Способ количественного анализа сыворотки крови методом ИК-спектроскопии Российский патент 2023 года по МПК G01N33/50 G01N33/52 G01N33/96 G01N21/3577 

Изобретение относится к области медицины, а именно к способам исследования биологической жидкости с помощью физических и химических методов. Плазма и сыворотка крови содержат более 300 типов белков, а также углеводы, липиды и аминокислоты и до 114 000 известных метаболитов в различных концентрациях. Определение клинических параметров сыворотки и плазмы крови широко применяется для диагностики различных заболеваний, а также как способ контроля эффективности лечения. В связи с этим спрос на клинические анализы растет, что обусловливает использование автоматических анализаторов, многие из которых основаны на колориметрических реакциях. Эти методы предполагают использование дорогостоящих и специфических реагентов. Принимая во внимание массовый характер подобных исследований, очевидна потребность в новых и дешевых альтернативных аналитических процедурах, особенно в качестве инструментов скрининга, как возможного индикатора в ситуациях, когда экономические ресурсы ограничены и требуются диагностические доказательства в месте оказания медицинской помощи.

Для этих целей могут быть использованы методы вибрационной спектроскопии, в частности ИК спектроскопия, поскольку они не требуют маркировки, экономичны, просты в эксплуатации и требуют минимальной подготовки образца. Чувствительность к незначительным изменениям биохимического состава делает их идеальными диагностическими инструментами, а недавние достижения в области технологий и анализа данных позволяют быстро и неинвазивно анализировать жидкости организма. Однако определение клинических параметров в сыворотках с помощью вибрационной спектроскопии может быть затруднено из-за высокой сложности матрицы и низкого уровня концентрации некоторых аналитов, поскольку для устранения эффектов матрицы обычно требуются хемометрические алгоритмы. В целом идея определения клинических параметров сыворотки по ИК-спектрам не нова и потенциал для количественного и полуколичественного анализа метаболитов в плазме, сыворотке и цельной крови подтвержден рядом исследований. В настоящее время методом ИК-спектроскопии сыворотки крови возможно диагностировать такие заболевания как мочекаменная болезнь (Патент RU 2 666 948 С1 от 06.07.2017 г.), сахарный диабет (Патент RU 2 405 148 С2 от 25.02.2009 г., Патент RU 2 198 402 С2 от 11.03.2001 г.), бронхиальная астма (Патент RU 2 372 621 С1 от 16.06.2008 г.), для дифференциальной диагностики шизофрении и злокачественных новообразований головного мозга (Патент RU 2 664 444 С1 от 03.07.2017 г.), ранней дифференциальной диагностики острого панкреатита и рака поджелудочной железы (Патент RU 2 602 689 С1 от 01.07.2015 г.). В данных методах подготовку образца сыворотки крови осуществляют путем высушивания образца и измельчения сухого остатка, с последующим суспензированием его в вазелиновом масле, исследование образца сыворотки крови проводят с использованием ИК спектроскопии в области спектра 1200-1000 см^-1 и определяют высоты пиков полос поглощения. Для ряда параметров сыворотки крови уже разработаны методы определения с использованием ИК спектроскопии. Так, глюкоза в крови, важный параметр для контроля диабета и других обычных заболеваний, была определена в сыворотке с приемлемой точностью. Показано, что спектроскопия в среднем ИК диапазоне может служить альтернативной основой для клинического измерения мочевины и глюкозы в сыворотке крови. В литературе сообщаются многообещающие результаты по определению важных параметров сыворотки, таких как мочевина, общий белок, альбумин, триглицериды или общий холестерин. Тем не менее, возможность одновременного определения нескольких параметров крови исследована недостаточно. Наиболее близким по технической сущности к заявляемому способу является метод анализа сухих отложений сыворотки с помощью спектроскопии пропускания выявил возможность количественного определения восьми компонентов сыворотки (R.A. Shaw, S. Kotowich, M. Leroux, H.H. Mantsch. “Multianalyte serum analysis using mid-infrared spectroscopy”. Ann. Clin. Biochem. An Int. J. Biochem. Lab. Med. 1998. 35: 624-632). Недостатком данного способа является малое количество определяемых компонентов и низкая точность (по ряду параметров погрешность превышает 100%).

