Способ проведения ПЦР с аллель-специфичными зондами для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики, генетики и селекции сельскохозяйственных животных, в частности к оценке аллельного полиморфизма гена, каппа-казеина (CSN3) крупного рогатого скота молекулярно-генетическим методом исследования.

Каппа-казеин - белок молока, который отвечает за взаимодействие с сычужным ферментом и образование казеинового сгустка, тем самым являясь основным белком для сыроварения. От конформационной структуры данного белка зависит качество сыродельческой продукции и общий выход сыра и, соответственно, количество используемого сырья для его производства. Белок входящий в состав молока полученного от коров с гомозиготным генотипом ВВ гена каппа-казеина, обладает лучшими коагуляционными свойствами, что сказывается на сокращении времени образования казеинового сгустка на 24% и повышении общего выхода сыра из данного молока на 10% [Ng-Kwai Hang, K.F. Genetic variants of milk proteins and cheese yield / K.F. Ng-Kwai Hang // IDF Seminar Cheese yield and factors affecting its control. - Cork. - 1993. - P. 160-166]. Знание информации о генотипе животного по данному гену, позволит производителям молока формировать стада животных для получения узконаправленной продукции.

Ген каппа-казеина (CSN3) располагается в 6 хромосоме и на текущий момент имеет 13 аллелей, из которых А и В являются самыми часто встречаемыми [Grosclaude, F. Deterministe genetique des caseines kappa du lait de vasche; etroite liaison du locus kappa-casein avec les loci alfa S1-casein et beta-casein / F. Grosclaude, [et al.] // Comptes rendus de I academic des Sciences. - 1965. - P. 5299]. Основой, влияющей на технологические свойства белка каппа-казеина, являются замены в поз. 136 и 148 белковой цепи IV экзона. Это замена аминокислоты треонин (аллель А) на изолейцин (аллель В) вследствие нуклеотидной замены (SNP) С>Т и аспаргина на аланин вследствие нуклеотидной замены А>С в позициях 136 и 148, соответственно [Robitaille,G., Britten, M., Morisset, J. and Petitclerc, D. // Polymorphism in the bovine kappa-casein (CSN3) gene and the 5'-flanking region: sequence analysis of CSN3 A and В alleles// Anim. Genet. 36 (2), 184-185 (2005)]. При этом, по данным базы данных NCBI в IV экзоне имеются еще 2 синонимические мутации (SNP), отличающие аллель А от аллеля В, одна из которых, позиция 168 A>G (А1а>А1а) подтверждена Федерацией разведения крупного рогатого скота Ирландии [Matthew McClure, Jennifer McClure, //Genetic Disease and Trait Information for IDB Genotyped Animals in Ireland//ICBF, Highfield House, Shinagh, Bandon, Co. Cork, 2016].

Известен способ (прототип) проведения ПЦР в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена CSN3 (патент РФ №2701648, опубликован 01.10.2019). Согласно прототипу, способ проведения ПЦР в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена CSN3, состоит в том, что используют 5'-флуоресцентно-меченый прямой А-аллель-специфический праймер CSN3-A: 5'-FAM-ACTGTAGCTACTCTAGACGA-3', 5'-флуоресцентно-меченый прямой В-аллель-специфический праймер CSN3-B: 5-VIC-ACTGTAGCTACTCTAGATGC-3', обратный общий праймер CSN3-R: 5'-GCTCTCAATAACTTCTGGAGAA-3', анти-праймер CSN3-S, меченый гасителем флуоресценции с 3'-конца олигонуклеотида: 5'-TCTAGAGTAGCTACAGT-3'-BHQ1. В данном методе проведения ПЦР в реальном времени используются аллельспецифичные праймеры, которые имеют аллельспецифичный нуклеотид на 3' конце и мечены с 5' конца флюоресцентной краской, а также два дополнительных праймера, один из которых мечен флюоресцентным гасителем. В результате в данном способе аллельспецифичные праймеры подобраны к одной SNP в позиции 136 белковой цепи IV экзона.

Недостатком данного метода можно обозначить использование в реакции аллель-специфичных праймеров, которые при использовании неоптимальных условий проведения реакции способны неспецифично отжигаться на матрице ДНК, что может приводить к получению ложноположительных результатов и снижению надежности способа.

Техническим результатом патентуемого способа является расширение арсенала способов генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина (CSN3) на основе ПЦР в реальном времени и повышение их надежности.

