СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА HSP70.1, ОБУСЛАВЛИВАЮЩЕГО ТЕПЛОВОЙ СТРЕСС КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 2024 года по МПК C12N15/11 

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и молекулярной генетике и может быть использовано в селекции крупного рогатого скота молочного направления продуктивности.

Тепловой стресс у крупного рогатого скота - это проблема, с которой сталкивается вся животноводческая отрасль в теплое и жаркое время года. Главным образом перегрев сказывается на молочной продуктивности коров - это снижение суточного удоя до 5 л от одной головы. Также у животных снижается воспроизводство и могут возникнуть проблемы со здоровьем. Современные породы скота молочного направления продуктивности высокочувствительны к жаре. Поэтому повышение температуры окружающей среды ведет к повышению температуры тела коровы, в результате чего развивается тепловой стресс [1, 2].

Белки теплового шока (англ. HSP, Heat shock proteins) - это класс функционально сходных белков, экспрессия которых возрастает при повышении температуры или при других стресс-воздействиях на клетку. Они являются основными молекулярными маркерами теплового шока [3].

Белки теплового стресса действуют как шапероны и уборщики, обеспечивающие защиту и восстановление белков, которые несовместимы или изменены из-за повышенных температур. HSP образуется через 2-4 часа после термического воздействия [4].

За синтез белков теплового шока у крупного рогатого скота отвечает соответствующий ген - HSP70.1. Из литературных данных известно, что ген HSP70.1 оказывает влияние на уровень удоя коров и на качество молока [5, 6] и рассматривается как биологический маркер для измерения теплового стресса у животных [7]. В ответ на стресс-фактор у животных возникает ряд физиолого-биохимических реакций и изменение поведения, направленных на восстановление теплового баланса.

Развитие молекулярно-генетических методов анализа, основанных на полимеразной цепной реакции (ПЦР) сделало возможным создать новые маркерные системы, обеспечивающие определение генотипов животных непосредственно на уровне генетического материала клетки (на уровне ДНК) независимо от пола и возраста, сократить время анализа и повысить его точность.

Изучены связи между индуцируемыми однонуклеотидными полиморфизмами (SNP) HSP70.1 и реакцией мононуклеарных клеток периферической крови на тепловой шок у молочных коров. Так, присутствие SNP (C/-) в области 5'-UTR индуцируемого HSP70.1 улучшает реакцию HSP и устойчивость к теплу молочного скота. Эти участки мутаций могут быть полезны в качестве молекулярно-генетических маркеров, помогающих отбору на устойчивость к жаре [8, 9].

Существуют методы оценки полиморфизма генов-маркеров молочной продуктивности коров. Например, жирномолочность оценивают по гену DGAT1 [10], белковомолочность крупного рогатого скота определяют с помощью анализа полиморфизма гена каппа-казеина [11]. При оценке генетических возможностей коров относительно уровня удоя используют анализ полиморфизма генов пролактина [12], рецептора гормона роста (GHR) [13], гена белка STAT5A [14]. Однако способ оценки генетического полиморфизма гена белка теплового шока крупного рогатого скота в нашей стране не выявлен.

В этой связи актуальным является способ оценки генетического полиморфизма гена-кандидата белка теплового шока коров, участвующий в формировании состояния и адаптации организма и, в свою очередь, влияющий на молочную продуктивностью скота.

Включение в генетический анализ информативных генетических маркеров состояния организма может существенно расширить возможности выявления состояния стресса и позволит не допускать снижения уровня молочной продуктивности коров.

При создании настоящего изобретения задача состояла в разработке способа обнаружения аллеля гена HSP70.1, ассоциированного с тепловым стрессом, с целью выявления влияния HSP70.1 на состояние организма и молочную продуктивность и в последующем разработки программ и их использования в селекции для получения телят толерантных к высокой температуре.

Задача изобретения - создание специфичного способа идентификации полиморфизма в гене HSP70.1, ассоциированного с тепловым стрессом крупного рогатого скота, для использования в селекции крупного рогатого скота.

Сущность изобретения - способ использования тест-системы, основанная на MspR9I - изменчивости гена белка теплового шока (HSP70.1), для выявления генотипов, ассоциированных с толерантностью к высокой температуре, которые могут широко использованы при селекции молочных пород.

