ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США 62/810891, поданной 26 февраля 2019, полное содержание которой включено здесь посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Здесь описаны стабильные белковые растворы, имеющие pH 7 или ниже, которые устойчивы к осаждению белка, а также способы получения таких стабильных белковых растворов и их применение в напитках или добавках к напиткам.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Возрастает спрос на богатые белком пищевые продукты, а также на вегетарианские и веганские богатые белком пищевые продукты. В частности, возрастает спрос на богатые белком напитки и добавки к напиткам, содержащие растительные белки и другие белки неживотного происхождения. Однако приготовление таких белков в растворах, особенно в растворах, имеющих pH 7 или ниже, как принято для напитков, затруднено по причине ограниченной растворимости таких белков при pH 7 и ниже. Таким образом, существует потребность в белковых растворах, устойчивых к осаждению белка при pH 7 и ниже.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Здесь представлены стабильные белковые растворы, содержащие (i) белок; (ii) стабилизатор; и (iii) дезамидирующий белок фермент, где раствор имеет рН от около 3,5 до около 7,0 и устойчив к осаждению белка. В некоторых вариантах осуществления раствор содержит (i) от около 0,1% до около 30% вес./об. белка в пересчете на объем раствора; (ii) от 0,001% до 5% вес./об. стабилизатора в пересчете на объем раствора; и (iii) от около 0,5 Ед до около 50 Ед активности дезамидирующего белок фермента или от около 0,1% до около 10% вес./вес. дезамидирующего белок фермента в пересчете на вес белка в растворе. В некоторых вариантах осуществления раствор содержит (i) от около 0,1% до около 30% вес./об. белка в пересчете на объем раствора; (ii) от около 0,001% до около 1% вес./об. стабилизатора в пересчете на объем раствора; и (iii) от около 5 Ед до около 50 Ед активности дезамидирующего белок фермента или от около 1% до около 10% вес./вес. дезамидирующего белок фермента в пересчете на вес белка в растворе. В некоторых вариантах осуществления раствор содержит от около 5% до около 15% белка в пересчете на объем раствора. В некоторых вариантах осуществления раствор содержит от около 0,02% до около 0,5% вес./вес. стабилизатора в зависимости от объема раствора. В некоторых вариантах осуществления раствор содержит от около 1% вес./вес. до около 5% вес./вес. дезамидирующего белок фермента в пересчете на вес белка в растворе.
В некоторых вариантах осуществления белок включает один или более белков, выбранных из белка растительного происхождения (такого как соевый, гороховый, чечевичный, турецкого гороха, бобовый, конопляный, рисовый, нутовый, пшеничный и глютеновый белки, включая арахисовый белок и миндальный белок), молочного белка (такого как, сывороточный белок) и белка насекомых (такого как один или более белков сверчка, медведки, шелкопряда, саго-червей, кузнечика, скорпиона, жука-плавунца, таракана, дождевого червя, мучного хрущака и паука).
В некоторых вариантах осуществления стабилизатор включает один или более из следующих компонентов: камедь, полисахарида и коллаген, таких как одно или более из следующего: ксантановая камедь, геллановая камедь, каррагенановая камедь, камедь кассии, камедь бобов рожкового дерева, камедь тары, камедь семян подорожника, желатин, камедь семян тамаринда, аравийская камедь, альгинат, пропиленгликольальгинаты, пектин, галактоманнан (гуаровая камедь), пуллулан, метилцеллюлоза (MЦ), карбоксиметилцеллюлоза (КMЦ) и их производные или комбинации.
В некоторых вариантах осуществления изобретения дезамидирующий белок фермент дезамидирует амидогруппы остатков аспарагина и/или глутамина в белке, например, представляет собой дезамидирующий белок фермент глутаминаза или дезамидирующий белок фермент аспарагиназа. В некоторых вариантах осуществления дезамидирующий белок фермент продуцируется бактериями, выбранными из Chryseobacterium, Flavobacterium, Enpedobacter, Sphingobacterium, Aureobacterium, Myroides, Cytophagales, Actinomycetes и Flavobacteriaceae. В некоторых вариантах осуществления дезамидирующий белок фермент продуцируется микроорганизмом Penicillium. В некоторых вариантах осуществления изобретения дезамидирующий белок фермент представляет собой белковую глутаминазу Amano 500 (PGA 500), которая представляет собой дезамидирующий белок фермент глутаминаза. В некоторых вариантах осуществления дезамидирующий белок фермент содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 (которая представляет собой дезамидирующий белок фермент глутаминаза) или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97%, по меньшей мере, 98% или, по меньшей мере, 99% идентичности с ней и обладающую активностью дезамидирующего белок фермента. В некоторых вариантах осуществления дезамидирующий белок фермент содержит вариантную аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, имеющую одну или более замен или делеций в аминокислотных остатках 35, 38-43, 45, 46, 49, 79-84, 103-106, 117, 142, 143, 146, 166 или 185 SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления дезамидирующий белок фермент содержит вариантную аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, которая, по меньшей мере, на 75%, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98% или, по меньшей мере, на 99% идентична ей, имеющая одну или более замен или делеций в аминокислотных остатках 35, 38-43, 45, 46, 49, 79-84, 103-106, 117, 142, 143, 146, 166 или 185 SEQ ID NO:1 и обладающая активностью дезамидирующего белок фермента.
В некоторых вариантах осуществления раствор имеет pH от около 4,0 до около 7,0 или от около 4,0 до около 5,0.
В некоторых вариантах осуществления раствор устойчив к видимому осаждения белка после хранения при 4°C в течение периода времени, выбранного из 7 дней, 14 дней, 21 дня, 1 месяца, 2 месяцев и 6 месяцев, включая 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев, 7 месяцев, 8 месяцев, 9 месяцев, 10 месяцев и 12 месяцев.
В некоторых вариантах осуществления раствор готовят в виде напитка или добавки к напитку для потребления людьми или животными.
Также предлагаются напитки или добавки к напиткам для употребления людьми или животными, содержащие стабильный белковый раствор, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления напиток или добавку к напитку выбирают из питательного напитка, спортивного напитка, функционального белкового напитка, молочного напитка, молочного коктейля, фруктового напитка, фруктового коктейля, кофейного напитка, чайного напитка, растительного молока, молочных сливок и немолочных сливок. В некоторых вариантах осуществления напиток или добавка к напитку включает один или более кислых или фруктовых соков или концентратов кислых или фруктовых соков. В некоторых вариантах осуществления напиток или добавка к напитку включает один или более овощных соков или овощных концентратов. В некоторых вариантах осуществления напиток или добавка к напитку содержит один или более кислых фруктовых или овощных соков или концентратов кислых фруктовых или овощных соков.
Также предлагаются способы получения стабильного белкового раствора, как описано здесь, или напитка или добавки к напитку, как описано здесь, включающие (а) добавление дезамидирующего белок фермента в раствор, содержащий белок и стабилизатор, для получения смеси; (b) инкубирование смеси; и (c) подкисление смеси для получения раствора с pH от около 3,5 до около 7,0. В некоторых вариантах осуществления раствор готовят смешиванием (i) раствора, содержащего белок, и (ii) раствора, содержащего стабилизатор. В некоторых вариантах осуществления инкубирование проводят до тех пор, пока ферментативная реакция не достигнет требуемого уровня завершения, необязательно, определяемого концентрацией свободных ионов аммония в растворе. В некоторых вариантах осуществления инкубирование проводят при температуре от около 30°C до около 70°C и в течение периода от около 0,5 часа до около 48 часов, необязательно при перемешивании, необязательно при pH от около 3,0 до около 8,0. В некоторых вариантах осуществления инкубирование проводят при температуре от около 40°C до около 60°C и в течение периода от около 3 часов до около 24 часов, необязательно при перемешивании, необязательно при pH от около 5,0 до около 8,0. В некоторых вариантах осуществления подкисление включает добавление кислого сока или концентрата сока. В некоторых вариантах осуществления дезамидирующий белок фермент представляет собой белковую глутаминазу Amano 500 (PGA 500) и/или имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 или ее вариант, как описано здесь, и инкубирование проводят при 50°C в течение 3 часов.
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает тепловую обработку раствора при температуре около 85°C в течение около 10 минут. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает проведение одной или более обработок раствора, выбранных из гомогенизации, пастеризации и стерилизации. В некоторых вариантах осуществления гомогенизацию проводят при давлении от около 2000 фунтов на квадратный дюйм до около 20000 фунтов на квадратный дюйм, включая от около 2000 фунтов на квадратный дюйм до около 2500 фунтов на квадратный дюйм. В некоторых вариантах осуществления пастеризацию проводят с использованием высокотемпературной кратковременной пастеризации (HTST) при температуре около 100°C в течение от около 10 секунд до около 20 секунд, ультравысокотемпературной пастеризации (UHT) при температуре около 120°C в течение от около 1 секунды до около 3 секунд или низкотемпературной длительной пастеризации (LTLT) при температуре от около 75°C до около 85°C в течение от около 10 минут до около 20 минут. В некоторых вариантах осуществления стерилизацию проводят с использованием стерилизации под высоким давлением (гипербарической).
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
На фиг.1 показано поглощение композиций горохового белка с (i) дезамидирующим белок ферментом глутаминазой и камедью; (ii) дезамидирующим белок ферментом глутаминазой; (iii) камедью; и (iv) без дезамидирующего белок фермента глутаминазы и без камеди по отношению pH.
На фиг.2 показано поглощение композиций соевого белка с (i) дезамидирующим белок ферментом глутаминазой и камедью; (ii) дезамидирующим белок ферментом глутаминазой; (iii) камедью; и (iv) без дезамидирующего белок фермента глутаминазы и без камеди по отношению pH.
На фиг.3 показано поглощение композиций конопляного белка с (i) дезамидирующим белок ферментом глутаминазой и камедью; (ii) дезамидирующим белок ферментом глутаминазой; (iii) камедью; и (iv) без дезамидирующего белок фермента глутаминазы и без камеди по отношению pH.
На фиг.4 показано поглощение композиций арахисового белка с (i) дезамидирующим белок ферментом глутаминазой и камедью; (ii) дезамидирующим белок ферментом глутаминазой; (iii) камедью; и (iv) без дезамидирующего белок фермента глутаминазы и без камеди по отношению pH.
На фиг.5 показано поглощение композиций белка сверчка с (i) дезамидирующим белок ферментом глутаминазой и камедью; (ii) дезамидирующим белок ферментом глутаминазой; (iii) камедью; и (iv) без дезамидирующего белок фермента глутаминазы и без камеди по отношению pH.
На фиг.6 показано поглощение гомогенизированных композиций горохового белка с (i) дезамидирующим белок ферментом глутаминазой и камедью; и (ii) только камедью (без дезамидирующего белок фермента глутаминазы).
На фиг.7 показано поглощение гомогенизированных композиций соевого белка, содержащих концентрат сока, с (i) дезамидирующим белок ферментом глутаминазой и камедью; и (ii) только камедью (без дезамидирующего белок фермента глутаминазы).
На фиг.8 показано поглощение гомогенизированных композиций арахисового белка, содержащих концентрат сока, с (i) дезамидирующим белок ферментом глутаминазой и камедью; и (ii) только камедью (без дезамидирующего белок фермента глутаминазы).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Технические и научные термины, используемые здесь, имеют значения, обычно понятные специалисту среднего уровня квалификации в данной области, к которой относится настоящее раскрытие, если не указано иное. Здесь приводится ссылка на различные методологии, известные специалистам среднего уровня квалификации в данной области. Подходящие материалы и/или методы, известные специалистам среднего уровня квалификации в данной области, можно использовать при осуществлении настоящего раскрытия. Однако конкретные материалы и методы описаны только для иллюстрации. Материалы, реагенты и тому подобное, на которые приводится ссылка в следующем описании и примерах, можно получить из платных источников информации, если не указано иное.
