СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКА ИЗ ПОДМОРА МУХИ ЧЕРНАЯ ЛЬВИНКА HERMETIA ILLUCENS Российский патент 2024 года по МПК A23J1/00 A23J1/02 A23K10/20 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения белка. Полученный белок может применяться в качестве полноценного корма или кормовой добавки для с/х и домашних животных, рыб.

Технология переработки органических отходов личинками мухи черная львинка (Hermetia illucens, H. illucens) позволяет не только решать вопросы экологии, но и получать ценные продукты, такие как зоокомпост и цельные личинки, которые затем служат источником кормового белка, энтомологического жира, хитина и его производного хитозана [Лопатин С.А., Хайрова А.Ш., Соколов И.В., Варламов В.П. «Способ получения хитина из личинок черной львинки Hermetia illucens», Патент РФ №2680691, 25.02.2019; Хайрова А.Ш., Лопатин С.А., Варламов В.П. «Способ получения хитозана из мухи черная львинка Hermetia illucens», Патент РФ №2763174, 28.12.2021.]. В отличие от личинок, подмор H. illucens (погибшие имаго) не используется, а остается в качестве отхода при воспроизводстве личинок из маточного поголовья. Ранее нами было показано, что подмор может служить сырьем для производства таких ценных продуктов, как хитин- и хитозан-меланиновые комплексы [Лопатин С.А., Хайрова А.Ш., Соколов И.В., Варламов В.П. «Способ получения ковалентно-связанного хитозан-меланинового комплекса из мухи черная львинка Hermetia illucens», Патент РФ №2728458, 29.07.2020] с потенциальным применением в производстве косметики и сорбентов. При получении этих продуктов применятся стадия депротеинирования для удаления белка. Так как содержание белка в подморе может достигать 30 %, выделение белковой фракции из имаго представляется целесообразным.

Данный патент направлен на выделение белка для кормовых целей, что потенциально может повысить эффективность комплексной переработки отходов личинками черной львинки. Несмотря на то, что использование биотехнологии с личинками H. illucens активно развивается, число исследований, посвященных получению белка из черной львинки, ограничено, в частности, не было отмечено работ по выделению белковой фракции из подмора мух. Как правило, получение белка из насекомых включает такие стадии, как гомогенизация/измельчение, обезжиривание, растворение с последующим высаживанием белка, сушка.

В работе [Сапронова Ж.А., Свергузова С.В. Этапы процесса получения животного белка и липидного концентрата при биоконверсии отходов с использованием насекомого Hermetia illucens // Безопасность, защита и охрана окружающей природной среды: фундаментальные и прикладные исследования. Сборник докладов Всероссийской научной конференции. Белгород. 2020. С. 369-372] предлагается технологический процесс получения животного белка и липидного концентрата из черной львинки, включающий следующие этапы:

- отжатие личинок на маслопрессе, где происходит отделение твердого белкового остатка, который поступает в сборник белковой фракции, и жидкой фракции;

- жидкая фракция по трубопроводу поступает в сборник, оборудованный системой подогрева;

- нагрев липидной фракцией с водой;

- очистка липидной фракции на тарельчатом сепараторе с горячей водой;

- отделенный белковый компонент с тарельчатого сепаратора поступает в общий сборник белковой фракции;

- белковая фракция сушится при температуре 70 , после чего поступает на хранение/фасовку;

- липидная фракция подается в специализированный сборник, охлаждается и поступает на хранение/фасовку.

Тем не менее, авторы не приводят массовые значения полученных продуктов и не определяют содержание примесей в них. Отсутствие в предложенной технологии этапа депротеинирования щелочью не обеспечивает получение чистого продукта.

В работах [Ушакова Н.А., Пономарев С.В., Федоровых Ю.В., Бастраков А.И. Использование протеин-хитинового концентрата личинок черной львинки Hermetia illucens в рационе всеядных рыб на примере красной тиляпии // Известия Уфимского Научного Центра РАН. Серия биологическая, 2018. № 3(3). С. 41-45] и [Ушакова Н.А. и др. Физиологические основы питательной ценности концентрата личинок Hermetia illucens в рационе рыб // Известия РАН. Серия биологическая, 2020. № 3. С. 293-300] получали концентрат черной львинки - протеин с хитином.

