УСТРОЙСТВО И СИСТЕМА ДЛЯ АНАЛИЗА ОБРАЗЦА, В ЧАСТНОСТИ КРОВИ, А ТАКЖЕ СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2023 года по МПК G01N33/543 G01N33/48 

Согласно настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительными заявками с порядковыми номерами 62/218455, поданной 14 сентября 2015 г., 62/293188, поданной 9 февраля 2016 г., 62/305123, поданной 8 марта 2016 г., 62/369181, поданной 31 июля 2016 г., заявкой по РСТ с порядковым номером PCT/US16/46437, поданной 10 августа 2016 г., при этом заявка по РСТ испрашивает приоритет в соответствии с предварительными заявками с порядковыми номерами 62/202989, поданной 10 августа 2015 г., 62/218455, поданной 14 сентября 2015 г., 62/293188, поданной 9 февраля 2016 г., 62/305123, поданной 8 марта 2016 г., и 62/369181, поданной 31 июля 2016 г., причем все заявки включены в данный документ во всей своей полноте для всех целей.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к области отбора образцов, обнаружения, проведения анализов при биохимических исследованиях и вариантам их применения.

Предшествующий уровень техники

При анализе образцов в биологии/химии, в частности крови существует потребность в способах и устройствах, с помощью которых можно ускорять процесс (например, связывание, смешивание реагентов и т.д.) и количественно измерять параметры (например, концентрацию аналитов, объем образца и т.д.), с помощью которых можно упрощать отбор образцов и процессы измерения, с помощью которых можно использовать образцы небольшого объема, с помощью которых обеспечивается выполнение всего анализа в течение менее минуты, с помощью которых обеспечивается выполнение анализа с помощью смартфона (например, мобильного телефона), которые позволяют лицу, не являющемуся профессионалом, выполнять анализ самостоятельно и которые позволяют передавать результаты теста локально, удаленно или по беспроводной связи различным заинтересованным сторонам. Настоящее изобретение относится к способам, устройствами и системам, которые могут удовлетворять этим потребностям.

Краткое описание изобретения

Следующее краткое описание не предусматривает включение всех характеристик и аспектов настоящего изобретения. Настоящее изобретение относится к способам, устройствами и системам, которые делают обнаружение в биологии/химии (в том числе без ограничения иммунологический анализ, анализ нуклеиновых кислот, анализ электролитов и т.д.) более быстрым, более чувствительным, обеспечивают меньшее число стадий, более легкое выполнение, меньшее количество требуемых образцов, способствуют меньшим или сниженным потребностям (или отсутствию таковых) в профессиональной помощи и/или более низкой стоимости по сравнению со многими современными способами и устройствами обнаружения.

Целью многих современных лабораторных тестов является точное определение абсолютной концентрации аналита в образце. Например, исследование эритроцитов (RBC) предусматривает подсчет количества эритроцитов в определенном количестве цельной крови с последующим расчетом количества эритроцитов на микролитр цельной крови. Однако такие измерения могут быть сложными для выполнения без применения специализированного диагностического центра (например, в условиях «на дому», «в аптеке» или «месте оказания медицинской помощи»), поскольку такие тесты часто требуют специализированного инструмента и/или точного измерительного устройства, которое способно точно измерять относительно небольшой объем (такой как пипетка для точного измерения или им подобные) биологической жидкости.

Измерение подходящего объема

С помощью многих анализов определяют абсолютную концентрацию аналита в образце. Однако результаты таких анализов становятся достаточно неточными, если анализируют лишь небольшой объем (в частности, например, от 100 нл до 10 мкл). Это происходит в связи с тем, что небольшие объемы сложно точно дозировать и/или измерять.

В некоторых анализах образец жидкости можно размещать между двумя пластинами, которые разделены разделителями, и анализировать. Теоретически объем аналита можно рассчитать в результате умножения площади образца, который анализируют, на толщину образца, который анализируют. Однако практически такие оценки нелегко выполнять и они являются достаточно неточными по ряду причин. В качестве примера, в некоторых устройствах применяются гранулы для разделения пластин, и либо гранулы, либо одна из пластин являются деформируемыми. Такие устройства могут быть предрасположены к неточности по следующим причинам.

- Сферические разделители имеют намного меньшую площадь контакта (почти точку) с пластинами. В таких устройствах в связи с намного меньшей площадью контакта в случае каждой единицы, к которой применяют силу сдавливания, применяется намного большее давление на площадь контакта как со стороны пластины, так и со стороны сфер. Такое большее давление приводит к тому, что сферы и/или пластины (в случае, если они являются гибкими) деформируются, что искажает любые измерения.

- Сферические разделители обычно заканчиваются, будучи равномерно распределенными между двумя пластинами. Поскольку сферические разделители распределены равномерно, расстояния между разделителями могут значительно варьировать и некоторые из расстояний являются достаточно большими. Это вызывает то, что разделители и/или пластины (если они гибкие) деформируются до значительно большей степени в некоторых областях по сравнению с другими, что также искажает результаты.

- Случайным образом расположенные разделители, которые находятся вблизи друг от друга, могут стать препятствиями, которые блокируют движение аналитов (например, клеток), потенциально приводя тем самым к образованию «скоплений» аналитов или клеток, которые могут вызвать еще больше сложностей.

- Значительная деформация одной из пластин может приводить к лизису клеток, что может вызывать ошибки в работе по подсчету клеток.

- Расчеты объемов являются неточными, поскольку число сферических разделителей в анализируемой области, а также степень, до которой разделители и/или одна из пластин деформируется, варьируют от образца к образцу.

- Деформация вызывает разницу во времени, которая требуется для того, чтобы молекулы диффундировали к поверхности одной из пластин.

В устройствах, в которых применяют сферические разделители, объем части образца, который анализировали, можно потенциально оценить с помощью а) подсчета сфер в объеме анализируемого образца и b) экспериментальной оценки толщины слоя образца (например, добавления внутреннего стандарта, такого как несмешивающаяся жидкость, которая содержит известную концентрацию калибрующего вещества, которую можно использовать для расчета расстояния между пластинами). Однако выполнять дополнительные стадии является неудобным, и поскольку верхняя пластина и/или разделители значительно деформируются при использовании, то показатели, получаемые от таких устройств, по-прежнему являются не очень точными.

В отличие от этого, варианты осуществления способа и устройства по настоящему изобретению основаны на разделителях, которые имеют в значительной степени однородную высоту, почти однородные поперечные (например, столбик с прямой боковой стенкой) и идеально плоские (например, «ровные») поверхности, которые закреплены на одной или более пластинах регулярным образом, при котором разделители отделены друг от друга непрерывным определенным расстоянием (например, не в случайных положениях, которые регулируются пуассоновской статистикой). Во время применения некоторых из вариантов осуществления способа и устройства по настоящему изобретению разделители и пластины не сжимаются и не деформируются в значительной степени ни в каком измерении, по меньшей мере пока пластины находятся в закрытом положении и сдвинуты вместе капиллярной силой. Устройство по настоящему изобретению может иметь многие преимущества, заключающиеся в том, что при применении устройства по настоящему изобретению объем части образца, из которого данные получают (например, «подходящий объем» или объем части образца в анализируемой области), можно легко очень точно рассчитать и в некоторых случаях можно даже рассчитать перед началом анализа, даже в том случае, если в устройстве размещают неизвестное количество образца. Поскольку в закрытом положении пластины являются в значительной степени ровными (что означает, что толщина образца является однородной) и число и измерения разделителей в анализируемой области известны, объем образца в участке можно легко рассчитать с высокой точностью. Подходящий объем образца можно определить без подсчета разделителей в области или оценки толщины слоя образца, после того, как анализ выполнен. Также существует потребность в размещении в устройство определенного количества образца. Кроме того, в начале инкубации необходимо, чтобы молекулы аналита равномерно распределились в подходящем объеме (до той степени, до которой возможно в соответствии с пуассоновской статистикой) для предотвращения большей концентрации в одной области по сравнению с другими.

Сниженное время реакции

Известно, что константа диффузии многих аналитов в водной среде является очень низкой, и в связи с этим для многих анализов требуется длительное время инкубации (часто несколько часов и в определенных случаях дней), перемешивание и применение средств или сил, которые способствуют смешиванию. Такие анализы разработаны с тем, чтобы обеспечить диффузию аналита в боковом направлении из начального местоположения до удаленного места на одной из пластин (см., в частности, например, Wei et al, Nucl. Acids Res. 33: e78, и Toegl et al, J. Biomol. Tech. 2003 14: 197-204). Такие системы ограничены, поскольку может потребоваться несколько часов для получения результата. Кроме того, при получении результата часто сложно утверждать с какой-либо определенностью, что реакция достигла равновесия во время, когда реакция была завершена. Такая неопределенность, наряду с другими факторами, делает невозможной оценку абсолютной концентрации аналита в образце.

Как будет объяснено более подробно ниже, в некоторых вариантах осуществления способа и устройства по настоящему изобретению высоту разделителя и конечную точку анализа можно выбрать таким образом, чтобы ограничить объем горизонтальной диффузии аналитов во время анализа. В этих случаях такой анализ (обычно анализ связывания) можно выполнять в течение очень короткого промежутка времени. Кроме того, концентрацию аналита в образце можно оценивать очень точно, даже несмотря на то, что не анализировали весь образец или он может быть неизвестного объема.

В этих вариантах осуществления анализ можно остановить и/или результаты анализов можно считывать в течение времени, которое i. равно или больше, чем время, которое требуется для того, чтобы целевой объект диффундировал в толще однородного по толщине слоя в закрытой конфигурации (т.е. меньше, чем время, которое потребовалось бы для того, чтобы аналит диффундировал вертикально от одной пластины к другой); и ii. меньше, чем время, которое требуется для того, чтобы целевой объект горизонтально диффундировал в линейном измерении предварительно определенной площади участка связывания (например, меньше, чем время, которое потребовалось бы для того, чтобы аналит горизонтально диффундировал от одной стороны участка связывания к другой). В таких конфигурациях «локального связывания» объем части образца, из которых данные получают («подходящий объем»), можно оценить достаточно точно, поскольку он представляет собой объем образца, который находится непосредственно над анализируемой областью. Действительно, объем части образца, из которого данные получают, может быть известен перед началом анализа. Такие варианты осуществления с «локальным связыванием» имеют дополнительное преимущество в том, что образец и необязательно любые реагенты для выявления вдавливают в тонкий слой на протяжении участка связывания и, таким образом, связывание между любыми аналитами и/или реагентами для выявления должно достичь равновесия быстрее, чем в вариантах осуществления, в которых образец не вдавливают в тонкий слой, например, если каплю образца просто размещают на поверхности пластины с участком связывания. Таким образом, во многих случаях равновесного связывания можно достичь за считанные секунды, а не минуты, и, таким образом, многие анализы, в частности, анализы связывания, можно выполнять очень быстро, например, менее чем за минуту.

Мультиплексирование

Кроме того, конфигурация «локального связывания» позволяет выполнять мультиплексные анализы без жидкостного отделения различных реакций друг от друга. Другими словами, несколько анализов можно выполнять в открытой среде, без необходимости разделения анализов друг от друга (т.е. без жидкостной изоляции). Например, в вариантах осуществления локального связывания два различных аналита в одном и том же образце можно анализировать совместно и, поскольку анализ необходимо остановить и/или результаты анализа считать перед диффузией одного аналита из одного анализа в другой, абсолютные концентрации этих аналитов в образце можно определять отдельно друг от друга, даже в случае, если они не отделены жидкостно друг от друга.

Возможность выполнения нескольких анализов в одном образце без жидкостной изоляции, только лишь с помощью размещения образца между двумя пластинами и выполнения анализа при ограничении диффузии, имеет несколько преимуществ. Например, анализы можно выполнять с помощью обычного капания капли образца (например, крови) неизвестного объема, распределения образца на пластинах в результате сдавливания пластин вместе, инкубирования образца в течение периода времени и снятия показателя из нескольких участков устройства. При практическом осуществлении данного способа отсутствует необходимость переносить определенные количества образца в несколько камер, что сложно осуществить без точного переноса жидкости и/или измерительного устройства. Более того, анализ является чрезвычайно быстрым по причинам, изложенным выше. Кроме того, поскольку отсутствует необходимость изготавливать пластины со «стенками», изготовление устройства является простым. В конечном итоге, отсутствует требование для портов в любой из пластин, т.е. портов, которые можно было бы потенциально использовать для добавления или удаления образца или реагента в то время, когда устройство находится в закрытом положении.

Поверхность усиления

Кроме того, в некоторых вариантах осуществления устройства и способа по настоящему изобретению устройство может содержать «поверхность усиления», см., например, поверхность, которая усиливает сигнал, например флуоресценцию или люминесценцию, которая образуется за счет средства для выявления. В некоторых случаях сигнал можно усилить в результате наноплазмонного эффекта (например, поверхностно усиленного рамановского рассеяния). Примеры усиления сигнала с помощью поверхности усиления описаны, например, в Li et al., Optics Express 201 1 19: 3925-3936 и WO 2012/024006, включенных в данный документ посредством ссылки. В некоторых случаях поверхность усиления может представлять собой дисковую антенну, сопряженную с точками на столбиках (D2PA), которое было описано в патенте США №9013690. При использовании устройство, содержащее поверхность усиления, может усиливать сигнал в 103 раз или более по сравнению с детектором, которой не имеет конфигурации для усиления сигнала, тем самым способствуя тому, чтобы аналиты были выявлены с чрезвычайно высокой чувствительностью. В некоторых вариантах осуществления количество аналита в подходящем объеме образца, в частности, неклеточных аналитов, которые выявляют с помощью «сэндвич»-анализа, можно подсчитать в цифровом измерении, например, с помощью способов, раскрытых в WO 2014144133. Применение поверхности усиления в некоторых случаях позволяет, чтобы анализ считывали с помощью смартфона или тому подобного. Другие характеристики

В вариантах осуществления устройства по настоящему изобретению разделители прикрепляют к одной или более пластинам, при этом они не способны изменить положение или их нельзя сместить, если пластину погружают в водную среду. Разделители не являются сферическими, и их не прикрепляют к поверхности пластины с помощью небольшой силы, такой как электростатическая сила, сила тяжести и т.п. В некоторых вариантах осуществления пластина, имеющая разделители, может представлять собой монолит. Во многих вариантах осуществления разделители не изготавливают предварительно и затем их закрепляют на пластине (например, приклеивают на нее или подобное этому). В отличие от этого, разделители можно выращивать и/или вытравливать с помощью процесса тиснения и/или микрообработки (например, фотолитографии).

Параметры разделителей (например, их поперечный разрез, пространство между ними и плотность и т.д.) можно оптимизировать таким образом, чтобы в закрытом положении верхняя пластина (которая может быть гибкой) значительно не деформировалась на протяжении части образца, который подлежит анализу («подходящий объем» образца). В некоторых случаях параметры разделителей можно регулировать в зависимости от гибкости верхней пластины. Например, если верхняя пластина является более гибкой, то разделители могут располагаться ближе друг к другу. Аналогично, если верхняя пластина является менее гибкой, то разделители могут располагаться дальше друг от друга.

Более того, при применении многих вариантов осуществления устройства по настоящему изобретению аналиты не мигрируют непосредственно в устройстве после того, как устройство закрыто. В связи с этим в закрытой конфигурации может отсутствовать как сортировка или фракционирование аналитов, так и направленный вынужденный поток аналитов в устройстве (например, в результате силы тяжести или электрофореза), как описано у Austin (US 6632652). Во многих случаях отсутствует необходимость в том, чтобы устройство было связано с источником энергии для образования электродвижущей силы. Во многих вариантах осуществления отсутствуют «препятствия», которые затрудняют прохождение аналита (клетки) во время распределения образца, приводящие к тому, что аналиты равномерно распределяются в подходящем объеме (до степени, возможной в соответствии с пуассоновской статистикой), для предотвращения большей концентрации в одной области по сравнению с другой. Кроме того, в других устройствах функция покровной пластины заключается в герметизации устройства в целях предупреждения утечки жидкости, и, таким образом, покровную пластину размещают сверху пластины-подложки в момент времени, когда образец отсутствует на какой-либо из пластин. Такие устройства не выталкивают жидкость на поверхность открытой пластины с образованием тонкого слоя образца, который можно анализировать. Кроме того, в других устройствах основной функцией столбиков является «фильтрация» или сортировка наночастиц (например, клеток или им подобного). Поэтому расстояние между столбиками определяется с помощью наночастиц, подлежащих сортировке, при этом не преследуется цель получения однородного пространства между покровной пластиной и пластиной-подложкой. В конечном итоге в устройствах, таких как устройство Austin, точность сортировки преимущественно контролируется пространством между столбиками, и контроль пространства между столбиками не считается значимым. Таким образом, такие раскрытия не привели бы к модификации однородности пространства между пластинами в результате размера, формы столбиков, расстояния между столбиками и т.д.

Исходя из вышеизложенного, считается, что устройство и способ по настоящему изобретению обеспечивают легкость в применении, недорогой, легкий в производстве и чрезвычайно быстрый способ определения абсолютной концентрации аналита (или аналитов, если устройство и способ применяются в мультиплексном виде) в образце жидкости.

Один аспект настоящего изобретения предусматривает средства, в которых применяют пару пластин, которые являются перемещаемыми относительно друг друга, с целью преобразования образца небольшого объема или одного или множества реагентов или обоих для более простого, более быстрого и/или лучшего анализа. Преобразование включает без ограничения изменение формы образца, выталкивание потока образца, создание контакта между образцом и реагентом, измерение объема образцов, снижение расстояния диффузии, повышение частоты столкновений и т.д., - все из них имеют предпочтительные эффекты для определенных анализов. В настоящем изобретении особые характеристики и свойства пластин, особые способы работы с пластинами и особые способы работы с реагентами и образцами обеспечивают преимущества в анализе.

Один аспект настоящего изобретения предусматривает средства, которые способствуют тому, что по меньшей мере часть небольшой капли образца жидкости, размещенная на пластину, превращается в тонкий слой с толщиной, которая является контролируемой, предварительно определенным и однородным на большой области. Однородная толщина может составлять менее 1 мкм. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает поддержание той же самой однородной толщины в течение длительного периода времени без испарения в среду.

Другой аспект настоящего изобретения предусматривает средства, в которых применяют предварительно определенную однородную тонкую толщину образца, полученную в результате настоящего изобретения, в целях определения объема части или всего образца без применения пипетки или тому подобного.

Другой аспект настоящего изобретения предусматривает вариант осуществления разделителей (для контроля пространства между двумя пластинами), который предусматривают форму столбика с ровной верхней поверхностью и почти однородным поперечным сечением в горизонтальной проекции. Такие разделители предусматривают много преимуществ в контроле толщины образца в разделителях сферической формы (гранулы).

Другой аспект настоящего изобретения предусматривает варианты осуществления разделителей (для контроля пространства между двумя пластинами), которые предусматривают форму столбика с ровной верхней поверхностью верхним и почти однородным поперечным сечением в горизонтальной проекции. Такие разделители предусматривают много преимуществ в контроле толщины образца в разделителях сферической формы (гранулы).

Другой аспект настоящего изобретения предусматривает средства, которые способствуют тому, что определенные химические реакции (или смешивание) происходят преимущественно лишь в небольшой части образца, а не в другой части образца, без жидкостной изоляции двух частей образца.

Другой аспект настоящего изобретения предусматривает средства, которые способствуют тому, что многочисленные химические реакции (или смешивание) происходят преимущественно лишь в каждой перспективной небольшой части образца, а не в другой части образца, без жидкостной изоляции между разными частями образца. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает мультиплексный параллельный анализ с использованием одной небольшой капли образца, без жидкостной изоляции различных участков реакций.

Другой аспект настоящего изобретения предусматривает средства, которые делают анализ (например, иммунологический анализ, анализ нуклеиновых кислот и т.д.) более быстрым. Например, время инкубации до насыщения (время связывания между молекулами для достижения равновесия) уменьшается от нескольких часов до менее 60 секунд.

Другой аспект настоящего изобретения предусматривает средства, которые значительно повышают чувствительность выявления с помощью одного или комбинации из нескольких способов, которые предусматривают поверхность усиления, крупные или яркие метки и т.д.

Другой аспект настоящего изобретения предусматривает средства, которые обеспечивают анализ с применением очень небольшого количества образца, например, в пределах 0,5 мкл (микролитра) или меньше.

Другой аспект настоящего изобретения предусматривает средства, которые упрощают анализ в результате обеспечения размещения небольшого количества биологической жидкости непосредственно от субъекта к области тестирования или области образца.

Другой аспект настоящего изобретения предусматривает средства, которые упрощают и ускоряют анализ в результате предварительного покрытия реагентов на пластинах. Например, средство для захвата и средство для выявления предварительно наносят и высушивают на пластинах. Другой пример предусматривает то, что все необходимые реагенты для обнаружения предварительно размещают на пластины и обнаружение выполняют путем размещения образца на предварительно покрытые пластины, при этом необходимость размещения других реагентов отсутствует.

Другой аспект настоящего изобретения предусматривает средства, которые позволяют считывать результаты выполняемого анализа с помощью мобильного телефона.

Другой аспект настоящего изобретения предусматривает средства, которые позволяют индивидууму исследовать его/ее собственные биомаркеры самостоятельно в течение 60 секунд с помощью непосредственного размещения капли своей собственной биологической жидкости (например, слюны) между парой пластмассовых изделий и снятия изображения с помощью мобильного телефона.

Устройство для анализа аналита в образце может иметь на одной или обеих пластинах сухой участок связывания, имеющий заданную площадь, при этом сухой участок связывания связывает и иммобилизирует аналит в образце.

Устройство может иметь на одной или обеих пластинах один или множество сухих участков связывания и/или один или множество участков реагента.

Средняя толщина слоя равномерной толщины может составлять от 1,8 до 2,6 мкм и образец представляет собой цельную кровь без разведения другой жидкостью.

Устройство может содержать сухой реагент, нанесенный на одну или обе пластины и реагент может содержит антикоагулянт.

Разделители имеют форму столбиков и по существу плоскую верхнюю поверхность, при этом для каждого разделителя отношение горизонтального размера разделителя к его высоте составляет по меньшей мере 1.

Для каждого разделителя отношение горизонтального размера разделителя к его высоте составляет по меньшей мере 1.

Разделители имеют форму столбика с по существу плоской верхней поверхностью, заданной по существу одинаковой высотой и заданным постоянным расстоянием между разделителями, которое по меньшей мере в 2 раза больше размера аналита, при этом произведение модуля Юнга разделителей и фактора заполнения разделителями равно или больше 2 МПа, при этом фактор заполнения представляет собой отношение площади контакта разделителей к общей площади пластины, и для каждого разделителя отношение горизонтального размера разделителя к его высоте равно по меньшей мере 1, причем четвертая степень расстояния между разделителями (ISD), деленная на толщину (h) и модуль Юнга (Е) гибкой пластины (ISD⁴/(hE)) составляет 5×10⁵ мкм³/ГПа или менее.

Разделители имеют плотность по меньшей мере 100/мм².

По существу равномерная толщина слоя образца имеет вариацию менее 30%.

Слой образца равномерной толщины является равномерным на горизонтальной площади, которая составляет по меньшей мере 1 мм².

При закрытой конфигурации устройство с конечной толщиной образца выполнено с возможностью проведения анализа образца за 10 секунд или менее.

Детектор может представлять собой оптический детектор, обнаруживающий оптический сигнал.

Разделители имеют форму столбиков, а отношение ширины к высоте столбиков больше или равно единице.

Детектор может представлять собой электрический детектор, который выявляет электрический сигнал.

Разделители могут быть зафиксированы на пластине путем прямого тиснения пластины или литьевого формования пластины.

По меньшей мере одна из камер для обнаружения и/или визуализации образца может считывать сигнал от устройства для сжатого регулируемого открытого потока (CROF).

Проведение анализа включает в себя проведение дифференциального анализа лейкоцитов.

Устройство мобильной связи может получать назначение, диагноз или рекомендацию от медицинского специалиста, находящегося в удаленном местоположении.

Устройство может содержать по меньшей мере пару масштабных меток, разнесенных на известное расстояние, в плоскости параллельной горизонтальной площади.

Расстояние между разделителями может быть приблизительно равно средней толщине эритроцитов (RBC).

Образцом может быть образец крови и этап анализа включает визуализацию клеток в крови.

Образцом может быть образец крови и анализ образца крови включает измерение гемоцитов, включающее в себя определение толщины образца с применением разделителя, определение горизонтальной площади путем визуализации и вычисление площади эритроцитов с помощью двумерного изображения.

Образец может представлять собой кровь, аналитами могут быть клетки крови, а равномерная толщина слоя может составлять от 1,9 до 2,2 мкм.

Разделители имеют форму столбиков и по существу одинаковое сечение.

Разделители имеют форму столбиков, по существу плоскую верхнюю поверхность, заданную по существу одинаковую высоту и заданное постоянное расстояние между разделителями, которое по меньшей мере в два раза больше размера аналита, при этом произведение модуля Юнга разделителей и фактора заполнения разделителей равно или больше 2 МПа, при этом фактор заполнения представляет собой отношение площади контакта разделителей к общей площади пластины, при этом для каждого разделителя отношение горизонтального размера разделителя к его высоте равно по меньшей мере 1.

Разделители имеют форму столбиков, по существу плоскую верхнюю поверхность, заданную по существу одинаковую высоту и заданное постоянное расстояние между разделителями, которое по меньшей мере приблизительно в 2 раза больше размера аналита, причем произведение модуля Юнга разделителей и фактора заполнения разделителей равно или больше 2 МПа, при этом фактор заполнения представляет собой отношение площади контакта разделителей к общей площади пластины, при этом для каждого разделителя отношение горизонтального размера разделителя к его высоте равно по меньшей мере 1, при этом образец представляет собой кровь; аналит представляет собой эритроцит, лейкоцит или тромбоциты; и равномерная толщина слоя находится в диапазоне от 1,8 до 2,6 мкм.

Этап анализа может представлять собой выявление белков, пептидов, нуклеиновых кислот, искусственных соединений и неорганических соединений.

Образцы могут являться образцами, которые используются для анализа сахара крови, уровня кислорода, общего состава крови (эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов).

Краткое описание графических материалов

Специалисту в данной области будет понятно, что графические материалы, описанные ниже, представлены лишь для иллюстративных целей. Данные графические материалы никоим образом не предназначены для ограничения объема идей настоящего изобретения. Графические материалы могут быть предоставлены не в масштабе. На фигурах, которые представляют экспериментальные точки, линии, которые соединяют экспериментальные точки, предусмотрены лишь в целях управления изображением данных и не имеют других значений.

На фиг. 1 представлена иллюстрация варианта осуществления CROF (сжатого регулируемого открытого потока). На панели (а) представлены первая пластина и вторая пластина, причем первая пластина имеет разделители. На панели (b) представлено размещение образца на первой пластине (показано) или второй пластине (не показано) или обеих (не показано) в открытой конфигурации. На панели (с) представлено (i) применение двух пластин для распределения образца (поток образца между пластинами) и снижения толщины образца и (ii) применение разделителей и пластины в целях регуляции толщины образца в закрытой конфигурации. Внутренняя поверхность каждой пластины может иметь один или множество участков связывания и участков хранения (не показано).

На фиг. 2 представлены пластины с участком связывания или участком хранения. На панели (а) представлена пластина, имеющая участок связывания. На панели (b) представлена пластина, имеющая участок хранения реагента. На панели (с) представлена первая пластина, имеющая участок связывания, и вторая пластина, имеющая участок хранения реагента. На панели (d) представлена пластина, имеющая несколько участков (участки связывания и/или участок хранения).

На фиг. 3 представлена технологическая карта и схема способа снижения времени инкубации в анализе за счет снижения толщины образца. На панели (а) представлена первая пластина, которая имеет по меньшей мере один участок связывания на поверхности субстрата. На панели (b) представлена вторая пластина (которая может иметь отличный от первой пластины размер). На панели (с) представлено размещение образца (содержащего целевой объект связывания) на поверхности субстрата (показано) или покровной пластине (не показано) или обеих (не показано). На панели (d) представлено движение первой и второй пластин таким образом, что они обращены друг к другу, и снижение толщины образца в результате уменьшения внутреннего пространства между пластинами. Образец со сниженной толщиной инкубируют. Сниженная толщина образца ускоряет время инкубации. Некоторые варианты осуществления способа предусматривают разделители для регулирования пространства, которые (разделители) не показаны на иллюстрации.

На фиг. 4 показано снижение времени связывания или смешивания путем уменьшения толщины образца с применением двух пластин, разделителей и сжатия (показано на поперечном сечении). На панели (а) представлено снижение времени связывания объектов в образце с участком связывания на твердой поверхности (Х-(объем к поверхности)). На панели (b) проиллюстрировано снижение времени при связывании объектов (например, реагента), хранящихся на поверхности пластины, с участком связывания на поверхности другой пластины (Х-(из поверхности на поверхность)). На панели (с) проиллюстрировано снижение времени при добавлении реагентов, хранящихся на поверхности, в образец, который помещен посередине между пластиной и другой пластиной (Х-(из поверхности в объем)).

На фиг. 5 показано как избежать или снизить локальный изгиб гибкой пластины. На панели (а) представлено, что если расстояние между разделителями является слишком большим для гибкой пластины (второй пластины, например, пластмассовой пленки) при определенном наборе образца и условиях сжатия, то пластина имеет в закрытой конфигурации локальный прогиб (например, изгиб внутрь) между двумя соседними разделителями при условии, что первая пластина является жесткой. Образец между пластинами не изображен. На панели (b) представлено, что локальный изгиб (прогиб) в гибкой пластине в панели (а) снижен или практически исключен с помощью соответствующего расстояния между разделителями и соответствующей силы сжатия. Образец между пластинами не изображен.

На фиг. 6 представлено ослабляющее влияние крупных пылевидных частиц на регуляцию пространства между пластинами (толщину образца). На панели (а) представлено, что при использовании двух жестких пластин пылевидная частица с толщиной больше высоты разделителя может нарушать регуляцию предполагаемого пространства между пластинами, осуществляемую разделителями (то есть нарушать регуляцию предполагаемой толщины образца). Образец между пластинами не изображен. На панели (b) представлено применение соответствующей гибкой пластины и соответствующего расстояния между пластинами, при этом влияние пыли ограничено небольшой областью, окружающей частицу пыли, в то время как в других участках пространство между пластинами (то есть толщина образца) регулируется разделителями, а не пылью. На данной иллюстрации показано, что первая пластина является жесткой, вторая пластина является гибкой, а разделители изначально закреплены на первой пластине. На панели (с) представлена иллюстрация, где показано применение соответствующей гибкой пластины и соответствующего расстояния между пластинами, при этом влияние пыли ограничено небольшой областью, окружающей частицу пыли, в то время как в других участках пространство между пластинами (то есть толщина образца) регулируется разделителями, а не пылью. На данной иллюстрации показано, что первая пластина является жесткой, вторая пластина является гибкой, а разделители изначально прикреплены на вторую пластину.

На фиг. 7 представлены ослабляющие влияние вариации ровности поверхности пластины в результате соответствующего упорядочения расстояния между разделителями и гибкой(гибкими) пластиной(пластинами). На панели (а) показано, что вариация ровности поверхности может быть значимо большой по сравнению с желательной толщиной образца, приводя к ошибкам в определении толщины образца. В данной иллюстрации лишь одна пластина имеет большую вариацию ровности (практически обе пластины могут иметь большую вариацию ровности). Образец между пластинами не изображен. На панели (b) представлено, что расстояние вариации ровности поверхности пластины, λ, представляет собой расстояние от локального максимума до соседнего локального минимума высоты поверхности. На панели (с) представлено, как можно достичь небольшой вариации ровности поверхности за счет изготовления одной или обеих пластин гибкими и в результате применения соответствующего расстояния между разделителями и соответствующей силы сжатия для коррекции, в закрытой конфигурации, исходной вариации ровности поверхности пластины в случае открытой конфигурации. Образец между пластинами не изображен. На панели (d) представлено получение вариации толщины образца, меньшей чем исходная вариация ровности поверхности пластины, с помощью второй гибкой пластины и соответствующего расстояния между разделителями. Гибкая пластина повторяет контур жесткой пластины. Образец между пластинами не изображен.

На фиг. 8 представлены пластины и разделители ограждающего типа (лунки) для регуляции толщины образца. На панели (а) представлены первая пластина и вторая пластина, причем первая пластина имеет разделитель ограждающего типа (лунка). На панели (b) представлено размещение образца на первой пластине (показано) или второй пластине (не показано) или обеих (не показано) в открытой конфигурации. На панели (с) представлено (i) применение двух пластин для распределения образца (поток образца между пластинами) и снижения толщины образца и (ii) применение разделителей и пластины в целях регуляции толщины образца в закрытой конфигурации.

На фиг. 9 представлен другой вариант осуществления, в котором применяют разделители ограждающего типа (лунки) для регуляции толщины образца. На панели (а) представлена первая пластина и вторая пластина, причем первая пластина имеет разделитель ограждающего типа (лунку) и по меньшей мере один разделитель внутри лунки. На панели (b) представлено размещение образца на первой пластине (показано) или второй пластине (не показано) или обеих (не показано) в открытой конфигурации. На панели (с) представлено (i) применение двух пластин для распределения образца (поток образца между пластинами) и снижения толщины образца и (ii) применение разделителей и пластины в целях регуляции толщины образца в закрытой конфигурации. На панели (d) представлен другой вариант осуществления первой и второй пластин, причем первая пластина не имеет разделителя внутри лунки.

На фиг. 10 схематически проиллюстрирован иллюстративный вариант осуществления настоящего изобретения, представляющий собой мультиплексное выявление в одном устройстве для CROF с использованием одного участка связывания на одной пластине и множества участков хранения на другой пластине. Панели (а) и (b) представляют собой изображение иллюстративного устройства в перспективе и его поперечное сечение соответственно.

На фиг. 11 схематически представлен дополнительный иллюстративный вариант осуществления настоящего изобретения, представляющий собой мультиплексное выявление в одном устройстве для CROF с использованием одного участка хранения на одной пластине и нескольких участков связывания на другой пластине. Панели (а) и (b) представляют собой изображение иллюстративного устройства в перспективе и его поперечное сечение соответственно.

На фиг. 12 схематически представлен дополнительный иллюстративный вариант осуществления настоящего изобретения, представляющий собой мультиплексное выявление в одном устройстве для CROF с несколькими участками связывания на одной пластине и несколькими соответствующими участками хранения на другой пластине. Панели (а) и (b) представляют собой изображение иллюстративного устройства в перспективе и его поперечное сечение соответственно.

На фиг. 13А схематически представлен анализ QMAX, в котором применяется CROF с массивом разделителей с высотой разделителя 30 мкм для осуществления анализа с временем инкубации до насыщения, равным менее 30 секунд.

На фиг. 13В представлено измерение сигнала захваченной метки по отношению к времени инкубации, показывая, что время инкубации до насыщения составляет менее 30 сек для анализа QMAX, описанного на фиг. 13а.

На фиг. 14 представлено экспериментально измеренное значение LoD (предел обнаружения) для анализа QAX & QMAX с промежутком 30 мкм (для устройства CROF) с отмывкой (гетерогенный анализ) и без отмывки (гомогенный анализ).

На фиг. 15 представлен верхний вид и вид в поперечном сечении (i) раскапывания образца небольшого объема на стеклянный субстрат, (ii) расширенной области образца в закрытой конфигурации CROF.

На фиг. 16 представлено обозначение некоторых из терминов, используемых в данном документе.

Фиг. 17. Разделители на пластине. Вид сверху на фотографию: (а) размер разделителей-столбиков 46 мкм × 46 мкм и расстояние между столбиками 54 мкм и (b) размер разделителей-столбиков 10 мкм × 70 мкм и расстояние между столбиками 10 мкм; и вид в перспективе, полученный с помощью SEM: (с) размер разделителей-столбиков 30 мкм × 40 мкм и высота разделителей 2 мкм и (d) размер разделителей-столбиков 30 мкм × 40 мкм и высота разделителей 30 мкм.

На фиг. 18 показаны влияние IDS и толщины пластины и материалов на толщину образца. Отклонение измеряемой толщины образца и однородность в зависимости от расстояния между разделителями (IDS) для различных пластин и материалов, различной толщины пластин и различных образцов. Субстраты устройств CROF представляют собой необработанные идеально плоские РММА толщиной 250 мкм (размером 25,4 мм × 25,4 мм). Х-пластина содержит массив периодических разделителей-столбиков с высотой столбиков 5 мкм прямоугольной формы (горизонтальным размером столбиков 10×10 мкм, почти однородным поперечным сечением и закругленными углами), и расстоянием между разделителями 20 мкм, 50 мкм, 100 мкм, 200 мкм, 500 мкм, изготовленных из РММА или PS размером 25,4 мм × 25,4 мм. Образец представлял собой 2 мкл крови (накапанной в результате прямого контакта с пальцем), слюны или PBS (накапанного пипеткой), и устройства CROF сдавливали рукой путем сдавливания рукой и пробкой на участке размером 1 дюйм на 1 дюйм, и они самоудерживались после нажатия. На фигуре метка - предназначена для РММА толщиной 175 мкм при использовании образца крови, метка предназначена для РММА толщиной 175 мкм при использовании образца слюны, метка предназначена для PS толщиной 125 мкм при использовании образца PBS, метка предназначена для РММА толщиной 50 мкм при использовании образца крови, метка предназначена для PS толщиной 25 мкм при использовании образца крови.

Фиг. 19. Отклонение измеряемой толщины образца и однородность в зависимости от значения ISD⁴/(h^xE) (х=1 на графике) для Х-пластин. ISD представляет собой пространство между разделителями, h представляет собой высоту (толщину) материала, Е представляет собой модуль Юнга материала, х представляет собой подгоняемый параметр с типичным диапазоном от 1 до 3. В исследовании субстраты устройств CROF представляют собой необработанные РММА толщиной 250 мкм (размером 25,4 мм × 25,4 мм), Х-пластины представляют собой необработанные РММА толщиной 175 мкм, необработанные PS толщиной 125 мкм, необработанные РММА толщиной 50 мкм и необработанные PS толщиной 25 мкм (размером 25,4 мм × 25,4 мм), содержащие массив периодических разделителей-столбиков с высотой столбиков 5 мкм прямоугольной формы (горизонтальным размером столбиков 10×10 мкм, почти однородным поперечным сечением и закругленными углами) и расстоянием между разделителями 20 мкм, 50 мкм, 100 мкм, 200 мкм, 500 мкм, образец представлял собой 2 мкл крови (накапанной в результате прямого контакта с пальцем), слюны или PBS (накапанных пипеткой), и устройства для CROF сдавливали рукой путем сдавливания рукой и пробкой на участке размером 1 дюйм на 1 дюйм, и они самоудерживались после сдавливания. При расчете ISD⁴/h^x=1/E модуль Юнга представляет собой 2,5 ГПа в случае РММА и 3,3 ГПа в случае PS. Если значение ISD⁴/(hE) больше чем 10⁶ мкм³/ГПа, то характеристика устройства для CROF ухудшается. На фигуре метка предназначена для РММА толщиной 175 мкм при использовании образца крови, метка предназначена для РММА толщиной 175 мкм при использовании образца слюны, метка предназначена для PS толщиной 125 мкм при использовании образца PBS, метка предназначена для РММА толщиной 50 мкм при использовании образца крови, метка предназначена для PS толщиной 25 мкм при использовании образца крови.

Фиг. 20. Отклонение измеряемой толщины образца и однородность в зависимости от расстояния между разделителями для различного размера разделителей-столбиков и высоты Х-пластин. Пластины-подложки устройств CROF представляют собой необработанное стекло толщиной 1 мм (размером 25,4 мм × 25,4 мм), Х-пластины представляют собой необработанные PS толщиной 125 мкм (размером 25,4 мм × 25,4 мм), содержащие массив периодических разделителей-столбиков с высотой разделителей 5 мкм прямоугольной формы с горизонтальным размером столбиков 10×10 мкм (почти однородным поперечным разрезом и закругленными углами) с расстоянием между разделителями 20 мкм, 50 мкм, 100 мкм, 200 мкм, 500 мкм (метка ); горизонтальным размером столбиков 40×40 мкм с расстоянием между разделителями 60 мкм, 150 мкм и 200 мкм (метка ); массив периодических разделителей-столбиков с высотой разделителей 12 мкм прямоугольной формы с горизонтальным размером столбиков 40×40 мкм с расстоянием между разделителями 150 мкм и 200 мкм (метка ); массив периодических разделителей-столбиков с высотой разделителей 22 мкм прямоугольной формы с горизонтальным размером столбиков 40×40 мкм с расстоянием между разделителями 150 мкм и 200 мкм (метка ); образец представлял собой 2 мкл крови в случае CROF толщиной 5 мкм, 5 мкл - в случае CROF толщиной 12 мкм и 9 мкл PBS в случае CROF толщиной 22 мкм (накапанного пипеткой), и устройства CROF сдавливали рукой путем сдавливания рукой и пробкой на участке размером 1 дюйм на 1 дюйм, и они самоудерживались после нажатия. (Линии на фигурах предназначены для зрительной ориентации).

Фиг. 21. Отклонение измеряемой толщины образца и однородность в зависимости от различного соотношения ширины столбиков и высоты столбиков, при этом ISD для всех образцов остается менее 150 мкм. Субстраты устройств CROF представляют собой необработанное стекло толщиной 1 мм (размером 25,4 мм × 25,4 мм). Устройства CROF сдавливали рукой путем сдавливания рукой и пробкой на участке размером 1 дюйм на 1 дюйм, и они самоудерживались после нажатия. Образец на вышеуказанных фигурах с меткой приведен далее.

A. Х-пластина, изготовленная из PS толщиной 125 мкм (с меткой ), слева направо: 1: размер столбиков Х-пластины 10×10 мкм, высота 22 мкм, ISD 100 мкм, 9 мкл буфера PBS, соотношение (ширина/высота) = 0,45; 2: размер столбиков Х-пластины 10×10 мкм, высота 12 мкм, ISD 100 мкм, 5 мкл буфера PBS, соотношение (ширина/высота) = 0,83; 3: размер столбиков Х-пластины 40×40 мкм, высота 22 мкм, ISD 150 мкм, 9 мкл буфера PBS, соотношение (ширина/высота) = 1,81; 4: размер столбиков Х-пластины 40×40 мкм, высота 5 мкм, ISD 100 мкм, 2 мкл буфера PBS, соотношение (ширина/высота) = 2; 5: размер столбиков Х-пластины 40×40 мкм, высота 12 мкм, ISD 150 мкм, 5 мкл буфера PBS, соотношение (ширина/высота) = 3,33; 6: размер столбиков Х-пластины 40×40 мкм, высота 5 мкм, ISD 150 мкм, 2 мкл буфера PBS, соотношение (ширина/высота) = 8; 7: размер столбиков Х-пластины 70×70 мкм, высота 5 мкм, ISD 150 мкм, 2 мкл буфера PBS, соотношение (ширина/высота) = 14.

B. Х-пластина, изготовленная из РММА, толщиной 175 мкм (с меткой ), слева направо: 1: размер столбиков Х-пластины 10×10 мкм, высота 22 мкм, ISD 100 мкм, 5 мкл крови, соотношение (ширина/высота) = 0,45; 2: размер столбиков Х-пластины 10×10 мкм, высота 5 мкм, ISD 50 мкм, 2 мкл крови, соотношение (ширина/высота) = 2; 3: размер столбиков Х-пластины 30×30 мкм, высота 30 мкм, ISD 80 мкм, 12 мкл крови, соотношение (ширина/высота) = 1; 4: размер столбиков Х-пластины 30×30 мкм, высота 10 мкм, ISD 80 мкм, 1 мкл крови, соотношение (ширина/высота) = 3; 5: размер столбиков Х-пластины 30 × 30 мкм, высота 2 мкм, ISD 80 мкм, 1 мкл крови, соотношение (ширина/высота) = 15.

С. Х-пластина, изготовленная из РММА толщиной 50 мкм (с меткой ), слева направо: 1: размер столбиков Х-пластины 10 × 10 мкм, высота 5 мкм, ISD 50 мкм, 2 мкл крови, соотношение (ширина/высота) = 2.

Х-пластина, изготовленная из PS толщиной 25 мкм (с меткой ), слева направо: 1: размер столбиков Х-пластины 10 × 10 мкм, высота 5 мкм, ISD 50 мкм, 2 мкл крови, соотношение (ширина/высота) = 2.

Фиг. 22. Отклонение измеряемой толщины образца и однородность в зависимости от расстояния между разделителями и размера столбиков/высоты Х-пластин, при этом субстраты устройств для CROF представляют собой необработанное стекло толщиной 1 мм (размером 25,4 мм × 25,4 мм), Х-пластины представляют собой необработанные PS толщиной 125 мкм (размером 25,4 мм × 25,4 мм), содержащие массив периодических разделителей-столбиков с высотой разделителей 5 мкм прямоугольной формы с горизонтальным размером столбиков 10 × 10 мкм (почти однородным поперечным сечением и закругленными углами) с расстоянием между разделителями 20 мкм, 50 мкм, 100 мкм, 200 мкм, 500 мкм (метка ), боковым размером столбиков 40 × 40 мкм с расстоянием между разделителями 60 мкм, 150 мкм и 200 мкм (метка ); массив периодических разделителей-столбиков с высотой разделителей 12 мкм прямоугольной формы с горизонтальным размером столбиков 40 × 40 мкм с расстоянием между разделителями 60 мкм, 150 мкм и 200 мкм (метка ); массив периодических разделителей-столбиков с высотой разделителей 22 мкм прямоугольной формы с горизонтальным размером столбиков 40 × 40 мкм с расстоянием между разделителями 150 мкм и 200 мкм (метка ); образец представлял собой 2 мкл крови в случае CROF толщиной 5 мкм, 5 мкл в случае CROF толщиной 12 мкм и 9 мкл PBS в случае CROF толщиной 22 мкм (накапанного пипеткой), и устройства для CROF сдавливали рукой путем сдавливания рукой и пробкой на участке размером 1 дюйм на 1 дюйм, и они самоудерживались после сдавливания. (Линии на фигурах предназначены для зрительной ориентации).

Фиг. 23. Отклонение измеряемой толщины образца и однородность в зависимости от различной толщины Х-пластины (от 25 мкм до 525 мкм), но при фиксированном размере столбиков (30 × 38 мкм), высоте столбиков (2 мкм) и пространств между столбиками (80 × 82 мкм), изготовленной из необработанного РММА, где субстрат представляет собой необработанное стекло толщиной 1 мм (размером 25,4 мм × 25,4 мм), образец представляет собой 1 мкл крови, накапанной в результате прямого контакта с пальцем, и устройства для CROF сдавливали рукой путем сдавливания рукой и пробкой на участке размером 1 дюйм на 1 дюйм, и они самоудерживались после сдавливания.

На фиг. 24 показано отклонение измеряемого размера пространств/однородность устройства для CROF (различные комбинированные пары гидрофильно-гидрофильные с меткой гидрофобно-гидрофобные с меткой ) с объемом крови от 0,1 мкл до 0,5 мкл, но одинаковым размером столбиков Х-пластин (30 × 38 мкм), высотой столбиков (2 мкм) и расстояниями между разделителями (80 × 82 мкм), где субстрат представляет собой стекло толщиной 1 мм (размером 25,4 мм × 25,4 мм) и Х-пластина изготовлена из РММА толщиной 175 мкм (размером 25,4 мм × 25,4 мм). Кровь накапывали в результате прямого контакта с пальцем, и устройства CROF сдавливали рукой путем сдавливания рукой и пробкой в области размером 1 дюйм на 1 дюйм.

Фиг. 25. Отклонение измеряемой толщины образца и однородность в зависимости от субстратов необработанного стекла толщиной 1 мм с меткой или необработанного РММА толщиной 250 мкм с меткой(размером 25,4 мм × 25,4 мм), где Х-пластина представляет собой необработанный РММА толщиной 175 мкм (размером 25,4 мм × 25,4 мм), содержащий массив периодических разделителей-столбиков с высотой столбиков 5 мкм прямоугольной формы (горизонтальным размером столбиков 10 × 10 мкм, почти однородным поперечным разрезом и закругленными углами), и расстоянием между разделителями 50 мкм, 100 мкм, 200 мкм и 500 мкм, образец представлял собой 2 мкл крови, накапанной в результате прямого контакта с пальцем, и устройства для CROF сдавливали рукой путем сдавливания рукой и пробкой на участке размером 1 дюйм на 1 дюйм, и они самоудерживались после сдавливания.

Фиг. 26. Отклонение измеряемой толщины образца и однородность в зависимости от исследований при различном времени сдавливания рукой от 0 секунд до 60 секунд, где субстрат устройств для CROF представляет собой необработанный РММА толщиной 250 мкм (размером 25,4 мм × 25,4 мм), Х-пластина представляет собой необработанный РММА толщиной 175 мкм (размером 25,4 мм × 25,4 мм), содержащий массив периодических разделителей-столбиков с высотой разделителей 2 мкм прямоугольной формы (горизонтальным размером столбиков 30 × 38 мкм, почти однородным поперечным сечением и закругленными углами) и расстоянием между разделителями 80 мкм, образец представляет собой 1 мкл крови, размещенной в результате прямого контакта, и устройства CROF сдавливали рукой путем сдавливания рукой и пробкой на участке размером 1 дюйм на 1 дюйм, и они самоудерживались после сдавливания.

Фиг. 27. Отклонение измеряемой толщины образца и однородность в зависимости от среднего IDS в случае применения случайного сферического разделителя или регулярного разделителя-столбика (Х-пластина), где субстрат устройств для CROF представляет собой необработанное стекло толщиной 1 мм (размером 25,4 мм × 25,4 мм), Х-пластина представляет собой необработанный РММА толщиной 175 мкм (размером 25,4 мм × 25,4 мм), содержащий массив периодических разделителей-столбиков с высотой разделителей 5 мкм прямоугольной формы (горизонтальным размером столбиков 10 × 10 мкм, почти однородным поперечным сечением и закругленными углами), и расстоянием между разделителями 20 мкм, 50 мкм и 100 мкм, образец представлял собой 2 мкл PBS, и устройства CROF сдавливали рукой путем сдавливания рукой и пробкой на участке размером 1 дюйм на 1 дюйм, и они самоудерживались после сдавливания. Сфера представляет собой микросферы из натровой извести со средним диаметром 4 мкм (вариация размера 5%) в PBS. Микросферы распределены в PBS с концентрациями 4 × 105/мкл, 0,9 × 105/мкл и 0,2 × 105/мкл, что соответствует среднему расстоянию между разделителями после сдавливания, соответствующему 20 мкм, 50 мкм и 100 мкм. Применяют два вида покровных пластин, необработанное стекло толщиной 220 мкм (размером 25,4 мм × 25,4 мм) и необработанный РММА размером 175 мкм (размером 25,4 мм × 25,4 мм). Все устройства CROF прижимали с помощью сдавливания рукой и пробкой на участке размером 1 дюйм на 1 дюйм, и они самоудерживались после нажатия. Метка предусмотрена в случае применения Х-пластины, метка предусмотрена в случае применения гранул в качестве разделителя, и стеклянное покрытие толщиной 220 мкм в качестве покровной пластины, метка предусмотрена в случае применения гранул в качестве разделителя, и пленка РММА толщиной 175 мкм в качестве покровной пластины.

Фиг. 28. Отклонение измеряемой толщины образца и однородность в зависимости от толщины Х-пластины (от 25 мкм до 350 мкм) и толщины субстрата (от 25 мкм до 750 мкм). Х-пластины имеют фиксированный размер столбиков (30 × 38 мкм), высоту столбиков (10 мкм) и пространства между разделителями (80 × 82 мкм), изготовленными из необработанного РММА толщиной 25 мкм, 175 мкм и 350 мкм, где субстрат изготовлен из необработанного РММА (размером 25,4 мм × 25,4 мм) толщиной 25 мкм, 50 мкм, 175 мкм, 250 мкм и 750 мкм. Образец представлял собой 4 мкл крови, накапанной в результате прямого контакта с пальцем, и устройства CROF сдавливали рукой путем сдавливания рукой и пробкой на участке размером 1 дюйм на 1 дюйм, и они самоудерживались после нажатия. На фигуре метка предусмотрена в случае применения Х-пластины толщиной 25 мкм, метка предусмотрена в случае применения Х-пластины толщиной 175 мкм, метка предусмотрена в случае применения Х-пластины толщиной 350 мкм.

На фиг. 29 показана (а) микрофотография (40х) клеток крови в Х-устройствах с пространством между пластинами (т.е. толщиной образца), составляющим 1 мкм, 2 мкм, 3 мкм и 5 мкм. Х-устройство с пространством 1 мкм лизирует большинство (99%) RBC, причем тромбоциты остаются нелизированными. Х-устройство с пространством 2 мкм отделяет каждую лунку с RBC и делает из RBC один слой. Некоторые уложенные RBC наблюдаются в Х-устройстве с пространством 3 мкм, и намного больше уложенных RBC - в Х-устройстве с расстоянием 5 мкм. Для подсчета предпочтительным является одноклеточный слой (Х-устройство с пространством 2 мкм). И (b) соотношение области эритроцитов (измеренной на основе 2D-изображения вида сверху) и общей площади в горизонтальной проекции пластины для CROF. Максимальное значение при пространстве между пластинами 2 мкм (т.е. толщине образца), поскольку ниже 2 мкм некоторые RBC лизируются, а выше 2 мкм RBC перекрываются и вращаются, при этом все из них дают меньшую площадь RBC на 2D-изображении.

Фиг. 30. Схема BCI (подсчет клеток крови с помощью CROF и визуализации) с помощью смартфона (а) и фотографий устройства (b). При анализе крови с помощью смартфона-BCI индивидуум вначале получает карту (1) и прокалывает палец (2), затем размещает небольшое количество крови непосредственно из пальца на CROF-карту в результате прикосновения к карте (2), закрывает карту (3), сдавливает пальцем (4) и освобождает его (5), вставляет карту в оптический адаптер (5), в конечном итоге делает фотографию карты с помощью смартфона (6), и на основании снятых фотографий компьютерная программа измеряет объем крови, подсчитывает клетки крови и другие параметры (6). (b) Фотография фактического смартфона и адаптера для р-BCI.

Фиг. 31. Изображения в светолопольном оптическом микроскопе свежей (а) и подвергавшейся хранению (b) неразведенной цельной крови в CROF-карте с различными конечными промежутками, и иллюстрация поведения RBC для разных ограниченных промежутков. Свежая кровь содержит антикоагулянт и была отобрана из проколотого пальца, при этом сохраняемая кровь содержит антикоагулянт и была получена от коммерческого поставщика, (от а-1 до а-6) и (от b-1 до b-6): для g = 2, 2,2, 2,6, 3, 5 и 10 мкм соответственно, на (с) показаны схемы поперечного разреза и вида сверху, (1) RBC отделены друг от друга, отсутствуют видимые наложения в CROF с промежутком 2 мкм, тогда как (2) RBC перекрывают друг друга в CROF с промежутком, большим 2 мкм.

Фиг. 32. Светлопольные (1) и флуоресцентные (2) изображения одного и того же образца (свежая кровь во взятой CROF-карте) с помощью смартфона с оптическим адаптером (а) и с помощью микроскопа с высоким разрешением с камерой DSLR (b). На изображениях показано, что смартфон с оптическим адаптером характеризуется аналогичным качеством фотографий клеток крови, что и микроскоп с высоким разрешением и камерой.

На фиг. 33 показана измеренная оптическая интенсивность одной типичной WBC и PLT в зависимости от расположений этих отделенных клеток. WBC имеет диаметр (FWHM) примерно 12 мкм, в то время как PLT имеет диаметр (FWHM) примерно 2 мкм. Максимальная интенсивность WBC составляет примерно в 3 раза больше, чем PLT. Как интенсивность, так и площадь создают суммарную интенсивность WBC, примерно в 108 раз больше, чем PLT. Таким образом, при применении меньшего увеличения (например, 4х), площадь WBC становится меньше, а их суммарная интенсивность становится ниже. В таком случае сигнал PLT может быть ничтожно малым.

На фиг. 34 показаны (а) график рассеяния интенсивности канала зеленого света в зависимости от интенсивностей канала красного света и (b) гистограмма соотношения интенсивности канала красного/зеленого света для 594 WBC на изображениях. На основании этого изображения можно отчетливо заметить, что клетки группируются в три различные участки (заштрихованные области, представленные в качестве ориентиров для глаза), соответствующие трем основным субпопуляциям лейкоцитов.

Подробное описание иллюстративных вариантов осуществления

В следующем подробном описании показаны некоторые варианты осуществления настоящего изобретения в качестве примера, но не в качестве ограничения. Названия разделов и любые подзаголовки, используемые в данном документе, предназначены лишь для организационных целей и никоим образом не предполагают ограничения описываемого объекта изобретения. Информация, находящаяся под заголовком и/или подзаголовком раздела, не ограничивается заголовком и/или подзаголовком раздела, а применима ко всему описанию настоящего изобретения.

Цитирование любой публикации означает ее раскрытие до даты подачи и не должно рассматриваться как признание того, что формула настоящего изобретения не имеет права датировать такую публикацию задним числом в силу того, что она представляет собой предшествующее изобретение. Кроме того, приводимые даты публикации могут отличаться от практических дат публикации, которые могут потребовать независимого подтверждения.

Настоящее изобретение относится, в числе прочего, к способам, устройствам и системам, которые могут улучшать и/или ускорять количественное определение, связывание и/или обнаружение аналита и/или объекта в образце.

Определения

Если не определено иное, все технические и научные термины, применяемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понятно специалисту в данной области техники, к которой принадлежит настоящее раскрытие. Хотя при применении на практике или тестировании идей настоящего изобретения можно также применять любые способы и материалы, аналогичные описанным в данном документе или эквивалентные им, далее описаны некоторые иллюстративные способы и материалы.

Термины «полинуклеотид», «нуклеотид», «нуклеотидная последовательность», «нуклеиновая кислота», «молекула нуклеиновой кислоты», «последовательность нуклеиновой кислоты» и «олигонуклеотид» используются взаимозаменяемо и могут также включать множественное число каждого соответственно в зависимости от контекста, в котором термины используют.

Термин «средство для захвата», используемый в данном документе, относится к элементу связывания, например, молекуле нуклеиновой кислоты, полипептидной молекуле или любой другой молекуле или соединению, которые могут специфически связываться со своим партнером по связыванию, например, второй молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательности, комплементарные молекуле первой нуклеиновой кислоты, антителу, которое специфически распознает антиген, антигену, специфически распознаваемому антителом, аптамеру нуклеиновой кислоты, который специфически связывается с целевой молекулой, и т.д.

Термин «вторичное средство для захвата», которое также может называться «средством для выявления», относится к группе биомолекул или химических соединений, которые обладают высокоспецифической аффинностью к антигену. Вторичное средство для захвата может быть прочно связано с оптической выявляемой меткой, например, ферментом, флуоресцентной меткой, или само по себе может выявляться с помощью другого средства для выявления, которое связывается с оптической выявляемой меткой в ходе биоконъюгации (Hermanson, "Bioconjugate Techniques" Academic Press, 2nd Ed., 2008).

Термин «средство для захвата-реакционно-способная группа» относится к фрагменту химического функционального элемента в молекуле, который является реакционно-способным по отношению к средствам для захвата, т.е. может реагировать с фрагментом (например, гидроксильной, сульфгидрильной, карбоксильной или аминогруппой) в средстве для захвата с образованием стабильной прочной, например, ковалентной связи.

Термины «специфическое связывание» и «селективное связывание» относятся к способности средства для захвата предпочтительно связываться с определенным целевым аналитом, который присутствует в гетерогенной смеси из различных целевых аналитов. Взаимодействие при специфическом или селективном связывании будет разграничивать желательные (например, активные) и нежелательные (например, неактивные) целевые аналиты в образце, обычно в более чем приблизительно 10-100 раз или более (например, в более чем приблизительно 1000 или 10000 раз).

Термин «образец», используемый в данном документе, относится к материалу или смеси из материалов, содержащих один или более аналитов или объект, представляющий интерес. В определенных вариантах осуществления образец может быть получен из биологического образца, такого как клетки, ткани, биологические жидкости и кал. Биологические жидкости, представляющие интерес, включают без ограничения амниотическую жидкость, водянистую влагу глаза, жидкую часть стекловидного тела, кровь (например, цельную кровь, фракционированную кровь, плазму, сыворотку крови и т.д.), грудное молоко, спинномозговую жидкость (CSF), ушную серу (серную пробку), хилус, химус, эндолимфу, перилимфу, фекалии, кислоты желудочного сока, желудочный сок, лимфу, слизь (в том числе отделяемую из носа и слизистую мокроту), перикардиальную жидкость, перитонеальную жидкость, плевральную жидкость, гной, водянистые выделения, слюну, секрет сальных желез (кожное сало), сперму, мокроту, пот, синовиальную жидкость, слезы, рвотную массу, мочу и конденсат выдыхаемого воздуха, цереброспинальную жидкость, влагалищное отделяемое, интерстициональную жидкость, получаемую из опухолевых тканей, внутриглазную жидкость, дерму. В определенных вариантах осуществления образец может быть получен от субъекта, например, человека, и он может быть обработан до применения в анализе субъекта. Например, перед анализом белок/нуклеиновую кислоту можно экстрагировать из образца ткани до применения с помощью способов, которые являются известными. В определенных вариантах осуществления образец может представлять собой клинический образец, например, образец, взятый от пациента, биологический образец, образец, относящийся к окружающей среде, химический образец или клинический препарат.

Термин «аналит» относится к молекуле (например, белку, пептидам, ДНК, РНК, нуклеиновой кислоте или другим молекулам), клеткам, тканям, вирусам и наночастицам различных форм.

Термин «анализ» относится к тестированию образца с целью выявления присутствия и/или содержания аналита.

Используемые в данном документе термины «определение», «измерение», а также «оценка» и «анализ» используются взаимозаменяемо и включают как количественные, так и качественные определения.

Используемый в данном документе термин «светоиспускающая метка» относится к метке, которая может испускать свет при внешнем возбуждении. Это может представлять собой люминесценцию. Флуоресцентные метки (которые включают молекулы красителей или квантовые точки) и люминесцентные метки (например, электро- или хемилюминесцентные метки) являются типами светоиспускающей метки. Внешнее возбуждение представляет собой свет (фотоны) в случае флуоресценции, электрический ток в случае электролюминесценции и химическую реакцию в случае хемилюминесценции. Внешнее возбуждение может представлять собой комбинацию из вышеуказанного.

Фраза «меченый аналит» относится к аналиту, который мечен выявляемым образом с помощью светоиспускающей метки, вследствие чего аналит может быть выявлен путем оценки присутствия метки. Меченый аналит может быть меченым непосредственно (т.е. аналит сам по себе может быть непосредственно конъюгирован с меткой, например, с помощью прочной связи, например, ковалентной или нековалентной связи), или меченый аналит может быть меченым опосредованно (т.е. анализ связывается вторичным средством для захвата, которое мечено напрямую).

Термины «гибридизация» и «связывание» по отношению к нуклеиновым кислотам используются взаимозаменяемо.

Термин «комплекс средство для захвата/аналит» представляет собой комплекс, который образуется в результате специфического связывания средства для захвата с аналитом. Средство для захвата и аналит для средства для захвата обычно будут специфически связываться друг с другом в «условиях специфического связывания» или «условиях, подходящих для специфического связывания», при этом такие условия представляют собой условия (с точки зрения концентрации солей, рН, содержания детергентов, концентрации белков, температуры и т.д.), которые обеспечивают возможность осуществления связывания между средствами для захвата и аналитами, подлежащими связыванию, в растворе. Такие условия, в частности, по отношению к антителам и их антигенам и гибридизации нуклеиновых кислот, хорошо известны из уровня техники (см., например, Harlow and Lane (Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), и Ausubel, et al., Short Protocols in Molecular Biology, 5th ed., Wiley & Sons, 2002).

Субъект может представлять собой либо человека, либо не относящееся к человеку животное. Субъект может представлять собой индивидуума, выполняющего способ по настоящему изобретению, пациента, клиента в центре тестирования и т.д.

«Аналит», используемый в данном документе, может представлять собой любое вещество, которое является подходящим для тестирования настоящего способа.

Используемый в данном документе термин «диагностический образец» относится к любому биологическому образцу, который представляет собой побочный продукт организма, такой как биологические жидкости, который был получен от субъекта. Диагностический образец может быть получен непосредственно от субъекта в форме жидкости или может быть получен от субъекта в результате изначального размещения побочного продукта организма в раствор, такой как буфер. Иллюстративные диагностические образцы включают без ограничения слюну, сыворотку крови, кровь, мокроту, мочу, пот, слезы, семенную жидкость, кал, воздух дыхания, биоптаты, слизь и т.д.

Используемый в данном документе термин «образец из окружающей среды» относится к любому образцу, который получен из окружающей среды. Образец из окружающей среды включает образцы жидкости из реки, озера, пруда, океана, ледников, айсбергов, дождя, снега, сточных вод, водохранилищ, водопроводной воды, питьевой воды и т.д.; твердые образцы из почвы, компоста, песка, камней, бетона, дерева, кирпича, отходов и т.д. и газообразные образцы из воздуха, подземных гидротермальных источников, промышленных выбросов, транспортных выбросов и т.д. Обычно образцы, которые не находятся в жидкой форме, превращают в жидкую форму перед анализом образца с помощью способа по настоящему изобретению.

Используемый в данном документе термин «пищевой образец» относится к любому образцу, который является подходящим для потребления животным, например, потребления человеком. Пищевой образец может включать сырые ингредиенты, приготовленную пищу, растительные и животные источники пищи, предварительно обработанную пищу, а также частично или полностью обработанную пищу и т.д. Обычно образцы, которые не находятся в жидкой форме, превращают в жидкую форму перед анализом образца с помощью способа по настоящему изобретению.

Термин «диагностический», используемый в данном документе, относится к применению способа или аналита для идентификации, прогнозирования результата и/или прогнозирования ответа на лечение заболевания или состояния, представляющих интерес. Диагноз может включать прогнозирование вероятности или предрасположенности к наличию заболевания или состояния, оценку тяжести заболевания или состояния, определение риска прогрессирования заболевания или состояния, оценку клинического ответа на лечение и/или прогнозирование ответа на лечение.

Термин «биомаркер», используемый в данном документе, представляет собой любую молекулу или соединение, которые встречаются в представляющем интерес образце и которые, как известно, имеют диагностическое значение или ассоциированы с присутствием или предрасположенностью к заболеванию или состоянию, представляющему интерес, у субъекта, от которого образец получен. Биомаркеры включают без ограничения полипептиды или их комплекс (например, антиген, антитело), нуклеиновые кислоты (например, ДНК, miRNA, мРНК), лекарственные метаболиты, липиды, углеводы, гормоны, витамины и т.д., которые, как известно, ассоциированы с заболеванием или состоянием, представляющими интерес.