MspR9I - рестрикционный полиморфизм гена белка теплового шока HSP70.1 обусловлен делецией азотистого основания цитозина, расположенного в позиции 12086 нуклеотида (GB ID AY149618), что приводит к возникновению сайта рестрикции при наличии такого полиморфизма. Такой нуклеотидный полиморфизм характеризуется делецией азотистого основания, что и проявляется в различиях значений реагирования животных на повышение температуры окружающей среды.

Способ основан на ПЦР анализируемого гена с последующим рестрикционным анализом продуктов амплификации (метод ПЦР-ПДРФ) и включает в себя выделение ДНК, амплификацию гена белка теплового шока с использованием специфичного праймера, рестрикционный анализ полученных ампликонов MspR9I (или StyD4I, или ScrFI), установление генотипов по данному гену:

продукты рестрикции ампликона гена белка теплового шока молекулярной массой 85 и 87 п.н. свидетельствуют о наличии аллельного варианта «CC» (рестриктаза MspR9I (или StyD4I, или ScrFI) определила сайт рестрикции и расщепила все имеющиеся ампликоны), продукты рестрикции ампликона гена белка теплового шока молекулярной массой 85 и 87 п.н. в совокупности с исходным ампликонов молекулярной массой 172 п.н. свидетельствуют о наличии аллельного варианта «С-» (рестриктаза MspR9I (или StyD4I, или ScrFI) определила сайт рестрикции и расщепила часть ампликонов, где есть сайт рестрикции, ампликоны с нуклеотидной заменой характеризовались отсутствием сайта рестрикции и остались в исходном состоянии), наличие после рестрикции лишь фрагмента ДНК молекулярной массой 172 п.н. свидетельствуют о наличии аллельного варианта «--» (ампликоны с нуклеотидной заменой характеризовались отсутствием сайта рестрикции и остались в исходном состоянии).

Способ осуществляют следующим образом.

1. Выделяют ДНК из образцов крови (200 мкл) животного с применением набора реагентов ДНК «ДНК-сорб В» (ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) или любым другим стандартным методом. Возможно использование иных образцов, содержащих ДНК.

2. Амплификацию выполняют, используя реакционную смесь для следующего состава (на одну пробу): деионизированная вода 11 мкл; 10-кратный ПЦР-буфер 2,5 мкл; смесь нуклеозид трифосфатов 2,5мМ 2,5 мкл; раствор MgCl₂ 25мМ 2,5 мкл; праймеры 10 пкМ по 0,5 мкл; Taq ДНК-полимераза (5Е/мкл) 0,5 мкл (специфичные праймеры для гена HSP70.1: FPHSP2 5'-TCCTGTTTCCTCCAGCGAATCCTA-3' и RPHSP2 5'-CTTTTCCCTTCGTCAGCCAATGA-3'; ДНК исследуемого образца 5 мкл. Общий объем реакционной смеси составляет 25 мкл. Программа для амплификации должна быть следующей: 1. 95°С 5 мин 1 цикл; 2. 94°С 30 с, отжиг праймеров 30 с при 59,1°С, 72°С 30 с 42 цикла; 3. 72°С 10 мин 1 цикл.

Праймеры для специфической амплификации представлены в таблице 1.

Таблица 1

Последовательность праймеров для индикации гена HSP70.1

Ген Название праймера Позиции в нуклеотидной последовательности гена Длина фрагмента п.о. Последовательность праймера (5' → 3') HSP70.1 FPHSP2 12002-12025 172 tcctgtttcctccagcgaatccta RPHSP2 12151-12173 cttttcccttcgtcagccaatga

Размер полученных фрагментов определяют методом электрофореза в 1,5% агарозном геле.

3. Проводят рестрикцию амплифицированного фрагмента гена HSP70.1 эндонуклеазой рестрикции MspR9I (или StyD4I, или ScrFI) в стандартных условиях.

4. Размер полученных рестрикционных фрагментов определяют методом горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле.

5. Определяют генотипы по гену HSP70.1 (согласно табл. 2).

Таблица 2

Характеристики эндонуклеазы рестрикции MspR9I (или StyD4I, или ScrFI), использованной в ПЦР-ПДРФ анализе

Ген Рестриктаза Сайт рестрикции Температура инкубации, °С Генотип Размеры продуктов рестрикции, п.н. HSP70.1 MspR9I (или StyD4I, или ScrFI) 5' CC/NGG 3'
3' GGN/CC 5' 37 CC 85 и 87 С- 85, 87 и 172 -- 172

Пример. Данным способом был проведен анализ шести проб крови коров. От каждой пробы крови (200 мкл) коров была выделена ДНК с помощью комплекта реагентов для выделения ДНК «ДНК-сорб В» (ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора).