Технический результат достигается тем, что способ проведения ПЦР с аллель-специфичными зондами для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина отличается тем, что используются:

- прямой общий праймер CSN3-RT-F-114: 5'-agagcccacctgagatcaac-3'

- обратный общий праймер CSN3-RT-R-114: 5'-tcttggctgttattcattttgc-3'

- В-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд Probe 1: FAM-caactgcggtctaaatactctaaggag-BHQ1

- А-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд Probe 2: HEX-caactgcagtctaaaaactctaaggag-BHQ1

Перечень графических материалов.

На фиг. 1 представлена схема расположения праймеров и ДНК-зондов в IV экзоне гена каппа-казеина (CSN3). Внешними границами отмечены последовательности праймеров. Жирным шрифтом отмечены последовательности зондов.

На фиг. 2 представлен результат ПЦР "в реальном времени" с применяемыми праймерами и ДНК-зондами.

На фиг. 3 представлена диаграмма распределения аллелей А и В в гене CSN3: по каналу HEX (ось Y, синие маркеры) результат исследования гомозиготного образца по аллелю А (генотип АА); по каналу FAM (ось X, оранжевый маркер) - результат исследования гомозиготного образца по аллелю В (генотип ВВ); в середине диаграммы (зеленые маркеры) - результат исследования гетерозиготного образца АВ; черные маркеры - отрицательный образец.

Патентуемый способ заключается в проведении ПЦР в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота по аллельным вариантам А/В гена каппа-казеина (CSN3). Заявленный способ отличается тем, что используются два общих для аллельных вариантов праймера: прямой общий праймер CSN3-RT-F-114: 5'-agagcccacctgagatcaac-3' и обратный общий праймер CSN3-RT-R-114: 5'-tcttggctgttattcattttgc-3' фланкирующие участок гена каппа-казеина длиной 114 п. н., и два аллель-специфичных флуоресцентно-меченых зонда типа TaqMan: Probe 1: FAM-caactgcggtctaaatactctaaggag-BHQ1 и Probe 2: HEX-caactgcagtctaaaaactctaaggag-BHQ1 (фиг. 1).

В отличие от прототипа (патент на изобретение 2701648 опубл. 01.10.2019), в заявленном изобретении точки мутации и детекция конечного результата иные: патентуемый способ осуществляется с помощью двух аллель-специфичных TaqMan зондов подобраных к участку IV экзона гена каппа-казеина, содержащего 2 синонимические мутации (SNP), располагающиеся на расстоянии друг от друга в 8 п.о., и отличающиеся друг от друга двумя mismatch-нуклеотидами. Использование данной конструкции олигонуклеотидных ДНК-зондов приводит к большей разнице в температурах плавления между mismatch и комплементарным ДНК-зондом и усилению конкурентных условий при одновременном присутствии обоих ДНК-зондов в реакционной смеси, что приводит к полному ингибированию неспецифического связывания олигонуклеотидных зондов.

Также в патентуемом способе используются контрольные материалы, искусственно сконструированные на основе плазмиды рЕТ-23b (+) и имеющие в своем составе участок гена каппа-казеина крупного рогатого скота, гомологичного к разработанным ДНК-зондам и олигонуклеотидным праймерам. Проводят выделение ДНК из биологического материала, постановку полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием указанных олигонуклеотидных праймеров и ДНК-зондов. Реакционную смесь для ПЦР готовят из расчета количества имеющихся образцов и дополнительно контрольные образцы в количестве 4 шт.: отрицательный, положительный с генотипом АА, положительный с генотипом АВ, положительный с генотипом ВВ. Смешанные реактивы содержащие 50 мМ KCl, 50 мМ TPIS-HCl, 200 нМ dNTP, 2,5 мМ MgCl2, праймеры (в концентрации 0,2 рМ/мкл), аллель-специфические зонды (в концентрации 0,1 рМ/мкл), разливают в ПЦР-пробирки или ПЦР-планшеты объемом 0,2 мл в количестве 19 мкл и добавляют 1 мкл выделенной ДНК или контрольных образцов. Пробирки помещают в амплификатор с функцией «real-time». Для анализа используется следующий протокол:

инициация: 37°С - 5 минут,

предварительная денатурация: 94°С - 5 минут,

цикл из 40 повторов,

денатурация: 94°С - 15 секунд,

совмещенный отжиг и элонгация: 60°С - 1 минута,

считывание уровня флюоресценции каждый цикл по окончанию этапа отжига и элонгации.

