СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОНЕРАСТВОРИМОГО МЕЛАНИНА ИЗ МУХИ ЧЕРНАЯ ЛЬВИНКА HERMETIA ILLUCENS Российский патент 2023 года по МПК C09B61/00 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения водонерастворимого меланина. Полученный биополимер может применяться для сорбции тяжелых металлов и радионуклидов, а также в косметологии, фармацевтике, медицине.

Технология переработки отходов личинками черной львинки Hermetia illucens (далее по тексту - H. illucens) получила широкое распространение по всему миру, и в последние годы внедряется и на территории нашей страны. В качестве отходов переработки личинок остается хитин-содержащее сырье, из которого можно получать хитин и хитозан [С.А. Лопатин, А.Ш. Хайрова, И.В. Соколов, В.П. Варламов «Способ получения хитина из личинок черной львинки Hermetia illucens», Патент РФ №2680691, 25.02.2019; С.А. Лопатин, А.Ш. Хайрова, В.П. Варламов «Способ получения хитозана из мухи черная львинка Hermetia illucens», Патент РФ №2763174, 28.12.2021], что потенциально может повысить эффективность технологии утилизации. Кроме того, отходом при воспроизводстве личинок из маточного поголовья остаются кутикулы куколок и подмор насекомых, которые никак не используются и могут служить сырьем для получения хитин- и хитозан-меланиновых комплексов. Ранее нами была разработана технология на получение хитозан-меланинового комплекса из данного вида насекомого [С.А. Лопатин, А.Ш. Хайрова, И.В. Соколов, В.П. Варламов «Способ получения ковалентно-связанного хитозан-меланинового комплекса из мухи черная львинка Hermetia illucens», Патент РФ №2728458, 29.07.2020]. Заявленный способ получения меланина разрабатывался в рамках проекта по комплексной переработки мухи черная львинка на разных стадиях онтогенеза с целью повышения эффективности технологии утилизации органических отходов личинками H. illucens.

Меланины представляют собой гетерологичную группу биополимерных пигментов, которые синтезируются различными прокариотами и эукариотами. Меланины - природные фото- и радиопротекторы, широко используемые в качестве биологически активных материалов и функциональных полимеров в биотехнологической промышленности. H. illucens накапливает меланин на более поздних стадиях онтогенеза, начиная с предкуколки. Этот пигмент связан в насекомом с другими соединениями, такими как белки, хитин, образуя биополимерные комплексы. Однако, такие комплексы частично разрушаются при обработке щелочью, в результате чего может быть получен чистый меланин.

Известные способы получения меланина из насекомых основаны на растворимости пигмента в щелочных условиях с последующей стадией осаждения при изменении pH среды в кислую область. В работе [Р.В. Некрасов и др., Меланиновая белково-энергетическая добавка из личинок Hermetia illucens в питании телят // Сельскохозяйственная биология. 2018. Т. 53. №2. С. 374-384] предлагается применение меланиновой белково-энергетической добавки (МБЭД) из смеси личинок и предкуколок H. illucens в рационе телят черно-пестрой породы для повышения их сохранности и интенсивности роста. Авторами было отмечено положительное воздействие микродозы МБЭД на показатели неспецифического иммунитета и состав кишечного микробиоценоза у подопытных животных, а также показатели роста, сохранности животных, конверсии корма. В другой работе [М.А. Фролова и др., Сорбционные и нейтрализующие свободные радикалы свойства меланина из подмора мухи черная львинка Hermetia illucens // Ветеринарный врач. 2022. №4. С. 66-71] рассматривается возможность использования меланина из подмора H. illucens в качестве сорбента. Несмотря на то, что астромеланин из антарктических дрожжей Nadsoniella nigra оказался эффективнее меланина из подмора мухи чёрная львинка при изучении антирадикальной и сорбционной активностей, авторы работы приходят к заключению, что меланин из H. illucens может быть использован в составе БАД и косметических средств.