Выполнили амплификацию, используя реакционную смесь для следующего состава (на одну пробу): деионизированная вода 11 мкл; 10-кратный ПЦР-буфер 2,5 мкл; смесь нуклеозид трифосфатов 2,5 мМ 2,5 мкл; раствор MgCl₂ 25 мМ 2,5 мкл; праймеры 10 пкМ по 0,5 мкл; Taq ДНК-полимераза (5Е/мкл) 0,5 мкл; ДНК исследуемого образца 5 мкл. Общий объем реакционной смеси составляет 25 мкл. Программа для амплификации должна быть следующей: 1. 95°С 5 мин 1 цикл; 2. 94°С 30 с, отжиг праймеров 30 с при 59,1°С, 72°С 30 с 42 цикла; 3. 72°С 10 мин. 1 цикл.

По результатам электрофореза в 1,5% агарозном геле установили наличие следующих ампликонов - 172 п.н.

Провели рестрикцию амплифицированного фрагмента гена HSP70.1 эндонуклеазой рестрикции MspR9I (или StyD4I, или ScrFI) в стандартных условиях.

Размеры полученных рестрикционных фрагментов определили методом электрофореза в 1,5% агарозном геле, которые составляли. В результате рестрикции участка ДНК гена HSP70.1 в исследуемых пробах ДНК коров образуются три продукта ДНК в 85, 87 и 172 bp. Наличие продуктов ДНК такой длины свидетельствует, что у двух коров выявлен гетерозиготный генотип «С-», т.к. в дорожке геле обнаруживается 3 мажорных паттерна ДНК на уровне 85, 87 и 172 bp. А у двух других коров выявлен генотип «СС». У них выявляются два паттерна на уровне 85 и 87 bp. Кроме того, у двух особей обнаружен генотип «--», который характеризуется наличием одного паттерна размером 172 bp.

Таким образом, была определена нуклеотидная последовательность полученных ампликонов. В результате ПЦР синтезируются заявленные нуклеотидные последовательности и подтверждена специфичность праймеров. Следовательно, ПЦР-ПДРФ тест-система способна проводить дискриминацию аллелей по гену белка теплового шока HSP70.1 крупного рогатого скота.

Заключение.

В результате практических исследований, направленных на апробацию разработанного способа определения полиморфизма гена HSP70.1 крупного рогатого скота, нами был получен обеспечиваемый предложенным способом технический результат, выраженный в специфичности разработанных праймеров по гену HSP70.1 и эффективной идентификации искомых генотипов. Следовательно, они пригодны для использования в селекционно-племенной работе с молочным скотом в качестве генетических маркеров.

Источники информации

1. Бокзонади, А. Тепловой стресс. Контроль состояния дойных коров / А. Бокзонади // Эффективное животноводство. - 2021. - № 3. - С. 98-101.

2. Карягин, Д.В. Разработка способа повышения термотолерантности цыплят бройлеров при напольном выращиваниив условиях юга России: дисс… на соискание ученой степени кандидата с.-х. наук. - СтГАУ. Ставрополь, 2016. - 136 с.

3. Belli, F. Vaccination of metastatic melanoma patients with autologous tumorderived heat shock protein gp96-pep-tide complexes: clinical and immunologic findings / F. Belli, A. Testori, L. Rivoltini // J. Clin. Oncol. - 2002. - Vol. 20. - Р. 4169-4180.

4. Hao, Y. Overexpression of heat shock protein 70 and its relationship to intestine under acute heat stress in broilers: Intestinal structure and digestive function / Y. Hao, X.H. Gu, X.L. Wang // Poult Sci. - 2012. - Vol. 91. - P. 781-789. (Doi: 10.3382/ps.2011-01627).

5. Aguilar, I. Genetic components of heat stress for dairy cattle with multiple lactation / I. Aguilar, I. Misztal, S. Tsuruta // J. Dairy Sci. - 2009. - Vol.92. - Р. 5702-5711 http://dx.doi.org/10.3168/jds.2008-1928.

6. Nardone, A. Effects of climate changes on animal production and sustainability of livestock systems / A. Nardone, B. Ronchi, N. Lacetera et al. // Livest. Sci. - 2010. - Vol. 130. - Р. 57-69. https://doi.org/10.1016/j.livsci.2010.02.011.