В работе [Ушакова Н.А., Пономарев С.В., Федоровых Ю.В., Бастраков А.И. Использование протеин-хитинового концентрата личинок черной львинки Hermetia illucens в рационе всеядных рыб на примере красной тиляпии // Известия Уфимского Научного Центра РАН. Серия биологическая, 2018. № 3(3). С. 41-45] биомассу личинок H. illucens подвергали обезжириванию прямым отжимом на маслопрессе. Полученный концентрат протеина с хитином содержал 2 % влаги, 53,4 % сырого протеина, 5,1 % сырого жира, 18,3 % хитина (по клетчатке), 7,6 % золы. Полученные данные позволили сделать вывод, что полная замена рыбной муки на протеин-хитиновый концентрат личинок H. illucens не оказывает негативного влияния на рыбоводно-биологические и физиологические показатели молодя красной тиляпии. При этом высокое содержание хитина личинок (более 8 %) в опытном комбикорме не привело к ожидаемому снижению массы тела и содержания жира в мышечной ткани рыб по окончании экспериментального кормления.

В работе [Ушакова Н.А. и др. Физиологические основы питательной ценности концентрата личинок Hermetia illucens в рационе рыб // Известия РАН. Серия биологическая, 2020. № 3. С. 293-300] белково-хитиновый концентрат H. illucens получали аналогичным способом. В концентрате содержалось 50,8 % протеина, 7,6 % жира, 7,8 % хитина. Авторы проводили опыты по оценке переваримости концентрата личинок у рыб с желудочно-кишечным пищеварением (радужной форели Oncorhynchus mykiss, русского осетра Acipenser gueldenstaedtii, красной тиляпии Oreochromis mosambicus × O. niloticus). Было установлено, что данный показатель составил 67-74%, а потребление протеина личинок всеми рыбами - 91-97 %. При этом хитин насекомого не оказывал негативного влияния на пищеварение протеина и жира у исследованных видов рыб.

В работе [Firmansyah M., Abduh M.Y. Production of protein hydrolysate containing antioxidant activity from Hermetia illucens // Heliyon. 2019. 5. e02005] описывается метод получения белкового гидролизата из личинок черной львинки путем ферментативного гидролиза с использованием бромелаина.

Обезжиривание биомассы личинок проводили методом экстракции по Сокслету с использованием N-гексана в течение 6 ч при температуре 70 при соотношении биомассы к растворителю 1:4. Затем 10 г обезжиренной материи растворяли в 50 мл фосфатного буферного раствора при различных значениях рН и добавляли фермент бромелаин в различных концентрациях. Реакцию гидролиза проводили в шейкере с водяной баней при температуре 50 , скорости вращения 150 об/мин в течение 3, 13,5 и 24 ч. Реакцию гидролиза останавливали нагреванием образца при температуре 90 в течение 10 мин с использованием водяной бани.

Смесь белкового гидролизата разделяли центрифугированием: каждый образец центрифугировали при 4000 об/мин в течение 30 мин при 25 . Надосадочную жидкость отделяли от выпавшей в осадок части. Полученный супернатант лиофильно высушивали.

Было получено 10,7 % белкового гидролизата. Концентрация белка варьировала в пределах 240-310 мкг/мл при степени гидролиза в пределах 10-43 %. Молекулярная масса полученного гидролизата составляла 14-25 кДа. Аминокислотный состав белкового гидролизата в основном содержал лизин (8,0 %), лейцин (7,7 %) и валин (7,2 %). В работе отмечается, что продукт обладал высокой антиоксидантной активностью и может быть использован в качестве биоактивного гидролизата.

В работе [Xu F.-M. и др. Effects of zymolytic black soldier fly (Hermetia illucens) pulp as dietary supplementation in largemouth bass (Micropterus salmoides) // Aquaculture Reports. 2021. 21. 100823] авторы используют ферменты протеазы и хитиназы для получения белка из личинок H. illucens, но условия проведения ферментативного гидролиза не раскрываются. Было обнаружено, что содержание растворимого в кислоте белка и небольших пептидов (молекулярная масса 180-2000) составляли 21,62 и 71,20 % соответственно. В работе также исследуются включение полученной белковой пасты в диетах большеротого окуня Aeromonas hydrophila. Испытания показали, что 1 % добавка оказывала положительное влияние на скорость набора веса, роста, потребление корма, микробиоту, улучшала антиоксидантную активность и снижала окислительную активность метаболитов.