В работе [М.И. Селионова и Н.В. Погарская «Способ получения хитозан-меланинового комплекса из подмора пчел», Патент РФ №2382051, 21.07.2008] описан способ получения меланина из подмора пчел как одного из составляющих при получении хитозан-меланинового комплекса. Способ включает предварительную сушку хитин-меланинового сырья до влажности 4-6%, обеспечивающую его крошимость, затем высушенную массу перетирают до порошкообразного состояния, депротеинируют 10% раствором щелочи NaOH при температуре 78-82°С в течение 1,5-2,0 часов. 50% раствор NaOH добавляют в реакционную смесь, таким образом доводя его концентрацию до 30% от исходной. Полученный хитин-меланиновый комплекс деацетилируют при температуре 90-95°С в течение 1,5-2,0 часов, фильтруют, при этом отфильтрованную массу получают путем промывания массы дистиллированной водой до достижения рН 7. Из оставшегося после фильтрования раствора осаждают меланин воздействием концентрированной соляной кислоты до изменения рН среды обрабатываемого раствора в кислую область и выпадения хлопьевидного осадка, представляющего собой меланин. Меланин отделяют от жидкой фазы центрифугированием, промывают и сушат при температуре 50-60°С до влажности 8-10%.

Также этот способ с некоторыми модификациями опубликован в двух статьях [Н.В. Погарская, М.И. Селионова, Получение хитозан-меланинового комплекса из подмора пчел и его использование для профилактики дисбактериоза молодняка животных. С. 188-190, 2008] и [Н.В. Погарская, М.И. Селионова, В.В. Бинатова, Получение хитозан-меланинового комплекса из подмора пчел и определение его физико-химических и биологических характеристик // Веткорм. 2008. №6. С. 28-29]. Предварительно высушенный до влажности 3-4% пчелиный подмор растирают в ступке или в барабанной мельнице до размера частиц 3-4 мм. В полученный порошок добавляют 10% раствор NaOH в соотношении 1:10 по массе и проводят деацетилирование при постоянном перемешивании при 78-82 в закрытом сосуде без доступа воздуха в течение 1,5 ч. Затем после охлаждения в том же количестве добавляют 50% раствор NaOH, доводя концентрацию NaOH до 30% от исходной, и проводят процесс деацетилирования в закрытом сосуде при 90-97 в течение 1,5-2,0 ч при периодическом перемешивании. Извлечение меланина из щелочного экстракта проводится осаждением концентрированной соляной кислотой до изменения pH среды в кислую область с последующим центрифугированием раствора при 5000 об/мин в течение 15 мин. Полученный меланин промывают до нейтральной реакции промывных вод с последующим центрифугированием и сушкой. Полученный меланин сушат одновременно с хитозан-меланиновым комплексом в сушильном шкафу при 50.

Способ получения меланина из мухи черной львинки H. illucens также описан в работах [А.И. Бастраков и др., Муха черная львинка Hermetia illucens в условиях искусственного разведения - возобновляемый источник меланин-хитозанового комплекса // Известия Уфимского Научного Центра РАН. 2016. №4. С. 77-79] и [Н.А. Ушакова и др., Меланины и особенности меланогенеза на разных стадиях жизненного цикла мухи Hermetia illucens // Известия РАН. Серия биологическая. 2018. №1. С. 55-59]. Авторы работы не описывают сам способ, а ссылаются на работу Н.В. Погарской [Pogarskaya N.V., Selionova M.I., Binatova V.V. Production of chitosan-melanin complex from dead bees and identification of its physicochemical and biological characteristics // Vetkorm. 2008. №6. С. 28-29], что свидетельствует о получении меланина путем его осаждения в соляной кислоте. Идентификацию пигментов проводили на основании оценки их растворимости, спектральных и парамагнитных свойств.

