Биотехнологический способ повышения устойчивости привитых саженцев винограда к биотическим стрессорам Российский патент 2023 года по МПК A01N65/00 

Изобретение относится к сельскохозяйственным биотехнологиям и может быть использовано для оздоровления посадочного материала винограда от системных инфекций, что в свою очередь способствует росту устойчивости к другим биотическим стрессорам как при выращивании высококачественных привитых саженцев в школке, так и в эксплуатируемых виноградниках.

Наиболее распространенными и экономически значимыми биотическими стрессорами для растений винограда являются грибные патогены. Особенностью микопатогенов, возбудителей некрозов проводящей системы (трахеомикозов), относящихся к группе так называемой системной хронической инфекции, является их труднодоступность для искоренения и невозможность контроля с помощью обычных опрыскиваний кустов. Виноград -это вегетативно размножаемая культура, поэтому очень важное значение приобретает последовательное формирование высокого адаптационного потенциала и высокой потенциальной продуктивности виноградных растений, начиная с посадочного материала - черенков, затем саженцев и т.д.

В последние годы на фоне увеличения абиотической нагрузки в плодоносящих виноградниках Западного Предкавказья отмечается расширение вредоносного ареала трахеомикозов. Эти заболевания стали одним из значительных факторов дестабилизации фитосанитарного состояния и продуктивности виноградников. Ежегодно в готовых партиях привитых саженцев (после школки) обнаруживается от 20 до 70% и более растений с некрозами сосудов разной степени и локализации, вызванными микопатогенами [Талаш, А.И. Карантин и система контроля при производстве виноградных саженцев // Питомниководство винограда. - Краснодар: СКЗНИИСиВ, 2004. - С. 43-50.; Лукьянова А.А., Никольский М.А., Панкин М.И. Влияние сосудистого некроза на приживаемость привитых черенков винограда и развитие саженцев в школке // Науч. журнал КубГау, №6 (07), 2010, с. 50-52.; Малых Г.П., Кравченко Л.В. Получение посадочного материала винограда, свободного от сосудистого некроза // Виноделие и виноградарство, 2010, №4, с. 40-41].

В производстве привитых саженцев винограда широко применяется привойный материал из эксплуатируемых плодоносящих насаждений, на основе визуального отбора, что не дает гарантии отсутствия трахеомикозной инфекции. Использование травмирующих ткани растений операций при заготовке черенков и изготовлении прививок создает высокий риск для заражения микопатогенами, в том числе возбудителями некрозов сосудов. Таким образом, технология производства существенно влияет на поражение саженцев сосудистым некрозом, особенно привитых, в 2,8-5,7 раза чаще, чем у корнесобственных [Лукьянова А.А. Роль микромицетов в этиологии сосудистого некроза саженцев винограда в анапо-таманской зоне Краснодарского края. Автореф. Канд. Дисс. 06.01.07. Краснодар, КубГАУ. - 2008. - 24 с]. Заражение сосудистым некрозом (трахеомикозом) саженцев плохо влияет на их приживаемость и продолжительность жизни насаждений в дальнейшем. При слабом поражении сосудистым некрозом (на 3-10%) приживаемость саженцев может составлять 93-96%, а к моменту плодоношения винограда процент полноценных кустов может снизиться до 82-90%; при сильном поражении (на 60-100%) - изреженность кустов уже на второй год может достичь 40 - 80% [Мисливский А.И. Элементы технологического комплекса устойчивого производства винограда в Краснодарском крае: дис…. канд. с. -х. наук. -Краснодар: СКЗНИИСиВ, 2000. - 172 с].

Традиционно в процессе производства саженцев используются химические препараты для борьбы с инфекцией. Наиболее широко в прививочных комплексах используют 0,5% водный раствор Хинозола, в котором замачивают черенки с экспозицией 2-5 часов в зависимости от температуры воды. Препарат Хинозол, П - порошок (бис (8-гидроксихинолин) сульфат, 98%), из группы хинолонов первого поколения - широкий биоцид контактного действия, дезинфектант и антисептик. [Вердеревский Д.Д. Хронические болезни плодовых культур и винограда / Д.Д. Вердеревский, Т.Д. Вердеревская, Е.А. Звягина и др.; под ред. проф. Д.Д. Вердеревского. - Кишинев: Картя молдовеняска, 1967. - 135 с; http://importprod.ru/proizvodstvo-posadochnogo-materiala/antisepticheskoe-sredstvo-8-oksixinolin-sulfat-(xinozon.html; https://ogorodstvo.com/bolezxii-rasteniy/bolezni-vinograda/bolezni-vinogradnogo-posadochnogo-materiala.html]. Такая обработка значительно снижает количество инфекции на черенках. Однако недостатком этого способа является непродолжительное антимикробное действие препарата. После обработки черенков вслед за первоначальным снижением численности колоний грибов через 10-14 дней наблюдается резкий рост обсемененности патогенной микрофлорой. Надо отметить, что из-за высокой фитотоксичности препарата, его не используют для обработки на стадии привитых черенков. При выращивании саженцев, обработанных Хинозолом, в школке снижается их приживаемость, выход, отмечается высокая зараженность сосудистым некрозом, что повышает в дальнейшем изреженность виноградников до 20% и более [Громаковский, И К. Выращивание виноградного посадочного материала / И. К. Громаковский // Новое в виноградном питомниководстве ВНР и МССР. -Кишинев, 1984. - С. 94-134]. Использование химического антисептика на протяжении очень долгого времени (более 50 лет) создало высокий риск формирования устойчивых штаммов патогенов.