Используемые здесь формы единственного числа «a», «an» и «the» обозначают как единственное, так и множественное число, если прямо не указано, что они обозначают только единственное число.
Используемый здесь термин «около» означает, что число или диапазон не ограничиваются указанным точным числом или диапазоном, а охватывают значения около указанного числа или диапазона, как будет понятно специалисту среднего уровня квалификации в данной области, в зависимости от контекста, в котором используется число или диапазон. Если иное не очевидно из контекста или условных обозначений в данной области, «около» означает до плюс или минус 10% от конкретной величины.
Здесь описаны стабильные белковые растворы, содержащие белок, стабилизатор и дезамидирующий белок фермент, где белковые растворы имеют pH от около 3,5 до около 7,0 и устойчивы к осаждению белка. Здесь также описаны напитки и добавки к напиткам, содержащие такие растворы. Здесь также описаны способы получения таких стабильных белковых растворов и способы получения напитков или добавок к напиткам, содержащих их.
Используемый здесь термин «устойчивый к осаждению белка» означает отсутствие видимого осаждения белка. В некоторых вариантах осуществления отсутствие видимого осаждения подтверждается определением поглощения при около 280 нм, при этом повышенное поглощение коррелирует с растворенным белком и отсутствием осаждения. Для растворов, имеющих описанные здесь концентрации белка (без осаждения), типичное поглощение при около 280 нм находится в диапазоне от около 8 до 50 мг белка/мл.
Описанные здесь стабильные белковые растворы решают проблему получения белков в растворах, имеющих значение pH 7 или ниже, которое является общепринятым значением pH для напитков и добавок к напиткам. Например, многие напитки, включая функциональные напитки и спортивные напитки, содержат соки из фруктов и/или овощей или ароматизаторы соков и имеют pH 7 или ниже, например pH от около 7 до около 3,5. Когда белки входят в состав таких напитков, они имеют тенденцию осаждаться из раствора, что приводит к образованию осадка. Не ограничиваясь какой-либо теорией, считается, что это осаждение происходит из-за того, что значение pH напитка приближается к изоэлектрической точке белка, что вызывает дестабилизацию белка и его осаждение и образование осадка. Осаждение белков не только неприемлемо для потребителей, но и ограничивает возможности маскировки вкуса и другие варианты рецептур. Стабильность описанных здесь растворов при кислом значении pH позволяет приготовить белковый раствор с кислым соком, таким как фруктовый сок. Как показано в приведенных ниже примерах, описанные здесь растворы устойчивы к осаждению даже при кислом значении pH. Таким образом, описанные здесь растворы позволяют получить белковый раствор в кислом соке или с кислым соком, таким как фруктовый сок, в частности, получить содержащий белок напиток или добавку к напитку на основе фруктового сока или со вкусоароматом фруктов или фруктового сока.
В описанных здесь стабильных белковых растворах используется уникальная комбинация дезамидирующего белок фермента и стабилизатора для решения этой проблемы. Несмотря на то, что ранее использовались ферменты протеазы, их применение ограничено образованием соединений с нежелательными вкусоароматами, которые возникают в результате ферментативной деградации белков-субстратов. Несмотря на то, что некоторые камеди, стабилизаторы и эмульгаторы использовались ранее, они эффективны только при высоких концентрациях (например, 2-5% вес./об.), которые вызывают другие нежелательные эффекты, такие как коагуляция, расслоение и даже осаждение. Кроме того, использование стабилизаторов в таких высоких концентрациях приводит к получению конечных продуктов с высокой вязкостью, что нежелательно для потребителей. В противоположность этому, описанные здесь растворы обладают приемлемыми вязкостными свойствами для использования в напитках или в качестве напитков и добавок к напиткам, такими как вязкость в диапазоне от около 10 до около 250 мПа⋅с. (Для справки: молоко имеет вязкость около 2-3 мПа⋅с, большинство растительных масел имеют вязкость около 40-50 мПа⋅с, а шоколадный соус может иметь вязкость 280 мПа⋅с).
Не ограничиваясь какой-либо теорией, считается, что описанные здесь дезамидирующие белок ферменты дезамидируют аминокислотные остатки, такие как остатки глутамина и/или аспарагина в белке, тем самым увеличивая отрицательный заряд белка, уменьшая изоэлектрическую точку белка, и повышая его растворимости при кислых значениях pH. В результате улучшается растворимость белка при кислом значении pH. Кроме того, не ограничиваясь какой-либо теорией, некоторые из описанных здесь дезамидирующих белок ферментов повышают растворимость белка без образования нежелательных ароматических соединений дезамидированием белка без разрыва пептидных связей, например, дезамидированием амидогрупп аминокислотных остатков в белке, включая превращение остатки глутамина в белке в глутаминовую кислоту и/или превращение остатков аспарагина в белке в аспарагиновую кислоту.
Несмотря на то, что ферментативная обработка сама по себе может в некоторой степени повысить растворимость белка, необходимы дополнительные подходы к составлению рецептуры для получения растворов, устойчивых к осаждению белка при pH 7 и ниже в течение продолжительных периодов времени, таких как условия хранения, обычные для потребительских продуктов типа напиток или добавка к напитку. Таким образом, описанные здесь растворы содержат стабилизаторы, которые дополнительно повышают стабильность белковых растворов и позволяют приготовить растворы с pH от около 3,5 до около 7, которые устойчивы к осаждению белка в условиях охлаждения в течение длительных периодов времени, таких как период времени 7 дней, 14 дней, 21 день, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев, 7 месяцев, 8 месяцев, 9 месяцев, 10 месяцев и 12 месяцев, например 4 месяца или 8 месяцев при хранении при 4°C. В отличие от ранее описанных композиций, для описанных здесь растворов требуются только относительно небольшие количества стабилизаторов, так что использование стабилизаторов, как описано здесь, не оказывает отрицательного влияния на физико-химические свойства раствора и не приводит к эффектам, нежелательным для потребителей, таким как коагуляция, расслоение, осаждение или высокая вязкость.
Описанные здесь растворы могут подвергаться гомогенизации и проявлять устойчивость к осаждению белка после гомогенизации, как показано в приведенных ниже примерах. Таким образом, даже несмотря на то, что процесс гомогенизации может вызывать изменения в белок-белковых взаимодействиях, белок, приготовленный в растворе, как описано здесь, может оставаться в растворе даже после гомогенизации.
Как отмечено выше, в соответствии с конкретными вариантами осуществления предлагаются стабильные белковые растворы, содержащие (i) белок; (ii) стабилизатор; и (iii) дезамидирующий белок фермент, при этом раствор имеет pH от около 3,5 до около 7,0 и устойчив к осаждению белка. Конкретные аспекты и конкретные варианты осуществления более подробно обсуждаются ниже.
БЕЛОК
Белки, которые можно приготовить, как описано здесь, не ограничены, но представляющие интерес варианты осуществления включают белки, подходящие для потребления людьми или животными, в том числе белки животных, растений, молочных продуктов и насекомых, подходящие для потребления людьми или животными. В некоторых вариантах осуществления описанный здесь раствор содержит один или более белков, выбранных из растительного белка, молочного белка и белка насекомых.
Примеры подходящих растительных белков включают, но не ограничиваются ими, белки сои, гороха, чечевицы, нута, бобовых, конопли, риса, орехов, пшеницы и глютена. В некоторых вариантах осуществления растительный белок выбирают из одного или более белков сои, гороха, чечевицы, нута, бобовых, конопли, риса, орехов, пшеницы и глютена. В некоторых вариантах осуществления орех представляет собой арахис, миндаль или фундук. В некоторых вариантах осуществления белок включает белок гороха. В некоторых вариантах осуществления белок включает белок сои. В некоторых вариантах осуществления белок включает белок арахиса. В некоторых вариантах осуществления белок включает конопляный белок.
Примеры подходящих молочных белков включают, но не ограничиваются ими, сывороточный белок. В некоторых вариантах осуществления белок включает сывороточный белок.
Примеры подходящих белков насекомых включают, но не ограничиваются ими, белки сверчка, медведки, шелкопряда, саго-червей, кузнечика, скорпиона, жука-плавунца, таракана, дождевого червя, мучного хрущака и паука. В некоторых вариантах осуществления белок включает белок насекомого, выбранный из одного или более белков сверчка, медведки, шелкопряда, саго-червей, кузнечика, скорпиона, жука-плавунца, таракана, дождевого червя, мучного хрущака и паука. В некоторых вариантах осуществления белок включает белок сверчка.
СТАБИЛИЗАТОР
Как отмечалось выше, описанные здесь растворы включают стабилизатор. Примеры подходящих стабилизаторов включают, но не ограничиваются ими, гидроколлоиды (камеди), полисахариды и коллаген. В некоторых вариантах осуществления стабилизатор включает одно или более из следующего: камедь, полисахарид и коллаген. В некоторых вариантах осуществления стабилизатор включает один или более из следующего: ксантановая камедь, геллановая камедь, каррагенановая камедь, камедь кассии, камедь бобов рожкового дерева, камедь тары, камедь семян подорожника, желатин, камедь семян тамаринда, аравийская камедь, альгинат, пропиленгликольальгинаты, пектин, галактоманнан (гуаровая камедь), пуллулан, карбоксиметилцеллюлоза (КMЦ), метилцеллюлоза (MЦ) и их производные или комбинации. В конкретных вариантах осуществления стабилизатор выбирают из ксантановой камеди, геллановой камеди, каррагенановой камеди, камеди тары, пектина, альгината и КМЦ. В некоторых вариантах осуществления стабилизатор включает геллановую камедь. В некоторых вариантах осуществления стабилизатор включает каррагенановую камедь. В некоторых вариантах осуществления стабилизатор включает пектин. В некоторых вариантах осуществления стабилизатор включает ксантановую камедь. Как показано в приведенных ниже примерах, разные стабилизаторы могут быть более эффективными при разных диапазонах pH или разных значениях pH. Таким образом, при выборе стабилизатора в некоторых аспектах можно руководствоваться значением pH конечного продукта.
ДЕЗАМИДИРУЮЩИЙ БЕЛОК ФЕРМЕНТ
Как отмечалось выше, описанные здесь растворы включают дезамидирующий белок фермент. Используемый здесь термин «дезамидирующий белок фермент» относится к ферменту, который дезамидирует амидогруппы аминокислотных остатков в белке. В некоторых вариантах осуществления дезамидирующий белок фермент дезамидирует амидогруппы остатков аспарагина и/или глутамина в белке. В некоторых вариантах осуществления изобретения дезамидирующий белок фермент дезамидирует амидогруппы остатков глутамина в белке. В некоторых вариантах осуществления изобретения дезамидирующий белок фермент дезамидирует амидогруппы остатков аспарагина в белке. Примеры подходящих дезамидирующих белок ферментов включают ферменты, описанные в патенте США № 6756221, патенте США № 6251651, патенте США № 7462477 и патенте США № 8735131, которые полностью включены здесь посредством ссылки, и в частности, для раскрываемых здесь дезамидирующих белок ферментов.