Задачей разрабатываемого технического решения является одновременное определения концентрации основных компонентов сыворотки крови по характеристикам ИК спектров с погрешностью не более 10%.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе количественного анализа сыворотки крови методом ИК спектроскопии комбинируют несколько подходов, а именно: (1) используют модельные растворы, что позволяет учесть сложный состав матрицы образца; (2) проводят моделирование в широком диапазоне концентраций, который соответствует диапазону концентраций компонентов реальной сыворотки крови; (3) применяют хемометрические методы для построения уравнения регрессии и расчета концентраций компонентов, что позволяет повысить точность. Описанная комбинация методов позволяет одновременно определять концентрации 38 компонентов при использовании интенсивностей полос поглощения 1717 и 3903 см^-1 и площадей полос поглощения 616, 3750 и 3903 см^-1 с погрешностью менее 10%. Полученные результаты подтверждают потенциальное клиническое использование метода ИК-спектроскопии в качестве безреагентного экспресс-метода анализа сыворотки крови.

Способ поясняется рисунками:

фигура 1 - Пример ИК-спектра сыворотки крови (А); Сравнение ИК-спектра сыворотки крови и модельного раствора (В).

фигура 2 - ИК- спектры модельных растворов при разбавлении исходного раствора в 5 раз (кривая 1), 3 раза (кривая 2) и в 2 раза (кривая 3) соответственно.

фигура 3 - Изменение интенсивностей и площадей характеристических полос поглощения при разбавлении модельных растворов.

Способ осуществляется следующим образом.

Для приготовления модельных растворов использован набор сывороток контрольных лиофилизированных на основе бычьей сыворотки крови, аттестованных приблизительно по 38 показателям (SPINREACT, S.A. Ctra. Santa Coloma, Spain). Раствор исходной модельной сыворотки разбавляли в 2, 3, 5, 7, 10 раз (в трех параллелях). Отбирают аликвоты объемом 50 мкл и высушивают в течение 30 минут на подложке из селенида цинка в термостате при 37°С. ИК-спектры поглощения регистрируют на ИК-Фурье-спектрометре «ФТ-801» (СИМЕКС) в диапазоне 500-4000 см^-1. Запись спектров проводят с числом сканов 32 с разрешением 4 см^-1.

Выбирают полосы поглощения, которые присутствуют на ИК- спектрах сыворотки независимо от разбавления. Были определены интенсивность (H) и площадь (S) для соответствующих полос поглощения.

Отбирают S и H в таких полосах поглощения, у которых наблюдалась высокая корреляция с концентрациями компонентов (В_i). Ими оказались H20, Н49, S2, S42, S49, где H20 и H49 - интенсивности полос поглощения 1717 и 3919 см^-1; S2, S42 и S49 - площади полос поглощения 617, 3750 и 3919 см^-1. Затем создают программу на Delphi и подбирают такую комбинацию K этих параметров, что имеет высокую корреляцию с Вi при изменении концентрации (уравнение 1, 2). Поскольку операции умножения и деления переменных могут усиливать корреляции, а умножение на константу, сложение и вычитание переменных не влияет на корреляции, в результате из всех комбинаций K отбирают те, для которых сильна корреляция c каждым В_i (коэффициент корреляции Пирсона r>0.999) и составляют их средневзвешенную сумму, имеющую минимальную сумму квадратов отклонения значений от В_i. Вектор весовых коэффициентов в этой сумме ищется путем решения нелинейной задачи методом обобщенного приведенного градиента. Далее выявляют весовые коэффициенты Сi, при которых квадрат отклонения Bi от значения K умноженного на Сi минимален.

Далее проводят тестирование модели, и корректировку константной погрешности, путем вычитания ошибки, так как вычисляемые значения получаются всегда примерно на 5% больше (уравнение 3). Разработку модели проводят на основе модельных растворов нормальной сыворотки крови (SPINREACT normal), тогда как для тестирования используют модельные растворы патологической сыворотки (SPINREACT pathologic). Концентрации всех компонентов в тестовом модельном растворе соответствуют диапазону концентраций исходных модельных растворов.