Интерпретация результатов осуществляется на основании пересечения кривой флюоресценции в соответствующих каналах детекции с пороговой линией и по конечному уровню флюоресценции. Пересечение пороговой линии и величина уровня флюоресценции в пределах 25-29 и 1200-1800, соответственно, в канале FAM и отсутствие в канале HEX, интерпретируется как гомозигота ВВ. Пересечение пороговой линии и величина уровня флюоресценции в пределах 22-27 и 1800-2300, соответственно, в канале HEX и отсутствие в канале FAM, интерпретируется как гомозигота АА. Пересечение пороговой линии и величина уровня флюоресценции в пределах 24-30 и 900-1500, соответственно, в обоих каналах, интерпретируется как гетерозигота АВ (фиг 2, 3).

Разработанный нами способ был апробирован на 250 образцах ДНК коров черно-пестрого голштинизированного скота. По результатам генотипирования 22% животных являлись гетерозиготами (генотип АВ), 68,8% - гомозиготами по аллелю А (генотип АА) и 9,2% животных - гомозитотами по аллелю В (генотип ВВ). Валидацию способа проводили с помощью классического метода ПЦР-ПДРФ анализа для диагностики аллельного полиморфизма гена каппа-казеина, основаного на применении рестриктазы Hinfl (Medrano, J.F. Genotyping of bovine kappa-casein loci following DNA sequence amplification / J.F. Medrano, E. Aguilar-Cordova // Bio. Technology. - 1990. - V.8. - P. 144-145). Результаты обоих способов генотипирования полностью совпали. На той же выборке патентуемый способ сравнивали со способом по прототипу: для 245-ти образцов результаты обоих способов и результаты ПЦР-ПДРФ анализа совпали. Пять образца с генотипом АВ определялись по методу прототипа как АА (ошибка составила 2%).

Таким образом, по результатам практических исследований, направленных на апробацию заявляемого способа, нами получен обеспечиваемый этим способом технический результат, выраженный в способности дифференциации аллельного полиморфизма гена каппа-казеина крупного рогатого скота (идентификация генотипов АА, ВВ, АВ).

Предлагаемое изобретение позволит перерабатывающим предприятиям повысить собственную производительность и снизить себестоимость конечной продукции, что позволит увеличить оборот на 20%.

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики, генетики и селекции сельскохозяйственных животных, в частности к оценке аллельного полиморфизма гена, каппа-казеина (CSN3) крупного рогатого скота молекулярно-генетическим методом исследования. Предложен способ проведения ПЦР с аллель-специфичными зондами для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина. В способе используют: прямой общий праймер CSN3-RT-F-114 с нуклеотидной последовательностью 5'-agagcccacctgagatcaac-3'; обратный общий праймер CSN3-RT-R-114 с нуклеотидной последовательностью 5'-tcttggctgttattcattttgc-3'; В-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд Probe 1 с нуклеотидной последовательностью FAM-caactgcggtctaaatactctaaggag-BHQ1; А-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд Probe 2 с нуклеотидной последовательностью HEX-caactgcagtctaaaaactctaaggag-BHQ1. Изобретение позволяет расширить арсенал способов генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина (CSN3) на основе ПЦР в реальном времени и повышение их надежности. 3 ил.

Способ проведения ПЦР с аллель-специфичными зондами для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина, отличающийся тем, что используются:

- прямой общий праймер CSN3-RT-F-114: 5'-agagcccacctgagatcaac-3',

- обратный общий праймер CSN3-RT-R-114: 5'-tcttggctgttattcattttgc-3',

- В-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд Probe 1: FAM-caactgcggtctaaatactctaaggag-BHQ1,

- А-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд Probe 2: HEX-caactgcagtctaaaaactctaaggag-BHQ1,

при этом пересечение пороговой линии и величина уровня флюоресценции в пределах 25-29 и 1200-1800, соответственно, в канале FAM и отсутствие в канале HEX интерпретируется как гомозигота ВВ; пересечение пороговой линии и величина уровня флюоресценции в пределах 22-27 и 1800-2300, соответственно, в канале HEX и отсутствие в канале FAM интерпретируется как гомозигота АА, пересечение пороховой линии и величина уровня флюоресценции в пределах 24-30 и 900-1500, соответственно, в обоих каналах интерпретируется как гетерозигота АВ.