Наиболее близкими к заявленному являются способы, описанные в работах [Лоскутова А.С., Кузнецов К.Г., Жустерова П.К., Прокошева А.В. Методы получения и требования к продуктам из личинок мух Hermetia illucens // XI Конгресс молодых учёных. Сборник научных трудов конгресса. Санкт-Петербург, 2022. С. 363-368] и [Mshayisa V.V., Van Wyk J., Zozo B. Nutritional, Techno-Functional and Structural Properties of Black Soldier Fly (Hermetia illucens) Larvae Flours and Protein Concentrates // Foods. 2022. 11. 724]. В работе [Лоскутова А.С., Кузнецов К.Г., Жустерова П.К., Прокошева А.В. Методы получения и требования к продуктам из личинок мух Hermetia illucens // XI Конгресс молодых учёных. Сборник научных трудов конгресса. Санкт-Петербург, 2022. С. 363-368] предложены способы для получения белкового концентрата из личинок H. illucens. При описании методов авторы ссылаются на статью [Mshayisa V.V., Van Wyk J., Zozo B. Nutritional, Techno-Functional and Structural Properties of Black Soldier Fly (Hermetia illucens) Larvae Flours and Protein Concentrates // Foods. 2022. 11. 724].

Первым этапом получения белкового концентрата являлось приготовление муки из личинок. Предварительно личинок H. illucens бланшировали и промывали холодной водой. Затем личинок замораживали при температуре -75 , измельчали и лиофильно высушивали, получая муку. Часть муки измельчали в блендере и просеивали. Просеянную муку обезжиривали смесью гексана и изопропанола (3:2) в соотношении 1:5 в течение 6 ч.

Вторым этапом являлось получение белков. В данной работе приводятся два метода. Щелочное и кислотное осаждение проходило следующим образом: после обезжиривания муку смешивали с водой в соотношении 1:10 (в/в), а pH смеси доводилось до pH 10 с помощью 1 М раствора NaOH. Суспензию перемешивали в течение 30 мин (25 ). Далее взвесь центрифугировали при 10,000 об/мин в течение 20 мин (4 ). pH супернатанта доводили до pH 4,5 с помощью 1 М HCl, и суспензию оставляли при 4 на ночь для осаждения белка. Для выделения растворимых белков проводили центрифугирование при 10,000 об/мин в течение 30 мин (4 ). Затем белковый концентрат лиофильно высушивали.

Для получения белкового концентрата методом щелочной экстракции, белок экстрагировали путем смешивания обезжиренной муки с водой в соотношении 1:40, а рН смеси сначала доводили до рН 10 с помощью 1 М раствора NaOH. Затем взвесь перемешивали в течение 2 ч при 40 , периодически контролируя рН и поддерживая на уровне 10 в течение всего периода перемешивания. Смесь центрифугировали при 10,000 об/мин в течение 30 мин (4 ). Белковый концентрат лиофильно высушивали. В работе приводится аминокислотный состав полученных белков, но не указывается выход конечного продукта.

Предлагаемое изобретение позволяет исключить такие технологические этапы как измельчение и обезжиривание исходной материи с использованием органических растворителей. Были исследованы диапазоны концентраций щелочи (0,2-5 %) и времени экстракции (60-180 мин). Соотношение раствора щелочи к материи выбиралось из минимально необходимого количества раствора для полного смачивания подмора.

Сущность способа получения белка из подмора мухи черная львинка H. illucens заключается в следующем: 140 г подмора подвергают обработке 1200 мл 0,2-1,0 % NaOH. Проводят экстракцию на водяной бане в течение 1-3 ч при 100 при перемешивании. Реакционную массу разделяют на пористом стеклянном фильтре, осадок промывают горячей дистиллированной водой. К фильтрату добавляют 24-120 мл 5 % HCl до pH 5, при этом белок выпадает в осадок. Полученную суспензию либо лиофильно высушивают, либо сначала центрифугируют при 5,000 об/мин в течение 10 мин с целью удаления солей и затем лиофильно высушивают. Получают 15-70 г материи с содержанием белка 41-49 % и золы 1-22 %. Содержание белка определяли по Методу Кьельдаля. Содержание золы определяли гравиметрически.

Технический результат данного способа заключается в получении белковой фракции для кормовых целей перед стадией депротеинирования подмора H. illucens при получении хитин/хитозан-меланиновых комплексов, как еще один ценный продукт, который может повысить экономическую ценность технологии по переработке насекомых.

Основное отличие данного способа заключается в том, что в отличие от предыдущих способов белок выделяется на иной стадии онтогенеза - подмора H. illucens, а не из личинок, что повышает эффективность комплексного процесса переработки.

Пример 1

140 г подмора мухи черная львинка суспендируют в 1200 мл 0,5 % NaOH. Реакцию проводят при 100 на водяной бане при перемешивании течение 2 ч. После этого реакционную смесь фильтруют на пористом стеклянном фильтре, осадок промывают 1200 мл горячей дист. H₂O (70 - 90 К объединенному фильтрату добавляют 60 мл 5 % HCl до pH 5,0. После подкисления экстрагированный белок выпадает в осадок. Полученную суспензию лиофильно высушивают. Выход составляет 66 г (47,1 %) материи, содержащей 44,8 % белка, 14,4 % золы.

