СПОСОБ ДЕТЕКЦИИ ОДНОНУКЛЕОТИДНОГО ПОЛИМОРФИЗМА ЛОКУСА PRL-RSAI С ПОМОЩЬЮ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ПРАЙМЕРОВ В ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной генетики.

Пролактин (prolactin, PRL) - это полипептидный гормон, который синтезируется и секретируется специализированными клетками передней доли гипофиза. Он является одним из самых плейотропных гормонов гипофиза с точки зрения биологического действия. Гормон пролактин играет важную роль в росте и развитии молочной железы (маммогенез), поддержании секреции молока (галактопоэз), синтезе молока (лактогенез). Кроме этого, гормон также отвечает за синтез лактозы, липидов и других важных компонентов молока. Поэтому ген, продуктом экспрессии которого является гормон пролактин, считается одним из ключевых звеньев в генной сети, составляющей наследственный компонент молочной продуктивности крупного рогатого скота. Эти характеристики делают ген PRL перспективным геном-кандидатом для оценки молочных признаков коров.

Известен способ определения генетического потенциала крупного рогатого скота (патент RU 2317704 С1 опубл. 27.02.2008 г.) путем ДНК-тестирования животных по RsaI-маркеру гена пролактина и AluI-маркеру гена гормона роста с помощью ПЦР-ПДРФ метода. Недостатком данного способа является специфика проведения полимеразных цепных реакций типа ПДРФ - необходимость выполнения дополнительных процедур после процесса амплификации ДНК (рестрикция и электрофорез), при этом анализ и интерпретация результатов не является автоматизированным, требует определенной квалификации от сотрудников, занимает значительное количество времени и плохо поддается формализации и переводу в цифровой формат.

В предлагаемом способе используются аллель-специфичные FAM- и VIC - зонды и один общий для обоих аллелей зонд, несущий BHQ-гаситель. Гибридизация зондов происходит после завершения амплификации, что делает возможным определять точечные мутации, расположенные внутри областей связывания ДНК-матрицы и зонда. Установление температуры плавления аллель-специфичных зондов, характерной для каждого из аллелей, позволяет проводить генотипирование образца в одной пробирке. Также при анализе генотипа учитывается форма кривой плавления, что позволяет автоматизировать и формализовать процедуру интерпретации полученных данных, снизив вероятность ошибки оператора.

Цель изобретения - разработка тест-системы для детекции однонуклеотидного полиморфизма локуса PRL-RsaI с помощью специфических праймеров в полимеразной цепной реакции в реальном времени с целью выявления генетически детерминированных факторов развития молочной железы крупного рогатого скота.

Принцип действия: метод основан на определении температуры плавления олигонуклеотидых зондов, которая напрямую зависит от наличия / отсутствия нуклеотидных замен в матрице ДНК в области гибридизации зондов. Определение генотипа основано на проведении полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) с праймерами, общими для «дикого» и «мутантного» вариантов нуклеотидной последовательности.

Для установления температуры плавления, кроме флуоресцентно-меченого типирующего зонда, в реакционную смесь добавляется тугоплавкий олигонуклеотидный зонд с гасителем флуоресценции, который гибридизуется на матрице ДНК в непосредственной близости к типирующему зонду. При низкой температуре происходит гибридизация зондов с амплифицированной в ходе ПЦР ДНК, в результате чего флуоресцентный краситель оказывается рядом с гасителем флуоресценции. По увеличению флуоресцентного сигнала при повышении температуры можно определить температуру плавления типирующего зонда и, следовательно, определить наличие однонуклеотидной замены. Для повышения надежности типирования предложен метод одновременной гибридизации с двумя альтернативными типирующими зондами, меченными различными флуорофорами (FAM-предковый аллель, VIC - мутантный аллель). С помощью метода генотипирования (метод кривых плавления) можно на основании пиков плавления (денатурации) определить гетерозиготный и гомозиготный образец. Для гомозиготных образцов пики плавления будут отличаться, а для гетерозиготных температуры плавления будут примерно одинаковы (фиг. 1).

Амплификационная смесь содержит: ПЦР-буфер 1-кратный, смесь дезоксирибонуклеотидов - 25 мМ каждого, зонд FAM - 0,1 пм/мкл, зонд VIC - 0,1 пм/мкл, зонд BHQ - 0,3 пм/мкл, праймер 1 - 0,1 пм/мкл, праймер 2 - 0,6 пм/мкл. В реакции используется термостабильный фермент Taq-полимераза в количестве 2,5 единицы активности на реакцию. Для предотвращения испарения амплификационной смеси поверх нее наслаивается 20 мкл минерального масла.