Термин «состояние», используемый в данном документе по отношению к постановке диагноза состояния здоровья, относится к физиологическому состоянию психической деятельности или тела, которое отличается от других физиологических состояний. В некоторых случаях состояние здоровья не может быть диагностировано как заболевание. Иллюстративные состояния здоровья, представляющие интерес, включают без ограничения алиментарное здоровье; старение; воздействие токсинов окружающей среды, пестицидов, гербицидов, синтетических аналогов гормонов; беременность; менопаузу; андропаузу; сон; стресс; преддиабет; физические нагрузки; усталость; кислотно-основное равновесие и т.д. Термин «фрагмент биотина» относится к аффинному средству, которое включает биотин или аналог биотина, такой как дестиобион, оксибиотин, 2'-иминобиотин, диаминобиотин, биотина сульфоксид, биоцитин и т.д. Фрагменты биотина связываются со стрептавидином с аффинностью, составляющей по меньшей мере 10-8 М. Аффинное средство для биотина может также включать линкер, например, -LC-биотин, -LC-LC-биотин, -SLC-биотин или -PEGn-биотин, где n равняется 3-12.

Термин «усиливать» относится к повышению величины сигнала, например, по меньшей мере 10-кратное повышение, по меньшей мере 100-кратное повышение, по меньшей мере 1000-кратное повышение, по меньшей мере 10000-кратное повышение или по меньшей мере 100000-кратное повышение сигнала.

Термин «объект» относится без ограничения к белками, пептидам, ДНК, РНК, нуклеиновой кислоте, молекулам (малым или большим), клеткам, тканям, вирусам, наночастицам различных форм, которые будут связываться с «участком связывания». Объект включает средство для захвата, средство для выявления и блокирующее средство. Термин «объект» включает «аналит», и эти два термина используются взаимозаменяемо.

Термин «участок связывания» относится к местоположению на твердой поверхности, которое может иммобилизировать «объект» в образце.

Термин «партнеры объекта» относится без ограничения к белками, пептидам, ДНК, РНК, нуклеиновой кислоте, молекулам (малым или большим), клеткам, тканям, вирусам, наночастицам различных форм, которые находятся на «участке связывания» и будут связываться с объектом. Объект включает без ограничения средства для связывания, средства для выявления, вторичные средства для выявления или «комплекс средство для захвата/аналит».

Термин «смартфон» или «мобильный телефон», которые используются взаимозаменяемо, относится к типу телефонов, которые имеют камеру, аппаратуру для передачи данных и программное обеспечение, с помощью которых можно сделать изображение с применением камеры, преобразовать изображение, полученное с помощью камеры, и передать данные в удаленное место. В некоторых вариантах осуществления смартфон имеет фотовспышку.

Термин «средний линейный размер» области определяется как длина, которая равна области, умноженная на 4, затем деленная на периметр области. Например, если область представляет собой прямоугольник, который имеет ширину w и длину L, то среднее из линейного размера прямоугольника представляет собой 4*W*L/(2*(L+W)) (где «*» означает умножить и «/» означает разделить). В соответствии с этим определением средний линейный размер представляет собой соответственно W для квадрата шириной W и d для круга диаметром d. Область включает без ограничения область участка связывания или участка хранения.

Термин «период» массива периодической структуры относится к расстоянию от центра структуры до центра ближайшей соседней идентичной структуры.

Термин «участок хранения» относится к участку области на пластине, при этом участок содержит реагенты, подлежащие добавлению в образец, и при этом реагенты способны растворяться в образце, который находится в контакте с реагентами, и диффундировать в образец.

Термин «подходящий» означает, что он подходит для выявления аналитов, количественного определения и/или контроля аналита или объекта в образце или на пластине или количественного определения или контроля реагента, подлежащего добавлению в образец или на пластину.

Термин «гидрофильный», «смачиваемый» или «влажный» по отношению к поверхности означает, что угол смачивания образца на поверхности составляет менее 90 градусов.

Термин «гидрофобный», «несмачиваемый» или «невлажный» по отношению к поверхности означает, что угол смачивания образца на поверхности равен или более 90 градусов.

Термин «вариация» по отношению к количеству относится к разнице между фактическим значением и требуемым значением или средним значением количества. Термин «относительная вариация» по отношению к количеству относится к соотношению вариации и требуемого значения или среднего значения количества. Например, если требуемое значение количества составляет Q и фактическое значение составляет (Q+Δ), то Δ представляет собой вариацию, и Δ/(Q+Δ) представляет собой относительную вариацию. Термин «относительная вариация толщины образца» относится к соотношению вариации толщины образца и средней толщины образца.

Термин «оптически прозрачный» относится к материалу, который способствует передаче оптического сигнала, при этом термин «оптический сигнал» относится, если не указано иное, к оптическому сигналу, который применяется для исследования свойства образца, пластины, разделителей, делений шкалы, любых используемых структур или любых их комбинаций.

Термин «не принадлежащий образцу объем» относится, при закрытой конфигурации процесса CROF, к объему между пластинами, который занят не образцом, а другими объектами, которые не представляют собой образец. Объекты включают без ограничения разделители, воздушные пузыри, пылевидные частицы или любые их комбинации. Часто не принадлежащий образцу объем(не принадлежащие образцу объемы) смешивают внутри образца.

Термин «время инкубации до насыщения» относится к времени, необходимому для связывания двух типов молекул (например, средств для захвата и аналитов) для достижения равновесия. При анализе поверхностной иммобилизации «время инкубации до насыщения» относится к времени, необходимому для того, чтобы связывание между целевым аналитом (объектом) в образце и участком связывания на поверхности пластины достигло равновесия, а именно, время, после которого среднее количество целевых молекул (объектов), захваченных и иммобилизированных участком связывания, является статистически почти постоянным.

В некоторых случаях «аналит», «связывающий объект» и «объект» используются взаимозаменяемо.

Термины «процессор», «устройство связи», «мобильное устройство» относятся к компьютерным системам, которые содержат основные электронные элементы (в том числе одно или более из памяти, интерфейса ввода-вывода, центрального процессора, инструкций, сетевого интерфейса, источника питания и т.д.) для выполнения вычислительных задач. Компьютерная система может представлять собой компьютер общего назначения, которой содержит инструкции для выполнения специальной задачи, или может представлять собой специализированный компьютер.

«Участок» или «местоположение», используемые в данном документе при описании передачи сигнала или данных, относится к локальной области, в которой находится устройство или субъект. Участок может представлять собой комнату внутри здания, такого как больница, или более мелкую географически определяемую область в пределах более крупной географически определяемой области. Удаленный участок или удаленное местоположение по отношению к первому участку, который удален от второго участка, представляет собой первый участок, который физически отделен от второго участка расстоянием и/или физическим препятствием. Удаленный участок может представлять собой первый участок, который находится в отделенной комнате в здании относительного второго участка, первый участок, который находится в другом здании относительно второго участка, первый участок, который находится в другом городе относительно второго участка и т.д.

Используемый в данном документе термин «участок сбора образцов» относится к местоположению, в котором образец может быть получен от субъекта. Участок сбора образцов может представлять собой, например, местоположение розничной торговли (например, торговую сеть, аптеку, супермаркет или универмаг), офис поставщика, кабинет врача, больницу, дом субъекта, военный объект, участок нанимателя или другой участок или комбинацию участков. Используемый в данном документе термин «участок сбора образцов» может также относиться к владельцу или представителю бизнеса, сервиса или учреждения, расположенного в участке или имеющего филиал в составе участка.

Используемый в данном документе термин «первичные данные» включает сигналы и непосредственные показатели от сенсоров, камер и других компонентов и инструментов, которые выявляют или измеряют свойства или характеристики образца.

«Управление процессами», используемое в данном документе, относится к любому числу способов и систем для планирования и/или мониторинга эффективности процесса, такого как процесс анализа образцов.

Специалисту в данной области будет понятно, что настоящее изобретение не ограничено в своем применении подробностями конструкции, упорядочением компонентов, выбором категорий, измерениями, предварительно заданными границами сигналов или стадиями, изложенными в описании или графических материалах в данном документе. Настоящее изобретение можно реализовывать в соответствии с другими вариантами осуществления и можно осуществлять на практике или выполнять многими различными путями.

Необходимо отметить, что используемые в данном документе и прилагаемой формуле изобретения формы существительного единственного числа включают формы множественного числа, если контекст четко не определяет иное, например, если используется слово «один». Например, ссылка на «аналит» включает один аналит и нескольких аналитов, ссылка на «средство для захвата» включает одно средство для захвата и несколько средств для захвата, ссылка на «средство для выявления» включает одно средство для выявления и несколько средств для выявления, а ссылка на «средство» включает одно средство и несколько средств.

Устройство и система для анализа образца, в частности крови, и способы их применения

В данном документе предусмотрено устройство для анализа аналита в образце, в частности крови. В некоторых вариантах осуществления устройство содержит первую пластину и вторую пластину, где:

пластины являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации (например, посредством шарнира);

одна или обе пластины являются гибкими;

каждая из пластин имеет на своей соответствующей поверхности область контакта с образцом для осуществления контакта с образцом;

одна или обе пластины содержат разделители, которые закреплены на соответствующей пластине, где разделители характеризуются предварительно заданной практически однородной высотой и предварительно заданным постоянным расстоянием между разделителями, которое находится в диапазоне от 7 мкм до 200 мкм (например, от 7 мкм до 50 мкм (микрон), от 50 мкм до 120 мкм или от 120 мкм до 200 мкм), и где по меньшей мере один из разделителей расположен внутри области контакта с образцом;

детектор, который выявляет аналит в образце;

где одна из конфигураций представляет собой открытую конфигурацию, при которой две пластины отделены друг от друга, пространство между пластинами не регулируется разделителями, и образец размещен на одной или обеих пластинах; и

где другая из конфигураций представляет собой закрытую конфигурацию, в которую приводят после размещения образца в открытой конфигурации; и в закрытой конфигурации по меньшей мере часть образца сжата двумя пластинами в слой с толщиной высокой степени однородности, и она является практически неподвижной (т.е. характеризуется практическим отсутствием движения или направленного потока) по отношению к пластинам, где однородная толщина слоя (который может иметь площадь в горизонтальной проекции, составляющую по меньшей мере 0,1 мм², по меньшей мере 0,5 мм² или по меньшей мере 1 мм²) ограничена внутренними поверхностями двух пластин, и регулируется пластинами и разделителями, и характеризуется средней толщиной, равной 5 мкм или меньше (например, от 1,8 мкм до 2 мкм, от 2 мкм до 2,2 мкм, от 2,2 мкм до 2,6 мкм или от 2,6 мкм до 3,8 мкм) с незначительной вариацией (например, вариацией, составляющей менее 10%, менее 5% или менее 1%); и где при закрытой конфигурации детектор выявляет аналит по меньшей мере в части образца.

Как описано ниже, устройство может быть использовано для анализа аналита, который содержит молекулу (например, белок, пептиды, ДНК, РНК, нуклеиновую кислоту или другую молекулу), клетки, ткани, вирусы и наночастицы различных форм; и, например, для подсчета клеток (например, эритроцитов и лейкоцитов) в образце крови, который помещен в устройство.

В некоторых вариантах осуществления устройство может содержать сухой реагент, нанесенный на одну или обе пластины. В некоторых вариантах осуществления сухой реагент может связываться с аналитом в образце и иммобилизировать аналит на поверхности одной или обеих пластин. В данных вариантах осуществления реагент, например, может представлять собой антитело или другое специфическое связывающее средство. Этот сухой реагент может иметь предварительно заданную площадь. В других вариантах осуществления устройство может содержать высвобождаемый сухой реагент на одной или более пластинах, например, меченый реагент, такой как краситель для клеток или меченое средство для выявления, такое как антитело или ему подобные. В некоторых случаях на пластине, которая содержит высвобождаемый сухой реагент, может быть материал для регуляции времени высвобождения, где материал для регуляции времени высвобождения задерживает время, за которое высвобождаемый сухой реагент высвобождается в образец. В некоторых случаях материал для регуляции времени высвобождения задерживает время, за которое сухой реагент начинает высвобождаться в образец, на по меньшей мере 3 секунды, например, по меньшей мере 5 секунд или по меньшей мере 10 секунд. В некоторых вариантах осуществления узел может содержать несколько сухих участков связывания и/или несколько участков реагента, обеспечивая тем самым возможность проведения мультиплексных анализов. В некоторых случаях области, занятые сухими участками связывания, могут быть расположены напротив областей, занятых участками реагентов, когда пластины находятся в закрытом положении.

В некоторых вариантах осуществления реагент содержит антикоагулянт и/или реагент(реагенты) для окрашивания.

В некоторых вариантах осуществления аналит может быть молекулой (например, белком, пептидами, ДНК, РНК, нуклеиновой кислотой или другой молекулой), клеткой, тканью, вирусом или наночастицами различных форм. В некоторых вариантах осуществления аналиты могут быть лейкоцитами, эритроцитами и тромбоцитами. В некоторых вариантах осуществления аналит является окрашенным.

В некоторых вариантах осуществления разделители, регулирующие слой однородной толщины (т.е. разделители, которые отделяют пластины друг от друга в слое) характеризуются «коэффициентом заполнения», составляющим по меньшей мере 1%, например, по меньшей мере 2% или по меньшей мере 5%, где коэффициент заполнения представляет собой соотношение площади разделителя, находящейся в контакте со слоем однородной толщины, и общей площади пластины, находящейся в контакте со слоем однородной толщины. В некоторых вариантах осуществления для разделителей, регулирующих слой однородной толщины, произведение модуля Юнга разделителей и коэффициента заполнения разделителей равняется 10 МПа или более, например, по меньшей мере 15 МПа или по меньшей мере 20 МПа, где коэффициент заполнения представляет собой соотношение площади разделителя, находящейся в контакте со слоем однородной толщины, и общей площади пластины, находящейся в контакте со слоем однородной толщины. В некоторых вариантах осуществления произведение толщины гибкой пластины и модуля Юнга гибкой пластины находится в диапазоне от 60 до 750 ГПа-мкм, например, от 100 до 300 ГПа-мкм, от 300 до 550 ГПа-мкм или от 550 до 750 ГПа-мкм. В некоторых вариантах осуществления для гибкой пластины четвертая степень расстояния между разделителями (ISD), деленная на толщину гибкой пластины (h) и модуль Юнга (Е) гибкой пластины ISD⁴/(hE), равна 10⁶ мкм³/ГПа или меньше, например, менее 10⁵ мкм³/ГПа, менее 10⁴ мкм³/ГПа или менее 10³ мкм³/ГПа.

В некоторых вариантах осуществления одна или обе пластины содержат метку местоположения или на поверхности, или внутри пластины, которая предоставляет информацию о местоположении на пластине, например, о местоположении, которое будет проанализировано, или местоположении, на котором образец должен быть размещен. В некоторых случаях одна или обе пластины могут содержать масштабную метку, или на поверхности, или внутри пластины, которая предоставляет информацию о размере структуры образца и/или пластины в горизонтальной проекции. В некоторых вариантах осуществления одна или обе пластины содержат метку для визуализации или на поверхности, или внутри пластины, что облегчает визуализацию образца. Например, метка для визуализации может содействовать фокусировке устройства для визуализации или направлять устройство для визуализации на местоположение устройства. В некоторых вариантах осуществления разделители могут функционировать в качества метки местоположения, масштабной метки, метки для визуализации или любой их комбинации.

В некоторых вариантах осуществления средняя толщина слоя однородной толщины находится в диапазоне от 2 мкм до 2,2 мкм, а образец представляет собой кровь. В некоторых вариантах осуществления средняя толщина слоя однородной толщины находится в диапазоне от 2,2 мкм до 2,6 мкм, а образец представляет собой кровь. В некоторых вариантах осуществления средняя толщина слоя однородной толщины находится в диапазоне от 1,8 мкм до 2 мкм, а образец представляет собой кровь. В некоторых вариантах осуществления средняя толщина слоя однородной толщины находится в диапазоне от 2,6 мкм до 3,8 мкм, а образец представляет собой кровь. В некоторых вариантах осуществления средняя толщина слоя однородной толщины находится в диапазоне от 1,8 мкм до 3,8 мкм, а образец представляет собой цельную кровь без разведения другой жидкостью.

В некоторых случаях средняя толщина слоя однородной толщины приблизительно равняется минимальному размеру аналита в образце, например эритроцита или другой клетки.

В некоторых вариантах осуществления расстояние между разделителями может быть практически регулярным. В некоторых случаях разделители могут быть в регулярном шаблоне, а пространство между смежными разделителями может быть примерно одинаковым. Разделители могут быть столбиками с формой поперечного сечения, выбранной из круглой, многоугольной, круговой, квадратной, прямоугольной, овальной, эллиптической или любой их комбинации, а в некоторых вариантах осуществления разделители могут иметь практически ровную верхнюю поверхность, где для каждого разделителя соотношение размера разделителя в горизонтальной проекции и его высоты составляет по меньшей мере 1. В некоторых случаях минимальный размер разделителя в горизонтальной проекции меньше, чем минимальный размер аналита в образце, или практически равен ему. Минимальный размер разделителя в горизонтальной проекции находится в диапазоне от 0,5 мкм до 100 мкм, например в диапазоне от 2 мкм до 50 мкм или от 0,5 мкм до 10 мкм.

В некоторых вариантах осуществления образец может представлять собой цельную кровь, например, кровь из клинического образца. В некоторых случаях кровь может быть получена путем взятия крови у индивидуума, например, путем прокалывания кожи индивидуума и касания взятой крови (без помощи устройства для подачи крови) с одной из пластин. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой неразведенную цельную кровь.

В некоторых вариантах осуществления разделители имеют форму столбика, а углы боковых стенок разделителей имеют закругленную форму с радиусом кривизны, составляющим по меньшей мере 1 мкм, например, по меньшей мере 1,2 мкм, по меньшей мере 1,5 мкм или по меньшей мере 2,0 мкм. Разделители могут иметь любую подходящую плотность, например, плотность, составляющую по меньшей мере 1000/мм², например, плотность, составляющую по меньшей мере 1000/мм², плотность, составляющую по меньшей мере 2000/мм², плотность, составляющую по меньшей мере 5000/мм², или плотность, составляющую по меньшей мере 10000/мм².

В данном устройстве по меньшей мере одна из пластин может быть прозрачной, обеспечивая тем самым оптическое считывание анализа. Аналогично в данном устройстве по меньшей мере одна из пластин может быть изготовлена из гибкого полимера, обеспечивая тем самым эффективное распределение образца путем сдавливания пластин вместе. В некоторых вариантах осуществления в отношении давления, которое сжимает пластины, разделители являются несжимаемыми и/или независимо только одна из пластин является гибкой. Гибкая пластина может иметь толщину в диапазоне от 10 мкм до 200 мкм, например, от 10 мкм до 50 мкм, от 50 мкм до 150 мкм или от 150 мкм до 200 мкм. Как отмечено выше, в закрытом положении толщина слоя однородной толщины может иметь незначительную вариацию. В некоторых вариантах осуществления вариация может быть меньше 30%, меньше 20%, меньше 10%, меньше 5% или меньше 2%, означая, что толщина области не превышает +/- 30%, +/- 20%, +/- 10%, +/- 5% или +/- 2% средней толщины.

В некоторых вариантах осуществления первая и вторая пластины соединены и выполнены с возможностью перехода из открытой конфигурации в закрытую конфигурацию путем складывания пластин. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая пластины соединены шарниром и выполнены с возможностью перехода из открытой конфигурации в закрытую конфигурацию путем складывания пластин таким образом, что устройство изгибается вдоль шарнира. Шарнир может быть из отличающегося материала, то есть присоединен к пластинам, или в некоторых случаях пластины могут составлять единое целое с пластинами. В некоторых случаях первая и вторая пластины изготовлены из одного куска материала и выполнены с возможностью перехода из открытой конфигурации в закрытую конфигурацию путем складывания пластин, например вдоль шарнира.

В некоторых вариантах осуществления устройство выполнено с возможностью очень быстрого проведения анализа образца. В некоторых случаях анализ может быть проведен за 60 секунд или меньше, за 30 секунд, за 20 секунд или меньше или за 10 секунд или меньше.

В каких-либо определенных вариантах осуществления сухой участок связывания может содержать средство для захвата, такое как антитело или нуклеиновая кислота. В некоторых вариантах осуществления высвобождаемый сухой реагент может быть меченым реагентом, таким как флуоресцентно меченый реагент, например флуоресцентно меченое антитело, или красителем для клеток, таким как краситель Романовского, краситель Лейшмана, краситель Мая-Грюнвальда, краситель Гимза, краситель Дженнера, краситель Райта или любая их комбинация (например, краситель Райта-Гимза). Такой краситель может содержать эозин Y или эозин В с метиленовым синим. В определенных вариантах осуществления краситель может быть щелочным красителем, таким как гематоксилин.

В некоторых вариантах осуществления детектор может быть оптическим детектором, который выявляет оптический сигнал. В некоторых вариантах осуществления детектор может быть электрическим детектором, который выявляет электрический сигнал

В некоторых вариантах осуществления пространство закреплено на пластине за счет прямого тиснения пластины или литьевого формования пластины.

В некоторых вариантах осуществления пластина и разделители изготовлены из полистирола, РММА, PC, СОС, СОР или другой пластмассы.

Также предусмотрена система для ускоренного анализа образца с применением мобильного телефона. В определенных вариантах осуществления данная система может содержать (а) устройство, описанное выше; (b) устройство мобильной связи (например, мобильный телефон, такой как iPhone или ему подобные), содержащее: i. одну или множество камер для выявления и/или визуализации образца; ii. интегральные схемы, процессоры обработки сигналов, аппаратные средства и программное обеспечение для получения и/или обработки выявляемого сигнала и/или изображения образца и для удаленной передачи данных и (с) источник света, или в устройстве мобильной связи, или внешний источник. В некоторых случаях, где детектор в устройстве может быть обеспечен устройством мобильной связи и выявляет аналит в образце при закрытой конфигурации.

В данной системе одна из пластин может иметь участок связывания, который связывает аналит, где по меньшей мере часть слоя однородной толщины образца расположена на участке связывания, и при этом она является практически меньшей, чем средний линейный размер в горизонтальной проекции участка связывания.

В некоторых вариантах осуществления система может дополнительно содержать корпус (d), выполненный с возможностью удерживания образца и подлежащий закреплению на устройстве мобильной связи. Корпус может содержать оптические средства, способствующие визуализации и/или обработке сигнала от образца с помощью устройства мобильной связи, и монтажную систему, выполненную с возможностью удерживания оптических средств на устройстве мобильной связи. В некоторых случаях элемент оптических средств устройства (например, линза, фильтр, зеркало, призма или светоделительное устройство) в корпусе может быть перемещаемым относительно корпуса таким образом, что образец может быть визуализирован по меньшей мере в двух каналах.

В некоторых вариантах осуществления устройство мобильной связи может быть выполнено с возможность передачи результатов теста медицинскому специалисту (например, доктору медицины), в медицинское учреждение (например, больницу или клиническую лабораторию) или страховую компанию. Кроме того, устройство мобильной связи может быть выполнено с возможностью передачи информации относительно субъекта (например, возраст субъекта, пол, вес, адрес, имя и фамилия, результаты предшествующих тестов, анамнез и т.д.) медицинскому специалисту, в медицинское учреждение или страховую компанию. В определенных вариантах осуществления устройство мобильной связи может быть выполнено с возможностью получать назначение, диагноз или рекомендацию от медицинского специалиста. Например, в некоторых вариантах осуществления устройство мобильной связи может отправлять результаты анализов в отдаленное местоположение, где медицинский специалист устанавливает диагноз. Диагноз может быть передан субъекту через устройство мобильной связи. В некоторых вариантах осуществления устройство мобильной связи может быть выполнено с возможностью передачи информации относительно теста и субъекта в облачную сеть, и в облачной сети происходит обработка информации для уточнения результатов теста. В некоторых вариантах осуществления устройство мобильной связи может быть выполнено с возможностью передачи информации относительно теста и субъекта в облачную сеть, и в облачной сети происходит обработка информации для уточнения результатов теста, и при этом уточненные результаты теста будут отправлены субъекту обратно.

В некоторых вариантах осуществления устройство мобильной связи может содержать аппаратные средства и программное обеспечение, которые позволяют (а) захватывать изображение образца; (b) проводить анализ тестируемого местоположения и контрольного местоположения на изображении и (с) сравнивать значение, полученное в результате анализа тестируемого местоположения, с пороговым значением, которое характеризует ускоренный диагностический тест.В некоторых случаях устройство мобильной связи осуществляет обмен данными с удаленным местоположением посредством технологии беспроводного доступа или сети мобильной сотовой связи. В любом варианте осуществления устройство мобильной связи может быть мобильным телефоном.

Данную систему можно использовать в способе, который предусматривает (а) размещение образца на устройстве данной системы; (b) проведение анализа аналита в образце, размещенном на устройстве, с получением результата; и (с) передачу результата от устройства мобильной связи в местоположение, удаленное от устройства мобильной связи. Способ может предусматривать анализ результатов в удаленном местоположении с получением проанализированного результата и передачу проанализированного результата из удаленного местоположения в устройство мобильной связи. Как отмечено выше, анализ может быть проведен медицинским специалистом в удаленном местоположении. И в некоторых вариантах осуществления устройство мобильной связи может получать назначение, диагноз или рекомендацию от медицинского специалиста, находящегося в удаленном местоположении.

В данном способе аналит может, например, быть молекулой (например, белком, пептидами, ДНК, РНК, нуклеиновой кислотой или другой молекулой), клеткой, тканью, вирусом или наночастицами различных форм. В некоторых вариантах осуществления аналиты могут быть лейкоцитами, эритроцитами и/или тромбоцитами.

В данном способе образец может представлять собой неразведенную цельную кровь, которая может быть перенесена непосредственно на устройство из участка взятия крови. В некоторых вариантах осуществления образец крови представляет собой клинический образец.

В некоторых вариантах осуществления стадия проведения анализа может предусматривать выявление аналита в образце, например, биомаркера, такого как белок, нуклеиновая кислота, клетка или метаболит, то есть находящегося в крови. Данный анализ может, например, представлять собой анализ связывания или биохимический анализ.

В некоторых вариантах осуществления способ предусматривает подсчет количества эритроцитов и/или подсчет количества лейкоцитов. В некоторых случаях способ может предусматривать окрашивание клеток в образце и подсчет количества одного или более из нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов и базофилов в образце.

В некоторых вариантах осуществления данный способ можно применять для проведения дифференциации лейкоцитов (по меньшей мере нейтрофилов, эозинофилов и лимфоцитов) для получения вероятного диагноза инфекции, воспаления, аллергий, астмы, иммунологических нарушений (например, аутоиммунных нарушений или иммунодефицита), лейкоза (например, хронического миелоидного лейкоза, хронического лимфоцитарного лейкоза), миелодиспластического синдрома или миелопролиферативных новообразований (например, миелофиброза).

Также предусмотрен способ анализа образца. В некоторых вариантах осуществления данный способ может предусматривать получение описанного выше устройства, размещение образца на одной или обеих пластинах устройства; помещение пластин в закрытую конфигурацию, и приложение внешней силы на протяжении по меньшей мере части пластин; и анализ аналита в образце в слое однородной толщины, пока пластины находятся в закрытой конфигурации.

В некоторых вариантах осуществления данный способ может предусматривать:

(a) получение образца;

(b) получение первой и второй пластин, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации, где каждая пластина имеет поверхность для контакта с образцом, которая является практически плоской, одна или обе пластины являются гибкими, и одна или обе пластины содержат разделители, которые закреплены на соответствующей поверхности для контакта с образцом, и где разделители характеризуются:

i. предварительно заданной практически однородной высотой,

ii. формой столбика с практически однородным поперечным сечением и ровной верхней поверхностью;

Ш. соотношением ширины и высоты, равным одному или больше;

iv. предварительно заданным постоянным расстоянием между разделителями, которое находится в диапазоне от 10 мкм до 200 мкм;

v. коэффициентом заполнения, равным 1% или больше; и

(c) размещение образца на одной или обеих пластинах, когда пластины приведены в открытую конфигурацию, где открытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, и пространство между пластинами не регулируется разделителями;

(d) после (с) применение двух пластин для сжатия по меньшей мере части образца в слой практически однородной толщины, которая ограничена поверхностями пластин для контакта с образцом, где однородная толщина слоя регулируется разделителями и пластинами и характеризуется средним значением в диапазоне от 1,8 мкм до 3 мкм с вариацией менее 10%, где сжатие предусматривает:

сведение двух пластин вместе и

сдавливание с согласованием формы, или одновременно, или последовательно в области по меньшей мере одной из пластин со сдавливанием пластин вместе до закрытой конфигурации, где сдавливание с согласованием формы создает практически однородное давление на пластинах на протяжении по меньшей мере части образца, и сдавливание распространяется по меньшей мере в части образца горизонтально между поверхностями пластин для контакта с образцом, и где закрытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой пространство между пластинами в слое участка однородной толщины регулируется разделителями; и

(е) анализ крови в слое однородной толщины, пока пластины находятся в закрытой конфигурации;

где коэффициент заполнения представляет собой соотношение площади контакта с разделителем и общей площади пластины, где сдавливание с согласованием формы представляет собой способ, который делает давление, прилагаемое на протяжении области, практически постоянным независимо от вариации формы наружных поверхностей пластин; и

где при одновременном сдавливании давление одновременно прилагается в отношении заданной области, а при последовательном сдавливании давление прилагается в отношении части заданной области и постепенно перемещается на другую область.

В некоторых вариантах осуществления этот способ может предусматривать снятие внешней силы после приведения пластин в закрытую конфигурацию; проведение визуализации клеток крови в слое однородной толщины, пока пластины находятся в закрытой конфигурации; и подсчет количества аналитов, например, клеток, в области на изображении. Как отмечено выше, в данных вариантах осуществления расстояние между разделителями может варьировать в диапазоне от 20 мкм до 200 мкм или от 5 мкм до 20 мкм. В данных вариантах осуществления результат произведения коэффициента заполнения и модуля Юнга разделителя составляет 2 МПа или больше. В некоторых вариантах осуществления вариация поверхности составляет менее 30 нм.

В некоторых вариантах осуществления образец может представлять собой неразведенную цельную кровь, в которую не добавляли антикоагулянт. В данных вариантах осуществления стадию размещения (b) можно осуществлять путем i. прокалывания кожи человека с выделением капли крови на кожу и ii. приведения капли крови в контакт с одной или обеими пластинами без применения инструмента для переноса крови.

Стадию анализа можно осуществлять, например, путем подсчета количества эритроцитов и/или подсчета количества лейкоцитов. В некоторых вариантах осуществления способ может предусматривать окрашивание клеток в образце и подсчет количества нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов и базофилов или любую их комбинацию.

В каком-либо из данных вариантов осуществления визуализация и подсчет могут быть проведены путем: i. освещения клеток в слое однородной толщины; ii. получения одного или более изображений клеток крови с применением ПЗС- или КМОП-сенсора; iii. идентификации клеток на изображении с применением компьютера и iv. подсчета количества клеток в области на изображении.

В некоторых вариантах осуществления внешняя сила может обеспечиваться с помощью руки человека, например, путем придавливания с помощью пальца, как, например, большого пальца, или сжатия между большим пальцем и другим пальцем, таким как указательный палец, одной и той же руки.

В некоторых вариантах осуществления способ может предусматривать измерение натрия, калия, хлорида, бикарбоната, мочевины крови, азота, магния, креатинина, глюкозы, кальция, уровней HDL-холестерина и LDL-холестерина и/или уровней триглицеридов в слое однородной толщины. Подробности относительно того, как проводить такие анализы, могут быть адаптированы из известных способов.

В некоторых вариантах осуществления одна или более из пластин могут содержать сухой реагент, нанесенный на одну или обе пластины (например, средство для связывания, средство для окрашивания, средство для выявления или реагент для анализа).

В некоторых вариантах осуществления слой образца однородной толщины может характеризоваться однородностью толщины, составляющей не более +/-5%, например, не более+1-2% или не более +/-1%.

В некоторых вариантах осуществления разделители представляют собой столбики с формой поперечного сечения, выбранной из круглой, многоугольной, круговой, квадратной, прямоугольной, овальной, эллиптической или любой их комбинации. В некоторых вариантах осуществления пространство между разделителями представляет собой примерно среднюю толщину эритроцитов.

Образец можно анализировать с помощью ряда различных способов. Например, в некоторых вариантах осуществления стадия анализа предусматривает визуализацию клеток, например, эритроцитов, лейкоцитов или тромбоцитов, в крови. Данный анализ может включать визуализацию раковых клеток, вирусов или бактерий в крови. В некоторых вариантах осуществления способ может предусматривать анализ крови, предусматривающий выявление белков или нуклеиновых кислот.

В некоторых вариантах осуществления анализ крови может предусматривать измерение форменных элементов крови, который может предусматривать определение толщины образца с применением разделителя, определение площади в горизонтальной проекции с помощью визуализации и проведение расчета площади эритроцитов с применением 2D-визуализации. Способ может предусматривать измерение концентрации эритроцитов в крови, концентрации лейкоцитов в крови и/или концентрации тромбоцитов в крови.

В каком-либо из описанных выше вариантов осуществления образец может представлять собой цельную кровь.

Иммуногистохимия

В способах иммуногистохимического окрашивания (IHC) образец ткани фиксируют (например, в параформальдегиде), необязательно заливают воском, нарезают с получением тонких срезов, толщина которых составляет менее 100 мкм (например, от 2 мкм до 6 мкм в толщину), а затем готовят микроскопический препарат на подложке, такой как предметное стекло. Как только был приготовлен микроскопический препарат, срезы тканей могут быть дегидратированы с применением промывок спиртами в возрастающих концентрациях и осветлены с применением детергента, такого как ксилол.

В большинстве IHC-способов можно использовать первичное и вторичное антитела. В таких способах первичное антитело связывается с антигеном (например, биомаркером), представляющим интерес, и при этом оно является немеченным. Вторичное антитело связывается с первичным антителом и является непосредственно конъюгированным или с репортерной молекулой, или с линкерной молекулой (например, биотином), которые могут вовлекать репортерную молекулу, которая находится в растворе. Альтернативно собственно первичное антитело может непосредственно конъюгироваться или с репортерной молекулой, или с линкерной молекулой (например, биотином), которые могут вовлекать репортерную молекулу, которая находится в растворе. Репортерные молекулы включают флуорофоры (например, FITC, TRITC, АМСА, флуоресцеин и родамин) и ферменты, такие как щелочная фосфатаза (АР) и пероксидаза хрена (HRP), для которых существует ряд флуорогенных, хромогенных и хемилюминесцентных субстратов, таких как DAB или BCIP/NBT.

В прямых способах срез ткани инкубируют с меченным первичным антителом (например, FITC-конъюгированным антителом) в буфере для связывания. Первичное антитело связывается непосредственно с антигеном в срезе ткани и, после того как срез ткани промывали для удаления любого несвязанного первичного антитела, срез анализируют с помощью микроскопии.

В непрямых способах срез ткани инкубируют с немеченым первичным антителом, которое связывается с целевым антигеном в ткани. После промывания среза ткани с удалением несвязанного первичного антитела срез ткани инкубируют с меченым вторичным антителом, которое связывается с первичным антителом.

После иммуногистохимического окрашивания антигена образец ткани можно подвергать окрашиванию другим красителем, например, гематоксилином, красителем Хехст и DAPI, которые обеспечивают контраст и/или идентификацию других признаков.

Устройство по настоящему изобретению можно использовать для иммуногистохимического (IHC) окрашивания образца ткани. В данных вариантах осуществления устройство может содержать

первую пластину и вторую пластину, где:

пластины являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации; одна или обе пластины являются гибкими;

каждая из пластин имеет на своей соответствующей поверхности область контакта с образцом для осуществления контакта с образцом ткани или жидкостью для IHC-окрашивания;

область контакта с образцом в первой пластине является ровной и плоской;

область контакта с образцом во второй пластине содержит разделители, которые закреплены на поверхности и характеризуются предварительно заданной практически однородной высотой, и предварительно заданное постоянное расстояние между разделителями находится в диапазоне от 7 мкм до 200 мкм;

где одна из конфигураций представляет собой открытую конфигурацию, при которой две пластины или полностью, или частично отделены друг от друга, пространство между пластинами не регулируется разделителями, и

где другая из конфигураций представляет собой закрытую конфигурацию, в которую приводят после размещения образца и жидкости для IHC-окрашивания в открытой конфигурации; и в закрытой конфигурации по меньшей мере часть образца расположена между двумя пластинами, и слой по меньшей мере части жидкости для окрашивания расположен между по меньшей мере частью образца и второй пластиной, где толщина по меньшей мере части слоя жидкости для окрашивания регулируется пластинами, образцом и разделителями, и характеризуется средним расстоянием между поверхностью для образца и поверхностью для второго образца, которое равняется 250 мкм или меньше с незначительной вариацией.

В некоторых вариантах осуществления устройство может содержать сухое средство для IHC-окрашивания, нанесенное на область контакта с образцом одной или обеих пластин.

В некоторых вариантах осуществления устройство может содержать сухое средство для IHC-окрашивания, нанесенное на область контакта с образцом второй пластины, и жидкость для IHC-окрашивания предусматривает жидкость, которая растворяет сухое средство для IHC-окрашивания. Устройство по п. 1, где толщина образца составляет от 2 мкм до 6 мкм.

Также предусмотрена система для ускоренного проведения окрашивания и анализа образца ткани с применением мобильного телефона, которая содержит:

(а) образец, жидкость для окрашивания и описанное выше устройство, (b) устройство мобильной связи, содержащее:

i. одну или множество камер для выявления и/или визуализации образца;

ii. интегральные схемы, процессоры обработки сигналов, аппаратные средства и программное обеспечение для получения и/или обработки выявляемого сигнала и/или изображения образца и для удаленного взаимодействия; и

(с) источник света или в устройстве мобильной связи, или внешний источник. Также предусмотрен способ ускоренного окрашивания и анализа образца ткани с применением мобильного телефона, который предусматривает:

(a) размещение образца ткани и жидкости для окрашивания на устройстве описанной выше системы и помещение двух пластин в закрытую конфигурацию;

(b) получение мобильного телефона, который имеет аппаратные средства и программное обеспечение для визуализации, обработки данных и передачи данных;

(c) проведение анализа образца ткани, размещенного на устройстве для CROF, с помощью мобильного телефона с получением результата и

(с) передачу результата от устройства мобильной связи в местоположение, удаленное от мобильного телефона.

Также предусмотрен способ окрашивания образца ткани, предусматривающий:

(a) получение образца ткани;

(b) получение жидкости для окрашивания;

(b) получение первой пластины и второй пластины, где:

пластины являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации;

одна или обе пластины являются гибкими;

каждая из пластин имеет на своей соответствующей поверхности область контакта с образцом для осуществления контакта с образцом ткани или жидкостью для IHC-окрашивания;

область контакта с образцом в первой пластине является ровной и плоской; область контакта с образцом во второй пластине содержит разделители, которые закреплены на поверхности и характеризуются предварительно заданной практически однородной высотой, и предварительно заданное постоянное расстояние между разделителями находится в диапазоне от 7 мкм до 200 мкм;

(c) размещение образца ткани и жидкости для окрашивания на пластинах, когда пластины приведены в открытую конфигурацию, где открытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, и пространство между пластинами не регулируется разделителями;

(d) после (с) применение двух пластин для сжатия по меньшей мере части образца ткани и по меньшей мере части жидкости для окрашивания в закрытую конфигурацию;

где в закрытой конфигурации по меньшей мере часть образца расположена между двумя пластинами, и слой по меньшей мере части жидкости для окрашивания расположен между по меньшей мере частью образца и второй пластиной, где толщина по меньшей мере части слоя жидкости для окрашивания регулируется пластинами, образцом и разделителями и характеризуется средним расстоянием между поверхностью для образца и поверхностью для второго образца, которое равняется или меньше 250 мкм с незначительной вариацией.

Все выгоды и преимущества (например, ускоренная реакция, более быстрый результат и т.д.) других вариантов осуществления могут быть применимы по отношению к данным устройству, системе и способу.

Кроме того, все параметры, описанные выше в контексте других вариантов осуществления (например, размер, пространство и форма разделителей, гибкость разделителей и пластин, и варианты использования устройства и системы и т.д.), могут быть внедрены в варианты осуществления ШС, описанные в данном разделе.

Например, в некоторых вариантах осуществления разделители, регулирующие слой однородной толщины (т.е. разделители, которые разделяют пластины одну от другой в слое) характеризуются «коэффициентом заполнения», составляющим по меньшей мере 1%, например, по меньшей мере 2% или по меньшей мере 5%, где коэффициент заполнения представляет собой соотношение площади разделителя, находящейся в контакте со слоем однородной толщины, и общей площади пластины, находящейся в контакте со слоем однородной толщины. В некоторых вариантах осуществления для разделителей, регулирующих слой однородной толщины, произведение модуля Юнга разделителей и коэффициента заполнения разделителей равняется 10 МПа или более, например, по меньшей мере 15 МПа или по меньшей мере 20 МПа, где коэффициент заполнения представляет собой соотношение площади разделителя, находящейся в контакте со слоем однородной толщины, и общей площади пластины, находящейся в контакте со слоем однородной толщины. В некоторых вариантах осуществления произведение толщины гибкой пластины и модуля Юнга гибкой пластины находится в диапазоне от 60 до 550 ГПа-мкм, например от 100 до 300 ГПа-мкм. В некоторых вариантах осуществления для гибкой пластины четвертая степень расстояния между разделителями (ISD), деленная на толщину гибкой пластины (h) и модуль Юнга (Е) гибкой пластины ISD⁴/(hE), равна 10⁶ мкм³/ГПа или меньше, например, менее 10⁵ мкм³/ГПа, менее 10⁴ мкм³/ГПа или менее 10³ мкм³/ГПа.

В некоторых вариантах осуществления одна или обе пластины содержат метку местоположения или на поверхности, или внутри пластины, которая предоставляет информацию о местоположении на пластине, например, о местоположении, которое будет проанализировано, или местоположении, на котором образец должен быть размещен. В некоторых случаях одна или обе пластины могут содержать масштабную метку, или на поверхности, или внутри пластины, которая предоставляет информацию о размере в горизонтальной проекции структуры среза и/или пластины. В некоторых вариантах осуществления одна или обе пластины содержат метку для визуализации, или на поверхности, или внутри пластины, что облегчает визуализацию образца. Например, метка для визуализации может содействовать фокусировке устройства для визуализации или направлять устройство для визуализации на местоположение устройства. В некоторых вариантах осуществления разделители могут функционировать в качества метки местоположения, масштабной метки, метки для визуализации или любой их комбинации.

В некоторых вариантах осуществления расстояние между разделителями может быть практически регулярным. В некоторых случаях разделители могут быть в регулярном шаблоне, а пространство между смежными разделителями может быть примерно одинаковым. Разделители могут быть столбиками с формой поперечного сечения, выбранной из круглой, многоугольной, круговой, квадратной, прямоугольной, овальной, эллиптической или любой их комбинации, а в некоторых вариантах осуществления разделители могут иметь практически ровную верхнюю поверхность, где для каждого разделителя соотношение размера разделителя в горизонтальной проекции и его высоты составляет по меньшей мере 1. В некоторых случаях минимальный размер разделителя в горизонтальной проекции меньше, чем минимальный размер аналита в образце, или практически равен ему. Минимальный размер разделителя в горизонтальной проекции находится в диапазоне от 0,5 мкм до 100 мкм, например в диапазоне от 2 мкм до 50 мкм или от 0,5 мкм до 10 мкм.

В некоторых вариантах осуществления разделители имеют форму столбика, а углы боковых стенок разделителей имеют закругленную форму с радиусом кривизны, составляющим по меньшей мере 1 мкм, например, по меньшей мере 1,2 мкм, по меньшей мере 1,5 мкм или по меньшей мере 2,0 мкм. Разделители могут иметь любую подходящую плотность, например, плотность, составляющую по меньшей мере 1000/мм², например, плотность, составляющую по меньшей мере 1000/мм², плотность, составляющую по меньшей мере 2000/мм², плотность, составляющую по меньшей мере 5000/мм², или плотность, составляющую по меньшей мере 10000/мм².

В данном устройстве по меньшей мере одна из пластин может быть прозрачной, обеспечивая тем самым оптическое считывание анализа. Аналогично в данном устройстве по меньшей мере одна из пластин может быть изготовлена из гибкого полимера, обеспечивая тем самым эффективное распределение образца путем сдавливания пластин вместе. В некоторых вариантах осуществления в отношении давления, которое сжимает пластины, разделители являются несжимаемыми и/или независимо только одна из пластин является гибкой. Гибкая пластина может иметь толщину в диапазоне от 20 мкм до 200 мкм, например, от 50 мкм до 150 мкм. Как отмечено выше, в закрытом положении толщина слоя однородной толщины может иметь незначительную вариацию. В некоторых вариантах осуществления вариация может быть менее 10%, менее 5% или менее 2%, означая, что толщина области не превышает +/-10%, +/- 5% или +/- 2% средней толщины.

В некоторых вариантах осуществления первая и вторая пластины соединены, и устройство может быть переведено из открытой конфигурации в закрытую конфигурацию путем складывания пластин. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая пластины могут быть соединены шарниром, и устройство может быть выполнено с возможностью перехода из открытой конфигурации в закрытую конфигурацию путем складывания пластин таким образом, что устройство изгибается вдоль шарнира. Шарнир может быть из отличающегося материала, то есть присоединен к пластинам, или в некоторых случаях пластины могут составлять единое целое с пластинами.

В некоторых вариантах осуществления устройство может предусматривать возможность очень быстрого анализа среза. В некоторых случаях анализ может быть проведен за 60 секунд или меньше, за 30 секунд, за 20 секунд или меньше или за 10 секунд или меньше.

В каких-либо определенных вариантах осуществления сухой участок связывания может содержать средство для захвата, такое как антитело или нуклеиновая кислота. В некоторых вариантах осуществления высвобождаемый сухой реагент может быть меченым реагентом, таким как флуоресцентно меченый реагент, например флуоресцентно меченое антитело, или красителем для клеток, таким как краситель Романовского, краситель Лейшмана, краситель Мая-Грюнвальда, краситель Гимза, краситель Дженнера, краситель Райта или любая их комбинация (например, краситель Райта-Гимза). Такой краситель может содержать эозин Y или эозин В с метиленовым синим. В определенных вариантах осуществления краситель может быть щелочным красителем, таким как гематоксилин.

В некоторых вариантах осуществления система может дополнительно содержать корпус (d), выполненный с возможностью удерживания образца и подлежащий закреплению на устройстве мобильной связи. Корпус может содержать оптические средства, способствующие визуализации и/или обработке сигнала от образца с помощью устройства мобильной связи, и монтажную систему, выполненную с возможностью удерживания оптических средств на устройстве мобильной связи. В некоторых случаях элемент оптических средств устройства (например, линза, фильтр, зеркало, призма или светоделительное устройство) может быть перемещаемым таким образом, что образец может быть визуализирован по меньшей мере в двух каналах.

В некоторых вариантах осуществления устройство мобильной связи может быть выполнено с возможность передачи результатов теста медицинскому специалисту (например, доктору медицины), в медицинское учреждение (например, больницу или клиническую лабораторию) или страховую компанию. Кроме того, устройство мобильной связи может быть выполнено с возможностью передачи информации относительно субъекта (например, возраст субъекта, пол, вес, адрес, имя и фамилия, результаты предшествующих тестов, анамнез и т.д.) медицинскому специалисту, в медицинское учреждение или страховую компанию. В определенных вариантах осуществления устройство мобильной связи может быть выполнено с возможностью получать назначение, диагноз или рекомендацию от медицинского специалиста. Например, в некоторых вариантах осуществления устройство мобильной связи может отправлять результаты анализов в отдаленное местоположение, где медицинский специалист устанавливает диагноз. Диагноз может быть передан субъекту через устройство мобильной связи.

В некоторых вариантах осуществления устройство мобильной связи может содержать аппаратные средства и программное обеспечение, которые позволяют (а) захватывать изображение образца; (b) проводить анализ тестируемого местоположения и контрольного местоположения на изображении и (с) сравнивать значение, полученное в результате анализа тестируемого местоположения, с пороговым значением, которое характеризует ускоренный диагностический тест. В некоторых случаях устройство мобильной связи осуществляет обмен данными с удаленным местоположением посредством технологии беспроводного доступа или сети мобильной сотовой связи. В любом варианте осуществления устройство мобильной связи может быть мобильным телефоном.

Данную систему можно использовать в способе, который предусматривает (а) образец на устройстве данной системы; (b) проведение анализа образца, размещенного на устройстве, с получением результата; и (с) передачу результата от устройства мобильной связи в местоположение, удаленное от устройства мобильной связи. Способ может предусматривать анализ результатов в удаленном местоположении с получением проанализированного результата и передачу проанализированного результата из удаленного местоположения в устройство мобильной связи. Как отмечено выше, анализ может быть проведен медицинским специалистом в удаленном местоположении. И в некоторых вариантах осуществления устройство мобильной связи может получать назначение, диагноз или рекомендацию от медицинского специалиста, находящегося в удаленном местоположении.

Также предусмотрен способ анализа среза ткани. В некоторых вариантах осуществления данный способ может предусматривать получение описанного выше устройства, размещение среза на одной или обеих пластинах устройства; помещение пластин в закрытую конфигурацию и приложение внешней силы на протяжении по меньшей мере части пластин; и анализ образца в слое однородной толщины, пока пластины находятся в закрытой конфигурации.

В некоторых вариантах осуществления данный способ может предусматривать:

(a) получение образца ткани;

(b) получение первой и второй пластин, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации, где каждая пластина имеет поверхность для контакта с образцом, которая является практически плоской, одна или обе пластины являются гибкими, и одна или обе пластины содержат разделители, которые закреплены на соответствующей поверхности для контакта с образцом, и где разделители характеризуются:

i. предварительно заданной практически однородной высотой,

ii. формой столбика с практически однородным поперечным сечением и ровной верхней поверхностью;

iii. соотношением ширины и высоты, равным одному или больше;

iv. предварительно заданным постоянным расстоянием между разделителями, которое находится в диапазоне от 10 мкм до 200 мкм;

v. коэффициентом заполнения, равным 1% или больше; и

(c) размещение среза на одной или обеих пластинах, когда пластины приведены в открытую конфигурацию, где открытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, и пространство между пластинами не регулируется разделителями;

(d) после (с) применение двух пластин для сжатия по меньшей мере части среза в слой практически однородной толщины, которая ограничена поверхностями пластин для контакта с образцом, где однородная толщины слоя регулируется разделителями и пластинами и характеризуется средним значением в диапазоне от 1,8 мкм до 3 мкм с вариацией менее 10%, где сжатие предусматривает

сведение двух пластин вместе и

сдавливание с согласованием формы, или одновременно, или последовательно в области по меньшей мере одной из пластин со сдавливанием пластин вместе до закрытой конфигурации, где сдавливание с согласованием формы создает практически однородное давление на пластинах на протяжении по меньшей мере части образца, и сдавливание распространяется по меньшей мере в части образца горизонтально между поверхностями пластин для контакта с образцом, и где закрытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой пространство между пластинами в слое участка однородной толщины регулируется разделителями; и

(e) анализ среза в слое однородной толщины, пока пластины находятся в закрытой конфигурации;

где коэффициент заполнения представляет собой соотношение площади контакта с разделителем и общей площади пластины;

где сдавливание с согласованием формы представляет собой способ, который делает давление, прилагаемое на протяжении области, практически постоянным независимо от вариации формы наружных поверхностей пластин; и

где при одновременном сдавливании давление одновременно прилагается в отношении заданной области, а при последовательном сдавливании давление прилагается в отношении части заданной области и постепенно перемещается на другую область.

В некоторых вариантах осуществления данный способ может предусматривать снятие внешней силы после приведения пластин в закрытую конфигурацию; проведение визуализации клеток крови в слое однородной толщины, пока пластины находятся в закрытой конфигурации. Как отмечено выше, в данных вариантах осуществления расстояние между разделителями может варьировать в диапазоне от 20 мкм до 200 мкм или от 5 мкм до 20 мкм. В данных вариантах осуществления результат произведения коэффициента заполнения и модуля Юнга разделителя составляет 2 МПа или больше. В некоторых вариантах осуществления вариация поверхности составляет менее 30 нм.

В каком-либо из данных вариантов осуществления визуализация и подсчет могут быть проведены путем: i. освещения клеток в слое однородной толщины; ii. получения одного или более изображений клеток крови с применением ПЗС- или КМОП-сенсора.

В некоторых вариантах осуществления внешняя сила может обеспечиваться с помощью руки человека, например, путем придавливания с помощью пальца, как, например, большого пальца, или сжатия между большим пальцем и другим пальцем, таким как указательный палец, одной и той же руки.

В некоторых вариантах осуществления одна или более из пластин могут содержать сухой реагент, нанесенный на одну или обе пластины (например, средство для связывания, средство для окрашивания, средство для выявления или реагент для анализа).

В некоторых вариантах осуществления слой образца однородной толщины может характеризоваться однородностью толщины, составляющей не более +/-5%, например, не более+1-2% или не более +/-1%.

В некоторых вариантах осуществления разделители представляют собой столбики с формой поперечного сечения, выбранной из круглой, многоугольной, круговой, квадратной, прямоугольной, овальной, эллиптической или любой их комбинации.

Сжатый регулируемый открытый поток (CROF)

Во многих вариантах осуществления по настоящему изобретению осуществляют преобразование геометрического размера, местоположения, площадей контакта, а также смешивание образца и/или реагента с применением способа, обозначаемого как «сжатый регулируемый открытой поток (CROF)», и устройства, которое осуществляет CROF.

Термин «сжатый открытый поток (COF)» относится к способу, при котором изменяется форма жидкотекучего образца, размещенного на пластине, в результате (i) размещения другой пластины сверху по меньшей мере части образца и (ii) последующего сжатия образца между двумя пластинами в результате проталкивания двух пластин по направлению друг к другу; при этом сжатие уменьшает толщину по меньшей мере части образца и обеспечивает продвижение образца в открытое пространство между пластинами.

Термин «сжатый регулируемый открытый поток» или «CROF» (или «самокалибруемый сжатый открытый поток», или «SCOF», или «SCCOF») относится к определенному типу COF, где конечная толщина части или всего образца после сжатия «регулируется» разделителями, при этом разделители размещены между двумя пластинами.

Термин «конечная толщина части или всего образца регулируется разделителями» в CROF означает, что во время CROF, как только достигается определенная толщина образца, относительное движение двух пластин и, таким образом, изменение толщины образца останавливается, при этом определенная толщина определяется разделителем.

Один вариант осуществления способа CROF, как показано на фиг. 1, предусматривает:

(a) получение образца, который является жидкотекучим;

(b) получение первой пластины и второй пластины, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в различных конфигурациях, при этом каждая пластина имеет поверхность для контакта с образцом, которая является в значительной степени плоской, при этом одна или обе пластины содержат разделители, разделители характеризуются предварительно заданной высотой, и разделители находятся на соответствующей поверхности контакта с образцом;

(c) размещение образца на одной или обеих пластинах, когда пластины приведены в открытую конфигурацию; где открытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, и пространство между пластинами не регулируется разделителями; и

(d) после (с) распределение образца за счет перевода пластин в закрытую конфигурацию, где в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, при этом разделители и соответствующий объем образца находятся между пластинами, причем толщина подходящего объема образца регулируется пластинами и разделителями, где соответствующий объем составляет по меньшей мере часть или весь объем образца, и где во время распределения образца образец перетекает в горизонтальной проекции между двумя пластинами.

Термин «пластина» относится, если конкретно не указано иное, к пластине, используемой в процессе CROF, которая представляет собой твердое вещество, которое имеет поверхность, которую можно применять вместе с другой пластиной для сжатия образца, помещенного между двумя пластинами с целью снижения толщины образца.

Термины «пластины» или «пара пластин» относятся к двум пластинам в процессе

CROF.

Термины «первая пластина» или «вторая пластина» относятся к пластине, применяемой в процессе CROF.

Термин «пластины обращены друг к другу» относится к случаям, когда пара пластин располагается по меньшей мере частично относительно друг друга.

Термины «разделители» или «стопоры» относятся, если не указано иное, к механическим объектам, которые устанавливают, при помещении между двумя пластинами, границу минимального пространства между двумя пластинами, которое может достигаться при сжатии пластин вместе. А именно, при сжатии разделители будут останавливать относительное движение двух пластин для предупреждения того, чтобы пространство между пластинами становилось меньше предварительно установленного (т.е. предварительно заданного) значения. Существуют два типа разделителей: «разделители открытого типа» и «разделители ограждающего типа».

Термин «разделитель открытого типа» означает, что разделитель имеет форму, которая обеспечивает возможность перетекания жидкости вокруг всего периметра разделителя и перетекания за пределы разделителя. Например, столбик представляет собой разделитель открытого типа.

Термин «разделитель ограждающего типа» означает разделитель, имеющий форму, при которой жидкость не может перетекать вокруг всего периметра разделителя и не может перетекать за пределы разделителя. Например, разделитель кольцевой формы представляет собой разделитель ограждающего типа для жидкости внутри кольца, при этом жидкость внутри кольцевого разделителя остается внутри кольца и не может выходить наружу (за пределы периметра).

Термины «разделитель имеет предварительно определенную высоту» и «разделители имеют предварительно заданное расстояние между разделителями» означают, соответственно, что значение высоты разделителя и расстояние между разделителями известно перед процессом CROF. Они не являются предварительно заданными в том случае, если значение высоты разделителя и расстояния между разделителями не известно перед процессом CROF. Например, в случае, когда гранулы распыляют на пластине в виде разделителей, где гранулы размещаются на случайных местоположениях на пластине, расстояние между разделителями не является предварительно заданным. Другим примером не заданного предварительно расстояния между разделителями является то, что разделители движутся во время процессов CROF.

Термин «разделитель закреплен на своей соответствующей пластине» в процессе CROF означает, что разделитель прикреплен к местоположению пластины, и прикрепление к этому местоположению сохраняется во время CROF (т.е. местоположение разделителя на соответствующей пластине не изменяется). Примером того, что «разделитель закреплен на своей соответствующей пластине», является то, что разделитель выполнен монолитно в виде одной части материала с пластиной, и местоположение разделителя относительно поверхности пластины не меняется во время CROF. Примером того, что «разделитель не закреплен на своей соответствующей пластине», является то, что разделитель приклеен к пластине с помощью адгезива, однако в ходе применения пластины во время CROF адгезив не может удерживать разделитель в его исходном местоположении на поверхности пластины, и разделитель смещается от своего исходного местоположения на поверхности пластины.

Термин «разделитель закреплен на пластине монолитно» означает, что разделитель и пластина ведут себя как единая часть объекта, при этом во время применения разделитель не движется или не отделяется от своего исходного местоположения на пластине.

Термин «открытая конфигурация» двух пластин в процессе CROF означает конфигурацию, при которой две пластины либо частично, либо полностью отделены друг от друга, и пространство между пластинами не регулируется разделителями.

Термин «закрытая конфигурация» двух пластин в процессе CROF означает конфигурацию, при которой пластины обращены друг к другу, разделители и подходящий объем образца находятся между пластинами, толщина подходящего объема образца регулируется пластинами и разделителями, при этом подходящий объем составляет по меньшей мере часть всего объема образца.

Термин «толщина образца регулируется пластиной и разделителями» в процессе CROF означает, что для определенного состояния пластин, образца, разделителей и способа сжатия пластин толщину по меньшей мере части образца в закрытой конфигурации пластин можно предварительно задавать, исходя из свойств разделителей и пластины.

Термин «внутренняя поверхность» или «поверхность образца» пластины в устройстве для CROF относится к поверхности пластины, которая соприкасается с образцом, в то время как другая поверхность (которая не соприкасается с образцом) пластины называется «внешняя поверхность».

Термин «Х-пластина» устройства для CROF относится к пластине, которая содержит разделители, которые расположены на поверхности для образца у пластины, где разделители характеризуются предварительно заданным расстоянием между пластинами и высотой разделителей, и где по меньшей мере один из разделителей находится внутри области контакта с образцом.

Термин «устройство для CROF» относится к устройству, которое выполняет процесс CROF. Термин «подвергнут процессу CROF» означает, что используется процесс CROF. Например, термин «образец был подвергнут процессу CROF» означает, что образец был помещен внутрь устройства для CROF, был выполнен процесс CROF, и образец удерживали, если не указано иное, при конечной конфигурации CROF.

Термин «пластины для CROF» относится к двум пластинам, применяемым в ходе выполнения процесса CROF.

Термин «гладкость поверхности» или «вариация гладкости поверхности» плоской поверхности относится к среднему отклонению плоской поверхности от идеальной плоской поверхности на протяжении короткого расстояния, которое составляет приблизительно несколько микрометров или меньше. Гладкость поверхности отличается от вариации ровности поверхности. Плоская поверхность может характеризоваться хорошей ровностью поверхности, но неудовлетворительной гладкостью поверхности.

Термин «ровность поверхности» или «вариация ровности поверхности» плоской поверхности относится к среднему отклонению плоской поверхности от идеальной плоской поверхности на протяжении длинного расстояния, которое составляет приблизительно 10 мкм или больше. Вариация ровности поверхности отличается от гладкости поверхности. Плоская поверхность может характеризоваться хорошей гладкостью поверхности, но неудовлетворительной ровностью поверхности (т.е. высокой вариацией ровности поверхности).

Термин «относительная ровность поверхности» пластины или образца представляет собой соотношение вариации ровности поверхности пластины и конечной толщины образца.

Термин «конечная толщина образца» в процессе CROF относится, если не определено иное, к толщине образца при закрытой конфигурации пластин в процессе CORF.

Термин «способ сжатия» в CROF относится к способу, который приводит две пластины из открытой конфигурации в закрытую конфигурацию.

Термин «интересующая область» или «область, представляющая интерес» пластины относится к области пластины, которая соответствует функции, выполняемой пластинами.

Термин «не более» означает «равный или меньше». Например, если высота разделителя составляет не более 1 мкм, это означает, что высота разделителя равна 1 мкм или меньше.

Термин «площадь образца» означает площадь образца в направлении, примерно параллельном пространству между пластинами и перпендикулярному толщине образца.

Термин «толщина образца» относится к размеру образца в направлении, перпендикулярном к поверхности пластин, которые обращены друг к другу (например, направлению пространства между пластинами).

Термин «пространство между пластинами» относится к расстоянию между внутренними поверхностями двух пластин.

Термин «отклонение конечной толщины образца» в CROF означает разницу между предварительно заданной высотой разделителя (заданной при изготовлении разделителя) и средним значением конечной толщины образца, где средняя конечная толщина образца является усредненной в пределах определенной области (например, среднее из 25 различных точек (на расстоянии 4 мм) в пределах области 1,6 см на 1,6 см).

Термин «однородность измеренной конечной толщины образца» в процессе CROF означает стандартное отклонение измеренной конечной толщины образца в пределах определенной области образца (например, стандартное отклонение по отношению к среднему значению).

Термины «подходящий объем образца» и «подходящая площадь образца» в процессе CROF относятся, соответственно, к объему и площади части или всего объема образца, размещенного на пластинах во время процесса CROF, который соответствует функции, выполняемой с помощью подходящего способа или устройства, где функция включает без ограничения снижение времени связывания аналита или объекта, выявление аналитов, количественное определение аналитов, количественное определение объема, количественное определение концентрации, смешивание реагентов или контроль концентрации (аналитов, объекта или реагентов).

Термин «некоторые варианты осуществления», «в некоторых вариантах осуществления», «в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения», «вариант осуществления», «один вариант осуществления», «другой вариант осуществления», «определенные варианты осуществления», «многие варианты осуществления» и т.п. относится, если специально не указано иное, к варианту(вариантам) осуществления, который(которые) применим(применимы) ко всему раскрытию (т.е. ко всему настоящему изобретению).

Термины «высота» или «толщина» объекта в процессе CROF относятся, если специально не указано иное, к размеру объекта, который находится в направлении, перпендикулярном к поверхности пластины. Например, высота разделителей представляет собой размер разделителя в направлении, перпендикулярном к поверхности пластины, и высота разделителя и толщина разделителя означают одно и то же.

Термин «площадь» объекта в процессе CROF относится, если специально не указано иное, к площади объекта, которая параллельна поверхности пластины. Например, площадь разделителя представляет собой площадь разделителя, которая параллельна поверхности пластины.

Термин «горизонтальный» или «в горизонтальной проекции» в процессе CROF относится, если специально не указано иное, к направлению, которое является параллельным поверхности пластины.

Термин «ширина» разделителя в процессе CROF относится, если специально не указано иное, к размеру разделителя в горизонтальной проекции.

Термин «разделитель внутри образца» означает, что разделитель окружен образцом (например, разделитель-столбик находится внутри образца).

Термин «размах критического изгиба» пластины в процессе CROF относится к размаху (т.е. расстоянию) пластины между двумя опорами, при котором изгиб пластины в случае определенной гибкой пластины, образца и силы сжатия, равен допустимому изгибу. Например, если допустимый изгиб составляет 50 нм и размах критического изгиба составляет 40 мкм для определенной гибкой пластины, образца и силы сжатия, то изгиб пластины между двумя соседними разделителями, расположенными на расстоянии 40 мкм, будет составлять 50 нм, и изгиб будет составлять менее 50 нм, если два соседних разделителя расположены на расстоянии менее 40 мкм.

Термин «жидкотекучий» в случае образца означает, что в том случае, если толщина образца снижается, то размер в горизонтальной проекции увеличивается. Например, образец кала считается жидкотекучим.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения образец в условиях процесса CROF не должен быть жидкотекучим для того, чтобы иметь преимущество в результате процесса, до тех пор, пока толщину образца можно снижать в условиях процесса CROF. Например, для окрашивания ткани путем помещения красителя на поверхность пластины для CROF с помощью процесса CROF можно снижать толщину ткани и, следовательно, ускорять время инкубации до насыщения в случае окрашивания красителем.

1. Снижение (укорочение) связывания или времени смешивания (X) При выполнении анализов или других химических реакций желательным является уменьшение времени инкубации/реакции. Например, при анализах иммобилизации поверхности, где целевой аналит в образце выявляют в результате захвата средствами для захвата, иммобилизованными на поверхности пластины (т.е. твердой фазе), часто желательно иметь короткое время инкубации до насыщения для захвата целевых аналитов в образце или иммобилизации средств для захвата в растворе на поверхности пластины, или и то, и другое. Другим примером является потребность в укорочении времени нанесения средства для захвата на поверхность пластины. Другим примером является потребность в укорочении времени смешивания реагента в образце.