Известен способ получения меланина из личинок черной львинки [Г.Е. Гайдадин «Способ получения меланина из личинок черной львинки», Патент РФ №2692260, 24.06.2019]. Способ получения меланина из личинок мух черной львинки в возрасте от 25 до 35 дней заключается в том, что сначала личинки тщательно промывают и высушивают, затем помещают в экструдер, и экструдирование осуществляют при температуре 37-38 методом холодного отжима в течение одной минуты, по завершении экструдирования дают полученному экструдату отстояться до разделения на фракции при температуре от 0 до -15 и полученный на поверхности слой меланина отделяют механическим способом, для повторного получения слоя меланина оставшуюся смесь выдерживают при комнатной температуре и полученный на поверхности слой меланина отделяют механическим способом, после чего на завершающем этапе оставшуюся смесь замораживают, затем нагревают ее до комнатной температуры, и вновь полученный на поверхности слой меланина отделяют механическим способом, при определенных условиях. Способ позволяет получить меланин путем естественной переработки личинок, не прибегая к агрессивным воздействиям химических реагентов.

В данной работе не описывается метод определения примесей в конечном продукте. По данным автора, содержание меланина составляло 88-90%, что свидетельствует о наличии примесей. Жир, более легкий по сравнению с меланином, образуется на поверхности, и входит в состав конечного продукта.

Наиболее близким к заявленному является способ получения меланина, описанный в работе [Ushakova N. и др. Antioxidative Properties of Melanins and Ommochromes from Black Soldier Fly Hermetia illucens // Biomolecules. 2019. №9. С. 408]. Подмор H. illucens собирали после окончания их жизненного цикла и хранили в замороженном виде при температуре -18. Для получения меланина биомассу сначала гомогенизировали в смесителе. Затем водорастворимый меланин экстрагировали с использованием 10% NaOH в соотношении масса/объем 1:4 при комнатной температуре в течение 16 ч. Щелочной экстракт фильтровали через бумажный фильтр. Водорастворимый меланин осаждали из экстракта путем его подкисления до рН 2,0 концентрированной соляной кислотой. Осадок промывали дистиллированной водой до нейтрального pH с последующим центрифугированием не менее 3 раз, после чего высушивали при 70 до постоянной массы. Согласно данным, полученным с помощью электронного парамагнитного резонанса, выделенный меланин относится к классу «эумеланинов». Тем не менее, авторы не указывают выход конечного продукта.

В заявленном нами способе депротеинирование проводится с использованием 15% щелочи при 100. Это гарантирует, что водорастворимый меланин на данной стадии переходит в раствор, а после обработки 50% NaOH в экстракт переходит меланин, нерастворимый не только в воде, но и разбавленных щелочных растворах. Это служит существенным отличием меланина, получаемого по заявленному способу. Потенциальным применением данного биополимера может быть использование в качестве природного сорбента тяжелых металлов и радионуклидов.

Можно сделать вывод, что практически во всех описанных ранее работах меланин получали из гидролизата путем осаждения при подкислении соляной кислотой. Следует отметить, что в некоторых работах меланин выделяли из личинок H. illucens, что свидетельствует о неэффективности процесса получения пигмента. На ранних стадиях онтогенеза содержание меланина незначительное, так как насекомое приобретает окраску в процессе своего развития, поэтому использование взрослых имаго представляется более целесообразным. Кроме того, подмор H. illucens остается побочным продуктом при воспроизводстве личинок из маточного поголовья, и перспектива его дальнейшего использования для получения биологически активных веществ способна повысить эффективность процесса переработки отходов.

Нами был разработан способ получения водонерастворимого меланина из подмора H. illucens без стадии осаждения с использованием кислоты.

Подмор H. illucens служил исходным сырьем для получения меланина. В исходном сырье содержалось более 30% белка, около 5% золы и 27% жира. Содержание золы определяли гравиметрически, массовую долю жира в образце - экстракцией органическим растворителем в аппарате Сокслета, а содержание белка путем анализа аминокислот (свободных и связанных) - методом ионообменной хроматографии с постколоночной дериватизацией проб нингидрином.

В основе предлагаемого способа получения меланина лежит ранее запатентованная нами технология по получению хитозан-меланинового комплекса из H. illucens [С.А. Лопатин, А.Ш. Хайрова, И.В. Соколов, В.П. Варламов «Способ получения ковалентно-связанного хитозан-меланинового комплекса из мухи черная львинка Hermetia illucens», Патент РФ №2728458, 29.07.2020].