При апробации разработанного способа использовали образцы биоматериала (периферическая кровь), отобранные у крупного рогатого скота костромской породы (n=50) из хвостовой вены в промаркированные стерильные вакуумные пробирки «Vacumed» с антикоагулянтом ЭДТА К2 («Greiner Bio-One», Австрия). Выделение ДНК из крови осуществляли на сорбирующих колонках набора «DNeasy Blood & Tissue Kit» для выделения ДНК из образцов крови и тканей животных, а также из клеток, дрожжей, бактерий и вирусов («Qiagen», Германия) в соответствии с инструкцией производителя.

Полимеразную цепную реакцию проводили на амплификаторе «ДТ-48» (ООО «НПО ДНК-технология», Россия) в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем, по следующей программе: 94°С - 1 мин 30 с, 67°С - 15 с 5 циклов, 67°С - 15 с 45 циклов, 25°С - 45 с 50 циклов. Для амплификации фрагмента 3 экзона гена PRL использовали праймеры:

PRL-f CCTTATGAGCTTGATTCTTGGGTTGCTG

PRL-r ATATCATCTCCATGCCTTCCAGAAGTCG.

Разработанные олигонуклеотиды позволяют детектировать фрагмент гена в пределах локуса PRL-RsaI длиной 164 нуклеотида.

Для контроля качества ДНК и оценки эффективности работы праймеров продукты ПЦР анализировали методом агарозного гель-электрофореза. Для приготовления 1 л 10 кратного ТВЕ-буфера добавляли в мерную колбу 108 г TRIS (основного), 55 г. борной кислоты, 40 мл 0,5М ЭДТА (рН 8,0) и довести объем mQ до 1 л. Для приготовления геля для электрофореза в мерном стакане на 50 мл смешивали 25 мл 1% ТВЕ-буфера, 0,25 г агарозы и 1 мкл бромистого этидия. Разогревали смесь в микроволновой печи до полного растворения агарозы. Заливали смесь в камеру для приготовления гелей. Образцы наносили в лунки в составе 5х загрузочного буфера (бромфенол/глицерин). Условия проведения электрофореза выставляли в соответствии с инструкцией производителя камеры «Mupid-exU» (Япония).

Последовательности генотипирующих зондов:

PRLa CGAGGTACGGGGTATG-FAM

PRLg CGAGGTGCGGGGTATG-VIC

PRLbq BHQ1 - AAAGGAGCCCC AGATGCTAT-P

С помощью разработанной тест-системы определены аллели и генотипы образцов ДНК крупного рогатого скота костромской породы (n=48) по полиморфизму локуса PRL-RsaI. Частота встречаемости генотипов АА, AG и GG составила 60,4, 37,5 и 2,1% соответственно. Аллели PRL (А) и PRL (G) демонстрировали частоту 0,79 и 0,21 соответственно.

Источники информации:

1. Сулимова Г.Е., Лазебная И.В., Лазебный О.Е. Способ определения генетического потенциала крупного рогатого скота по качеству молока // Патент на изобретение RU 2317704 С1, 27.02.2008. Заявка №2006119781/13 от 06.06.2006.

Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной генетики. Предложен способ детекции однонуклеотидного полиморфизма локуса PRL-RsaI с помощью тест-системы. Тест-система включает смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов, буфер для постановки реакции, термостабильный фермент - Taq-полимеразу, два синтетических олигонуклеотидных праймера, специфичных к данному участку ДНК: PRL-f CCTTATGAGCTTGATTCTTGGGTTGCTG; PRL-r ATATCATCTCCATGCCTTCCAGAAGTCG, два вида аллель-специфичных флюоресцирующих зондов: PRLa - CGAGGTACGGGGTATG – FAM; PRLg - CGAGGTGCGGGGTATG – VIC, общий для обоих аллелей гасящий зонд: PRLbhq - (BHQ1) AAAGGAGCCCCAGATGCTAT - Р, минеральное масло, защищающее реакционную смесь от испарения при ПЦР. Способ демонстрирует стабильную воспроизводимость результатов при анализе количества копий ДНК, превышающего порог чувствительности тест-системы. 1 ил.

Способ детекции однонуклеотидного полиморфизма локуса PRL-RsaI с помощью тест-системы, включающей смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов, буфер для постановки реакции, термостабильный фермент - Taq-полимеразу, два синтетических олигонуклеотидных праймера, специфичных к данному участку ДНК:

PRL-f CCTTATGAGCTTGATTCTTGGGTTGCTG

PRL-r ATATCATCTCCATGCCTTCCAGAAGTCG,

два вида аллель-специфичных флюоресцирующих зондов:

PRLa - CGAGGTACGGGGTATG - FAM

PRLg - CGAGGTGCGGGGTATG - VIC

общий для обоих аллелей гасящий зонд:

PRLbhq - (BHQ1) AAAGGAGCCCCAGATGCTAT - Р,

минеральное масло, защищающее реакционную смесь от испарения при ПЦР.