Известно использование борной кислоты в технологиях производства привитых саженцев винограда - привитые черенки перед парафинированием обрабатывают 0,2% раствором борной кислоты в течение 2-3 секунд, а затем в стратификационной камере выдерживают базальные концы прививок с погружением на глубину 10 см в 0,1%) раствор борной кислоты в течение 72 часов. [Патент №2332837. Способ оздоровления саженцев винограда / Малых Г.П., Малых П.Г., Кравченко Л.В., Киселева Т.Г.]. Недостатком данного способа является то, что при изготовлении прививок черенки подвоя и привоя не обрабатываются, сохраняется высокий риск заражения сосудов. Кроме того, при обработке привитых черенков отмечается недостаточное и непродолжительное антимикробное действие, так как борная кислота обладает слабой антифунгальностью в отношении специфических возбудителей трахеомикоза, и на выходе из школки получается высокий процент больных саженцев.

Использование других химических препаратов в борьбе с комплексом патогенов на саженцах, зарегистрированных в разные годы для винограда, например, из класса бензимидазолов - Фундазол, Карбендазим, Комфорт Дерозал, Топсин М и др. неэкологично, а их действие непродолжительно, что вызывает необходимость многократного применения и создает риск резистентности. При этом большинство химических препаратов предназначено для внешнего опрыскивания; замачивание черенков или привитых саженцев в их растворах может быть фитотоксичным и негативно повлиять на приживаемость, рост и развитие растений в школке.

В последние годы в технологиях выращивания винограда наметился биотехнологический тренд. Для использования в производстве привитых саженцев винограда в школках все больший интерес вызывают полезные микроорганизмы. Известны попытки использования симбиотических микроорганизмов как отдельно Chaetomium sp., [Лукьянова А.А., Пучков В.Н. Изучение ростостимулирующего действия p. Chaetomium sp.на приживаемость и развитие виноградных саженцев / Плодоводство и виноградарство Юга России. -№66(6), 2020 г. DOI 10.30679/2219-5335-2020-6-66-198-207], так и в консорциуме [Лукьянова А.А., Пучков В.Н., Юрченко Е.Г. Влияние комплекса микроорганизмов на рост и развитие виноградных саженцев // Научная жизнь. 2019. Т. 14. №7 (95). С. 1115-1121] с помощью однократного полива. Отмечалось оптимизирующее действие на рост и развитие привитых саженцев в школке. Однако при их использовании не изучалось влияние на подавление инфекции, ассоциированной с растениями винограда, не учитывался выход здоровых саженцев. А между тем однократный полив привитых саженцев биопрепаратами при высадке в школку не подавляет трахеомикозную инфекцию. Проникшие через сосуды во время изготовления черенков микопатогены остаются там, в том числе в латентной форме, и могут негативно повлиять на приживаемость готовых саженцев при закладке виноградников.

Известен способ использования штамма гриба арбускулярной микоризы Glomus intraradices Shenck & Smith, штамм RCAM02146 с помощью замачивания привитых саженцев перед высадкой в школку [Патент №2672381. Биотехнологический способ оптимизации производства привитых саженцев винограда на основе применения гриба Glomus intraradices Shenck & Smith, штамм RCAM02146 / Юрченко Е.Г., Юрков А.П., Политова 3. С]. В данном способе используется симбиотический микроорганизм, который не обладает прямым антимикотическим действием, а только опосредованно может влиять на микрофлору. Данный способ оптимизирует формирование почвенно-биотического комплекса виноградных школок, что положительно влияет на биологическую продуктивность виноградных саженцев и в целом увеличивает выход высококачественных стандартных саженцев. Оптимизация метаболизма обладает иммуноиндуцирующим эффектом в отношении наружных сезонных инфекций (милдью). Однако нет никаких сведений о том, как он влияет на некрозы сосудов, а между тем риски заражения трахеомикозной инфекцией на стадии изготовления черенков сохраняются.