Пример 2

Аналогично примеру 1, но после стадии подкисления фильтрата суспензию центрифугируют при 5,000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок лиофильно высушивают. Выход составляет 35 г (25,0 %) материи, содержащей 46,9 % белка, 2,5 % золы.

Пример 3

Аналогично примеру 2, но после стадии центрифугирования осадок суспендируют в 1500 мл дист. H₂O и еще один раз центрифугируют при 5,000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок лиофильно высушивают. Выход составляет 33 г (23,6 %) материи, содержащей 48,6 % белка, 1,0 % золы.

Пример 4

Аналогично примеру 1, но реакцию проводят при 100 на водяной бане при перемешивании течение 1 ч. Выход составляет 35 г (25,2 %) материи, содержащей 40,7 % белка, 16,8 % золы.

Пример 5

Аналогично примеру 1, но реакцию проводят при 100 на водяной бане при перемешивании течение 1,5 ч. Выход составляет 51 г (36,7 %) материи, содержащей 43,4 % белка, 15,2 % золы.

Пример 6

Аналогично примеру 1, но реакцию проводят при 100 на водяной бане при перемешивании течение 3 ч. Выход составляет 69 г (49,6 %) материи, содержащей 44,6 % белка, 14,5 % золы.

Пример 7

Аналогично примеру 1, подмор суспендируют в 1200 мл 0,2 % NaOH. К объединенному фильтрату добавляют 24 мл 5 % HCl до pH 5,0. Выход составляет 27 г (19,3 %) материи, содержащей 41,8 % белка, 17,4 % золы.

Пример 8

Аналогично примеру 1, но подмор суспендируют в 1200 мл 1,0 % NaOH. К объединенному фильтрату добавляют 120 мл 5 % HCl до pH 5,0. Выход составляет 74 г (52,9 %) материи, содержащей 44,4 % белка, 22,0 % золы.

Пример 9

120 г подмора мухи черная львинка суспендируют в 1000 мл дист. H₂O. Реакцию проводят при 100 на водяной бане при перемешивании течение 2 ч. После этого реакционную смесь фильтруют на пористом стеклянном фильтре, осадок промывают 1000 мл горячей дист. H₂O (70 - 90 К объединенному фильтрату добавляют 1,2 мл 5 % HCl до pH 5,0. При этом не происходит выпадения осадка. Фильтрат лиофильно высушивают. Выход составляет 18 г (15,0 %) материи, содержащей 51,8 % белка, 15,2 % золы.

При экстракции белка водой выход получаемой материи был невысоким (не более 15 %), при этом выделяемый белок при подкислении не выпадал в осадок, что не позволяет обессоливать препарат с помощью центрифугирования.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения кормового белка. Способ получения белка из подмора мухи черной львинки Hermetia illucens предусмтаривает депротеинизацию 140 г высушенного подмора путем обработки 1200 мл 0,2-1,0 % NaOH при перемешивании при 100°С в течение 1 – 3 ч. Затем фильтруют твердый остаток на пористом стеклянном фильтре и промывают 1200 мл дистиллированной воды. Затем добавляют к объединенному фильтрату 24-120 мл 5 % HCl до pH 5,0. После чего экстрагированный белок выпадает в осадок. Полученную суспензию либо лиофильно высушивают, либо сначала центрифугируют при 5,000 об/мин в течение 10 мин с целью удаления солей, и осадок затем лиофильно высушивают. Изобретение обеспечивает получение белковой фракции из подмора мухи черной львинки Hermetia illucens для кормовых целей. 9 пр.

Способ получения белка из подмора мухи черной львинки Hermetia illucens, заключающийся в том, что 140 г высушенного подмора подвергают процессу депротеинирования путем обработки 1200 мл 0,2-1,0 % NaOH при перемешивании при 100°С в течение 1 – 3 ч, с последующей фильтрацией твердого остатка на пористом стеклянном фильтре и промыванием 1200 мл дистиллированной воды, с последующим добавлением к объединенному фильтрату 24-120 мл 5 % HCl до pH 5,0, после чего экстрагированный белок выпадает в осадок, полученную суспензию либо лиофильно высушивают, либо сначала центрифугируют при 5,000 об/мин в течение 10 мин с целью удаления солей, и осадок затем лиофильно высушивают.