Настоящее изобретение предусматривает способы и устройство, которые снижают (т.е. сокращают) время инкубации до насыщения, необходимое для связывания объекта в образце с участком связывания на твердой поверхности (т.е. время для связывания объекта из объема с поверхностью). Другим аспектом настоящего изобретения является снижение времени, необходимого для связывания объекта, хранящегося на поверхности пластины, с участком связывания на поверхности другой пластины (т.е. времени для связывания объекта из одной поверхности с другой поверхностью). Другим аспектом настоящего изобретения является снижение времени, необходимого для добавления/смешивания реагента, хранящегося на поверхности, к объему/с объемом образца (т.е. времени для добавления/смешивания реагента с поверхности с объемом образца).

Настоящее изобретение предусматривает снижение времени инкубации до насыщения при связывании и/или смешивании в анализе с применением устройств и способов, с помощью которых распределяют образец (или жидкость) до более тонкой толщины, снижая тем самым время диффузии объекта через толщину образца. Время диффузии объекта в материале (например, жидком, твердом или полутвердом) пропорционально квадрату расстояния диффузии, поэтому снижение толщины образца может снизить расстояние диффузии, приводя к значительному снижению времени диффузии и времени инкубации до насыщения. Более тонкая толщина (например, плотное замкнутое пространство) также повышает частоту столкновений объекта с другими объектами в материале, дополнительно усиливая связывание и смешивание. Средства в настоящем изобретении также делают снижение толщины образца точным, однородным, быстрым, простым (меньше стадий обработки) и применимым для снижения толщины образца до микрометров или нанометров. Настоящее изобретения имеет значительную применимость при быстрой, недорогой РоС-диагностике и химическом/биологическом анализе. Несколько вариантов осуществления настоящего изобретения представлены на фиг. 1-4.

1.1. Снижение времени инкубации до насыщения при связывании объекта в образце с участком связывания на твердой поверхности за счет снижения толщины образца

X1. Способ снижения времени инкубации до насыщения при связывании целевого объекта в образце с участком связывания поверхности пластины, как показано на фиг.1-2, 3а и 4а, который предусматривает:

(a) получение образца, который является жидкотекучим и содержит целевой объект, который способен к диффузии в образце;

(b) получение первой пластины и второй пластины, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации, где первая пластина имеет на своей поверхности участок связывания, который выполнен с возможностью связывания с целевым объектом, где одна или обе пластины содержат разделители, и каждый из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине и имеет предварительно заданную высоту;

(c) размещение образца на одной или обеих пластинах, когда пластины приведены в открытую конфигурацию; где открытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой две

пластины или полностью, или частично отделены друг от друга, и пространство между пластинами не регулируется разделителями;

(d) после (с) распределение образца за счет перевода пластин в закрытую конфигурацию, где в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, при этом разделители и подходящий объем образца находятся между пластинами, причем участок связывания находится в контакте с подходящим объемом, а толщина подходящего объема образца регулируется с помощью пластин и разделителей, и она тоньше максимальной толщины образца, когда пластины находятся в открытой конфигурации;

где подходящий объем представляет собой часть или весь объем образца; и

где сниженная толщина образца снижает время инкубации до насыщения при связывании целевого объекта в подходящем объеме с участком связывания.

В случае определенного объема образца CROF снижает толщину образца, но увеличивает размер образца в горизонтальной проекции. В настоящем изобретении этот факт применяется для осуществления (а) локального связывания или смешивания в части образца и (b) мультиплексирования множественного связывания или смешивания участков без жидкостного барьера для жидкостного разделения образца на различные карманы с отделением жидкостей.

Х2. Устройство для снижения времени инкубации до насыщения при связывании целевого объекта в подходящем объеме образца с поверхностью, как показано на фиг.1-2, 3а и 4а, которое содержит:

первую пластину и вторую пластину, которые (а) являются перемещаемыми относительно друг друга в различных конфигурациях, (b) каждая пластина имеет площадь контакта с образцом для приведения в контакт образца, который имеет целевой объект, в подходящем объеме образца, (с) одна из пластин имеет участок связывания, который связывает целевой объект, и (d) по меньшей мере одна из пластин содержит разделители, которые имеют предварительно определенное расстояние между разделителями и высоту и закреплены на своей соответствующей поверхности, при этом по меньшей мере один из разделителей находится внутри площади контакта с образцом;

где одна из конфигураций представляет собой открытую конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, и пространство между пластинами не регулируется разделителями,

где другая из конфигураций представляет собой закрытую конфигурацию, в которую приводят после размещения образца в открытой конфигурации; и в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители и подходящий объем образца находятся между пластинами, участок связывания находится в контакте с подходящим объемом, и толщину подходящего объема образца регулируют с помощью пластин и разделителей, и она является тоньше, чем максимальная толщина образца, когда пластины находятся в открытой конфигурации; где подходящий объем представляет собой часть или весь объем образца; и где сниженная толщина образца снижает время инкубации до насыщения в случае связывания целевого объекта в подходящем объеме с участком связывания.

1.2. Снижение времени инкубации до насыщения при связывании объекта, хранящегося на поверхности одной пластины, с участком связывания на поверхности другой пластины

Х3. Способ снижения времени инкубации до насыщения при связывании объекта, хранящегося на участке хранения одной пластины, с соответствующим участком связывания на другой пластине, как показано на фиг.1, 3с и 4b, который предусматривает:

(a) получение первой пластины и второй пластины, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации, где поверхность первой пластины имеет участок связывания; а поверхность второй пластины имеет участок хранения, который содержит объект, подлежащий связыванию с участком связывания; где площадь участка связывания и площадь участка хранения меньше площади соответствующих пластин; и где одна или обе пластины содержат разделители, и каждый из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине и имеет предварительно заданную высоту;

(b) получение передающей среды, где объект на участке хранения способен растворяться в передающей среде и диффундировать в передающей среде;

(c) размещение, когда пластины приведены в открытую конфигурацию, передающей среды на одной или обеих пластинах; где открытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой две пластины частично или полностью отделены друг от друга, и пространство между пластинами не регулируется разделителями;

(d) после (с) распределение передающей среды за счет перевода пластин в закрытую конфигурацию, где в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители, участок связывания, участок хранения и по меньшей мере часть передающей среды находятся между пластинами, участок связывания и участок хранения находятся по меньшей мере частично на поверхности друг друга, передающая среда контактирует с по меньшей мере частью участка связывания и участка хранения, толщина передающей среды регулируется пластинами и разделителями, и она является более тонкой, чем максимальная толщина передающей среды в том случае, когда пластины находятся в открытой конфигурации;

где сниженная толщина передающей среды снижает время связывания объекта, хранящегося на второй пластине, с участком связывания на первой пластине.

Х4. Устройство для снижения времени инкубации до насыщения при связывании объекта, хранящегося на участке хранения одной пластины, с участком связывания на другой пластине, как показано на фиг.1, 3с и 4b, содержащее:

первую пластину и вторую пластину, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации, где поверхность первой пластины имеет участок связывания; и поверхность второй пластины имеет участок хранения, который содержит объект, подлежащий связыванию с участком связывания; где площадь участка связывания и площадь участка хранения являются меньшими, чем соответствующие пластины; и где одна или обе пластины содержат разделители, и каждый из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине и имеет предварительно заданную высоту;

где одна из конфигураций представляет собой открытую конфигурацию, при которой две пластины либо частично, либо полностью отделены друг от друга, пространство между пластинами не регулируется разделителями, а передающая среду может размещаться на одной или обеих пластинах, где объект на участке хранения способен растворяться в передающей среде и диффундировать в передающей среде,

где другая из конфигураций представляет собой закрытую конфигурацию, в которую приводят после размещения передающей среды в открытой конфигурации; и в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители, участок связывания, участок хранения и по меньшей мере часть передающей среды находятся между пластинами, участок связывания и участок хранения находятся по меньшей мере частично на поверхности друг друга, передающая среда контактирует с по меньшей мере частью участка связывания и участка хранения, толщина передающей среды регулируется пластинами и разделителями, и она является более тонкой, чем максимальная толщина передающей среды в том случае, когда пластины находятся в открытой конфигурации;

где сниженная толщина передающей среды снижает время инкубации до насыщения при связывании объекта на участке хранения второй пластины с участком связывания первой пластины.

В способе по пункту Х3 и устройстве по пункту Х4, в некоторых вариантах осуществления передающая среда содержит жидкость, которая обеспечивает диффузию объекта или реагента или обоих.

В способе по пункту Х3 и устройстве по пункту Х4 в некоторых вариантах осуществления передающая среда представляет собой образец, где образец содержит аналит (также называемый целевой аналит), который связывается с участком связывания.

В способе по пункту Х3 и устройстве по пункту Х4 в некоторых вариантах осуществления передающая среда представляет собой образец, где образец содержит аналит (также называемый целевой аналит), который связывается с участком связывания, и реагент представляет собой средство для выявления, которое связывается с аналитом.

1.3. Снижение времени добавления (смешивания) реагента, хранящегося на поверхности, в образец жидкости

Для многих анализов требуется добавление реагентов в образец (в том числе жидкость). Зачастую необходимо контролировать концентрацию реагентов, добавляемых в образец или жидкость. Существуют потребности в новых способах для осуществления добавления таких реагентов и контроля их концентрации, которые являются простыми и/или низкозатратными. Два примера, при которых требуется добавление реагентов, представляют собой (а) подсчет эритроцитов, где антикоагулянт и/или реагент(реагенты) для окрашивания можно добавить в образец крови, и (b) иммунологические анализы, где средства для выявления добавляют для связывания целевого аналита в растворе.

Один аспект настоящего изобретения предусматривает способы, устройства и системы, которые делают добавление реагента и контроль концентрации реагента простыми и/или низкозатратными. В одном варианте осуществления настоящего изобретения слой реагента (например, слой высушенного реагента) вначале наносят на поверхность пластины в устройстве для CROF, а затем образец размещают в устройство для CROF, и в ходе способа CROF образец приводится в контакт с реагентом, и при этом толщина образца тоньше толщины в случае, когда образец находится при открытой конфигурации пластин для CROF. За счет снижения толщины образца будет снижаться время диффузии, за которое реагент диффундирует с поверхности в весь образец, и, следовательно, снижается время смешивания реагента с образцом.

Х5. Способ уменьшения времени смешивания реагента, хранящегося на поверхности пластины, в образце, как показано на фиг.1, 3b и 4с, предусматривающий:

(a) получение первой пластины и второй пластины, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации, где первая пластина имеет на своей поверхности участок хранения, который содержит реагенты, подлежащие добавлению в образец, и при этом реагенты способны растворяться в образце и диффундировать в образце; и где одна или обе пластины содержат разделители, и каждый из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине и имеет предварительно определенную высоту;

(b) получение образца;

(c) размещение образца на одной или обеих пластинах, когда пластины приведены в открытую конфигурацию; где открытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, и пространство между пластинами не регулируется разделителями;

(d) после (с) распределение образца за счет перевода пластин в закрытую конфигурацию, где в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители, участок хранения и по меньшей мере часть образца находятся между пластинами, образец контактирует с по меньшей мере частью участка хранения, толщину образца на участке хранения регулируют с помощью пластин и разделителей, и она является тоньше, чем максимальная толщина образца, когда пластины находятся в открытой конфигурации;

где сниженная толщина образца снижает время смешивания реагентов на участке хранения с образцом.

В способе по пункту Х5 пока пластины находятся в закрытой конфигурации, дополнительно предусмотрена стадия инкубации, где время инкубации выбрано таким образом, что она приводит к тому, что значительное количество реагентов, растворимых в образце, содержится в подходящем объеме образца, где подходящий объем представляет собой объем образца, который располагается на участке связывания, а инкубация представляет собой процесс, который обеспечивает возможность растворения и диффузии реагента в образце.

В способе по пункту Х5 после (d) и пока пластины находятся в закрытой конфигурации, дополнительно предусмотрена стадия, на которой инкубация проводится в течение времени, равного или меньше времени, кратного времени диффузии реагента в образце через толщину образца, регулируемой пластинами при закрытой конфигурации, а затем инкубация прекращается; при этом инкубация обеспечивает возможность диффузии реагента в образце; и при этом коэффициент составляет 0,0001, 0,001, 0,01, 0,1, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 100, 1000, 10000 или находится в диапазоне между любыми из этих значений. Например, если коэффициент составляет 1,1, а время диффузии составляет 20 секунд, то время инкубации равно 22 секундам или меньше. В одном предпочтительном варианте осуществления коэффициент составляет 0,1, 1, 1,5 или находится в диапазоне между любыми из этих значений.

Х6. Устройство для снижения времени добавления реагента, хранящегося на поверхности пластины, в образце, как показано на фиг.1, 3b и 4с, которое содержит:

первую пластину и вторую пластину, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации, где первая пластина имеет на своей поверхности участок хранения, который содержит реагенты, подлежащие добавлению в образец, при этом реагенты способны растворяться в образце и диффундировать в образце; и где одна или обе пластины содержат разделители, и каждый из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине и имеет предварительно заданную высоту;

где одна из конфигураций представляет собой открытую конфигурацию, в которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, пространство между пластинами не регулируется разделителями, и образец размещен на одной или обеих пластинах;

где другая из конфигураций представляет собой закрытую конфигурацию, в которую приводят после размещения передающей среды в открытой конфигурации; и в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители, участок хранения и по меньшей мере часть образца находятся между пластинами, образец контактирует с по меньшей мере частью участка хранения, толщину образца на участке хранения регулируют с помощью пластин и разделителей, и она является тоньше, чем максимальная толщина образца в случае, когда пластины находятся в открытой конфигурации;

где сниженная толщина образца снижает время смешивания реагентов на участке хранения с образцом.

В способе или устройствах по любому из пунктов X1-6 в некоторых вариантах осуществления подходящий объем образца представляет собой объем образца, который размещается на (т.е. на поверхности) участке связывания или участке хранения.

В способе или устройствах по любому из пунктов Х1-6 в некоторых вариантах осуществления подходящий объем образца представляет собой объем образца, который размещается на (т.е. на поверхности) всей площади или части площади участка связывания или участка хранения.

В способе или устройствах по любому из пунктов X1-6 в некоторых вариантах осуществления соотношение размера в горизонтальной проекции участка связывания или участка хранения и толщины образца при закрытой конфигурации составляет 1,5 3 или больше, 3 или больше, 5 или больше, 10 или больше, 20 или больше, 30 или больше, 50 или больше, 100 или больше, 200 или больше, 1000 или больше, 10000 или больше или находится в диапазоне между любыми двумя из этих значений.

В способе или устройствах по любому из пунктов X1-6 соотношение размера в горизонтальной проекции участка связывания или участка хранения и толщины образца при закрытой конфигурации составляет от 3 до 20 в предпочтительном варианте осуществления, от 20 до 100 в другом предпочтительном варианте осуществления, и от 100 до 1000 в другом предпочтительном варианте осуществления и от 1000 до 10000 в другом предпочтительном варианте осуществления.

В способе по любому из пунктов X1 и Х3 в некоторых вариантах осуществления конечная сниженная толщина образца является значимо меньшей, чем у площади участка связывания, поэтому объекту в площади образца, который находится за пределами участка связывания, понадобится больше времени, чтобы связаться с участком связывания. При надлежащем выборе времени инкубации объект, который связывается с участками связывания, будет преимущественно представлять собой объект в объеме образца, который размещается на участке связывания (т.е. в объеме образца, который находится прямо над областью связывания). Тогда расчет концентрации объекта в образце будет основан на толщине образца и площади участка связывания.

В способе по пункту Х5 в некоторых вариантах осуществления конечная сниженная толщина образца значительно меньше площади участка хранения, так что объекту

в области образца, который находится за пределами участка связывания, потребуется больше времени, чтобы связаться с участком связывания. При надлежащем выборе времени инкубации объект, который связывается с участками связывания, будет преимущественно представлять собой объект в объеме образца, который размещается на участке связывания (т.е. в объеме образца, который находится прямо над областью связывания). Тогда расчет концентрации объекта в образце будет основан на толщине образца и площади участка связывания.

В способе по любому из пунктов Х2, Х4, Х6 дополнительно предусмотрено устройство для сжатия, которое приводит пластины из открытой конфигурации в закрытую конфигурацию. В некоторых вариантах осуществления устройство для сжатия представляет собой один вариант осуществления или любую их комбинацию, описанные в настоящем изобретении.

В способе по любому из пунктов Х2, Х4, Х6 дополнительно предусмотрено устройство для сжатия, которое приводит пластины из открытой конфигурации в закрытую конфигурацию, и устройство для удерживания, которое выполнено с возможностью удерживания пластин в закрытой конфигурации. В некоторых вариантах осуществления устройство для удерживания представляет собой один вариант осуществления или любую их комбинацию, описанные в настоящем изобретении.

В способе по любому из пунктов Х2, Х4, Х6 дополнительно предусмотрено устройство для сжатия, которое приводит пластины из открытой конфигурации в закрытую конфигурацию, и устройство для удерживания, которое разработано с возможностью удерживания пластин в закрытой конфигурации в течение времени, составляющего 0,001 с или меньше, 0,01 с или меньше, 0,1 с или меньше, 1 с или меньше, 5 с или меньше, 10 с или меньше, 20 с или меньше, 30 с или меньше, 40 с или меньше, 1 мин. или меньше, 2 мин. или меньше, 3 мин. или меньше, 5 мин. или меньше, 10 мин. или меньше, 20 мин. или меньше, 30 мин. или меньше, 60 мин. или меньше, 90 мин. или меньше, 120 мин. или меньше, 180 мин. или меньше, 250 мин. или меньше или находящегося в диапазоне между любыми двумя из этих значений.

В способе по любому из пунктов Х2, Х4, Х6 дополнительно предусмотрено устройство для сжатия, которое приводит пластины из открытой конфигурации в закрытую конфигурацию, и устройство для удерживания, которое выполнено с возможностью удерживания пластин в закрытой конфигурации в течение времени, составляющего в предпочтительном варианте осуществления 0,001 с или меньше, 0,01 с или меньше, 0,1 с или меньше, 1 с или меньше, 5 с или меньше, 10 с или меньше, 20 с или меньше, 30 с или меньше, 40 с или меньше, 1 мин. или меньше, 2 мин. или меньше, 3 мин. или меньше или находящегося в диапазоне между любыми двумя из этих значений.

Конечная толщина образца. Конечная толщина образца в закрытой конфигурации пластин может быть значительным фактором в снижении времени инкубации до насыщения. Конечная толщина после снижения толщины/деформации, в зависимости от свойств объекта и образцов, а также применений, обсуждается по отношению к регулируемому промежутку между пластинами.

В некоторых вариантах осуществления конечная толщина образца составляет менее приблизительно 0,5 мкм (микрометра), менее приблизительно 1 мкм, менее приблизительно 1,5 мкм, менее приблизительно 2 мкм, менее приблизительно 4 мкм, менее приблизительно 6 мкм, менее приблизительно 8 мкм, менее приблизительно 10 мкм, менее приблизительно 12 мкм, менее приблизительно 14 мкм, менее приблизительно 16 мкм, менее приблизительно 18 мкм, менее приблизительно 20 мкм, менее приблизительно 25 мкм, менее приблизительно 30 мкм, менее приблизительно 35 мкм, менее приблизительно 40 мкм, менее приблизительно 45 мкм, менее приблизительно 50 мкм, менее приблизительно 55 мкм, менее приблизительно 60 мкм, менее приблизительно 70 мкм, менее приблизительно 80 мкм, менее приблизительно 90 мкм, менее приблизительно 100 мкм, менее приблизительно 110 мкм, менее приблизительно 120 мкм, менее приблизительно 140 мкм, менее приблизительно 160 мкм, менее приблизительно 180 мкм, менее приблизительно 200 мкм, менее приблизительно 250 мкм, менее приблизительно 300 мкм, менее приблизительно 350 мкм, менее приблизительно 400 мкм, менее приблизительно 450 мкм, менее приблизительно 500 мкм, менее приблизительно 550 мкм, менее приблизительно 600 мкм, менее приблизительно 650 мкм, менее приблизительно 700 мкм, менее приблизительно 800 мкм, менее приблизительно 900 мкм, менее приблизительно 1000 мкм (1 мм), менее приблизительно 1,5 мм, менее приблизительно 2 мм, менее приблизительно 2,5 мм, менее приблизительно 3 мм, менее приблизительно 3,5 мм, менее приблизительно 4 мм, менее приблизительно 5 мм, менее приблизительно 6 мм, менее приблизительно 7 мм, менее приблизительно 8 мм, менее приблизительно 9 мм, менее приблизительно 10 мм или находиться в диапазоне между любыми двумя из этих значений.

В определенных вариантах осуществления конечная толщина образца в закрытой конфигурации составляет менее 0,5 мкм (микрон), менее 1 мкм, менее 5 мкм, менее 10 мкм, менее 20 мкм, менее 30 мкм, менее 50 мкм, менее 100 мкм, менее 200 мкм, менее 300 мкм, менее 500 мкм, менее 800 мкм, менее 200 мкм, менее 1 мм (миллиметр), менее 2 мм (миллиметров), менее 4 мм (миллиметров), менее 8 мм (миллиметров) или находится в диапазоне между любыми двумя из этих значений.

В определенных вариантах осуществления Q-способы делают конечную толщину образца однородной, и в них применяют плоские поверхности первой пластины и второй пластины.

В настоящем изобретении инкубацию образца выполняют при различных температурах, влажности, газовой среде и различной продолжительности во времени, со встряхиванием или без встряхивания.

Время инкубации. В способе по любому из пунктов XI и ХЗ после (d) и пока пластины находятся в закрытой конфигурации, дополнительно предусмотрена стадия, на которой инкубация проводится в течение времени, равного или меньше времени, кратного времени диффузии объекта в образце, диффундирующего через толщину образца, регулируемой пластинами при закрытой конфигурации, а затем инкубация прекращается; где инкубация обеспечивает возможность связывания объекта с участком связывания; и при этом коэффициент составляет 0,0001, 0,001, 0,01, 0,1, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 100, 1000, 10000 или находится в диапазоне между любыми из этих значений. Например, если коэффициент составляет 1,1, а время диффузии составляет 20 секунд, то время инкубации равно 22 секундам или меньше. В одном предпочтительном варианте осуществления коэффициент составляет 0,1, 1, 1,5 или находится в диапазоне между любыми из этих значений.

В способе по пункту Х5 после (d) и пока пластины находятся в закрытой конфигурации, дополнительно предусмотрена стадия, на которой инкубация проводится в течение времени, равного или меньше времени, кратного времени диффузии реагентов, диффундирующих через толщину образца, регулируемой пластинами при закрытой конфигурации, а затем инкубация прекращается; где инкубация обеспечивает возможность связывания объекта с участком связывания; и при этом коэффициент составляет 0,0001, 0,001, 0,01, 0,1, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 100, 1000, 10000 или находится в диапазоне между любыми из этих значений. Например, если коэффициент составляет 1,1, а время диффузии составляет 20 секунд, то время инкубации равно 22 секундам или меньше. В одном предпочтительном варианте осуществления коэффициент составляет 0,1, 1, 1,5 или находится в диапазоне между любыми из этих значений.

Способ по любому из пунктов X1, Х3 и Х5 или устройство по любому из пунктов Х2, Х4 и Х6, где по меньшей мере один из разделителей находится внутри площади контакта с образцом.

Способ по любому из пунктов X1, Х3 и Х5 или устройство по любому из пунктов Х2, Х4 и Х6, где разделители имеют предварительно определенное расстояние между разделителями.

В способе по любому из пунктов X1, Х3, Х5, пока пластины находятся в закрытой конфигурации, дополнительно предусмотрена стадия инкубации, время инкубации до насыщения при сниженной толщине образца составляет 0,001 с или меньше, 0,01 с или меньше, 0,1 с или меньше, 1 с или меньше, 5 с или меньше, 10 с или меньше, 20 с или меньше, 30 с или меньше, 40 с или меньше, 1 мин. или меньше, 2 мин. или меньше, 3 мин. или меньше, 5 мин. или меньше, 10 мин. или меньше, 20 мин. или меньше, 30 мин. или меньше, 60 мин. или меньше, 90 мин. или меньше, 120 мин. или меньше, 180 мин. или меньше, 250 мин. или меньше или находится в диапазоне между любыми двумя из этих значений.

В способе по любому из пунктов X1, Х3, Х5 время инкубации до насыщения при сниженной толщине образца в закрытой конфигурации составляет 0,001 с или меньше, 0,01 с или меньше, 0,1 с или меньше, 1 с или меньше, 5 с или меньше, 10 с или меньше, 20 с или меньше, 30 с или меньше, 40 с или меньше, 1 мин. или меньше, 2 мин. или меньше, 3 мин. или меньше, 5 мин. или меньше, 10 мин. или меньше, 20 мин. или меньше, 30 мин. или меньше, 60 мин. или меньше, 90 мин. или меньше, 120 мин. или меньше, 180 мин. или меньше, 250 мин. или меньше или находится в диапазоне между любыми двумя из этих значений.

В некоторых вариантах осуществления средства для захвата сначала иммобилизуют на участке связывания, затем образец приводят в контакт с участком связывания и объект в образце захватывается средствами для захвата и, наконец, добавляют средства для выявления, подлежащие связыванию с захваченным объектом, и сигнал от средств для выявления будут считывать (например, с помощью оптических способов, электрических способов или их комбинации). В некоторых вариантах осуществления кроме средств для захвата и средств для выявления добавляют другие реагенты (например, блокирующее средство).

Во многих вариантах применения, таких как РоС, желательно иметь простые и/или недорогие устройства и способы для добавления дополнительных реагентов в образец. Один аспект настоящего изобретения связан с простыми и/или недорогими устройствами и способами для добавления дополнительных реагентов в образец. Добавляемые дополнительные реагенты включают средства для выявления, блокирующие средства, усилители светового сигнала, гасители светового сигнала или другие. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения процессы анализа контролируются за счет применения различного времени высвобождения реагентов, хранящихся в одном и том же местоположении. Различного времени высвобождения можно достичь за счет добавления других материалов, которые имеют различную скорость растворения.

В определенных вариантах осуществления концентрацию реагента, смешиваемого с образцом, можно контролировать путем контроля толщины образца (например, контроля отношения толщины образца к области участка хранения и/или времени смешивания).

2. Пластины, разделители, деления шкал, регуляция толщины образца

2.1. Конфигурации пластин и регуляция толщины образца

Открытая конфигурация. В некоторых вариантах осуществления в открытой конфигурации две пластины (т.е. первая пластина и вторая пластина) отделены друг от друга. В определенных вариантах осуществления две пластины имеют одну сторону, соединенную вместе, во время всех операций с пластинами (в том числе открытой и закрытой конфигурации), при этом две пластины открываются и закрываются подобно книге. В некоторых вариантах осуществления две пластины имеют прямоугольную (или квадратную) форму, и две стороны прямоугольника соединены вместе во время всех операций с пластинами.

В некоторых вариантах осуществления открытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой пластины находятся далеко друг от друга, вследствие чего образец размещается на одной пластине из пары без препятствия в виде другой пластины из пары.

В некоторых вариантах осуществления открытая конфигурация предусматривает конфигурацию, при которой пластины размещены далеко друг от друга, вследствие чего образец размещается непосредственно на одной пластине, как если бы другая пластина не существовала.

В некоторых вариантах осуществления открытая конфигурация предусматривает конфигурацию, при которой пара пластин отделена друг от друга расстоянием, составляющим по меньшей мере 10 нм, по меньшей мере 100 нм, по меньшей мере 1000 нм, по меньшей мере 0,01 см, по меньшей мере 0,1 см, по меньшей мере 0,5 см, по меньшей мере 1 см, по меньшей мере 2 см или по меньшей мере 5 см или находящимся в диапазоне между любыми двумя из этих значений.

В некоторых вариантах осуществления открытая конфигурация предусматривает конфигурацию, при которой пара пластин ориентирована в различных направлениях. В некоторых вариантах осуществления открытая конфигурация предусматривает конфигурацию, которая определяет промежуток доступа между парой пластин, в которую они приводятся для осуществления добавления образца.

В некоторых вариантах осуществления открытая конфигурация предусматривает конфигурацию, где каждая пластина имеет поверхность контакта с образцом, и где по меньшей мере одна из поверхностей контакта у пластин является не покрытой, когда пластины находятся в открытой конфигурации.

Закрытая конфигурация и регуляция толщины образца. В настоящем изобретении закрытая конфигурация двух пластин представляет собой конфигурацию, при которой пространство (т.е. расстояние) между внутренними поверхностями двух пластин регулируется разделителями между двумя пластинами. Поскольку внутренние поверхности (также называемые «поверхность для образца») пластин находятся в контакте с образцом во время стадии сжатия процесса CROF, то при закрытой конфигурации толщина образца регулируется с помощью разделителей.

Во время процесса перевода пластин из открытой конфигурации в закрытую конфигурацию пластины обращены друг к другу (по меньшей мере часть пластин обращена друг к другу), и при этом для перевода двух пластин вместе прилагают силу. Если две пластины приводят из открытой конфигурации в закрытую конфигурацию, то внутренние поверхности двух пластин сжимают образец, размещенный на пластине(пластинах) в целях снижения толщины образца (при этом образец имеет открытый поток в боковом направлении между пластинами), а толщину подходящего объема образца определяют с помощью разделителей, пластин и способа, который предполагается применять, а также механического/жидкостного свойства образца. Толщину при закрытой конфигурации можно предварительно задавать для определенного образца и определенных разделителей, пластин и способа сдавливания пластин.

Термины «регуляция пространства между внутренними поверхностями пластин с помощью разделителей», или «регуляция толщины образца с помощью пластин и разделителя», или «толщина образца регулируется с помощью разделителей и пластин» означают, что толщина образца в процессе CROF задается с помощью определенных пластин, разделителей, образца и способа сдавливания.

В некоторых вариантах осуществления регулируемая толщина образца при закрытой конфигурации является такой же, как и высота разделителя; в этом случае при закрытой конфигурации разделители непосредственно контактируют с обеими пластинами (при одна пластина представляет собой пластину, на которой закреплен разделитель, а другая пластина представляет собой пластину, которая приводится в контакт с разделителем).

В определенных вариантах осуществления регулируемая толщина образца при закрытой конфигурации больше, чем высота разделителя; в этом случае при закрытой конфигурации разделители непосредственно контактируют только с пластиной, на которой разделители закреплены или присоединены к ее поверхности, и опосредованно контактируют с другой пластиной (т.е. опосредованный контакт). Термин «опосредованный контакт» с пластиной означает, что разделитель и пластина отделены за счет тонкого слоя образца, который называется «остаточным слоем образца», а его толщина называется «остаточной толщиной». В случае определенных разделителей и пластин, определенного способа сдавливания пластин и определенного образца остаточная толщина может быть предварительно заданной (предварительно заданный означает перед достижением закрытой конфигурации), что приводит к предварительному заданию толщины образца при закрытой конфигурации. Это происходит благодаря тому, что остаточный слой является одинаковым в случае определенных условий (образца, разделителей, пластин и силы сдавливания) и его можно предварительно калибровать и/или рассчитывать. Регулируемая толщина образца примерно равна высоте разделителя вместе с остаточной толщиной образца.

Во многих вариантах осуществления размер и форма столбиков являются предварительно охарактеризованными (т.е. предварительно заданными) перед их применением. Информацию о предварительно заданных параметрах применяют для проведения в дальнейшем анализа, такого как определение объема образца (или подходящего объема) и т.д.

В некоторых вариантах осуществления регулирование толщины образца включает применение замыкающей силы (силы сжатия) в отношении пластин для поддержания пространства между пластинами.

В некоторых вариантах осуществления регулирование толщины образца включает установление пространства между пластинами с помощью разделителей, замыкающая сила применяется к пластинам и физическим свойствам образца, и необязательно при этом физические свойства образца включают по меньшей мере одно из вязкости и сжимаемости.

2.2. Пластины

В настоящем изобретении, как правило, пластины CROF изготовлены из любого материала, который (i) способен применяться для регуляции, совместно с разделителями, толщины части или всего объема образца и (ii) не имеет значительных побочных эффектов по отношению к образцу, анализу или цели, которую предполагается осуществить с помощью пластин. Однако в некоторых вариантах осуществления для достижения определенных целей для пластины применяют конкретные материалы (что связано с их свойствами).

В некоторых вариантах осуществления две пластины характеризуются одинаковыми или различными параметрами в случае каждого из следующих параметров: материал пластины, толщина пластины, форма пластины, площадь пластины, гибкость пластины, свойства поверхности пластины и оптическая прозрачность пластины.

Материалы пластин. Пластины изготавливают из одного материала, композитных материалов, нескольких материалов, многослойных материалов, сплавов или их комбинации. Каждый из материалов для пластины представляет собой неорганический материал, органический материал или смесь, где примеры материалов представлены в пунктах Mat-1 и Mat-2.

Mat-1. Неорганические материалы для пластин включают без ограничения стекло, кварц, оксиды, диоксид кремния, нитрид кремния, оксид гафния (HfO), оксид алюминия (AIO), полупроводники: (кремний, GaAs, GaN и т.д.), металлы (например, золото, серебро, медь, алюминий, Ti, Ni и т.д.), керамические материалы или любые композиции из них.

Mat-2. Органические материалы для разделителей включают без ограничения полимеры (например, пластмассы) или аморфные органические материалы. Полимерные материалы для разделителей включают без ограничения акрилатные полимеры, виниловые полимеры, олефиновые полимеры, целлюлозные полимеры, нецеллюлозные полимеры, сложнополиэфирные полимеры, нейлон, циклический олефиновый сополимер (СОС), поли(метилметакрилат) (РММА), поликарбонат (PC), циклический олефиновый полимер (СОР), жидкокристаллический полимер (LCP), полиамид (РА), полиэтилен (РЕ), полиимид (PI), полипропилен (РР), простой поли(фенилэфир) (РРЕ), полистирол (PS), полиоксиметилен (РОМ), простой полиэфирный эфир оксикетона (РЕЕК), простой полиэфирсульфон (PES), поли(этиленфталат) (PET), политетрафторэтилен (PTFE), поливинилхлорид (PVC), поливинилиденфторид (PVDF), полибутилентерефталат (РВТ), фторированный этилен-пропилен (FEP), перфторалкоксиалкан (PFA), полидиметилсилоксан (PDMS), резины или любые их комбинации.

В некоторых вариантах осуществления каждая из пластин независимо изготовлена по меньшей мере из одного из стекла, пластмассы, керамического материала и металла. В некоторых вариантах осуществления каждая пластина независимо включает по меньшей мере одно из стекла, пластмассы, керамического материала и металла.

В некоторых вариантах осуществления одна пластина отличается от другой пластины площадью в горизонтальной проекции, толщиной, формой, материалами или обработкой поверхности. В некоторых вариантах осуществления одна пластина является такой же, как и другая пластина, по площади в горизонтальной проекции, толщине, форме, материалам или обработке поверхности.

Материалы для пластин являются жесткими, гибкими или характеризуются любой гибкостью между этими двумя состояниями. Жесткость (т.е. неэластичность) или гибкость определяются относительно определенных сил сдавливания, применяемых при переводе пластин в закрытую конфигурацию.

В некоторых вариантах осуществления выбор жесткой или гибкой пластины определяют, исходя из требований контроля однородности толщины образца при закрытой конфигурации.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна из двух пластин является прозрачной (для света). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере часть или несколько частей одной пластины или обеих пластин являются прозрачными. В некоторых вариантах осуществления пластины являются непрозрачными.

Толщина пластин. В некоторых вариантах осуществления средняя толщина для по меньшей мере одной из пластин составляет 2 нм или меньше, 10 нм или меньше, 100 нм или меньше, 500 нм или меньше, 1000 нм или меньше, 2 мкм (микрона) или меньше, 5 мкм или меньше, 10 мкм или меньше, 20 мкм или меньше, 50 мкм или меньше, 100 мкм или меньше, 150 мкм или меньше, 200 мкм или меньше, 300 мкм или меньше, 500 мкм или меньше, 800 мкм или меньше, 1 мм (миллиметр) или меньше, 2 мм или меньше, 3 мм или меньше или находится в диапазоне между любыми двумя из этих значений.

В некоторых вариантах осуществления средняя толщина для по меньшей мере одной из пластин составляет не более 3 мм (миллиметров), не более 5 мм, не более 10 мм, не более 20 мм, не более 50 мм, не более 100 мм, не более 500 мм или находится в диапазоне между любыми двумя из этих значений.

В некоторых вариантах осуществления толщина пластины не является однородной на всем протяжении пластины. Применение различной толщины пластин в разных местоположениях можно применять для контроля изгиба пластины, сворачивания, регуляции толщины образца и т.д.

Форма и площадь пластин. Как правило, пластины могут иметь любые формы, при условии, что форма обеспечивает сжатие открытого потока образца и регуляцию толщины образца. Однако в определенных вариантах осуществления может быть предпочтительной определенная форма. Форма пластины может быть круглой, эллиптической, в виде прямоугольников, в виде треугольников, в виде многоугольников, кольцевой или представлять любые наложения из этих форм.

В некоторых вариантах осуществления две пластины могут иметь одинаковый размер или форму или могут отличаться. Площадь пластин зависит от применения. Площадь пластины составляет не более 1 мм2 (квадратного миллиметра), не более 10 мм2, не более 100 мм2, не более 1 см2 (квадратного сантиметра), не более 5 см2, не более 10 см2, не более 100 см2, не более 500 см2, не более 1000 см2, не более 5000 см2, не более 10000 см2 или свыше 10000 см2 или находится в любом диапазоне между любыми двумя из этих значений. Форма пластины может быть прямоугольной, квадратной, круглой или другой.

В определенных вариантах осуществления по меньшей мере одна из пластин имеет форму полоски (или ленты), которая характеризуется шириной, толщиной и длиной. Ширина составляет не более 0,1 см (сантиметра), не более 0,5 см, не более 1 см, не более 5 см, не более 10 см, не более 50 см, не более 100 см, не более 500 см, не более 1000 см или находится в диапазоне между любыми двумя из этих значений. Длина может быть такой, как требуется. Полоска может быть свернута в рулон.

Ровность поверхности пластины. Во многих вариантах осуществления внутренняя поверхность пластин является ровной или в значительной степени ровной, плоской. В определенных вариантах осуществления две внутренние поверхности расположены в закрытой конфигурации параллельно друг другу. Ровные внутренние поверхности облегчают количественное определение и/или контроль толщины образца просто путем применения предварительно заданной высоты разделителей при закрытой конфигурации. В случае внутренних поверхностей пластины, не являющихся ровными, для количественного определения и/или контроля толщины образца при закрытой конфигурации необходимо знать не только высоту разделителя, но также точную топологию внутренней поверхности. Для определения топологии поверхности необходимы дополнительные измерения и/или поправки, которые могут быть сложными, затратными по времени и дорогостоящими.

Ровность поверхности пластины является относительной по отношению к конечной толщине образца (конечная толщина образца представляет собой толщину в закрытой конфигурации) и часто характеризуется термином «относительная ровность поверхности», которая представляет собой соотношение вариации ровности поверхности пластины и конечной толщине образца.

В некоторых вариантах осуществления относительная поверхность составляет менее 0,01%, 0,1%, менее 0,5%, менее 1%, менее 2%, менее 5%, менее 10%, менее 20%, менее 30%, менее 50%, менее 70%, менее 80%, менее 100% или находится в диапазоне между любыми двумя из этих значений.

Параллельность поверхности пластин. В некоторых вариантах осуществления две поверхности пластины являются значительно параллельными друг другу. В определенных вариантах осуществления две поверхности пластины не являются параллельными друг другу.

Гибкость пластин. В некоторых вариантах осуществления пластина является гибкой в условиях сжатия процесса CROF. В некоторых вариантах осуществления обе пластины являются гибкими в условиях сжатия процесса CROF. В некоторых вариантах осуществления одна пластина является жесткой, а другая пластина является гибкой в условиях сжатия процесса CROF. В некоторых вариантах осуществления обе пластины являются жесткими. В некоторых вариантах осуществления обе пластины являются гибкими, однако имеют разную гибкость.

Оптическая прозрачность пластин. В некоторых вариантах осуществления пластина является оптически прозрачной. В некоторых вариантах осуществления обе пластины являются оптически прозрачными. В некоторых вариантах осуществления одна пластина является оптически прозрачной, а другая пластина является непрозрачной. В некоторых вариантах осуществления обе пластины являются непрозрачными. В некоторых вариантах осуществления обе пластины являются прозрачными, однако имеют различную оптическую прозрачность. Оптическая прозрачность пластины относится к части или всей площади пластины.

Свойства смачивания поверхности. В некоторых вариантах осуществления пластина имеет внутреннюю поверхность, которая смачивает (т.е. угол смачивания составляет менее 90 градусов) образец, передающую жидкость или и то, и другое. В некоторых вариантах осуществления обе пластины имеют внутреннюю поверхность, которая смачивается образцом, передающей жидкостью или обоими; при этом смачиваемость является либо одинаковой, либо различной. В некоторых вариантах осуществления пластина имеет внутреннюю поверхность, которая смачивает образец, передающую жидкость или и то, и другое; и другая пластина имеет внутреннюю поверхность, которая не смачивает (т.е. угол смачивания равен или более 90 градусов). Смачивание внутренней стороны пластины относится к части или всей площади пластины.

В некоторых вариантах осуществления внутренняя поверхность пластины имеет другие нано- или микроструктуры для контроля горизонтального потока образца во время CROF. Нано- или микроструктуры включают без ограничения каналы, насосы и т.д. Нано- или микроструктуры также применяются для контроля свойств смачивания внутренней поверхности.

2.3. Разделители

Функция разделителей. В настоящем изобретении разделители выполнены с возможностью получения одной или любых комбинаций следующих функций и свойств: разделители выполнены с возможностью (1) контроля вместе с пластинами толщины образца или подходящего объема образца (предпочтительно контроль толщины является точным или однородным, или и то, и другое, на подходящей площади); (2) обеспечения сжатого регулируемого открытого потока (CROF) образца на поверхности пластины; (3) не занимания значительной площади (объема) поверхности в определенной площади (объеме) образца; (4) снижения или повышения эффекта осаждения частиц или аналитов в образце; (5) изменения и/или контроля свойств смачивания внутренней поверхности пластин; (6) идентификации местоположения на пластине, масштаба размера и/или информации, связанной с пластиной, или (7) выполнения любой комбинации из вышеуказанного.

Дизайн и формы разделителей. Для достижения желательного снижения и контроля толщины образца в определенных вариантах осуществления разделители прикрепляют к соответствующей пластине. Как правило, разделитель может иметь любую форму, при условии, что разделители способны регулировать толщину образца во время процесса CROF, однако предпочтительными являются формы для достижения определенных функций, таких как повышенная однородность, меньшее превышение сдавливания и т.д.

Разделитель(разделители) представляет(представляют) собой одиночный разделитель или множество разделителей (например, массив). В некоторых вариантах осуществления множество разделителей представляет собой массив из разделителей (например, столбиков), при этом расстояние между разделителями является периодическим или непериодическим, или является периодическим или непериодическим в определенных областях пластин, или они характеризуются разными расстояниями в разных областях пластин.

Существует два вида разделителей: разделители открытого типа и разделители ограждающего типа. Разделитель открытого типа представляет собой разделитель, который позволяет образцу протекать через разделитель (т.е. образец протекает вокруг и проходит мимо разделителя. Например, разделителем является стойка), а разделитель ограждающего типа представляет собой разделитель, который останавливает поток образца (т.е. образец не может перетекать за пределы разделителя. Например, разделитель имеет кольцевую форму, а образец находится внутри кольца.). В обоих типах разделителей применяют их высоту для регуляции конечной толщины образца при закрытой конфигурации.

В некоторых вариантах осуществления разделители представляют собой только разделители открытого типа. В некоторых вариантах осуществления разделители представляют собой только разделители ограждающего типа. В некоторых вариантах осуществления разделители представляют собой комбинацию разделителей открытого типа и разделителей ограждающего типа.

Термин «разделитель-столбик» означает, что разделитель имеет форму столбика, и разделитель-столбик относится к объекту, который характеризуется высотой и формой в горизонтальной проекции, которые обеспечивают возможность протекания образца вокруг него во время сжатого открытого потока.

В некоторых вариантах осуществления виды формы в горизонтальной проекции у разделителей-столбиков представляют собой форму, выбранную из группы, состоящей из (i) круглой, эллиптической, прямоугольной, треугольной, многоугольной, кольцевой, звездообразной, формы в виде букв (например, L-образной, С-образной, в виде букв от А до Z), формы в виде цифр (например, формы, подобной 0, 1, 2, 3, 4, …до 9); (ii) форм из группы (i) по меньшей мере с одним закругленным углом; (iii) формы из группы (i) с зигзагообразными или шероховатыми краями и (iv) любого наложения (i), (ii) и (iii). В случае нескольких разделителей различные разделители могут иметь различную форму в горизонтальной проекции, а также размер и различное расстояние от соседних разделителей.

В некоторых вариантах осуществления разделители могут представлять собой и/или могут включать стойки, столбики, гранулы, сферы и/или другие подходящие геометрические фигуры. Форма и размер в горизонтальной проекции (т.е. пересечение с соответствующей поверхностью пластины) разделителей могут быть любыми, за исключением следующих ограничений в определенных вариантах осуществления: (i) геометрические характеристики разделителя не будут обусловливать значительную ошибку в измерении толщины и объема образца; или (ii) геометрические характеристики не будут препятствовать вытеканию образца между пластинами (т.е. они не имеют ограждающую форму). Однако в некоторых вариантах осуществления требуется, чтобы некоторые разделители представляли собой разделители закрытого типа для ограничения потока образца.

В некоторых вариантах осуществления формы разделителей имеют закругленные углы. Например, разделитель в форме прямоугольника имеет один, несколько или все закругленные углы (подобно кругу, вместо угла, равного 90 градусов). Круглый угол зачастую облегчает изготовление разделителя, а в некоторых случаях он меньше повреждает биологических материал.

Боковая стенка столбиков может быть прямой, кривой, наклоненной или иметь различную форму в различных участках боковой стенки. В некоторых вариантах осуществления разделители представляют собой столбики, имеющие различные формы в горизонтальной проекции, боковые стенки и отношение высоты столбика к площади столбика в горизонтальной проекции.

В предпочтительном варианте осуществления разделители имеют форму столбиков, которая обеспечивает возможность открытого потока.

Материалы разделителей. В настоящем изобретении разделители, как правило, изготовлены из любого материала, который способен применяться вместе с двумя пластинами для регуляции толщины подходящего объема образца. В некоторых вариантах осуществления материалы для разделителей отличаются от материалов для пластин. В некоторых вариантах осуществления материалы для разделителей являются по меньшей мере такими же, как часть материалов по меньшей мере одной пластины.

Разделители изготавливают из одного материала, композитных материалов, нескольких материалов, многослойных материалов, сплавов или их комбинации. Каждый из материалов для разделителей представляет собой неорганический материал, органический материал или смесь, где примеры материалов представлены в пунктах Mat-1 и Mat-2. В предпочтительном варианте осуществления разделители изготовлены из того же материала, что и пластина, применяемая в CROF.

Механическая прочность и гибкость разделителей. В некоторых вариантах осуществления механическая прочность разделителей является достаточно сильной, таким образом, во время сжатия и в закрытой конфигурации пластин высота разделителей является такой же или в значительной степени такой же, как и таковая в случае, когда пластины находятся в открытой конфигурации. В некоторых вариантах осуществления различия разделителей между открытой конфигурацией и закрытой конфигурацией могут быть охарактеризованными и предварительно определенными.

Материал для разделителей является жестким, гибким или характеризуется любой гибкостью между этими двумя состояниями. Жесткость является относительной для получения сил сдавливания, применяемых для приведения пластин в закрытую конфигурацию: если разделитель не деформируется более чем на 1% по своей высоте в условиях силы сдавливания, то материал разделителя считается жестким, в противном случае гибким. Если разделитель изготовлен из гибкого материала, то конечная толщина образца при закрытой конфигурации все еще может быть предварительно заданной, исходя из силы сдавливания и механических свойств разделителя.

Разделитель внутри образца. Для достижения желательного контроля и снижения толщины образца, в частности, для достижения высокой однородности толщины образца в определенных вариантах осуществления разделители помещают внутри образца или подходящего объема образца. В некоторых вариантах осуществления существует один или более разделителей внутри образца или подходящего объема образца с надлежащим расстоянием между разделителями. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере один из разделителей находится внутри образца, по меньшей мере двое из разделителей находятся внутри образца или подходящего объема образца, или по меньшей мере «n» разделителей находятся внутри образца или подходящего объема образца, где «n» можно определить с помощью однородности толщины образца или необходимого свойства потока образца во время CROF.

Высота разделителей. В некоторых вариантах осуществления все разделители имеют одинаковую предварительно заданную высоту. В некоторых вариантах осуществления разделители имеют различную предварительно заданную высоту. В некоторых вариантах осуществления разделители могут быть разделены на группы или области, где каждая группа или область имеет свою собственную высоту разделителя. В определенных вариантах осуществления предварительно определенная высота разделителей представляет собой среднюю высоту разделителей. В некоторых вариантах осуществления разделители имеют примерно одинаковую высоту. В некоторых вариантах осуществления процент числа разделителей имеет одинаковую высоту.

Высоту разделителей выбирают с помощью желательной регулируемой конечной толщины образца и остаточной толщины образца. Высота разделителя (предварительно определенная высота разделителя) и/или толщина образца составляет 3 нм или меньше, 10 нм или меньше, 50 нм или меньше, 100 нм или меньше, 200 нм или меньше, 500 нм или меньше, 800 нм или меньше, 1000 нм или меньше, 1 мкм или меньше, 2 мкм или меньше, 3 мкм или меньше, 5 мкм или меньше, 10 мкм или меньше, 20 мкм или меньше, 30 мкм или меньше, 50 мкм или меньше, 100 мкм или меньше, 150 мкм или меньше, 200 мкм или меньше, 300 мкм или меньше, 500 мкм или меньше, 800 мкм или меньше, 1 мм или меньше, 2 мм или меньше, 4 мм или меньше или находится в диапазоне между любыми двумя из этих значений.

Высота разделителя и/или толщина образца составляет от 1 нм до 100 нм в одном предпочтительном варианте осуществления, от 100 нм до 500 нм в другом предпочтительном варианте осуществления, от 500 нм до 1000 нм в отдельном предпочтительном варианте осуществления, от 1 мкм (т.е. 1000 нм) до 2 мкм в другом предпочтительном варианте осуществления, от 2 мкм до 3 мкм в отдельном предпочтительном варианте осуществления, от 3 мкм до 5 мкм в другом предпочтительном варианте осуществления, от 5 мкм до 10 мкм в отдельном предпочтительном варианте осуществления, от 10 мкм до 50 мкм в другом предпочтительном варианте осуществления и от 50 мкм до 100 мкм в отдельном предпочтительном варианте осуществления.

В некоторых вариантах осуществления высота разделителя и/или толщина образца (i) равны или немного больше минимального размера аналита или (ii) равны или немного больше максимального размера аналита. «Немного больше» означает от приблизительно 1% до 5% и больше и составляет любое число между этими двумя значениями.

В некоторых вариантах осуществления высота разделителя и/или толщина образца больше минимального размера аналита (например, аналит имеет анизотропную форму), однако меньше максимального размера аналита.

Например, эритроцит имеет форму диска с минимальным размером 2 мкм (толщина диска) и максимальным размером 11 мкм (диаметр диска). В одном варианте осуществления настоящего изобретения разделители выбирают с целью получения промежутка между внутренними поверхностями пластин в соответствующей области, составляющего 2 мкм (равного минимальному размеру) в одном варианте осуществления, 2,2 мкм в другом варианте осуществления или 3 мкм (на 50% больше, чем минимальный размер) в другом варианте осуществления, однако меньшего, чем максимальный размер эритроцита. Такой вариант осуществления имеет определенные преимущества при подсчете клеток крови. В одном варианте осуществления в случае подсчета эритроцитов в результате получения промежутка между внутренними поверхностями 2 или 3 мкм и любого числа между этими двумя значениями образец неразбавленной цельной крови заключается в промежуток, в среднем каждый эритроцит (RBC) не перекрывается другими, способствуя точному подсчету эритроцитов визуально. (Слишком много перекрытий между RBC может вызывать серьезные ошибки при подсчете).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения пластины и разделители применяются для регуляции не только толщины образца, но также ориентации и/или плотности распределения по поверхности аналитов/объектов в образце, когда пластины находятся в закрытой конфигурации. Если пластины находятся в закрытой конфигурации, то меньшая толщина образца приводит к меньшему количеству аналитов/объектов на площадь поверхности (т.е. к меньшей концентрации на поверхности).

Размер в горизонтальной проекции разделителя. В случае разделителя открытого типа размеры в горизонтальной проекции могут характеризоваться их размером в горизонтальной проекции (иногда называемого шириной) по оси х и у - двух ортогональных направлениях. Размер разделителя в горизонтальной проекции в каждом направлении является одинаковым или различным. В некоторых вариантах осуществления размер в горизонтальной проекции для каждого направления (х или у) представляет собой ….

В некоторых вариантах осуществления соотношение размеров в горизонтальной проекции х и размера у составляет 1, 1,5, 2, 5, 10, 100, 500, 1000, 10000 или находится в диапазоне между любыми двумя из этих значений. В некоторых вариантах осуществления другое соотношение используется для регуляции направления движения образца; чем больше соотношение, тем больше поток направляется вдоль одного направления (направления большего размера).

В некоторых вариантах осуществления применяют разделители с разными размерами в горизонтальной проекции в направлении оси х и у, чтобы (а) применять разделители в виде масштабных меток для указания ориентации пластин, (b) применять разделители для создания большего потока образца в предпочтительном направлении, или и для того, и для другого.

В предпочтительном варианте осуществления период, ширина и высота.

В некоторых вариантах осуществления все разделители имеют одинаковую форму и размеры. В некоторых вариантах осуществления каждый разделитель имеет отличающиеся размеры в горизонтальной проекции.

В случае разделителей ограждающего типа в некоторых вариантах осуществления внутреннюю форму и размер в горизонтальной проекции выбирают, исходя из общего объема образца, подлежащего ограничению с помощью разделителя(разделителей) ограждающего типа, где размер объема был описан в настоящем изобретении; и в определенных вариантах осуществления внешнюю форму и размер в горизонтальной проекции выбирают, исходя из силы, необходимой для сдерживания давления жидкости в направлении разделителя и давления сжатия, которое обеспечивает сдавливание пластин.

Аспектовое соотношение высоты и среднего размера в горизонтальной проекции разделителя-столбика.

В определенных вариантах осуществления аспектовое соотношение высоты и среднего размера в горизонтальной проекции разделителя-столбика составляет 100000, 10000, 1000, 100, 10, 1, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001, 0,00001 или находится в диапазоне между любыми двумя из этих значений.

Прецизионность высоты разделителей. Высоту разделителей можно контролировать точно. Относительная прецизионность разделителя (т.е. соотношение отклонения и желательной высоты разделителя) составляет 0,001% или меньше, 0,01% или меньше, 0,1% или меньше; 0,5% или меньше, 1% или меньше, 2% или меньше, 5% или меньше, 8% или меньше, 10% или меньше, 15% или меньше, 20% или меньше, 30% или меньше, 40% или меньше, 50% или меньше, 60% или меньше, 70% или меньше, 80% или меньше, 90% или меньше, 99,9% или меньше или находится в диапазоне между любыми из этих значений.

Расстояние между разделителями. Разделители могут представлять собой одиночный разделитель или множество разделителей на пластине или в подходящей области образца. В некоторых вариантах осуществления разделители на пластинах приведены в конфигурацию и/или упорядочены в форме массива, и массив является периодическим, непериодическим или периодическим в некоторых местоположениях пластины, в то же время являясь непериодическим в других местоположениях.

В некоторых вариантах осуществления периодический массив из разделителей имеет решетку со структурой в виде квадрата, прямоугольника, треугольника, шестиугольника, многоугольника или любой их комбинации, где комбинация означает, что различные местоположения пластины имеют различные решетки разделителей.

В некоторых вариантах осуществления расстояние между разделителями в массиве из разделителей является периодическим (т.е. однородным расстоянием между разделителями) по меньшей мере в одном направлении массива. В некоторых вариантах осуществления расстояние между разделителями приведено в конфигурацию в целях улучшения однородности между промежутком между пластинами при закрытой конфигурации.

Расстояние между соседними разделителями (т.е. расстояние между разделителями) составляет 1 мкм или меньше, 5 мкм или меньше, 10 мкм или меньше, 20 мкм или меньше, 30 мкм или меньше, 40 мкм или меньше, 50 мкм или меньше, 60 мкм или меньше, 70 мкм или меньше, 80 мкм или меньше, 90 мкм или меньше, 100 мкм или меньше, 200 мкм или меньше, 300 мкм или меньше, 400 мкм или меньше или находится в диапазоне между любыми двумя из этих значений.

В определенных вариантах осуществления расстояние между разделителями составляет 400 мкм или меньше, 500 мкм или меньше, 1 мм или меньше, 2 мм или меньше, 3 мм или меньше, 5 мм или меньше, 7 мм или меньше, 10 мм или меньше или находится в любом диапазоне между этими значениями. В определенных вариантах осуществления расстояние между разделителями составляет 10 мм или меньше, 20 мм или меньше, 30 мм или меньше, 50 мм или меньше, 70 мм или меньше, 100 мм или меньше или находится в любом диапазоне между этими значениями.

Расстояние между соседними разделителями (т.е. расстояние между разделителями) выбирают таким образом, чтобы для определенных свойств пластин и образца, в закрытой конфигурации пластин, вариация толщины образца между двумя соседними разделителями составляла в некоторых вариантах осуществления не более 0,5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 80% или находилась в любом другом диапазоне между значениями; или в определенных вариантах осуществления не более 80%, 100%, 200%, 400% или в диапазоне между любыми двумя из этих значений.

Очевидно, что для поддержания определенной вариации толщины образца между двумя соседними разделителями в случае применения более гибкой пластины требуется меньшее расстояние между разделителями.

- Необходимо определить точность расстояния между разделителями.

В предпочтительном варианте осуществления разделитель представляет собой периодический массив из квадратов, где разделитель представляет собой столбик, который имеет высоту от 2 до 4 мкм, средний размер в горизонтальной проекции от 5 до 20 мкм и пространство между разделителями от 1 мкм до 100 мкм.

В предпочтительном варианте осуществления разделитель представляет собой периодический массив из квадратов, где разделитель представляет собой столбик, который имеет высоту от 2 до 4 мкм, средний размер в горизонтальной проекции от 5 до 20 мкм и пространство между разделителями от 100 мкм до 250 мкм.

В предпочтительном варианте осуществления разделитель представляет собой периодический массив из квадратов, где разделитель представляет собой столбик, который имеет высоту от 4 до 50 мкм, средний размер в горизонтальной проекции от 5 до 20 мкм и пространство между разделителями от 1 мкм до 100 мкм.

В предпочтительном варианте осуществления разделитель представляет собой периодический массив из квадратов, где разделитель представляет собой столбик, который имеет высоту от 4 до 50 мкм, средний размер в горизонтальной проекции от 5 до 20 мкм и пространство между разделителями от 100 мкм до 250 мкм.

Интервал в массиве разделителей составляет от 1 нм до 100 нм в одном предпочтительном варианте осуществления, от 100 нм до 500 нм в другом предпочтительном варианте осуществления, от 500 нм до 1000 нм в отдельном предпочтительном варианте осуществления, от 1 мкм (т.е. 1000 нм) до 2 мкм в другом предпочтительном варианте осуществления, от 2 мкм до 3 мкм в отдельном предпочтительном варианте осуществления, от 3 мкм до 5 мкм в другом предпочтительном варианте осуществления, от 5 мкм до 10 мкм в отдельном предпочтительном варианте осуществления, от 10 мкм до 50 мкм в другом предпочтительном варианте осуществления, от 50 мкм до 100 мкм в отдельном предпочтительном варианте осуществления, от 100 мкм до 175 мкм в отдельном предпочтительном варианте осуществления и от 175 до 300 мкм в отдельном предпочтительном варианте осуществления.

Плотность разделителей. Разделители упорядочены на соответствующих пластинах при плотности распределения по поверхности, составляющей более одного на мкм², более одного на 10 мкм², более одного на 100 мкм², более одного на 500 мкм², более одного на 1000 мкм², более одного на 5000 мкм², более одного на 0,01 мм², более одного на 0,1 мм², более одного на 1 мм², более одного на 5 мм², более одного на 10 мм², более одного на 100 мм², более одного на 1000 мм², более одного на 10000 мм² или в диапазоне между любыми двумя из этих значений.

(3) разделители выполнены с возможностью не занимать значительную площадь (объем) поверхности в определенной площади (объеме) образца;

Соотношение объема разделителя и объема образца. Во многих вариантах осуществления соотношение объема разделителя (т.е. объема разделителя) и объема образца (т.е. объему образца) и/или соотношение объема разделителей, которые находятся внутри подходящего объема образца, и подходящего объема образца контролируют для достижения определенных преимуществ. Преимущества включают без ограничения контроль однородности толщины образца, однородность аналитов, свойства потока образца (например, скорость потока, направление потока и т.д.).

В определенных вариантах осуществления соотношение объема разделителя г) и объема образца и/или соотношение объема разделителей, которые находятся внутри подходящего объема образца, и подходящего объема образца, составляет менее 100%, не более 99%, не более 70%, не более 50%, не более 30%, не более 10%, не более 5%, не более 3%, не более 1%, не более 0,1%, не более 0,01%, не более 0,001% или находится в диапазоне между любыми из этих значений.

Разделители, закрепленные на пластинах. Расстояние между разделителями и ориентация разделителей, которые играют ключевую роль в настоящем изобретении, предпочтительно сохраняются во время процесса перевода пластин из открытой конфигурации в закрытую конфигурацию, и/или предпочтительно они являются предварительно заданными перед процессом перевода из открытой конфигурации в закрытую конфигурацию.

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения предусматривают, что разделители закреплены на одной из пластин перед переводом пластин в закрытую конфигурацию. Термин «разделитель закреплен на своей соответствующей пластине» означает, что разделитель прикреплен к пластине и прикрепление сохраняется во время применения пластины. Примером того, что «разделитель закреплен на своей соответствующей пластине», является то, что разделитель выполнен монолитно в виде одной части материала пластины и положение разделителя относительно поверхности пластины не меняется. Примером того, что «разделитель не закреплен на своей соответствующей пластине», является то, что разделитель приклеен к пластине с помощью адгезивного средства, однако во время применения пластины адгезивное средство не может удерживать разделитель в его исходном местоположении на поверхности пластины (т.е. разделитель перемещается со своего исходного местоположения на поверхности пластины).

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине. В определенных вариантах осуществления два разделителя закреплены на своих соответствующих пластинах. В определенных вариантах осуществления большинство из разделителей закреплены на своих соответствующих пластинах. В определенных вариантах осуществления все из разделителей закреплены на своих соответствующих пластинах.

В некоторых вариантах осуществления разделитель закреплен на пластине монолитно.

В некоторых вариантах осуществления разделители закреплены на своей соответствующей пластине с помощью одного или любой комбинации из следующих способов и/или конфигураций: присоединены, связаны, слиты, впечатаны и вытравлены.

Термин «впечатанный» означает, что разделитель и пластина закреплены монолитно с помощью впечатывания (например, тиснения) участка материала с образованием разделителя на поверхности пластины. Материал может представлять собой один слой материала или несколько слоев материала.

Термин «вытравленный» означает, что разделитель и пластина прикреплены монолитно путем травления участка материала с образованием разделителя на поверхности пластины. Материал может представлять собой один слой материала или несколько слоев материала.

Термин «слитый» означает, что разделитель и пластина закреплены монолитно за счет прикрепления разделителя и пластины вместе, при этом исходные материалы для разделителя и пластины слиты друг с другом, и имеется явная граница материала между двумя материалами после слияния.

Термин «связанный» означает, что разделитель и пластина закреплены монолитно за счет связывания разделителя и пластины путем адгезии.

Термин «прикрепленный» означает, что разделитель и пластина соединены вместе.

В некоторых вариантах осуществления разделители и пластина изготовлены из одинаковых материалов. В другом варианте осуществления разделители и пластина изготовлены из разных материалов. В другом варианте осуществления разделитель и пластина образуются в виде одной части. В другом варианте осуществления один конец разделителя закреплен на своей соответствующей пластине, при этом конец открыт для приспособления к различным конфигурациям двух пластин.

В другом варианте осуществления каждый из разделителей независимо по меньшей мере прикреплен, связан, слит, впечатан или вытравлен в соответствующей пластине. Термин «независимо» означает, что один разделитель закреплен на своей соответствующей пластине с помощью такого же или отличающегося способа, который выбран из способов, связанных с прикреплением, связыванием, слиянием, впечатыванием и травлением в соответствующей пластине.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере расстояние между двумя разделителями является предварительно заданным («предварительно заданное расстояние между разделителями» означает, что расстояние известно, когда потребитель применяет пластины.).

В некоторых вариантах осуществления всех способов и устройств, описанных в данном документе, кроме закрепленных разделителей имеются дополнительные разделители.

Специфическая толщина образца. В настоящем изобретении было замечено, что большей удерживающей силы в отношении пластин (т.е. силы, которая удерживает две пластины вместе) можно достичь путем применения более маленького пространства между пластинами (для определенной площади образца) или большей площади образца (для определенного пространства между пластинами), или обоих.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна из пластин является прозрачной в участке, охватывающем соответствующую область, каждая пластина имеет внутреннюю поверхность, приведенную в конфигурацию с целью контакта с образцом в закрытой конфигурации; внутренние поверхности пластин в значительно степени параллельны друг другу в закрытой конфигурации; внутренние поверхности пластин в значительно степени плоские, помимо местоположений, которые имеют разделители; или любая их комбинация.

2.4. Конечная толщина и однородность образца

В некоторых вариантах осуществления в значительной степени ровный определяется относительно конечной толщины образца и характеризуется в зависимости от вариантов осуществления и применений отношением к толщине образца, составляющим менее 0,1%, менее 0,5%, менее 1%, менее 2%, менее 5% или менее 10% или находится в диапазоне между любыми двумя из этих значений.

В некоторых вариантах осуществления ровность по отношению к толщине образца может составлять менее 0,1%, менее 0,5%, менее 1%, менее 2%, менее 5%, менее 10%, менее 20%, менее 50% или менее 100% или находится в диапазоне между любыми двумя из этих значений.

В некоторых вариантах осуществления в значительной степени ровный может означать, что сама вариация ровности поверхности (измеренная на основе средней толщины) составляет менее 0,1%, менее 0,5%, менее 1%, менее 2%, менее 5% или менее 10% или находится в диапазоне между любыми двумя из этих значений. Как правило, ровность по отношению к толщине пластины может составлять менее 0,1%, менее 0,5%, менее 1%, менее 2%, менее 5%, менее 10%, менее 20%, менее 50% или менее 100% или находится в диапазоне между любыми двумя из этих значений.