Известна усовершенствованная технология производства привитых саженцев винограда на основе использования экологически безопасных средств защиты - биопрепаратов на основе антагонистической микрофлоры - Гуапсина {Pseudomonas aureofaciens штамм В-306 и В-111 с неизвестным титром) и Триходермина (штамм Trichoderma viride Pers., с титром не ниже 2×10⁹ КОЕ/мл [Володин В.А. Экологизация элементов технологии производства привитых виноградных саженцев в условиях Крыма: дисс.канд. с. -х. наук: 06.01.08/ Володин Виталий Александрович. - СКФНЦСВВ, Краснодар, 2016. - 190 с.]. Происхождение и принадлежность микроорганизмов-продуцентов этих препаратов неизвестны. В данном способе проводят обеззараживание черенков в растворах Гуапсина, 0,2% или Триходермина, 0,5% с экспозицией: черенки подвоя 16 часов, привоя - 12 часов. Затем в период проведения стратификации 1-3-кратно (в зависимости от способа на воде или на торфе) опрыскивают привитые черенки биофунгицидами Гуапсин, 0,2% или Триходермин, 0,5%. Недостатком данного способа является то, что для снижения влияния жестких климатических условий на процессы роста и развития привитых черенков, увеличения выхода привитых стандартных саженцев и улучшения их биометрических показателей дополнительно применяются растворы специальных препаратов - регуляторов роста Атоник Плюс, 0,02% и Гумисол, 0,01% на этапе выращивания школки. Дополнительное применение средств с ростостимулирующей активностью несет в себе риски передозировок в конкретных условиях школок и может оказать негативное действие - излишний рост клеток тканей растений, вызываемый ими, снижает адаптивный потенциал к стрессовым условиям среды, иммунный статус, повышает заболеваемость. Кроме того, у Гуапсина и Триходермина используемых в данном способе, неизвестна эффективность в отношении специфических возбудителей трахеомикозов винограда, например, таких как фузарие-вые грибы.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение выхода качественных оздоровленных привитых саженцев винограда, увеличение их приживаемости как в школке, так и при закладке виноградников, повышение устойчивости к биотическим стрессорам растений винограда и снижение себестоимости производства посадочного материала.

Предлагаемый способ заключается в применении вымочки черенков подвоя и привоя в антимикробном растворе перед прививкой, затем опрыскивании антимикробным раствором привитых черенков на стадии закалки после стратификации и замачивания в антимикробном растворе перед посадкой, в последующем выращивают по принятой в отдельном хозяйстве технологии.

Технический результат достигается тем, что в разработанном биотехнологическом способе проводят замачивание черенков подвоя и привоя на 48-72 часа (в зависимости от исходной влажности черенков) в антимикробном 0,5%-ном водном растворе культуральной жидкости штамма Т. viride F-838 с титром не ниже 1×10⁹ КОЕ/мл, в срок до изготовления прививок (соединения подвоя с привоем), затем после парафинирования прививок, их хранения и стратификации (на воде) на этапе закалки проводят 1-2-кратное опрыскивание 0,5%-ным водным раствором культуральной жидкости штамма Т. viride F-838 с титром не ниже 1×10⁹ КОЕ/мл, и затем перед посадкой в школку привитые саженцы винограда еще раз замачивают на 2-3 часа в смеси 1:1 0,5%-ного водного раствора культуральной жидкости штамма Т. viride F-838 с титром не ниже 1×10⁹ КОЕ/мл и 0,5%-ного и водного раствора культуральной жидкости штамма Т. viride 256 с титром не ниже 1×10⁹ КОЕ/мл