В некоторых вариантах осуществления дезамидирующий белок фермент продуцируется бактериями, выбранными из Chryseobacterium, Flavobacterium, Enpedobacter, Sphingobacterium, Aureobacterium, Myroides, Cytophagales, Actinomycetes и Flavobacteriaceae, или микроорганизмом Penicillium. В некоторых вариантах осуществления дезамидирующий белок фермент продуцируется бактериями рода Chryseobacterium. В некоторых вариантах осуществления дезамидирующий белок фермент продуцируется бактериями рода Flavobacterium. В некоторых вариантах осуществления дезамидирующий белок фермент продуцируется бактериями рода Enpedobacter. В некоторых вариантах осуществления дезамидирующий белок фермент продуцируется бактериями рода Sphingobacterium. В некоторых вариантах осуществления дезамидирующий белок фермент продуцируется бактериями рода Aureobacterium. В некоторых вариантах осуществления дезамидирующий белок фермент продуцируется бактериями рода Myroides. В некоторых вариантах осуществления дезамидирующий белок фермент продуцируется бактериями рода Cytophagales. В некоторых вариантах осуществления дезамидирующий белок фермент продуцируется бактериями рода Actinomycetes. В некоторых вариантах осуществления дезамидирующий белок фермент продуцируется бактериями рода Flavobacteriaceae.
В некоторых вариантах осуществления изобретения дезамидирующий белок фермент представляет собой дезамидирующий белок фермент глутаминазу Amano 500 (PGA 500), имеющийся в продаже от Amano Enzyme.
В некоторых вариантах осуществления изобретения дезамидирующий белок фермент имеет или содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 (которая представляет собой дезамидирующий белок фермент глутаминазу) или последовательность, по меньшей мере, на 75%, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98% или, по меньшей мере, на 99% идентичную ей и обладающую активностью дезамидирующего белок фермента. Степень активности дезамидирующего белок фермента особо не ограничивается при условии, что может проявляться функция дезамидирующего белок фермента, но предпочтительно она эквивалентна или выше, чем у фермента, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления дезамидирующий белок фермент содержит вариантную аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, имеющую одну или более замен или делеций в аминокислотных остатках 35, 38-43, 45, 46, 49, 79-84, 103-106, 117, 142, 143, 146, 166 или 185 SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления дезамидирующий белок фермент содержит вариантную аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, которая, по меньшей мере, на 75%, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98% или, по меньшей мере, на 99% идентична ей с одной или более заменами или делециями в аминокислотных остатках 35, 38-43, 45, 46, 49, 79-84, 103-106, 117, 142, 143, 146, 166 или 185 SEQ ID NO:1 и обладает активностью дезамидирующего белок фермента. В некоторых вариантах осуществления дезамидирующий белок фермент имеет или содержит вариантную аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, имеющую одну или более замен или делеций в аминокислотных остатках 39, 40, 41, 43, 79-82, 142, 143, 146, 166 или 185 SEQ ID NO:1, например, одну или более замен или делеций в аминокислотных остатках 35, 38, 40-43, 45, 46, 49, 80-84, 103-106 или 117 SEQ ID NO:1, как описано в патенте США № 8735131. В некоторых вариантах осуществления дезамидирующий белок фермент имеет или содержит вариантную аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, имеющую одну или более замен или делеций в аминокислотных остатках 82 или 84 SEQ ID NO:1, как описано в патенте США № 8735131. В некоторых вариантах осуществления дезамидирующий белок фермент имеет или содержит вариантную аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, например, замену в аминокислотном остатке 82 SEQ ID NO:1, такую как замена серина в аминокислотном остатке 82 SEQ ID NO:1, и/или замену в аминокислотном остатке 84 SEQ ID NO:1, такую как замена аспарагиновой кислоты в аминокислотном остатке 84 SEQ ID NO:1, как описано в патенте США № 8735131.
СТАБИЛЬНЫЕ БЕЛКОВЫЕ РАСТВОРЫ
Как отмечалось выше, в некоторых вариантах осуществления описанные здесь стабильные белковые растворы содержат:
(i) от около 0,1% до около 30% вес./об. белка в пересчете на объем раствора;
(ii) от около 0,001% до около 5%, в том числе от около 0,001% до около 1% вес./об. стабилизатора в пересчете на объем раствора; и
(iii) от около 0,5 Ед до около 50 Ед активности дезамидирующего белок фермента или от около 0,1% до около 10%, в том числе от около 1% до около 10% вес./вес. дезамидирующего белок фермента в пересчете на вес белка в растворе, где активность дезамидирующего белок фермента можно определить в соответствии с анализом, приведенным в примере 16 ниже.
Таким образом, в некоторых вариантах осуществления раствор содержит от около 0,1% до около 30% вес./об. белка в пересчете на объем раствора (например, конечный объем раствора) или от около 0,5% до около 30% вес./вес., или от около 5% до около 25% вес./вес. или от около 10% до около 20% вес./вес. В некоторых вариантах осуществления раствор содержит от около 1% до около 15% вес./об. белка в пересчете на объем раствора. В некоторых вариантах осуществления раствор содержит от около 5% до около 15% вес./об. белка в пересчете на объем раствора. В некоторых вариантах осуществления раствор содержит около 1%, около 2%, около 3%, около 4%, около 5%, около 6%, около 7%, около 8%, около 9%, около 10%, около 11%, около 12%, около 13%, около 14%, около 15%, около 20%, около 25% или около 30% вес./об. белка в пересчете на объем раствора, в том числе 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 25% или 30% вес./об. белка в пересчете на объем раствора.
В некоторых вариантах осуществления раствор содержит от около 0,001% до около 5% вес./об. стабилизатора в пересчете на объем раствора, в том числе от около 0,001% до около 1,5%, от около 0,001% до около 2%, от около 0,001% до около 3% и от около 0,001% до около 4% вес./об. стабилизатора в пересчете на объем раствора. В некоторых вариантах осуществления раствор включает от около 0,001% до около 1% вес./об. стабилизатора в пересчете на объем раствора, например, от около 0,01% до около 1%, от около 0,01% до около 0,5% и от около 0,02% до около 0,5% вес./об. стабилизатора в пересчете на объем раствора. В некоторых вариантах осуществления раствор содержит около 0,02%, около 0,03%, около 0,04%, около 0,05%, около 0,06%, около 0,07%, около 0,08%, около 0,09%, около 0,1%, около 0,2%, около 0,3%, около 0,4%, около 0,5% вес./об. стабилизатора в пересчете на объем раствора, в том числе 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45% или 0,5% вес./об. стабилизатора. В некоторых вариантах осуществления раствор содержит около 0,01%, около 0,02%, около 0,03%, около 0,04%, около 0,05%, около 0,06%, около 0,07%, около 0,08%, около 0,09%, около 0,1%, около 0,2%, около 0,3%, около 0,4%, около 0,5%, около 0,6%, около 0,7%, около 0,8%, около 0,9%, около 1,0%, около 1,5%, около 2%, около 3%, около 4% или около 5% вес./об. стабилизатора в пересчете на объем раствора, в том числе 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1,0%, 1,5%, 2%, 3%, 4% и 5% вес./об. стабилизатора. В некоторых вариантах осуществления из относительно небольшого количества используемого стабилизатора получают раствор, который имеет вязкость, приемлемую для потребителей напитков и добавок к напиткам, такую как вязкость от около 10 до около 250 мПа⋅с.
В некоторых вариантах осуществления раствор содержит от около 0,1% вес./вес. до около 10% вес./вес. дезамидирующего белок фермента в пересчете на вес белка в растворе, в том числе от около 0,1% вес./вес. до около 1,0% вес./вес., от около 0,5% до около 1,0% вес./вес., около 0,1% вес./вес., около 0,2% вес./вес., около 0,3% вес./вес., около 0,4% вес./вес., около 0,5% вес./вес. или около 0,6% вес./вес., около 0,7% вес./вес., около 0,8% вес./вес. или около 0,9% вес./вес. в пересчете на вес белка в растворе. В некоторых вариантах осуществления раствор содержит от около 1% вес./вес. до около 10% вес./вес. дезамидирующего белок фермента в пересчете на вес белка в растворе. В некоторых вариантах осуществления раствор содержит от около 1% вес./вес. до около 5% вес./вес. дезамидирующего белок фермента, например, около 1% вес./вес., около 2% вес./вес., около 3% вес./вес., около 4% вес./вес. или около 5% вес./вес. дезамидирующего белок фермента в пересчете на вес белка в растворе, в том числе 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% или 10%.
В некоторых вариантах осуществления раствор содержит от около 0,5 Ед до около 50 Ед активности дезамидирующего белок фермента, в том числе от около 0,5 Ед до около 5,0 Ед, от около 2,5 Ед до около 5,0 Ед, около 0,5 Ед, около 1,0 Ед, около 2,0 Ед, около 2,5 Ед, около 3,0 Ед, около 4,0 Ед или около 5,0 Ед. В некоторых вариантах осуществления раствор содержит от около 5 Ед до около 50 Ед активности дезамидирующего белок фермента. В некоторых вариантах осуществления раствор содержит от около 5 Ед до около 25 Ед активности дезамидирующего белок фермента, например, около 5 Ед, около 10 Ед, около 15 Ед, около 20 Ед или около 25 Ед активности дезамидирующего белок фермента, в том числе 5 Ед, 10 Ед, 15 Ед, 20 Ед, 25 Ед, 30 Ед, 35 Ед, 40 Ед, 45 Ед или 50 Ед. Активность дезамидирующего белок фермента можно определить, как описано ниже в примере 16.
В некоторых вариантах осуществления раствор (или напиток или добавка к напитку, содержащие раствор, как описано здесь) имеет pH от около 3,5 до около 7, в том числе от 3,5 до 7, например от около 3,5 до около 5,5, включая от 3,5 до 5,5. В некоторых вариантах осуществления раствор (или напиток или добавка к напитку, содержащие раствор, как описано здесь) имеет pH от около 4,0 до около 5,0, в том числе от 4,0 до 5,0. В некоторых вариантах осуществления раствор (или напиток или добавка к напитку, содержащие раствор, как описано здесь) имеет pH от около 4,0 до около 7,0, в том числе от 4,0 до 7,0, например, pH около 3,5, около 4,0, около 4,5, около 5,0, около 5,5, около 6,0, около 6,5 или около 7,0, включая 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5 или 7,0.
В некоторых вариантах осуществления вязкость раствора (или напитка или добавки к напитку, содержащих раствор, как описано здесь) составляет от около 10 до около 250 мПа⋅с, включая от 10 до 250 мПа⋅с. В некоторых вариантах осуществления вязкость раствора (или напитка или добавки к напитку, содержащих раствор, как описано здесь) составляет около 10, около 20, около 30, около 40, около 50, около 60, около 70, около 80, около 90, около 100, около 110, около 120, около 130, около 140, около 150, около 160, около 170, около 180, около 190, около 200, около 210, около 220, около 230, около 240 или около 250 мПа⋅с, в том числе 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240 или 250 мПа⋅с. Вязкость можно измерить с помощью вискозиметра AMETEK BROOKFIELD с использованием шпинделя S61 при комнатной температуре (~20°C).