7. Habib, H.N. Molecular detection of polymorphism of heat shock protein 70 (Hsp70) in the semen of Iraqi Holstein bulls / H.N. Habib, A.F. Hassan, B.Y. Khudaler // Asian J. Anim. Sci. - 2017. - Vol. 11 (3). - Р. 132-139. http://dx.doi.org/10.3923/ajas.2017.132.139.

8. Adamowicz, T.A New SNP in the 3'-UTR of the Hsp70-1 Gene in Bos Taurus and Bos indicus / T. Adamowicz, E. Pers, D. Lechniak // Biochem Genet. -2005. - 43. - P. 623-627.

9. Öner, Y. Genetic diversity of the 3' and 5' untranslated regions of the HSP70.1 gene between native Turkish and Holstein Friesian cattle breeds / Y. Öner, A. Keskin, H. Üstüner, D. Soysal & V. Karakaş // South African Journal of Animal Science. - 2017. - 47 (No. 4). - Pp. 424-439.

10. RU 2668829 C 2,2.10.2018 Усольцев К.В. и др. Способ проведения аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллельным вариантам АА, КК и АК гена фермента диацетил-глицерин О-ацетилтрансферазы для определения наследуемости жирномолочности.

11. Miluchová, M. Association of HindIII-polymorphism in kappa-casein gene with milk, fat and protein yield in holstein cattle / M. Martina, M. Gábor, J. Candrák, A. Trakovická, K. Candráková // ActaBiochim. - Pol., 2018; - 65(3). - Pp. 403-407.

12. Udina, I.G. Polymorphism of cattle prolactin gene: microsatellites, PSR-RFLP / I.G. Udina, S.O. Turkova, M.V. Kostiuchenko, L.A. Lebedeva, G.E. Sulimova // Genetika. - 2001. - 37 (4). Pp. 511-516.

13. Cobanoglu, O. Determination of the association of GHR/AluI gene polymorphisms with milk yield traits in Holstein and Jersey cattle raised in Turkey / O. Cobanoglu, E. Kul, E.K. Gurcan, S.H. Abaci, S. Cankaya // Arch Anim Breed. - 2021. - 64 (2). - Pp. 417-424.

14. He, X. Polymorphisms of STAT5A gene and their association with milk production traits in Holstein cows / X. He, M.X. Chu, L. Qiao, J.N. He, P.Q. Wang, T. Feng Di R., G.L. Cao, L. Fang, Y.F. An // MolBiolRep. - 2012. - 39(3). - Pp. 2901-2907.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к cпособу определения полиморфизма гена HSP70.1, обуславливающего тепловой стресс крупного рогатого скота. Изобретение позволяет обнаружить полиморфизмы в гене HSP70.1. 2 табл., 1 пр.

Способ определения полиморфизма гена HSP70.1, обуславливающего тепловой стресс крупного рогатого скота, основанный на использовании ПЦР-ПДРФ метода, включающий выделение ДНК, амплификацию с использованием специфичных праймеров, рестрикционный анализ полученных ампликонов с установлением генотипов по гену HSP70.1, отличающийся тем, что в качестве праймеров используют праймеры, специфичные для фрагмента гена белка теплового шока (HSP70.1) крупного рогатого скота: FPHSP2 5’-TCCTGTTTCCTCCAGCGAATCCTA-3’ и RPHSP2 5’-CTTTTCCCTTCGTCAGCCAATGA-3’, анализ полученных ампликонов проводят MspR9I (или StyD4I, или ScrFI) рестриктазой; обнаружение продуктов рестрикции ампликона гена белка теплового шока молекулярной массой 85 и 87 п.н. свидетельствует о расщеплении всех ампликонов, обнаружение продуктов рестрикции ампликона гена белка теплового шока молекулярной массой 85 и 87 п.н. и 172 п.н. свидетельствует о расщеплении части ампликонов, где есть сайт рестрикции, ампликоны с нуклеотидной заменой характеризовались отсутствием сайта рестрикции и остались в исходном состоянии; обнаружение продуктов рестрикции ампликона гена белка теплового шока молекулярной массой 172 п.н. свидетельствует о том, что ампликоны с нуклеотидной заменой характеризовались отсутствием сайта рестрикции и остались в исходном состоянии.