Впервые для повышения устойчивости привитых виноградных саженцев к биотическим стрессорам используются специально подобранные (на основании скрининга на антимикотическую активность в отношении целевых патогенов) штаммы гриба Trichoderma viride Pers.: Т. viride F-838; Т. viride 256, путем 2-кратного замачивания и опрыскивания для подавления не только наружной, но и системной (сосудистой) инфекции. При этом штамм Т. viride F-838 обладает выраженной антагонистической, гиперпаразитной и конкурентной активностью в том числе в отношении грибов рода Fusarium и возбудителя эски Phomopsis viticola, а штамм Т. viride 256 наряду с антагонистической активностью обладает и эффективным росторегуляторным действием. Как показали исследования биологическая эффективность способа в оздоровлении от сосудистого некроза составляет 93,5-96,8%, что на 35,5% выше в среднем эффективности традиционной технологии с применением Хинозола. В период выкопки готовых саженцев из школки наблюдается снижение общей численности плесневых грибов, ассоциированных с растениями, при этом отмечается полное отсутствие специфической трахеомикозной инфекции по сравнению с традиционной технологией, где в составе микрофлоры сохраняются патогенные виды фузариев и фомопсис. При применении предлагаемого способа наряду с высокой фунгицидной активностью проявляется адаптивное регуляторное воздействие в целом на структуру микромицетов, нет резких колебаний численности отдельных групп грибов, появляются виды-антагонисты. Такой механизм влияния предполагает более пролонгированное подавляющее действие на системную инфекцию и снижает риски заражения патогенами при различных стрессах как на стадии производства саженцев в школке, так и в дальнейшем при закладке виноградников.

Положительными показателями новой технологии являются: увеличение приживаемости саженцев в школке в стрессовых средовых условиях на 11-14%; увеличение выхода саженцев на 21-35%, а также более высокая приживаемость саженцев при закладке промышленных виноградников - на 15-18% по сравнению с традиционной технологией. Инновационная технология позволяет сократить издержки на защиту в среднем на 20%, относительно доходной части на 20,5 пункта; снизить себестоимость производства саженца на 32% или на 24 руб/шт; способствует росту выручки от продаж на 52,3%, росту прибыли от продаж - в 2,5 раза; рост рентабельности производства может достигнуть 126%. Биотехнология обладает характеристиками, требующимися для агроприемов в адаптивном земледелии - экологичная, экономичная, ресурсосберегающая (используются возобновляемые биологические ресурсы).

Сущность изобретения. После первой обработки - вымочки черенков в растворах антимикробных препаратов - наибольшее снижение общей численности микромицетов (по сравнению с контролем) наблюдалось в варианте обработки Хинозолом - в 4,7 раза. В варианте обработки штаммом Т. viride F-838 - в 3,1 раза; при обработке Хинозолом на фоне снижения грибной микрофлоры резко выросла численность бактерий (почти в 2,8 раза), (табл.1 ).

После обработки привитых черенков (опрыскивания после стратификации на стадии закалки) численность микромицетов заметно снизилась только в варианте штамма Т. viride F-838 (в 2,5 раза); кроме того, в структуре комплекса микромицетов уменьшилась доля плесневых грибов, особенно заметно в варианте штамма Т. viride F-838 (табл. 2).

Общая численность бактерий при обработке привитых черенков штаммом Т. viride F-838 снизилась в 2 раза по сравнению с контролем и в 2,8 раза по сравнению с Хинозолом; при этом у Хинозола наблюдали увеличение бактериальной обсемененности в 1,3 раза по сравнению с контролем (фиг. 1).

Оздоравливающее влияние биотехнологии, т.е. всего комплекса обработок биопрепаратами на основе специально подобранных штаммов Т. viride (замачивание черенков перед прививкой, опрыскивания привитых черенков и замачивания привитых саженцев перед посадкой), оценивали на основании анализа общей численности и таксономического состава микокомплекса на привойной и подвойной частях готовых привитых саженцев (после выкопки). На привое снижение общей численности грибов отмечалось в обоих вариантах обработок: Хинозолом и штаммами Т. viride F-838; Т. viride 256, но в варианте Хинозола отмечался более интенсивный рост доли гифомицетов (плесневых грибов) более чем в 2,2 раза по сравнению с контролем и более чем в 1,5 раза по сравнению со смесью штаммов Т. viride (табл. 3).

На подвое снижение общей численности микромицетов при обработке штаммами Т. viride F-838 и Т. viride 256 произошло примерно в 7 раз по сравнению с контролем и в 11 раз - по сравнению с Хинозолом (табл. 4).

В вариантах Хинозола на фоне роста общей численности микромицетов (в 1,5 раза по сравнению с контролем) в структуре микокомплекса, ассоциированного с подвоем, 100% занимали плесневые грибы, что можно отметить, как дисбаланс.

В исследованиях рассматривалось также изменение таксономической структуры комплекса гифомицетов, ассоциированных с растениями в условиях обработок. В период производства саженцев на этапах черенков и прививок (привитых черенков) наиболее распространенной и опасной является инфекция серой гнили, чему способствуют оптимальные условия среды -наличие тепла и влаги. На этапе черенков в подавлении В. cinerea оба варианта показали высокую эффективность, однако Хинозол не смог полностью подавить трахеомикозную инфекцию (Phomopsis viticold). При этом надо заметить, что в структуре микромицетов варианта биотехнологии почти 2/3 комплекса занимали триходермовые грибы (табл. 5).