Сущность способа получения меланина из мухи черная львинка H. illucens заключается в следующем: подмор H. illucens подвергают стадиям деминерализации (1-2% HCl, 1,5-2 ч, 20) и депротеинирования (15% NaOH, 2 ч, 100). Депротеинированную материю обрабатывают 50% NaOH 1,5-2 ч при 100. Реакционную смесь фильтруют на стеклянном пористом фильтре. Фильтрат разбавляют дистиллированной водой в 15-20 раз, перемешивают и оставляют на 24 ч для формирования осадка. Выпавший осадок меланина в фильтрате отмывают водой методом декантации. После декантации осадок переносят в диализный мешок, суспензию меланина диализуют против воды в Spectra/Por Membrane MWCO:14,000 до pH не более 9 и лиофильно высушивают. Получаемый на этой стадии пигмент является наиболее чистым, так как после проведения депротеинирования, деминерализации и деацетилирования в гидролизате практически полностью отсутствуют белок или другие примеси.

Полученный продукт представляет собой черный порошок, нерастворимый в диапазоне рН от 0 до 13. Образующийся при экстракции меланина хитозан-меланиновый комплекс может быть использован в качестве УФ-фильтра [А.Ш. Хайрова и др., Хитозан-меланиновый полимерный комплекс - перспективный ингредиент эмульсионных композиций // Все материалы. Энциклопедический справочник. 2021. №10. С. 35-40] или сорбента тяжелых металлов и радионуклидов [М.А. Фролова и др., Сорбционные и нейтрализующие свободные радикалы свойства меланина из подмора мухи черная львинка Hermetia illucens // Ветеринарный врач. 2022. №4. С. 66-71].

Технический результат данного способа заключается в получении меланина с широким спектром потенциальных областей применения. Более того, из-за своей нерастворимости полученный продукт предпочтителен в качестве сорбента тяжелых металлов и радионуклидов, чем растворимые меланины.

Основное отличие данного способа заключается в том, что для выделения меланина не используется кислота, что повышает экономическую эффективность процесса.

Пример 1

400 г сухого подмора мухи черная львинка депротеинируют на водяной бане в течение 2 ч при 100 с использованием 2,5 л 15% (в/в) NaOH, перемешивая. Затем полученный твердый остаток отделяют на пористом стеклянном фильтре, промывают дистиллированной водой до нейтрального значения pH и высушивают. Получают 32 г материи (8%).

Затем к 30 г депротеинированного подмора добавляют 300 мл 1% HCl и перемешивают 2 ч при 20. После этого твердый остаток отделяют на пористом стеклянном фильтре. Затем промывают дистиллированной водой до нейтральных значений рН и лиофильно высушивают. Получают 25 г деминерализованной материи (83%).

К 15 г полученной материи добавляют 400 мл 50% (в/в) NaOH. Реакцию проводят при 100 на водяной бане в течение 2 ч, перемешивая. Суспензию охлаждают, реакционную смесь фильтруют на пористом стеклянном фильтре.

К 100 мл фильтрата добавляют 1,9 л воды, перемешивают и оставляют на 24 ч для формирования осадка. Выпавший осадок меланина в фильтрате отмывают водой методом декантации. После декантации суспензию этого осадка переносят в диализный мешок, суспензию меланина диализуют против воды в Spectra/Por Membrane MWCO:14,000 до pH не более 9 и лиофильно высушивают. Получают 0,91 г меланина (6,1%).

Пример 2

200 г сухого подмора мухи черная львинка депротеинируют на водяной бане в течение 2 ч при 100 с использованием 1 л 15% (в/в) NaOH, перемешивая. Затем полученный твердый остаток отделяют на пористом стеклянном фильтре, промывают дистиллированной водой до нейтрального значения pH и лиофильно сушат. Получают 14 г материи (7%).