Проводят сравнение ИК-спектров сыворотки крови и предлагаемых модельных растворов (фиг. 1). Показано, что вклад белков в ИК-спектры находится в диапазонах частот 3400-3030 см^-1, 1720-1480 см^-1 и 1301-1229 см^-1 - регион I; липидов в диапазонах 3020-2819 см^-1, 1750-1725 см^-1 и 1480-1430 см^-1 - регион II; углеводов и нуклеиновых кислот (ДНК/РНК) в диапазоне частот 1200-900 см^-1 - регион III (фиг. 1а). Максимальные различия между ИК-спектрами сыворотки и модельных растворов наблюдаются в регионах III и IV и обусловлены отсутствием ряда углеводов и нуклеиновых кислот в модельных смесях (фиг. 1б).

Получают ИК-спектры модельных растворов с разной концентрацией составляющих веществ (фиг. 2а). Для построения уравнения регрессии выбирают четыре полосы поглощения: H20 и H49 - интенсивности полос поглощения 1717 и 3903 см^-1; S2, S42 и S49 - площади полос поглощения 616, 3750 и 3903 см^-1 (фиг. 2). На фиг. 2в - 2е показано изменение полос поглощения при изменении концентраций модельных растворов. При разбавлении соответствующих растворов интенсивности и площади выбранных полос поглощения уменьшаются (фиг. 3).

На основе предложенного алгоритма получают уравнение для расчета концентраций компонентов модельного раствора (B_i), где i=1,…38 (уравнение 3). Коэффициенты (С_i) для расчета приведены в таблице 1. В таблице 2 приведен полный перечень определяемых компонентов модельного раствора, диапазон концентраций, который использован при построении модели, а также истинные и найденные при тестировании модели концентрации тестового раствора. Согласно приведенным данным во всех случаях погрешность определения концентрации не превышает 10% (табл.2).

Таблица 1. Коэффициенты (С_i) для расчета концентраций компонентов В_i (i=1, …, 38) i 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C_i 1019 136.7 61.42 458.7 1507 21.46 5.474 32.66 7.744 2.815 i 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 C_i 2.768 4.447 3.685 5.474 167.9 51.32 65.93 106.8 37.16 3.81 i 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 C_i 2.084 227 3.623 531.8 78.53 53.8 317.2 768.2 8554 88.48 i 31 32 33 34 35 36 37 38 C_i 329.7 309.4 247.2 220.8 131.4 1157 65.47 489.8

Таблица 2. Перечень определяемых компонентов и диапазон концентраций модельных растворов № Компонент Единицы измерения Модель диапазон концентраций Тест Ист Тест найд Δ, % В1 Мочевая кислота мкмоль/л 58.40 - 292.00 131.00 134.51 2.68 В2 Билирубин (общ) мкмоль/л 5.78 - 28.90 17.58 16.49 6.20 В3 Билирубин (связ) мкмоль/л 3.06 - 15.30 7.90 8.51 7.74 В4 Креатинин мкмоль/л 18.02 - 90.10 59.00 63.65 7.88 В5 Фруктозамин мкмоль/л 147.40 - 737.00 193.80 182.22 5.98 В6 Глюкоза ммоль/л 1.04 - 5.22 2.76 2.95 6.87 В7 Лактат ммоль/л 0.30 - 1.52 0.70 0.75 6.61 В8 Мочевина ммоль/л 1.39 - 6.97 4.20 4.44 5.81 В9 Холестерин ммоль/л 0.48 - 2.39 1.00 1.07 7.21 В10 ЛПВП (липопротеиды высокой плотности) ммоль/л 0.14 - 0.72 0.36 0.34 5.74 В11 ЛПНП (липопротеиды низкой плотности) ммоль/л 0.27 - 1.34 0.36 0.38 6.98 В12 Фосфолипиды ммоль/л 0.32 - 1.60 0.57 0.62 8.01 В13 Триглицериды ммоль/л 0.25 - 1.24 0.47 0.43 8.29 В14 Кальций ммоль/л 0.44 - 2.22 0.70 0.75 6.61 В15 Хлориды ммоль/л 16.20 - 81.00 21.60 23.70 9.72 В16 Медь мкмоль/л 3.64 - 18.20 6.60 6.18 6.36 В17 Железо мкмоль/л 3.68 - 18.40 8.48 9.13 7.64 В18 Железосвязывающая способность мкмоль/л 13.74 - 68.70 13.74 15.11 10.00 В19 Калий ммоль/л 0.70 - 3.51 4.78 5.19 8.55 В20 Литий ммоль/л 0.20 - 1.00 0.49 0.52 6.68 В21 Магний ммоль/л 0.17 - 0.87 0.27 0.25 5.90 В22 Натрий ммоль/л 25.20 - 126.00 29.20 31.73 8.66 В23 Фосфор ммоль/л 0.27 - 1.36 0.47 0.50 7.75 В24 Цинк мкг/мл 77.40 - 387.00 68.40 63.25 7.52 В25 Общий белок г/л 13.24 - 66.20 10.10 10.81 7.02 В26 Альбумин г/л 9.78 - 48.90 6.92 7.47 7.89 В27 Амилаза Е/л 16.40 - 82.00 40.80 44.05 7.97 В28 Креатинкиназа Е/л 29.00 - 145.00 98.80 91.94 6.95 В29 Холинэстераза Е/л 1107.80 - 5539.00 1100.20 1181.62 7.40 В30 Кислая фосфатаза Е/л 6.72 - 33.60 11.38 12.21 7.28 В31 Щелочная фосфатаза Е/л 15.20 - 76.00 42.40 45.00 6.12 В32 Гаммаглутамилтрансфераза Е/л 8.40 - 42.00 39.80 36.30 8.79 В33 АСТ Е/л 10.60 - 53.00 31.80 34.71 9.16 В34 АЛТ Е/л 10.40 - 52.00 28.40 30.61 7.79 В35 Липаза Е/л 7.86 - 39.30 16.90 15.69 7.15 В36 Лактатдегидрогеназа Е/л 78.00 - 390.00 148.80 138.91 6.65 В37 Глутаматдегидрогеназа Е/л 4.98 - 24.90 8.42 8.98 6.65 В38 Альфа-гидроксибутират
дегидрогеназа Е/л 31.00 - 155.00 63.00 67.94 7.85