В некоторых вариантах осуществления раствор (или напиток или добавка к напитку, содержащие раствор, как описано здесь) устойчив к видимому осаждению белка после хранения при 4°C в течение периода времени, выбранного из 7 дней, 14 дней, 21 дня, 1 месяца, 2 месяцев и 6 месяцев. В некоторых вариантах осуществления раствор устойчив к видимому осаждению белка после хранения при 4°C в течение периода времени, выбранного из 7 дней, 14 дней, 21 дня, 1 месяца, 2 месяцев, 3 месяцев, 4 месяцев, 5 месяцев, 6 месяцев, 7 месяцев, 8 месяцев, 9 месяцев, 10 месяцев и 12 месяцев, например, в течение 4 месяцев или в течение 8 месяцев. В некоторых вариантах осуществления раствор (или напиток или добавка к напитку, содержащие раствор, как описано здесь) устойчив к видимому осаждению белка после хранения при 4°C в течение 7 дней. В некоторых вариантах осуществления раствор (или напиток или добавка к напитку, содержащие раствор, как описано здесь) устойчив к видимому осаждению белка после хранения при 4°C в течение 14 дней. В некоторых вариантах осуществления раствор (или напиток или добавка к напитку, содержащие раствор, как описано здесь) устойчив к видимому осаждению белка после хранения при 4°C в течение 21 дня. В некоторых вариантах осуществления раствор (или напиток или добавка к напитку, содержащие раствор, как описано здесь) устойчив к видимому осаждению белка после хранения при 4°C в течение 1 месяца. В некоторых вариантах осуществления раствор (или напиток или добавка к напитку, содержащие раствор, как описано здесь) устойчив к видимому осаждению белка после хранения при 4°C в течение 2 месяцев. В некоторых вариантах осуществления раствор (или напиток или добавка к напитку, содержащие раствор, как описано здесь) устойчив к видимому осаждению белка после хранения при 4°C в течение 4 месяцев. В некоторых вариантах осуществления раствор (или напиток или добавка к напитку, содержащие раствор, как описано здесь) устойчив к видимому осаждению белка после хранения при 4°C в течение 6 месяцев. В некоторых вариантах осуществления раствор (или напиток или добавка к напитку, содержащие раствор, как описано здесь) является устойчив к видимому осаждению белка после хранения при 4°C в течение 8 месяцев. Как отмечено выше и проиллюстрировано в приведенных ниже примерах, устойчивость к осаждению также можно оценить путем измерения поглощения при 280 нм, при этом более высокое поглощение коррелирует с растворенным белком и, следовательно, снижением или отсутствием осаждения.
НАПИТОК ИЛИ ДОБАВКА К НАПИТКУ
Описанные здесь белковые растворы можно приготовить в виде напитков или добавок к напиткам для потребления людьми или животными или можно использовать для приготовления напитков или добавок к напиткам для потребления людьми или животными. Примеры напитков или добавок к напиткам включают, но не ограничиваются ими, питательные напитки, спортивные напитки, функциональные белковые напитки, молочные напитки, молочные коктейли, фруктовые напитки, фруктовые коктейли, кофейные напитки, чайные напитки, растительное молоко, молочные сливки и немолочные сливки. В некоторых вариантах осуществления напиток или добавку к напитку выбирают из питательного напитка, спортивного напитка, функционального белкового напитка, молочного напитка, молочного коктейля, фруктового напитка, фруктового коктейля, кофейного напитка, чайного напитка, растительного молока, молочных сливок и немолочных сливок. Напиток или добавка к напитку может дополнительно содержать одно или более из следующего: фруктовые соки, витамины и ароматизаторы.
Как отмечено выше, в некоторых вариантах осуществления напиток или добавка к напитку содержит один или более кислых соков, таких как один или более фруктовых или овощных соков, включая смеси фруктовых и овощных соков, в том числе кислый фруктовый сок и/или кислый овощной сок. Примеры таких соков включают яблочный сок, вишневый сок, клюквенный сок, виноградный сок, ананасовый сок, гранатовый сок, грейпфрутовый сок, сок гуавы, сок мускусной дыни, сок лайма, лимонный сок, сок ежевики, апельсиновый сок, ананасовый сок, малиновый сок, банановое пюре, абрикосовый сок, персиковый сок, пюре асаи, сок асаи, сок киви, сок сахарного тростника, клубничный сок, арбузный сок, сок маракуйи, сок сельдерея, морковный сок, картофельный сок, свекольный сок, сок петрушки, томатный сок, сок кресс-салата и сок репы. Как отмечалось выше, настоящее раскрытие белковых растворов, которые устойчивы к осаждению при кислом значении pH, позволяет приготовить белковый раствор в фруктовом и/или овощном соке или с ним, например, для получения содержащего белок напитка или добавки к напитку на основе фруктового и/или овощного сока, или фруктовый и/или овощной, или ароматизированный фруктовым и/или овощным соком.
СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ
Здесь также описаны способы получения стабильного белкового раствора, как описано здесь, и способы получения напитков и добавок к напиткам. Способы могут включать (а) добавление дезамидирующего белок фермента в раствор, содержащий белок и стабилизатор, для получения смеси; (b) инкубирование смеси; и (c) подкисление смеси для получения раствора с pH от около 3,5 до около 7,0. В некоторых вариантах осуществления раствор готовят смешиванием (i) раствора, содержащего белок, и (ii) раствора, содержащего стабилизатор. Способы могут включать предоставление смеси, содержащей белок и стабилизатор, и добавление дезамидирующего белок фермента в смесь и инкубирование смеси. В некоторых вариантах осуществления инкубирование проводят до тех пор, пока ферментативная реакция не достигнет требуемого уровня завершения, необязательно, как это определяется концентрацией свободных ионов аммония в растворе. Способы обычно могут включать смешивание раствора, содержащего белок, с раствором, содержащим стабилизатор, для получения смеси, содержащей белок и стабилизатор, и добавление дезамидирующего белок фермента в смесь и инкубирование смеси. Смешивание и добавление можно проводить в любом порядке. В некоторых вариантах осуществления смешивание завершают перед добавлением фермента.
Способы также могут включать доведение pH раствора до значения pH от около 3,5 до около 7,0, например, подкислением раствора до значения pH от около 3,5 до около 7,0. В некоторых вариантах осуществления подкисление раствора включает добавление кислого сока или концентрата сока, такого как кислый фруктовый сок или кислый концентрат фруктового сока и/или кислый овощной сок или кислый концентрат овощного сока. В некоторых вариантах осуществления раствор подкисляют более чем одним подкисляющим агентом, таким как, например, кислотная добавка и кислый сок или концентрат сока. В некоторых вариантах осуществления подкисляющий агент добавляют для других целей, таких как придание вкусоаромата раствору или увеличения его питательного или нутрицевтического содержания, а кислое значение pH определяется количеством подкисляющего агента, добавленного для этой цели.
Условиями инкубирования могут быть любые условия инкубирования, подходящие для конкретного используемого дезамидирующего белок фермента(ов), такие как любая температура и pH, при которых фермент активен, и любой период времени, необходимый для достижения требуемого уровня дезамидирования. В некоторых вариантах осуществления контролируют ход реакции дезамидирования, например, измерением концентрации свободных ионов аммония в растворе. Например, когда концентрация свободных ионов аммония в растворе достигает определенного уровня, реакцию можно считать завершенной. Для растворов, содержащих количества белка, описанные здесь, реакция может считаться завершенной, когда концентрация свободных ионов аммония в растворе достигает от около 0,002% до около 0,07% вес./об. в пересчете на объем раствора, например от 0,002% до 0,07% вес./об., в том числе около 0,002%, около 0,003%, около 0,004%, около 0,005%, около 0,006%, около 0,007%, около 0,008%, около 0,009%, около 0,01%, около 0,02%, около 0,03%, около 0,04%, около 0,05%, около 0,06% или около 0,07% вес./об., или 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008%, 0,009% 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06% или 0,07% вес./об. в пересчете на объем раствора. Условия инкубирования могут включать перемешивание. Перемешивание может быть медленным (например, от около 150 до около 250 об/мин) или быстрым (например, от около 3000 до около 5000 об/мин). В некоторых вариантах осуществления перемешивание проводят с использованием встряхивающего стола с перемешиванием в диапазоне от около 150 до около 250 об/мин. В некоторых вариантах осуществления перемешивание проводят с использованием встряхивающего стола с перемешиванием в диапазоне от около 3000 до около 5000 об/мин.
В некоторых вариантах осуществления дезамидирующий белок фермент представляет собой белковую глутаминазу Amano 500 (PGA 500), а инкубирование проводят при 50°C в течение 3 часов при pH от около 5,0 до около 8,0. В некоторых вариантах осуществления дезамидирующий белок фермент имеет или содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, а инкубирование проводят при 50°C в течение 3 часов при pH от около 5,0 до около 8,0. В некоторых вариантах осуществления дезамидирующий белок фермент представляет собой вариант SEQ ID NO:1, как описано здесь, а инкубирование проводят при 50°C в течение 3 часов при pH от около 5,0 до около 8,0.
Раствор может подвергаться одной или более дополнительным стадиям обработки, таким как одно или более добавление одного или более ароматизирующих или питательных компонентов, тепловая обработка, гомогенизация, фильтрация, пастеризация и стерилизация.
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает тепловую обработку раствора, такую как тепловая обработка при температуре от около 75°C до около 95°C в течение от около 5 минут до около 20 минут. В некоторых вариантах осуществления тепловую обработку проводят при температуре около 75°C, около 80°C, около 85°C, около 90°C или около 95°C в течение около 5 минут, 10 минут, 15 минут или около 20 минут. В некоторых вариантах осуществления тепловую обработку проводят при температуре около 85°C в течение около 10 минут.
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает гомогенизацию раствора. В некоторых вариантах осуществления гомогенизацию проводят при давлении от около 2000 фунтов на квадратный дюйм до около 20000 фунтов на квадратный дюйм, например от около 2000 фунтов на квадратный дюйм до около 2500 фунтов на квадратный дюйм. В некоторых вариантах осуществления гомогенизацию проводят при давлении около 2000 фунтов на квадратный дюйм, около 5000 фунтов на квадратный дюйм, около 10000 фунтов на квадратный дюйм, около 15000 фунтов на квадратный дюйм или около 20000 фунтов на квадратный дюйм. В некоторых вариантах осуществления гомогенизацию проводят при давлении около 2000 фунтов на квадратный дюйм, около 2500 фунтов на квадратный дюйм, около 3000 фунтов на квадратный дюйм, около 3500 фунтов на квадратный дюйм, около 4000 фунтов на квадратный дюйм, около 4500 фунтов на квадратный дюйм или около 5000 фунтов на квадратный дюйм.
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает пастеризацию раствора. В некоторых вариантах осуществления пастеризацию проводят с использованием высокотемпературной кратковременной пастеризации (HTST), ультравысокотемпературной пастеризации (UHT) или низкотемпературной длительной пастеризации (LTLT). В некоторых вариантах осуществления пастеризацию проводят с использованием высокотемпературной кратковременной пастеризации (HTST). В некоторых вариантах осуществления пастеризацию проводят с использованием высокотемпературной кратковременной пастеризации (HTST) при температуре от около 90°C до около 110°C в течение от около 5 секунд до около 30 секунд. В некоторых вариантах осуществления пастеризацию проводят с использованием высокотемпературной кратковременной пастеризации (HTST) при температуре около 100°C в течение от около 10 секунд до около 20 секунд. В некоторых вариантах осуществления пастеризацию проводят с использованием ультравысокотемпературной пастеризации (UHT). В некоторых вариантах осуществления пастеризацию проводят с использованием ультравысокотемпературной пастеризации (UHT) при температуре от около 110°C до около 130°C в течение от около 1 секунды до около 10 секунд. В некоторых вариантах осуществления пастеризацию проводят с использованием ультравысокотемпературной пастеризации (UHT) при температуре около 120°C в течение от около 1 секунды до около 3 секунд. В некоторых вариантах осуществления пастеризацию проводят с использованием низкотемпературной длительной пастеризации (LTLT). В некоторых вариантах осуществления пастеризацию проводят с использованием низкотемпературной длительной пастеризации (LTLT) при температуре от около 65°C до около 95°C в течение от около 5 минут до около 30 минут. В некоторых вариантах осуществления пастеризацию проводят с использованием низкотемпературной длительной пастеризации (LTLT) при температуре от около 75°C до около 85°C в течение от около 10 минут до около 20 минут.
