крупного рогатого скота [6]. Условные обозначения: М - ДНК-маркеры 50 bp + 100 bp + 1 kb (СибЭнзим); 1, 5, 8, 9, 11 - MspR9I-ПЦР-ПДРФ-профиль генотипа HSP70.1/«АА» (49/47 bp);2, 4, 6, 12, 13, 14 - MspR9I-ПЦР-ПДРФ-профиль генотипа HSP70.1/«АВ» (96/49/47 bp); 3, 7, 10 - MspR9I-ПЦР-ПДРФ-профиль генотипа HSP70.1/«ВВ» (96 bp); 15 - цельный ПЦР-фрагмент гена HSP70.1 (96 bp). Таким образом, коровы по гену белков теплового шока имеют три варианта генотипа: «АА», «ВВ», «АВ».

Решаемой технической задачей изобретения является повышение точности оценки и отбора молочного скота по стрессоустойчивости путем использования маркерной селекции.

Поставленная задача в способе оценки и отбора молочного скота на стрессоустойчивость по полиморфизму гена белков теплового шока HSP достигается тем, что осуществляется выделение ДНК из крови с дальнейшим генотипированием коров с помощью полимеразной цепной реакции, животных с генотипом «АА» относят к высокому типу стрессоустойчивости, «АВ» - среднему типу, «ВВ» - низкому типу, отбирают коров высокого и среднего типа.

Пример выполнения.

Исследования проведены на стаде коров-первотелок голштинской породы (n = 74) в КФХ «Мухаметшин З.З.» Сабинского района Республики Татарстан и в лаборатории молекулярных исследований Татарского филиала ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Для проведения ПЦР-диагностики по гену HSP70.1 от коров брали пробы крови, которые вносили в пробирки с 100 мМ ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ. Для экстракции ДНК из цельной консервированной крови применяли комбинированный щелочной способ.

Протокол проведения nested PCR для амплификации локуса гена HSP70.1 длиной 96 bp. выполняли с использованием соответствующих реактивов ООО производства ООО «СибЭнзим» (Россия) и двух пар специфических праймеров: 5/-GTCGCCAGGAAACCAGAGAC-3/ (20 n.), 5/-GGAACACCCCTACGCAGGAG-3/ (20 n.) и 5/-GTTCTGGGAGGAGAGGCATTCAG-3/ (23 n.), 5/-CTGCCATGTCGGGAATATTCAA-GG-3/ (24 n.) В дальнейшем проводили ПДРФ-анализ, включающего обработку продуктов амплификации 10 ед. эндонуклеазы рестрикции MspR9I в 1× буфере «O» (ООО «СибЭнзим») при 37 °С в течение ночи.

Анализ результатов цельных фрагментов и ПЦР-ПДРФ-продуктов выполняли с использованием комплекта реагентов для проведения гель-электрофореза производства ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора. Фиксирование результатов выполняли гель-документирующей системой Gel Doc XR + (Bio-Rad, США).

Частоту встречаемости генотипов и отдельных аллелей определяли по формулам Е.К. Меркурьевой (1977):

,

где P - частота определенного генотипа, n - количество особей, имеющих определенный генотип, N - общее число особей.

,

,

где P_А - частота аллеля А, Q_В - частота аллеля В, 2N - общее число аллелей.

Полученные результаты обработаны по общепринятым методам с использованием программы «MS Excel».

В таблице 1 представлены результаты анализа молочной продуктивности коров-первотелок с различным генотипом по гену HSP70.1.

У первотелок с генотипом «АА» молочная продуктивность за 305 дней лактации составила 8589 кг. Это выше на 7,7 и 10,6 %, чем у сверстниц с генотипами «АВ» и «ВВ» соответственно.

По массовой доле жира превосходство имеют животные с генотипом «АВ» (3,77 %): над сверстницами с генотипом «АА» на 0,25 %, с генотипом «ВВ» - на 0,31 %. По массовой доле белка ситуация аналогичная: гетерозиготные коровы превосходят сверстниц двух других групп на 0,07 %.