2.5. Способы изготовления разделителей

Разделители могут быть изготовлены на пластине с помощью множества путей, с применением литографии, травления, тиснения (наноимпринтинга), нанесений, взрывной литографии, слияния или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления непосредственно проводят оттиск разделителей или впечатывают их на пластинах. В некоторых вариантах осуществления разделители впечатывают в материал (например, пластмассы), который размещают на пластинах. В определенных вариантах осуществления разделители изготавливают непосредственно с помощью тиснения на поверхности пластины для CROF. Наноимпринтинг можно выполнять с помощью технологии «рулон за рулоном» с применением роллерного импринтера или наносить путем плоскостного наноимпринтинга. Такой процесс имеет большое экономическое преимущество и, следовательно, снижает стоимость.

В некоторых вариантах осуществления разделители размещают на пластинах. Размещение может представлять собой испарение, пастирование или взрывную литографию. При пастировании разделитель изготавливают вначале на носителе, затем разделитель переносят от носителя к пластине. При взрывной литографии подлежащий удалению материал вначале размещают на пластине и создают отверстия в материале; низ отверстия ориентируют к поверхности пластины и затем материал разделителя размещают в отверстие и после этого подлежащий удалению материал удаляют, оставляя лишь разделители на поверхности пластины. В некоторых вариантах осуществления разделители, размещенные на пластине, сливаются с пластиной. В некоторых вариантах осуществления разделитель и пластины изготавливают в одном процессе. Один процесс включает впечатывание (например, тиснение, формование) или синтез.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере два разделителя закреплены на соответствующей пластине за счет различных способов изготовления, и необязательно при этом различные способы изготовления включают по меньшей мере одно из размещения, связывания, слияния, впечатывания и травления.

В некоторых вариантах осуществления один или более разделителей закреплены на соответствующей пластине(соответствующих пластинах) за счет способа изготовления, предусматривающего связывание, слияние, впечатывание или травление или любую их комбинацию.

В некоторых вариантах осуществления способы изготовления для образования таких монолитных разделителей на пластине включают способ, связанный со связыванием, слиянием, впечатыванием или травлением или любой их комбинацией.

2.6. Масштабные метки

Термин «масштабная метка(масштабные метки)» относится к масштабной метке(масштабным меткам), которая(которые) способны облегчить количественное определение (например, измерение размеров) или контроль подходящей области и/или относительного объема образца. В некоторых вариантах осуществления масштабные метки находятся на первой пластине или второй пластине, на обеих пластинах, на одной поверхности пластины, на обеих поверхностях пластины, между пластинами, возле пластин или любой их комбинации. В некоторых вариантах осуществления масштабные метки закреплены на первой пластине или второй пластине, на обеих пластинах, на одной поверхности пластины, на обеих поверхностях пластины, между пластинами, возле пластин или любой их комбинации. В некоторых вариантах осуществления масштабные метки размещены на первой пластине или второй пластине, на обеих пластинах, на одной поверхности пластины, на обеих поверхностях пластины, между пластинами, возле пластин или любой их комбинации. В некоторых вариантах осуществления некоторые разделители закреплены и некоторые разделители размещены.

В некоторых вариантах осуществления масштабные метки представляют собой вытравленные масштабные метки, нанесенные материалы или впечатанные материалы. В определенных вариантах осуществления материалы поглощают свет, отражают свет, испускают свет или обеспечивают любую комбинацию из этого.

В некоторых вариантах осуществления масштабные метки представляют собой один объект или множество объектов с известными размерами и/или известными промежутками. Примеры объектов включают без ограничения прямоугольники, цилиндры или круги.

В некоторых вариантах осуществления масштабные метки имеют размер в диапазоне нанометров (нм), микрон (мкм) или миллиметров (мм) или другие размеры.

В некоторых вариантах осуществления масштабные метки представляют собой линейку, которая имеет шкалу из масштабных меток, которые выполнены с возможностью измерения размера объекта. В некоторых вариантах осуществления масштабные метки находятся в масштабе нанометров (нм), микронов (мкм), или миллиметров, (мм) или других размеров. В некоторых вариантах осуществления масштабные метки представляют собой вытравленные масштабные метки, нанесенные материалы или впечатанные материалы. В некоторых вариантах осуществления материалы для масштабных меток представляют собой материалы, которые поглощают свет, отражают свет, рассеивают свет, интерферируют свет, диффрагируют свет, испускают свет или обеспечивают любую комбинацию из этого.

В некоторых вариантах осуществления метки представляют собой разделители, которые выполняют двойные функции «регулируют толщину образца» и «обеспечивают масштабные метки и/или измерение масштаба размеров». Например, прямоугольный разделитель с известным размером или два разделителя с известным расстоянием разделения можно применять для измерения размера, связанного с образцом вокруг разделителя(разделителей). На основании измеренного размера образца можно рассчитать объем подходящего объема образца.

В некоторых вариантах осуществления масштабные метки выполнены с возможностью по меньшей мере частичного определения границы подходящего объема образца.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна масштабная метка выполнена с возможностью получения известного размера, который является параллельным плоскости площади подходящего объема образца в горизонтальной проекции.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере пара масштабных меток отделена с помощью известного расстояния, которое является параллельным плоскости площади в горизонтальной проекции.

В некоторых вариантах осуществления масштабные метки выполнены с возможностью оптического выявления.

В некоторых вариантах осуществления каждая масштабная метка независимо обеспечивает по меньшей мере одно из поглощения света, отражения света, рассеяния света, дифракции света и испускания света.

В некоторых вариантах осуществления масштабные метки упорядочены в виде регулярного массива с известным пространством в горизонтальной проекции.

В некоторых вариантах осуществления каждая масштабная метка независимо имеет профиль в горизонтальной проекции, который является по меньшей мере одним из квадратного, прямоугольного, многоугольного и кругового.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна из масштабных меток прикреплена, соединена, слита, впечатана и вытравлена на одной из пластин.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна из масштабных меток представляет собой один из разделителей.

В некоторых вариантах осуществления некоторые разделители также играют роль масштабной метки для количественного определения подходящего объема образца.

В определенных вариантах осуществления участок(участки) связывания (который(которые) иммобилизует(иммобилизируют)аналиты), участки хранения или тому подобное служат в качестве масштабной метки(масштабных меток). В одном варианте осуществления участок с известным боковым размером взаимодействует со светом, генерируя подлежащий выявлению сигнал, который дает известный размер участка в горизонтальной проекции, тем самым выполняя роль масштабной метки(масштабных меток).

В другом варианте осуществления размер участков является предварительно заданным перед процессом CROF, и толщина части образца, размещенного на участке, когда пластины находятся в закрытой конфигурации, является практически меньшей, чем средний размер в горизонтальной проекции участка, тем самым контролируется время инкубации таким образом, что после инкубации (1) большая часть из аналитов/объекта, которые связываются с участком связывания, выходят из объема образца, который расположен на поверхности участка связывания, или (2) большая часть из реагента, который смешивается (диффундирует) в объеме образца, который расположен на поверхности участка связывания, выходит из участка связывания. В этих случаях подходящий объем образца для связывания или смешивания реагента представляет собой объем, который примерно равен предварительно заданной площади участка, умноженной на толщину образца на участке. Основной причиной для возможности этого является то, что в случае определенного времени инкубации аналиты/объект в объеме образца за пределами подходящего объема не имеют достаточно времени для диффузии в участок связывания, или реагенты на участке хранения не имеют достаточно времени для диффузии в объем образца за пределами подходящего объема.

Примером для иллюстрации способа измерения и/или контроля соответствующей площади и объема с применением участка с известным размером и с ограничением времени инкубации является то, что в анализе имеется участок связывания (например, область со средствами для захвата) размером 1000 мкм на 1000 мкм на первой пластине в процессе CROF (который имеет поверхность больше участка связывания); при закрытой конфигурации пластин образец с аналитами находится над участком связывания, имеет толщину приблизительно 20 мкм (в области участка связывания) и площадь, которая больше участка связывания, и его инкубируют в течение времени, равного времени диффузии целевого аналита/объекта через толщину образца. В этом случае большая часть аналитов/объект, которые связываются с участком связывания, выходят из объема образца, который расположен на поверхности участка связывания, который составляет 1000 мкм на 1000 мкм на 20 мкм=0,02 р, поскольку аналиты в части образца, которая находится на расстоянии 20 мкм от участка связывания, не имеют времени для диффузии к участку связывания (статистически). В этом случае, если сигнал, возникающий в результате захвата аналитов/объекта участком связывания, измеряют после инкубации, можно определить концентрацию аналита/объекта в соответствующей площади и подходящем объеме образца, исходя из информации (полученной из участка связывания) о соответствующей площади и подходящем объеме. Концентрацию аналита количественно определяют с помощью количества аналитов, захваченных участком связывания, разделенного на подходящий объем.

В некоторых вариантах осуществления подходящий объем примерно равен площади участка связывания, умноженной на толщину образца, и концентрация целевого аналита в образце примерно равна количеству аналита, захваченного участком связывания, деленному на подходящий объем образца. Данная точность способа количественного определения объема целевого аналита повышается, если отношение размера участка связывания к толщине образца становится большим (при условии, что время инкубации приблизительно равно времени диффузии целевого аналита в образце на расстояние, составляющем толщину образца).

Время распределения в CROF. В настоящем изобретении в способах и устройствах всех пунктов, в которых распределяют образец с помощью двух пластин, время распределения образца до конечной толщины при закрытой конфигурации составляет 0,001 с или меньше, 0,01 с, 0,1 с, 1 с, 5 с, 10 с, 20 с, 30 с, 60 с, 90 с, 100 с, 150 с, 200 с, 300 с, 500 с, 1000 с или находится в диапазоне между любыми двумя из этих значений.

В способах и устройствах всех пунктов, в которых распределяют образец с помощью двух пластин, в предпочтительном варианте осуществления время распределения образца до конечной толщины при закрытой конфигурации составляет 0,001 с или меньше, 0,01 с, 0,1 с, 1 с, 3 с, 5 с, 10 с, 20 с, 30 с, 60 с, 90 с, 100 с, 150 с или находится в диапазоне между любыми двумя из этих значений.

В способах и устройствах всех пунктов, в которых распределяют образец с помощью двух пластин, в предпочтительном варианте осуществления время распределения образца до конечной толщины при закрытой конфигурации составляет 0,001 с или меньше, 0,01 с, 0,1 с, 1 с, 3 с, 5 с, 10 с, 20 с, 30 с, 60 с, 90 с или находится в диапазоне между любыми двумя из этих значений.

В способах и устройствах всех пунктов, в которых распределяют образец с помощью двух пластин, в предпочтительном варианте осуществления время распределения образца до конечной толщины при закрытой конфигурации составляет 0,001 с или меньше, 0,01 с, 0,1 с, 1 с, 3 с, 5 с, 10 с, 20 с, 30 с или находится в диапазоне между любыми двумя из этих значений.

В способах и устройствах всех пунктов, в которых распределяют образец с помощью двух пластин, в предпочтительном варианте осуществления время распределения образца до конечной толщины при закрытой конфигурации составляет 0,001 с или меньше, 0,01 с, 0,1 с, 1 с, 3 с, 5 с, 10 с или находится в диапазоне между любыми двумя из этих значений.

В способах и устройствах всех пунктов, в которых распределяют образец с помощью двух пластин, в предпочтительном варианте осуществления время распределения образца до конечной толщины при закрытой конфигурации составляет 0,001 с или меньше, 0,01 с, 0,1 с, 1 с, 3 с или находится в диапазоне между любыми двумя из этих значений.

Варианты осуществления и любая из их комбинаций, описанные в разделе 3, применимы (т.е. комбинируются) к другим вариантам осуществления во всем описании настоящего изобретения.

В одном предпочтительном варианте осуществления разделители монолитно изготавливают на Х-пластине путем тиснения (например, наноимпринтинга) тонкой пластмассовой пленки с помощью формы и изготавливают из одинаковых материалов.

В одном предпочтительном варианте осуществления разделители монолитно изготавливают на Х-пластине путем тиснения (например, наноимпринтинга) тонкой пластмассовой пленки с помощью формы и изготавливают из одинаковых материалов, и толщина Х-пластины составляет от 50 мкм до 500 мкм.

В одном предпочтительном варианте осуществления разделители монолитно изготавливают на Х-пластине путем тиснения (например, наноимпринтинга) тонкой пластмассовой пленки с помощью формы, и изготавливают из одинаковых материалов, и толщина Х-пластины составляет от 50 мкм до 250 мкм.

В одном предпочтительном варианте осуществления разделители монолитно изготавливают на Х-пластине и изготавливают из одинаковых материалов, и толщина X-пластины составляет от 50 мкм до 500 мкм.

В одном предпочтительном варианте осуществления разделители монолитно изготавливают на Х-пластине с помощью тонкой пластмассовой пленки с помощью формы, и изготавливают из одинаковых материалов, и толщина Х-пластины составляет от 50 мкм до 250 мкм.

В одном предпочтительном варианте осуществления разделители монолитно изготавливают на Х-пластине путем тиснения (например, наноимпринтинга) тонкой пластмассовой пленки с применением формы и изготавливают из одинаковых материалов, где пластмассовая пленка представляет собой либо РММА (полиметилметакрилат), либо PS (полистирол).

В одном предпочтительном варианте осуществления разделители монолитно изготавливают на Х-пластине путем тиснения (например, наноимпринтинга) тонкой пластмассовой пленки с применением формы и изготавливают из одинаковых материалов, где пластмассовая пленка представляет собой либо РММА (полиметилметакрилат), либо PS (полистирол), и толщина Х-пластины составляет от 50 мкм до 500 мкм.

В одном предпочтительном варианте осуществления разделители монолитно изготавливают на Х-пластине путем тиснения (например, наноимпринтинга) тонкой пластмассовой пленки с применением формы и изготавливают из одинаковых материалов, где пластмассовая пленка представляет собой либо РММА (полиметилметакрилат), либо PS (полистирол), и толщина Х-пластины составляет от 50 мкм до 250 мкм.

В одном предпочтительном варианте осуществления разделители монолитно изготавливают на Х-пластине путем тиснения (например, наноимпринтинга) тонкой пластмассовой пленки с помощью формы и изготавливают из одинаковых материалов, где пластмассовая пленка представляет собой либо РММА (полиметилметакрилат), либо PS (полистирол), и разделители имеют либо квадратную, либо прямоугольную форму и имеют одинаковую высоту разделителей.

В одном предпочтительном варианте осуществления разделители имеют квадратную или прямоугольную форму (с круглыми углами или без таковых).

В одном предпочтительном варианте осуществления разделители имеют вид квадратных или прямоугольных столбиков, при этом ширина столбика (ширина разделителя в каждом горизонтальном направлении) составляет от 1 мкм до 200 мкм; интервал между столбиками (т.е. интервал между разделителями) составляет от 2 мкм до 2000 мкм, и высота столбика (т.е. высота разделителя) составляет от 1 мкм до 100 мкм.

В одном предпочтительном варианте осуществления разделители, изготовленные из РММА или PS, имеют вид квадратных или прямоугольных столбиков, при этом ширина столбика (ширина разделителя в каждом горизонтальном направлении) составляет от 1 мкм до 200 мкм; интервал между столбиками (т.е. интервал между разделителями) составляет от 2 мкм до 2000 мкм, и высота столбика (т.е. высота разделителя) составляет от 1 мкм до 100 мкм.

В одном предпочтительном варианте осуществления разделители монолитно изготовлены на Х-пластине и изготовлены из пластмассовых материалов, и разделители имеют вид квадратных или прямоугольных столбиков, при этом ширина столбика (ширина разделителя в каждом горизонтальном направлении) составляет от 1 мкм до 200 мкм; интервал между столбиками (т.е. интервал между разделителями) составляет от 2 мкм до 2000 мкм, и высота столбика (т.е. высота разделителя) составляет от 1 мкм до 100 мкм.

В одном предпочтительном варианте осуществления разделители монолитно изготовлены на Х-пластине и изготовлены из одних и тех же материалов, и разделители имеют вид квадратных или прямоугольных столбиков, при этом ширина столбика (ширина разделителя в каждом горизонтальном направлении) составляет от 1 мкм до 200 мкм; интервал между столбиками (т.е. интервал между разделителями) составляет от 2 мкм до 2000 мкм, и высота столбика (т.е. высота разделителя) от 1 мкм до 10 мкм.

В одном предпочтительном варианте осуществления разделители монолитно изготовлены на Х-пластине и изготовлены из одинаковых материалов, выбранных из PS или РММА или других пластмассовых материалов, и разделители имеют вид квадратных или прямоугольных столбиков, при этом ширина столбика (ширина разделителя в каждом горизонтальном направлении) составляет от 1 мкм до 200 мкм; интервал между столбиками (т.е. интервал между разделителями) составляет от 2 мкм до 2000 мкм, и высота столбика (т.е. высота разделителя) составляет от 10 мкм до 50 мкм.

В одном предпочтительном варианте осуществления устройства CROF одна пластина представляет собой Х-пластину, и другая пластина представляет собой плоскую тонкую пленку, где толщина по меньшей мере одной из пластин находится в диапазоне от 10 мкм до 250 мкм; где разделители закрепляют на Х-пластине, и где пластины и разделители могут быть из одинаковых или различных материалов, и они изготовлены из РММА (полиметилметакрилата), PS (полистирола) или материала с аналогичными механическими свойствами, аналогичными таковым РММА или PS.

В одном предпочтительном варианте осуществления устройства CROF одна пластина представляет собой Х-пластину, и другая пластина представляет собой плоскую тонкую пленку, где толщина по меньшей мере одной из пластин находится в диапазоне от 250 мкм до 500 мкм; где разделители закрепляют на Х-пластине, и где пластины и разделители могут быть из одинаковых или различных материалов, и они изготовлены из РММА (полиметилметакрилата), PS (полистирола) или материала с аналогичными механическими свойствами, аналогичными таковым РММА или PS.

В одном предпочтительном варианте осуществления устройства для CROF одна пластина представляет собой Х-пластину, а другая пластина представляет собой идеально плоскую тонкую пленку, где толщина по меньшей мере одной из пластин находится в диапазоне от 10 мкм до 250 мкм; где разделители закреплены на Х-пластине, и они представляют собой массив из квадратных или прямоугольных столбиков с шириной столбика (шириной разделителя в каждом горизонтальном направлении) от 1 мкм до 200 мкм; интервалом между столбиками (т.е. интервалом между разделителями) от 2 мкм до 2000 мкм и высотой столбика (т.е. высотой разделителя) от 1 мкм до 100 мкм, и где пластины и разделители могут быть из одинаковых или различных материалов, и они изготовлены из РММА (полиметилметакрилата), PS (полистирола) или материала с аналогичными механическими свойствами, как у РММА или PS.

«Аналогичный» в вышеуказанных пунктах означает, что отличие механических свойств находится в пределах 60%.

Предохранительное кольцо. В некоторых вариантах осуществления для предотвращения вытекания образца с поверхности пластины имеется предохранительное кольцо. В некоторых вариантах осуществления предохранительное кольцо представляет собой ограждающую стенку вокруг области образца. Высота стенки равна высоте разделителя или отличается от высоты разделителя. Стенка может находиться на значительном расстоянии от области измерения образца.

Перемещаемые пластины в процессе CROF могут включать шарнир, стойку или некоторую другую систему ориентации, которые выполнены с возможностью перехода пластин между открытой конфигурацией и закрытой конфигурацией, и/или могут быть связаны с ними. Перемещаемые пластины могут быть связаны вместе с помощью одного или нескольких соединений, так что остается отверстие для доступа к пространству между пластинами (например, для помещения и/или удаления образца), при условии, что по меньшей мере одно из соединений и/или по меньшей мере одна из пластин являются достаточно гибкими для достижения описанных открытой и закрытой конфигураций. Мембранный насос не считается перемещаемой пластиной(перемещаемыми пластинами).

3. Однородное пространство между пластинами и толщина образца (U)

При многих применениях процесса CROF желательно повышать однородность пространства между пластинами и тем самым толщину образца в закрытой конфигурации, в частности, когда пространство находится в микронной и/или наношкале. Высокая однородность может повысить однородность анализа. Настоящее изобретение предусматривает средства для повышения однородности.

Факторы, которые могут нарушать однородность пространства между пластинами в CROF, включают (а) локальный изгиб пластины, (b) неровность внутренней поверхности пластины и (с) пылевидные частицы. Чем меньше конечное пространство между пластинами, тем хуже становятся эффекты, оказываемые этими факторами.

Для повышения однородности промежутков (тем самым толщины образца) в настоящем изобретении применяется определенная схема в пластинах (механическая сила, толщина и т.д.), размер промежутков, число разделителей, расположение разделителей, промежуток между разделителями, прецизионность высоты разделителей, среди прочего, для преодоления этих факторов, которые вызывают неоднородность.

Гладкость внутренних поверхностей

3.1 Применение расстояния между разделителями для достижения однородной толщины образца для гибкой пластины

При некоторых применениях требуется, чтобы одна или обе пластины для CROF были гибкими. Однако, как показано на фиг. 5а, в случае гибкой пластины (например, пластмассовой тонкой пластины), если расстояние между разделителями является слишком большим, то во время процесса CROF гибкость пластины(пластин) может приводить к локальному изгибу (например, прогибу, а именно изгибу внутрь) пластины в местоположениях, которые находятся между двумя соседними разделителями, приводя к низкой однородности толщины образца. Низкая однородность толщины образца имеет много недостатков, таких как значительные ошибки определения объема образца и/или концентрации аналитов, вариация времени инкубации и т.д.

Один вариант осуществления настоящего изобретения предусматривает решение, при котором снижается локальный изгиб, и, следовательно, вариация конечной толщины образца за счет применения надлежащего расстояния между разделителями. Как показано на фиг. 5, устройство для CROF имеет одну жесткую пластину с ровной поверхностью образца и одну гибкую пластину, которая имеет локальный изгиб между двумя соседними разделителями, если расстояние между разделителями является слишком большим (фиг. 5а). Для снижения локального изгиба расстояние между разделителями устанавливают таким образом, чтобы оно было равным или меньше размаха критического изгиба гибкой пластины (фиг. 5b). Если обе пластины являются гибкими, то расстояние между разделителями должно быть меньше, чем наименьшее из размаха критического изгиба двух пластин.

U1. Способ регуляции однородности толщины подходящего объема образца с помощью двух пластин, предусматривающий:

(a) получение образца, где толщина подходящего объема образца подлежит регуляции;

(b) получение двух пластин, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации; где одна или обе пластины являются гибкими; и где одна или обе пластины содержат разделители, разделители характеризуются предварительно заданным расстоянием между пластинами и высотой, и каждый из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине;

(c) размещение образца на одной или обеих пластинах, когда пластины приведены в открытую конфигурацию; где открытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, и пространство между пластинами не регулируется разделителями;

(d) после (с) распределение образца за счет перевода пластин в закрытую конфигурацию, где в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители и подходящий объем образца находятся между пластинами, толщину подходящего объема образца регулируют с помощью пластин и разделителей;

где в случае определенных пластин разделители приводят в конфигурацию с целью получения толщины подходящего объема образца, имеющей вариацию в пределах определенной области, меньшую, чем предварительно заданное значение; и где подходящий объем представляет собой часть или весь объем образца.

В способе по пункту U1 конфигурация разделителей предусматривает выбор надлежащего расстояния между разделителями. В некоторых вариантах осуществления расстояние между разделителями выбирают таким образом, чтобы в случае допустимой вариации толщины образца, определенных двух пластин и способа сжатия изгиб двух пластин в условиях способа сжатия был равен или меньше допустимой вариации толщины образца. Регулируемая толщина образца в закрытой конфигурации может быть тоньше, чем максимальная толщина образца, когда пластины находятся в открытой конфигурации.

U2. Устройство для регуляции толщины подходящего объема образца, содержащее

первую пластину и вторую пластину, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации;

где одна или обе пластины являются гибкими, и где одна или обе пластины содержат разделители, разделители характеризуются предварительно заданным расстоянием между пластинами и высотой, и каждый из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине;

где одна из конфигураций представляет собой открытую конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, пространство между пластинами не регулируется разделителями, и образец размещен на одной или обеих пластинах;

где другая из конфигураций представляет собой закрытую конфигурацию, в которую приводят после размещения образца в открытой конфигурации; и в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители и подходящий объем образца находятся между пластинами, толщину подходящего объема образца регулируют с помощью пластин и разделителей;

где в случае определенных пластин разделители приводят в конфигурацию с целью получения толщины подходящего объема образца, имеющей вариацию толщины в пределах определенного участка, меньшую, чем предварительно заданное значение; и где подходящий объем представляет собой часть или весь объем образца.

В устройстве по пункту U2 конфигурация разделителей и пластин предусматривает выбор надлежащего расстояния между разделителями. В некоторых вариантах осуществления расстояние между разделителями выбирают таким образом, чтобы в случае допустимой вариации толщины образца, определенных двух пластин и способа сжатия изгиб двух пластин в условиях способа сжатия был равен или меньше допустимой вариации толщины образца. Регулируемая толщина образца в закрытой конфигурации может быть тоньше, чем максимальная толщина образца, когда пластины находятся в открытой конфигурации.

В некоторых вариантах осуществления небольшое пространство между разделителями также обеспечивает применение гибких тонких пленок (например, пластмассовой пленки толщиной 100 мкм) за счет получения расстояния между разделителями меньшего, чем изгиб пластины между двумя разделителями.

В некоторых вариантах осуществления для получения однородной толщины образца в пределах большой площади в закрытой конфигурации в случае определенного допустимого максимального изгиба гибкой пластины соотношение расстояния между разделителями и размаха критического изгиба пластины составляет не более 0,001%, не более 0,001%, не более 0,001%, не более 0,01%, не более 0,1%, не более 1%, не более 10%, не более 20%, не более 50%, не более 70%, не более 100% или находится в диапазоне между любыми двумя из этих значений.

3.2. Применение гибкой пластины(гибких пластин) и разделителей для преодоления влияний пыли в CROF

Одной проблемой, которую необходимо преодолеть в процессе CROF, является то, что пыль при толщине более, чем высота разделителя, может нарушать регуляцию разделителей для достижения предполагаемого конечного пространства между пластинами (тем самым, конечной толщины образца) (показано на фиг. 6а). При использовании двух жестких пластин одна такая пылевидная частица может нарушать регуляцию разделителей в пределах всей области пластины.

С помощью определенных вариантов осуществления настоящего изобретения решается проблема в результате применения надлежащей гибкой пластины (надлежащих гибких пластин) и расстояния между разделителями с целью ограничения влияния пыли в небольшой области вокруг пыли, при этом способствуя тому, что участок за пределами небольшого участка имеет конечное пространство между пластинами и толщину образца, установленные (регулируемые) с помощью разделителей).

Например, на фиг. 6b показано, что для преодоления эффектов пыли одну гибкую пластину с надлежащей гибкостью используют для ограничения области с пылью, и ее используют совместно с жесткой пластиной, которая имеет закрепленные разделители. На фиг. 6с показан другой вариант осуществления ослабления эффекта пыли, где разделители закреплены на гибкой пластине. Очевидно, существует другое решение для того, чтобы сделать обе пластины гибкими.

Надлежащую гибкость пластин в целях сведения к минимуму эффектов пыли в процессе CROF можно выбрать, исходя из толщины и механического свойства пластины. На основании исследования, показанного в примере, предпочтительными вариантами осуществления являются следующие.

U3. Способ сведения к минимуму влияния пыли на регуляцию толщины подходящего объема образца, предусматривающий:

(a) получение образца, где толщина подходящего объема образца подлежит регуляции;

(b) получение двух пластин, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации; где одна или обе пластины являются гибкими; и где одна или обе пластины содержат разделители, разделители характеризуются предварительно заданным расстоянием между пластинами и высотой, и каждый из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине;

(c) размещение образца на одной или обеих пластинах, когда пластины приведены в открытую конфигурацию; где открытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, и пространство между пластинами не регулируется разделителями;

(d) после (с) распределение образца за счет перевода пластин в закрытую конфигурацию, где в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители, подходящий объем образца и одна или множество из пылевидных частиц толщиной большей, чем высота, находятся между пластинами, при этом толщину подходящего объема образца регулируют с помощью пластин и разделителей;

где разделители и пластины приводят в конфигурацию с целью сведения к минимуму области между двумя пластинами, которая подвержена влиянию пыли; где область, подверженная влиянию пыли, представляет собой область, где пыль предотвращает регуляцию разделителями конечного пространства между пластинами в области в закрытой конфигурации пластин таким же образом, как если бы пыль отсутствовала; и где подходящий объем представляет собой часть или весь объем образца.

В способе по пункту U3 конфигурация разделителей и пластин для сведения к минимуму области с влиянием пыли содержит выбор соответствующей толщины и механического свойства гибкой пластины.

В некоторых вариантах осуществления расстояние между разделителями выбирают таким образом, чтобы в случае допустимой вариации толщины образца, определенных двух пластин и способа сжатия изгиб двух пластин в условиях способа сжатия был равен или меньше допустимой вариации толщины образца. Регулируемая толщина образца в закрытой конфигурации может быть тоньше, чем максимальная толщина образца, когда пластины находятся в открытой конфигурации.

Необходимо определить гибкость пластины.

U4. Устройство для сведения к минимуму эффектов пыли на регуляцию толщины подходящего объема образца, содержащее:

первую пластину и вторую пластину, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации, и каждая пластина имеет поверхность соприкосновения с образцом, которая контактирует с образцом, где одна или обе пластины являются гибкими;

разделители на поверхности для контакта с образцом одной или обеих из пластин, где разделители характеризуются предварительно заданным расстоянием между пластинами и высотой, и каждый из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине;

где одна из конфигураций представляет собой открытую конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, пространство между пластинами не регулируется разделителями, и образец размещен на одной или обеих пластинах;

где другая из конфигураций представляет собой закрытую конфигурацию, в которую приводят после размещения образца в открытой конфигурации; и в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители, подходящий объем образца и одна или множество пылевидных частиц толщиной, большей, чем высота разделителя, находятся между пластинами, толщину подходящего объема образца регулируют с помощью пластин и разделителей; и

где разделители и пластины приводят в конфигурацию с целью сведения к минимуму области между двумя пластинами, которая подвержена влиянию пыли; где область, подверженная влиянию пыли, представляет собой область внутренней поверхности пластин, где пластины и разделители больше не способны регулировать толщину образца, поскольку область больше не содержит пыли; и где подходящий объем представляет собой часть или весь объем образца.

3.3. Применение разделителей для снижения эффектов вариации ровности поверхности

Фактически, никакая поверхность пластины не является совершенно ровной. Как показано на фиг. 7а, в CROF вариация ровности поверхности может быть значимо большей по сравнению с желательной толщиной образца, что может приводить к большим ошибкам определения толщины образца. Поскольку конечная толщина образца в CROF становится очень тонкой (например, в микро- или нанометровом диапазоне), вариация ровности поверхности может все больше приводить к значительным ошибкам.

Вариация ровности поверхности может быть охарактеризована с помощью расстояния вариации ровности поверхности пластины, X, которая представляет собой расстояние от локального максимума высоты поверхности до соседнего локального минимума (показано на фиг. 7b).

Настоящее изобретение предусматривает средства, которые делают вариацию конечной толщины образца при закрытой конфигурации в процессе CROF меньше, чем вариация ровности поверхности на поверхности образца пластин, которая существовала, когда пластины находились в открытой конфигурации. Основным подходом в настоящем изобретении для достижения однородной толщины конечного образца является применение гибкой пластины, надлежащего расстояния между разделителями и надлежащей силы сжатия (показано на фиг. 7с и d).

При рассмотрении случая, где одну жесткую пластину и гибкую пластину применяют в процессе CROF, при открытой конфигурации пластин поверхность образца жесткой пластины характеризуется высокой ровностью, однако поверхность образца гибкой пластины характеризуется значительной вариацией ровности (т.е значительной по сравнению с предполагаемой конечной толщиной образца), как показано на фиг. 7а и b. В настоящем изобретении корректируется исходная вариация ровности поверхности образца при открытой конфигурации (например, при получении меньшей вариации ровности) с помощью (i) расстояния между разделителями, которое меньше, чем исходное расстояние вариации ровности поверхности; (ii) надлежащей силы сжатия и/или надлежащей капиллярной силы между образцом и пластинами при закрытой конфигурации с деформацией гибкой пластины и (iii) надлежащей гибкости гибкой пластины таким образом, что в конечной конфигурации пластин поверхность образца гибкой пластины деформируется и повторяет контур ровной поверхности жесткой пластины (фиг. 7с). Кроме того, в целях снижения вариации конечной толщины образца расстояние между разделителями также должно быть меньшим, чем размах критического изгиба гибкой пластины.

Вышеизложенный способ коррекции вариации ровности поверхности также работает в случаях, когда (а) жесткая пластина имеет исходную значительную вариацию ровности поверхности образца, в то время как гибкая пластина имеет плоскую поверхность образца, (b) как гибкая пластина, так и жесткая пластина имеют значительную вариацию ровности на своей соответствующей поверхности образца, и (с) обе пластины являются гибкими, и поверхность(поверхности) образца одной или обеих пластин имеет(имеют) значительную вариацию ровности поверхности (фиг. 7d).

U5. Способ снижения влияния вариации ровности поверхности пластины на однородность конечной толщины подходящего объема образца в процессе CROF, предусматривающий:

(a) получение образца, где толщина подходящего объема образца подлежит регуляции;

(b) получение двух пластин, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации; где одна или обе пластины являются гибкими; где одна или обе пластины имеют вариацию ровности поверхности, и где одна или обе пластины содержат разделители, разделители характеризуются предварительно заданной высотой, и каждый из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине;

(c) размещение образца на одной или обеих пластинах, когда пластины приведены в открытую конфигурацию; где открытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, и пространство между пластинами не регулируется разделителями;

(d) после (с) распределение образца за счет перевода пластин в закрытую конфигурацию, где в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители и подходящий объем образца находятся между пластинами, толщину подходящего объема образца регулируют с помощью пластин и разделителей;

где разделители и пластины выполнены с возможностью получения вариации толщины подходящего объема образца в закрытой конфигурации, меньшей, чем вариация ровности поверхности пластины(пластин) в открытой конфигурации, и где подходящий объем представляет собой часть или весь объем образца.

U6. Устройство для снижения эффекта вариации ровности поверхности пластины на однородность регуляции толщины подходящего объема образца, содержащее:

первую пластину и вторую пластину, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации, где одна или обе пластины являются гибкими, и одна или обе пластины имеют вариации ровности поверхности;

разделители, которые закреплены на одной или обеих пластинах, и которые имеют предварительно заданную высоту;

где одна из конфигураций представляет собой открытую конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, пространство между пластинами не регулируется разделителями, и образец размещен на одной или обеих пластинах;

где другая из конфигураций представляет собой закрытую конфигурацию, в которую приводят после размещения образца в открытой конфигурации; и в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители и подходящий объем образца находятся между пластинами, толщину подходящего объема образца регулируют с помощью пластин и разделителей;

где разделители и пластины выполнены с возможностью получения вариации толщины подходящего объема образца при закрытой конфигурации, меньшей, чем вариация ровности поверхности пластины(пластин) при открытой конфигурации, и где подходящий объем представляет собой часть или весь объем образца, и где средний размер подходящего объема является большим, чем вариация ровности поверхности пластины в открытой конфигурации.

В способе по пункту U5 и устройстве по пункту U6 конфигурация разделителей и пластин с целью снижения влияния вариации ровности поверхности пластины на однородность конечной толщины подходящего объема образца предусматривает надлежащее расстояние между разделителями (IDS). Одним предпочтительным вариантом осуществления является то, что IDS равно или меньше исходного расстояния ровности поверхности пластины в открытой конфигурации.

В способе и устройстве по пунктам U5 и U6 в некоторых вариантах осуществления (1) разделители находятся внутри образца при закрытой конфигурации, (2) разделители закреплены на соответствующей пластине, (3) имеется короткое расстояние между разделителями или (4) любые их комбинации.

В способах и устройствах в пунктах с U1 по U8 конфигурации разделителей и пластин, которые делают толщину подходящего объема образца однородной, предусмотрен вариант осуществления, описанный выше. В некоторых вариантах осуществления предварительно заданное расстояние между разделителями приводят в конфигурацию с целью ограничения локального изгиба пластин между двумя разделителями, и где подходящий объем представляет собой часть или весь объем образца.

Это включает случаи, когда одна или обе пластины являются гибкими и имеют различную гибкость (например, толщиной 100 мкм из РММА или PS).

В одном предпочтительном варианте осуществления одна пластина представляет собой РММА. В одном предпочтительном варианте осуществления одна пластина (первая пластина) представляет собой стекло толщиной от 0,5 до 1,5 мм, и она не имеет никакого разделителя, и другая (вторая) пластина представляет собой пленку из РММА толщиной 175 мкм, и она имеет массив разделителей, где разделитель представляет собой столбики прямоугольной формы (размером 40 мкм в х-направлении х и 30 мкм в у-направлении) с круглыми углами и периодом 120 мкм в х-направлении и 110 мкм в у-направлении (приводящем к образованию пространства между разделителями, составляющего 80 мкм как в х-, так и в у-направлениях).

В способах и устройствах раздела 3 некоторые варианты осуществления в случае разделителей внутри образца в закрытой конфигурации, материалы разделителей и пластины предусмотрены в вариантах осуществления раздела 2.

В способах или устройствах пунктов U1-6 в некоторых вариантах осуществления соотношение ширины столбика (или среднего размера в горизонтальной проекции) и высоты столбика составляет 0,01 или больше, 0,1 или больше, 1 или больше, 1,5 или больше, 2 или больше, 3 или больше, 5 или больше, 10 или больше, 50 или больше, 100 или больше или находится в диапазоне между любыми двумя из этих значений.

В способах и устройствах по пунктам U1-U6 в предпочтительном варианте осуществления соотношение ширины столбика (или среднего размера в горизонтальной проекции) и высоты столбика составляет 1, 1,5, 2, 10, 20, 30, 50, 100 или находится в диапазоне между любыми двумя из этих значений.

В способах и устройствах по пунктам U1-6 в некоторых вариантах осуществления соотношение интервала между столбиками и ширины столбиков (или среднего размера в горизонтальной проекции) составляет 1, 0,1, 1,1, 1,2, 1,5, 1,7, 2, 3, 5, 7, 10, 20, 50, 100, 500, 1000, 10000 или находится в диапазоне между любыми двумя из этих значений.

Отношение расстояния между разделителями (столбиками) к средней ширине разделителей равно или более 2.

В способах и устройствах по пунктам U1-U6 в предпочтительном варианте осуществления соотношение интервала столбика и ширины столбика (или среднего размера в горизонтальной проекции) составляет 1,2, 1,5, 1,7, 2, 3, 5, 7, 10, 20, 30 или находится в диапазоне между любыми двумя из этих значений.

В способах и устройствах по пунктам U1-U6 в предпочтительном варианте осуществления соотношение интервала столбика и ширины столбика (или среднего размера в горизонтальной проекции) составляет 1, 2,1, 5, 1,7, 2, 3, 5, 7, 10 или находится в диапазоне между любыми двумя из этих значений.

c) Например, при применении в подсчете клеток крови предпочтительная высота столбиков Х-пластины составляет от 1 мкм до 5 мкм, ширина столбиков составляет от 2 мкм до 30 мкм, интервал между столбиками составляет от 4 мкм до 300 мкм.

d) Например, при применении в иммунологическом анализе предпочтительная высота столбиков Х-пластины составляет от 5 мкм до 50 мкм, ширина столбиков составляет от 10 мкм до 250 мкм, интервал между столбиками составляет от 20 мкм до 2500 мкм.

Варианты осуществления и любая из их комбинаций, описанные в разделе 3, применимы (т.е. комбинируются) к другим вариантам осуществления во всем описании настоящего изобретения.

В некоторых вариантах осуществления также применяют другие факторы для контроля однородности толщины образца, эти факторы включают без ограничения площадь образца, механические свойства пластины, конечную толщину образца в закрытой конфигурации и свойств смачивания поверхности пластины.

Ниже представлены некоторые предпочтительные варианты осуществления для способов и устройств в разделе 1 и остальная часть раскрытий.

В предпочтительном варианте осуществления разделитель представляет собой периодический массив из квадратов, где разделитель представляет собой столбик, который имеет высоту от 2 до 4 мкм, средний размер в горизонтальной проекции от 5 до 20 мкм и пространство между разделителями от 1 мкм до 100 мкм.

В предпочтительном варианте осуществления разделитель представляет собой периодический массив из квадратов, где разделитель представляет собой столбик, который имеет высоту от 2 до 4 мкм, средний размер в горизонтальной проекции от 5 до 20 мкм и пространство между разделителями от 100 мкм до 250 мкм.

В предпочтительном варианте осуществления разделитель представляет собой периодический массив из квадратов, где разделитель представляет собой столбик, который имеет высоту от 4 до 50 мкм, средний размер в горизонтальной проекции от 5 до 20 мкм и пространство между разделителями от 1 мкм до 100 мкм.

В предпочтительном варианте осуществления разделитель представляет собой периодический массив из квадратов, где разделитель представляет собой столбик, который имеет высоту от 4 до 50 мкм, средний размер в горизонтальной проекции от 5 до 20 мкм и пространство между разделителями от 100 мкм до 250 мкм.

Интервал в массиве разделителей составляет от 1 нм до 100 нм в одном предпочтительном варианте осуществления, от 100 нм до 500 нм в другом предпочтительном варианте осуществления, от 500 нм до 1000 нм в отдельном предпочтительном варианте осуществления, от 1 мкм (т.е. 1000 нм) до 2 мкм в другом предпочтительном варианте осуществления, от 2 мкм до 3 мкм в отдельном предпочтительном варианте осуществления, от 3 мкм до 5 мкм в другом предпочтительном варианте осуществления, от 5 мкм до 10 мкм в отдельном предпочтительном варианте осуществления, от 10 мкм до 50 мкм в другом предпочтительном варианте осуществления, от 50 мкм до 100 мкм в отдельном предпочтительном варианте осуществления, от 100 мкм до 175 мкм в отдельном предпочтительном варианте осуществления и от 175 до 300 мкм в отдельном предпочтительном варианте осуществления.

4. Образец и размещение

В способах и устройствах настоящего изобретения, в которых применяют процесс CROF, образец размещают с помощью нескольких способов или комбинации способов. В одном варианте осуществления размещения образец размещают лишь на одной пластине. В определенных вариантах осуществления образец размещают на обеих пластинах (т.е. на первой пластине и на второй пластине).

Образец размещают, когда пластины находятся в открытой конфигурации. В некоторых вариантах осуществления первую пластину и вторую пластину тщательно отделяют друг от друга во время размещения образца для того, чтобы образец легко разместить на одной пластине без препятствия для другой пластины. Например, первая пластина и вторая пластина могут располагаться далеко друг от друга, таким образом, образец непосредственно накапывают на первую пластину или вторую пластину, как если бы вторая пластина не существовала. В определенных вариантах осуществления размещения образца первая пластина и вторая пластина отделены расстоянием друг от друга в открытой конфигурации пластин, затем образец размещают на пластины (например, с помощью горизонтального потока или других способов раскапывания). В определенных вариантах осуществления две пластины имеют одну сторону (например, край), соединенную вместе во время всех операций с пластинами (фиг. 30); и открытие и закрытие двух пластин происходит подобно открытию и закрытию книги.

Размещение образца может представлять собой одну каплю или несколько капель. Несколько капель могут находиться в одном местоположении или нескольких местоположениях либо одной, либо обеих пластин. Капли могут быть тщательно отделены друг от друга, соединены или представлять комбинацию из них.

В некоторых вариантах осуществления образец содержит более одного материала, и материалы размещают совместно или отдельно. Материалы размещают отдельно, либо параллельно, либо последовательно.

Размещение образца на пластинах (т.е. первой пластине и второй пластине) можно выполнять с помощью устройства или непосредственно от испытуемого субъекта на пластины. В некоторых вариантах осуществления образец размещают с помощью устройства. Устройство включает без ограничения пипетки, иглу, стик, тампон, пробирку, насадку, дозатор жидкости, наконечники, стержень, сопла для распыления, принтеры, распыляющие устройства и т.д. В определенных вариантах осуществления образец размещают в результате прямого контакта между образцом в источнике образца и пластиной для CROF без применения каких-либо устройств (т.е. приведения образца и пластины в контакт для получения контакта между обоими). Это называется «прямым размещением образца».

Примерами прямого размещения образца на пластину(пластины) являются (а) прямой контакт между проколотым пальцем (или другими частями тела) и пластиной, (b) сплевывание слюны на пластину(пластины), (с) взятие слезы в глазах человека в результате прямого контакта между слезой и пластиной(пластинами), (d) прямой контакт между потом и пластиной(пластинами) и (е) непосредственное выдыхание на пластину(пластины) для размещения конденсата и т.д. Такой способ прямого размещения можно применять как для человека, так и для животных.

В некоторых вариантах осуществления применяют как прямое, так и косвенное (с помощью устройства) размещение образца.

В настоящем изобретении объем образца, который размещают на пластине или пластинах («объем образца») составляет не более 0,001 пл (пиколитра), не более 0,01 пл, не более 0,1 пл, не более 1 пл, не более 10 пл, не более 100 пл, не более 1 нл (нанолитра), не более 10 нл, не более 100 нл, не более 1 мкл (микролитра), не более 10 мкл, не более 100 мкл, не более 1 мл (миллилитра), не более 10 мл или находится в диапазоне между любыми двумя из этих значений.

В некоторых вариантах осуществления размещения образца предусматривает стадии (а) помещения образца на одну или обе пластины и (b) распределения образца с помощью средств, отличных от сжатия второй пластины в процессе CROF. Средства распределения образца включают применение другого устройства (например, стика, лезвия), воздушного потока или др.

Деформация образцов

В ходе процесса CROF в некоторых вариантах осуществления образцы ведут себя подобно несжимаемой жидкости (которая называется жидкостью, которая поддерживает постоянные объем в условиях деформации формы), таким образом, изменение толщины образца привело бы к изменению области образца. В некоторых вариантах осуществления образцы ведут себя подобно несжимаемой жидкости, при этом их площадь в горизонтальной проекции по-прежнему увеличивается, в то время как их толщина снижается во время процесса CROF. В определенных вариантах осуществления образец представляет собой жидкость, гель и полутвердые вещества при условии, что во время процесса CROF их боковая площадь увеличивается, в то время как их толщина уменьшается.

В настоящем изобретении раскрываемый термин «обращение первой пластины и второй пластины друг к другу» представляет собой процесс, который воздействует на положение и ориентацию первой пластины или второй пластины или обеих таким образом, что образец находится между внутренними поверхностями первой пластины и второй пластины. В некоторых вариантах осуществления действие «обращения первой пластины и второй пластины друг к другу» выполняется руками человека, руками человека с помощью определенных устройств или автоматическими устройствами без вовлечения рук человека.

В некоторых вариантах осуществления толщина составляет не более 1 мм, не более 100 мкм, не более 20 мкм, не более 10 мкм или не более 2 мкм. В некоторых вариантах осуществления толщина составляет по меньшей мере 0,1 мкм. В некоторых вариантах осуществления дополнительно предусмотрено измерение толщины.

В некоторых вариантах осуществления вариация толщины подходящего объема образца составляет не более 300%, не более 100%, не более 30%, не более 10%, не более 3%, не более 1%, не более 0,3% или не более 0,1% от эффективного диаметра соответствующей области.

В некоторых вариантах осуществления толщина является по меньшей мере частично определенной с помощью предварительно определенной высоты.

5. Аналиты, объект, участок связывания, участок хранения и передающие среды

В настоящем изобретении объект включает без ограничения одно из белка, аминокислоты, нуклеиновой кислоты, липида, углевода, метаболита, клетки или наночастицы.

В некоторых вариантах осуществления участок связывания включает партнера по связыванию, выполненного с возможностью связывания соответствующего объекта.

В некоторых вариантах осуществления участок связывания включает объект, связанный с участком связывания.

В некоторых вариантах осуществления помещение образца включает помещение образца внутрь участка связывания.

В некоторых вариантах осуществления реагент включают по меньшей мере одно из белка, аминокислоты, нуклеиновой кислоты, липида, углевода и метаболита.

В определенных вариантах осуществления участок хранения включает высушенный реагент.

В некоторых вариантах осуществления участок хранения включает реагент, выполненный с возможностью высвобождения из участка хранения после контакта с образцом.

В некоторых вариантах осуществления первый участок хранения и второй участок хранения находятся в общем участке хранения.

В некоторых вариантах осуществления передающая среда представляет собой образец. В некоторых вариантах осуществления передающая среда представляет собой жидкость, при этом реагент или объект могут растворяться и диффундировать в этой жидкости.

В некоторых вариантах осуществления пластина содержит несколько участков хранения. В другом варианте осуществления один участок хранения содержит несколько реагентов.

Различное время высвобождения. В некоторых вариантах осуществления пластина имеет множественные участки хранения в различных местоположениях пластины, или один участок хранения содержит несколько реагентов, и при контакте с образцом участков хранения реагенты высвобождаются, однако высвобождаются в течение различного времени в случае различных реагентов одного и того же участка хранения или реагентов различных участков хранения.

В некоторых вариантах осуществления первый реагент выполнен с возможностью высвобождения из первого участка хранения после контакта с образцом за первое среднее время высвобождения, а второй реагент выполнен с возможностью высвобождения из второго участка хранения после контакта с образцом за второе среднее время высвобождения, и где первое среднее время высвобождения меньше, чем второе среднее время высвобождения.

В некоторых вариантах осуществления первый реагент выполнен с возможностью высвобождения из первого участка хранения после контакта с образцом, и при этом второй реагент представляет собой связанный реагент.

В некоторых вариантах осуществления размещение включает связывание по меньшей мере одного из реагентов с соответствующей пластиной.

В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт включает высвобождение по меньшей мере одного из реагентов из соответствующей пластины.

В некоторых вариантах осуществления размещение включает размещение первого реагента и второго реагента, и при этом приведение в контакт включает высвобождение первого реагента перед вторым реагентом.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна из пластин содержит участок хранения, который включает реагент, который подлежит добавлению к подходящему объему образца.

В некоторых вариантах осуществления реагент включает по меньшей мере одно из белка, аминокислоты, нуклеиновой кислоты, липида, углевода и метаболита.

В некоторых вариантах осуществления участок хранения включает высушенный реагент.

В некоторых вариантах осуществления участок хранения включает реагент, выполненный с возможностью высвобождения из участка хранения после контакта с образцом.

В некоторых вариантах осуществления участок хранения представляет собой первый участок хранения, а реагент представляет собой первый реагент, где устройство включает второй участок хранения, включающий второй реагент, который подлежит добавлению в подходящий объем образца, где второй участок хранения находится на одной из пластин.

В некоторых вариантах осуществления первый участок хранения и второй участок хранения находятся в общем участке хранения.

В некоторых вариантах осуществления первый реагент выполнен с возможностью высвобождения из первого участка хранения после контакта с образцом за первое среднее время высвобождения, а второй реагент выполнен с возможностью высвобождения из второго участка хранения после контакта с образцом за второе среднее время высвобождения, и где первое среднее время высвобождения меньше, чем второе среднее время высвобождения.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из реагентов высушивают на соответствующей пластине.

В некоторых вариантах осуществления набора по меньшей мере один из реагентов связан с соответствующей пластиной.

В некоторых вариантах осуществления набора по меньшей мере один из реагентов выполнен с возможностью высвобождения из соответствующей пластины после контакта с образцом.

В некоторых вариантах осуществления набора первый реагент находится на одной или обеих из пластин, а второй реагент находится на одной или обеих из пластин, где первый реагент выполнен с возможностью высвобождения из соответствующей пластины после контакта с образцом за первое среднее время высвобождения, а второй реагент выполнен с возможностью высвобождения из соответствующей пластины после контакта с образцом за второе среднее время высвобождения, и где первое среднее время высвобождения меньше, чем второе среднее время высвобождения.

В некоторых вариантах осуществления устройств участок хранения представляет собой первый участок хранения, а реагент представляет собой первый реагент, где устройство включает второй участок хранения, включающий второй реагент, который подлежит добавлению в подходящий объем образца, где второй участок хранения находится на одной из пластин.

6. Локальное связывание или смешивание в части образца (Р)

При некоторых применениях желательно иметь участок связывания для захвата (т.е. связывания) аналитов лишь в части образца, а не во всем образце. Также в некоторых случаях желательно, чтобы реагент добавляли (т.е. смешивали) в часть образца, а не во весь образец. Часто желательно, чтобы отсутствовало жидкостное разделение между частью образца и остальной частью образца. Такие требования являются предпочтительными или необходимыми при определенных мультиплексных выявлениях.

Настоящее изобретение предлагает решение вышеуказанных требований за счет применения способа CROF и устройства для CROF путем превращения образца в сверхтонкую пленку, толщина которой меньше размера части образца в горизонтальной проекции, где будет захватываться только аналит внутри этой части образца или только часть образца будет смешиваться с реагентом. Принцип работы для такого подхода заключается в том, что если толщина образца меньше размера образца в горизонтальной проекции, то захват аналита поверхностью или смешивание реагента, помещенного на поверхность, в первую очередь, может ограничиваться диффузией аналитов и реагента в направлении толщины, где диффузия в виде диффузии в горизонтальной проекции относительно незначительна. Например, если образец превращается в тонкую пленку толщиной 5 мкм, если часть образца, в которой должен захватываться аналит или которая должна смешиваться с реагентом, имеет размер в горизонтальной проекции 5 мм на 5 мм, и если время диффузии аналита или реагента через толщину 5 мкм составляет 10 с, то диффузия в горизонтальной проекции у аналита или реагента на расстояние 5 мм составляет 1000000 с (поскольку время диффузии пропорционально квадрату расстояния, на которое осуществляется диффузия). Это означает, что при выборе правильного соотношения размера интересующей части образца в горизонтальной проекции и толщины образца при определенном интервале времени захваченные аналиты в первую очередь происходят из интересующей части образца, или реагент смешивается в первую очередь с представляющей интерес частью образца.

6.1. Локальное связывания объекта в части образца с поверхностью (Р: объем к поверхности)

Р1. Способ локального связывания целевых объектов в подходящем объеме образца с участком связывания на поверхности, предусматривающий:

(i) осуществление стадий от (а) до (d) в способе по пункту X1, где толщина образца при закрытой конфигурации значительно меньше, чем средний линейный размер участка связывания; и где подходящий объем представляет собой объем образца, который располагается на участке связывания, когда пластины приведены в закрытую конфигурацию;

(ii) после (i) и пока пластины находятся в закрытой конфигурации, одно из:

(1) инкубации образца на протяжении подходящего интервала времени, а затем прекращения инкубации; или

(2) инкубации образца на протяжении времени, которое равно минимальному подходящему интервалу времени или превышает его, а затем проведение оценки в течение периода времени, который равен максимальному подходящему интервалу времени или меньше него, при этом со связыванием целевого объекта в участке связывания;

где подходящий интервал времени:

i. равен времени, которое требуется для диффузии целевого объекта через толщину слоя однородной толщины при закрытой конфигурации, или превышает его; и

ii. существенно короче времени, которое требуется для горизонтальной диффузии целевого объекта через участок связывания с минимальным размером в горизонтальной проекции;

где при завершении инкубации (1) или в ходе проведения оценки (2) большинство целевых объектов, связанных с участком связывания, происходят из образца подходящего объема;

где инкубация обеспечивает возможность связывания целевого объекта с участком связывания, и где подходящий объем представляет собой часть образца, которая расположена над участком связывания при закрытой конфигурации.

Способ по пункту Р2, где термин «толщина подходящего объема образца значительно меньше, чем минимальный средний размер участка связывания» означает, что соотношение минимального среднего размера участка связывания и толщины образца (названное как «соотношение длины и толщины») составляет по меньшей мере 3, по меньшей мере 5, по меньшей мере 10, по меньшей мере 20, по меньшей мере 50, по меньшей мере 100, по меньшей мере 500, по меньшей мере 1000, по меньшей мере 10000, по меньшей мере 100000 или находится в любом диапазоне между этими значениями. В предпочтительных вариантах осуществления соотношение длины и толщины составляет по меньшей мере 3, по меньшей мере 5, по меньшей мере 10, по меньшей мере 20, по меньшей мере 50, по меньшей мере 100, по меньшей мере 500 или находится в любом диапазоне между этими значениями.

Способ по пункту Р2, где термин «значительно короче, чем время, которое требуется для того, чтобы целевой объект горизонтально диффундировал через минимальный размер в горизонтальной проекции участка связывания» означает, что соотношение времени для диффузии через минимальный размер в горизонтальной проекции участка связывания и времени диффузии через толщину образца (названное как «соотношение длины и времени диффузии через толщину») составляет по меньшей мере 3, по меньшей мере 10, по меньшей мере 50, по меньшей мере 10, по меньшей мере 100, по меньшей мере 1000, по меньшей мере 10000, по меньшей мере 100000, по меньшей мере 100000 или находится в любом диапазоне между этими значениями. В предпочтительных вариантах осуществления соотношение длины и времени диффузии через толщину составляет по меньшей мере 3, по меньшей мере 10, по меньшей мере 50, по меньшей мере 10, по меньшей мере 100, по меньшей мере 1000, по меньшей мере 10000 или находится в любом диапазоне между этими значениями.

Р2. Устройство для локального связывания объекта в подходящем объеме образца с участком связывания на поверхности, содержащее

первую пластину и вторую пластину, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации,

где первая пластина имеет на своей поверхности участок связывания, который имеет площадь меньшую, чем такая площадь пластины, и выполнен с возможностью связывания целевого объекта в образце, где целевой объект способен диффундировать в образце, и где одна или обе пластины содержат разделители и каждый из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине и имеет предварительно заданную высоту;

где одна из конфигураций представляет собой открытую конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, пространство между пластинами не регулируется разделителями, и образец размещен на одной или обеих пластинах,

где другая из конфигураций представляет собой закрытую конфигурацию, в которую приводят после размещения образца в открытой конфигурации; и в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители, участок связывания и по меньшей мере часть образца находятся между пластинами, образец контактирует с по меньшей мере частью участка связывания, толщину подходящего объема образца регулируют с помощью пластин и разделителей, и она является тоньше, чем максимальная толщина образца, когда пластины находятся в открытой конфигурации; где подходящий объем образца представляет собой объем образца, который размещен на участке связывания;

где высоту разделителя выбирают с целью регуляции толщины подходящего объема при закрытой конфигурации, которая по меньшей в 3 раза меньше, чем средний линейный размер участка связывания.

Регуляция толщины подходящего объема, чтобы он был в 3 раза меньше среднего линейного размера участка связывания, приводит к тому, что время диффузии объекта через толщину образца в 9 раз меньше времени диффузии на расстояние, равное среднему линейному размеру участка связывания. Такая регуляция толщины делает возможным выбор времени инкубации таким образом, что инкубация приводит к тому, что (i) значительное количество целевого объекта в подходящем объеме связывается с участком связывания и (ii) значительное количество целевого объекта, связанного с участком связывания, происходит из подходящего объема образца, и при этом инкубация представляет собой процесс, который способствует связыванию целевого объекта с участком связывания.

Например, если время инкубации устанавливают таким образом, что это время было равно времени диффузии объекта через толщину подходящего объема образца, то после инкубации большая часть объекта внутри подходящего объема уже достигла участка связывания и связывается в соответствии с уравнением скорости реакции, при этом объект, который изначально (т.е. перед инкубацией) находится за пределами подходящего объема, может диффундировать только в периферическую часть подходящего объема (относительно небольшой объем), и такой объем становится менее значимым, поскольку отношение среднего линейного размера участка связывания к толщине подходящего объема становится большим.

6.2. Локальное связывание объекта, хранящегося на поверхности пластины, с участком связывания на поверхности другой пластины (поверхность к поверхности)

Р3. Способ локального связывания объекта, хранящегося на участке хранения одной пластины, с участком связывания на другой пластине, предусматривающий:

(а) получение первой пластины и второй пластины, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации, где поверхность первой пластины имеет участок связывания; и поверхность второй пластины имеет участок хранения, который содержит объект, подлежащий связыванию с участком связывания; где площадь участка связывания и площадь участка реагента меньше площади соответствующих пластин; и где одна или обе пластины содержат разделители, и каждый из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине и имеет предварительно заданную высоту;

(b) получение передающей среды, где объект способен растворяться в передающей среде и диффундировать в передающей среде;

(c) размещение, когда пластины приведены в открытую конфигурацию, передающей среды на одной или обеих пластинах; где открытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой две пластины частично или полностью отделены друг от друга, и пространство между пластинами не регулируется разделителями;

(d) после (с) распределение передающей среды за счет перевода пластин в закрытую конфигурацию, где в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители, участок связывания, участок хранения и по меньшей мере часть передающей среды находятся между пластинами; по меньшей мере часть участка хранения непосредственно обращена к участку связывания с частью передающей среды между ними, и толщину подходящего объема передающей среды регулируют с помощью пластин и разделителей, и она является тоньше, чем максимальная толщина образца, когда пластины находятся в открытой конфигурации, и значительно меньше, чем средний линейный размер подходящего объема в направлении поверхности пластины; и

(e) после (d) и пока пластины находятся в закрытой конфигурации, инкубацию в течение некоторого времени и прекращение инкубации, где время инкубации выбрано таким образом, что она приводит к тому, что значительное количество объекта, связанного с участком связывания, происходит из участка хранения, где подходящий объем представляет собой объем передающей среды, которая располагается на участке связывания, а инкубация представляет собой процесс, который обеспечивает возможность связывания объекта с участком связывания.

Термин «по меньшей мере часть участка хранения непосредственно обращена к участку связывания» означает, что самое короткое расстояние от точки в части до участка связывания совпадает с толщиной подходящего объема при закрытой конфигурации пластин.

Р4. Устройство для локального связывания объекта, хранящегося на участке хранения одной пластины, с соответствующим участком связывания на другой пластине, содержащее:

первую пластину и вторую пластину, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации, где поверхность первой пластины имеет участок связывания; и поверхность второй пластины имеет участок хранения, который содержит объект, подлежащий связыванию с участком связывания; где площадь участка связывания и площадь участка хранения являются меньшими, чем соответствующие пластины; и где одна или обе пластины содержат разделители, и каждый из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине и имеет предварительно заданную высоту;

где одна из конфигураций представляет собой открытую конфигурацию, при которой две пластины либо частично, либо полностью отделены друг от друга, пространство между пластинами не регулируется разделителями, и передающую среду размещают на одну или обе пластины, где объект на участке хранения способен растворяться в передающей среде и диффундировать в передающей среде,

где другая из конфигураций представляет собой закрытую конфигурацию, в которую приводят после размещения передающей среды в открытой конфигурации; и в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители, участок связывания, участок хранения и по меньшей мере часть передающей среды находятся между пластинами; по меньшей мере часть участка хранения непосредственно обращена к участку связывания с частью передающей среды между ними, и толщину подходящего объема передающей среды регулируют с помощью пластин и разделителей, и она является тоньше, чем максимальная толщина образца, когда пластины находятся в открытой конфигурации;

где подходящий объем представляет собой объем передающей среды, которая располагается на участке хранения, когда пластины находятся в закрытой конфигурации; и

где высоту разделителя выбирают с целью регуляции толщины подходящего объема при закрытой конфигурации, которая по меньшей в 3 раза меньше, чем средний линейный размер участка связывания,

где по меньшей мере один из разделителей находится внутри площади контакта с образцом;

и разделители имеют предварительно заданное расстояние между разделителями и высоту.

6.3. Способ локального связывания объекта на нескольких участках хранения одной пластины, соответствующих участкам связывания на другой пластине

Р5. Способ локального связывания объекта, хранящегося на нескольких участках хранения одной пластины, соответствующих участкам связывания на другой пластине, предусматривающий:

(а) получение первой пластины и второй пластины, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации, где поверхность первой пластины имеет множественные участки связывания; и поверхность второй пластины имеет множественные соответствующие участки хранения; где каждый соответствующий участок хранения находится в местоположении на второй пластине, которая соответствует местоположению участка связывания, таким образом, что когда две пластины расположены друг напротив друга, каждый участок связывания перекрывает только один участок хранения; и где одна или обе пластины содержат разделители, и каждый из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине и имеет предварительно определенную высоту;

(b) получение передающей среды, где объект на участках хранения способен растворяться в передающей среде и диффундировать в передающей среде;

(c) размещение, когда пластины приведены в открытую конфигурацию, передающей среды на одной или обеих пластинах; где открытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой две пластины частично или полностью отделены друг от друга, и пространство между пластинами не регулируется разделителями;

(d) после (с) распределение передающей среды за счет приведения в контакт пластин в закрытую конфигурацию, где в закрытой конфигурации две пластины обращены друг к другу, разделители, участки связывания, участки хранения и по меньшей мере часть передающей среды находятся между пластинами, каждый участок связывания непосредственно обращен только к одному соответствующему участку хранения, передающая среда контактирует с по меньшей мере частью из каждого из участков связывания и частью из каждого из участков хранения, толщину подходящего объема передающей среды регулируют с помощью пластин и разделителей, и она является тоньше, чем максимальная толщина передающей среды в том случае, когда пластины приведены в открытую конфигурацию, и значительно меньшей, чем средний линейный размер участков связывания; и

(e) после (d) и пока пластины находятся в закрытой конфигурации, инкубация в течение определенного времени и остановка инкубации, где время инкубации выбрано таким образом, что оно приводит к тому, что значительное количество объекта, связанного с каждым участком связывания, происходит из соответствующего участка хранения, где подходящий объем представляет собой объем передающей среды, которая расположена на участках связывания, и инкубация представляет собой процесс, который способствует связыванию объекта с участком связывания.

В некоторых вариантах осуществления промежуток ограничен площадью связывающего образца.

В некоторых вариантах осуществления способа Р5 передающая среда представляет собой образец с целевым аналитом, участок связывания содержит средство для захвата, и объект в участке связывания представляет собой средство для выявления, где целевой аналит связывается со средством для захвата и средством для выявления с образованием «сэндвича» средство для захвата-аналит-средство для выявления. Способ Р5 упрощает стадии анализа и может снизить время анализа за счет применения меньшей высоты разделителей, чтобы получить более тонкую толщину образца и более короткое время вертикальной диффузии как аналитов, так и средств выявления для более короткого времени анализа до насыщения.