Таким образом, в проведенном исследовании мы впервые показали возможность одновременного определения 38 показателей в сыворотке крови с минимальной пробоподготовкой и погрешностью, не превышающей 10%, а многочисленные исследования, подтверждающие принцип, выявили потенциальное клиническое использование такого метода.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для количественного анализа сыворотки крови методом ИК-спектроскопии. Снимают ИК-спектр сыворотки крови в диапазоне 500-4000 см^-1. Определяют интенсивности полос поглощения 1717 и 3903 см^-1 и площади полос поглощения 616, 3750 и 3903 см^-1, по которым одновременно определяют концентрации 38 компонентов сыворотки крови, перечисленных в таблице 2 описания, для расчета которых применяют уравнение регрессии B_i – концентрация i-го компонента, i=1,…,38; C_i – коэффициенты для расчета, приведенные в таблице 1 описания; H20 и H49 – интенсивности полос поглощения 1717 и 3919 см^-1; S2, S42 и S49 – площади полос поглощения 617, 3750 и 3919 см^-1. Способ обеспечивает возможность одновременного определения концентрации основных компонентов сыворотки крови по характеристикам ИК-спектров с погрешностью не более 10% за счет количественного анализа сыворотки крови методом ИК-спектроскопии, в котором объединены несколько подходов: используют модельные растворы, что позволяет учесть сложный состав матрицы образца, проводят моделирование в широком диапазоне концентраций, который соответствует диапазону концентраций компонентов реальной сыворотки крови, а также применяют хемометрические методы для построения уравнения регрессии и расчета концентраций компонентов, что позволяет повысить точность. 3 ил., 2 табл.

Способ количественного анализа сыворотки крови методом ИК-спектроскопии, заключающийся в том, что снимают ИК-спектр сыворотки крови в диапазоне 500-4000 см^-1, отличающийся тем, что определяют интенсивности полос поглощения 1717 и 3903 см^-1 и площади полос поглощения 616, 3750 и 3903 см^-1, по которым одновременно определяют концентрации 38 компонентов сыворотки крови, перечисленных в таблице 2 описания, для расчета которых применяют уравнение регрессии

B_i – концентрация i-го компонента, i=1,…,38;

C_i – коэффициенты для расчета, приведенные в таблице 1 описания;

H20 и H49 – интенсивности полос поглощения 1717 и 3919 см^-1;

S2, S42 и S49 – площади полос поглощения 617, 3750 и 3919 см^-1.