Таким образом, результаты свидетельствуют, что животные, имеющие в генотипе аллельный вариант «А» гена HSP70.1 (генотипы HSP70.1/«АА» и HSP70.1/«АВ»), превосходят сверстниц с аллельным вариантом «В» (генотип HSP70.1/«ВВ») по всем показателям продуктивности. Можно сказать, что это является результатом различного реагирования животных на стресс-факторы. Соответственно, генотип коров по гену белков теплового шока HSP70.1 является объективным индикатором их стрессоустойчивости.

Предложенное решение в способе оценки и отбора молочного скота на стрессоустойчивость по полиморфизму гена белков теплового шока HSP позволяет достигать поставленной цели - повышение точности оценки и отбора молочного скота по стрессоустойчивости путем использования маркерной селекции.

Таблица 1
Молочная продуктивность коров с разными генотипами HSP70.1-гена Показатель Генотип HSP70.1/«АА» HSP70.1/«АВ» HSP70.1/«ВВ» Число коров 39 24 11 Удой, кг 8589±285,47 7972±308,38 7767±375,57^* МДЖ, % 3,52±0,05^*** 3,77±0,04 3,46±0,04^*** Молочный жир, кг 301,9±8,5 300,7±11,9 257,3±20,8^* МДБ, % 3,10±0,03^* 3,17±0,03 3,10±0,04 Молочный белок, кг 264,1±9,6 254,3±13,9 236,2±17,6 *Р < 0,05; ***Р < 0,001

Источники информации

1. Чеченихина, О.С. Стрессоустойчивость и показатели продуктивного долголетия коров разных пород / О.С. Чеченихина, Ю.А. Степанова // Молочнохозяйственный вестник. - 2019. - № 4 (36). - С. 133-140 (https://reader.lanbook.com/journalArticle/579195).

2. De Maio, A. Heat shock proteins: facts, thoughts, and dreams / A. De Maio // Shock. - 1999. - Vol. 11(1). - P. 1-12 (doi: 10.1097/00024382-199901000-00001).

3. Hao, Y. Overexpression of heat shock protein 70 and its relationship to intestine under acute heat stress in broilers: Intestinal structure and digestive function / Y. Hao, X.H. Gu, X.L. Wang // Poult Sci. - 2012. - Vol. 91. - P. 781-789 (doi: 10.3382/ps.2011-01627).

4. Ciupitu, A. Immunization with a lymphocytic choriomeningitis virus peptide mixed with heat shock protein 70 results in protective antiviral immunity specifi c cytotoxic T lymphocytes / A. Ciupitu, M. Peterson, C. O’Donnell // J. Exp. Med. - 1998. - No 187. - Р. 685-690 (doi: 10.1084/jem.187.5.685).

5. Armstrong, D.V. Heat stress interaction with shade and cooling / D.V. Armstrong // J. Dairy Sci. - 1994. - Vol. 77. - Р. 2044-2050 (https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(94)77149-6).

6. Загидуллин, Л.Р. Оценка генотипа первотелок по гену белка теплового шока и его влияние на продуктивные и воспроизводительные показатели / Л.Р. Загидуллин, Р.Р. Хисамов, С.В. Тюлькин, Т.М. Ахметов, Р.Р. Шайдуллин // Молочное и мясное скотоводство. - 2022. - № 1. - С. 28-31 (doi: 10.33943/MMS.2022.35.77.006).

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ оценки и отбора молочного скота на стрессоустойчивость по полиморфизму гена белков теплового шока HSP, включающий выделение ДНК из крови с дальнейшим генотипированием коров с помощью полимеразной цепной реакции, животных с генотипом «АА» относят к высокому типу стрессоустойчивости, «АВ» – среднему типу, «ВВ» – низкому типу, отбирают коров высокого и среднего типа. Изобретение позволяет повысить точность оценки и отбора молочного скота по стрессоустойчивости путем использования маркерной селекции. 1 ил., 1 табл.

Способ оценки и отбора молочного скота на стрессоустойчивость по полиморфизму гена белков теплового шока HSP, включающий выделение ДНК из крови с дальнейшим генотипированием коров с помощью полимеразной цепной реакции, животных с генотипом «АА» относят к высокому типу стрессоустойчивости, «АВ» – среднему типу, «ВВ» – низкому типу, отбирают коров высокого и среднего типа.