Р6. Устройство для локального связывания объекта, хранящегося на нескольких участках хранения одной пластины, с несколькими соответствующими участками связывания на другой пластине, содержащее:

первую пластину и вторую пластину, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации;

где поверхность первой пластины имеет несколько участков связывания; а поверхность второй пластины имеет несколько соответствующих участков хранения; где каждый соответствующий участок хранения находится в местоположении на второй пластине, которое соответствует местоположению участка связывания, вследствие чего, когда две пластины расположены друг напротив друга, каждый участок связывания перекрывается только с одним участком хранения; и где одна или обе пластины содержат разделители, и каждый из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине и имеет предварительно заданную высоту;

где одна из конфигураций представляет собой открытую конфигурацию, при которой две пластины либо частично, либо полностью отделены друг от друга, промежуток между пластинами не регулируется разделителями, и передающую среду размещают на одной или обеих пластинах, где объект на участке хранения способен растворяться в передающей среде и диффундировать в передающей среде,

где другая из конфигураций представляет собой закрытую конфигурацию, в которую приводят после размещения передающей среды в открытой конфигурации; и в закрытой конфигурации две пластины обращены друг к другу, разделители, участки связывания, участки хранения и по меньшей мере часть передающей среды находятся между пластинами, каждый участок связывания непосредственно обращен только к одному соответствующему участку хранения, передающая среда находится в контакте по меньшей мере с частью каждого из участков связывания и частью каждого из участков хранения, толщину подходящего объема передающей среды регулируют с помощью пластин и разделителей, и она является тоньше, чем максимальная толщина передающей среды в том случае, когда пластины находятся в открытой конфигурации;

где подходящий объем представляет собой объем передающей среды, который расположен на участке хранения, когда пластины находятся в закрытой конфигурации; и

где предварительно заданная высота разделителя выбрана для регуляции толщины подходящего объема при закрытой конфигурации, чтобы она была значительно меньше, чем средний линейный размер участков связывания.

6.4. Локальное добавление реагента, хранящегося на поверхности, к части образца (поверхность к объему)

Р7. Способ локального добавления реагента к подходящему объему образца, предусматривающий:

(a) получение первой пластины и второй пластины, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации, где первая пластина имеет на своей поверхности участок хранения, который содержит реагенты, подлежащие добавлению в подходящий объем образца, при этом реагенты способны растворяться в образце и диффундировать в образце, и площадь участка хранения является меньшей, чем площадь пластины; и где одна или обе пластины содержат разделители, и каждый из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине и имеет предварительно заданную высоту;

(b) получение образца;

(c) размещение образца на одной или обеих пластинах, когда пластины приведены в открытую конфигурацию; где открытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, и пространство между пластинами не регулируется разделителями;

(d) после (с) распределение образца за счет перевода пластин в закрытую конфигурацию; где в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу; разделители, участок хранения и по меньшей мере часть образца находятся между пластинами; образец находится в контакте по меньшей мере с частью участка хранения и контактирует с пластинами в пределах площади, которая является большей, чем такая площадь у участка хранения; толщину подходящего объема образца регулируют с помощью пластин и разделителей, и она является тоньше, чем максимальная толщина образца, когда пластины находятся в открытой конфигурации, и значительно меньше, чем средний линейный размер подходящего объема в направлении поверхности пластины; и

(e) после (d) и пока пластины находятся в закрытой конфигурации, инкубацию в течение некоторого времени и прекращение инкубации, где время инкубации выбрано таким образом, что она приводит к тому, что (i) значительное число реагентов, растворенных в образце, содержатся в подходящем объеме образца, и (ii) реагенты находятся в значительной части подходящего объема, и где подходящий объем представляет собой объем образца, который располагается на участке хранения, когда пластины находятся в закрытой конфигурации, и инкубация представляет собой процесс, который способствует растворению и диффузии реагента в образце.

Р8. Устройство для локального добавления реагента, хранящегося на поверхности пластины, к подходящему объему образца, содержащее

первую пластину и вторую пластину, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации,

где первая пластина имеет на своей поверхности участок хранения, который содержит реагенты, подлежащие добавлению в подходящий объем образца, при этом реагенты способны растворяться в образце и диффундировать в образце; и где одна или обе пластины содержат разделители, и каждый из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине и имеет предварительно заданную высоту;

где одна из конфигураций представляет собой открытую конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, пространство между пластинами не регулируется разделителями, и образец размещен на одной или обеих пластинах;

где другая из конфигураций представляет собой закрытую конфигурацию, в которую приводят после размещения образца в открытой конфигурации; и в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители, участок хранения и по меньшей мере часть образца находятся между пластинами, образец контактирует с по меньшей мере частью участка хранения и по меньшей мере с частью поверхности связывания за пределами участка хранения, толщину подходящего объема образца регулируют с помощью пластин и разделителей, и она является тоньше, чем максимальная толщина образца, когда пластины находятся в открытой конфигурации, и где подходящий объем образца представляет собой объем образца, который размещен на участке хранения, когда пластины находятся в закрытой конфигурации;

где высоту разделителя выбирают с целью регуляции толщины подходящего объема при закрытой конфигурации пластин, которая по меньшей в 3 раза меньше, чем средний линейный размер подходящего объема в направлении поверхности пластины.

7. Образование «сэндвича» средство для захвата-аналит-средство для выявления на участке связывания (W)

Один аспект настоящего изобретения предусматривает образование «сэндвича» средство для захвата-аналит-средство для выявления на участке связывания на твердой поверхности в одной стадии с помощью применения процесса CROF и с помощью размещения участка связывания на одной пластине, а участка хранения, который содержит средство выявления, в соответствующем местоположении другой пластины.

7.1. Образование «сэндвича» средство для захвата-аналит-средство для выявления на участке связывания в одной стадии инкубации (общее) (W)

W1. Способ образования «сэндвича» средство для захвата-аналит-средство для выявления на участке связывания пластины, предусматривающий:

(a) получение образца, который содержит целевой аналит, где целевой аналит способен к диффузии в образце;

(b) получение средств для захвата и получение средств для выявления, где средства для захвата и средства для выявления способны связываться с целевым аналитом с образованием «сэндвича» средство для захвата-целевой аналит-средство для выявления;

(c) получение первой пластины и второй пластины, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации; где первая пластина имеет участок связывания, который содержит средства для связывания, подлежащие иммобилизации на участок, и вторая пластина имеет участок хранения, который содержит средства для выявления; где в случае, когда участок хранения находится в контакте с образцом, средства для выявления способны растворяться в образце и диффундировать в образце; и где одна или обе пластины содержат разделители, и каждый из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине и имеет предварительно заданную высоту;

(d) размещение образца на одной или обеих пластинах, когда пластины приведены в открытую конфигурацию; где открытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой две пластины частично или полностью отделены друг от друга, а пространство между пластинами не регулируется разделителями;

(e) после (d) распределение образца за счет перевода пластин в закрытую конфигурацию, при этом в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители и подходящий объем образца находятся между пластинами, толщина подходящего объема образца регулируется пластинами и разделителями, и она является тоньше, чем толщина образца в том случае, когда пластины приведены в открытую конфигурацию; и образец находится в контакте с участком связывания и участком хранения;

(f) после (е), пока пластины находятся в закрытой конфигурации, инкубация в течение некоторого времени, которое обеспечивает возможность образования «сэндвича» средство для захвата-целевой аналит-средство для выявления;

где подходящий объем представляет собой по меньшей мере часть или весь объем образца.

W2. Устройство для образования «сэндвича» средство для захвата-аналит-средство для выявления на участке связывания пластины, содержащее

первую пластину и вторую пластину, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации;

где первая пластина имеет участок связывания, который содержит средства для захвата, иммобилизированные на участке, а вторая пластина имеет участок хранения, который содержит средства для выявления; где средства для захвата и средства для выявления (способны связываться) связываются с целевым аналитом в образце с образованием «сэндвича» средство для захвата-целевой аналит-средство для выявления; при этом, когда участок хранения находится в контакте с образцом, средства для выявления способны растворяться в образце и диффундировать в образце; и где одна или обе пластины содержат разделители, и каждый из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине и имеет предварительно заданную высоту;

где одна из конфигураций представляет собой открытую конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, пространство между пластинами не регулируется разделителями, и образец размещен на одной или обеих пластинах;

где другая конфигурация представляет собой закрытую конфигурацию, в которую приводят после размещения образца в открытой конфигурации; и в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители и подходящий объем образца находятся между пластинами, толщина подходящего объема образца регулируется пластинами и разделителями, и она является тоньше, чем толщина образца в том случае, когда пластины приведены в открытую конфигурацию; и образец находится в контакте с участком связывания и участком хранения;

и где подходящий объем представляет собой по меньшей мере часть или весь объем образца.

7.2. Образование «сэндвича» средство для захвата-аналит-средство для выявления на участке связывания в одной стадии инкубации с применением аналита, который происходит из части образца (т.е. локально).

W3. Способ образования «сэндвича» средство для захвата-аналит-средство для выявления на участке связывания пластины с применением аналитов, которые происходят из части образца, предусматривающий:

(а) получение образца, который содержит целевой аналит, где целевой аналит способен к диффузии в образце;

(b) получение средств для захвата и получение средств для выявления, где средства для захвата и средства для выявления способны связываться с целевым аналитом с образованием «сэндвича» средство для захвата-целевой аналит-средство для выявления;

(c) получение первой пластины и второй пластины, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации; где первая пластина имеет участок связывания, который содержит средства для связывания, подлежащие иммобилизации на участок, и вторая пластина имеет участок хранения, который содержит средства для выявления, которые в случае, когда участок хранения находится в контакте с образцом, способны растворяться в образце и диффундировать в образце; и где одна или обе пластины содержат разделители, и каждый из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине и имеет предварительно заданную высоту;

(d) размещение образца на одной или обеих пластинах, когда пластины приведены в открытую конфигурацию; где открытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой две пластины частично или полностью отделены друг от друга, а пространство между пластинами не регулируется разделителями;

(e) после (d) распределение образца за счет перевода пластин в закрытую конфигурацию, где в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители, участок связывания и участок хранения находятся между пластинами, участок связывания и участок хранения находятся в контакте с подходящим объемом образца, и толщину подходящего объема образца регулируют с помощью пластин и разделителей, и она является тоньше, чем толщина образца в том случае, когда пластины приведены в открытую конфигурацию, и значительно меньше, чем средний линейный размер участка связывания; и

(f) после (е) и пока пластины находятся в закрытой конфигурации, инкубация в течение определенного времени и остановка инкубации, где время инкубации выбрано таким образом, что оно приводит к тому, что значительное количество «сэндвича» средство для захвата-аналит-средство для выявления, образованного в участке связывания, содержит аналиты, которые происходят из подходящего объема образца, где подходящий объем представляет собой объем образца, который расположен на участке связывания, и инкубация представляет собой процесс, который способствует образованию «сэндвича» средство для захвата-аналит-средство для выявления.

В некоторых вариантах осуществления соотношение пространства и размера участка может составлять не более 1/5.

W4. Устройство для образования «сэндвича» средство для захвата-аналит-средство для выявления на участке связывания пластины с применением аналитов, которые происходят из части образца, содержащее:

первую пластину и вторую пластину, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации;

где первая пластина имеет участок связывания, который содержит средства для захвата, иммобилизированные на участке, а вторая пластина имеет участок хранения, который содержит средства для выявления; где средства для захвата и средства для выявления (способны связываться) связываются с целевым аналитом в образце с образованием «сэндвича» средство для захвата-целевой аналит-средство для выявления; при этом, когда участок хранения находится в контакте с образцом, средства для выявления способны растворяться в образце и диффундировать в образце; и где одна или обе пластины содержат разделители, и каждый из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине и имеет предварительно заданную высоту;

где одна из конфигураций представляет собой открытую конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, пространство между пластинами не регулируется разделителями, и образец размещен на одной или обеих пластинах;

где другая из конфигураций представляет собой закрытую конфигурацию, в которую приводят после размещения образца в открытой конфигурации; и в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители, участок связывания и участок хранения находятся между пластинами, участок связывания и участок хранения находятся в контакте с подходящим объемом образца, и толщину подходящего объема образца регулируют с помощью пластин и разделителей, и она является тоньше, чем толщина образца в случае, когда пластины находятся в открытой конфигурации; и где подходящий объем представляет собой объем образца, который размещен на участке связывания; и

где высоту разделителя выбирают с целью регуляции толщины подходящего объема в закрытой конфигурации, которая значительно мекыне, чем средний линейный размер участка связывания.

7.3. Способ уменьшения времени образования «сэндвича» средство для захвата-аналит-средство для выявления на участке связывания в результате снижения расстояния диффузии (W, X)

W5. Способ уменьшения времени образования «сэндвича» средство для захвата-аналит-средство для выявления на участке связывания пластины, предусматривающий:

(а) получение образца, который содержит целевой аналит, где целевой аналит способен к диффузии в образце;

(b) получение средств для захвата и получение средств для выявления, где средства для захвата и средства для выявления способны связываться с целевым аналитом с образованием «сэндвича» средство для захвата-целевой аналит-средство для выявления;

(c) получение первой пластины и второй пластины, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации; где первая пластина имеет участок связывания, который содержит средства для связывания, подлежащие иммобилизации на участок, и вторая пластина имеет участок хранения, который содержит средства для выявления, которые в случае, когда участок хранения находится в контакте с образцом, способны растворяться в образце и диффундировать в образце; и где одна или обе пластины содержат разделители, и каждый из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине и имеет предварительно заданную высоту;

(d) размещение образца на одной или обеих пластинах, когда пластины приведены в открытую конфигурацию; где открытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой две пластины частично или полностью отделены друг от друга, а пространство между пластинами не регулируется разделителями;

(e) после (d) распределение образца за счет перевода пластин в закрытую конфигурацию, где в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители, участок связывания и участок хранения находятся между пластинами, участок связывания перекрывает участок хранения, участок связывания и участок хранения находятся в контакте с подходящим объемом образца, и толщину подходящего объема образца регулируют с помощью пластин и разделителей, и она является тоньше, чем толщина образца в том случае, когда пластины находятся в открытой конфигурации, и тем самым уменьшенная толщина образца снижает время для вертикальной диффузии аналитов и средств для выявления в толще образца, где подходящий объем составляет по меньшей мере часть всего объема образца.

где период времени, обеспечивающий возможность целевому объекту в подходящем объеме связаться с участком связывания, короче, чем таковой в отсутствие закрытой конфигурации.

- Способ может дополнительно предусматривать стадию промывки для удаления образца между пластинами, и стадию промывки выполняют, когда пластины находятся либо в закрытой конфигурации, либо в открытой конфигурации.

- Способы дополнительно предусматривают стадию считывания, во время которой считывается сигнал от «сэндвича» средство для захвата-аналит-средство для выявления, иммобилизированного на участке связывания. Считывание выполняют либо после промывки, либо без какой-либо промывки.

Способ дополнительно может быть мультиплексным, как описано выше или ниже.

W6. Устройство для снижения времени образования «сэндвича» средство для захвата-аналит-средство для выявления на участке связывания пластины, содержащее

первую пластину и вторую пластину, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации;

где первая пластина имеет участок связывания, который содержит средства для захвата, иммобилизированные на участке, а вторая пластина имеет участок хранения, который содержит средства для выявления; где средства для захвата и средства для выявления (способны связываться) связываются с целевым аналитом в образце с образованием «сэндвича» средство для захвата-целевой аналит-средство для выявления; при этом, когда участок хранения находится в контакте с образцом, средства для выявления способны растворяться в образце и диффундировать в образце; и где одна или обе пластины содержат разделители, и каждый из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине и имеет предварительно заданную высоту;

где одна из конфигураций представляет собой открытую конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, пространство между пластинами не регулируется разделителями, и образец размещен на одной или обеих пластинах;

где другая из конфигураций представляет собой закрытую конфигурацию, в которую приводят после размещения образца в открытой конфигурации; и в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители, участок связывания и участок хранения находятся между пластинами, участок связывания перекрывает участок хранения, участок связывания и участок хранения находятся в контакте с подходящим объемом образца, и толщину подходящего объема образца регулируют с помощью пластин и разделителей, и она является тоньше, чем толщина образца в случае, когда пластины находятся в открытой конфигурации, и тем самым сниженная толщина образца снижает время для вертикальной диффузии аналитов и средств для выявления в толще образца, где подходящий объем составляет по меньшей мере часть всего объема образца.

В этих вариантах осуществления способ может предусматривать прикрепление средства для захвата к пластине, где прикрепление выполняют посредством химической реакции средства для захвата с реакционно-способной группой на пластине. Другая пластина может содержать пятно высушенного средства для выявления в местоположении, вследствие чего после смыкания пластин, закрепленное средство для захвата и пятно средства для выявления становятся обращенными друг к другу. Кроме того, способ может предусматривать приведение в контакт образца, содержащего целевой аналит, с устройством, и закрытие пластин как описано выше. Средство для выявления растворяется и диффундирует в образец. Поскольку целевой аналит находится в растворе, то целевой аналит будет связываться средством для захвата и иммобилизироваться на поверхности одной из пластин. Средство для выявления может связываться с целевым аналитом до или после того, как оно свяжется со средством для захвата. В некоторых случаях способ может предусматривать удаление любых целевых аналитов, которые не связались со средством для захвата, или любого не связавшегося реагента для выявления (например, путем промывки поверхности пластины в буфере для связывания). Средство для выявления можно конъюгировать с оптической выявляемой меткой, обеспечивая тем самым метод выявления целевого аналита. После необязательного удаления средства для выявления, которое не связалось с целевым аналитом, систему можно подвергать считыванию, например, с применением системы для считывания, чтобы провести считывание светового сигнала (например, света при длине волны, которая находится в диапазоне от 300 нм до 1200 нм) от средства для выявления, которое связалось с пластиной. Кроме того, как упомянуто выше, средство для выявления может быть меченым непосредственно (в этом случае средство для выявления можно прочно связать со светоиспускающей меткой до размещения на одной из пластин), или меченым опосредованно (т.е. за счет связывания средства для выявления со вторым средством для захвата, например, вторичным антителом, которое является меченным, или меченой нуклеиновой кислотой, которая специфически связывается со средством для выявления, и которые связаны со светоиспускающей меткой). В некоторых вариантах осуществления способ может предусматривать блокирующее средство, с предотвращением тем самым неспецифического связывания средств для захвата с нецелевыми аналитами. Подходящие условия для специфического связывания целевых аналитов с другими средствами, включающие соответствующую температуру, время, показатель рН раствора, уровень естественной освещенности, влажность, концентрацию химических реагентов, соотношение антиген-антитело и т.д., являются хорошо известными или их с можно с легкостью получить, исходя из настоящего изобретения. Общие способы в случае способов молекулярного взаимодействия между средствами для захвата и их партнерами по связыванию (в том числе аналитами) хорошо известны из уровня техники (см., например, Harlow et al,. Antibodies: A Laboratory Manual, First Edition (1988) Cold spring Harbor, N.Y.; Ausubel, et al, Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995). Способы, описанные выше и ниже, являются иллюстративными; способы данного документа не представляют собой единственные пути выполнения анализа.

В определенных вариантах осуществления средство для захвата на основе нуклеиновой кислоты можно применять для захвата белкового аналита (например, ДНК- или РНК-связывающий белок). В альтернативных вариантах осуществления белковое средство для захвата (например, ДНК- или РНК-связывающий белок) можно применять для захвата аналита, представляющего собой нуклеиновую кислоту.

Образец может представлять собой клинический образец, полученный из клеток, тканей или биологических жидкостей. Биологические жидкости, представляющие интерес, включают без ограничения амниотическую жидкость, водянистую влагу глаза, жидкую часть стекловидного тела, кровь (например, цельную кровь, фракционированную кровь, плазму, сыворотку крови и т.д.), грудное молоко, спинномозговую жидкость (CSF), ушную серу (серную пробку), хилус, химус, эндолимфу, перилимфу, фекалии, кислоты желудочного сока, желудочный сок, лимфу, слизь (в том числе отделяемую из носа и слизистую мокроту), перикардиальную жидкость, перитонеальную жидкость, плевральную жидкость, гной, водянистые выделения, слюну, секрет сальных желез (кожное сало), сперму, мокроту, пот, синовиальную жидкость, слезы, рвотную массу, мочу и конденсат выдыхаемого воздуха.

В одном варианте осуществления данного анализа пластину приводят в контакт с образцом, содержащим целевой аналит (например, целевой белок), и пластины закрывают. Образец содержит все необходимые реагенты или является усовершенствован, чтобы содержать их (например, соли и т.п.) в условиях, подходящих для специфического связывания. Средства для захвата (например, антитела) и средство для выявления специфически связываются с целевым аналитом в образце, что приводит тем самым к тому, что пятно меченого аналита может быть выявлено.

Как и в любом варианте осуществления, количество целевого аналита в образце можно измерить с получением качественной или количественной меры количества целевого аналита в образце. В некоторых вариантах осуществления величина сигнала обеспечивает количественное определение величины целевого аналита в образце. В некоторых случаях оценку можно сравнить со стандартной кривой например, полученной для второго аналита или точно отмеренного аналита, которые в определенных случаях могут находиться при известной концентрации. Это сравнение можно облегчать в результате размещения средств для захвата при различных плотностях (например, различных концентрациях) и считывания сигнала от каждой вставки средства для захвата.

8. Связывание и добавление с применением образцов и реагентов с небольшим объемом (V)

Во многих вариантах применения очень желательно использовать как можно меньший объем образца или реагента. Однако в микрофлюидных канальных устройствах (наиболее популярный подход в настоящее время при использовании небольших образцов) значительный объем образца расходуется при перемещении от входного отверстия к участку тестирования (выявления) устройства, что в результате влечет за собой необходимость в объеме образца большем, чем объем в исследуемом местоположении. Одним аспектом настоящего изобретения является значительное снижение объема образца или реагента, используемых при тестировании, в результате размещения небольшого объема образца или реагента на пластине и затем превращения объема в тонкую пленку с меньшей толщиной, но большей поверхностью, чем ранее. Такое превращение также способствует более быстрой реакции.

8-1. Связывание целевого объекта в образце небольшого объема на участке связывания поверхности в результате распределения образца

V1. Способ связывания целевого объекта в образце с участком связывания, предусматривающий:

(a) получение первой пластины и второй пластины, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации, где первая пластина имеет на своей поверхности участок связывания, и где одна или обе пластины содержат разделители, и каждый из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине и имеет предварительно заданную высоту;

(b) получение образца, который содержит целевой объект, подлежащий связыванию с участком связывания;

(c) размещение образца на одной или обеих пластинах, когда пластины приведены в открытую конфигурацию; при этом в открытой конфигурации две пластины частично или полностью отделены друг от друга, промежуток между пластинами не регулируется с помощью разделителей, и после размещения образец либо не покрывает площадь, либо частично покрывает площадь участка связывания;

(d) после (с) распределение образца за счет перевода пластин в закрытую конфигурацию, где в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители и подходящий объем образца находятся между пластинами, образец контактирует с большей площадью участка хранения, чем когда пластины находятся в открытой конфигурации, и толщину подходящего объема образца регулируют с помощью разделителя, где подходящий объем представляет собой часть образца на участке хранения.

V2. Устройство для связывания целевого объекта в образца с поверхностью участка связывания, содержащее первую пластину и вторую пластину, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации;

где первая пластина имеет на своей поверхности участок связывания, который связывает целевой объект в образце, и где участок связывания имеет площадь, большую, чем площадь контакта с образцом, когда образец размещен только на одной из пластин и не контактирует с другой пластиной;

где одна или обе пластины содержат разделители, и каждый из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине и имеет предварительно заданную высоту;

где одна из конфигураций представляет собой открытую конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, пространство между пластинами не регулируется разделителями, и образец размещен на одной или обеих пластинах, и после размещения, либо не покрывает площадь, либо частично покрывает площадь участка связывания;

где другая из конфигураций представляет собой закрытую конфигурацию, в которую приводят после размещения образца в открытой конфигурации; и в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители и образец находятся между пластинами, образец контактирует с большей площадью участка связывания, чем когда пластины находятся в открытой конфигурации, и толщину подходящего объема образца на участке связывания регулируют с помощью пластин и разделителей.

8-2. Добавление реагентов в образец небольшого объема за счет распределения образца

V3. Способ связывания целевого объекта в образце с участком связывания, предусматривающий:

(a) получение первой пластины и второй пластины, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации, где первая пластина имеет на своей поверхности участок хранения, который содержит реагенты, подлежащие добавлению в образец, и где одна или обе пластины содержат разделители, и каждый из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине и имеет предварительно заданную высоту;

(b) размещение образца на одной или обеих пластинах, когда пластины приведены в открытую конфигурацию; где в открытой конфигурации две пластины частично или полностью отделены друг от друга, пространство между пластинами не регулируется с помощью разделителей, и образец после размещения либо не контактирует с площадью, либо частично покрывает площадь участка хранения;

(c) после (b) распределение образца за счет перевода пластин в закрытую конфигурацию, где в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители и подходящий объем образца находятся между пластинами, образец контактирует с большей площадью участка хранения, чем когда пластины находятся в открытой конфигурации, и толщину подходящего объема образца регулируют с помощью разделителя, где подходящий объем представляет собой часть образца на участке хранения.

V4. Устройство для связывания целевого объекта в образце с участком связывания, содержащее

первую пластину и вторую пластину, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации,

где первая пластина имеет на своей поверхности участок хранения, который содержит реагенты, и реагенты подлежат добавлению в образец; и где одна или обе пластины содержат разделители, и каждый из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине и имеет предварительно заданную высоту;

где одна или обе пластины содержат разделители, и каждый из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине и имеет предварительно заданную высоту;

где одна из конфигураций представляет собой открытую конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, пространство между пластинами не регулируется разделителями, и образец размещен на одной или обеих пластинах,

где другая из конфигураций представляет собой закрытую конфигурацию, в которую приводят после размещения образца в открытой конфигурации; и в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители и подходящий объем образца находятся между пластинами, образец контактирует с большей площадью участка хранения, чем когда пластины находятся в открытой конфигурации, и толщину подходящего объема образца регулируют с помощью разделителя, где подходящий объем представляет собой часть образца на участке хранения.

В способах по пунктам VI и V2 и устройствах по пунктам V3 и V4 в некоторых случаях, даже в том случае, если образец размещен в области участка связывания или области хранения, благодаря небольшому объему образца и смачиваемому свойству поверхности, площадь контакта с размещенным таким образом образцом с пластиной будет меньше, чем площадь участка связывания или участка хранения. Таким образом, требуется распределение, особенно точное распределение.

Капли образца могут представлять собой несколько капель, и в закрытой конфигурации капли сливаются с пленкой с толщиной меньшей, чем максимальная толщина.

В настоящем изобретении в способе по пунктам V1-V7 и устройствах по пунктам V2-V8 объем образца, который размещен на пластине или пластинах («объем образца»), составляет не более 0,001 пл (пиколитра), не более 0,01 пл, не более 0,1 пл, не более 1 пл, не более 10 пл, не более 100 пл, не более 1 нл (нанолитра), не более 10 нл, не более 100 нл, не более 1 мкл (микролитра), не более 10 мкл, не более 100 мкл, не более 1 мл (миллилитра), не более 10 мл или находится в диапазоне между любыми двумя из этих значений.

9. Однородность связывания или добавления реагентов с применением однородной толщины образца (UAB)

В случае анализов и химических реакций предпочтительным является получение тонкой пленки образца, однородной в пределах значительной площади. Примеры включают связывание объекта в образце с поверхностным участком связывания, добавление реагентов в образец, количественное определение подходящего объема образца, количественное определение аналитов и т.д. В случае способов, в которых две пластины применяются для снижения и регуляции толщины подходящего объема (части или всего объема) образца, необходимо, чтобы они были точными, единообразными и легкими для применения.

Один аспект настоящего изобретения должен повысить точность, единообразность или легкость применения способов и/или устройств, которые регулируют толщину подходящего объема образца за счет сжатия образца с помощью двух пластин.

9.1. Способ однородного связывания объекта в образце в участке связывания пластины

UAB1. Способ однородного связывания объекта в образце в участке связывания пластины, предусматривающий:

(a) получение образца, который содержит целевой объект, который способен к диффузии в образце;

(b) получение первой пластины и второй пластины, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации, где первая пластина имеет на своей поверхности участок связывания, который выполнен с возможность связывания с целевым объектом, где одна или обе пластины содержат разделители, и каждый из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине и имеет предварительно заданную высоту;

(c) размещение образца на одной или обеих пластинах, когда пластины приведены в открытую конфигурацию; где открытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, и пространство между пластинами не регулируется разделителями;

(d) после (с) распределение образца за счет перевода пластин в закрытую конфигурацию, при этом в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители и подходящий объем образца находятся между пластинами, участок связывания находится в контакте с подходящим объемом, толщину подходящего объема образца регулируют с помощью пластин и разделителей, и по сравнению с пластинами, которые находятся в открытой конфигурации, она является тоньше, чем максимальная толщина образца, и более однородной в пределах участка связывания;

где разделители и пластина выполнены с возможностью получения регулируемой толщины подходящего объема при закрытой конфигурации пластин, более однородной, чем такая толщина в открытой конфигурации пластин; и где подходящий объем представляет собой часть или весь объем образца.

- Дополнительно имеется участок хранения на пластине, противоположный участку связывания, для образования однородного «сэндвича».

UAB2. Устройство для однородного связывания объекта в образце в участке связывания пластины, содержащее

первую пластину и вторую пластину, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации;

где первая пластина имеет на своей поверхности участок связывания, который выполнен с возможностью связывания целевого объекта, где одна или обе пластины содержат разделители, и каждый из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине и имеет предварительно определенную высоту;

где одна из конфигураций представляет собой открытую конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, пространство между пластинами не регулируется разделителями, и образец размещен на одной или обеих пластинах;

где другая из конфигураций представляет собой закрытую конфигурацию, в которую приводят после размещения образца в открытой конфигурации; и в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители и подходящий объем образца находятся между пластинами, участок связывания находится в контакте с подходящим объемом, толщину подходящего объема образца регулируют с помощью пластин и разделителей, и по сравнению с пластинами, которые находятся в открытой конфигурации, она является тоньше, чем максимальная толщина образца, и более однородной в пределах участка связывания;

где разделители и пластины выполнены с возможностью получения более однородной регулируемой толщины подходящего объема при закрытой конфигурации пластин, чем толщина при открытой конфигурации пластин; и где подходящий объем представляет собой часть или весь объем образца.

9.2. Способ для однородности добавления реагента на пластине в образец

UAB3. Способ для однородности добавления реагента в подходящий объем образца, предусматривающий:

(a) получение первой пластины и второй пластины, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации, где первая пластина имеет на своей поверхности участок хранения, который содержит реагенты, подлежащие добавлению в подходящий объем образца, при этом реагенты способны растворяться в образце и диффундировать в образце; и где одна или обе пластины содержат разделители, и каждый из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине и имеет предварительно заданную высоту;

(b) получение образца;

(c) размещение образца на одной или обеих пластинах, когда пластины приведены в открытую конфигурацию; где открытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, и пространство между пластинами не регулируется разделителями;

(d) после (с) распределение образца за счет перевода пластин в закрытую конфигурацию, при этом в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители и подходящий объем образца находятся между пластинами, участок хранения находится в контакте с подходящим объемом, и толщину подходящего объема образца регулируют с помощью пластин и разделителей, и она является тоньше, чем максимальная толщина образца, когда пластины находятся в открытой конфигурации;

где разделители и пластины выполнены с возможностью получения более однородной толщины подходящего объема образца над областью подходящего объема при закрытой конфигурации пластин, чем толщина при открытой конфигурации пластин; и где подходящий объем представляет собой часть или весь объем образца.

UAB4. Устройство для однородного добавления реагента к подходящему объему образца, содержащее

первую пластину и вторую пластину, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации;

где первая пластина имеет на своей поверхности участок хранения, который содержит реагенты, подлежащие добавлению в подходящей объем образца, при этом реагенты способны растворяться в образце и диффундировать в образце; и где одна или обе пластины содержат разделители, и каждый из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине и имеет предварительно заданную высоту;

где одна из конфигураций представляет собой открытую конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, пространство между пластинами не регулируется разделителями, и образец размещен на одной или обеих пластинах;

где другая из конфигураций представляет собой закрытую конфигурацию, в которую приводят после размещения образца в открытой конфигурации; и в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители и подходящий объем образца находятся между пластинами, участок хранения находится в контакте с подходящим объемом, и толщину подходящего объема образца регулируют с помощью пластин и разделителей, и она является тоньше, чем максимальная толщина образца, когда пластины находятся в открытой конфигурации;

где разделители и пластины выполнены с возможностью получения более однородной толщины подходящего объема образца над областью подходящего объема при закрытой конфигурации пластин, чем толщина при открытой конфигурации пластин; и где подходящий объем представляет собой часть или весь объем образца.

9.3. Способ однородного образования «сэндвича» средство для захвата-аналит-средство для выявления на участке связывания

UAB5. Способ однородного образования «сэндвича» средство для захвата-аналит-средство для выявления на участке связывания пластины, предусматривающий:

(a) получение образца, который содержит целевой аналит;

(b) получение средств для захвата и получение средств для выявления, где средства для захвата и средства для выявления способны связываться с целевым аналитом с образованием «сэндвича» средство для захвата-целевой аналит-средство для выявления;

(c) получение первой пластины и второй пластины, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации; где первая пластина имеет участок связывания, который содержит средства для связывания, подлежащие иммобилизации на участок, и вторая пластина имеет участок хранения, который содержит средства для выявления, которые в том случае, когда участок хранения находится в контакте с образцом, способны растворяться в образце и диффундировать в образце; и где одна или обе пластины содержат разделители, и каждый из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине и имеет предварительно заданную высоту;

(d) размещение образца на одной или обеих пластинах, когда пластины приведены в открытую конфигурацию; где открытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой две пластины частично или полностью отделены друг от друга, а пространство между пластинами не регулируется разделителями;

(е) после (d) распределение образца за счет перевода пластин в закрытую конфигурацию, где в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители и подходящий объем образца находятся между пластинами, толщина подходящего объема образца регулируется пластинами и разделителями, и она является тоньше, чем толщина образца в том случае, когда пластины приведены в открытую конфигурацию; и образец находится в контакте с участком связывания и участком хранения;

где разделители и пластины выполнены с возможностью получения более однородной толщины подходящего объема образца над областью подходящего объема при закрытой конфигурации пластин, чем толщина при открытой конфигурации пластин; и где подходящий объем представляет собой часть или весь объем образца.

UAB6. Устройство для однородного образования «сэндвича» средство для захвата-аналит-средство для выявления на участке связывания пластины, содержащее:

первую пластину и вторую пластину, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации;

где первая пластина имеет участок связывания, который содержит средства для захвата, подлежащие иммобилизации на участке, и средства для захвата способны к связывания с целевым аналитом в образце;

где вторая пластина имеет участок связывания, который содержит средства для выявления, которые способны (а) при приведении участка хранения в контакт с образцом растворяться в образце и диффундировать в образце и (b) связываться с целевым аналитом и образовывать многослойную структуру средство для захвата-целевой аналит-средство для выявления;

где одна или обе пластины содержат разделители, и каждый из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине и имеет предварительно заданную высоту;

где одна из конфигураций представляет собой открытую конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, пространство между пластинами не регулируется разделителями, и образец размещен на одной или обеих пластинах;

где другая конфигурация представляет собой закрытую конфигурацию, в которую приводят после размещения образца в открытой конфигурации; и в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители и подходящий объем образца находятся между пластинами, толщина подходящего объема образца регулируется пластинами и разделителями, и она является тоньше, чем толщина образца в том случае, когда пластины находятся в открытой конфигурации; и образец находится в контакте с участком связывания и участком хранения;

где разделители и пластины выполнены с возможностью получения более однородной толщины подходящего объема образца над областью подходящего объема при закрытой конфигурации пластин, чем толщина при открытой конфигурации пластин; и где подходящий объем представляет собой часть или весь объем образца.

9.4. Однородная регуляция толщины подходящего объема образца между двумя пластинами

UAB7. Способ регуляции толщины подходящего объема образца, предусматривающий:

(a) получение образца, где толщина подходящего объема образца подлежит регуляции;

(b) получение двух пластин, которые являются перемещаемым относительно друг друга в разные конфигурации, где одна или обе пластины содержат разделители, и при этом разделители характеризуются предварительно заданными расстоянием между разделителями и высотой, и при этом каждый из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине;

(c) размещение образца на одной или обеих пластинах, когда пластины приведены в открытую конфигурацию; где открытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, и пространство между пластинами не регулируется разделителями;

(d) после (с) распределение образца за счет перевода пластин в закрытую конфигурацию, где в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители и подходящий объем образца находятся между пластинами, толщину подходящего объема образца регулируют с помощью пластин и разделителей, и она является тоньше, чем максимальная толщина образца, когда пластины находятся в открытой конфигурации;

где разделители и пластины выполнены с возможностью получения более однородной толщины подходящего объема образца над областью подходящего объема при закрытой конфигурации пластин, чем толщина при открытой конфигурации пластин; и где подходящий объем представляет собой часть или весь объем образца.

UAB8. Устройство для регулирования толщины подходящего объема образца, содержащее первую пластину и вторую пластину, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации;

где одна или обе пластины содержат разделители, при этом разделители имеют предварительно заданные расстояние между разделителями и высоту, и каждый из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине;

где одна из конфигураций представляет собой открытую конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, пространство между пластинами не регулируется разделителями, и образец размещен на одной или обеих пластинах;

где другая из конфигураций представляет собой закрытую конфигурацию, в которую приводят после размещения образца в открытой конфигурации; и в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители и подходящий объем образца находятся между пластинами, толщину подходящего объема образца регулируют с помощью пластин и разделителей, и она является тоньше, чем максимальная толщина образца, когда пластины находятся в открытой конфигурации;

где разделители и пластины выполнены с возможностью получения более однородной толщины подходящего объема образца над областью подходящего объема при закрытой конфигурации пластин, чем толщина при открытой конфигурации пластин; и где подходящий объем представляет собой часть или весь объем образца.

В способах и устройствах по пунктам U1-U8 конфигурация разделителей и пластин, которые делают толщину подходящего объема образца однородной, предусмотрен вариант осуществления, описанный в настоящем раскрытии.

Однородность толщины образца. В способах и устройствах по пунктам U1-U8 однородность толщины подходящего объема образца является такой, что толщина образца при закрытой конфигурации имеет относительную вариацию не более 0,001%, не более 0,01%, не более 0,05%, не более 0,1%, не более 0,5%, не более 1%, не более 2%, не более 5%, не более 10%, не более 20%, не более 30%, не более 50%, не более 75%, не более 90%, не более 100% или находится между любыми двумя из этих значений.

В предпочтительном варианте осуществления способов и устройств в пунктах с U1 по U8 однородность толщины подходящего объема образца является такой, что толщина образца при закрытой конфигурации характеризуется относительной вариацией не более 0,1%, не более 0,5%, не более 1%, не более 2%, не более 5%, не более 10%, не более 20%, не более 30%, не более 50% или находится между любыми двумя из этих значений.

Другим параметром, который может быть важным для снижения времени инкубации до насыщения, является однородность толщины образца. Если толщина имеет большую вариацию в пределах участка связывания, то время инкубации до насыщения может варьировать от местоположения до местоположения в участке связывания, ускоряя более длительное время инкубации до насыщения, чтобы обеспечить достижение насыщения всех местоположений в участке связывания.

10. Поверхность усиления

Одним из текущих основных препятствий для РоС-диагностики и для любых анализов, в которых применяют образец небольшого объема, является низкая чувствительность. Желательно усиливать сигнал анализа. Один аспект настоящего изобретения связан с устройствами и способами, которые помещают участок связывания на поверхность усиления сигнала (SAS) для усиления сигнала с целью достижения более высокой чувствительности. Поверхности усиления сигнала также могут называться слоями усиления сигнала (SAL).

Общие структуры SAL предусматривают наноразмерные структуры металл-диэлектрик/полупроводник-металл, которые усиливают электрическое поле, и градиент локальной поверхности, а также световые сигналы. Усиление является сильным в местоположении, где имеются острые (например, с большой кривизной) края металлических структур и небольшие промежутки между двумя металлическими структурами. Областями с самым большим усилением являются области, имеющие как острые края, так и небольшие промежутки. Кроме того, размеры всех металлических и неметаллических микро/наноструктур обычно меньше, чем длина волны света, которую усиливает SAL (т.е. субволновые).

В некоторых вариантах осуществления слой SAL имеет как можно больше металлических острых краев и небольших промежутков. Для этого требуется наличие плотной группы металлических наноструктур с небольшими промежутками между наноструктурами. Структуры SAL могут включать несколько различных слоев. Кроме того, слой SAL сам по себе можно дополнительно улучшить с помощью способа, в котором можно дополнительно покрывать части металлических материалов, которые не имеют острых краев и небольших промежутков, как описано в предварительной заявке США с порядковым №61/801424, поданной 15 марта 2013 г., и заявке согласно РСТ WO2014197096, поданной 15 марта 2014 г., которые включены посредством ссылки для всех целей, а также PCT/US2014/028417 (Chou et al, "Analyte Detection Enhancement By Targeted Immobilization, Surface Amplification, And Pixelated Reading And Analysis"), который включен в данный документ посредством ссылки для всех целей.

Одним определенным вариантом осуществления поверхности усиления сигнала является массив D2PA (массивы дисковых антенн, сопряженных с точками на столбиках), который может также содержать молекулярный адгезивный слой, который покрывает часть указанной металлической точечной структуры, указанный металлический диск и/или указанную металлическую заднюю пластину, и необязательно средство для захвата, которое специфически связывается с аналитом, где указанное средство для захвата связано с молекулярным адгезивным слоем массива D2PA. Наносенсор может усиливать световой сигнал от аналита, если указанный аналит связан со средством для захвата. В некоторых вариантах осуществления размер одного, нескольких или всех критических металлических и диэлектрических компонентов SAL является меньшим длины волны света при обнаружении. Подробности физической структуры массивов антенных устройств из соединенных с диском точек на столбике, способы их изготовления, способы связывания средств для захвата с массивами дисковых антенн, сопряженных с точками на столбиках и способы применения массивов дисковых антенн, сопряженных с точками на столбиках для выявления аналитов описаны в ряде публикаций, в том числе WO2012024006, WO2013154770, Li et al (Optics Express 201 1 19, 3925-3936), Zhang et al (Nanotechnology 2012 23: 225-301); и Zhou et al (Anal. Chem. 2012 84: 4489), которые включены посредством ссылки для всех целей.

10.1. Усиление сигнала при проведении анализа целевого объекта в подходящем объеме образца

M1. Способ усиления сигнала при проведении анализа целевого объекта в подходящем объеме образца, предусматривающий:

(a) получение образца, который содержит целевой объект;

(b) получение двух пластин, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации, где одна пластина содержит на своей поверхности один участок связывания, который содержит поверхность усиления сигнала, которую приводят в конфигурацию с целью связывания целевого объекта и усиления оптического сигнала, который находится на поверхности усиления сигнала или возле нее; и где одна или обе пластины содержат разделители, и каждый из разделителей находится на своей соответствующей пластине и имеет предварительно заданную высоту;

(c) размещение образца на одной или обеих пластинах, когда пластины приведены в открытую конфигурацию; где открытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой две пластины отделены друг от друга, и пространство между пластинами не регулируется разделителями;

(d) после (с) распределение образца за счет перевода пластин в закрытую конфигурацию, при этом в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители и подходящий объем образца находятся между пластинами, толщина подходящего объема образца регулируется пластинами и разделителями, и она является тоньше, чем такая толщина, когда пластины приведены в открытую конфигурацию; и подходящий объем образца находится в контакте с участком связывания; и

(е) после (е) инкубацию, когда пластины находятся в закрытой конфигурации, в течение периода времени, который обеспечивает связывание целевого объекта в подходящем объеме образца с участком связывания; где подходящий объем представляет собой часть образца, которая контактирует с участком связывания, пока пластины находятся в закрытой конфигурации.

М2. Устройство для усиления сигнала при определении целевого объекта в подходящем объеме образца, содержащее

первую пластину и вторую пластину, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации,

где первая пластина содержит на своей поверхности один участок связывания, и участок связывания содержит поверхность усиления сигнала, которую приводят в конфигурацию с целью (i) связывания целевого объекта в образце и (ii) усиления оптического сигнала, который находится на поверхности усиления сигнала или возле нее;

где одна или обе пластины содержат разделители, и каждый из разделителей находится на своей соответствующей пластине и имеет предварительно заданную высоту;

где одна из конфигураций представляет собой открытую конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, пространство между пластинами не регулируется разделителями, и образец размещен на одной или обеих пластинах,

где другая из конфигураций представляет собой закрытую конфигурацию, в которую приводят после размещения образца в открытой конфигурации; и в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители и подходящий объем образца находятся между пластинами, толщину подходящего объема образца регулируют с помощью пластин и разделителей, и она является тоньше, чем такая толщина, когда пластины находятся в открытой конфигурации;

где подходящий объем представляет собой часть образца, которая контактирует с участком связывания, когда пластины находятся в закрытой конфигурации.

В некоторых вариантах осуществления поверхность усиления сигнала включает по меньшей мере одно из наноструктуры металл-диэлектрик, наноструктуры металл-полупроводник и массива дисковых антенн, сопряженных с точками на столбиках.

В некоторых вариантах осуществления поверхность усиления сигнала включает металлический слой.

11. Сохранение объема реагента при анализе при быстром связывании (S)

В ситуации связывания объекта в реагенте с участком связывания на поверхности (например, покрытия пластины средством для захвата или окрашивания поверхности биологическим образцом) желательно иметь короткое время инкубации. Одним подходом для короткого времени инкубации является значительное повышение концентрации объекта в реагенте. Однако такой подход является расточительным в отношении объекта и, следовательно, дорогостоящим, поскольку при коротком времени инкубации лишь небольшая часть объекта в реагенте, который находится возле участка связывания, может достичь участка связывания с целью связывания, а оставшаяся часть находится слишком далеко, чтобы диффундировать к участку связывания с целью связывания и является бесполезной и растраченной впустую. В случае типичной константы диффузии обычных реагентов в обычных растворах типичная длина диффузии составляет приблизительно 10 мкм, 33 мкм и 100 мкм соответственно для времени инкубации 1 с (секунда), 10 с и 100 с. Типичная толщина жидкой капли на типичной поверхности составляет 2,5 мм, что по меньшей мере в 25 раз толще, чем вышеуказанные значения длины диффузии, что приводит к образованию значительного количества отходов (затратам), если время инкубации составляет 100 с или меньше. Один аспект настоящего изобретения предусматривает распределение капли(капель) реагента на большей области, однако при очень тонкой толщине (тоньше, чем естественное накалывание) с целью сохранения реагентов и тем самым снижения стоимости.

11-1. Способ сохранения реагента, который содержит целевой объект в реагентах, который связывается с участком связывания поверхности в результате распределения реагента. (Объем имеет естественную площадь соприкосновения, которая меньше, чем участок связывания)

S1. Способ сохранения реагента, который содержит целевой объект, который связывается с участком связывания поверхности, предусматривающий:

(a) получение первой пластины и второй пластины, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации, где первая пластина имеет на своей поверхности участок связывания, и где одна или обе пластины содержат разделители, и каждый из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине и имеет предварительно заданную высоту;

(b) получение реагента, который (i) содержит целевой объект, способный связывать участок связывания, и (ii) имеет объем и смачивающее свойство, за счет которых площадь контакта с реагентом, размещенным на участке связывания, без контакта с другой пластиной, меньше, чем площадь участка связывания;

(c) размещение образца на одной или обеих пластинах, когда пластины приведены в открытую конфигурацию; где в открытой конфигурации две пластины частично или полностью отделены друг от друга, и пространство между пластинами не регулируется разделителями;

(d) после (с) распределение образца за счет перевода пластин в закрытую конфигурацию, где в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители и образец находятся между пластинами, образец контактирует с большей площадью участка связывания, чем когда пластины находятся в открытой конфигурации, и толщину образца на участке связывания регулируют с помощью пластин и разделителей, и она тоньше, чем такая толщина, когда пластины находятся в открытой конфигурации.

В способе по пункту S1 дополнительно предусмотрена стадия после (d), и когда пластины находятся в закрытой конфигурации, инкубации в течение определенного времени и остановка инкубации, где время инкубации примерно равно времени, в течение которого целевой объект диффундирует в пределах максимальной толщины образца, пока пластины находятся в закрытой конфигурации, и где инкубация представляет собой процесс, который способствует связыванию объекта с участком связывания.

S2. Устройство для сохранения реагента, который содержит целевой объект, который связывается с участком связывания поверхности, содержащее:

первую пластину и вторую пластину, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации,

где первая пластина имеет на своей поверхности участок связывания, который связывает целевой объект в реагенте, и где участок связывания имеет площадь большую, чем площадь контакта с реагентом, если реагент размещен только на одной из пластин, без контакта с другой пластиной;

где одна или обе пластины содержат разделители, и каждый из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине и имеет предварительно заданную высоту;

где одна из конфигураций представляет собой открытую конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, пространство между пластинами не регулируется разделителями, и реагент размещен на одной или обеих пластинах,

где другая из конфигураций представляет собой закрытую конфигурацию, в которую приводят после размещения реагента в открытой конфигурации; и в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители и реагент находятся между пластинами, реагент контактирует с большей площадью участка связывания, чем когда пластины находятся в открытой конфигурации, и толщину подходящего объема реагента на участке связывания регулируют с помощью пластин и разделителей, и она тоньше, чем такая толщина, когда пластины находятся в открытой конфигурации.

12. Выявление и/пли количественное определение объема и/или концентрации (Q)

Количественное определение и/или контроль подходящего объема образца является применимым для количественного определения и/или контроля концентрации химических соединений (в том числе аналитов, объекта, реагентов и т.д.) в образце.

Обычные способы количественного определения объема образца включают применение пипетки-дозатора (например, пипетки с регулируемым объемом типа эппендорф «Research plus», 0,5-10 мкл, SKU #3120000020) или применение геометрического анализа. В случае РоС-применения (в месте оказания медицинской помощи) или применения в домашних условиях такие дозирующие устройства являются неудобными для применения и/или дорогостоящими. Существуют потребности в более простых и дешевых способах и устройствах для количественного определения и/или контроля объема и/или концентрации образца.

Один аспект настоящего изобретения связан со способами, устройствами и системами, с помощью которых количественно определяют и/или контролируют подходящий объем образца, который размещают на пластине, без применения пипетки-дозатора и/или фиксированного микрофлюидного канала. Подходящий объем, который может представлять часть или весь объем образца, относится к количественному определению и/или контролю концентрации целевого аналита и/или объекта в образце. Способы, устройства и системы в настоящем изобретении являются легко применимыми и недорогими.

12.1. Способ количественного определения подходящего объема образца

Q1. Способ количественного определения подходящего объема образца, предусматривающий:

(a) получение образца, в котором подходящий объем образца подлежит количественному определению;

(b) получение двух пластин, которые являются перемещаемым относительно друг друга в разные конфигурации, где одна или обе пластины содержат разделители, и при этом разделители характеризуются предварительно заданными расстоянием между разделителями и высотой, и при этом каждый из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине;

(c) размещение образца на одной или обеих пластинах, когда пластины приведены в открытую конфигурацию; где открытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, и пространство между пластинами не регулируется разделителями;

(d) после (с) распределение образца за счет перевода пластин в закрытую конфигурацию, где в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители и подходящий объем образца находятся между пластинами, толщину подходящего объема образца регулируют с помощью пластин и разделителей, и она является тоньше, чем максимальная толщина образца, когда пластины находятся в открытой конфигурации, и по меньшей мере один из разделителей находится внутри образца;

(е) количественное определение подходящего объема образца, пока пластины находятся в закрытой конфигурации;

где подходящий объем представляет собой по меньшей мере часть от всего объема образца.

Q2. В некоторых вариантах осуществления способ количественного определения подходящего объема в образце предусматривает:

(a) получение первой пластины и второй пластины;

(b) получение образца, подлежащего количественному определению между двумя пластинами;

(c) деформацию формы образца в результате сжатия двух пластин, что снижает толщину образца, и распределение образца между пластинами в боковом направлении; и

(d) количественное определение подходящего объема образца, пока пластины находятся в закрытой конфигурации;

где подходящий объем представляет собой по меньшей мере часть от всего объема образца.

12.2. Пластина для применения в количественном определении подходящего объема в образце

Q3. Пластина для применения в количественном определении подходящего объема в образце, предусматривающая

пластину, которая содержит на своей поверхности (i) разделители, которые имеют предварительно заданное расстояние между разделителями и высоту и закреплены на поверхности, и (ii) поверхность контакта с образцом соответствующего объема, подлежащего количественному определению, где по меньшей мере один из разделителей находится внутри площади контакта с образцом.

12.3. Устройство для применения в количественном определении подходящего объема в образце

Q4. Устройство для количественного определения подходящего объема в образце, содержащее

первую пластину и вторую пластину, которые (а) являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации, и (b) каждая имеет площадь контакта с образцом с целью контакта образца с подходящим объемом, подлежащим количественному определению,

где одна или обе пластины содержат разделители на своей(своих) поверхности(поверхностях), разделители имеют предварительно определенное расстояние между разделителями и высоту, и разделители закреплены на своих соответствующих пластинах;

где одна из конфигураций представляет собой открытую конфигурацию, при которой две пластины отделены друг от друга, пространство между пластинами не регулируется разделителями, и образец размещен на одной или обеих пластинах,

где другая из конфигураций представляет собой закрытую конфигурацию, в которую приводят после размещения образца в открытой конфигурации; и в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители и подходящий объем образца находятся между пластинами, толщину подходящего объема образца регулируют с помощью пластин и разделителей, и она является тоньше, чем таковая, когда пластины находятся в открытой конфигурации, и по меньшей мере один из разделителей находится внутри образца; и

где подходящий объем образца количественно определяют в закрытой конфигурации, и подходящий объем представляет собой по меньшей мере часть от всего объема образца.

12-5. Измерение подходящего объема образца

MS1. В настоящем изобретении количественное определение подходящего объема образца, когда пластины находятся в закрытой конфигурации, включает без ограничения каждый из следующих пяти вариантов осуществления:

(a) измерение подходящего объема образца с помощью способа, который является механическим, оптическим, электрическим, или любой их комбинации;

(b) измерение одного или более параметров, связанных с подходящим объемом образца, независимым образом с помощью способа, выбранного из способа, который является механическим, оптическим, электрическим, или любой их комбинации;

(c) применение предварительно заданного параметра(заданных параметров), связанного(связанных) с подходящим объемом образца (т.е. параметра(параметров) образца, заданного(заданных) перед тем, как пластины находятся в закрытой конфигурации);

(d) определение подходящего объема образца путем (i) измерения одного или более параметров, связанных с подходящим объемом, когда пластины находятся в закрытой конфигурации, и (ii) предварительного определения других параметров, связанных с подходящим объемом, перед тем, как пластины находятся в закрытой конфигурации;

(e) определение объема, не относящегося к образцу;

(f) любые комбинации из вышеизложенного (т.е. a, b и с).

В способе по пункту MS1 механические способы предусматривают без ограничения применение разделителей (т.е. механического устройства, которое регулирует пространство между внутренними поверхностями субстрата и покровной пластины до предварительно заданного значения), механического зонда или масштабных линеек, звуковых волн (например, отражения и/или интерференции ультразвуковой волны для измерения пространства) или любой их комбинации.

В способе по пункту MS1 оптические способы предусматривают без ограничения применение интерференции света или оптической визуализации (например, получение 2D (двумерного)/30 (трехмерного) изображения образца, многократную оптическую визуализацию (при различных углах зрения, различной длине волны, различной фазе и/или различной поляризации), обработку изображений или любую их комбинацию.

Электрические способы предусматривают без ограничения определения емкости, сопротивления или импеданса или любую их комбинацию.

В некоторых вариантах осуществления способа по пункту MS1 измерение толщины образца представляет собой измерение пространства между внутренними поверхностями двух пластин.

В способе по пункту MS1 в некоторых вариантах осуществления применение предварительно определенного одного или более параметров, связанных с подходящим объемом образца, где предварительно заданный параметр представляет собой предварительно заданную толщину образца, которую регулируют разделителями, когда пластины находятся в закрытой конфигурации.

В некоторых вариантах осуществления способа по пункту MS1 применение предварительно заданного одного или нескольких параметров, связанных с подходящим объемом образца, где предварительно заданный параметр представляет собой предварительно заданную высоту разделителя.

В некоторых вариантах осуществления способа по пункту MS1 параметры, связанные с подходящим объемом образца, представляют собой параметры в закрытой конфигурации, которые включают без ограничения (i) промежуток между внутренними поверхностями первой пластины и второй пластины (в CROF), (ii) толщину образца, (iii) все или подходящую часть площади образца, (iv) все или подходящую часть объема или (v) любую их комбинацию.

В некоторых вариантах осуществления способа по пункту MS1 количественное определение объема образца или подходящего объема образца предусматривает стадии (i) умножения толщины образца на площадь всего образца с получением объема всего образца, (ii) умножения толщины образца на соответствующую площадь образца с получением подходящего объема образца или (iii) умножения соответствующей толщины образца на все или подходящую площадь образца с получением подходящего объема образца.

В некоторых вариантах осуществления способа по пункту MS1 измерение представляет собой 3D (трехмерное) изображение подходящего объема.

В некоторых вариантах осуществления способа по пункту MS1 количественное определение подходящего объема образца осуществляют путем измерения площади подходящего объема образца в горизонтальной проекции, а затем применяя ее вместе с толщиной подходящего объема для определения объема подходящего объема образца, где толщину подходящего объема определяют, исходя из информации о разделителе, а информация о разделителе включает высоту разделителя.

В некоторых вариантах осуществления способа по пункту MS1 количественное определение подходящего объема образца путем измерения площади в горизонтальной проекции подходящего объема образца и разделителя совместно, затем применение ее с толщиной подходящего объема и объемом разделителей для определения объема подходящего объема образца, где толщину подходящего объема определяют, исходя из информации о разделителе.

В некоторых вариантах осуществления способа по пункту MS1 количественное определение подходящего объема образца путем измерения площади в горизонтальной проекции и толщины подходящего объема образца.

В некоторых вариантах осуществления способа по пункту MS1 количественное определение подходящего объема образца проводится путем измерения объема подходящего объема образца оптическим способом.

В некоторых вариантах осуществления способа по пункту MS1 масштабные метки применяются для облегчения количественного определения подходящего объема образца, пока пластины находятся в закрытой конфигурации, где некоторые варианты осуществления масштабных меток, их применение, а также измерения и т.д. описаны в разделе 2.

В некоторых вариантах осуществления способа по пункту MS1 количественное определение подходящего объема образца предусматривает стадию вычитания объема, не относящегося к образцу, где в некоторых вариантах осуществления объем, не принадлежащий образцу, определяют с помощью вариантов осуществления, описанных в настоящем изобретении.

12-4. Способ количественного определения концентрации аналитов в подходящем объеме образца

Q5. Способ количественного определения аналитов в подходящем объеме образца, предусматривающий:

(a) выполнение стадий в способе по пункту Q1 и

(b) после стадии (а) измерение сигнала, связанного с аналитами из подходящего объема, где подходящий объем представляет собой по меньшей мере часть от всего объема образца.

Q6. Способ количественного определения аналитов в подходящем объеме образца, предусматривающий:

(a) выполнение стадий в способе по пункту Q2 и

(b) после стадии (а) измерение сигнала, связанного с аналитами из подходящего объема, где подходящий объем представляет собой по меньшей мере часть от всего объема образца.

В некоторых вариантах осуществления способа по любому из пунктов Q5-6 дополнительно предусмотрена стадия расчета концентрации аналитов путем деления значения сигнала, связанного с аналитами из подходящего объема образца, на объем подходящего объема.

В способе по любому из пунктов Q5-6 одна или обе пластины дополнительно содержат участок связывания, участок хранения или оба.

В некоторых вариантах осуществления способа по любому из пунктов Q5-6 сигнал, связанный с аналитом, представляет собой непосредственный сигнал аналитов или метки, прикрепленной к аналиту.

Q7. Способ количественного определения аналитов в подходящем объеме образца, предусматривающий:

(a) выполнение стадий в способе по пункту Q1, где одна или обе пластины дополнительно содержат участок связывания; и

(b) измерение после стадии (а) сигнала, связанного с аналитами из подходящего объема,

где подходящий объем представляет собой по меньшей мере часть от всего объема образца.

Q8. Способ количественного определения аналитов в подходящем объеме образца, предусматривающий:

(a) выполнение стадий в способе по пункту Q2, где одна или обе пластины дополнительно содержат участок связывания; и

(b) измерение после стадии (а) сигнала, связанного с аналитами из подходящего объема,

где подходящий объем представляет собой по меньшей мере часть от всего объема образца.

В некоторых вариантах осуществления способа по любому из пунктов Q7-8 сигнал, связанный с аналитами, представляет собой непосредственный сигнал от аналитов, которые связываются с участком связывания, или метки, присоединенной к аналиту, который связывается с участком связывания.

12.5. Пластина для применения в количественном определении концентрации аналитов в подходящем объеме в образце

Q9. Пластина для применения при количественном определении концентрации аналитов в подходящем объеме в образце, предусматривающая

пластину, которая содержит на своей поверхности (i) разделители, которые имеют предварительно заданное расстояние между разделителями и высоту, и (ii) площадь контакта с образцом с целью приведения в контакт образца с концентрацией аналитов в подходящем объеме, подлежащем количественному определению, где по меньшей мере один из разделителей находится внутри площади контакта с образцом.

12.6. Пластина для применения в количественном определении концентрации аналитов в подходящем объеме в образце

Концентрацию целевых аналитов и/или объектов в образце можно количественно определить или контролировать, если количественно определено количество целевых аналитов и/или объектов в образце, а также количественно определен подходящий объем образца.

Q10. Устройство для количественного определения концентрации аналитов в подходящем объеме в образце, содержащее:

первую пластину и вторую пластину, которые (а) являются перемещаемыми относительно друг друга в различных конфигурациях, и (b) каждая имеет площадь контакта с образцом с целью приведения образца в контакт с концентрацией аналитов в подходящем объеме, подлежащем количественному определению, где одна или обе пластины содержат на своей поверхности (своих поверхностях) разделители, которые имеют предварительно определенное расстояние между разделителями и высоту, и каждый из разделителей прикрепляют на соответствующие пластины;

где одна из конфигураций представляет собой открытую конфигурацию, при которой две пластины отделены друг от друга, пространство между пластинами не регулируется разделителями, и образец размещен на одной или обеих пластинах,

где другая из конфигураций представляет собой закрытую конфигурацию, в которую приводят после размещения образца в открытой конфигурации; и в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители и подходящий объем образца находятся между пластинами, толщину подходящего объема образца регулируют с помощью пластин и разделителей, и она является тоньше, чем таковая, когда пластины находятся в открытой конфигурации, и по меньшей мере один из разделителей находится внутри образца; и

где концентрацию аналита в подходящем объеме образца количественно определяют в закрытой конфигурации, и подходящий объем представляет собой по меньшей мере часть от всего объема образца.

В устройстве по любому из пунктов Q9 и Q10 пластина дополнительно содержит участок связывания или участок хранения или оба. Один вариант осуществления участка связывания предусматривает участок связывания, который связывает аналиты в образце.

В устройстве по любому из пунктов Q9 и Q10 пластина дополнительно содержит одно или множество масштабных меток, где некоторые варианты осуществления масштабных меток описаны в разделе 2.

В способе или устройстве по любому из пунктов Q1-10 в некоторых вариантах осуществления устройство для измерения включает по меньшей мере одно из устройства визуализации и камеры.

В способе или устройстве по любому из пунктов Q1-10 в некоторых вариантах осуществления измерительное устройство приводят в конфигурацию для визуализации площади в горизонтальной проекции подходящего объема образца.

В способе или устройстве по любому из пунктов Q1-10 в некоторых вариантах осуществления измерительное устройство включает источник света для освещения площади в горизонтальной проекции подходящего объема образца.

В способе или устройстве по любому из пунктов Q1-10 в некоторых вариантах осуществления стадия расчета концентрации предусматривает деление всех целевых аналитов или объекта на подходящий объем образца.

В способе или устройстве по любому из пунктов Q1-10 в некоторых вариантах осуществления измерение сигнала предусматривает применение оптического устройства визуализации для подсчета количества целевых аналитов или объекта. Например, измерение может предусматривать применение оптического микроскопа для измерения клеток крови (эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов) в образце крови.

В способе или устройстве по любому из пунктов Q1-10 в некоторых вариантах осуществления измерение количества целевых аналитов или объекта в образце может предусматривать вариант осуществления анализа поверхностной иммобилизации, в котором целевые аналиты или объект захватываются на поверхности.

В некоторых вариантах осуществления аппарат для количественного определения объема образца или выявление/количественное определение аналита в образце предусматривает любое из устройств в пунктах Q1-10 совместно с (1) оптическими устройствами визуализации и/или (2) источником света и оптическими устройствами визуализации и т.д. Оптическое устройство визуализации включает фотосенсор, оптические линзы, фильтры, поляризаторы, волновые пластинки, расщепители пучка, механические подставки или любую их комбинацию.

В некоторых вариантах осуществления измерение подходящей площади или объема образца предусматривает (i) наличие метки на первой пластине, покровной пластине, между ними или любой их комбинации, (ii) получение оптического изображения (например, получение 2D (двумерного)/3D (трехмерного) изображения образца, и получение изображение можно выполнять несколько раз при различных углах зрения, различной длине волны, различной фазе и/или различной поляризации) и (ш) обработку изображения, исходя из метки и изображений образца. "Подходящий" означает связанный с определением концентрации целевого аналита.

Сканирование. В некоторых вариантах осуществления при считывании сигнала от образца применяют способ сканирования, при котором ридер (например, фотодетекторы или камера) считывает часть образца (или пластины), а затем движется к другой части образца (или пластины), и такой процесс продолжается до тех пор, пока определенная предварительно указанная часть образца (или пластины) не будет подвергнута считыванию. Сканирующее считывание образца охватывает все части образца (или пластины) или малую долю образца (или пластины). В некоторых вариантах осуществления сканирующее считывание облегчается за счет меток местоположения, которые указывают на местоположение образца (или пластины). Одним примером меток местоположений являются периодические разделители, которые имеют фиксированный интервал и местоположение, или метки для соответствующей области, которые также имеют предварительно определенное местоположение и размер для указания местоположения образца или пластины.

13. Выявление и количественное определение аналитов и т.д. (D)

В определенных вариантах осуществления аналит выявляют и/или количественно определяют (т.е. анализируют) с помощью измерения сигнала, связанного с аналитом, где сигнал представляет собой оптический сигнал, электрический сигнал, механический сигнал, химико-физический сигнал или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления анализ аналита выполняют, когда две пластины в устройстве CROF закрыты относительно друг друга. В некоторых вариантах осуществления анализ аналита выполняют, когда две пластины в устройстве CROF отделены друг от друга.