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стерилизацию раствора. В некоторых вариантах осуществления стерилизацию проводят с использованием стерилизации под высоким давлением (гипербарической).
Способы получения напитка или добавки к напитку, как описано здесь, могут включать добавление стабильного белкового раствора, как описано здесь, в состав напитка или добавки к напитку или приготовление раствора, как описано здесь, в качестве напитка или добавки к напитку. Например, стабильный белковый раствор, как описано здесь, можно добавлять в предварительно приготовленный питательный напиток, спортивный напиток, функциональный белковый напиток, молочный напиток, молочный коктейль, фруктовый напиток, фруктовый коктейль, кофейный напиток, чайный напиток, растительное молоко, молочные сливки или немолочные сливки в количестве, обеспечивающем требуемое количество белка в напитке или добавке к напитку. В качестве альтернативы стабильный белковый раствор, как описано здесь, можно приготовить в виде питательного напитка, спортивного напитка, функционального белкового напитка, молочного напитка, молочного коктейля, фруктового напитка, фруктового коктейля, кофейного напитка, чайного напитка, растительного молока, молочных сливок или немолочных сливок, например, содержащих другие компоненты такого напитка и добавки к напитку и требуемое количество белка.
В некоторых вариантах осуществления конечный раствор, напиток или добавка к напитку имеют содержание белка до около 30% вес./вес. в пересчете на вес белка в растворе, включая около 30% вес./вес. В некоторых вариантах осуществления конечный раствор, напиток или добавка к напитку имеют содержание белка от около 0,5% до около 30% вес./вес. в пересчете на вес белка в растворе, включая от 0,5% до 30% вес./вес., или от около 5% до около 25% вес./вес. или от около 10% до около 20% вес./вес. В некоторых вариантах осуществления конечный раствор, напиток или добавка к напитку имеют содержание белка около 0,5%, около 1%, около 2%, около 3%, около 4%, около 5%, около 6%, около 7%, около 8%, около 9%, около 10%, около 11%, около 12%, около 13%, около 14%, около 15%, около 16%, около 17%, около 18%, около 19%, около 20%, около 21%, около 22%, около 23%, около 24%, около 25%, около 26%, около 27%, около 28%, около 29% или около 30% вес./вес. в пересчете на вес белка в растворе.
В любых вариантах осуществления напиток или добавка к напитку может дополнительно содержать один или более компонентов, обычно присутствующих в таких напитках или добавках к напиткам, включая одно или более из следующего: фруктовые или овощные соки, витамины, пищевые добавки, ароматизаторы, красители и консерванты. В некоторых вариантах осуществления напиток или добавка к напитку содержит один или более кислых соков или один или более фруктовых и овощных соков, включая один или более кислых фруктовых соков, в том числе одно или более выбранное из яблочного сока, вишневого сока, клюквенного сока, виноградного сока, ананасового сока, гранатового сока, грейпфрутового сока, сока гуавы, сока мускусной дыни, сока лайма, лимонного сока, ежевичного сока, апельсинового сока, ананасового сока, малинового сока, бананового пюре, абрикосового сока, персикового сока, пюре асаи, сока асаи, сока киви, сока сахарного тростника, клубничного сока, арбузного сока, сока маракуйи, сока сельдерея, морковного сока, картофельного сока, свекольного сока, сока петрушки, томатного сока, сока кресс-салата и сока репы.
Следующие ниже конкретные примеры включены в качестве иллюстрации описанных здесь композиций и способов. Эти примеры никоим образом не предназначены для ограничения объема раскрытия. Другие аспекты раскрытия будут очевидны специалистам в данной области, к которой относится раскрытие.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Растворы горохового белка (композиции 1-4)
Растворы горохового белка готовили с использованием изолята горохового белка в порошковой форме (NOW Foods) в качестве белка с геллановой камедью (Ticagel® Gellan HS NGMO, высокоацилгеллановая камедь от TIC Gums) и без нее в качестве стабилизатора, а также с использованием PGA 500 (Amano Enzyme Inc.) и без нее в качестве дезамидирующего белок фермента, как указано в таблице ниже.
Например, 10% (вес./об.) раствор горохового белка в воде готовили и смешивали с 0,2% (вес./об.) раствором геллановой камеди в воде для получения водного раствора с 3% (вес./об.) горохового белка и 0,03-0,05% (вес./об.) геллановой камеди. Для растворов, содержащих PGA 500, фермент добавляли в количестве 2% (вес./вес.) белка и инкубировали при 50°C в течение 3 часов. Для композиций, которые не содержали PGA 500, растворы нагревали до 50°C без инкубирования. Раствор подкисляли лимонной кислотой до pH 4,0-4,5, а затем подвергали тепловой обработке при 85°C в течение 10 минут. Остальные композиции готовили аналогичным способом.
Полученные растворы хранили при 4°C в лабораторном холодильнике VWR и оценивали через 24 часа и 72 часа посредством (1) визуального осмотра, (2) измерения содержания растворенного белка в супернатанте при поглощении при 280 нм, (3) измерения вязкости с использованием вискозиметра (AMETEK BROOKFIELD) и (4) измерения pH. Результаты представлены в таблице ниже.
Результаты показывают, что при pH около 4,5 композиция по настоящему раскрытию (содержащая PGA 500 и камедь) (композиция 2) была устойчива к осаждению белка, на что указывает внешний вид диспергированный по сравнению с разделенным и более высокое поглощение (отражающее в большей степени растворенный белок).
Пример 2: Растворы соевого белка (композиции 5-12)
Растворы соевого белка готовили с использованием изолята соевого белка в порошковой форме (NOW Foods) в качестве белка с геллановой камедью (Ticagel® Gellan HS NGMO от TIC Gums) и без нее в качестве стабилизатора, а также с использованием PGA 500 (Amano Enzyme Inc.) и без нее в качестве дезамидирующего белок фермента, как указано в таблице ниже.
Например, 10% (вес./об.) раствор соевого белка в воде готовили и смешивали с 0,2% (вес./об.) раствором геллановой камеди в воде для получения водного раствора с 3% (вес./об.) соевого белка и 0,10% (вес./об.) геллановой камеди. Для композиций, содержащих PGA 500, фермент добавляли в количестве 2% (вес./вес.) белка и инкубировали при 50°C в течение 3 часов. Для композиций, которые не содержали PGA 500, растворы нагревали до 50°C без инкубирования. Раствор подкисляли лимонной кислотой до pH 4,0-4,6, а затем подвергали тепловой обработке при 85°C в течение 10 минут. Остальные композиции готовили аналогичным способом.
Полученные растворы хранили при 4°C в лабораторном холодильнике VWR и оценивали, как описано в примере 1 выше. Результаты представлены в таблице ниже.
Результаты показывают, что при кислом значении pH (от около 4,0 до 4,5) композиции по настоящему раскрытию (содержащие PGA 500 и камедь) (композиции 6 и 10) были устойчивы к осаждению белка, на что указывает внешний вид диспергированный по сравнению с разделенным и более высокое поглощение.
Пример 3: Растворы арахисового белка (композиции 13-16)
Растворы арахисового белка готовили с использованием порошка арахисового белка (Tru-Nut Company) в качестве белка с геллановой камедью (Ticagel® Gellan HS NGMO от TIC Gums) и без нее в качестве стабилизатора, а также с использованием PGA 500 (Amano Enzyme Inc.) и без нее в качестве дезамидирующего белок фермента, как указано в таблице ниже.
Например, 10% (вес./об.) раствор арахисового белка в воде готовили и смешивали с 0,2% (вес./об.) раствором геллановой камеди в воде для получения водного раствора с 3% (вес./об.) арахисового белка и 0,02% (вес./об.) геллановой камеди. Для композиций, содержащих PGA 500, фермент добавляли в количестве 2% (вес./вес.) белка и инкубировали при 50°C в течение 3 часов. Для композиций, которые не содержали PGA 500, растворы нагревали до 50°C без инкубирования. Раствор подкисляли лимонной кислотой до pH 4,0-4,5, а затем подвергали тепловой обработке при 85°C в течение 10 минут. Остальные композиции готовили аналогичным способом.
Полученные растворы хранили при 4°C в лабораторном холодильнике VWR и оценивали, как описано в примере 1 выше. Результаты представлены в таблице ниже.
Результаты показывают, что при кислом значении pH (около 4,0) композиция по настоящему раскрытию (содержащую PGA 500 и камедь) (композицию 14) была более устойчивой к осаждению белка, на что указывает более высокое поглощение (отражающая в большей степени растворенный белок) по сравнению с другими композициями. Наблюдаемый незначительный осадок может быть связан с особенностью арахисового белка и тем фактом, что условия обработки не были оптимизированы для арахисового белка.
Пример 4: Растворы белка сверчка (композиции 17-24)
Растворы белка сверчка готовили с использованием муки из сверчков, содержащей 68% (вес./вес.) белка сверчка (LITHIC), с геллановой камедью (Ticagel® Gellan HS NGMO от TIC Gums) и без нее в качестве стабилизатора, а также с использованием PGA 500 (Amano Enzyme Inc.) и без нее в качестве дезамидирующего белок фермента, как указано в таблице ниже.
Например, 10% (вес./об.) раствор муки из сверчков в воде готовили и смешивали с 0,2% (вес./об.) раствором геллановой камеди в воде для получения водного раствора с 3% (вес./об.) муки из сверчков и 0,03% (вес./об.) геллановой камеди. Для растворов, содержащих PGA 500, фермент добавляли в количестве 2% (вес./вес.) белка и инкубировали при 50°C в течение 3 часов. Для композиций, которые не содержали PGA 500, растворы нагревали до 50°C без инкубирования. Раствор подкисляли лимонной кислотой до pH 4,0-4,5, а затем подвергали тепловой обработке при 85°C в течение 10 минут. Остальные композиции готовили аналогичным способом.
Полученные растворы хранили при 4°C в лабораторном холодильнике VWR и оценивали, как описано в примере 1 выше. Результаты представлены в таблице ниже.
Результаты показывают, что при кислом значении pH (от около 4,0 до около 4,5) композиции по настоящему раскрытию (содержащие PGA 500 и камедь) (композиции 18 и 22) были более устойчивы к осаждению белка, на что указывает более высокие значения поглощения (отражающие в большей степени растворенный белок) по сравнению с другими композициями. Поскольку композиции 17-20 готовили с pH около 4,5 (с некоторой погрешностью измерения), в то время как композиции 21-24 имеют pH около 4,0, более низкий pH в композиции 22 (pH 4,0) по сравнению с композицией 18 (pH 4,5) объясняет более низкое поглощение и вязкость, наблюдаемые в композиции 22, так как меньшее количество белка находится в суспензии вследствие более низкого значения pH.
Пример 5: Раствор конопляного белка (композиции 25-28)
Растворы конопляного белка готовили с использованием порошка конопляного белка (Nutiva) в качестве белка с каррагинановой камедью (Ticaloid® 750 от TIC Gums) и без нее в качестве стабилизатора, а также с использованием PGA 500 (Amano Enzyme Inc.) и без нее в качестве дезамидирующего белок фермента, как указано в таблице ниже.