Затем к 10 г депротеинированного подмора добавляют 100 мл 1% HCl и перемешивают 1,5 ч при 20. После этого твердый остаток отделяют на пористом стеклянном фильтре. Затем промывают дистиллированной водой до нейтральных значений рН и лиофильно высушивают. Получают 8,4 г деминерализованной материи (84%).

К 8 г полученной материи добавляют 200 мл 50% (в/в) NaOH. Реакцию проводят при 100 на водяной бане в течение 1,5 ч, перемешивая. Суспензию охлаждают, реакционную смесь фильтруют на пористом стеклянном фильтре.

К 100 мл фильтрата добавляют 1,9 л воды, перемешивают и оставляют на 24 ч для формирования осадка. Выпавший осадок меланина в фильтрате отмывают водой методом декантации. После декантации суспензию этого осадка переносят в диализный мешок, суспензию меланина диализуют против воды в Spectra/Por Membrane MWCO:14,000 до pH не более 9 и лиофильно высушивают. Получают 0,45 г меланина (5,6%).

Пример 3

Аналогично примеру 1, но после стадии депротеинирования материю не высушивают, а сразу обрабатывают 1,5 л 2% HCl, отделяют на пористом стеклянном фильтре и высушивают. Получают 28 г материи (7%). К 25 г полученной материи добавляют 1000 мл 50% раствора NaOH при 100 в течение 2 часов при перемешивании. Суспензию охлаждают, реакционную смесь фильтруют на пористом стеклянном фильтре. К 200 мл фильтрата добавляют 2,8 л воды, перемешивают и оставляют на 24 ч для формирования осадка. Выпавший осадок меланина в фильтрате однократно промывают водой методом декантации. После декантации суспензию этого осадка переносят в диализный мешок, диализуют против воды в Spectra/Por Membrane MWCO:14,000 до pH не более 9 и лиофильно высушивают. Получают 1,3 г меланина (5,2%).

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения нерастворимого меланина из подмора мухи черной львинки Hermetia illucens. Способ получения нерастворимого меланина из подмора мухи черной львинки Hermetia illucens заключается в том, что 200-400 г высушенного подмора подвергают стадиям деминерализации путем обработки 100-1500 мл 1-2% HCl при комнатной температуре в течение 1,5-2 ч и депротеинирования путем обработки 15% в/в NaOH при 100°С, твердый остаток фильтруют на пористом стеклянном фильтре, промывают дистиллированной водой до нейтральных значений рН и высушивают, затем подвергают обработке 50% в/в NaOH в течение 1,5-2 ч при 100°С при перемешивании, твердый остаток отделяют на пористом стеклянном фильтре, а фильтрат разбавляют в 15-20 раз дистиллированной водой, после формирования осадка меланина однократно промывают дистиллированной водой методом декантации, затем суспензию меланина переносят в диализный мешок, диализуют против воды в Spectra/Por Membrane MWCO:14,000 до pH не более 9 и лиофильно высушивают. Вышеописанный способ позволяет получать меланин с широким спектром потенциальных областей применения, в том числе из-за своей нерастворимости полученный продукт предпочтителен в качестве сорбента тяжелых металлов и радионуклидов. 3 пр.

Способ получения нерастворимого меланина из подмора мухи черной львинки Hermetia illucens заключается в том, что 200-400 г высушенного подмора подвергают стадиям деминерализации путем обработки 100-1500 мл 1-2% HCl при комнатной температуре в течение 1,5–2 ч и депротеинирования путем обработки 15% в/в NaOH при 100°С, твердый остаток фильтруют на пористом стеклянном фильтре, промывают дистиллированной водой до нейтральных значений рН и высушивают, затем подвергают обработке 50% в/в NaOH в течение 1,5-2 ч при 100°С при перемешивании, твердый остаток отделяют на пористом стеклянном фильтре, а фильтрат разбавляют в 15-20 раз дистиллированной водой, после формирования осадка меланина однократно промывают дистиллированной водой методом декантации, затем суспензию меланина переносят в диализный мешок, диализуют против воды в Spectra/Por Membrane MWCO:14,000 до pH не более 9 и лиофильно высушивают.