Оптический сигнал включает без ограничения отражение, рассеяние, передачу, поглощение света, спектр, цвет света, испускание, интенсивность света, длину волны света, местоположение света, поляризацию, люминесценцию, флуоресценцию, электролюминесценцию, хемолюминесценцию, электрохемолюминесценцию или любую их комбинацию. Оптический сигнал представлен в форме оптического изображения (т.е. светового сигнала в зависимости от местоположения образца или устройства) или общей суммы всех фотонов, поступающих из указанных области или объема. Предпочтительная длина волны света находится в диапазоне от 400 нм до 1100 нм, в диапазоне от 50 нм до 400 нм, в диапазоне от 1 нм до 50 нм или в диапазоне от 1100 до 30000 нм. Другая предпочтительная длина волны находится в терагерцевом диапазоне.

Электрический сигнал включает без ограничения заряд, ток, импеданс, емкость, сопротивление или любую их комбинацию. Механический сигнал включает без ограничения механическую волну, звуковую волну, ударную волну или вибрацию. Химико-физический сигнал включает без ограничения значение рН, ионы, тепло, пузырьки газа, изменение цвета, которые образуются в ходе реакции.

Например, метка представляет собой гранулу, и метка прикрепляется к метке во время процесса специфического связывания аналита (например, применения средства для выявления для связывания гранулы с аналитом, применения средства для захвата для захвата аналита гранулой, применение средства для захвата для связывания аналита и затем применение средства для выявления для прикрепления гранулы или другие подходы. Следует отметить, что средства для захвата и выявления связывают аналит специфическим образом), затем измерение применяют для идентификации каждой из гранул, которые прикрепились к аналитам, и их подсчитывают.

В некоторых вариантах осуществления каждое из аналита или гранул обнаруживают и подсчитывают с помощью оптических средств (таких как (i) оптические метки и считывание меток, (ii) поверхностный плазмонный резонанс, (iii) оптическая интерференция, (iv) электрические способы (например, емкость, сопротивление, импеданс и т.д.) и другие. Сенсоры могут находиться на поверхности первой пластины и/или второй пластины.

Определенные варианты осуществления могут включать определение концентрации аналита в (а) анализе иммобилизации на поверхности, (b) объемном анализе (например, подсчете клеток крови) и (с) других. В некоторых вариантах осуществления в способах определения объема образца, подходящего объема образца или концентрации применяют смартфон.

В некоторых вариантах осуществления способа или устройства по любому из пунктов Q1-10 измерение сигнала предусматривает измерение ряда аналитов в образце, или измерение ряда меток, присоединенных к аналитам в образце. В другом варианте осуществления пункта Q5 "измерение сигнала" представляет собой (а) идентификацию каждого из аналита или метки, присоединенной к каждому аналиту, и (b) подсчет их количества.

В некоторых вариантах осуществления выявление аналитов представляет собой электрический способ, при котором электроды помещают на одну или обе из первой и второй пластин (это применимо к любому из способов и устройств, в которых применяется CROF). С помощью электродов измеряют заряд, ток, емкость, импеданс или сопротивление образца или любую их комбинацию. С помощью электродов измеряют содержание электролита в образце. Электроды имеют толщину, равную или меньше, чем толщина разделителя. В некоторых вариантах осуществления электрод выступает в роли части разделителей. Электроды изготавливают из различных проводящих материалов. Предпочтительным материалом для электродов является золото, серебро, алюминий, медь, платина, углеродные нанотрубки или любая их комбинация.

В способе или устройстве по любому из пунктов Q1-10 в некоторых вариантах осуществления в ходе измерения применяют устройства, т.е. камеру или фотодетектор совместно с оптическим процессором, выполненным с возможностью проведения измерения.

В некоторых вариантах осуществления способа или устройства по любому из пунктов Q1-10 устройства, определяющие концентрацию, содержат процессор, выполненный с возможностью определения концентрации на основе измерений (объема, площади, толщины, количества аналитов, интенсивности).

В способе или устройстве по любому из пунктов Q1-10 в некоторых вариантах осуществления дополнительно предусмотрено устройство, определяющее концентрацию, которое выполнено с возможностью определения концентрации целевых аналитов в подходящем объеме, исходя из измеренной площади в горизонтальной проекции, толщины и измеренного числа целевых молекул.

К вопросу о выявлении сигнала с помощью пиксельного считывания и анализа

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения сигналы, полученные от образца, аналитов, а также объекта, участков связывания, реагентов, CROF-пластин или любых их комбинаций, выявляют и анализируют. Некоторые варианты осуществления выявления сигнала с применением пиксельного считывания и анализа описаны в настоящем раскрытии, в то время как другие варианты осуществления описаны в публикации с номером WO 2014144133 А и заявке с номером PCT/US2014/028417 (Chou et al, "Analyte Detection Enhancement By Targeted Immobilization, Surface Amplification, And Pixelated Reading And Analysis"), которые включены в данный документ посредством ссылки для всех целей.

В некоторых вариантах осуществления сигнал представляет собой электромагнитный сигнал, в том числе электрический и оптический сигналы с различными частотами, интенсивностью света, флуоресценцией, хроматичностью, люминесценцией (электро- и хемолюминесценцией), рамановским рассеянием, сигналом с временным разрешением (в том числе мерцанием). Сигналы часто могут представлять собой силы, обусловленные локальному электрическому, локальному механическому, локальному биологическому или локальному оптическому взаимодействию между пластиной и считывающим устройством. Сигнал также включает пространственное (например, позиционное), временное и спектральное распределение сигнала. Выявляемый сигнал также может представлять собой поглощение.

Аналит включает белки, пептиды, ДНК, РНК, нуклеиновую кислоту, малые молекулы, клетки, наночастицы различных форм. Целевой аналит может находиться либо в растворе, либо в воздухе, либо в газообразной фазе. Определение предусматривает выявление существования, количественное определение концентрации и определение состояний целевого аналита.

В некоторых вариантах осуществления для содействия молекулярной селективности или связыванию, а также выявлению применяют электрическое поле.

Способы выявления/считывания

В некоторых вариантах осуществления оптического выявления (т.е. выявления с помощью электромагнитного излучения) способы предусматривают без ограничения оптические способы в дальней зоне, оптические способы в ближней зоне, эпифлуоресцентную спектроскопию, конфокальную микроскопию, конфокальную микроскопию, дзухфотонную микроскопию и микроскопию полного внутреннего отражения, где целевые аналиты метят с помощью эмиттера электромагнитного излучения, и сигнал при этих видах микроскопии можно усилить с помощью поверхности усиления пластины для CROF.

В некоторых вариантах осуществления сигнал содержит информацию о положении, локальной интенсивности, локальном спектре, локальной поляризации, локальной фазе, локальной рамановской сигнатуре указанных сигналов или любой их комбинации.

В некоторых вариантах осуществления выявление сигнала предусматривает измерение общего сигнала от участка (например, сигнала от участка, независимо от местоположения в участке).

В определенных вариантах осуществления выявление сигнала представляет собой измерение с помощью изображения сигнала на области (т.е. сигнала в зависимости от местоположения); а именно, область делят на пиксели и сигнал от каждого пикселя из области измеряют отдельно, что также называется "PIX" или "пиксельное выявление на изображении". Получение отдельного измерения каждого пикселя может быть одновременным, или последовательным, или смешанным.

В некоторых вариантах осуществления при считывании применяют соответствующие системы выявления для того, чтобы сигнал был выявлен последовательно или одновременно, или их комбинация. При последовательном выявлении один или более пикселей выявляют в момент времени, и сканер будут использовать для продолжения выявления в других участках SAL. При одновременном выявлении для выявления сигналов от различных пикселей в одно и то же время будет применяться мультипиксельная детекторная матрица, такая как камера для визуализации (например, ПЗС). Сканер может быть однополосным или многополосным с различным размером пикселей для каждой полосы. На фиг. 2С PCT/US2014/028417 схематически представлено пиксельное считывание на трехкоординатном столе.

Размер пикселя для считывания/выявления будет регулироваться в целях равновесия оптического разрешения и суммарного времени считывания. При меньшем размере пикселя понадобится больше времени для считывания/сканирования всего или части SAL. Типичный размер пикселя составляет от 1 мкм до 10 мкм. Пиксель имеет различные формы: круглую, квадратную и прямоугольную. Нижний предел размера пикселя определяется оптическим разрешением микроскопической системы, а верхний предел размера пикселя определяется, чтобы избежать ошибки считывания от неправильного оптического сигнала устройства визуализации (оптическая аберрация, однородность освещения и т.д.).

Система считывания

Как указано на фигурах в PCT/US2014/028417, вариант осуществления системы считывания предусматривает (а) пластину или пластины, применяемые для CROF; (b) считывающее устройство 205 с целью получения изображения сигналов, исходящих от поверхности указанной пластины, где сигналы представляют отдельные события связывания целевых аналитов; (с) сборное устройство 300, которое удерживает пластину и устройство визуализации; (d) электронные устройства и хранение данных 301 с целью хранения указанных изображений; и (е) компьютер, выполняющий программу для идентификации и подсчета отдельных событий связывания в области на изображении.

Сборное приспособление 300 контролирует или изменяет относительное положение между пластиной и считывающим устройством по меньшей мере в одном из трех (х, у, z) ортогональных направлений в случае считывания сигнала. Вариант осуществления сборного приспособления предусматривает сканер 301. В некоторых вариантах осуществления сканер 301 сканирует в по меньшей мере одном из трех (х, у, z) ортогональных направлений.

В некоторых вариантах осуществления считывающее устройство 302 представляет собой камеру ПЗС. В некоторых вариантах осуществления считывающее устройство 302 представляет собой фотодетектор, содержащий один или более оптических устройств, которые выбирают из оптических фильтров 303, спектрометра, линз 304, апертур, расщепителя пучка 305, зеркал 306, поляризаторов 307, волновых пластин и затворов. В некоторых вариантах осуществления считывающее устройство 302 представляет собой смартфон или мобильный телефон, которые имеют возможность локальных или удаленных взаимодействий. Считывающее устройство собирает информацию о положении, локальной интенсивности, локальном спектре, локальной рамановской сигнатуре указанных сигналов или любой их комбинации.

В некоторых вариантах осуществления оптические фильтры 303, расщепители 305 светового пучка, оптические волокна, фотодетектор (например, соединение, диод, РМТ (фотомультимерная трубка) или APD (лавинный фотодиод), камера для визуализации (например, ПЗС или камера сотового телефона) и спектрометр совместно со сканером, оснащенным сборным устройством 301, соединены с микроскопической системой, в которой используется конфокальная установка в дальней зоне или пейзажная установка в широкой зоне.

В некоторых вариантах осуществления при конфокальной установке считывание осуществляется с помощью фиксации яркости, временного изменения и спектрального изменения одного или более пикселей в момент времени и растрового сканирования всей интересующей области SAL. В некоторых вариантах осуществления при пейзажной установке в широкой зоне камеру применяют для записи яркости и временного изменения всей или части области SAL в момент времени. В некоторых вариантах осуществления требуются соответствующие оптические фильтры и манипуляторы светового пучка (поляризатор, расщепители пучка, оптические волокна и т.д.) для обеспечения сбора и выявления лишь желательного сигнала. На фиг. 9 PCT/US2014/028417 схематически представлена одна схема компонентов для такой системы. В некоторых вариантах осуществления анализ предусматривает способы обработки изображений, в том числе без ограничения способы в Open-CV или Image-J.

Пиксельный анализ (PIX). В некоторых вариантах осуществления PIX сигналы, выявляемые в пиксельном виде, анализируют для определения количества и/или типов определенных молекул в определенном пикселе или нескольких пикселях, что, в свою очередь, используется для количественного определения типа и/или концентрации целевых аналитов. Термин "сигнал, выявляемый в пиксельном виде" относится к способу, при котором область, которая имеет сигнал(сигналы), делят на пиксели и сигнал от каждого пикселя области измеряют отдельно, что также называется "PIX" или "пиксельное выявление на изображении". Получение отдельного измерения каждого пикселя может быть одновременным, или последовательным, или смешанным.

В некоторых вариантах осуществления анализ предусматривает анализ пространственной, временной, спектральной информации о сигнале. В некоторых вариантах осуществления анализ предусматривает без ограничения статистический анализ, сравнение, интегрирование и т.д. На фиг. 5 в PCT/US2014/028417 представлена технологическая карта для одного такого варианта осуществления данного способа.

14. Метки

Одна или любые комбинации вариантов осуществления оптических меток, описанных во всем настоящем изобретении, применимы ко всем способам и устройствам, описанным во всем описании настоящего изобретения.

В некоторых вариантах осуществления метку (метки) присоединяют к средству(средствам) для выявления, аналиту(аналитам) или объекту(объектам). В определенных вариантах осуществления метка представляет собой оптическую метку, электрическую метку, ферменты, которые могут быть использованы для генерирования оптического или электрического сигнала, или любую их комбинацию. В определенных вариантах осуществления средство (средства) для выявления, аналит (аналиты) или объект (объекты) присоединяют к соединяющей молекуле (например, к белку, нуклеиновой кислоте или другим соединениям), которую впоследствии присоединяют к метке. В определенных вариантах осуществления клетки (например, клетки крови, бактерий и т.п.) или наночастицы окрашивают при помощи меток. В некоторых вариантах осуществления оптическая метка представляет собой объект, который может генерировать оптический сигнал, где генерация оптического сигнала включает без ограничения отражение, рассеяние, передачу, поглощение, спектр, цвет, испускание, интенсивность, длину волны, местоположение, поляризацию света (например, фотонов), люминесценцию, флуоресценцию, электролюминесценцию, фотолюминесценцию (флуоресценцию), хемилюминесценцию, электрохемилюминесценцию или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления оптический сигнал представлен в форме оптического изображения (т.е. светового сигнала в зависимости от местоположения образца или устройства) или общей суммы всех фотонов, поступающих из указанных области или объема. Предпочтительная длина волны света находится в диапазоне от 400 нм до 1100 нм, в диапазоне от 50 нм до 400 нм, в диапазоне от 1 нм до 50 нм или в диапазоне от 1100 до 30000 нм. Другая предпочтительная длина волны находится в терагерцевом диапазоне.

Гранулы, наночастицы и квантовые точки. В некоторых вариантах осуществления оптическая метка представляет собой гранулы, наночастицы, квантовые точки или любую их комбинацию.

В некоторых вариантах осуществления диаметр гранул, наночастиц или квантовых точек составляет 1 нм или меньше, 2 нм или меньше, 5 нм или меньше, 10 нм или меньше, 20 нм или меньше, 30 нм или меньше, 40 нм или меньше, 50 нм или меньше, 60 нм или меньше, 70 нм или меньше, 80 нм или меньше, 100 нм или меньше, 120 нм или меньше, 200 нм или меньше, 300 нм или меньше, 500 нм или меньше, 800 нм или меньше, 1000 нм или меньше, 1500 нм или меньше, 2000 нм или меньше, 3000 нм или меньше, 5000 нм или меньше или диапазон между любыми двумя из этих значений.

В некоторых вариантах осуществления гранулы или квантовые точки используют в качестве меток и ими предварительно покрывают пластины для CROF, а внутреннее пространство между двумя пластинами составляет 1 мкм или меньше, 10 мкм или меньше, 50 мкм или меньше или диапазон между любыми двумя из этих значений.

В некоторых вариантах осуществления разделение между гранулами в растворе

- Время диффузии. (Толщина подходящего объема передающей среды приводит в результате ко времени диффузии оптической метки через толщу, составляющему менее 1 мс,

- Можно контролировать время растворения. Для осуществления контроля можно использовать фотон, тепло или другие виды возбуждения и их комбинации. Растворение не начнется до тех пор, пока не применят энергию возбуждения.

В некоторых вариантах осуществления метки представляют собой наночастицы, имеющие диаметр 10 нм или больше. Наночастицы такого большого диаметра характеризуются меньшей константой диффузии, чем малые молекулы (масса <1000 Да) и крупные молекулы (масса=1000-1000000 Дальтон (Да), что приводит к более продолжительному времени диффузии для данного раствора и расстояния. Чтобы уменьшить время диффузии, необходимо уменьшить расстояние диффузии.

Они обладают особыми преимуществами по сравнению с предшествующим уровнем техники, если оптические метки представляют собой гранулы или другие наночастицы с диаметром более нескольких нанометров. Это обусловлено тем, что константа диффузии объекта в жидкости для приближения первого порядка обратно пропорциональна диаметру объекта (согласно уравнению Эйнштейна-Стокса).

Например, оптическая метка, представляющая собой гранулу диаметром 20 нм, 200 и 2000 нм соответственно, характеризуется константой диффузии и, следовательно, временем диффузии, которые в 10, 100 и 1000 раз больше и дольше, чем в случае гранулы размером 2 нм. Что касается типичного расстояния диффузии, используемого в данных анализах, то это приведет к длительному времени инкубации до насыщения, что является непрактичным для применений РоС (Point of Care, в месте оказания медицинской помощи).

Однако в настоящем изобретении решили проблему длительного времени инкубации для оптических меток с диаметром, превышающим несколько нанометров. В настоящем изобретении оптическая метка хранится на поверхности пластины, а затем поверхность хранения помещают рядом с участком связывания с разделительным расстоянием (между ними) порядка субмиллиметров, микрометров или даже нанометров и заполняют разделительный промежуток передающей средой (при этом хранящаяся оптическая метка растворяется в передающей среде и диффундирует к участку связывания). С помощью настоящего изобретения также можно контролировать однородность такого небольшого расстояния на протяжении большой площади участка связывания и выполнять это с легкостью с помощью технологий использования разделителей.

Введение метки в аналит может включать использование, например, средства для мечения, такого как элемент специфического связывания с аналитом, который содержит выявляемую метку. Выявляемые метки включают без ограничения флуоресцентные метки, колориметрические метки, хемилюминесцентные метки, связанные с ферментом реагенты, многоцветные реагенты, авидин-стрептавидин-ассоциированные реагенты для выявления и им подобные. В определенных вариантах осуществления выявляемая метка представляет собой флуоресцентную метку. Флуоресцентные метки представляют собой фрагменты для мечения, которые выявляют с помощью детектора флуоресценции. Например, связывание флуоресцентной метки с представляющим интерес аналитом может обеспечить возможность выявления представляющего интерес аналита с помощью детектора флуоресценции. Примеры флуоресцентных меток включают без ограничения флуоресцентные молекулы, которые флуоресцируют после контакта с реагентом, флуоресцентные молекулы, которые флуоресцируют при облучении электромагнитным излучением (например, УФ, видимым светом, рентгеновским излучением и т.д.) и т.п.

В определенных вариантах осуществления подходящие флуоресцентные молекулы (флуорофоры) для мечения включают без ограничения IRDye800CW, Alexa 790, Dylight 800, флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцианат, сложные сукцинимидиловые эфиры карбоксифлуоресцеина, сложные сукцинимидиловые эфиры флуоресцеина, 5-изомер флуоресцеиндихлортиазина, каркасный карбоксифлуоресцеин-аланин-карбоксамид, Oregon Green 488, Oregon Green 514; люцифер желтый, акридиновый оранжевый, родамин, тетраметилродамин, техасский красный, пропидия йодид, JC-1 (5,5',6,6'-тетрахлор-1,1',3,3'-тетраэтилбензимидазоилкарбоцианина иодид), тетрабромродамин 123, родамин 6G, TMRM (сложный тетраметилродаминметиловый эфир), TMRE (сложный тетраметилродаминэтиловый эфир), тетраметилрозамин, родамин В и 4-диметиламинотетраметилрозамин, зеленый флуоресцентный белок, зеленый флуоресцентный белок с синим смещением, зеленый флуоресцентный белок с зеленым смещением, зеленый флуоресцентный белок с красным смещением, зеленый флуоресцентный белок с желтым смещением, 4-ацетамидо-4'-изотиоцианатостильбен-2,2'-дисульфоновую кислоту; акридин и производные, такие как акридин, акридинизотиоцианат; 5-(2'-аминоэтил)аминонафталин-1-сульфоновую кислоту (EDANS); 4-амино-N- [3-винилсульфонилфенил]нафталимид-3,5-дисульфонат; N-(4-анилино-1-нафтил)малеимид; антраниламид; 4,4-дифтор-5-(2-тиенил)-4-бор-3а,4а диаза-5-индацен-3-пропионовую кислоту BODIPY; каскадный синий; бриллиантовый желтый; кумарин и производные: кумарин, 7-амино-4-метилкумарин (АМС, Coumarin 120), 7-амино-4-трифторметилкумарин (Coumarin 151); цианиновые красители; цианозин; 4',6-диаминидино-2-фенилиндол (DAPI); 5',5''-дибромпирогаллол-сульфонафталеин (бромпирогаллол красный); 7-диэтиламино-3-(4'-изотиоцианатофенил)-4-метилкумарин; диэтилентриамина пентаацетат; 4,4'-диизотиоцианатодигидро-стильбен-2,2'-дисульфоновую кислоту; 4,4'-диизотиоцианатостильбен-2,2'-дисульфоновую кислоту; 5-(диметиламино)нафталин-1-сульфонилхлорид (DNS, дансил хлорид), 4-диметиламинофенилазофенил-4'-изотиоцианат (DABITC), эозин и его производные: эозин, эозинизотиоцианат, эритрозин и производные: эритрозин В, эритрозин, изотиоцианат; этидий; флуоресцеин и производные: 5-карбоксифлуоресцеин (FAM), 5-(4,6-дихлортриазин-2-ил)аминофлуоресцеин (DTAF), 2',7'-диметокси-4'5'-дихлор-6-карбоксифлуоресцеин (JOE), флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцианат, QFITC, (XRITC); флуорескамин; IR144; IR1446; малахитового зеленого изотиоцианат; 4-метилумбелли-феронеортокрезолфталеин; нитротирозин; парарозанилин; фениловый красный; В-фикоэритрин; о-фтальдиальдегид; пирен и его производные: пирен, пиренбутират, сукцинимидил-1-пирен; бутиратные квантовые точки; реактивный красный 4 (Cibacron™ Brilliant Red 3 В-А), родамин и производные: 6-карбокси-Х-родамин (ROX), 6-карбоксиродамин (R6G), лиссамин родамин В сульфонилхлорид (Rhod), родамин В, родамин 123, родамин X изотиоцианат, сульфородамин В, сульфородамин 101, сульфонилхлоридное производное сульфородамина 101 (техасский красный); N,N,N',N'-тетраметил-6-карбоксиродамин (TAMRA); тетраметилродамин; тетраметилродаминизотиоцианат (TRITC); рибофлавин; 5-(2'-аминоэтил)аминонафталин-1-сульфоновую кислоту (EDANS), 4-(4'-диметиламинофенилазо)бензойную кислоту (DABCYL), розолевую кислоту; CAL Fluor Orange 560; производные хелата тербия; Су 3; Су 5; Су 5.5; Су 7; IRD 700; IRD 800; La Jolla Blue; фталоцианин и нафталоцианин, кумарины и родственные красители, ксантеновые красители, такие как родолы, резоруфины, биманы, акридины, изоиндолы, дансиловые красители, аминофталевые гидразиды, такие как люминол, и производные изолюминола, аминофталимиды, аминонафталимиды, аминобензофураны, аминохинолины, дицианогидрохиноны, флуоресцентные комплексы европия и тербия; их комбинации и т.п. Подходящие флуоресцентные белки и хромогенные белки включают без ограничения зеленый флуоресцентный белок (GFP), в том числе без ограничения GFP, полученный из Aequoria victoria, или его производное, например, "гуманизированное" производное, такое как усиленный GFP; GFP от другого вида, такого как Renilla reniformis, Renilla mulleri или Ptilosarcus guernyi; "гуманизированный" рекомбинантный GFP (hrGFP); любой из множества флуоресцентных и окрашенных белков из видов Anthozoa; их комбинации и т.п.

В определенных вариантах осуществления красители, которые можно использовать для окрашивания клеток крови, предусматривают краситель Райта (эозин, метиленовый синий), краситель Гимза (эозин, метиленовый синий и азур В), краситель Мая-Грюнвальда, краситель Лейшмана ("полихромный" метиленовый синий (т.е. деметилированный в разные азуры) и эозин), краситель эритрозин В (эритрозин В) и другой флуоресцентный краситель, включая без ограничения краситель акридиновый оранжевый, 3,3-дигексилоксикарбоцианин (DiOC6), пропидия йодид (PI), флуоресцеинизотиоцианат (FITC) и основной оранжевый краситель 21 (В021), этидия бромид, бриллиантовый сульфафлавин и производное стильбен-дисульфоновой кислоты, эритрозин В или трипановый синий, хехст 33342, тригидрохлорид, тригидрат и DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол, дигадрохлорид).

В определенных вариантах осуществления средство для мечения создано с возможностью специфического связывания с аналитом, представляющим интерес. В определенных вариантах осуществления средство для мечения может присутствовать в устройстве для CROF до того, как образец нанесут на устройство для CROF. В других вариантах осуществления средство для мечения можно наносить на устройство для CROF после того, как образец нанесут на устройство для CROF. В определенных вариантах осуществления после того, как образец нанесен на устройство для CROF, устройство для CROF можно промыть для удаления любых не связанных компонентов, например не связанного аналита и других не относящихся к аналиту компонентов в образце, и при этом средство для мечения можно наносить на устройство для CROF после промывки для мечения связанного аналита. В некоторых вариантах осуществления устройство для CROF можно промыть после того, как средство для мечения связалось с комплексом аналит-средство для захвата, чтобы удалить из устройства для CROF любой избыток средства для мечения, которое не связано с комплексом аналит-средство для захвата.

В определенных вариантах осуществления аналит метят после того, как аналит связался с устройством для CROF, например, с применением меченого средства для связывания, которое может связываться с аналитом одновременно со средством для захвата, с которым аналит связывается в устройстве для CROF, то есть в анализе "сэндвич"-типа. В некоторых вариантах осуществления аналит, представляющий собой нуклеиновую кислоту, можно захватывать на устройстве для CROF, и меченая нуклеиновая кислота может гибридизироваться с аналитом одновременно со средством для захвата, с которым аналит, представляющий собой нуклеиновую кислоту, связывается в устройстве для CROF.

В определенных аспектах устройство для CROF усиливает световой сигнал, например флуоресценцию или люминесценцию, который генерируется выявляемой меткой, прямо или опосредованно связанной с аналитом, который, в свою очередь, связан с устройством для CROF. В определенных вариантах осуществления сигнал усиливается с помощью физического процесса усиления сигнала. В некоторых вариантах осуществления световой сигнал усиливается с помощью наноплазмонного эффекта (например, рамановское рассеяние, усиленное поверхностными явлениями). Примеры усиления сигнала с помощью наноплазмонныхэффектов описаны, например, в Li et al, Optics Express 201 1 19: 3925-3936 и WO 2012/024006, включенных в данный документ посредством ссылки. В определенных вариантах осуществления усиления сигнала достигают без применения биологического/химического усиления сигнала. Биологическое/химическое усиление сигнала может включать ферментативное усиление сигнала (например, используемое в твердофазных иммуноферментных анализах (ELISA)) и усиление сигнала с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). В других вариантах осуществления усиления сигнала можно достичь посредством физического процесса и биологического/химического усиления.

Чувствительность. В определенных вариантах осуществления устройство для CROF выполнено с возможностью обеспечения чувствительности выявления, составляющей 0,1 нМ или меньше, например 10 пМ или меньше, или 1 пМ или меньше, или 100 фМ или меньше, например 10 фМ или меньше, в том числе 1 фМ или меньше, или 0,5 фМ или меньше, или 100 аМ или меньше, или 50 аМ или меньше, или 20 аМ или меньше. В определенных вариантах осуществления устройство для CROF выполнено с возможностью обеспечения чувствительности выявления в диапазоне от 10 аМ до 0,1 нМ, например от 20 аМ до 10 пМ, от 50 аМ до 1 пМ, в том числе от 100 аМ до 100 фМ. В некоторых случаях устройство для CROF выполнено с возможностью выявления аналитов в концентрации 1 нг/мл или меньше, например 100 пг/мл или меньше, в том числе 10 пг/мл или меньше, 1 пг/мл или меньше, 100 фг/мл или меньше, 10 фг/мл или меньше, или 5 фг/мл или меньше. В некоторых случаях устройство для CROF выполнено с возможностью выявления аналитов в концентрации в диапазоне от 1 фг/мл до 1 нг/мл, например от 5 фг/мл до 100 пг/мл, в том числе от 10 фг/мл до 10 пг/мл. В определенных вариантах осуществления устройство для CROF выполнено с возможностью обеспечения динамического диапазона, составляющего 5 порядков или больше, например 6 порядков или больше, в том числе 7 порядков или больше.

Считывание. В определенных случаях период времени от нанесения образца на устройство для CROF до считывания устройства для CROF может находиться в диапазоне от 1 секунды до 30 минут, например от 10 секунд до 20 минут, от 30 секунд до 10 минут, в том числе от 1 минуты до 5 минут. В некоторых случаях период времени от нанесения образца на детектор усиления сигнала до генерирования выходного сигнала, который может быть принят устройством, может составлять 1 час или меньше, 30 минут или меньше, 15 минут или меньше, 10 минут или меньше, 5 минут или меньше, 3 минуты или меньше, 1 минуту или меньше, 50 секунд или меньше, 40 секунд или меньше, 30 секунд или меньше, 20 секунд или меньше, 10 секунд или меньше, 5 секунд или меньше, 2 секунды или меньше, 1 секунду или меньше, или даже меньше. В некоторых случаях период времени от нанесения образца на детектор усиления сигнала до генерирования выходного сигнала, который может быть принят устройством, может составлять 100 миллисекунд или больше, в том числе 200 миллисекунд или больше, например, 500 миллисекунд или больше, 1 секунду или больше, 10 секунд или больше, 30 секунд или больше, 1 минуту или больше, 5 минут или больше, или дольше.

Любой подходящий способ можно использовать для считывания устройства для CROF, чтобы получить измерение количества аналита в образце. В некоторых вариантах осуществления считывание устройства для CROF включает получение электромагнитного сигнала от выявляемой метки, связанной с аналитом в устройстве для CROF. В определенных вариантах осуществления электромагнитный сигнал представляет собой световой сигнал. Полученный световой сигнал может предусматривать интенсивность света, длину волны света, местоположение источника света и им подобные. В конкретных вариантах осуществления световой сигнал, генерируемый меткой, характеризуется длиной волны, которая находится в диапазоне от 300 нм до 900 нм. В определенных вариантах осуществления световой сигнал считывается в виде визуального изображения устройства для CROF.

В определенных вариантах осуществления считывание устройства для CROF включает обеспечение источника электромагнитного излучения, например источника света, в качестве источника возбуждения для выявляемой метки, связанной с биомаркером в устройстве для CROF. Источником света может быть любой подходящий источник света для возбуждения выявляемой метки. Примеры источников света включают без ограничения солнечный свет, естественное освещение, УФ-лампы, люминесцентные лампы, светоизлучающие диоды (LED), фотодиоды, лампы накаливания, галогеновые лампы и т.п.

Считывание устройства для CROF можно осуществить с помощью любого подходящего способа для измерения количества аналита, присутствующего в образце и связанного с устройством для CROF. В определенных вариантах осуществления устройство для CROF считывают с помощью устройства, выполненного с возможностью захвата светового сигнала от выявляемой метки, связанной с аналитом в устройстве для CROF. В некоторых случаях устройство представляет собой карманное устройство, такое как мобильный телефон или смартфон. Любое подходящее карманное устройство, выполненное с возможностью считывания устройства для CROF, можно применять в устройствах, системах и способах по настоящему изобретению. Устройства, выполненные с возможностью считывания устройства для CROF, описаны, например, в предварительной заявке на патент США с порядковым №62/066777, поданной 21 октября 2014 года, которая включена в данный документ посредством ссылки.

В некоторых вариантах осуществления устройство включает оптический регистрирующий аппарат, который выполнен с возможностью захвата светового сигнала от устройства для CROF, например захвата изображения устройства для CROF. В определенных случаях оптический регистрирующий аппарат представляет собой камеру, например цифровую камеру. Термин "цифровая камера" означает любую камеру, которая в качестве основного компонента содержит аппарат для фиксации изображений, оснащенный оптической системой фиксации изображений для формирования оптического изображения, датчик изображения для преобразования оптического изображения в электрический сигнал и другие компоненты, примеры таких камер включают цифровые фотокамеры, цифровые кинокамеры и веб-камеры (т.е. камеры, которые подключены, как публично, так и в частном порядке, к устройству, подключенному к вычислительной сети для обмена изображениями, включая те, которые подключены непосредственно к вычислительной сети, и подключенные к вычислительной сети посредством аппарата, такого как персональный компьютер, обладающий возможностью обработки информации). В одном примере считывание устройства для CROF может предусматривать получение видеоизображения, которое может фиксировать изменения на протяжении определенного времени. Например, видео может быть получено для проведения оценки динамических изменений в образце, нанесенном на устройство для CROF.

В определенных вариантах осуществления оптический регистрирующий аппарат характеризуется чувствительностью, которая слабее, чем чувствительность высокочувствительного оптического регистрирующего аппарата, применяемого в исследовательских/клинических лабораторных условиях. В определенных случаях оптический регистрирующий аппарат, применяемый в заявляемом способе, характеризуется чувствительностью, которая в 10 раз или больше, например в 100 раз или больше, в том числе в 200 раз или больше, в 500 раз или больше или в 1000 раз или больше, слабее, чем чувствительность высокочувствительного оптического регистрирующего аппарата, используемого в исследовательских/клинических лабораторных условиях.

В определенных вариантах осуществления устройство может иметь видеодисплей. Видеодисплеи могут содержать компоненты, на которых дисплейная страница может отображаться способом, воспринимаемым пользователем, например, компьютерный монитор, электронно-лучевая трубка, жидкокристаллический дисплей, светодиодный дисплей, сенсорная панель или сенсорный дисплей и/или другие средства, известные в данной области, для испускания визуально воспринимаемого выходного сигнала. В некоторых вариантах осуществления устройство оборудовано сенсорным экраном для отображения информации, такой как изображение, полученное от детектора, и/или отчет, созданный из обработанных данных, и позволяющим субъекту вводить информацию.

15. Мультиплексирование

В любом варианте осуществления, описанном в данном документе, система может быть сконструирована для проведения мультиплексного анализа и таким образом может содержать несколько участков хранения, несколько участков связывания или несколько участков хранения и несколько участков связывания, вследствие чего различные анализы можно выполнять в разных областях на поверхности одной из пластин. Например, в одном варианте осуществления одна из пластин может содержать несколько участков связывания, каждый из которых содержит другое средство для захвата, обеспечивая тем самым возможность выявления нескольких аналитов в образце в одном и том же анализе. Участки могут быть пространственно отделены, хотя и расположены рядом друг с другом.

На фиг. 10 схематически проиллюстрирован иллюстративный вариант осуществления настоящего изобретения, представляющий собой мультиплексное выявление в одном устройстве для CROF с использованием одного участка связывания на одной пластине и множества участков хранения на другой пластине. Панели (а) и (b) представляют собой изображение иллюстративного устройства в перспективе и его поперечное сечение соответственно. В данном иллюстративном случае мультиплексное устройство для CROF содержит первую пластину и вторую пластину, где одна поверхность первой пластины имеет один участок связывания; где одна поверхность второй пластины имеет множество участков хранения; и где разные участки хранения могут иметь одно и то же средство для выявления, но с разной концентрацией, или могут иметь разные средства для выявления в одинаковых или разных концентрациях. В некоторых вариантах осуществления площадь участка связывания больше площади каждого участка хранения. В некоторых вариантах осуществления площадь участка связывания больше общей площади всех участков хранения, и/или площадь участка связывания выровнена по участкам хранения (то есть они расположены друг на друге, а именно кратчайшее расстояние между участком связывания и точкой на накопителях одинаково или практически одинаково).

На фиг. 11 схематически представлен дополнительный иллюстративный вариант осуществления настоящего изобретения, представляющий собой мультиплексное выявление в одном устройстве для CROF с использованием одного участка хранения на одной пластине и нескольких участков связывания на другой пластине. Панели (а) и (b) представляют собой изображение иллюстративного устройства в перспективе и его поперечное сечение соответственно. В иллюстративном случае мультиплексное устройство для CROF содержит первую пластину и вторую пластину, где одна поверхность первой пластины имеет несколько участков связывания; где одна поверхность второй пластины имеет один участок хранения; и где различные участки связывания могут иметь одно и то же средство для захвата, но с разной концентрацией, или могут они иметь разные средства для захвата в одинаковых или разных концентрациях. В некоторых вариантах осуществления площадь участка хранения больше площади каждого участка связывания. В некоторых вариантах осуществления площадь участка хранения больше общей площади всех участков связывания, и/или она выровнена по участкам связывания (т.е. они расположены друг на друге).

На фиг. 12 схематически представлен дополнительный иллюстративный вариант осуществления настоящего изобретения, представляющий собой мультиплексное выявление в одном устройстве для CROF с несколькими участками связывания на одной пластине и несколькими соответствующими участками хранения на другой пластине. Панели (а) и (b) представляют собой изображение иллюстративного устройства в перспективе и его поперечное сечение соответственно. В иллюстративном случае мультиплексное устройство для CROF содержит первую пластину и вторую пластину, где одна поверхность первой пластины имеет множество участков связывания; где одна поверхность второй пластины имеет множество соответствующих участков хранения; где каждый соответствующий участок хранения расположен в местоположении на второй пластине, которое соответствует местоположению участка связывания на первой пластине, вследствие чего, когда пластины размещены друг напротив друга, каждый участок связывания перекрывается только с одним участком хранения, и каждый участок хранения перекрывается только с одним участком связывания; где разные участки хранения могут иметь одно и то же средство для выявления, но с разной концентрацией, или могут иметь разные средства для выявления в одинаковых или разных концентрациях; и где разные участки хранения могут иметь одно и то же средство для захвата, но с разной концентрацией, или могут иметь разные средства для захвата в одинаковых или разных концентрациях.

В определенных вариантах осуществления предусмотрено устройство согласно любой из фиг. 10, 11 и 12, где первая пластина дополнительно содержит на своей поверхности первый предварительно заданный участок для анализа и второй предварительно заданный участок для анализа, где расстояние между краями нескольких соседних участков для анализа значительно больше, чем толщина слоя однородной толщины, когда пластины приведены в закрытое положение, где по меньшей мере часть слоя однородной толщины образца расположена над предварительно заданными участками для анализа, и где образец содержит один или множество аналитов, которые способны к диффузии в образце. Посредством обеспечения расстояния между краями соседних нескольких участков для анализа, которое больше толщины образца, создается возможность получения несколько участков связывания без жидкостной изоляции отдельной части образца, поскольку инкубация до насыщения в анализе может осуществляться при существенной взаимной диффузии между двумя соседними участками. Путем соответствующего выбора соотношения расстояния до соседнего участка и толщины образца и соответствующего выбора времени измерения между временем, превышающим время инкубации до насыщения для анализа, но меньшим, чем время для существенной взаимной диффузии между двумя соседними участками, можно осуществлять мультиплексирование с помощью CROF без изоляции отдельной части образца. В некоторых вариантах осуществления соотношение расстояния до соседнего участка и толщины образца при закрытой конфигурации составляет 1,5 или больше, 3 или больше, 5 или больше, 10 или больше, 20 или больше, 30 или больше, 50 или больше, 100 или больше, 200 или больше, 1000 или больше, 10 000 или больше, или диапазон между любыми двумя из этих значений. Соотношение составляет 3 или больше для предпочтительного варианта осуществления, 5 или больше для другого предпочтительного варианта осуществления, 10 или больше для определенного предпочтительного варианта осуществления, 30 или больше для другого предпочтительного варианта осуществления и 100 или больше для другого предпочтительного варианта осуществления.

В определенных вариантах осуществления предусмотрено устройство согласно любой из фиг. 10, 11 и 12, где первая пластина имеет на своей поверхности по меньшей мере три участка для анализа аналита, и при этом расстояние между краями любых двух соседних участков для анализа значительно больше, чем толщина слоя однородной толщины, когда пластины приведены в закрытое положение, где по меньшей мере часть слоя однородной толщины расположена над участками для анализа, и где образец содержит один или множество аналитов, которые способны к диффузии в образце.

В определенных вариантах осуществления предусмотрено устройство согласно любой из фиг. 10, 11 и 12, где первая пластина имеет на своей поверхности по меньшей мере два соседних участка для анализа аналита, которые не разделены расстоянием, которое значительно больше, чем толщина слоя однородной толщины, когда пластины приведены в закрытое положение, где по меньшей мере часть слоя однородной толщины расположена над участками для анализа, и где образец содержит один или множество аналитов, которые способны к диффузии в образце.

Способ или устройства по любому из пунктов U1-6, Х-6, P1-8, W1-6, V1-4, UAB1-8, M1-2, S1-2, Q1-10 и H1, а также любой их комбинации, где первая и вторая пластины дополнительно содержат участок(участки) связывания и участок хранения, как описано на фиг. 10, фиг. 11 или фиг. 12 для мультиплексного выявления.

В данных вариантах осуществления с помощью устройства можно осуществлять одновременный мультиплексный анализ образца жидкости без жидкостной изоляции (т.е. без наличия физического барьера между участками анализа). Это устройство может содержать первую пластину и вторую пластину, где i. пластины являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации; при этом одна или обе пластины являются гибкими; ii. одна или обе пластины содержат разделители, которые закреплены на соответствующей пластине; и разделители характеризуются предварительно заданной практически однородной высотой и предварительно заданным постоянным расстоянием между разделителями; iii. каждая из пластин на своей соответствующей поверхности имеет область контакта с образцом для осуществления контакта с образцом, который содержит образец, который содержит один или более целевых аналитов, которые способны к диффузии в образце, iii. первая пластина имеет на своей поверхности один или множество участков связывания, каждый из которых характеризуется предварительно заданной площадью и содержит средство для захвата, которое связывает и иммобилизирует соответствующий целевой аналит в образце; и iv. вторая пластина имеет на своей поверхности один или множество соответствующих участков хранения, каждый из которых характеризуется предварительно заданной площадью и содержит средство для выявления в некоторой концентрации, которое после контакта с образцом растворяется в образце и диффундирует в образце, где каждое средство для захвата, целевой аналит и соответствующее средство для выявления способны образовывать «сэндвич» средство для захвата-целевой аналит-средство для выявления в участке связывания на первой пластине; где одна из конфигураций представляет собой открытую конфигурацию, при которой две пластины либо частично, либо полностью отделены друг от друга, пространство между пластинами не регулируется разделителями, и образец размещен на одной или обеих пластинах, и где другая конфигурация представляет собой закрытую конфигурацию, в которую приводят после размещения образца в открытой конфигурации; и в закрытой конфигурации: i. по меньшей мере часть образца сжата в слой однородной толщины, который находится в контакте с внутренними поверхностями двух пластин и ограничен ими, и который покрывает один или множество участков связывания и один или множество участков хранения, ii один или множество соответствующих участков хранения расположены над одним или множеством участков связывания, и iii. слой однородной толщины, который регулируется разделителями и пластинами, составляет меньше 250 мкм, и он существенно меньше, чем линейный размер предварительно заданной площади каждого участка хранения; и iv. отсутствует жидкостная изоляция между участком связывания и/или участками хранения, где разделение между краями соседних участков хранения и разделение между краями соседних участков связывания больше, чем расстояние, на которое целевой аналит или средство для выявления могут диффундировать за подходящий период времени, и где отсутствует жидкостная изоляция между участками связывания и/или участками хранения.

В некоторых вариантах осуществления первая пластина имеет на своей поверхности множество (по меньшей мере 2, по меньшей мере 4 или по меньшей мере 16 или больше) участков связывания.

В некоторых вариантах осуществления каждый из указанного множества участков связывания связывается с отдельным целевым аналитом.

В некоторых вариантах осуществления вторая пластина имеет на своей поверхности множество (по меньшей мере 2, по меньшей мере 4 или по меньшей мере 16 или больше) соответствующих участков хранения.

В некоторых вариантах осуществления каждый из множества соответствующих участков хранения связывается с отдельным целевым аналитом.

В некоторых вариантах осуществления первая пластина имеет на своей поверхности множество указанных участков связывания, а вторая пластина имеет на своей поверхности множество указанных соответствующих участков хранения, где каждый участок связывания обращен к соответствующему участку хранения, когда пластины находятся в закрытой конфигурации.

В некоторых вариантах осуществления первая пластина имеет на своей поверхности множество указанных участков связывания, а вторая пластина имеет на своей поверхности участок хранения, где по меньшей мере некоторые из участков связывания обращены к области в участке хранения, когда пластины приведены в закрытую конфигурацию.

В некоторых вариантах осуществления первая пластина имеет на своей поверхности участок связывания, а вторая пластина имеет на своей поверхности множество участков хранения, где по меньшей мере некоторые из участков хранения обращены к области в участке связывания, когда пластины находятся в закрытой конфигурации.

В некоторых вариантах осуществления первая пластина имеет на своей поверхности множество участков связывания, где участки связывания содержат разные средства для захвата, которые связывают и иммобилизируют один и тот же целевой аналит.

В некоторых вариантах осуществления первая пластина имеет на своей поверхности множество участков связывания, где участки связывания содержат одно и то же средство для захвата.

В некоторых вариантах осуществления средство для захвата присутствует с разной плотностью в разных участках связывания. Эти варианты осуществления можно применять для обеспечения метода количественного определения количества аналита в образце.

В некоторых вариантах осуществления существует разделение между двумя соседними участками связывания или двумя соседними участками хранения, и при этом отношение разделения к толщине образца в закрытой конфигурации составляет по меньшей мере 3, например по меньшей мере 5, по меньшей мере 10, по меньшей мере 20 или по меньшей мере 50.

В некоторых вариантах осуществления расстояние между разделителями находится в диапазоне от 1 мкм до 120 мкм.

В некоторых вариантах осуществления гибкие пластины характеризуются толщиной в диапазоне от 20 мкм до 250 мкм (например, в диапазоне от 50 мкм до 150 мкм) и модулем Юнга в диапазоне от 0,1 до 5 ГПа (например, в диапазоне 0,5-2 ГПа).

В некоторых вариантах осуществления произведение толщины гибкой пластины и модуля Юнга гибкой пластины находится в диапазоне от 60 до 750 ГПа-мкм.

В некоторых вариантах осуществления данный способ может предусматривать (а) получение образца, который содержит один или более целевых аналитов, которые способны к диффузии в образце; (b) получение первой и второй пластин, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации, где i. одна или обе пластины содержат разделители, которые закреплены на соответствующей пластине, и одна или обе пластины являются гибкими, ii. разделители характеризуются предварительно заданной практически однородной высотой и предварительно заданным постоянным расстоянием между разделителями, iii. первая пластина имеет на своей поверхности один или множество участков связывания, каждый из которых имеет предварительно заданную площадь, содержащую средство для захвата, которое связывает и иммобилизирует соответствующий целевой аналит из (а); и iv. вторая пластина имеет на своей поверхности один или множество соответствующих участков хранения, каждый из которых имеет предварительно заданную площадь и содержит средство для выявления в концентрации, которая при контакте с образцом растворяется в образце и диффундирует в образце, где каждое средство для захвата, целевой аналит и соответствующее средство для выявления способно образовывать сэндвич «средство для захвата-целевой аналит-средство для выявления» в участке связывания первой пластины; (с) размещение образца на одной или обеих пластинах, когда пластины приведены в открытую конфигурацию, где открытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, а пространство между пластинами не регулируется разделителями; (d) после (с) сжатие образца путем приведения двух пластин в закрытую конфигурацию, где закрытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой i. по меньшей мере часть образца сжата в слой однородной толщины, который контактирует с внутренними поверхностями обеих пластин и ограничен ими, и который контактирует с одним или множеством участков связывания и одним или множеством участков для хранения, п. один или множество соответствующих участков для хранения расположены над одним или более участками связывания, и iii. однородная толщина слоя, регулируемая разделителями и пластинами, составляет менее 250 мкм и существенно меньше линейного размера предварительно заданной площади каждого участка для хранения; (е) после (d) и в то время, когда пластины приведены в закрытую конфигурации, или (1) инкубирование образца на протяжении подходящего интервала времени и затем прекращение инкубации; или (2) инкубирование образца на протяжении времени, которое равно или больше минимального подходящего интервала времени, а затем проведение оценки в течение периода времени, который равен или меньше максимального подходящего интервала времени, связывание каждого целевого аналита с участком связывания; где подходящий интервал времени: i. равен или больше времени, которое занимает диффузия целевого аналита (а) через толщину слоя однородной толщины при закрытой конфигурации; и ii. значительно меньше времени, которое занимает латеральная диффузия целевого аналита (а) через наименьший линейный размер предварительно заданной площади участка хранения или участка связывания; вследствие чего осуществляется реакция, в ходе которой по завершении инкубации (1) или в ходе проведения оценки (2) большая часть «сэндвича» средство для захвата-целевой аналит-средство для выявления, связанного с каждым участком связывания, происходит из соответствующего подходящего объема образца; где инкубация обеспечивает возможность связывания каждого целевого аналита с участком связывания и средством для выявления, где соответствующий подходящий объем представляет собой часть образца, которая расположена над соответствующим участком хранения при закрытой конфигурации, где разделение между краями соседних участков хранения и разделение между краями соседних участков связывания больше, чем расстояние, на которое целевой аналит или средство для выявления могут диффундировать за подходящий период времени, и где отсутствует жидкостная изоляция между участками связывания и/или участками хранения.

В данном способе можно применять любой вариант осуществления мультиплексного устройства для анализа, описанного выше.

16. Образцы малого объема или реагент в широкой лунке (Е)

В некоторых применениях лунка на пластине будет использоваться для тестирования образца с объемом образца, небольшим по отношению к площади лунки, которую должен покрывать образец. Одним из аспектов настоящего изобретения являются способы и устройства, которые обеспечивают возможность проведения анализа, и другие химические реакции с образцами малого объема или реагентом в широкой лунке. Термин «лунка» относится к вогнутой ячейке, углубленной области или углублению на поверхности, которое предотвращает вытекание жидкости, размещенной внутри лунки, за пределы лунки за счет сплошного дна лунки и ограждающей боковой стенки (фиг.8). Площадь лунки означает площадь, огражденную боковой стенкой. Термины «малый объем образца» и «широкая лунка» означают, что если образец капают на дно лупки и без какого-либо устройства для распределения образца, то объем образца на дне лунки характеризуется площадью контакта с дном лунки меньше площади лунки (т.е. малая и широкая представляет собой сравнение площади естественного контакта образца и площади дна лунки). Лунка играет роль ограждающего разделителя (Е).

На фиг. 8 и 9 проиллюстрированы определенные варианты осуществления пластин и разделителей ограждающего типа (лунок) для регулирования толщины образца. Показаны два иллюстративных варианта осуществления: (а) первая пластина имеет разделитель ограждающего типа (лунка) и по меньшей мере один разделитель внутри лунки (фиг. 9), а (b) первая пластина не имеет разделителя внутри лунки (фиг. 8). Другие варианты осуществления заключаются в том, что перед тем как первую и вторую пластины приводят в закрытую конфигурацию, разделитель ограждающего типа расположен на одной из пластин, а изолированный разделитель (разделители) находятся на другой пластине; и при закрытой конфигурации пластин изолированный разделитель (разделители) находятся внутри лунки.

В одном варианте осуществления объем образца, размещенного в лунке пластины, может характеризоваться предварительно заданным объемом (т.е. дозируют объем до определенного объема), который приблизительно равен внутреннему объему лунки (т.е. произведению площади внутренней поверхности лунки и высоты лунки), так что когда пластины приводят в закрытую конфигурацию, образец практически полностью заполняет лунку без или практически без вытекания образца из лунки.

В другом варианте осуществления объем образца, размещенного в лунке пластины, не дозируют, и при закрытой конфигурации пластин часть образца заполняет лунку практически полностью, тогда как другая часть образца вытекает из лунки.

В других вариантах осуществления множество лунок составляет одну пластину. В некоторых вариантах осуществления между лунками имеются канавки (места слива) для образцов, которые переливаются из лунок. Места слива предотвращают переливание образца из одной лунки в другую лунку (другие лунки).

Е1. Как показано на фиг. 8, способ анализа и/или проведения химических реакций в образце малого объема в широкой лунке предусматривает:

(a) получение первой пластины и второй пластины, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации, где первая пластина имеет на своей поверхности лунку, которая характеризуется предварительно заданным размером (включая дно лунки, глубину и ободок), и участок связывания в нижней части лунки;

(b) получение образца, который (i) содержит целевой объект, способный к связыванию с участком связывания и диффузии в образце, и (ii) характеризуется объемом и смачивающим свойством, за счет чего площадь контакта образца, размещенного только на дне лунки, без контакта со второй пластиной, меньше площади дна лунки;

(c) размещение образца внутри лунки или на соответствующей области на второй пластине, или и первое, и второе, когда пластины приведены в открытую конфигурацию;

где в открытой конфигурации две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, а пространство между второй пластиной и дном лунки не регулируется ободком лунки (т.е. глубиной лунки);

(d) после (с) распределение образца за счет перевода пластин в закрытую конфигурацию; где в закрытой конфигурации вторая пластина покрывает лунку, толщина образца на участке связывания регулируется лункой и второй пластиной, и образец характеризуется большей площадью контакта с дном лунки, чем площадь, когда пластины приведены в открытую конфигурацию;

где соответствующая площадь второй пластины представляет собой площадь по верхней кромке лунки и внутри ободка лунки при закрытой конфигурации.

В способе по пункту Е1 пластина дополнительно содержит по меньшей мере один изолированный разделитель внутри лунки (т.е. разделитель лунки).

В способе по пункту Е1 в некоторых вариантах осуществления объем образца отмеривают (например, с получением определенного объема). Отмеренный объем приблизительно меньше или больше объема лунки или равен ему.

В некоторых вариантах осуществления способа по пункту Е1 сила сжатия с наружной стороны пластин настроена так, чтобы удерживать пластины в закрытой конфигурации.

В некоторых вариантах осуществления способа по пункту Е1 капиллярная сила настроена так, чтобы удерживать пластины в закрытой конфигурации.

Как показано на фиг. 8d, в некоторых вариантах осуществления способа по пункту Е1 дно лунки, соответствующая площадь последней или и первое, и второе присоединены к разделителям предварительно заданной высоты, где при закрытой конфигурации толщина образца регулируется разделителями, ободком или и первым, и вторым.

В некоторых вариантах осуществления высота разделителя равна, меньше или больше глубины лунки. Дно лунки является плоским (т.е. ровным) или изогнутым. В некоторых вариантах осуществления разделители (1) характеризуются предварительно заданным пространством между разделителями, (2) внутренним пространством образца, (3) закреплены на соответствующих пластинах или любой их комбинацией.

В некоторых вариантах осуществления объем образца примерно равен объему лунки с вычетом объема разделителей. В некоторых вариантах осуществления вторая пластина выполнена с возможностью герметизации лунки.

В некоторых вариантах осуществления соотношение площади лунки и квадрата глубины лунки составляет 3 или больше, 5 или больше, 10 или больше, 20 или больше, 30 или больше, 50 или больше, 100 или больше, 200 или больше, 1000 или больше, 10000 или больше, или диапазон между любыми двумя из этих значений.

Соотношение площади лунки и квадрата глубины лунки составляет от 3 до 20 в предпочтительном варианте осуществления, от 20 до 100 в другом предпочтительном варианте осуществления, и от 100 до 1000 в другом предпочтительном варианте осуществления, и от 1000 до 10000 в другом предпочтительном варианте осуществления. 17. Количественное определение путем корректировки эффектов, создаваемых объемом, не относящимся к образцу (С)

В процессе CROF образец зачастую смешан с объемом(объемами), не относящимся к образцу, который обусловлен объектами, которые не относятся к образцу, которые включают без ограничения разделители, воздушные пузырьки, пыль или любые их комбинации. Воздушные пузырьки или пыль могут быть внесены при нанесении образца или в ходе другого процесса в процессе CROF. Эти объекты, не относящиеся к образцу, занимают объем и внутреннее пространство образца, что должно быть откорректировано при определении подходящего объема (представляющего интерес объема) образца. Один аспект настоящего изобретения заключается в корректировке эффектов, создаваемых объемом, не относящимся к образцу, во внутреннем пространстве подходящего объема образца между двумя пластинами, где толщина подходящего объема регулируется разделителями.

С1. Способ корректировки эффектов, создаваемых материалом, не относящимся к образцу, при определении подходящего объема образца между двумя пластинами, предусматривающий:

(a) получение образца, в котором подходящий объем образца подлежит количественному определению;

(b) получение двух пластин, которые являются перемещаемым относительно друг друга в разные конфигурации, где одна или обе пластины содержат разделители, и при этом разделители характеризуются предварительно заданными расстоянием между разделителями и высотой, и при этом каждый из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине;

(c) размещение образца на одной или обеих пластинах, когда пластины приведены в открытую конфигурацию; где открытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, и пространство между пластинами не регулируется разделителями;

(d) после (с) приведение пластин в закрытую конфигурацию, где в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители и подходящий объем образца находятся между пластинами, толщина образца подходящего объема регулируется пластинами и разделителями и тоньше максимальной толщины образца, когда пластины находятся в открытой конфигурации, и подходящий объем может содержать объем материала, не относящегося к образцу;

(e) измерение, пока пластины находятся в закрытой конфигурации, (i) площади горизонтальной поверхности подходящего объема образца и (ii) объема материала, не относящегося к образцу; и

(f) вычисление подходящего объема образца с использованием толщины подходящего объема, регулируемого разделителями, и корректировку эффектов, обусловленных материалом, не относящимся к образцу;

где подходящий объем представляет собой по меньшей мере часть полного объема образца, а материалы, не относящиеся к образцу, представляют собой материалы, которые не происходят из образца.

- Измерение объема, не относящегося к образцу, осуществляют путем визуализации образца между двумя пластинами.

18. Точное количественное определение путем двойной проверки пространства

В случае определенного набора условий при CROF даже разделители и пластины могут обеспечивать предварительно заданную толщину образца при закрытой конфигурации, фактический набор условий в ходе проведения конкретного CROF может отличаться от ожидаемого, что приводит к ошибкам в предварительно заданной конечной толщине образца. Для уменьшения таких ошибок одним из аспектов настоящего изобретения является двойная проверка конечной толщины образца при закрытой конфигурации.

С2. Способ определения и проверки толщины подходящего объема образца между двумя пластинами предусматривает:

(a) получение образца, в котором подходящий объем образца подлежит количественному определению;

(b) получение двух пластин, которые являются перемещаемым относительно друг друга в разные конфигурации, где одна или обе пластины содержат разделители, и при этом разделители характеризуются предварительно заданными расстоянием между разделителями и высотой, и при этом каждый из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине;

(c) размещение образца на одной или обеих пластинах, когда пластины приведены в открытую конфигурацию; где открытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, и пространство между пластинами не регулируется разделителями;

(d) после (с) приведение пластин в закрытую конфигурацию, где в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители и подходящий объем образца находятся между пластинами, толщина образца подходящего объема регулируется пластинами и разделителями и тоньше максимальной толщины образца, когда пластины находятся в открытой конфигурации, и подходящий объем может содержать объем материала, не относящегося к образцу;

(e) измерение, пока пластины находятся в закрытой конфигурации, (i) площади горизонтальной поверхности подходящего объема образца и (ii) объема материала, не относящегося к образцу; и

(f) вычисление подходящего объема образца при корректировании эффектов, обусловленных материалом, не относящимся к образцу;

где подходящий объем представляет собой по меньшей мере часть полного объема образца, а материалы, не относящиеся к образцу, представляют собой материалы, которые не происходят из образца.

19. Промывка (WS)

В настоящем изобретении одна или любые комбинации вариантов осуществления сдавливания и удержания пластин, описанных в данном документе, используются во всех способах и устройствах, описанных во всем описании настоящего изобретения.

Способ для стадии промывки при проведении анализа, предусматривающий:

(a) проведение стадий в одном или любой комбинации способов, описанных выше, и

(b) отмывку образца или переносящей среды между пластинами.

В способе, в котором применяют CROF, промывку проводят путем удержания пластины в закрытой конфигурации.

В способе, в котором применяют CROF, промывку проводят путем разделения пластин из закрытой конфигурации.

20. Анализы с несколькими стадиями (МА)

В настоящем изобретении варианты осуществления, описанные в раскрытии (т.е. все разделы), можно применять в комбинации (а) путем объединения одного варианта осуществления с другим (другими) вариантом (вариантами) осуществления, (b) путем применения одного и того же варианта (вариантов) осуществления более одного раза, и (с) любой комбинации (а) и (b).

МА1. Способ анализа аналита в образце, предусматривающий:

(a) получение образца с аналитом;

(b) проведение способа, в котором применяют CROF; и

(c) разделение пластин и проведение способа, в котором применяют CROF. Способ по пункту МА1 в некоторых вариантах осуществления дополнительно

предусматривает после стадии (с) МА1 стадию повторения тех же стадий из всех стадий

способа по пункту МА1 по меньшей мере один раз.

МА2. Способ анализа аналита в образце, предусматривающий:

(a) получение образца с аналитом;

(b) проведение способа, в котором применяют CROF;

(c) разделение пластин и проведение способа (промывка), в котором применяют CROF; и

(d) проведение способа, в котором применяют CROF.

Способ по пункту МА2 в некоторых вариантах осуществления дополнительно предусматривает после стадии (с) в МА2 стадию повторения тех же стадий из всех стадий способа по пункту МА2 по меньшей мере однократно.

Способ по пункту МА2 в некоторых вариантах осуществления дополнительно предусматривает после стадии (с) в МА2 стадию повторения тех же стадий из всех стадий способа по пункту МА1 по меньшей мере однократно.

МА3. Набор для анализа аналита в образце, который содержит;

первое устройство для CROF, в котором применяется CROF; и

третью пластину, которую комбинируют с одной из пластин первого устройства для CROF, когда пластины первого устройства для CROF разделяют, с получением второго устройства для CROF.

МА4. Набор для анализа аналита в образце, который содержит:

первое устройство для CROF, в котором применяется CROF;

по меньшей мере один участок связывания или участок хранения, который расположен на области контакта с образцом на пластине устройства для CROF; и

третью пластину, которую когда пластины первого устройства для CROF разделены, совмещают с одной из пластин первого устройства для CROF с получением второго устройства для CROF; где участок связывания связывает целевой аналит с поверхностью пластины, и при этом участок хранения содержит реагент, который при контакте с образцом может растворяться в образце и диффундировать в образце.

Получение изображения может предусматривать использование смартфона. Способы из данного раздела могут дополнительно предусматривать стадию освещения с помощью источника света. Источником света может быть лазер, LED, лампа или вспышка камеры.

Набор (MQXA) для проведения анализа с целью выявлению целевого объекта в образце

Набор для анализа целевого объекта в образце может содержать:

а. первую пластину, где одна поверхность первой пластины имеет один или множество участков связывания, которые могут иммобилизировать целевой объект, и участок связывания содержит партнера по связыванию, который связывает целевой объект;

b. покровную пластину;

с.образец во внутреннем пространстве между покровной пластиной и первой пластиной, где образец содержит указанный целевой объект, который является подвижным в образце, форма образца является деформируемой, первая пластина и вторая пластина являются подвижными относительно друг друга, форма образца практически соответствует внутренним поверхностям, по меньшей мере часть образца находится в контакте с участком связывания, и внутреннее пространство во время инкубации меньше определенного расстояния, при этом образец находится в контакте с указанными участками связывания;

d. устройство для визуализации, которое может получать изображение поверхности первой пластины и/или поверхности покровной пластины; и

е. измерительное устройство, которое может измерять пространство внутреннего промежутка. Способы из данного раздела могут включать применение смартфона. Способы из данного раздела могут включать применение осветительного устройства. Осветительное устройство может предусматривать лазер, LED, лампу или вспышку камеры.

21. Сдавливание и удерживание пластин (Н)

Силы сжатия. В способе CROF используют силы для сжатия двух пластин с приведением пластин из открытой конфигурации в закрытую конфигурацию. Силы сжатия уменьшают расстояние между внутренними поверхностями пластин и таким образом толщину образца, который расположен между пластинами. В настоящем изобретении силы сжатия включают без ограничения механическую силу, капиллярные силы (вследствие поверхностных натяжений), электростатическую силу, электромагнитную силу (в том числе свет) и любую их комбинацию.

В некоторых вариантах осуществления при приведении пластин из открытой конфигурации в закрытую конфигурацию прикладывают внешнюю силу, чтобы привести первую пластину и вторую пластину по направлению друг к другу.

В некоторых вариантах осуществления при переводе пластин из открытой конфигурации в закрытую конфигурацию внешнее давление прикладывают с наружной стороны первой пластины и второй пластины, чтобы прижать пластины по направлению друг к другу, и при этом давление выше, чем давление между пластинами. Для создания более высокого давления снаружи пластины, чем с внутренней стороны пластины, применяется устройство. Устройство предусматривает, в частности, уплотнительное устройство.

В некоторых вариантах осуществления сила сжатия по меньшей мере частично обеспечивается капиллярной силой, которая обусловлена жидкостью между первой пластиной и второй пластиной и соответствующими поверхностными натяжениями и взаимодействиями с пластинами. В некоторых вариантах осуществления жидкость представляет собой собственно образец или образец, смешанный с жидкостью. В определенных вариантах осуществления капиллярную силу используют вместе с другими силами. Во многих случаях образец часто находится в жидком состоянии и поверхностные натяжения являются подходящими для внесения капиллярной силы. В некоторых вариантах осуществления деформация образца пластинами может автоматически останавливаться, когда капиллярная сила равна силе, необходимой для деформирования образца.

В определенных вариантах осуществления силу сжатия (следовательно, деформацию образца) создают путем изоляции давления между первой пластиной и второй пластиной (внутреннее давление) от давления снаружи пластин (внешнее давление), а затем понижения внутреннего давления ниже внешнего давления. Изоляцию можно выполнить с помощью вакуумного затвора или других устройств.

В некоторых вариантах осуществления предусмотрена комбинация способов, описанных выше.

Постепенное сдавливание. В определенных вариантах осуществления силу сжатия для приведения пластин в закрытую конфигурацию прилагают в процессе, называемом «постепенным сдавливанием», который предусматривает следующее: сдавливание (т.е. приложение силы сжатия) сначала прилагают в одном местоположении пластины (пластин), затем постепенно прилагают к другим местоположениям образца. В некоторых вариантах осуществления постепенного сдавливания силу сжатия (за исключением капиллярных сил самого образца) в одном местоположении после деформирования образца до требуемой толщины в этом местоположении (i) поддерживают в течение всего процесса сдавливания и деформации образца, (ii) снимают при сдавливании других мест, или (iii) применяют (i) для определенной части пластин и применяют (ii) для другой части образца.

В одном варианте осуществления постепенного сдавливания валик применяют, чтобы придавить первую пластину и вторую пластину (образец расположен между пластинами и пластины являются слегка гибкими) к другому валику или к ровной поверхности.