На этапе прививок в варианте Хинозола В. cinerea занимал 10,2% от всего количества гифомицетов, кроме того, отмечался резкий рост доли пеницилловых грибов. В варианте штамма Т. viride F-838 серая гниль отсутствовала, наибольшую долю в структуре микокомплекса занимали триходермовые грибы (табл. 6).

На этапе готовых саженцев (после выкопки) в варианте Хинозола обнаруживались возбудители трахеомикозов {Fusarium sp., в т.ч. Fusarium spo-rotrichioides; Phomopsis viticold), как на привойной части, так и на подвойной, что можно рассматривать как негативное влияние. В варианте биотехнологии специфические возбудители трахеомикозов полностью контролировались, при этом в микокомплекс входили триходермовые грибы (табл. 7, 8).

Появление триходермовых грибов можно рассматривать как механизм саморегуляции грибного патокомплекса, что обеспечивает его пролонгированное действие в контроле патогенов.

На заключительном этапе (после выкопки готовых саженцев) была проведена сравнительная оценка биологической эффективности технологий (химической и биологической) в снижении заражения трахеомикозной инфекцией растений. Наибольшее антимикробное действие выявлено в варианте биотехнологии - 93,5%. Использование биотехнологии на 2-й год в производственном опыте также имело высокую биологическую эффективность в оздоровлении от сосудистого некроза саженцев - 96,8% (фиг. 2).

Таким образом, на основании сравнительного анализа влияния химического и биотехнологического способов на патогенную и условно патогенную микрофлору саженцев винограда, входящую в патокомплекс сосудистого некроза, отмечена преимущественная эффективность подавляющего действия биотехнологии на микопатогены в целом и сложно искореняемую сосудистую инфекцию в частности. Механизм влияния предполагает более пролонгированное антимикотическое действие и снижает риски заражения патогенами при различных стрессах на стадии выращивания саженцев в школке и в дальнейшем при закладке виноградников.

Использование в биотехнологии штаммов с полифункциональными свойствами (антифунгальность и рострегуляция) решает проблемы не только снижения инфекции, но и оптимизации метаболизма, т.е. включается еще и механизм иммуноиндукции, что также способствует повышению устойчивости саженцев к биотическим стрессорам. Ниже приведены данные 2-летних исследований по оценке рострегуляторной эффективности новой биотехнологии (табл. 9. 10, 11).

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой способ, включающий обработку антимикробными растворами биопрепаратов на этапах производства привитых саженцев винограда. Продуцентами биопрепаратов являются специально подобранные штаммы гриба Trichoderma viride Pers.: Т. viride F-838; Т. viride 256. Изобретение позволяет снизить поражение привитых саженцев сосудистым некрозом до 93,5-96,8% и полностью контролирует специфических возбудителей трахеомикозов - грибов рода Fusarium sp., в т.ч. Fusarium sporotrichioides; Phomopsis viticola. Способ позволяет увеличить приживаемость саженцев в школке в стрессовых средовых условиях на 11-14%; увеличить выход саженцев на 21-35% и их приживаемость при закладке промышленных виноградников на 15-18%. 2 ил., 11 табл.

Биотехнологический способ повышения устойчивости привитых саженцев винограда к биотическим стрессорам, заключающийся в применении перед прививкой вымочки черенков подвоя и привоя в антимикробном растворе; опрыскивания антимикробным раствором привитых черенков на стадии закалки после стратификации; замачивания в антимикробном растворе перед посадкой и последующей технологией выращивания, принятой в хозяйстве, отличающийся тем, что в качестве антимикробных растворов применяют 0,5% водные растворы культуральной жидкости штаммов гриба Trichoderma viride Pers.: Trichoderma viride F-838 и Trichoderma viride 256, при этом перед прививкой черенки подвоя и привоя замачивают на 48-72 часа в зависимости от исходной влажности черенков, в 0,5%-ном водном растворе культуральной жидкости штамма Trichoderma viride F-838; на этапе закалки проводят 1-2-кратное опрыскивание 0,5%-ным водным раствором культуральной жидкости штамма Trichoderma viride F-838; перед посадкой в школку привитые саженцы винограда замачивают на 2-3 часа в растворе смеси в пропорции 1:1 0,5%-ного водного раствора культуральной жидкости штамма Trichoderma viride F-838 и 0,5%-ного водного раствора культуральной жидкости штамма Trichoderma viride 256.