Например, 10% (вес./об.) раствор конопляного белка в воде готовили и смешивали с 1,0% (вес./об.) раствором каррагинановой камеди в воде для получения водного раствора с 3% (вес./об.) конопляного белка и 0,5% (вес./об.) каррагинановой камеди. Для растворов, содержащих PGA 500, фермент добавляли в количестве 2% (вес./вес.) белка и инкубировали при 50°C в течение 3 часов. Для композиций, которые не содержали PGA 500, растворы нагревали до 50°C без инкубирования. Раствор подкисляли лимонной кислотой до pH 4,0-4,5, а затем подвергали тепловой обработке при 85°C в течение 10 минут. Остальные композиции готовили аналогичным способом.
Полученные растворы хранили при 4°C в лабораторном холодильнике VWR и оценивали, как описано в примере 1 выше. Результаты представлены в таблице ниже.
Результаты показывают, что при кислом значении pH (около 4,5) композиция по настоящему раскрытию (содержащая PGA 500 и камедь) (композиция 26) была устойчива к осаждению белка, на что указывает внешний вид диспергированный по сравнению с разделенным и более высокое поглощение (отражающее в большей степени растворенный белок).
Пример 6: Растворы горохового белка с рН от 3,5 до 7,0 (композиции 29-37)
Растворы горохового белка готовили с использованием изолята горохового белка в порошковой форме (NOW Foods) в качестве белка с камедью и без нее в качестве стабилизатора, а также с использованием PGA 500 (Amano Enzyme Inc.) и без нее в качестве дезамидирующего белок фермента, как указано в таблицах ниже. Использовали следующие камеди от TIC Gums: геллан (Ticagel® Gellan HS NGMO), пектин (Pre-Hydrated® Pectin 1694 Powder, карбоксиметилцеллюлозу (CMC, Pre-Hydrated® Ticalose® CMC 2500 Powder), альгинат (TICA-algin® HG-400 Powder) и камедь тары (TIC Pretested® Tara Gum 100).
Например, 10% (вес./об.) раствор горохового белка в воде готовили и смешивали с раствором камеди в воде для получения водного раствора с 3% (вес./об.) горохового белка и концентрацией камеди (% вес./об.), показанной в таблицах ниже. Для композиций, которые содержали PGA 500 (композиции «А» в таблицах ниже), фермент добавляли в количестве 2% (вес./вес.) белка и инкубировали при 50°C в течение 3 часов. Для композиций, которые не содержали PGA 500 (композиции «В» в таблицах ниже), растворы нагревали до 50°C без инкубирования. Раствор подкисляли лимонной кислотой до значения pH в диапазоне от 3,5 до 7 (как показано в таблицах), а затем подвергали тепловой обработке при 85°C в течение 10 минут. Остальные композиции готовили аналогичным способом.
Полученные растворы хранили при 4°C в лабораторном холодильнике VWR, первоначально оценивали через 24 часа, а затем оценивали с периодическими интервалами в течение двух месяцев (i) посредством визуального осмотра, (ii) посредством измерения содержания растворенного белка в супернатанте при поглощении при 280 нм, (iii) посредством измерения pH. Результаты представлены в таблицах ниже и показаны на фиг.1.
0,01%
0,01%
0,015%
0,03%
0,05%
Пектин
0,62%
0,05%
КMЦ 0,07%
0,05%
Альгинат 0,062%
0,6%
CMC
0,4%
0,6%
CMC
0,5%
Тара
0,1%
Фермент*= дезамидирующий белок фермент глутаминаза PGA 500
0,01%
0,01%
0,015%
0,03%
0,05%
Пектин
0,62%
0,05%
КMЦ 0,07%
0,05%
Альгинат 0,062%
0,6%
CMC
0,4%
0,6%
CMC
0,5%
Тара
0,1%
Фермент*= дезамидирующий белок фермент глутаминаза PGA 500
Результаты показывают, что при значении pH от около 3,5 до около 7 композиции по настоящему раскрытию (содержащие PGA 500 и камедь) (композиции 29A-37A) были устойчивы к осаждению белка, на что указывает внешний вид диспергированный по сравнению с разделенным и более высокое поглощение (отражающее в большей степени растворенный белок). С другой стороны, композиции без дезамидирующего белок фермента были менее стабильными при значении pH ниже около 4,0.
Пример 7: Растворы соевого белка с pH от 3,5 до 7,0 (композиции 38-45)
Растворы соевого белка готовили и оценивали, как описано в Примере 6, с использованием изолята соевого белка в порошкообразной форме (NOW Foods) в качестве белка. Результаты представлены в таблицах ниже и показаны на фиг.2.
0,015%
0,02%
0,02%
0,02%
0,03%
0,05%
Пектин
0,6%
0,03%
Пектин
0,6%
0,6%
CMC
0,4%
0,015%
0,02%
0,02%
0,02%
0,03%
0,05%
Пектин
0,6%
0,03%
Пектин
0,6%
0,6%
CMC
0,4%
Результаты показывают, что композиции по настоящему раскрытию (содержащие PGA 500 и камедь) (композиции 38A-45A) были устойчивы к осаждению белка в диапазоне pH от около 3,5 до около 7, на что указывает внешний вид диспергированный по сравнению с разделенным и более высокое поглощение (отражающее в большей степени растворенный белок). В отличие от этого, другие композиции (содержащие камедь, но не содержащие PGA 500) не были устойчивы к осаждению белка при pH ниже 5,2 (смотри результаты, представленные для рН 4,4-3,5).
Пример 8: Растворы конопляного белка с pH от 3,5 до 6,5 (композиции 46-52)
Растворы конопляного белка готовили и оценивали, как описано в Примере 6, с использованием порошка конопляного белка (Nutiva) в качестве белка. Результаты представлены в таблицах ниже и показаны на фиг.3.
0,015%
0,02%
CMC
0,2%
0,015%
CMC
0,2%
0,02%
CMC
0,2%
0,02%
CMC
0,2%
0,09%
0,1%
0,015%
0,02%
CMC
0,2%
0,015%
CMC
0,2%
0,02%
CMC
0,2%
0,02%
CMC
0,2%
0,09%
0,1%
Результаты показывают, что композиции по настоящему раскрытию (содержащие PGA 500 и камедь) (композиции 46A-52A) были более устойчивы к осаждению белка в диапазоне pH от около 3,5 до около 7, на что указывает диспергированный внешний вид и более высокое поглощение (отражающее в большей степени растворенный белок).
Пример 9: Растворы арахисового белка с pH от 3,5 до 7,0 (композиции 53-59)
Растворы арахисового белка готовили и оценивали, как описано в Примере 6, с использованием порошка арахисового белка (Tru-Nut Company) в качестве белка и ксантановой камеди (Pre-Hydrated® Ticaxan® Xanthan EC NGMO от TIC Gums). Результаты представлены в таблицах ниже и показаны на фиг.4.
0,02%
0,01%
CMC
0,1%
0,018%
0,06%
0,04%
CMC
0,2%
0,6%
CMC
0,2%
0,02%
0,01%
CMC
0,1%
0,018%
0,06%
0,04%
CMC
0,2%
0,6%
CMC
0,2%
Результаты показывают, что композиции по настоящему раскрытию (содержащие PGA 500 и камедь) (композиции 53A-59A) были устойчивы к осаждению белка в диапазоне pH от около 3,5 до около 7, на что указывает диспергированный внешний вид и более высокое поглощение (отражающее в большей степени растворенный белок), в то время как другие композиции были менее стабильны, особенно при более кислых значениях pH.
Пример 10: Растворы белка сверчка с pH от 3,5 до 7,0 (композиции 60-67)
Растворы белка сверчка готовили и оценивали таким же образом, как описано в Примере 6, с использованием муки из сверчков, содержащей 68% (вес./вес.) белка сверчка (LITHIC). Результаты представлены в таблицах ниже и показаны на фиг.5.
0,02%
0,02%
0,0075%
0,03%
0,07%
0,2%
0,5%
Геллан
0,05%
0,02%
0,02%
0,0075%
0,03%
0,07%
0,2%
0,5%
Геллан
0,05%
Результаты показывают, что композиции по настоящему раскрытию (содержащие PGA 500 и камедь) (композиции 60A-67A) были устойчивы к осаждению белка в диапазоне pH от около 3,5 до около 7, на что указывает диспергированный внешний вид и более высокое поглощение (отражающее в большей степени растворенный белок). Осадок наблюдался в композиции 62A, что может быть связано с тем, что определенного количества геллановой камеди было недостаточно для полного предотвращения осаждения белка, используемого при pH 5,1. Большинство других композиций были менее стабильными, особенно при более кислых значениях pH (например, ниже около 4,5). Не желая быть связанными теорией, можно предположить, что используемый белок сверчка не был чистым белком сверчка, а содержал примеси, включая небелковые примеси.
Пример 11: Растворы горохового белка с использованием гомогенизации (композиции 68-71)
Растворы горохового белка готовили с использованием изолята горохового белка в порошковой форме (NOW Foods) в качестве белка с камедью (геллан: Ticagel® Gellan HS NGMO; пектин: Pre-Hydrated® Pectin 1694 Powder; оба от TIC Gums) и без нее в качестве стабилизатора, а также с PGA 500 (Amano Enzyme Inc.) и без нее в качестве дезамидирующего белок фермента, как указано в таблице ниже.
Например, раствор готовили гидратацией 0,075% (вес./вес.) геллановой камеди и 0,45% (вес./вес.) пектина в воде. Добавляли гороховый белок для получения растворов горохового белка, содержащих различные количества горохового белка, как показано в таблице ниже. Для содержащих PGA 500 композиций фермент добавляли в количестве от 0,67% до 1,8% (вес./вес.) белка и инкубировали при 50°C в течение 3 часов. Для композиций, которые не содержали PGA 500, растворы нагревали до 50°C без инкубирования. Для подкисления использовали 1М (молярную) лимонную кислоту для достижения требуемого pH. Подкисленный раствор подвергали гомогенизации под давлением 2000~2500 фунтов на квадратный дюйм, а затем подвергали тепловой обработке при 85°C в течение 10 минут. Другие композиции готовили аналогичным способом.
Активность дезамидирующего белок фермента определяли в соответствии с примером 16.
Полученные растворы хранили при 4°C в лабораторном холодильнике VWR и оценивали, как описано в примере 6 выше. Результаты представлены в таблице ниже и показаны на фиг.6.
0,05% Пектин
0,3%
0,05% Пектин
0,3%
0,05% Пектин
0,3%
0,05% Пектин
0,3%
0,05% Пектин
0,3%
0,05% Пектин
0,3%
0,05% Пектин
0,3%
0,05% Пектин
0,3%
Ед/300 мл раст.=единицы на 300 мл раствора (активность фермента)
Результаты показывают, что при кислом значении pH (от около 4,0 до около 4,5) композиции по настоящему раскрытию (содержащие PGA 500 и камедь) (композиции 68B-71B) были устойчивы к осаждению белка, на что указывает диспергированный внешний вид и более высокое поглощение (отражающее в большей степени растворенный белок). Эти результаты показывают, что улучшенная стабильность, достигнутая с использованием рецептур, раскрытых здесь, сохраняется даже после гомогенизации.