В другом варианте осуществления пальцы человека представляют собой инструмент для сдавливания пластин (следовательно, образца). Сдавливание осуществляют одной частью руки человека относительно другой части тела человека (включая другую часть руки человека) или рукой человека относительно объекта (например, поверхности стола). В одном варианте осуществления сдавливание начинают в одном местоположении образца и постепенно перемещают в другие места образца.

В одном варианте осуществления постепенного сдавливания струю сжатого воздуха сначала направляют в местоположение (например, центр) пары пластин (которое находится между первой пластиной и второй пластиной, при этом одна из пластин является немного гибкой) и давление постепенно распространяют на другую часть пары пластин.

В другом варианте осуществления одна или обе из первой пластины и второй пластины являются гибкими и находятся в контакте с одним местоположением образца, а затем капиллярная сила в этом данном местоположении сдвигает пару пластин (по направлению друг к другу) с деформированием образца.

Преимущество постепенного сдавливания включает следующее: возможность использовать меньшую силу для деформирования образца (потому что при одной и той же силе, чем меньше площадь сдавливания, чем больше давление); помощь движению (деформации) образца и/или уменьшение содержания пузырей воздуха в образце. Чем больше давление, тем большей будет деформация образца. Постепенное сдавливание может улучшить однородность толщины деформированного образца.

Устройства для сдавливания. Устройства контроля силы (сил) сжатия для деформации образца в CROF имеют несколько практических реализации. В некоторых вариантах осуществления для сдавливания применяется рука человека, например, сдавливание осуществляется пальцами человека. В определенных вариантах осуществления применяется устройство для сдавливания, где устройство для сдавливания включает без ограничения руку(руки) человека, механическую клипсу, механический пресс, механический зажим, механический ползунок, механическое устройство, электромагнитное устройство, ролик, который прокатывают по поверхности, два ролика друг напротив друга, струйный пресс, гидравлическое устройство или любую их комбинацию. В определенных вариантах осуществления для непосредственного или опосредованного сдавливания первой пластины и/или второй пластины применяется жидкость под давлением (в том числе сжатый воздух). «Непосредственно» означает, что жидкость под давлением прилагают непосредственно к первой пластине и/или второй пластине; а «опосредованно» означает, что ее прилагают через третий объект. В определенных вариантах осуществления при сдавливании применяют комбинацию вышеуказанных вариантов осуществления устройств и способов для сдавливания.

Кроме того, в некоторых вариантах осуществления деформации образца осуществляют мониторинг сдавливания и деформации образца. Мониторинг можно использовать для управления сдавливанием и деформацией образца. Мониторинг деформации включает без ограничения механический, электрический, оптический, химический, магнитный способ и любую их комбинацию. Механические способы включают без ограничения механические датчики, разделители (механические стопоры, более подробно обсуждаемые ниже) и звуковые волны.

В CROF устройство контроля пространства предусматривает механический пресс, механические столики для поступательного движения, пальцы человека, жидкость, обеспечивающую капиллярные силы, которые сдвигают пластины по отношению друг к другу, жидкость (в том числе воздух), которая прилагает давление на пластины, или их комбинацию.

В определенных вариантах осуществления механические столики (поступательные и/или вращательные) применяют для контроля деформации образца и толщины образца, и они функционируют вместе с системами мониторинга.

В некоторых вариантах осуществления сила сжатия по меньшей мере частично обеспечивается прессом (который представляет собой устройство, переводящее пластины в закрытую конфигурацию), выполненным с возможностью сдавливания пластин вместе в закрытую конфигурацию.

В некоторых вариантах осуществления сдавливание пластин осуществляется с помощью руки человека. Человек может быть субъектом, подвергаемым тестированию, или субъектом, проводящим тест, или субъектом, который отбирает образец.

В некоторых вариантах осуществления сдавливание пластин заключается в удержании двух пластин вместе для применения капиллярной силы. Капиллярная сила генерируется за счет придания гидрофильности по меньшей мере части внутренней поверхности одной пластины или обеих. С помощью надлежащей капиллярной силы две пластины способны поддерживать одинаковое пространство между пластинами и одинаковую толщину подходящего объема образца, такие же, как при исходном переводе пластин в закрытую конфигурацию, даже если удаляется часть сил или все силы (кроме капиллярной силы), которые применялись для сжатия пластины в закрытую конфигурацию.

В некоторых вариантах осуществления устройство, которое прилагает силу сжатия к наружной поверхности пластин для уменьшения расстояния между внутренними поверхностями пластин, содержит поверхность для контакта, соответствующую наружным поверхностям пластины, где поверхность для контакта устройства представляет собой поверхность устройства, которая контактирует с наружной поверхностью пластин, а «соответствующая внешней поверхности пластины» означает, что поверхность устройства может деформироваться во время сжатия, чтобы форма соответствовала форме внешней поверхности пластины. В одном иллюстративном варианте осуществления устройство для сжатия представляет собой пальцы человека. В другом иллюстративном варианте осуществления устройство для сжатия имеет поверхность для контакта, изготовленную из видов мягкого пластика или резины.

Самоудерживание (сохранение конечной толщины образца после снятия сил сжатия). В некоторых вариантах осуществления сдавливания в CROF после деформации образца при закрытой конфигурации некоторые из сил сжатия устраняют, и образец сохраняет ту же конечную толщину образца, как если бы силы сжатия еще присутствовали. Такая ситуация называется «самоудерживанием». Одной из причин самоудерживания является то, что после удаления сил сжатия, которые были приложены снаружи пары пластин, между внутренними поверхностями пластин все еще существуют другие силы, такие как капиллярная сила, которая удерживает пару пластин вместе. Капиллярная сила обусловлена смачивающими свойствами образца на пластинах.

Для наличия самоудерживания необходимо контролировать смачивающие свойства поверхности пластин, общую площадь контакта образца с пластинами, конечную толщину образца при закрытой конфигурации или их комбинацию.

В некоторых вариантах осуществления для достижения самоудерживания одна или обе внутренние поверхности пластин являются гидрофильными. А именно, или одна из пластин имеет внутреннюю поверхность, которая является гидрофильной, или обе пластины имеют внутреннюю поверхность, которая является гидрофильной.

Капиллярная сила зависит от радиуса кривизны поверхности жидкости, причем, чем меньше кривизна, тем выше капиллярная сила. Меньшей кривизны можно достигать за счет применения меньшего пространства между двумя пластинами (т.е. парой пластин) и, таким образом, меньшей толщины образца. В некоторых вариантах осуществления конечная толщина образца для достижения самоудерживания составляет 10 нм или меньше, 100 нм или меньше, 100 нм или меньше, 500 нм или меньше, 1 мкм (микрометр) или меньше, 2 мкм или меньше, 3 мкм или меньше, 5 мкм или меньше, 10 мкм или меньше, 20 мкм или меньше, 50 мкм или меньше, 70 мкм или меньше, 100 мкм или меньше, 150 мкм или меньше, 300 мкм или меньше, 500 мкм или меньше, 700 мкм или меньше, 1000 мкм или меньше, 1200 мкм или меньше или диапазон между любыми двумя из этих значений.

В некоторых вариантах осуществления площадь образца в контакте с пластинами для самоудерживания составляет не более 10 мкм², не более 100 мкм², не более 200 мкм², не более 500 мкм², не более 1000 мкм², не более 2000 мкм², не более 5000 мкм², не более 8000 мкм², не более 0,01 мм², не более 0,05 мм², не более 0,1 мм², не более 0,5 мм², не более 1 мм², не более 5 мм², не более 10 мм², не более 50 мм², не более 100 мм², не более 500 мм², не более 1000 мм², не более 2000 мм², не более 5000 мм², не более 10000 мм², не более 100000 мм² или диапазон между любыми двумя из этих значений.

В некоторых вариантах осуществления свойства смачивания внутренней поверхности одной или обеих пластин модифицируют для лучшего самоудерживания.

HS.1 В некоторых вариантах осуществления в способе CROF используют устройство для приложения силы сжатия с приведением пластин в закрытую конфигурацию, а после достижения закрытой конфигурации силу сжатия устройства снимают, а толщина образца и внутреннее пространство между поверхностями пластин остаются примерно такими же, как и перед снятием силы сжатия устройства. В некоторых вариантах осуществления в способах по предыдущем пункту дополнительно предусмотрена стадия считывания сигнала от пластин или между пластинами, где сигнал предусматривает без ограничения сигнал, связанный с аналитами, объектом, метками, объемом образца, концентрацией материала (т.е. химических веществ) или любой их комбинацией.

В способе пункта SH.1 устройство представляет собой руку(руки) человека, механическую клипсу, механический пресс, механический зажим, механический ползунок, механическое устройство, электромагнитное устройство, ролик, который прокатывают по поверхности, два ролика друг напротив друга, струйный пресс, гидравлическое устройство или любую их комбинацию.

В способе по пункту SH.1 в некоторых вариантах осуществления выражение «толщина образца и пространство между внутренними поверхностями пластин остаются примерно такими же, как и до снятия силы сжатия устройства» означает, что относительная разница толщины образца и пространства между внутренними поверхностями пластины до и после снятия силы сжатия составляет 0,001% или меньше, 0,01% или меньше, 0,1% или меньше; 0,5% или меньше, 1% или меньше, 2% или меньше, 5% или меньше, 8% или меньше, 10% или меньше, 15% или меньше, 20% или меньше, 30% или меньше, 40% или меньше, 50% или меньше, 60% или меньше, 70% или меньше, 80% или меньше, 90% или меньше, 99,9% или меньше или диапазон между любыми данными значениями.

В некоторых вариантах осуществления способа по пункту SH.1 толщина образца и пространство между внутренними поверхностями пластин после удаления силы сжатия за счет устройства являются предварительно заданными, где выражение «предварительно заданный» означает, что толщина и пространство после удаления силы сжатия известны до приложения силы сжатия для данных условий сжатия.

H1. Способ уменьшения толщины подходящего объема образца и поддержание уменьшенной толщины, предусматривающий:

(a) получение образца, в котором необходимо уменьшить толщину подходящего объема образца;

(b) получение двух пластин, которые являются перемещаемым относительно друг друга в разные конфигурации, где одна или обе пластины содержат разделители, и при этом разделители характеризуются предварительно заданными расстоянием между разделителями и высотой, и при этом каждый из разделителей закреплен на своей соответствующей пластине;

(c) размещение образца на одной или обеих пластинах, когда пластины приведены в открытую конфигурацию; где открытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, и пространство между пластинами не регулируется разделителями;

(d) после (с) распределение образца с применением сдавливающего устройства, которое приводит пластины в закрытую конфигурацию, где в закрытой конфигурации пластины обращены друг к другу, разделители и подходящий объем образца находятся между пластинами, толщина подходящего объема образца регулируется пластинами и разделителями и тоньше максимальной толщины образца, когда пластины находятся в открытой конфигурации, и при этом по меньшей мере один из разделителей находится внутри образца; и

(e) после (d) освобождение устройства, где после разжимания сдавливающего устройства пространство между пластинами остается таким же или примерно таким же, как во время применения устройства,

где подходящий объем представляет собой по меньшей мере часть от всего объема образца.

В способе по пункту HI примерно такое же, как пространство между пластинами составляет не более 1%, не более 2%, не более 5%, не более 10%, не более 20%, не более 50%, не более 60%, не более 70%, не более 80%, не более 90% или диапазон между любыми двумя из этих значений.

Например, в CROF руку или руки человека используют для сжатия двух пластин в закрытое положение, затем руку(руки) и, таким образом, силу сжатия за счет руки(рук) убирают, но конечная толщина образца все еще остается такой же, как во время существования силы сжатия за счет рук.

22. Другие комбинации

В настоящем изобретении каждый из вариантов осуществления в раскрытиях (т.е. во всех разделах) может применяться (а) по отдельности, (b) в комбинации с другим вариантом(вариантами) осуществления, (с) несколько раз и (d) в любой комбинации (а) - (с).

Способы и устройства, раскрытые в настоящем изобретении, можно применять по отдельности или в любой их комбинации. Термин способ или устройство «QMAX» относится к вариантам осуществления способа или устройства, описанных в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления способы и устройства, раскрытые в настоящем изобретении, могут применяться в виде Q, X, А, М, QX, QA, QM, ХА, ХМ, AM, QXA, QAM, ХАМ и QXAM.

Некоторые варианты осуществления применения Q, X, А и М для анализа иммобилизации на поверхности предусматривают:

a. обеспечение первой пластины, где поверхность первой пластины имеет по меньшей мере одну лунку известной глубины и объема, а нижняя поверхность лунки имеет один или множество участков связывания, которые могут иммобилизировать целевой объект в образце;

b. размещение в лунке образца с объемом примерно таким же, как объем лунки, где образец содержит целевой объект, при этом целевой объект является подвижным в образце, форма образца является деформируемой, а образец покрывает только часть лунки (следовательно, характеризуется обычной толщиной, которая больше, чем глубина лунки);

c. наличие покровной пластины;

d. осуществление обращения первой пластины и покровной пластины друг к другу, где образец находится между внутренними поверхностями первой пластины и второй пластины;

e. уменьшение толщины образца за счет уменьшения пространства между внутренними поверхностями первой пластины и второй пластины и

f. инкубирование образца при уменьшенной толщине образца в течение некоторого периода времени.

Одним вариантом данных способов является применение одной или более из вышеуказанных стадий по отношению к 96-луночным планшетам или другим планшетам с лунками.

Способы и устройства по настоящему изобретению, раскрытые в разделах 1, 2, 3 и 5, могут применяться по отдельности или в любой их комбинации. В частности, применяют Q для изобретений, раскрытых в разделе 1 и 2, А для изобретений, раскрытых в разделе 3 и 5, X для изобретений, раскрытых в разделе 4 и 5, и М для изобретений, раскрытых в разделе 6. Следовательно, способы и устройства по настоящему изобретению, раскрытые в разделах 1, 2, 3 и 5, могут применяться в виде Q, X, А, М, QX, QA, QM, ХА, ХМ, AM, QXA, QAM, ХАМ и QXAM.

Некоторые варианты осуществления применения Q, X, А и М для анализа иммобилизации на поверхности предусматривают:

a. обеспечение первой пластины, где поверхность первой пластины имеет по меньшей мере одну лунку известной глубины и объема, а нижняя поверхность лунки имеет один или множество участков связывания, которые могут иммобилизировать целевой объект в образце;

b. размещение в лунке образца с объемом примерно таким же, как объем лунки, где образец содержит целевой объект, при этом целевой объект является подвижным в образце, форма образца является деформируемой, а образец покрывает только часть лунки (следовательно, характеризуется обычной толщиной, которая больше, чем глубина лунки);

c. наличие покровной пластины;

d. осуществление обращения первой пластины и покровной пластины друг к другу, где образец находится между внутренними поверхностями первой пластины и второй пластины;

e. уменьшение толщины образца за счет уменьшения пространства между внутренними поверхностями первой пластины и второй пластины и

f. инкубирование образца при уменьшенной толщине образца в течение некоторого периода времени.

Одним вариантом данных способов является применение одной или более из вышеуказанных стадий по отношению к 96-луночным планшетам или другим планшетам с лунками.

Несколько вариантов осуществления способов, устройств и систем комбинируют одну или несколько особенностей количественного определения объема образца (Q), добавления реагентов (А) и/или ускорения анализа (X) (и могут упоминаться как соответствующие акронимы QA, QX, АХ и QAX). Ниже приведены некоторые экспериментальные демонстрации способов и устройств Q, А, X, QA, QX, АХ и QAX.

23. Реагенты

Термин «реагенты» относится, если не указано иное, к одному или более биологическим средствам, биохимическим средствам и/или химическим средствам. Например, реагенты могут включать средства для захвата, средства для выявления, химические соединения, оптические метки, радиоактивные метки, ферменты, антитела, белки, нуклеиновые кислоты, ДНК, РНК, липиды, углеводы, соли, металлы, поверхностно-активные вещества, растворители или любую их комбинацию.

В некоторых вариантах осуществления реагенты на пластине присутствуют в форме жидкости, твердого вещества, молекулярного пара или их комбинации. Размещение реагента включает без ограничения размещение, помещение, печать, штамповку, дозирование жидкости, испарение (термическое испарение, испарение паров, дыхание человека), химическое осаждение из паровой фазы и/или напыление. Различные реагенты могут находиться в разных местоположениях. Реагенты могут быть нанесены печатью и/или нанесены в виде небольших точек реагентов.

В некоторых вариантах осуществления реагенты сначала наносят на пластину в форме жидкости или пара, а затем сушат с получением сухих реагентов на пластине до выполнения процесса CROF.

Осуществление регуляции времени высвобождения реагентов. Способы А могут дополнительно предусматривать стадию осуществления регуляции времени высвобождения реагента (т.е. времени, определяющего, как быстро реагент может растворяться в образце). Некоторые варианты осуществления регуляции времени высвобождения реагента предусматривают стадию смешивания или нанесения поверх реагента одного или более «материалов для контроля высвобождения», которые оказывают воздействие на высвобождение (в образец) реагента. В некоторых вариантах осуществления материалом для регуляции высвобождения может быть другой реагент. Например, если имеется два реагента А и В и при этом реагент А наносят поверх реагента В, то при определенных условиях реагент А будет растворяться в образце до реагента В.

Кроме того, для осуществления регуляции высвобождения реагента можно использовать свойства поверхности первой пластины и второй пластины. Одним пример заключается в регуляции свойств смачивания поверхности. В случае многих реагентов гидрофобная поверхность хорошо связывает реагент, что, следовательно, приводит к медленному высвобождению или отсутствию высвобождения реагента в образец (в зависимости от толщины слоя реагента), тогда как гидрофильная поверхность хуже связывает реагент, что, следовательно, приводит к быстрому высвобождению в образец.

Высушивание реагентов. В некоторых вариантах осуществления после стадии (с) нанесения реагента, но перед стадией (d) нанесения образца способы А дополнительно предусматривают стадию высушивания некоторых или всех реагентов, нанесенных на стадии (с).

Местоположение реагентов. Реагенты можно наносить и/или упорядочивать на одной или обеих пластинах. Реагенты могут находиться в участках (местоположениях) для хранения на пластине (пластинах), где каждый участок хранения содержит один или более реагентов. Различные участки для хранения могут включать различные реагенты, одни и те же реагенты или один или более обычных реагентов.

Осуществление контроля концентрации добавленных реагентов. В некоторых вариантах осуществления способы могут дополнительно предусматривать стадию осуществления контроля концентрации добавленных реагентов путем контроля толщины образцов над участками хранения (т.е. поверхности с реагентами).

Реагент, применяемый в настоящем изобретении, может представлять собой любой подходящий реагент, требуемый для анализа, например, меченое или немеченое антитело, меченую или немеченую нуклеиновую кислоту, фермент, который может содержать аффинный фрагмент или не содержать его, и т.д. В некоторых вариантах осуществления и, как указано выше, хранящийся реагент может быть компонентом анализа, предназначенного для тестирования крови или другого образца жидкости на наличие аналита. Например, хлорид-ионы можно измерить согласно любому из следующих протоколов, и компоненты этих анализов могут присутствовать в участке хранения: Колориметрические способы: хлорид-ионы вытесняют тиоцианат из тиоцианата ртути. Свободный тиоцианат вступает в реакцию с ионами трехвалентного железа с образованием окрашенного комплекса тиоцианата железа, который измеряют фотометрическим способом. Кулонометрические способы: при прохождении постоянного тока между серебряными электродами образуются ионы серебра, которые вступают в реакцию с хлоридом, образуя хлорид серебра. После того как весь хлорид объединяется с ионами серебра, свободные ионы серебра накапливаются, вызывая увеличение электрического тока на электродах, и это указывает на конечную точку реакции. Меркуриметрические способы: хлорид титруют с помощью стандартного раствора ионов ртути, и они образуют растворимый комплекс HgCl2. Конечную точку данной реакции выявляют колориметрически, когда избыток ионов ртути вступает в реакцию с индикаторным красителем дифенилкарбазоном, с образованием синей окраски. Аналогично колориметрически можно измерить магний с использованием калмагита, который при взаимодействии с магнием дает красно-фиолетовую окраску; в тесте с формазановым красителем возникает испускание при 600 нм в реакции с магнием; или с использованием метилтимолового синего, который связывается с магнием с образованием окрашенного в синий цвет комплекса. Аналогично можно обнаружить кальций с помощью колориметрической методики с использованием О-крезолфталеина, который дает фиолетовую окраску при реакции О-крезолфталеинового комплексона с кальцием. Аналогично бикарбонат можно тестировать бихроматически, поскольку бикарбонат (НСО3^-) и фосфоенолпируват (PEP) превращаются в оксалоацетат и фосфат в реакции, катализируемой фосфоенолпируваткарбоксилазой (РЕРС). Малатдегидрогеназа (MD) катализирует восстановление оксалацетата до малата с одновременным окислением восстановленного никотинамидадениндинуклеотида (NADH). Это окисление NADH приводит в результате к уменьшению поглощения реакционной смеси, измеряемого бихроматически при 380/410 нм, пропорционально содержанию бикарбоната в образце. Азот мочевины крови можно выявить в колориметрическом тесте, в котором диацетил или феарон образует желтый хромоген с мочевиной и может быть количественно оценен с помощью фотометрии или многократного использования фермента уреазы, которая превращает мочевину в аммиак и углекислоту, которые можно проанализировать, например, при помощи i) уменьшения поглощения при 340 нм, когда аммиак взаимодействует с альфа-кетоглутаровой кислотой, ii) измерения скорости увеличения проводимости раствора, в котором гидролизуется мочевина. Аналогично креатинин можно измерить колориметрически, путем обработки образца щелочным раствором пикрата с получением красного комплекса. Кроме того, креатинин можно измерить с использованием реакции, отличной от реакции Яффе, в ходе которой измеряют аммиак, образующийся при гидролизе креатинина креатинин-иминогидролазой. Глюкозу можно измерить в анализе, в котором кровь подвергают воздействию определенного количества глюкозооксидазы в течение ограниченного периода времени для оценки концентрации. По истечении указанного времени избыток крови удаляют и обеспечивают возможность проявления окрашивания, которое применяют для оценки концентрации глюкозы. Например, в ходе реакции глюкозооксидазы с глюкозой образуется кислород, который превращает йодид калия (на фильтровальной бумаге) в йод с образованием коричневого цвета. Концентрация гликозилированного гемоглобина в качестве непрямой оценки уровня глюкозы в крови. Когда гемолизаты эритроцитов подвергают хроматографии, то три или более мелких пика, соответствующих гемоглобину A1, А1 и А1 с, элюируют перед основным пиком гемоглобина А. Эти «быстрые» гемоглобины образуются за счет необратимого присоединении глюкозы к гемоглобину в ходе двухстадийной реакции. Гексокиназу можно измерить в анализе, в ходе которого глюкоза фосфорилируется гексокиназой (НК) в присутствии аденозинтрифосфата (АТФ) и ионов магния с получением глюкозо-6-фосфата и аденозиндифосфата (АДФ). Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (G6P-DH) специфически окисляет глюкозо-6-фосфат до глюконат-6-фосфата с одновременным восстановлением NAD+ до NADH. Увеличение поглощения при 340 нм является пропорциональным концентрации глюкозы в образце. HDL, LDL, триглицериды можно измерить с применением протокола по методике Абеля-Кендалла, которая предусматривает проявление цвета под действием реагента Либермана-Берхарда (смешанный реагент из ангидрида уксусной кислоты, ледяной уксусной кислоты и концентрированной серной кислоты) при 620 нм после гидролиза и экстрагирования холестерина. Флуорометический анализ можно использовать для определения референтных значений триглицеридов. Определение холестерина липопротеинов высокой плотности (HDL-C) в плазме крови проводят с помощью тех же процедур, которые применяют для измерения общего холестерина в плазме крови после осаждения липопротеинов, содержащих апопротеин В, из цельной плазмы крови (LDL и VLDL) с помощью гепарина-хлорида марганца. Эти соединения также можно выявить колориметрически в анализе, основанном на ферментативной реакции, при которой количественно определяют и сложные эфиры холестерина, и свободный холестерин. Сложные эфиры холестерина гидролизуются с помощью холестеринэстеразы в холестерин, который затем окисляется холестериноксидазой в кетон-холест-4-ен-3-он и пероксид водорода. Затем пероксид водорода выявляют с помощью высокоспецифичного колориметрического зонда. Пероксидаза хрена катализирует реакцию зонда и пероксида водорода, которые связываются в соотношении 1:1. Образцы можно сравнить с известной концентрацией стандарта холестерина.

24. Области применения, образцы и ряд био/химических биомаркеров

Области применения настоящего изобретения включают без ограничения (а) выявление, очистку и количественное определение химических соединений или биомолекул, которые коррелируют со стадией определенных заболеваний, например, инфекционных и паразитарных заболеваний, травм, сердечно-сосудистых заболеваний, рака, психических расстройств, психоневрологических расстройств и органических заболеваний, например, заболеваний легких, заболеваний почек, (b) выявление, очистку и количественное определение микроорганизма, например, вируса, гриба и бактерий, из окружающей среды, например, воды, почвы или биологических образцов, например, тканей, жидкостей организма, (с) выявление, количественное определение химических соединений или биологических образцов, которые представляют угрозу для безвредности пищевых продуктов или национальной безопасности, например, токсичные отходы, сибирская язва, (d) количественное определение жизненно важных параметров при проведении медицинского или физиологического мониторинга, например, уровня глюкозы, уровня кислорода в крови, общего анализа крови, (е) выявление и количественное определение специфической ДНК или РНК из биологических образцов, например, клеток, вирусов, жидкостей организма, (f) секвенирование и сравнение генетических последовательностей в ДНК в хромосомах и митохондриях для анализа генома, или (g) для выявления продуктов реакции, например в ходе синтеза или очистки фармацевтических препаратов. Настоящее изобретение также может быть использовано в различных областях, включая без ограничения медицину, ветеринарию, сельское хозяйство, продукты питания, окружающую среду, испытание лекарственных средств и другие.

Выявление можно осуществлять в различных матрицах образцов, таких как клетки, ткани, биологические жидкости и кал. Биологические жидкости, представляющие интерес, включают без ограничения амниотическую жидкость, водянистую влагу глаза, жидкую часть стекловидного тела, кровь (например, цельную кровь, фракционированную кровь, плазму, сыворотку крови и т.д.), грудное молоко, спинномозговую жидкость (CSF), ушную серу (серную пробку), хилус, химус, эндолимфу, перилимфу, фекалии, кислоты желудочного сока, желудочный сок, лимфу, слизь (в том числе отделяемую из носа и слизистую мокроту), перикардиальную жидкость, перитонеальную жидкость, плевральную жидкость, гной, водянистые выделения, слюну, секрет сальных желез (кожное сало), сперму, мокроту, пот, синовиальную жидкость, слезы, рвотную массу, мочу и конденсат выдыхаемого воздуха. В некоторых вариантах осуществления образец содержит биологическую жидкость от человека. В некоторых вариантах осуществления образец содержит по меньшей мере одно из клеток, тканей, биологических жидкостей, стула, амниотической жидкости, водянистой влаги глаза, жидкой части стекловидного тела, крови, цельной крови, фракционированной крови, плазмы, сыворотки крови, грудного молока, спинномозговой жидкости, ушной серы, хилуса, химуса, эндолимфы, перилимфы, фекалий, кислоты желудочного сока, желудочного сока, лимфы, слизи, отделяемого из носа, слизистой мокроты, перикардиальной жидкости, перитонеальной жидкости, плевральной жидкости, гноя, водянистых выделений, слюны, кожного сала, спермы, мокроты, пота, синовиальной жидкости, слез, рвотных масс, мочи и выдыхаемого воздуха.

В вариантах осуществления образец представляет собой по меньшей мере одно из биологического образца, образца из окружающей среды и биохимического образца.

В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой по меньшей мере одно из биологического образца, образца из окружающей среды и биохимического образца.

В любом варианте осуществления устройство для CROF может быть помещено в микрофлюидное устройство и стадия b) нанесения может включать в себя нанесение образца в микрофлюидное устройство, содержащее устройство для CROF.

В любом варианте осуществления стадия d) считывания может включать выявление флуоресцентного или люминесцентного сигнала от устройства для CROF.

В любом варианте осуществления стадия d) считывания может предусматривать считывание устройства для CROF с помощью портативного устройства, выполненного с возможностью считывания устройства для CROF. Портативное устройство может быть мобильным телефоном, например смартфоном.

В любом варианте осуществления устройство для CROF может включать средство для мечения, которое может связываться с комплексом аналит-средство для захвата на устройстве для CROF.

В любом варианте осуществления устройства, системы и способы по настоящему изобретению могут дополнительно предусматривать между стадиями с) и d) стадии нанесения на устройство для CROF средства для мечения, которое связывается с комплексом аналит-средство для захвата на устройстве для CROF, и промывания устройства для CROF.

В любом варианте осуществления стадия d) считывания может предусматривать считывание идентификатора устройства для CROF. Идентификатор может быть оптическим штрих-кодом, меткой для радиочастотной идентификации или их комбинациями.

В любом варианте осуществления устройства, системы и способы по настоящему изобретению могут дополнительно предусматривать нанесение контрольного образца на контрольное устройство для CROF, содержащее средство для захвата, которое связывается с аналитом, где контрольный образец содержит известное выявляемое количество аналита, и считывание контрольного устройства для CROF с получением тем самым контрольного показателя для известного выявляемого количества аналита в образце.

В любом варианте осуществления образец может представлять собой диагностический образец, полученный от субъекта, аналит может представлять собой биомаркер, а измеренное количество аналита в образце может быть диагностическим признаком заболевания или состояния.

Количество образца может составлять приблизительно каплю образца. Количество образца может составлять количество, полученное из проколотого пальца или за одно взятие крови из пальца. Количество образца может составлять количество, полученное из микроиглы или за одно взятие венозной крови.

Образец может быть использован без дальнейшей обработки после его получения из источника или может быть обработан, например, для обогащения представляющего интерес аналита, удаления крупных твердых частиц, растворения или ресуспендирования твердого образца и т.д.

Можно использовать любой подходящий способ нанесения образца на устройство для CROF. Подходящие способы могут включать использование пипетки, капельницы, шприца и т.д. В определенных вариантах осуществления, когда устройство для CROF расположено на подложке в формате тест-полоски, как описано ниже, образец можно наносить на устройство для CROF путем погружения области приема образца тест-полоски в образец.

Образец можно собрать за один раз или за несколько раз. Образцы, собранные на протяжении определенного времени, можно объединить и/или обработать (путем нанесения на устройство для CROF и получения показателя количества аналита в образце, как описано в данном документе) индивидуально. В некоторых случаях показатели, полученные на протяжении определенного времени, могут быть объединены и могут быть применимы для продленного анализа на протяжении определенного времени для облегчения скрининга, диагностики, лечения и/или предупреждения заболеваний.

Промывание устройства для CROF для удаления несвязанных компонентов образца можно выполнить любым удобным способом, как описано выше. В определенных вариантах осуществления поверхность устройства для CROF промывают с использованием буфера для связывания для удаления несвязанных компонентов образца.

Мечение аналита выявляемой меткой можно выполнить любым удобным способом. Аналит можно метить прямо или опосредованно. При прямом мечении аналит в образце метят до того, как образец наносят на устройство для CROF. При опосредованно введении метки немеченый аналит в образце метят после того, как образец наносят на устройство для CROF для захвата немеченого аналита, как описано ниже.

Обработка данных

В определенных вариантах осуществления заявленное устройство выполнено с возможностью обработки данных, полученных в результате считывания устройства для CROF. Устройство может быть выполнено с возможностью обработки данных любым подходящим способом для применения в заявленных способах. В определенных вариантах осуществления устройство имеет ячейку памяти для хранения данных, и/или хранения инструкций для обработки данных, и/или хранения базы данных. Данные могут храниться в памяти в любом подходящем формате.

В определенных вариантах осуществления устройство имеет процессор для обработки данных. В определенных вариантах осуществления инструкции для обработки данных могут храниться в процессоре или могут храниться в отдельной ячейке памяти. В некоторых вариантах осуществления устройство может содержать программное обеспечение для реализации обработки.

В определенных вариантах осуществления устройство, выполненное с возможностью обработки данных, полученных от устройства для CROF, содержит программно реализованные способы для выполнения обработки. Программно реализованные способы могут включать один или более из алгоритмов получения изображений; алгоритмов обработки изображений; способов реализации пользовательского интерфейса, которые облегчают взаимодействие между пользователем и вычислительным устройством и служат средствами для сбора, передачи и анализа данных, протоколов связи; и алгоритмов обработки данных. В определенных вариантах осуществления алгоритмы обработки изображений включают в себя одно или более из счетчика частиц, фильтра LUT (таблицы преобразования), фильтра частиц, распознавания образов, морфологического определения, гистограммы, линейного профиля, топографического представления, бинарного преобразования или профиля соответствия цветов.

В определенных вариантах осуществления устройство выполнено с возможностью отображения информации на видеодисплее или сенсорном дисплее, при этом дисплейная страница интерпретируется программным обеспечением, находящимся в памяти устройства. Дисплейные страницы, описанные в данном документе, могут быть созданы с применением любого подходящего языка программирования, такого как, например, язык разметки гипертекста («HTML»), язык динамической разметки гипертекста («DHTML»), расширяемый язык разметки гипертекста («XHTML»), расширяемый язык разметки («XML») или другой язык программирования, который может применяться для создания файла компьютера, отображаемого на видео или другом дисплее, при помощи способа, воспринимаемого пользователем. Любой машиночитаемый носитель с логической частью, кодом, данными, инструкциями может применяться для реализации любого программного обеспечения, или стадий, или методологии. Если сеть предусматривает Интернет, то дисплейная страница может предусматривать веб-страницу подходящего типа.

Дисплейная страница согласно настоящему изобретению может включать встроенные функции, предусматривающие программные продукты, хранящиеся на запоминающем устройстве, такие как, например, подпрограммы VBScript, подпрограммы JScript, подпрограммы JavaScript, утилиты Java, компоненты ActiveX, ASP.NET, AJAX, утилиты Flash, утилиты Silverlight или AIR.

Дисплейная страница может содержать хорошо известные функции технологии графического пользовательского интерфейса, такие как, например, рамки, окна, полосы прокрутки, кнопки, пиктограммы и гиперссылки, а также известные функции, такие как интерфейс с использованием координатного указателя или интерфейс с сенсорным экраном. Наведение и щелчок по кнопке графического пользовательского интерфейса, пиктограмме, варианту выбора из меню или гиперссылке также называют «выбором» кнопки, варианта выбора или гиперссылки. Дисплейная страница в соответствии с настоящим изобретением также может включать в себя мультимедийные функции, мультисенсорные, с пиксельной чувствительностью, поверхности на основе ИК-светодиодов (IR LED), видеовзаимодействия с камерами или без них.

Пользовательский интерфейс может отображаться на видеодисплее и/или дисплейной странице. Пользовательский интерфейс может отображать отчет, созданный на основе проанализированных данных, относящихся к образцу, как дополнительно описано ниже.

Процессор может быть выполнен с возможностью обработки данных любым подходящим способом для применения в заявленных способах. Данные обрабатывают, например, в сгрупированные данные, преобразованные данные (например, пространственно-временные данные преобразуют за счет преобразования Фурье в пространственно-частотные), или они могут быть объединены с другими данными. При обработке можно поместить данные в требуемую форму, и это может предусматривать изменение формата данных. Обработка может включать в себя выявление сигнала из образца, корректировку первичных данных на основе математических манипуляций или коррекции и/или калибровок, характерных для устройства пли реагентов, используемых для исследования образца; вычисление значения, например значения концентрации, сравнение (например, с исходным уровнем, пороговым значением, стандартной кривой, данными за прошедший период или данными других датчиков), определение того, является ли тест точным, выделяя значения или результаты, которые являются выбросами или могут быть причиной для беспокойства (например, выше или ниже нормального или приемлемого диапазона или указывают на аномальное состояние), или комбинации результатов, которые вместе могут указывать на наличие аномального состояния, подбор аппроксимирующей кривой, использование данных в качестве основы для математических или других аналитических рассуждений (включая дедуктивные, индуктивные, байесовские или другие рассуждения) и другие подходящие формы обработки. В определенных вариантах осуществления обработка может включать в себя сравнение обрабатываемых данных с базой данных, хранящейся в устройстве, для извлечения инструкций относительно образа действий, которые должен выполнять субъект.

В определенных вариантах осуществления устройство может быть выполнено с возможностью обработки вводимых данных путем сравнения вводимых данных с базой данных, хранящейся в памяти, для получения инструкций относительно порядка действий, которые должен выполнять субъект. В некоторых вариантах осуществления база данных может содержать хранимую информацию, которая содержит пороговое значение для представляющего интерес аналита. Пороговое значение может быть применимо для определения присутствия или концентрации одного или более аналитов. Пороговое значение может быть применимо для выявления ситуаций, когда может быть полезным предупреждение. Блок хранения данных может включать в себя записи или другую информацию, которая может быть применима для составления отчета, относящегося к образцу.

В определенных вариантах осуществления устройство может быть выполнено с возможностью приема данных, которые получены от устройства для CROF. Таким образом, в определенных случаях устройство может быть выполнено с возможностью приема данных, которые не связаны с образцом, предоставленным субъектом, но при этом могут иметь отношение к диагнозу. Такие данные включают без ограничения возраст, пол, рост, вес, индивидуальный и/или семейный анамнез и т.д. В определенных вариантах осуществления устройство выполнено с возможностью обработки данных, полученных из образца, или независимо от образца, нанесенного на устройство для CROF.

Сеть. В определенных вариантах осуществления устройство может быть выполнено с возможностью связи по сети, такой как локальная сеть (LAN), глобальная сеть (WAN), такая как Интернет, персональная сеть, телекоммуникационная сеть, такая как телефонная сеть, сеть мобильной связи, мобильная сеть, беспроводная сеть, сеть передачи данных или любой другой тип сети. В определенных вариантах осуществления устройство может быть выполнено с возможностью использования беспроводной технологии, такой как технология Bluetooth или RTM. В некоторых вариантах осуществления устройство может быть выполнено с возможностью использования различных способов связи, таких как коммутируемое проводное соединение с модемом, прямая связь, такая как TI, цифровая сеть с интеграцией услуг (ISDN) или кабельная линия. В некоторых вариантах осуществления при беспроводном соединении могут использоваться такие иллюстративные беспроводные сети, как сотовые, спутниковые или пейджинговые сети, радиослужба пакетной передачи данных (GPRS) или локальная система передачи данных, такая как Ethernet или Token Ring по LAN. В некоторых вариантах осуществления устройство может осуществлять беспроводную связь с использованием компонентов оптической связи в инфракрасном диапазоне.

В определенных вариантах осуществления устройство выполнено с возможностью приема компьютерного файла, который может храниться в памяти, передан с сервера по сети. Устройство может получать материальные машиночитаемые носители, которые могут содержать инструкции, логическую часть, данные или код, которые могут храниться в постоянной или временной памяти устройства или могут оказывать влияние на действие устройства или инициировать его. Одно или более устройств могут передавать компьютерные файлы или ссылки, которые могут обеспечивать доступ к другим файлам компьютера.

В некоторых вариантах осуществления устройство представляет собой персональный компьютер, сервер, портативный компьютер, мобильное устройство, планшет, мобильный телефон, сотовый телефон, спутниковый телефон, смартфон (например, iPhone, Android, Blackberry, Palm, Symbian, Windows), персональный цифровой помощник, устройство Bluetooth, пейджер, телефон наземной линии связи или другое сетевое устройство. Такие устройства могут быть устройствами с поддержкой связи. Используемый в данном документе термин «мобильный телефон» относится к телефонной трубке, которая может функционировать в сети мобильной сотовой связи, сети для передачи голоса через IP (VoIP), такой как протокол инициирования сеанса (SIP), или беспроводной локальной сети (WLAN) с использованием протокола 802.11х, или любой их комбинации. В определенных вариантах осуществления устройство может быть ручным и компактным, чтобы оно могло вместиться в кошелек и/или карман потребителя (например, карманного размера).

Тестирование окружающей среды. Как подытожено выше, устройства, системы и способы по настоящему изобретению могут найти применение в анализе образца из окружающей среды, например образца из воды, почвы, промышленных отходов и т.д., на присутствие маркеров из окружающей среды. Маркером окружающей среды может быть любой подходящий маркер, который может быть захвачен средством для захвата, специфически связывающим маркер окружающей среды в устройстве для CROF, выполненном с наличием средства для захвата. Образец из окружающей среды можно получить из любого подходящего источника, такого как река, океан, озеро, дождь, снег, сточные воды, стоки после очистки сточных вод, сельскохозяйственные стоки, промышленные стоки, водопроводная вода или питьевая вода и т.д. В некоторых вариантах осуществления устройства и системы в настоящем изобретении выявляют концентрацию свинца или токсинов в воде. В некоторых вариантах осуществления присутствие или отсутствие или количественный уровень маркера окружающей среды в образце могут указывать на состояние окружающей среды, из которой получен образец. В некоторых случаях маркер окружающей среды может представлять собой вещество, которое является токсичным или вредным для организма, например человека, домашнего животного, растения и т.д., которые подвергаются воздействию этой среды. В некоторых случаях экологический маркер может быть аллергеном, который может вызывать аллергические реакции у некоторых индивидуумов, которые подвергаются воздействию этой среды. В некоторых случаях присутствие или отсутствие или количественный уровень маркера окружающей среды в образце могут коррелировать с общим состоянием окружающей среды. В таких случаях общее состояние окружающей среды можно измерить в течение определенного периода времени, такого как неделя, месяцы, годы или десятилетия.

В некоторых вариантах осуществления устройства, системы и способы в настоящем изобретении дополнительно предусматривают получение или предоставление отчета, который указывает на безопасность или вред для субъекта, подвергающегося воздействию окружающей среды, из которой получен образец, на основе информации, включающей измеренное количество маркера окружающей среды. Информация, используемая для оценки угрозы безопасности или состояния окружающей среды, может включать данные помимо типа и измеренного количества маркера окружающей среды. Эти дополнительные данные могут включать местоположение, высоту, температуру, время суток/месяц/год, давление, влажность, направление и скорость ветра, погоду и т.д. Данные могут представлять среднее значение или тенденцию в течение определенного периода (минуты, часы, дни, недели, месяцы, годы и т.д.) или текущее значение за более короткий период (миллисекунды, секунды, минуты и т.д.).

Отчет может быть составлен устройством, выполненным с возможностью считывания устройства для CROF, или может быть составлен в удаленном местоположении после отправки данных, включая измеренное количество маркера окружающей среды. В некоторых случаях эксперт может находиться в удаленном местоположении или иметь доступ к данным, отправленным в удаленное место, и может анализировать или просматривать данные для составления отчета. Эксперт может быть научным сотрудником или администратором в правительственном учреждении, таком как Центры контроля и профилактики заболеваний США (CDC) или Агентство по охране окружающей среды США (ЕРА), исследовательском учреждении, таком как университет, или в частной компании. В определенных вариантах осуществления эксперт может отправлять пользователю инструкции или рекомендации на основе данных, переданных устройством и/или проанализированных в удаленном местоположении.

Тестирование пищевых продуктов. Как подытожено выше, устройства, системы и способы по настоящему изобретению могут найти применение в анализе образца пищевых продуктов, например образца необработанных продуктов питания, обработанных продуктов питания, приготовленной пищи, питьевой воды и т.д., на присутствие маркеров пищевых продуктов. Маркером пищевых продуктов может быть любой подходящий маркер, такой как показанный в таблице В9 ниже, который может быть захвачен средством для захвата, специфически связывающий маркер пищевого продукта в устройстве для CROF, выполненном с наличием средства для захвата. Образец из окружающей среды можно получить из любого подходящего источника, такого как водопроводная вода, питьевая вода, приготовленные продукты питания, обработанные продукты питания или необработанные продукты питания и т.д. В некоторых вариантах осуществления присутствие или отсутствие или количественный уровень маркера пищевых продуктов в образце может указывать на безопасность или вредность для субъекта при употреблении данного пищевого продукта. В некоторых вариантах осуществления маркер пищевых продуктов представляет собой вещество, полученное из патогенного организма или микроорганизма, которое указывает на присутствие организма в пищевом продукте, из которого получен образец. В некоторых вариантах осуществления маркером пищевых продуктов является токсичное или вредное при употреблении субъектом вещество. В некоторых вариантах осуществления маркер пищевых продуктов представляет собой биологически активное соединение, которое может непреднамеренно или неожиданно изменить физиологию при употреблении субъектом. В некоторых вариантах осуществления маркер пищевых продуктов является показателем способа получения пищевого продукта (выращивают, закупают, вылавливают, собирают, обрабатывают, готовят и т.д.). В некоторых вариантах осуществления маркер пищевых продуктов указывает на пищевой состав пищевых продуктов. В некоторых вариантах осуществления маркер пищевых продуктов представляет собой аллерген, который может вызвать аллергическую реакцию, если пищевой продукт, из которого получен образец, употребляется субъектом.

В некоторых вариантах осуществления устройства, системы и способы в настоящем изобретении дополнительно предусматривают получение или предоставление отчета, который указывает на безопасность или вредность для субъекта при употреблении пищевых продуктов, из которых получен образец, на основе информации, включающей измеренный уровень маркера пищевых продуктов. Информация, используемая для оценки безопасности пищевых продуктов для употребления, может включать данные помимо типа и измеренного количества маркера пищевых продуктов. Эти дополнительные данные могут включать любое состояние здоровья, связанное с потребителем (аллергии, беременность, хронические или острые заболевания, принимаемые рецептурные препараты и т.д.).

Отчет может быть составлен устройством, выполненным с возможностью считывания устройства для CROF, или может быть составлен в удаленном местоположении при отправке данных, включая измеренное количество маркера пищевого продукта. В некоторых случаях эксперт по безопасности пищевых продуктов может находиться в удаленном местоположении или иметь доступ к данным, отправленным в удаленное место, и может анализировать или просматривать данные для составления отчета. Эксперт по безопасности пищевых продуктов может быть научным сотрудником или администратором в правительственном учреждении, таком как Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) или CDC, исследовательском учреждении, таком как университет, или в частной компании. В определенных вариантах осуществления эксперт по безопасности пищевых продуктов может отправлять пользователю инструкции или рекомендации на основе данных, переданных устройством и/или проанализированных в удаленном местоположении.

25. Анализ крови

Некоторые иллюстративные варианты осуществления применения настоящего изобретения представляют собой простой быстрый подсчет клеток крови с использованием смартфона.

В некоторых вариантах осуществления первую пластину и вторую пластину выбирают из тонкого предметного стекла (например, толщиной 0,2 мм) или тонкой пластиковой пленки (например, толщиной 15 мм) с относительно ровной поверхностью, и при этом каждая из них характеризуется площадью с длиной и шириной от приблизительно 0,5 см до 10 см. Разделители изготавливают из стекла, пластмассы или других материалов, которые не будут значительно деформироваться при сдавливании. Перед нанесением образца разделитель помещают на первую пластину, вторую пластину или и на первую, и на вторую; или обе необязательно покрывают реагентом, который облегчает подсчет крови (окрашивающие красители и/или антикоагулянт). Первая пластина и вторая пластина могут быть необязательно запечатаны в пакет для удобства транспортировки и более длительного срока хранения.

При тестировании с подсчетом клеток крови требуется только приблизительно 1 мкл (микролитр) (или приблизительно от 0,1 мкл до 3 мкл) крови, которую можно взять из пальца или другого места тела человека. Образец крови можно нанести непосредственно из тела человека (например, пальца) на первую пластину и вторую пластину без какого-либо разбавления. Затем первую пластину и вторую пластину обращают друг к другу так, что образец крови распологается между внутренними поверхностями первой пластины и второй пластины. Если предварительно наносят необязательные реагенты (окрашивающие красители или антикоагулянты), то их наносят на внутреннюю поверхность для смешивания с образцом. Затем первую пластину и вторую пластину сдавливают пальцами или простым механическим устройством (например, клипсой, которая сдавливает с помощью пружины). При сдавливании внутреннее пространство уменьшается, причем уменьшение в конечном итоге остановится на значении, заданном высотой разделителей, и будет достигнута конечная толщина образца, которая в целом равна конечному внутреннему пространству. Поскольку конечное внутреннее пространством известно, то конечная толщина образца становится известной, а именно определяется количественно (измеряется) с помощью данного способа.

Если образец крови не разбавлен, то после сдавливания (деформации образца) разделители и, следовательно, конечная толщина образца могут быть тонкими, например, менее 1 мкм, менее 2 мкм, менее 3 мкм, менее 4 мкм, менее 5 мкм, менее 7 мкм, менее 10 мкм, менее 15 мкм, менее 20 мкм, менее 30 мкм, менее 40 мкм, менее 50 мкм, менее 60 мкм, менее 80 мкм, менее 100 мкм, менее 150 мкм или любых диапазонов между любыми из двух чисел. Тонкий конечный образец может быть применим, поскольку если толщина конечного образца большая, то много эритроцитов может перекрываться в ходе визуализации, что способно привести к неправильному подсчету клеток. Например, образец цельной крови без разбавления толщиной приблизительно 4 мкм даст приблизительно один слой эритроцитов крови.

После сдавливания образец можно визуализировать с помощью смартфона или непосредственно, или посредством дополнительных оптических элементов (например, линзам, фильтрам или источникам света при необходимости). Изображение образца будет обработано для идентификации типов клеток, а также количества клеток. Обработку изображений можно выполнить локально на том же смартфоне, который принимает изображение, или удаленно, но конечный результат передается обратно на смартфон (где изображение передается в удаленное местоположение и обрабатывается там). В смартфоне будет отображаться количество клеток для конкретного типа клеток. В некоторых случаях будут показаны определенные рекомендации. Рекомендации могут храниться на смартфоне перед тестированием или поступать от удаленных компьютеров или специалистов.

В определенных вариантах осуществления реагенты поместят на внутренние поверхности первой пластины и/или второй пластины с использованием способов и устройств, описанных в разделе 5 (смешивание реагентов).

Устройство или способ для анализа крови предусматривает (а) устройство или способ в пункте, описанном в данном документе, и (b) пространство между пластинами (то есть пространство между внутренними поверхностями двух пластин) в закрытой конфигурации или применение такого пространства, при котором неразбавленная цельная кровь в пространстве между пластинами имеет среднее межклеточное расстояние для эритроцитов (RBC) в горизонтальном направлении большее чем средний диаметр диска RBC.

Устройство или способ упорядочивания ориентации несферической клетки, которые предусматривают (а) устройство или способ, как описано в данном документе, и (b) пространство между пластинами (то есть пространство между внутренними поверхностями двух пластин) в закрытой конфигурации или применение такого пространства, где пространство меньше среднего размера клетки в ее продольном направлении (продольное направление представляет собой максимальный размер стороны клетки). Такая компоновка может улучшить измерения объема образца (например, объема эритроцитов).

В настоящем изобретении аналиты в анализах крови включают белковые маркеры, список которых можно найти на веб-сайте Американской ассоциации клинической химии).

26. Виды упаковки

Другой аспект настоящего изобретения относится к упаковке, которая будет продлевать срок службы применяемого реагента и облегчает применение.

В некоторых вариантах осуществления пластины в CROF с реагентами или без них помещены внутрь упаковки, либо по одной пластине на упаковку, либо по несколько пластин на упаковку. В одном варианте осуществления первую пластину и вторую пластину упаковывают в другую упаковку перед применением. В некоторых вариантах осуществления разные анализы имеют общую первую пластину или общую вторую пластину.

В некоторых вариантах осуществления каждая из упаковок герметизирована. В некоторых вариантах осуществления герметичность нужна для предотвращения попадания внутрь упаковки воздуха, химических веществ, влаги, контаминантов или любой их комбинации из-за пределов упаковки. В некоторых вариантах осуществления упаковку герметизируют в вакууме или заполняют газообразным азотом или инертными газами. В некоторых вариантах осуществления материал, который может продлить срок хранения пластины и/или реагентов (включая средства для захвата, средства для выявления и т.д.), упаковывают внутри упаковки вместе с пластиной.

В некоторых вариантах осуществления упаковочные материалы имеют форму тонкого слоя, поэтому такую упаковку человек может легко разорвать руками.

27. РоС, смартфон и сеть

Один из аспектов настоящего изобретения направлен на способ мониторинга состояния здоровья субъекта, при этом способ предусматривает: нанесение образца, предоставленного субъектом, на детектор на основе CROF, выполненный с возможностью указания выходного сигнала, который является характерным для образца; обработку выходного сигнала детектора устройством, выполненным с возможностью получения выходного сигнала детектора в качестве входных данных и анализа входных данных для составления отчета; и получение отчета. Детектор усиления сигнала предлагает преимущества быстрого выявления, упрощенного устройства для считывания (например, замены смартфоном большого обычного устройства для считывания) и снижения стоимости.

Биологическая жидкость. В определенных вариантах осуществления образец может включать различные жидкие или твердые образцы. В некоторых случаях образец может быть образцом биологической жидкости от субъекта. В некоторых случаях могут быть получены твердые или полутвердые образцы. Образец может включать ткани и/или клетки, отобранные у субъекта. Образец может быть биологическим образцом. Примеры биологических образцов могут включать без ограничения кровь, сыворотку крови, плазму крови, назальный мазок, смыв из носоглотки, слюну, мочу, желудочную жидкость, ликвор, слезы, стул, слизь, пот, ушную пробку, жир, секрет желез, спинномозговую жидкость, ткань, сперму, вагинальную жидкость, интерстициальные жидкости, полученные из опухолевой ткани, глазные жидкости, ликвор, мазок из горла, воздух дыхания, волосы, ногти пальцев, кожу, биопсию, жидкость плаценты, амниотическую жидкость, пуповинную кровь, лимфатические жидкости, жидкости из полости, мокроту, гной, микробиоту, меконий, грудное молоко и/или другие выделения. Образцы могут включать смыв из носоглотки. Назальные мазки, мазки из горла, образцы стула, волосы, ноготь пальца, ушную пробку, выдыхаемый воздух и другие твердые, полутвердые или газообразные образцы можно обработать в экстрагирующем буфере, например в течение фиксированного или варьируемого количества времени до их анализа. Затем экстрагирующий буфер или его аликвоту можно обработать аналогично другим образцам жидкости, если это необходимо. Примеры образцов ткани субъекта могут включать без ограничения соединительную ткань, мышечную ткань, нервную ткань, эпителиальную ткань, хрящ, образец раковой опухоли или кость.

В определенных вариантах осуществления субъект может быть человеком или животным, отличным от человека. Субъект может быть млекопитающим, позвоночным, таким как мыши, обезьяны, люди, сельскохозяйственные животные, животные, участвующие в спортивных соревнованиях, или домашние животные. В некоторых вариантах осуществления субъект может быть пациентом. В других вариантах осуществления у субъекта может быть диагностировано заболевание, или у субъекта может быть не диагностировано заболевание. В некоторых вариантах осуществления субъект может быть здоровым субъектом.

Считывание устройства

Как подытожено выше, аспекты способа включают обработку выходного сигнала детектора усиления сигнала с помощью устройства, выполненного с возможностью получения выходного сигнала детектора в качестве входных данных и обработки входных данных для составления отчета. Можно использовать любое устройство, подходящее для получения выходного сигнала детектора в качестве входных данных и обработки входных данных для составления отчета. В некоторых вариантах осуществления устройство содержит оптический записывающий аппарат, который выполнен с возможностью получения выходного сигнала оптического детектора в качестве входных данных. В определенных случаях оптический регистрирующий аппарат представляет собой камеру, например цифровую камеру. Термин «цифровая камера» означает любую камеру, которая в качестве основного компонента содержит аппарат для фиксации изображений, оснащенный оптической системой фиксации изображений для формирования оптического изображения, датчик изображения для преобразования оптического изображения в электрический сигнал и другие компоненты, примеры таких камер включают цифровые фотокамеры, цифровые кинокамеры и веб-камеры (т.е. камеры, которые подключены, как публично, так и в частном порядке, к устройству, подключенному к вычислительной сети для обмена изображениями, включая те, которые подключены непосредственно к вычислительной сети, и подключенные к вычислительной сети посредством аппарата, такого как персональный компьютер, обладающий возможностью обработки информации). В одном примере входные данные могут содержать видеоизображение, которое может фиксировать изменения на протяжении определенного времени. Например, видео может быть получено для оценки динамических изменений в образце.

В определенных вариантах осуществления устройство получает выходной сигнал детектора посредством адаптера, который формирует интерфейс между устройством и детектором. В определенных вариантах осуществления интерфейс является универсальным для совместимости с любым устройством, подходящим для выполнения заявленного способа. Представляющие интерес интерфейсы включают без ограничения USB (универсальная последовательная шина), FireWire (шина сверхбыстрой передачи данных), Ethernet и т.д. В определенных вариантах осуществления устройство получает выходной сигнал детектора посредством беспроводной связи, включая сотовую, Bluetooth, Wi-Fi и т.д.

В определенных вариантах осуществления устройство может иметь видеодисплей. Видеодисплеи могут содержать компоненты, на которых дисплейная страница может отображаться способом, воспринимаемым пользователем, например, компьютерный монитор, электронно-лучевая трубка, жидкокристаллический дисплей, светодиодный дисплей, сенсорная панель или сенсорный дисплей и/или другое средства, известные в данной области, для испускания визуально воспринимаемого выходного сигнала. В некоторых вариантах осуществления устройство оснащено сенсорным экраном для отображения информации, такой как входные данные, полученные от детектора, и/или отчет, созданный из обработанных данных, и позволяющим субъекту вводить информацию.

В определенных вариантах осуществления устройство оснащено возможностями вибрации в качестве способа оповещения субъекта, например, об отчете, созданном при обработке выходного сигнала детектора или при подготовке к получению выходного сигнала из детектора.

В определенных вариантах осуществления устройство выполнено с возможностью отображения информации на видеодисплее или сенсорном дисплее, при этом дисплейная страница интерпретируется программным обеспечением, находящимся в памяти устройства. Дисплейные страницы, описанные в данном документе, могут быть созданы с использованием любого подходящего языка программирования, такого как, например, язык разметки гипертекста («HTML»), язык динамической разметки гипертекста («DHTML»), расширяемый язык разметки гипертекста («XHTML»), расширяемый язык разметки («XML») или другой язык программирования, который может использоваться для создания файла компьютера, отображаемого на видео- или другом дисплее, при помощи способа, воспринимаемого пользователем. Любой машиночитаемый носитель с логической частью, кодом, данными, инструкциями может применяться для реализации любого программного обеспечения, или стадий, или методологии. Если сеть предусматривает Интернет, то дисплейная страница может предусматривать веб-страницу подходящего типа.

Дисплейная страница согласно настоящему изобретению может включать встроенные функции, предусматривающие программные продукты, хранящиеся на запоминающем устройстве, такие как, например, подпрограммы VBScript, подпрограммы JScript, подпрограммы JavaScript, утилиты Java, компоненты ActiveX, ASP.NET, AJAX, утилиты Flash, утилиты Silverlight или AIR.

Дисплейная страница может содержать хорошо известные функции технологии графического пользовательского интерфейса, такие как, например, рамки, окна, полосы прокрутки, кнопки, пиктограммы и гиперссылки, а также известные функции, такие как интерфейс с использованием координатного указателя или интерфейс с сенсорным экраном. Наведение и щелчок по кнопке графического пользовательского интерфейса, пиктограмме, варианту выбора из меню или гиперссылке также называют «выбором» кнопки, варианта выбора или гиперссылки. Дисплейная страница в соответствии с настоящим изобретением также может включать мультимедийные функции, мультисенсорные, с пиксельной чувствительностью поверхности на основе ИК-светодиодов (IR LED), видеовзаимодействия с камерами или без них.

В определенных вариантах осуществления устройство может быть выполнено с возможностью приема данных, которые не являются выходными данными из детектора усиления сигнала. Таким образом, в определенных случаях устройство может быть выполнено с возможностью приема данных, которые не характеризуют образец, предоставленный субъектом, но все еще могут характеризовать субъекта. Такие данные включают без ограничения возраст, пол, рост, вес, индивидуальный и семейный анамнез и т.д. В определенных вариантах осуществления устройство выполнено с возможностью обработки входных данных, полученных от выхода детектора, в сочетании с данными, которые получены независимо от выхода детектора.

В определенных вариантах осуществления устройство может быть выполнено с возможностью связи по сети, такой как локальная сеть (LAN), глобальная сеть (WAN), такая как Интернет, персональная сеть, телекоммуникационная сеть, такая как телефонная сеть, сеть мобильной связи, мобильная сеть, беспроводная сеть, сеть передачи данных или любой другой тип сети. В определенных вариантах осуществления устройство может быть выполнено с возможностью использования беспроводной технологии, такой как технология Bluetooth или RTM. В некоторых вариантах осуществления устройство может быть выполнено с возможностью использования различных способов связи, таких как коммутируемое проводное соединение с модемом, прямая связь, такая как TI, ISDN или кабельная линия. В некоторых вариантах осуществления при беспроводном соединении могут использоваться такие иллюстративные беспроводные сети, как сотовые, спутниковые или пейджинговые сети, GPRS или локальная система передачи данных, такая как Ethernet или Token Ring по LAN. В некоторых вариантах осуществления устройство может осуществлять беспроводную связь с использованием компонентов оптической связи в инфракрасном диапазоне.

В определенных вариантах осуществления устройство выполнено с возможностью приема компьютерного файла, который может храниться в памяти, передан с сервера по сети. Устройство может получать материальные машиночитаемые носители, которые могут содержать инструкции, логическую часть, данные или код, которые могут храниться в постоянной или временной памяти устройства или могут так или иначе оказывать влияние на действие устройства или инициировать его. Одно или более устройств могут передавать компьютерные файлы или ссылки, которые могут обеспечивать доступ к другим файлам компьютера.

В некоторых вариантах осуществления устройство представляет собой персональный компьютер, сервер, портативный компьютер, мобильное устройство, планшет, мобильный телефон, сотовый телефон, спутниковый телефон, смартфон (например, iPhone, Android, Blackberry, Palm, Symbian, Windows), персональный цифровой помощник, устройство Bluetooth, пейджер, телефон наземной линии связи или другое сетевое устройство. Такие устройства могут быть устройствами с поддержкой связи. Используемый в данном документе термин «мобильный телефон» относится к телефонной трубке, которая может функционировать в сети мобильной сотовой связи, сети для передачи голоса через IP (VoIP), такой как протокол инициирования сеанса (SIP), или беспроводной локальной сети (WLAN) с использованием протокола 802.11х, или любой их комбинации. В определенных вариантах осуществления устройство может быть ручным и компактным, чтобы оно могло вместиться в кошелек и/или карман потребителя (например, карманного размера).

В определенных вариантах осуществления способ предусматривает передачу данных, полученных из образца, в удаленное местоположение, где осуществляют анализ переданных данных. Удаленное местоположение может быть местом, которое отличается от места, где расположено устройство. Удаленное местоположение может включать без ограничения больницу, кабинет врача или другое медицинское учреждение или исследовательскую лабораторию. В некоторых случаях в удаленном местоположении может быть компьютер, например сервер, который выполнен с возможностью связи (например, получения информации и передачи информации) с устройством по сети. В некоторых вариантах осуществления устройство может передавать данные в инфраструктуру облачных вычислений. Устройство может иметь доступ к инфраструктуре облачных вычислений. В некоторых вариантах осуществления предоставление вычислительных ресурсов (данных, программного обеспечения) по требованию может выполняться посредством компьютерной сети, а не с локального компьютера. Устройство может содержать очень мало программного обеспечения или данных (возможно, только минимальную операционную систему и веб-браузер), выступая в качестве базового терминала с дисплеем, подключенного к Интернету. Поскольку облако может быть основным механизмом доставки, облачные приложения и сервисы могут поддерживать любой тип программного приложения или сервиса. Информация, предоставляемая устройством и/или доступная для устройств, может быть распределена по различным вычислительным ресурсам. Альтернативно информация может храниться в одном или более фиксированных блоках хранения данных или базе данных.

В определенных вариантах осуществления удаленное местоположение содержит центральную базу данных, хранящуюся в блоке хранения данных, который получает и осуществляет анализ данных, переданных с устройства. Блоки хранения данных могут быть способными к хранению машиночитаемых носителей, которые могут содержать код, логическую часть или инструкции процессору для выполнения одной или более стадий. В некоторых вариантах осуществления полученные данные анализируют в сравнении с данными, содержащимися в центральной базе данных, и при этом результат отправляют обратно субъекту. Анализ может включать выявление сигнала из образца, корректировку первичных данных на основе математических манипуляций или коррекции и/или калибровок, характерных для устройства или реагентов, используемых для исследования образца; вычисление значения, например значения концентрации, сравнение (например, с исходным уровнем, пороговым значением, стандартной кривой, данными за прошедший период или данными других датчиков), определение того, является ли тест точным, выделяя значения или результаты, которые являются выбросами или могут быть причиной для беспокойства (например, выше или ниже нормального или приемлемого диапазона или указывают на аномальное состояние), или комбинации результатов, которые вместе могут указывать на наличие аномального состояния, подбор аппроксимирующей кривой, использование данных в качестве основы для математических или других аналитических рассуждений (включая дедуктивные, индуктивные, байесовские или другие рассуждения) и другие подходящие формы обработки.

В определенных вариантах осуществления анализ может включать в себя сравнение анализируемых данных с базой данных, хранящейся в блоке хранения данных в удаленном местоположении, для извлечения инструкций относительно образа действий, которые должен выполнять субъект. В некоторых вариантах осуществления база данных может содержать хранимую информацию, которая содержит пороговое значение для представляющего интерес аналита. Пороговое значение может быть применимо для определения присутствия или концентрации одного или более аналитов. Пороговое значение может быть применимо для выявления ситуаций, когда может быть полезным предупреждение. Блок хранения данных может содержать другую информацию, относящуюся к подготовке образца или к клиническим тестам, которые могут быть проведены с образцом. Блок хранения данных может содержать записи или другую информацию, которая может быть полезна для создания отчета, относящегося к анализируемым данным.

В определенных вариантах осуществления специалист в области здравоохранения находится в удаленном местоположении. В других вариантах осуществления специалист в области здравоохранения имеет доступ к данным, переданным устройством, в третьем местоположении, которое отличается от удаленного места или местоположения устройства. Специалист в области здравоохранения может представлять собой лицо или объект, которые связаны с системой здравоохранения. Специалистом в области здравоохранения может быть поставщик медицинских услуг в сфере здравоохранения. Специалистом в области здравоохранения может быть врач. Специалистом в области здравоохранения может быть индивидуум или учреждение, которые систематически предоставляют профилактические, лечебные, рекламно-информационные или реабилитационные медицинские услуги отдельным индивидуумам, семьям и/или общинам. Примеры специалистов в области здравоохранения могут включать врачей (включая врачей общего профиля и специалистов), стоматологов, ассистентов врачей, медсестер, акушерок, фармацевтов/провизоров, диетологов, терапевтов, психологов, мануальных терапевтов, штатных сотрудников клиники, физиотерапевтов, эксфузионистов, врачей по профессиональным заболеваниям, оптометристов, фельдшеров скорой помощи, спасателей, врачей-лаборантов, рентгенологов, социальных работников и широкий круг другого персонала, обученного для предоставления определенного вида медицинских услуг. Специалист в области здравоохранения может быть сертифицирован для выписывания рецептов или не сертифицирован. Специалист в области здравоохранения может работать в больницах, медицинских центрах и других пунктах оказания услуг или быть связанным с ними, а также с академической подготовкой, исследованиями и управлением. Некоторые специалисты в области здравоохранения могут оказывать услуги по уходу и лечению пациентов в частных домах. Общинные медико-санитарные работники могут работать вне официальных учреждений здравоохранения. Руководители служб здравоохранения, технический персонал для ведения медицинских записей и составления медико-санитарной информации и другие вспомогательные работники также могут быть специалистами в области здравоохранения или связаны с поставщиком медицинских услуг.