Пример 12: Растворы соевого белка с использованием гомогенизации и концентрата сока (композиции 72-74)
Растворы соевого белка готовили с использованием изолята соевого белка в порошковой форме (NOW Foods) в качестве белка с (геллан: Ticagel® Gellan HS NGMO; пектин: Pre-Hydrated® Pectin 1694 Powder; оба от TIC Gums)камедью и без нее в качестве стабилизатора, а также с PGA 500 (Amano Enzyme Inc.) и без нее в качестве дезамидирующего белок фермента, как указано в таблице ниже.
Например, раствор готовили гидратацией 0,06% или 0,075% (вес./вес.) геллановой камеди и 0,45% (вес./вес.) пектина в воде. Изолят соевого белка добавляли для получения растворов соевого белка, содержащих различные количества соевого белка, как показано в таблице ниже. Для содержащих PGA 500 композиций фермент добавляли в количестве 0,67%~2,4% (вес./вес.) белка и инкубировали при 50°C в течение 3 часов. Для композиций, которые не содержали PGA 500, растворы нагревали до 50°C без инкубирования. Для подкисления добавляли концентрат ягодного сока (100% концентрат сока ягодной смеси 65 Брикс от Old Orchard) в соотношении 1:2 вес./вес. Подкисленный раствор подвергали гомогенизации под давлением 2000~2500 фунтов на квадратный дюйм, а затем подвергали тепловой обработке при 85°C в течение 10 минут. Другие композиции готовили аналогичным способом. Активность дезамидирующего белок фермента определяли в соответствии с примером 16.
Полученные растворы хранили при 4°C в лабораторном холодильнике VWR и оценивали, как описано в примере 6 выше. Результаты представлены в таблице ниже и показаны на фиг.7.
0,04% Пектин
0,3%
0,04% Пектин
0,3%
0,05% Пектин
0,3%
0,05% Пектин
0,3%
0,05% Пектин
0,3%
0,05% Пектин
0,3%
Результаты показывают, что при кислом значении pH (от около 4,0 до около 4,5) композиции по настоящему раскрытию (содержащие PGA 500 и камедь) (композиции 72B-74B) были устойчивы к осаждению белка, на что указывает диспергированный внешний вид и более высокое поглощение (отражающее в большей степени растворенный белок). Эти результаты показывают, что улучшенная стабильность, достигнутая с использованием рецептур, раскрытых здесь, сохраняется даже после гомогенизации.
Пример 13: Растворы арахисового белка с использованием гомогенизации и концентрата сока (композиции 75-77)
Растворы арахисового белка готовили с использованием порошка арахисового белка (компании Tru-Nut) в качестве белка с камедью геллан: Ticagel® Gellan HS NGMO; пектин: Pre-Hydrated® Pectin 1694 Powder; оба от TIC Gums) и без нее (в качестве стабилизатора, а также с PGA 500 (Amano Enzyme Inc.) и без нее в качестве дезамидирующего белок фермента, как указано в таблице ниже.
Например, раствор готовили гидратацией в воде количества геллановой камеди и пектина, указанного в таблице ниже. Арахисовый белок добавляли для получения растворов арахисового белка, содержащих различные количества арахисового белка, как показано в таблице ниже. Для содержащих PGA 500 композиций фермент добавляли в количестве 0,67%~3,6% (вес./вес.) белка и инкубировали при 50°C в течение 3 часов. Для композиций, которые не содержали PGA 500, растворы нагревали до 50°C без инкубирования. Для подкисления добавляли концентрат ягодного сока (100% концентрат сока ягодной смеси 65 Брикс от Old Orchard) в соотношении 1:2 вес./вес. Подкисленный раствор подвергали гомогенизации под давлением 2000~2500 фунтов на квадратный дюйм, а затем подвергали тепловой обработке при 85°C в течение 10 минут. Другие композиции готовили аналогичным способом. Активность дезамидирующего белок фермента определяли в соответствии с примером 16.
Полученные растворы хранили при 4°C в лабораторном холодильнике VWR и оценивали, как описано в примере 6 выше. Результаты представлены в таблице ниже и показаны на фиг.8.
0,04% Пектин
0,6%
0,04% Пектин
0,6%
0,02% Пектин
0,6%
0,02% Пектин
0,6%
0,03% Пектин
0,6%
0,03% Пектин
0,6%
Результаты показывают, что при кислом значении pH (от около 4,0 до около 4,5) композиции по настоящему раскрытию (содержащие PGA 500 и камедь) (композиции 75B-77B) были устойчивы к осаждению белка, на что указывает диспергированный внешний вид и более высокое поглощение (отражающее в большей степени растворенный белок). Эти результаты показывают, что улучшенная стабильность, достигнутая с использованием рецептур, раскрытых здесь, сохраняется даже после гомогенизации.
Пример 14: Растворы миндального белка с использованием гомогенизации (композиции 78-79)
Растворы миндального белка готовили с использованием порошка миндального белка (марки Noosh) в качестве белка с камедью геллан: Ticagel® Gellan HS NGMO; пектин: Pre-Hydrated® Pectin 1694 Powder; оба от TIC Gums) и без нее в качестве стабилизатора (, а также с PGA 500 (Amano Enzyme Inc.) и без нее в качестве дезамидирующего белок фермента, как указано в таблице ниже.
Например, раствор готовили гидратацией 0,06% (вес./вес.) геллановой камеди или 0,45% (вес./вес.) пектина в воде. Миндальный белок добавляли для получения миндальных растворов, содержащих 3,3% (вес./вес.) миндального белка. Для содержащих PGA 500 композиций фермент добавляли в количестве 3,3% (вес./вес.) белка и инкубировали при 50°C в течение 3 часов. Для композиций, которые не содержали PGA 500, растворы нагревали до 50°C без инкубирования. Для подкисления добавляли концентрат ягодного сока (100% концентрат сока ягодной смеси 65 Брикс от Old Orchard) в соотношении 1:2 вес./вес. Подкисленный раствор подвергали гомогенизации под давлением 2000~2500 фунтов на квадратный дюйм, а затем подвергали тепловой обработке при 85°C в течение 10 минут. Активность дезамидирующего белок фермента определяли в соответствии с примером 16.
Полученные растворы хранили при 4°C в лабораторном холодильнике VWR и оценивали, как описано в примере 6 выше. Результаты представлены в таблице ниже.
0,04%
0,04%
0,3%
0,3%
Результаты показывают, что при кислом значении pH (около 4,0) композиции по настоящему раскрытию (содержащие PGA 500 и камедь) (композиции 78B-79B) были устойчивы к осаждению белка, на что указывают диспергированный внешний вид и более высокое поглощение (отражающее в большей степени растворенный белок). Эти результаты показывают, что улучшенная стабильность, достигнутая с использованием рецептур, раскрытых здесь, сохраняется даже после гомогенизации.
Результаты показывают, что при pH от около 4,0 до около 4,2 оба PGA 500 композиции с камедью (композиции 78B и 79B) были стабильны, на что указывает более высокие значения поглощения (в большей степени растворенный белок) и отсутствие осаждения или осадка по сравнению со сравнительными композициями, не содержащими PGA 500, но содержащими камедь (композиции 78A и 79A), которые демонстрируют разделение и более низкие значения поглощения (в меньшей степени растворенный белок). Эти результаты показывают, что стабильность, наблюдаемая для комбинации PGA 500 и камеди, сохраняется даже при гомогенизации.
Пример 15: Долгосрочные испытания стабильности
Долгосрочные испытания стабильности проводят следующим образом. Композиции, описанные ниже, смешивали и асептически упаковывали на сертифицированной опытно-промышленной установке для производства серийно выпускаемых пастеризованных и стабильных продуктов и хранили до шести месяцев в условиях охлаждения (4°C). Эти продукты устойчивы к осаждению белка.
Например, для приготовления серийно выпускаемой пастеризованной композиции можно использовать следующий процесс:
1. Взвесить пектин, геллановую камедь, воду и гороховый белок.
2. Смешать камедь и воду в условиях высокого сдвига.
3. Активировать камедь в растворе нагреванием и выдерживанием при температуре 85°C.
4. Перенести камедь в водном растворе в чан на 100 л, добавить белок.
5. Добавить фермент в чан и тщательно перемешать. Перенести раствор в контейнер для инкубирования при 50°C в течение 3 часов.
6. Взвесить концентрат сока и пищевой краситель.
7. Вернуть раствор в чан на 100 л и добавить концентрат сока и пищевой краситель.
8. При надлежащем перемешивании подавать смесь в систему ультравысокотемпературной пастеризации (UHT; например, при температуре около 120°C в течение от около 1 секунды до около 3 секунд)/ высокотемпературной кратковременной пастеризации (HTST, например, при температуре около 100°C в течение от около 10 секунд до около 20 секунд) для пастеризации.
9. Загрузить пастеризованный продукт в гомогенизатор для гомогенизации при 2000 фунтов на квадратный дюйм.
10. Разлить в бутылки и укупорить продукт в стерильной среде и переложить в ящики для хранения.
На сегодняшний день испытания стабильности показали, что описанная выше композиция с дезамидирующим белок ферментом стабильна после хранения в течение 25 недель при 4°C.
Пример 16: Определение активности дезамидирующих белок ферментов
Активность дезамидирующего белок фермента можно определить следующим методом, который проиллюстрирован применительно к активности дезамидирующей белок глутаминазы. Аналогичное определение можно проводить применительно к активности дезамидирующей белок аспарагиназы с использованием подходящего субстрата для дезамидирования белка аспарагиназой (например, Z-Asn-Gly).
Испытуемый раствор готовят добавлением 0,1 мл водного раствора, содержащего дезамидирующий белок фермент, в 1 мл 0,2 М фосфатного буфера (pH 6,5), содержащего 30 мМ Z-Gln-Gly (субстрат для определения активности дезамидирующей белок глутаминазы) и инкубируют в течение 10 минут при 37°C. Реакцию заканчивают добавлением 1 мл 0,4 М раствора трихлоруксусной кислоты (TCA). Контрольный раствор готовят добавлением 0,1 мл водного раствора, содержащего дезамидирующий белок фермент, в раствор, содержащий 1 мл 0,2 М фосфатного буфера (pH 6,5), содержащего 30 мМ Z-Gln-Gly (для определения активности дезамидирующей белок глутаминазы) и 1 мл 0,4 М раствора трихлоруксусной кислоты (TCA) и инкубируют в течение 10 минут при 37°C. Количество аммиака, образующегося в результате реакции в испытуемом растворе, измеряют с использованием теста на аммиак Wako (производства Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), где концентрация аммиака определяется с использованием калибровочной кривой зависимости концентрации аммиака от поглощения (при 630 нм), полученной с использованием стандартного раствора аммиака (хлорида аммония). Активность дезамидирующего белок фермента можно рассчитать следующим образом (1 единица=количество фермента, необходимое для получения 1 мкмоль аммиака в минуту):
Активность фермента (Ед/мл)=(концентрация аммиака в реакционном растворе (мг/л))×(1/17,03)×(2,1/0,1)×(1/10)×Df,
где:
17,03 - молекулярная масса аммиака;
2,1 - объем жидкости в системе ферментативной реакции (мл) в приведенном выше протоколе;
0,1 - объем раствора фермента (мл) в приведенном выше протоколе;
10 - время реакции (мин) в приведенном выше протоколе; а также
Df - степень разбавления раствора фермента.
В совокупности эти примеры показывают, что стабильные белковые растворы можно приготовить, как описано здесь, для различных белков из различных источников, и что такие белковые растворы устойчивы к осаждению белка при кислом значении pH, включая композиции, подкисленные концентратом фруктового сока. Примеры также показывают, что белковые растворы, приготовленные, как описано здесь, стабильны после гомогенизации.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
SEQ ID NO: 1
LASVIPDVATLNSLFNQIKNQSCGTSTASSPCITFRYPVDGCYARAHKMRQILMNNGYDCEKQFVYGNLKASTGTCCVAWSYHVAILVSYKNASGVTEKRIIDPSLFSSGPVTDTAWRNACVNTSCGSASVSSYANTAGNVYYRSPSNSYLYDNNLINTNCVLTKFSLLSGCSPSPAPDVSSCGF
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> AMANO ENZYME USA CO., LTD,
AMANO ENZYME INC.
<120> СТАБИЛЬНЫЕ БЕЛКОВЫЕ КОМПОЗИЦИИ
<130> 21043WO
<150> US 62/810891
<151> 2019-02-26
<160> 1
<170> PatentIn версия 3.5
<210> 1
<211> 185
<212> ПРТ
<213> Chryseobacterium proteolyticum
<400> 1
Leu Ala Ser Val Ile Pro Asp Val Ala Thr Leu Asn Ser Leu Phe Asn
1 5 10 15
Gln Ile Lys Asn Gln Ser Cys Gly Thr Ser Thr Ala Ser Ser Pro Cys
20 25 30
Ile Thr Phe Arg Tyr Pro Val Asp Gly Cys Tyr Ala Arg Ala His Lys
35 40 45
Met Arg Gln Ile Leu Met Asn Asn Gly Tyr Asp Cys Glu Lys Gln Phe
50 55 60
Val Tyr Gly Asn Leu Lys Ala Ser Thr Gly Thr Cys Cys Val Ala Trp
65 70 75 80
Ser Tyr His Val Ala Ile Leu Val Ser Tyr Lys Asn Ala Ser Gly Val
85 90 95
Thr Glu Lys Arg Ile Ile Asp Pro Ser Leu Phe Ser Ser Gly Pro Val
100 105 110
Thr Asp Thr Ala Trp Arg Asn Ala Cys Val Asn Thr Ser Cys Gly Ser
115 120 125
Ala Ser Val Ser Ser Tyr Ala Asn Thr Ala Gly Asn Val Tyr Tyr Arg
130 135 140
Ser Pro Ser Asn Ser Tyr Leu Tyr Asp Asn Asn Leu Ile Asn Thr Asn
145 150 155 160
Cys Val Leu Thr Lys Phe Ser Leu Leu Ser Gly Cys Ser Pro Ser Pro
165 170 175
Ala Pro Asp Val Ser Ser Cys Gly Phe
180 185
<---
Изобретение относится к области пищевой промышленности. Описана группа изобретений, включающая стабильный белковый раствор для потребления человеком или животным, напиток для потребления людьми или животными, содержащий вышеуказанный раствор, добавка к напитку для потребления людьми или животными, содержащая вышеуказанный раствор, и способ получения раствора, или напитка, или добавки к напитку. Изобретение расширяет арсенал стабильных белковых композиций для потребления человеком или животным. 4 н. и 37 з.п. ф-лы, 8 ил., 16 табл., 16 пр.
1. Стабильный белковый раствор для потребления человеком или животным, содержащий:
(i) от около 0,1 до около 8% вес./об. белка в пересчете на объем раствор;
(ii) от 0,01 до 5% вес./об. стабилизатора в пересчете на объем раствора;
и
(iii) от около 0,5 Ед до около 50 Ед активности дезамидирующего белок фермента или от около 0,1 до около 10% вес./вес. дезамидирующего белок фермента в пересчете на вес белка в растворе,
где раствор имеет рН от около 3,5 до около 7,0 и устойчив к осаждению белка.
2. Раствор по п. 1, в котором дезамидирующий белок фермент представляет собой дезамидирующий белок фермент глутаминазу, которая дезамидирует амидогруппы остатков глутамина в белке.
3. Раствор по п. 1 или 2, в котором белок включает один или более белков, выбранных из растительного белка и белка насекомых.
4. Раствор по п. 3, в котором белок включает растительный белок, выбранный из одного или более белков сои, гороха, конопли и орехов.
5. Раствор по п. 4, в котором орех представляет собой арахис или миндаль.
6. Раствор по п. 3, в котором белок включает белок насекомого, выбранный из одного или более белков сверчка.
7. Раствор по одному из предшествующих пунктов, в котором стабилизатор включает одно или более из следующего: камедь и полисахарид.
8. Раствор по п. 7, в котором стабилизатор включает одно или более из следующего: ксантановая камедь, геллановая камедь, каррагенановая камедь, альгинаты, пропиленгликольальгинаты, пектин, карбоксиметилцеллюлоза (КMЦ) и их производные или комбинации.
9. Раствор по одному из предшествующих пунктов, в котором дезамидирующий белок фермент продуцируется Chryseobacterium.
10. Раствор по одному из предшествующих пунктов, в котором дезамидирующий белок фермент продуцируется микроорганизмом Penicillium.
11. Раствор по одному из предшествующих пунктов, в котором фермент представляет собой белковую глутаминазу Amano 500 (PGA 500).
12. Раствор по одному из предшествующих пунктов, в котором дезамидирующий белок фермент содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или последовательность, имеющую по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности с ней и обладающую активностью дезамидирующего белок фермента.
13. Раствор по одному из предшествующих пунктов, в котором дезамидирующий белок фермент содержит вариантную аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, обладающую активностью дезамидирующего белок фермента и имеющую одну или более замен или делеций в аминокислотных остатках 35, 38-43, 45, 46, 49, 79-84, 103-106, 117, 142, 143, 146, 166 или 185 SEQ ID NO: 1, необязательно, где вариантная аминокислотная последовательность по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична SEQ ID NO: 1.
14. Раствор по одному из пп. 1-13, содержащий:
i) от около 0,01 до около 1% вес./об. стабилизатора в пересчете на объем раствора; и
(ii) от около 5 Ед до около 50 Ед активности дезамидирующего белок фермента или от около 1 до около 10% вес./вес. дезамидирующего белок фермента в пересчете на вес белка в растворе.
15. Раствор по одному из пп. 1-14, в котором раствор имеет вязкость от около 10 до около 250 мПа⋅с.
16. Раствор по п. 15, где раствор содержит от около 0,1 до около 6% вес./об. белка в пересчете на объем раствора.
17. Раствор по п. 15, где раствор содержит от около 0,01 до около 1% вес./об. или от около 0,02 до около 0,5% вес./об. стабилизатора в пересчете на объем раствора.
18. Раствор по п. 15, где раствор содержит от около 5 Ед до около 25 Ед дезамидирующей белок активности или от около 1% вес./вес. до около 5% вес./вес. дезамидирующего белок фермента в пересчете на вес белка в растворе.
19. Раствор по одному из предшествующих пунктов, где раствор имеет pH от около 4,0 до около 7,0 или от около 4,0 до около 5,0.
20. Раствор по одному из предшествующих пунктов, где раствор является устойчивым к видимому осаждению белка после хранения при 4°C в течение периода времени, выбранного из 7 дней, 14 дней, 21 дня, 1 месяца, 2 месяцев, 4 месяцев, 6 месяцев и 8 месяцев.
21. Раствор по одному из предшествующих пунктов, где раствор приготовлен в виде напитка или добавки к напитку для потребления людьми или животными.
22. Напиток для потребления людьми или животными, содержащий раствор по одному из предшествующих пунктов.
23. Напиток по п. 22, выбранный из питательного напитка, спортивного напитка, функционального белкового напитка, молочного напитка, молочного коктейля, фруктового напитка, фруктового коктейля, кофейного напитка, чайного напитка и растительного молока.
24. Напиток по п. 22 или 23, дополнительно содержащий один или более из следующего: фруктовый сок, концентрат фруктового сока, овощной сок и концентрат овощного сока.
25. Напиток по п. 24, где композиция содержит кислый сок или концентрат сока.
26. Добавка к напитку для потребления людьми или животными, содержащая раствор по одному из пп. 1-21.
27. Добавка к напитку по п. 26, выбранная из молочных сливок и немолочных сливок.
28. Добавка к напитку по п. 26 или 27, дополнительно содержащая один или более из следующего: фруктовый сок, концентрат фруктового сока, овощной сок и концентрат овощного сока.
29. Добавка к напитку по п. 28, где композиция содержит кислый сок или концентрат сока.
30. Способ получения раствора по одному из пп. 1-21 или напитка по одному из пп. 22-25 или добавки к напитку по одному из пп. 26-29, включающий:
(а) добавление дезамидирующего белок фермента в раствор, содержащий белок и стабилизатор, для получения смеси;
(b) инкубирование смеси; и
(c) подкисление смеси для получения раствора с pH от около 3,5 до около 7,0.
31. Способ по п. 30, дополнительно включающий до стадии (а) смешивание (i) раствора, содержащего белок, и (ii) раствора, содержащего стабилизатор.
32. Способ по п. 30, где инкубирование проводят при температуре от около 30°C до около 70°C и в течение периода от около 0,5 ч до около 48 ч при перемешивании с pH от около 3,0 до около 8.0.
33. Способ по п. 32, где инкубирование проводят при температуре от около 40°C до около 60°C и в течение периода от около 3 ч до около 24 ч при медленном перемешивании с pH от около 5,0 до около 8,0.
34. Способ по одному из пп. 30-33, где инкубирование проводят до тех пор, пока ферментативная реакция не достигнет требуемого уровня завершения, что определяется концентрацией свободных ионов аммония в растворе.
35. Способ по одному из пп. 30-34, где подкисление включает добавление кислого сока или концентрата сока.
36. Способ по одному из пп. 30-35, где дезамидирующий белок фермент представляет собой белковую глутаминазу Amano 500 (PGA 500) и/или имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и инкубирование проводят при 50°C в течение 3 ч.
37. Способ по одному из пп. 30-36, дополнительно включающий проведение пастеризации раствора с целью тепловой обработки при температуре около 85°C в течение около 10 мин.
38. Способ по одному из пп. 30-37, дополнительно включающий проведение одной или более обработок раствора, выбранной из гомогенизации, пастеризации и стерилизации.
39. Способ по п. 38, где раствор подвергают гомогенизации при давлении от около 2000 фунтов на квадратный дюйм до около 20000 фунтов на квадратный дюйм.
40. Способ по п. 38, где раствор подвергают пастеризации, проводимой с использованием высокотемпературной кратковременной пастеризации (HTST) при температуре около 100°C в течение от около 10 с до около 20 с, ультравысокотемпературной пастеризации (UHT) при температуре около 120°C в течение от около 1 с до около 3 с или низкотемпературной длительной пастеризации (LTLT) при температуре от около 75°C до около 85°C в течение от около 10 мин до около 20 мин.
41. Способ по п. 38, где раствор подвергают стерилизации под высоким давлением.
| CN 107325977 A, 07.10.2017 | |||
| WO 2004032648 A1, 22.04.2004 | |||
| УСТРОЙСТВО ДЛЯ ВЫРЕЗКИ ОТВЕРСТИЙ В ДЕЙСТВУЮЩЕМ ТРУБОПРОВОДЕ | 2007 |
|
RU2351837C2 |
| WO 2008138900 A2, 20.11.2008 | |||
| СТАБИЛЬНЫЕ КОМПОЗИЦИИ С ВЫСОКИМИ КОНЦЕНТРАЦИЯМИ БЕЛКОВ АНТИТЕЛ ЧЕЛОВЕКА ПРОТИВ TNF-АЛЬФА | 2010 |
|
RU2560701C2 |