В некоторых вариантах осуществления специалист в области здравоохранения уже может быть знаком с субъектом или связан с субъектом. Субъект может быть пациентом специалиста в области здравоохранения. В некоторых случаях специалист в области здравоохранения, может предписать субъекту прохождение клинического теста. В одном примере специалист в области здравоохранения может быть врачом первичного звена медицинской помощи для данного субъекта. Специалистом в области здравоохранения может быть любой тип врача для данного субъекта (включая врачей общего профиля и специалистов).

Таким образом, специалист в области здравоохранения может анализировать или просматривать данные, переданные с устройства, и/или результаты анализа, выполненного в удаленном местоположении. В определенных вариантах осуществления специалист в области здравоохранения может отправлять субъекту инструкции или рекомендации на основе данных, переданных устройством и/или проанализированных в удаленном местоположении.

28. Контроль и измерение толщины образца без использования разделителей

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения разделители, которые используются для регулирования образца или подходящего объема образца, заменяют на: (а) сенсоры позиционирования, которые могут измерять внутренне пространство пластин, и (b) устройства, которые могут контролировать положения пластин и перемещать пластины до желаемого внутреннего пространства пластин на основе информации, предоставленной сенсорами. В некоторых вариантах осуществления все разделители заменены механическими столиками для поступательного движения, мониторными сенсорами и системой обратной связи.

Измерение пространства и/или толщины образца с использованием оптического способа. В некоторых вариантах осуществления измерение (f) пространства между внутренними поверхностями предусматривает использование оптической интерференции. При оптической интерференции могут использоваться несколько длин волн. Например, световой сигнал в результате интерференции света, отраженного от внутренней поверхности первой пластины и второй пластины, совершает колебания с определенной длиной волны света. По колебанию можно определить пространство между внутренними поверхностями. Для усиления сигнала интерференции одну из внутренних поверхностей или обе можно покрывать светоотражающим материалом.

В некоторых вариантах осуществления измерение (f) пространства между внутренними поверхностями предусматривает получение оптической визуализации (например, получение 2D (двухмерного)/3D (трехмерного) изображения образца, при этом получение изображения может происходить несколько раз с различными углами обзора, разной длиной волны, разной фазой и/или разной поляризацией) и обработку изображений.

Измерение площади или объема целого образца с помощью оптических способов. В некоторых вариантах осуществления измерение (f) площади или объема целого образца предусматривает получение оптической визуализации (например, получение 2D (двухмерного)/3D (трехмерного) изображения образца, при этом получение изображения может происходить несколько раз с различными углами обзора, разной длиной волны, разной фазой и/или разной поляризацией) и обработку изображений. Площадь образца означает площадь в направлении, примерно параллельном первой пластине и второй пластине. При 3D-визуализации можно использовать способ профилометрии проекционных полос (FPP), который является одним из наиболее распространенных способов получения трехмерных (3D) изображений объектов.

В некоторых вариантах осуществления измерение площади или объема образца путем визуализации предусматривает (а) калибровку масштаба изображения путем использования образца с известными площадью или объемом (например, устройство для получения изображения представляет собой смартфон, и размеры изображения, полученного с помощью телефона, можно откалибровать путем сравнения с изображением образца с известным размером, полученного тем же телефоном); (b) сравнение изображения с масштабными отметками (линейками), размещенными на первой пластине и второй пластине или рядом с ними (дополнительно обсуждается в данном документе), и (с) их комбинацию.

Используемый в данном документе свет может включать видимый свет, ультрафиолетовый свет, инфракрасный свет и/или свет ближней инфракрасной области спектра. Свет может включать длины волн в диапазоне от 20 нм до 20000 нм.

29. Другие описания вариантов осуществления

Предусмотрены следующие способы, устройства и системы. Эти варианты осуществления могут быть реализованы с использованием любых из компонентов, материалов, параметров или стадий, описанных выше или ниже. В следующих вариантах осуществления применяют пластину для CROF.

Вариант осуществления 1. Способ анализа образца жидкости, предусматривающий:

(a) получение образца, который содержит аналит;

(b) получение первой и второй пластин, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации, где каждая пластина имеет поверхность для контакта с образцом, которая является практически плоской, одна или обе пластины являются гибкими, и одна или обе пластины содержат разделители, которые закреплены на соответствующей поверхности для контакта с образцом, и где разделители характеризуются предварительно заданной практически однородной высотой и предварительно заданным постоянным расстоянием между разделителями, которое по меньшей мере в приблизительно 2 раза больше размера аналита, но не более 200 мкм (микрометров);

(c) размещение образца на одной или обеих пластинах, когда пластины приведены в открытую конфигурацию, где открытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, и пространство между пластинами не регулируется разделителями;

(d) после (с) применение двух пластин для сжатия по меньшей мере части образца в слой практически однородной толщины, которая ограничена поверхностями пластин для контакта с образцом, где однородность толщины слоя регулируется разделителями и пластинами, где сжатие предусматривает

сведение двух пластин вместе и

сдавливание с согласованием формы, или одновременно, или последовательно в области по меньшей мере одной из пластин со сдавливанием пластин вместе до закрытой конфигурации, где сдавливание с согласованием формы создает практически однородное давление на пластинах на протяжении по меньшей мере части образца, и сдавливание распространяется по меньшей мере в части образца горизонтально между поверхностями пластин для контакта с образцом, и где закрытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой пространство между пластинами в слое участка однородной толщины регулируется разделителями; и

(e) проведение анализа аналита в слое однородной толщины в то время, когда пластины приведены в закрытую конфигурацию;

где сдавливание с согласованием формы представляет собой способ, который делает давление, прилагаемое на протяжении области, практически постоянным независимо от вариации формы наружных поверхностей пластин; и

где при одновременном сдавливании давление одновременно прилагается в отношении заданной области, а при последовательном сдавливании давление прилагается в отношении части заданной области и постепенно перемещается на другую область.

Вариант осуществления 2. Устройство для анализа образца жидкости, содержащее

первую пластину и вторую пластину, где:

i. пластины являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации;

ii. одна или обе пластины являются гибкими;

iii. каждая из пластин имеет на своей соответствующей поверхности область контакта с образцом для осуществления контакта с образцом, который содержит аналит,

iv. одна или обе пластины содержат разделители, которые закреплены на соответствующей области для контакта с образцом, где разделители характеризуются предварительно заданной практически однородной высотой и предварительно заданным постоянным расстоянием между разделителями, которое по меньшей мере в приблизительно 2 раза больше размера аналита, но не более 200 мкм, и где по меньшей мере один из разделителей расположен внутри области контакта с образцом;

где одна из конфигураций представляет собой открытую конфигурацию, при которой две пластины отделены друг от друга, пространство между пластинами не регулируется разделителями, и образец размещен на одной или обеих пластинах; и

где другая из конфигураций представляет собой закрытую конфигурацию, в которую приводят после размещения образца в открытой конфигурации; и в закрытой конфигурации по меньшей мере часть образца сжата двумя пластинами в слой с толщиной высокой степени однородности, где однородная толщина слоя ограничена поверхностями пластин для контакта с образцом и регулируется пластинами и разделителями.

Вариант осуществления 3. Способ анализа образца крови, предусматривающий:

(a) получение образца крови;

(b) получение первой и второй пластин, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации, где каждая пластина имеет поверхность для контакта с образцом, которая является практически плоской, одна или обе пластины являются гибкими, и одна или обе пластины содержат разделители, которые закреплены на соответствующей поверхности для контакта с образцом, и где разделители характеризуются:

i. предварительно заданной практически однородной высотой, п. формой столбика с практически однородным поперечным сечением и ровной верхней поверхностью;

iii. соотношением ширины и высоты, равным единице или больше;

iv. предварительно заданным постоянным расстоянием между разделителями, которое находится в диапазоне от 10 мкм до 200 мкм;

v. коэффициентом заполнения, равным 1% или больше; и

vi. результатом произведения коэффициента заполнения и модуля Юнга разделителя, составляющим 2 МПа или больше; и

(c) размещение образца крови на одной или обеих пластинах, когда пластины приведены в открытую конфигурацию, где открытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, и пространство между пластинами не регулируется разделителями;

(d) после (с) применение двух пластин для сжатия по меньшей мере части образца крови в слой практически однородной толщины, которая ограничена поверхностями пластин для контакта с образцом, где однородность толщины слоя регулируется разделителями и пластинами и характеризуется средним значением в диапазоне от 1,8 мкм до 3 мкм с вариацией менее 10%, где сжатие предусматривает

сведение двух пластин вместе и

сдавливание с согласованием формы, или одновременно, или последовательно в области по меньшей мере одной из пластин со сдавливанием пластин вместе до закрытой конфигурации, где сдавливание с согласованием формы создает практически однородное давление на пластинах на протяжении по меньшей мере части образца, и сдавливание распространяется по меньшей мере в части образца горизонтально между поверхностями пластин для контакта с образцом, и где закрытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой пространство между пластинами в слое участка однородной толщины регулируется разделителями; и

(е) анализ крови в слое однородной толщины, пока пластины находятся в закрытой конфигурации;

где коэффициент заполнения представляет собой соотношение площади контакта с разделителем и общей площади пластины;

где сдавливание с согласованием формы представляет собой способ, который делает давление, прилагаемое на протяжении области, практически постоянным независимо от вариации формы наружных поверхностей пластин; и

где при одновременном сдавливании давление одновременно прилагается в отношении заданной области, а при последовательном сдавливании давление прилагается в отношении части заданной области и постепенно перемещается на другую область.

Вариант осуществления 4. Устройство для анализа образца жидкости, содержащее

первую пластину и вторую пластину, где:

v. пластины являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации;

vi. одна или обе пластины являются гибкими;

vii. каждая из пластин имеет на своей соответствующей поверхности область контакта с образцом для осуществления контакта с образцом крови;

viii. одна или обе пластины содержат разделители, которые закреплены на соответствующей пластине, где разделители характеризуются предварительно заданной практически однородной высотой и предварительно заданным постоянным расстоянием между разделителями, которое находится в диапазоне от 7 мкм до 200 мкм, и где по меньшей мере один из разделителей расположен внутри области контакта с образцом;

где одна из конфигураций представляет собой открытую конфигурацию, при которой две пластины отделены друг от друга, пространство между пластинами не регулируется разделителями, и образец размещен на одной или обеих пластинах; и

где другая из конфигураций представляет собой закрытую конфигурацию, в которую приводят после размещения образца в открытой конфигурации; и в закрытой конфигурации по меньшей мере часть образца сжата двумя пластинами в слой с толщиной высокой степени однородности, где однородная толщина слоя ограничена внутренними поверхностями двух пластин, и регулируется пластинами и разделителями, и характеризуется средним значением в диапазоне от 1,8 мкм до 3 мкм с незначительной вариацией.

Вариант осуществления 5. Способ местного связывания целевого объекта в части образца жидкости, предусматривающий:

(a) получение образца, который содержит целевой объект, способный к диффузии в образце;

(b) получение первой и второй пластин, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации, где одна или обе пластины содержат разделители, которые закреплены на соответствующей пластине, где разделители характеризуются предварительно заданной практически однородной высотой, и где первая пластина содержит на своей поверхности участок связывания, который характеризуется предварительно заданной площадью и связывается с целевым объектом и иммобилизирует его;

(c) размещение образца на одной или обеих пластинах, когда пластины приведены в открытую конфигурацию, где открытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, и пространство между пластинами не регулируется разделителями;

(d) после (с) сжатие образца путем приведения двух пластин в закрытую конфигурацию, где закрытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой по меньшей мере часть образца сжата в слой однородной толщины, который соприкасается с внутренними поверхностями двух пластин и ограничен ими, и который соприкасается с участком связывания, где однородная толщина слоя, регулируемая разделителями и пластинами, составляет менее 250 мкм и является практически меньшей, чем линейный размер для предварительно заданной площади участка связывания;

(e) после (d) и пока пластины находятся в закрытой конфигурации, или:

(1) инкубирование образца на протяжении подходящего интервала времени с последующим прекращением инкубации, или

(2) инкубирование образца на протяжении времени, которое равно минимальному подходящему интервалу времени или превышает его, с последующим проведением оценки в течение периода времени, который равен максимальному подходящему интервалу времени или меньше него, связывания целевого объекта в участке связывания;

где подходящий интервал времени:

i. равен времени, которое требуется для диффузии целевого объекта через толщину слоя однородной толщины при закрытой конфигурации, или превышает его; и

ii. существенно короче времени, которое требуется для горизонтальной диффузии целевого объекта через участок связывания с минимальным размером в горизонтальной проекции;

где при завершении инкубации (1) или в ходе проведения оценки (2) большинство целевых объектов, связанных с участком связывания, происходят из образца подходящего объема;

где инкубация обеспечивает возможность связывания целевого объекта с участком связывания, и где подходящий объем представляет собой часть образца, которая расположена над участком связывания при закрытой конфигурации.

Вариант осуществления 6. Устройство для местного связывания целевого объекта в части образца жидкости, содержащее

первую пластину и вторую пластину, где:

i. пластины являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации; одна или обе пластины являются гибкими;

iii. каждая из пластин имеет на своей соответствующей поверхности область контакта с образцом для осуществления контакта с образцом, который содержит объект, способный к диффузии в образце,

iv. одна из пластин на своей области контакта с образцом имеет участок связывания, который характеризуется предварительно заданной площадью, и связывает, и иммобилизирует целевой объект;

v. одна или обе пластины содержат разделители, которые закреплены на соответствующей пластине, где разделители характеризуются предварительно заданной практически однородной высотой и предварительно заданным постоянным расстоянием между разделителями, и где по меньшей мере один из разделителей расположен внутри области контакта с образцом;

где одна из конфигураций представляет собой открытую конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, пространство между пластинами не регулируется разделителями, и образец размещен на одной или обеих пластинах, и

где другая из конфигураций представляет собой закрытую конфигурацию, в которую приводят после размещения образца в открытой конфигурации; и в закрытой конфигурации по меньшей мере часть образца сжата двумя пластинами в слой однородной толщины, где по меньшей мере часть слоя однородной толщины расположена над участком связывания, и где однородная толщина слоя, ограниченная внутренними поверхностями двух пластин, которая регулируется пластинами и разделителями, составляет менее 250 мкм и является практически меньшей, чем средний линейный размер для предварительно заданной площади участка связывания.

Вариант осуществления 7. Способ местного высвобождения реагента в часть образца жидкости, предусматривающий:

(a) получение образца;

(b) получение первой и второй пластин, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации, где:

(i) одна или обе пластины содержат разделители, которые закреплены на соответствующей пластине,

(ii) разделители характеризуются предварительно заданной однородной высотой, и

(iii) первая пластина содержит на своей поверхности участок хранения, который характеризуется предварительно заданной площадью и который содержит реагент, который при контакте с образцом растворяется в образце и диффундирует в образце;

(c) размещение образца на одной или обеих пластинах, когда пластины приведены в открытую конфигурацию, где открытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, и пространство между пластинами не регулируется разделителями;

(d) после (с) сжатие образца путем приведения двух пластин в закрытую конфигурацию, где закрытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой по меньшей мере часть образца сжата в слой однородной толщины, который ограничен внутренними поверхностями двух пластин и который покрывает участок хранения, где однородная толщина слоя, регулируемая разделителями и пластинами, составляет менее 250 мкм и является практически меньшей, чем линейный размер для предварительно заданной площади участка связывания;

(e) после (d) и пока пластины находятся в закрытой конфигурации, инкубирование образца на протяжении подходящего интервала времени с последующим прекращением инкубации,

где подходящий интервал времени:

i. приблизительно равен времени, которое требуется для диффузии целевого объекта через толщину слоя однородной толщины при закрытой конфигурации, или дольше него; и

ii. короче времени, которое требуется для горизонтальной диффузии целевого объекта через предварительно заданную площадь участка связывания с минимальным линейным размером;

вследствие чего после инкубации большая часть реагента, которая исходно расположена на участке хранения, находится в подходящем объеме образца,

где инкубация представляет собой процесс, который предоставляет возможность реагенту связывать образец или смешиваться с ним, и где подходящий объем представляет собой часть образца, расположенную над участком связывания при закрытой конфигурации.

Вариант осуществления 8. Устройство для местного высвобождения реагента в часть образца жидкости, содержащее

первую пластину и вторую пластину, где:

i. пластины являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации;

ii. одна или обе пластины являются гибкими;

vi. каждая из пластин имеет на своей соответствующей поверхности область контакта с образцом для осуществления контакта с образцом;

vii. одна из пластин содержит на своей области контакта с образцом участок хранения, который характеризуется предварительно заданной площадью и который содержит реагент, который при контакте с образцом растворяется в образце, диффундирует в образце и связывается с целевым объектом;

viii. одна или обе пластины содержат разделители, которые закреплены на соответствующей пластине, где разделители характеризуются (а) предварительно заданной практически однородной высотой, составляющей 250 мкм или меньше, и которая является практически меньшей, чем средний линейный размер для предварительно заданной площади участка реагента, и (b) предварительно заданным постоянным расстоянием между разделителями, которое составляет 200 мкм или меньше, и где по меньшей мере один из разделителей расположен в пределах области контакта с образцом;

где одна из конфигураций представляет собой открытую конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, пространство между пластинами не регулируется разделителями, и образец размещен на одной или обеих пластинах, и

где другая из конфигураций представляет собой закрытую конфигурацию, в которую приводят после размещения образца в открытой конфигурации; и в закрытой конфигурации по меньшей мере часть образца сжата двумя пластинами в слой однородной толщины, где по меньшей мере часть слоя однородной толщины расположена над участком связывания, и где однородная толщина слоя, ограниченная внутренними поверхностями двух пластин, регулируется пластинами и разделителями.

Вариант осуществления 9. Способ уменьшения времени для связывания целевого объекта в подходящем объеме образца с участком связывания на поверхности пластины, предусматривающий:

(a) получение образца, который содержит целевой объект, способный к диффузии в образце;

(b) получение первой и второй пластин, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации, где одна или обе пластины содержат разделители, которые закреплены на соответствующей пластине, и одна или обе пластины являются гибкими, где разделители характеризуются предварительно заданной практически однородной высотой и предварительно заданным постоянным расстоянием между разделителями, и где первая пластина содержит на своей поверхности участок связывания, который характеризуется предварительно заданной площадью и связывается с целевым объектом и иммобилизирует его;

(c) размещение образца на одной или обеих пластинах, когда пластины приведены в открытую конфигурацию, где открытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, и пространство между пластинами не регулируется разделителями;

(d) после (с) сжатие образца путем приведения двух пластин в закрытую конфигурацию, где закрытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой толщина образца подходящего объема уменьшена по сравнению с таковой в открытой конфигурации пластин, с обеспечением слоя практически однородной толщины, характеризующегося площадью в горизонтальной проекции по меньшей мере 1 мм2, которая ограничена внутренними поверхностями двух пластин и которая покрывает участок связывания, где однородная толщина слоя, регулируемая разделителями и пластинами, составляет менее 250 мкм и является практически меньшей, чем линейный размер для предварительно заданной площади участка связывания; где подходящий объем представляет собой полный объем образца или его часть;

где уменьшение толщины подходящего объема образца уменьшает время связывания между участком связывания и целевым объектом в подходящем объеме с достижением равновесия.

Вариант осуществления 10. Устройство для местного связывания целевого объекта в части образца жидкости, содержащее

первую пластину и вторую пластину, где:

i. пластины являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации; одна или обе пластины являются гибкими;

iii. каждая из пластин имеет на своей соответствующей поверхности область контакта с образцом для осуществления контакта с образцом, который содержит объект, способный к диффузии в образце,

iv. одна из пластин имеет на своей области контакта с образцом участок связывания, который характеризуется предварительно заданной площадью, и связывает, и иммобилизирует целевой объект;

v. одна или обе пластины содержат разделители, которые закреплены на соответствующей пластине, где разделители характеризуются предварительно заданной практически однородной высотой и предварительно заданным постоянным расстоянием между разделителями, и где по меньшей мере один из разделителей расположен внутри области контакта с образцом;

где одна из конфигураций представляет собой открытую конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, пространство между пластинами не регулируется разделителями, и образец размещен на одной или обеих пластинах, и

где другая из конфигураций представляет собой закрытую конфигурацию, в которую приводят после размещения образца в открытой конфигурации; и в закрытой конфигурации по меньшей мере часть образца сжата двумя пластинами в слой однородной толщины, где по меньшей мере часть слоя однородной толщины расположена над участком связывания, и где однородная толщина слоя, ограниченная внутренними поверхностями двух пластин, регулируется пластинами и разделителями, составляет менее 250 мкм и является практически меньшей, чем средний линейный размер для предварительно заданной площади участка связывания.

где уменьшение толщины подходящего объема образца уменьшает время связывания между участком связывания и целевым объектом в подходящем объеме с достижением равновесия.

Вариант осуществления 11. Способ одновременного мультиплексного анализа образца жидкости без жидкостной изоляции, предусматривающий:

(a) получение образца, который содержит один или более целевых аналитов, которые способны к диффузии в образце;

(b) получение первой и второй пластин, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации, где:

i. одна или обе пластины содержат разделители, которые закреплены на соответствующей пластине, и при этом одна или обе пластины являются гибкими,

ii. разделители характеризуются предварительно заданной практически однородной высотой и предварительно заданным постоянным расстоянием между разделителями,

iii. первая пластина имеет на своей поверхности один или множество участков связывания, каждый из которых характеризуется предварительно заданной областью, содержащей средство для захвата, которое связывает и иммобилизирует соответствующий целевой аналит (а); и

iv. вторая пластина имеет на своей поверхности один или множество соответствующих участков хранения, каждый из которых характеризуется предварительно заданной площадью и содержит средство для выявления в концентрации, которое при контакте с образцом растворяется в образце и диффундирует в образце,

где каждое средство для захвата, целевой аналит и соответствующее средство для выявления способны образовывать «сэндвич» средство для захвата-целевой аналит-средство для выявления в участке связывания первой пластины;

(c) размещение образца на одной или обеих пластинах, когда пластины приведены в открытую конфигурацию, где открытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, и пространство между пластинами не регулируется разделителями;

(d) после (с) сжатие образца путем приведения двух пластин в закрытую конфигурацию, где закрытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой:

i. по меньшей мере часть образца сжата в слой однородной толщины, который контактирует с внутренними поверхностями двух пластин и ограничен ими, и который контактирует с одним или множеством участков связывания и одним или множеством участков хранения,

ii. один или множество соответствующих участков хранения расположены на протяжении одного или множества участков связывания, и

iii. однородная толщина слоя, регулируемая разделителями и пластинами, составляет менее 250 мкм и является практически меньшей, чем линейный размер для предварительно заданной области каждого участка хранения;

(е) после (d) и пока пластины находятся в закрытой конфигурации, или:

(1) инкубирование образца на протяжении подходящего интервала времени с последующим прекращением инкубации или

(2) инкубирование образца на протяжении времени, которое равно минимальному подходящему интервалу времени или превышает его, с последующим проведением оценки в течение периода времени, который равен максимальному подходящему интервалу времени или меньше него, связывания целевого объекта в участке связывания;

где подходящий интервал времени

i. равен или больше времени, которое требуется для диффузии целевого аналита (а) через толщину слоя однородной толщины при закрытой конфигурации; и

ii. существенно меньше времени, которое требуется для горизонтальной диффузии целевого аналита (а) через предварительно заданную область участка хранения или участка связывания с наименьшим линейным размером;

вследствие чего осуществляется реакция, в ходе которой по завершении инкубации в (1) или в ходе проведения оценки в (2) большая часть «сэндвича» средство для захвата-целевой аналит-средство для выявления, связанного с каждым участком связывания, происходит из соответствующего подходящего объема образца;

где инкубация обеспечивает возможность связывания каждого целевого аналита с участком связывания и средством для выявления, где соответствующий подходящий объем представляет собой часть образца, расположенного над соответствующим участком хранения при закрытой конфигурации, где расстояние разделения между краями соседних участков хранения и разделение между краями соседних участков связывания больше, чем расстояние, которое целевой аналит или средство для выявления могут преодолеть при диффузии за подходящий период времени, и где отсутствует жидкостная изоляция между участками связывания и/или участками хранения.

Вариант осуществления 12. Устройство для одновременного мультиплексного проведения анализа образца жидкости без жидкостной изоляции, содержащее первую пластину и вторую пластину, где:

i. пластины являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации; одна или обе пластины являются гибкими;

ii. одна или обе пластины содержат разделители, которые закреплены на соответствующей пластине; и при этом разделители характеризуются предварительно заданной практически однородной высотой и предварительно заданным постоянным расстоянием между разделителями;

iii. каждая из пластин имеет на своей соответствующей поверхности область контакта с образцом для осуществления контакта с образцом, который содержит один или более целевых аналитов, способных к диффузии в образце,

iv. первая пластина на своей поверхности имеет один или множество участков связывания, каждый из которых характеризуется предварительно заданной областью, содержащей средство для захвата, которое связывает и иммобилизирует соответствующий целевой аналит в образце; и

v. вторая пластина на своей поверхности имеет один или множество соответствующих участков хранения, каждый из которых характеризуется предварительно заданной площадью и содержит средство для выявления в некоторой концентрации, которое при контакте с образцом растворяется в образце и диффундирует в образце,

где каждое средство для захвата, целевой аналит и соответствующее средство для выявления способны образовывать «сэндвич» средство для захвата-целевой аналит-средство для выявления в участке связывания первой пластины;

где одна из конфигураций представляет собой открытую конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, пространство между пластинами не регулируется разделителями, и образец размещен на одной или обеих пластинах, и

где другая из конфигураций представляет собой закрытую конфигурацию, в которую приводят после размещения образца в открытой конфигурации; и в закрытой конфигурации:

i. по меньшей мере часть образца сжата в слой однородной толщины, который контактирует с внутренними поверхностями двух пластин и ограничен ими, и который покрывает один или множеством участков связывания и один или множество участков хранения,

ii. один или множество соответствующих участков хранения расположены на протяжении одного или множества участков связывания, и

iii. однородная толщина слоя, регулируемая разделителями и пластинами, составляет менее 250 мкм и является практически меньшей, чем линейный размер для предварительно заданной области каждого участка хранения; и

iv. отсутствует жидкостная изоляция между участками связывания и/или участками хранения,

где расстояние разделения между краями соседних участков хранения и расстояние разделения между краями соседних участков связывания больше расстояния, которое целевой аналит или средство для выявления могут преодолеть при диффузии за подходящий период времени, и где отсутствует жидкостная изоляция между участками связывания и/или участками хранения.

Вариант осуществления 13А. Система для ускоренного анализа образца с применением мобильного телефона, содержащая:

(a) устройство для CROF, где одна или обе пластины устройства для CROF являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации; где:

i. одна из конфигураций представляет собой открытую конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, пространство между пластинами не регулируется разделителями, и образец размещен на одной или обеих пластинах; и

ii. другая из конфигураций представляет собой закрытую конфигурацию, в которую приводят после размещения образца в открытой конфигурации; и в закрытой конфигурации по меньшей мере часть образца сжата двумя пластинами в слой однородной толщины, и где слой однородной толщины, который соприкасается с внутренними поверхностями двух пластин и ограничен ими, регулируется пластинами и разделителями;

(b) устройство мобильной связи, содержащее:

i. одну или множество камер для выявления и/или визуализации образца;

ii. интегральные схемы, процессоры обработки сигналов, аппаратные средства и программное обеспечение для получения и/или обработки выявляемого сигнала и/или изображения образца и для удаленного взаимодействия; и

(c) источник света или в устройстве мобильной связи, или внешний источник.

Вариант осуществления 13 В. Способ ускоренного анализа образца с применением мобильного телефона, предусматривающий:

(a) размещение образца на устройстве для CROF системы согласно варианту осуществления 13А;

(b) проведение анализа образца, размещенного на устройстве для CROF, с получением результата и

(c) передачу результата от устройства мобильной связи в местоположение, удаленное от устройства мобильной связи.

Вариант осуществления 14. Способ анализа образца жидкости, предусматривающий:

(а) получение образца, который содержит аналит, способный к диффузии в образце;

(b) получение первой и второй пластин, которые являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации, где одна или обе пластины содержат разделители, которые закреплены на соответствующей пластине, где разделители характеризуются предварительно заданной однородной высотой, и где первая пластина содержит на своей поверхности область анализа аналита, которая характеризуется предварительно заданной площадью;

(c) размещение образца на одной или обеих пластинах, когда пластины приведены в открытую конфигурацию, где открытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой две пластины или частично, или полностью отделены друг от друга, и пространство между пластинами не регулируется разделителями;

(d) после (с) применение двух пластин для сжатия по меньшей мере части образца в слой однородной толщины, которая ограничена внутренними поверхностями двух пластин, где по меньшей мере часть слоя расположена на протяжении области анализа аналита, где однородная толщина слоя регулируется разделителями и пластинами и является практически меньшей, чем линейный размер предварительно заданной площади в горизонтальной проекции области анализа аналита, где сжатие предусматривает

сведение двух пластин вместе и

приложение внешней силы на наружные поверхности пластин со сдавливанием пластин вместе до закрытой конфигурации, где сила создает давление на пластинах на протяжении по меньшей мере части образца, и давление распространяется над по меньшей мере частью образца горизонтально между внутренними поверхностями пластин, и где закрытая конфигурация представляет собой конфигурацию, при которой пространство между пластинами в слое участка однородной толщины регулируется разделителями;

(e) инкубирование образца, пока пластины находятся в закрытой конфигурации, на протяжении времени, которое (i) приблизительно равняется или больше времени, необходимого для диффузии аналита через толщину слоя однородной толщины, и (i) существенно меньше времени, которое требуется для диффузии аналита через некоторую площадь в области анализа аналита; и

(f) сразу после (е) или прекращение инкубации и проведение измерения аналита в области анализа, или продолжение инкубации, пока пластины находятся в закрытой конфигурации, и проведение измерения аналита в области анализа за время, которое существенно меньше времени, которое требуется для диффузии аналита через некоторую область в области анализа аналита.

Следующие описания могут быть применены к вариантам осуществления 1-14, как изложено выше.

В любом варианте осуществления, в котором применяют CROF, разделители могут располагаться внутри области образца и внутри подходящей области образца для обеспечения надлежащей однородности контроля толщины образца.

В любом варианте осуществления, в котором применяют CROF, по меньшей мере одна из двух пластин может представлять собой пластмассовую пленку толщиной от 1 мкм до 50 мкм.

В любом варианте осуществления, в котором применяют CROF, по меньшей мере одна из двух пластин может представлять собой пластмассовую пленку толщиной от 50 мкм до 100 мкм.

В любом варианте осуществления, в котором применяют CROF, по меньшей мере одна из двух пластин может представлять собой пластмассовую пленку толщиной от 100 мкм до 150 мкм.

В любом варианте осуществления, в котором применяют CROF, по меньшей мере одна из двух пластин может представлять собой пластмассовую пленку толщиной от 150 мкм до 250 мкм.

В любом варианте осуществления, в котором применяют CROF, обе эти пластины могут представлять собой пластмассовую пленку толщиной, каждая из которых независимо выбрана из 10-300 мкм.

В любом варианте осуществления, в котором применяют CROF, обе эти пластины могут представлять собой пластмассовую пленку толщиной, каждая из которых независимо выбрана из 100-200 мкм.

В любом варианте осуществления, в котором применяют CROF, обе эти пластины могут представлять собой пластмассовую пленку толщиной, каждая из которых независимо выбрана из 10-100 мкм.

В любом варианте осуществления, в котором применяют CROF, высота разделителя на пластине может быть в диапазоне от 5 нм до 100 нм.

В любом варианте осуществления, в котором применяют CROF, высота разделителя на пластине может быть в диапазоне от 100 нм до 500 нм.

В любом варианте осуществления, в котором применяют CROF, высота разделителя на пластине может быть в диапазоне от 500 нм до 1 мкм.

В любом варианте осуществления, в котором применяют CROF, высота разделителя на пластине может быть в диапазоне от 1 до 2 мкм.

В любом варианте осуществления, в котором применяют CROF, высота разделителя на пластине может быть в диапазоне от 2 до 5 мкм.

В любом варианте осуществления, в котором применяют CROF, высота разделителя на пластине может быть в диапазоне от 5 до 10 мкм.

В любом варианте осуществления, в котором применяют CROF, высота разделителя на пластине может быть в диапазоне от 10 до 30 мкм.

В любом варианте осуществления, в котором применяют CROF, высота разделителя на пластине может быть в диапазоне от 30 до 50 мкм.

В любом варианте осуществления, в котором применяют CROF, высота разделителя на пластине может быть в диапазоне от 50 до 100 мкм.

В любом варианте осуществления, в котором применяют CROF, расстояние между разделителями (IDS) составляет не более 200 мкм.

В любом варианте осуществления, в котором применяют CROF, расстояние между разделителями (IDS) составляет не более 150 мкм.

В любом варианте осуществления, в котором применяют CROF, расстояние между разделителями (IDS) составляет не более 100 мкм.

В любом варианте осуществления, в котором применяют CROF, расстояние между разделителями (IDS) составляет не более 80 мкм, например, не более 60 мкм, не более 40 мкм или не более 20 мкм.

В любом варианте осуществления, в котором применяют CROF, соотношение ширины и высоты разделителей составляет по меньшей мере 1,5 (например, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4 или по меньшей мере 5).

В любом варианте осуществления, в котором применяют CROF, соотношение ширины столбика и высоты столбика может составлять по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 5 или по меньшей мере 10.

В любом варианте осуществления, в котором применяют CROF, расстояние между пластинами может быть в диапазоне 2-50 мкм, и любой анализ может характеризоваться временем насыщения менее 1 минуты.

В любом варианте осуществления, в котором применяют CROF, способ предусматривает промывку.

В любом варианте осуществления, в котором применяют CROF, способ не предусматривет промывку.

В любом варианте осуществления, в котором применяют CROF, способ характеризуется чувствительностью менее 1 нМ, например, 0,1 нмоль, 10 пмоль, 1 пмоль, 0,1 пмоль, 10 фмоль, 1 фмоль или 0,1 фмоль после инкубации менее 1 минуты.

В любом варианте осуществления, в котором применяют CROF, соотношение интервала разделителей и ширины разделителя может составлять менее приблизительно 7,0 (например, приблизительно 7,0-1,0), в частности, когда высота столбика составляет менее приблизительно 100 мкм.

В любом варианте осуществления, в котором применяют CROF, пластина может иметь толщину 20-200 мкм, например 10-50 или 50-200 мкм.

В любом варианте осуществления, в котором применяют CROF, объем образца может составлять менее 0,5 мкм, например, менее 0,5 мкм, менее 0,4 мкм, менее 0,3 мкм, менее 0,2 мкм или менее 0,1 мкм.

В любом варианте осуществления, в котором применяют CROF, расстояние между разделителями может составлять менее 200 мкм, например 20-200 мкм, 20-50 мкм или 50-200 мкм.

Другие варианты осуществления. В предпочтительном варианте осуществления для уменьшения времени инкубации до насыщения для процесса связывания, процесса смешивания реагентов, комбинации двух или другого процесса конечная толщина образца при закрытой конфигурации составляет менее 0,5 мкм (микрона). В другом предпочтительном варианте осуществления конечная толщина образца находится в диапазоне от 0,5 мкм до 1 мкм. В другом предпочтительном варианте осуществления конечная толщина образца находится в диапазоне от 1 мкм до 4 мкм. В другом предпочтительном варианте осуществления конечная толщина образца находится в диапазоне от 4 мкм до 10 мкм. В другом предпочтительном варианте осуществления конечная толщина образца находится в диапазоне от 10 мкм до 30 мкм. В другом предпочтительном варианте осуществления конечная толщина образца находится в диапазоне от 30 мкм до 100 мкм.

В предпочтительном варианте осуществления для уменьшения времени инкубации до насыщения для процесса связывания, процесса смешивания реагентов, комбинации двух или другого процесса конечная толщина образца выбрана таким образом, чтобы получить время инкубации до насыщения, составляющего менее 2 сек. В других предпочтительных вариантах конечная толщина образца выбрана таким образом, чтобы получить время инкубации до насыщения, составляющее менее 4 сек, менее 8 с, менее 12 с, менее 20 с, менее 30 с, менее 40 с, менее 60 с, менее 120 с, менее 300 с, менее 420 с или диапазон между любыми двумя из этих значений.

В любом варианте осуществления, в котором применяют CROF, устройство можно сжимать вручную в течение периода менее 1 минуты, например менее 10 с.

В определенных вариантах осуществления устройство для CROF интегрировано с микрофлюидной платформой или устройством. Микрофлюидное устройство может быть выполнено с возможностью наличия разных областей для приема образца, выявления аналитов в образце с помощью устройства для CROF, сбора отходов в резервуар и т.д. Таким образом, в определенных вариантах осуществления платформа микрофлюидных каналов может содержать компоненты для манипуляции с жидкостью, чтобы направить образец, наносимый на область приема образца микрофлюидного устройства в устройство для CROF, выполненное с возможностью выявления аналита, как описано выше. Компоненты для манипуляции с жидкостью могут быть выполнены с возможностью направления одной или более жидкостей через микрофлюидное устройство. В некоторых случаях компоненты для манипуляции с жидкостью выполнены с возможностью направления жидкостей, таких как без ограничения раствор образца, буферы и им подобные. Компоненты для манипуляции с жидкостью могут содержать без ограничения пассивные насосы и микрофлюидные каналы. В некоторых случаях пассивные насосы выполнены с возможностью микрофлюидной манипуляции с использованием капиллярного действия и направления жидкостей через микрофлюидное устройство, раскрытое в данном документе. В определенных случаях компоненты для микрофлюидной манипуляции с жидкостью выполнены с возможностью доставки небольших объемов жидкости, таких как 1 мл или меньше, таких как 500 мкл или меньше, в том числе 100 мкл или меньше, например 50 мкл или меньше, или 25 мкл или меньше, или 10 мкл или меньше, или 5 мкл или меньше, или 1 мкл или меньше. Таким образом, в определенных вариантах осуществления не требуется внешний источник энергии для функционирования микрофлюидного устройства и эксплуатации устройств, систем и способов в настоящем изобретении.

В определенных вариантах осуществления микрофлюидное устройство имеет размеры в диапазоне от 5 мм × 5 мм до 100 мм × 100 мм, в том числе размеры 50 мм × 50 мм или меньше, например 25 мм × 25 мм или меньше, или 10 мм × 10 мм или меньше. В определенных вариантах осуществления микрофлюидное устройство имеет толщину в диапазоне от 5 мм до 0,1 мм, например от 3 мм до 0,2 мм, в том числе от 2 мм до 0,3 мм или от 1 мм до 0,4 мм.

В определенных вариантах осуществления устройство для CROF расположено внутри контейнера, например лунки многолуночного планшета. Устройство для CROF также может быть встроено в дно или стенку лунки многолуночного планшета.

В некоторых вариантах осуществления носитель, содержащий устройство для CROF, такой как микрофлюидное устройство или многолуночный планшет, может иметь идентификатор устройства для CROF, который содержится в носителе. Идентификатором может быть физический объект, сформированный на носителе, таком как микрофлюидное устройство. Например, идентификатор может считываться с помощью карманного устройства, такого как мобильный телефон или смартфон, как описано выше.

В некоторых вариантах осуществления камера может захватывать изображение идентификатора, и это изображение можно проанализировать для идентификации устройства для CROF, содержащегося в микрофлюидном устройстве. В одном примере идентификатором может быть штрих-код. Штрих-код может быть 1D- или 2D-штрих-кодом. В некоторых вариантах осуществления идентификатор может испускать один или более сигналов, которые может идентифицировать детектор усиления сигнала. Например, идентификатор может обеспечивать инфракрасный, ультразвуковой, оптический, звуковой, электрический или другой сигнал, который может указывать на идентичность устройства для CROF. Идентификатор может использовать метку радиочастотной идентификации (RFID).

Идентификатор может содержать информацию, которая позволяет определять конкретный тип устройства для CROF, присутствующего в микрофлюидном устройстве или многолуночном планшете. В определенных вариантах осуществления идентификатор предоставляет ключ к базе данных, которая связывает каждый ключ идентификатора с информацией, специфичной для типа устройства для CROF, присутствующего в микрофлюидном устройстве или многолуночном планшете. Информация, специфичная для типа устройства для CROF, может включать в себя без ограничения идентификатор аналитов, с возможностью обнаружения которых выполнено устройство для CROF, координаты положения, в котором конкретный аналит может связываться с устройством для CROF, чувствительность выявления для каждого аналита и т.д. База данных может содержать другую информацию, относящуюся к конкретному устройству CROF, включая дату срока годности, номер партии и т.д. База данных может присутствовать на карманном устройстве, предоставляемом на машиночитаемом носителе, или может находиться на удаленном сервере, доступном с помощью карманного устройства.

В определенных вариантах осуществления, когда карта для CROF (например, пластина для CROF) находится в закрытой конфигурации, общая толщина карты для CROF находится в диапазоне от 10 мкм до 3 мм (например, в диапазоне от 10 мкм до 100 мкм, от 100 до 500 мкм, от 500 мкм до 1 мм, от 1 мм до 2 мм или от 2 мм до 3 мм); и размер пластины для CROF в горизонтальной проекции находится от 2 мм до 50 мм (например, от 2 мм до 5 мм, от 5 мм до 10 мм, от 10 мм до 20 мм, от 20 мм до 30 мм, от 30 мм до 40 мм или от 40 мм до 50 мм), где направления х и у принимают, соответственно, значение в данном диапазоне.

В определенных вариантах осуществления пластину для CROF вставляют в оптический адаптер и извлекают из него для проведения тестирования.

В определенном варианте осуществления оптический адаптер имеет толщину в диапазоне от 2 мм до 40 мм (например, от 2 до 5 мм, от 5 до 10 мм, от 10 до 20 мм, от 20 до 30 мм или от 30 до 40 мм), и размер в горизонтальной проекции от 10 мм до 100 мм (например, от 10 до 20 мм, от 20 до 30 мм, от 30 до 40 мм, от 40 до 50 мм, от 50 до 60 мм, от 50 до 60 мм, от 60 до 70 мм, от 70 до 80 мм или от 80 до 100 мм), где определенная толщина, размер в горизонтальной проекции в направлении х и размер в горизонтальной проекции в направлении у принимают одно из значений в данном диапазоне соответственно.

В определенных вариантах осуществления разделители для тестирования лейкоцитов находятся в диапазоне от 2 мкм до 40 мкм (например, от 2 до 10 мкм, от 10 до 20 мкм, от 20 до 30 мкм или от 30 мкм до 40 мкм).

30. Гомогенный анализ с применением поверхности усиления сигнала Во многих применениях анализа, в частности в РоС или других быстрых анализах, желательно избегать стадий промывки. Один аспект настоящего изобретения относится к устройствам, системам и способам, в которых можно избежать промывки в ходе анализа.

Путем встраивания и/или применения поверхности усиления сигнала раскрытые устройства, системы и способы могут облегчать проведение анализов без промывки. Поверхность усиления сигнала может только усиливать свет, испускаемый на небольшом расстоянии от поверхности (например, 20 нм, или 50 нм, или 100 нм). Одним примером слоя усиления сигнала является D2PA.

31. Пример ускорения анализа с использованием CROF с кольцевым (закрытого типа) разделителем

Проводили эксперимент по ускорению анализа, в котором использовали тонкую пленку из полистирола в качестве одной из пластин для CROF, тонкое стекло в качестве другой пластины, и восковое кольцо являлось разделителем, и его закрепляли на пластине из полистирола. В ходе способа CROF 2 мкл (микролитра) образца накапывали в кольцевой разделитель (и в центр с образованием небольшой капли) и сжимали двумя пластинами в более тонкую пленку, при этом расстояние между пластинами регулировалось за счет кольцевого разделителя (т.е. закрытая конфигурация двух пластин для CROF). Пластины сжимали вручную. Толщина образца была однородной при закрытой конфигурации пластин. Одна из основных причин однородности заключается в том, что объем образца соответствует объему между кольцевыми разделителями и двумя пластинами. Тестировали и иммунологический анализ, и анализ гибридизации ДНК.

При тестировании иммунологического анализа (восковой кольцевой разделитель высотой ~40 мкм и диаметром 0,8 см) белок А использовали в качестве средства для захвата и наносили на поверхность из полистирола, а в качестве аналита использовали меченый IgG. После инкубации для связывания между белком А и меченым IgG несвязанный IgG промывали и измеряли метку захваченного IgG. Тестировали различное время инкубации. В эксперименте авторов настоящего изобретения было показано, что реакция связывания насыщается менее чем за 1 мин инкубации (т.е. через 1 мин или меньше сигнал захваченного IgG не будет изменяться со временем инкубации). Такое короткое время инкубации до насыщения ожидается для пространства 40 мкм (отсюда и толщина образца), поскольку время диффузии для IgG в растворе на расстояние 40 мкм составляет приблизительно несколько секунд.

Также протестировали инкубацию подобного прямого анализа на обычном 96-луночном планшете с толщиной образца 3 мм и обнаружили, что типичное время инкубации до насыщения составляет приблизительно 120 мин. Если процесс инкубации ограничен диффузией меченого IgG, то при уменьшении толщины образца с 3 мм до 40 мкм время инкубации сокращается с -120 мин. до 1,28 с, что согласуется с нашим наблюдением времени инкубации до насыщения менее 1 минуты.

При тестировании гибридизации ДНК (восковой кольцевой разделитель высотой ~52 мкм и диаметром 0,7 см) стрептавидин-BSA представлял собой молекулярный связывающий слой на подложке из полистирола и был связан с биотинилированной нитью для захвата, причем нить для захвата захватывает меченую нить-мишень посредством гибридизации. После инкубации негибридизированную нить-мишень отмывали и тестировали сигнал метки. Тестировали различное время инкубации. В данном эксперименте было показано, что реакция связывания насыщается в пределах 30 с времени инкубации (т.е. через 1 мин. или меньше сигнал захваченного IgG не будет изменяться со временем инкубации). Такое короткое время инкубации до насыщения ожидается для пространства в 52 мкм (отсюда и толщина образца), поскольку время диффузии для целевого зонда в растворе на расстояние 52 мкм составляет приблизительно несколько секунд. (Более подробно эксперименты раскрыты, например, в предварительной заявке с порядковым номером 62/202989

Для сравнения проводили тестирование тех же самых анализов при большей толщине образца и обнаружили, что для образца толщиной 1 мм для достижения насыщения потребуется приблизительно 20 минут инкубации.

(Более подробно эксперименты раскрыты, например, в предварительной заявке с порядковым номером 62/202989

32. Пример ускорения анализа (QAX и QMAX) с помощью CROF с разделителями-столбиками

Е-1.1 Анализ QAX с устройством для CROFF с массивом из разделителей-столбиков с высотой разделителей 30 мкм для достижения времени инкубации до насыщения менее 30 с

Проводили тестирование QAX с помощью CROF и достигали времени насыщения ~30 с. Эксперимент проиллюстрирован на фиг.13а и b. В данном эксперименте средство для захвата и меченое средство для выявления предварительно наносили на одну из пары пластин для CROF до проведения способа CROF и высушивали, затем образец капали на пластину и закрывали другой пластиной с использованием способа CROF. Раскапывание образца заняло несколько секунд, способ CROF занял менее 10 секунд. В данном эксперименте показали, что для высоты разделителя 30 мкм время инкубации до насыщения составляет не более 30 секунд.

Пластины, образцы, реагенты. (1) в CROF используют устройство для CROF с самоудерживанием, которое содержит (i) Х-пластину площадью 2,5 см на 2,5 см, изготовленную из пленки РММА толщиной 175 мкм с массивом из разделителей в области контакта с образцом, где массив из разделителей имеет решетку со структурой в виде прямоугольника с постоянным интервалом 120 мкм/110 мкм (в горизонтальных направлениях х и у соответственно), при этом все разделители представляют собой столбики и имеют одинаковую форму прямоугольника с одинаковой высотой разделителя 30 мкм и шириной 40 мкм в х и 30 мкм в у, и при этом разделители изготовлены из того же материала (РММА), что и пластина, и изготовлены путем наноимпринта пленки РММА с помощью пресс-формы (следовательно, разделители закреплены на пластине с предварительно заданной высотой разделителя и пространством между разделителями 80 мкм); и (и) стеклянную пластину с плоской поверхностью (толщиной 1 мм, 3 см на 5 см). Поверхности Х-пластины и стеклянной пластины являются необработанными и гидрофильными для образца. (2) Сухое средство для захвата (cAb), представляющее собой антитело к IgG, предварительно наносили на стеклянную пластину перед раскапыванием образца и проведением способа CROF; (3) сухое средство для выявления (dAb), представляющее собой антитело к IgG, предварительно наносили на Х-пластину перед раскапыванием образца и проведением способа CROF; и (4) образец представляет собой человеческий IgG в буфере BSA с разной условной концентрацией.

Стадии эксперимента и результаты. Небольшой объем образца с аналитами (человеческий IgG) раскапывали на поверхность одной из пластин устройств для CROF, описанных в Е2-1. Исходно образец на пластине образует лужицу, но, помещая другую пластину устройства для CROF на лужицу и сжимая две пластины вместе, исходная лужица крови распределяется в пленку образца большой площади, но ультратонкую (~30 мкм), регулируемую с помощью массива из разделителей, которые находятся внутри распределенного образца. Затем человек руками равномерно прижимал Х-пластину к капле (центр к центру) на стеклянной пластине в течение 5-10 секунд, отпускал руки, ждал 30 секунд и пластины оставались в закрытой конфигурации.

Затем разные образцы (с разными устройствами для CROF) инкубировали в течение разного времени, промывали и измеряли (оптический сигнал). Результаты приведены на фиг. 13.b, на который показано время инкубации до насыщения, составляющее менее 30 секунд для анализа QAX, описанного на фиг. 13.а.

Е.1.2. Анализ QMAX и гомогенный анализ

QMAX экспериментально тестировали с использованием М-пластины (т.е. D2PA) для усиления сигнала. Кроме того, анализ QMAX сравнивали с анализом QAX, где М-пластина для усиления сигнала отсутствовала. Тестировали как гетерогенно (с промывкой), так и гомогенно (без промывки). Тестируемый анализ представляет собой флуоресцентный иммунологический анализ человеческого IgG с использованием QAX & QMAX.

Материалы и способы: Х-пластина (высота столбика 30 мкм, размер столбика 30 мкм × 40 мкм, ISD 80 мкм), 25 мм × 25 мм; М-пластина, размер 25 мм × 25 мм; и реагенты для анализа (в порядке нанесения) (a) DSU, белок А, антитело к человеческому IgG (нанесено и высушено на пластине-подложке), (b) человеческий IgG (аналит) и (с) реагенты к человеческому IgG-IR800 (нанесены и высушены на участках для хранения X-пластины).

Результаты (также показаны на фиг. 14). В данных экспериментах показано, что для устройства для CROF с пространством 30 мкм при закрытой конфигурации инкубация до насыщения находится в пределах 1 мин., а чувствительность для однократного считывания составляет LoD=2 пМ для QMAX с промывкой, LoD=10 пМ для QMAX без промывки (гомогенный); LoD=200 пМ для QAX с промывкой и для QAX без промывки (гомогенный) LoD= (не может быть считан, отсутствует разницы для различной концентрации аналита).

33. Дополнительные иллюстративные экспериментальные тестирования и предпочтительные варианты осуществления

В этом разделе приведены дополнительные иллюстративные экспериментальные тестирования и наблюдения и дополнительные предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения, которые были выполнены с использованием следующих условий и совместного проведения следующих общих работ.

Объем нанесенного образца. Если не указано иное, то все образцы, нанесенные на пластину для CROF, имеют неизвестный объем, а именно в момент нанесения точный объем не известен.

Пластины. В устройствах для CROF, используемых в данном разделе, если не указано иное, одна из двух пластин, именуемая как «Х-пластина», является единственной пластиной, которая имеет разделители. Другая пластина, называемая «пластиной-подложкой», имеет плоскую поверхность и в ней отсутствуют разделители. Тестировали различные материалы (в том числе стекло, РММА (полиметакрилат) и PS (полистирол)) для пластин и разделителей, различную толщину пластин и геометрические характеристики разделителей (формы и размеры). Поверхность контакта с образцом каждой пластины представляет собой плоскую поверхность (за исключением выступающих разделителей) с вариацией гладкости поверхности обычно менее 30 нм, но многие из плоских поверхностей имели вариацию ровности поверхности, что было вызвано гибкостью пластин, ровностью, характерной для поверхностей (не связанной с гибкостью пластин), или и тем, и другим. Некоторые из пластин имеют вариацию в гладкости внутренней поверхности более 30 нм. Типичные размеры пластин, используемых в данных примерах, составляют, если не указано иное, по меньшей мере 25 мм в ширину и по меньшей мере 25 мм в длину.

Разделители. Если не указано иное, все разделители в данном разделе: (i) закреплены на поверхности для образца Х-пластины и изготовлены путем тиснения поверхности (следовательно, материал разделителей является таким же, как и в X-пластине); (ii) представляли собой массив из столбиков, которые имеют практически однородное поперечное сечение прямоугольной или квадратной формы с закругленными углами, практически прямую боковую стенку с углом наклона от нормали менее 5 градусов, ровную верхнюю поверхность и однородную высоту разделителя; и (iii) имели фиксированное внутреннее расстояние между разделителям и (ISD) в каждом направлении X и Y (обратите внимание, что пространство по X может отличаться от пространства по Y) (см. фиг. 17.b). Кроме того, форма в горизонтальной проекции разделителей-столбиков является или квадратной, или прямоугольной с закругленными углами; тестировали разделители с разной высотой, размером, расстоянием между разделителями, формой и из разных материалов.

Изготовление разделителей. Разделители, тисненые на поверхности Х-пластины, изготавливали по методике наноимпринта, где пресс-форму вдавливали непосредственно в пластину и на исходно полностью ровной поверхности осуществляли тиснение с получением ровной поверхности, но с наличием разделителей-столбиков, выступающих из поверхности. В ходе проведения тиснения использовали температуру выше температуры стеклования пластмассы, где пластмасса может течь в ходе проведения тиснения. Пресс-форму изготавливали с помощью литографим и травления, а в некоторых случаях с помощью нанесения гальванического покрытия на исходную пресс-форму. Пресс-форму изготавливали из Si, диоксида кремния или никеля.

На фиг. 17 показаны примеры разделителей, изготовленных на пластине. Разделители изготавливали путем прямого впечатывания на поверхности пластмассовой пластины с использованием пресс-формы. На фиг. 17(a) и (b) показан вид сверху на оптической микрофотографии решетки из квадратных разделителей. Вид сверху на фотографию: (а) размер разделителей-столбиков 46 мкм × 46 мкм и расстояние между столбиками 54 мкм и (b) размер разделителей-столбиков 10 мкм × 70 мкм и расстояние между столбиками 10 мкм; и вид в перспективе, полученный с помощью SEM: (с) размер разделителей-столбиков 30 мкм × 40 мкм и высота разделителей 2 мкм и (d) размер разделителей-столбиков 30 мкм × 40 мкм и высота разделителей 30 мкм. На микрофотографиях показано, что (1) верхняя часть разделителя-столбика является очень ровной, (2) разделитель имеет практически однородное поперечное сечение, и (3) углы разделителя-столбика закруглены с радиусом кривизны приблизительно 1 мкм. Предпочтительной является кривизна большого радиуса (например, менее острый край), поскольку острый край может привести к лизису клетки или в большей степени воздействовать на поток жидкости, чем закругленный край.

Используя поверхностный профилометр, измеряли высоту столбиков на площади Х-пластины, составляющей 2 см на 2 см. Обнаружили, что типичная однородность высоты разделителей-столбиков Х-пластины, изготовленной с использованием описанных выше способов, характеризуется средней вариацией в 4 нм, 10 нм и 100 нм и относительной средней вариацией в 0,2%, 0,2% и 0,33%, соответственно, для высоты разделителя в 2 мкм, 5 мкм и 30 мкм.

Типичная процедура эксперимента. Как проиллюстрировано на фиг. 15, во-первых, небольшой объем (несколько мкл или меньше) образца наносили или на подложку, или на Х-пластине с образованием небольшой лужицы(лужиц) Во-вторых, пластины сводили вместе с перекрытием поверхности для образца пластины. В-третьих, руки использовали для сдавливания пластин с приведением в закрытую конфигурацию, где образец становится тонкой пленкой с намного большей площадью, чем исходная лужица. В-четвертых, руку(руки) отпускали. И в-пятых, различные измерения проводили при закрытой конфигурации. Ниже приведены определенные подробности стадий.

Способы нанесения образцов. Использовали два способа нанесения образцов. В одном способе наносили образец на пластины с помощью пипетки. В другом способе образцы крови непосредственно наносили из пальца субъекта (проколотого инструментом), приводя кровь на субъекте и пластину в контакт. Кровь непосредственно наносили из пальца на пластину без разведений. В данных экспериментах обнаружили, что конечные экспериментальные результаты, если не указано, не зависят от способов нанесения образца.

Нанесение образцов проводили внутри комнаты и при стандартных условиях помещения без какого-либо специального контроля температуры или использования фильтров для пыли. Обнаружили, что в таких условиях пыль, падающая на образцы, не оказывает влияние на конечные результаты измерений, поскольку (1) гибкую пластину использовали с учетом падения пыли, позволяя толщине образца в других областях по прежнему регулироваться разделителями и не оказывать влияние на самоудерживание толщины образца, и (2) площадь покрытия пылью была лишь очень небольшой частью общей доступной площади образца, при этом измерения проводили на участках, которые не подвергались воздействия пыли. Выбор области без пыли проводили с помощью оптической визуализации.

В некоторых ситуациях две пластины имеют защитные покрытия для уменьшения количества пыли, попадающей на пластины. В некоторых ситуациях две пластины помещают вместе с поверхностями для образцов во внутреннее пространство, чтобы предотвратить попадание пыли и других контаминантов.

Свойства смачивания поверхности пластины. Измерили смачивающие свойства поверхностей различных пластин, используемых в данных иллюстративных экспериментах. В таблице ниже приведены значения измерения угла смачивания образца объемом 5 мкл на необработанных или обработанных поверхностях различных материалов пластин (стекло, РММА и PS) и с различными геометрическими характеристиками поверхности (ровная поверхность и поверхность для образца в X-пластине) для образцов разных типов (вода, буфер PBS (фосфатно-солевой буферный раствор) и кровь), где Х-пластина представляет собой РММА толщиной 175 мкм, а ее поверхность для образца имеет массив из столбиков (т.е. разделителей) высотой 2 мкм с горизонтальным размером 30 мкм × 40 мкм и интервалом 110 мкм/120 мкм (т.е. расстояние между разделителями составляет 80).

Эксперименты показали, что (1) все необработанные поверхности из стекла, РММА и PS имеют гидрофильную поверхность (т.е. угол смачивания составляет менее 90 градусов); (2) необработанная поверхность из стекла имеет меньший угол смачивания (более гидрофильный), чем необработанный РММА и PS; (3) углы смачивания для воды, PBS и крови аналогичны и кровь немного лучше смачивает, чем вода и PBS; (4) необработанная Х-пластина из РММА характеризуется почти таким же углом смачивания, как и пластина из необработанного РММА; и (5) свойства смачивания поверхности могут, как и ожидалось, значительно изменяться при обработке поверхности с получением более гидрофильных или более гидрофобных.

Гидрофобность поверхности пластины можно изменить с помощью обработки поверхности. Например, для Х-пластины из РММА сделали ее более гидрофильной, подвергая поверхность воздействию кислородной плазмы, и более гидрофобной, обработав поверхность тридекафтор-1,1,2,2-тетрагидрооктилтрихлорсиланом. Углы смачивания составляли 25, 27, 28 градусов для гидрофобно обработанной Х-пластины и 105, 104 и 103 градуса для гидрофильно обработанной Х-пластины, соответственно, для образцов воды, PBS-буфера и крови.

В приведенном ниже обсуждении, если не указано специально, вся поверхность для образца (т.е. внутренняя поверхность, которая контактирует с образцом) пластин не обработана.

Площадь и высота нанесенного образца. Измеряли площадь и высоту образца на пластине, когда образец воды наносили с помощью пипетки на пластины, которые находились в открытой конфигурации.

Эксперименты показали, что типичный образец, нанесенный на пластину при открытой конфигурации, имеет толщину намного большую, чем при закрытой конфигурации.

Было отмечено, что при закрытой конфигурации пластин (1) общая площадь образца расширяется от нескольких миллиметров в диаметре до нескольких сантиметров (в зависимости от высоты разделителя), и (2) если массив из разделителей имеет решетку со структурой в виде квадрата, тогда площадь образца при закрытой конфигурации пластин также практически квадратная с квадратным краем образца, выровненным в направлении решетки со структурой в виде квадрата с разделителями. Следовательно, это демонстрирует, что конечную площадь образца при закрытой конфигурации можно контролировать, используя разделители в различном пространственном расположении. Если разделитель имеет решетку со структурой в виде прямоугольника, то итоговая область образца в закрытой конфигурации должна быть прямоугольной. Если разделитель имеет кольцевой круглый шаблон, то итоговая площадь образца в закрытой конфигурации может быть круглой.

Ручное сдавливание. Во всех экспериментах в разделе 30 пластины в способе CROF сводили вместе и сжимали в закрытую конфигурацию пластин с помощью руки (рук) человека. При итоговом сжатии для однородной толщины образца на большой площади пластин для CROF большим палец часто сдавливают одну область, а затем втирают в разные области пластин для CROF. Процесс, при котором используют руку (руки) для сдавливания устройства (пластин) для CROF в закрытую конфигурацию, называется «ручным сдавливанием».

Самоудерживание. Было отмечено, если не указано иное, что после сдавливания пластин для CROF в итоговую конфигурацию и снятия силы сжатия (например, сдавливающей руки), толщина образца между двумя пластинами по прежнему регулировалась высотой разделителей и удерживалась при постоянной толщине в течение длительного периода времени (пока образец в итоге не высохнет). Данный результат называется «самоудерживанием». Самоудерживание представляет собой капиллярные силы между пластинами, образцом жидкости и окружающей средой (например, воздухом), обусловленные поверхностным натяжением. Отметили, что ручное сдавливание и самоудерживание устройства для CROF дали отличную толщину образца, как показано в Е-1.

Измерения пространства между пластинами и толщины образца. Во всех экспериментах, приведенных ниже, пространство между внутренними поверхностями (т.е. поверхностями для образца) двух пластин при закрытой конфигурации измеряли с помощью резонанса полости Фабри-Перо (FP-резонанс), обусловленного внутренними поверхностями пластин. Из-за различий в оптическом индексе между образцом (и воздухом) и внутренней поверхностью каждая из внутренних поверхностей пластин действует в качестве оптического отражателя, а две внутренние поверхности образуют оптическую полость. Спектры FP-резонанса являются периодическими, а пространство между внутренними поверхностями, h, (следовательно, толщину образца) в точке измерения оптическим методом можно рассчитать по формуле:

где с представляет собой скорость света, Av представляет собой период в частотном интервале, и п представляет собой индекс преломления образца между пластинами.

В данном FP-резонансном тестировании источник света имел площадь в приблизительно 2 мкм на 2 мкм. Как правило, измеряли пространство между внутренними поверхностями пластин в 25 разных точках на протяжении площади 1,6 см на 1,6 см вокруг центра устройства для CROF, где 25 точек представляют собой решетку со структурой в виде квадрата 5 × 5 с интервалом (т.е. расстоянием между двумя соседними точками) в 4 мм. Измерения не затрагивали области, которые были заняты разделителями (т.е. столбиками).

Поскольку внутренние поверхности и образец находятся в контакте при закрытой конфигурации пластин, то измеренное пространство между внутренними поверхностями совпадает с толщиной образца в точке измерения.

Средняя толщина образца, Н. Среднюю толщину образца, Н, рассчитывали с использованием пространства между пластинами, измеренного в 25 точках, и формулы:

Отклонение толщины образца относится к отклонению средней толщины образца, Н, на протяжении данной площади, исходя из предварительно заданной высоты разделителя, Н₀: (Н - Н₀). При этом относительное отклонение толщины образца представляет собой отклонение, разделенное на предварительно заданную высоту разделителя: [(Н - Н₀)/Н₀]. Положительное отклонение толщины означает, что образец в среднем толще, чем высота разделителя, а отрицательное отклонение толщины означает, что образец в среднем тоньше, чем высота разделителя.

Однородность толщины образца. Однородность толщины образца, Δ, на протяжении данной площади определяют в качестве стандартного отклонения толщины образца на протяжении данной площади.

32.1 Отклонение толщины образца и однородность в CROF с ручным сдавливанием и самоудерживанием

Экспериментально изучали параметры в устройствах и способе CROF, которые могут оказывать влияние на отклонение толщины образца и однородность при закрытой конфигурации пластин после того, как отпускают руки. Было обнаружено, что параметры включают без ограничения расстояние между разделителями (IDS), форму и размеры разделителя (например, горизонтальный размер разделителя, высоту разделителя, соотношение ширины разделителя и высоты, коэффициенты заполнения площади для разделителя (соотношение площади разделителя и общей площади или соотношение интервала разделителей и ширины), механическую прочность материала (модуль Юнга) разделителей и пластины, толщину пластины и ровность поверхности каждой пластины. Ниже приведены некоторые результаты и предпочтительные варианты осуществления, полученные в экспериментах. Определение высоты разделителя, IDS, интервала и горизонтального размера разделителей приведено на фиг.16.

Е-1.1 Влияние IDS (расстояния между разделителями), и толщины, и материалов пластины на толщину образца. В эксперименте отметили, что расстояние между разделителями (ISD) массива периодических разделителей может существенно влиять на отклонение толщины образца (исходя из высоты разделителя) и ее однородность при закрытой конфигурации способа для CROF.

На фиг. 18 показаны влияние IDS, и толщины, и материалов пластины на толщину образца. Отклонение измеряемой толщины образца и однородность в зависимости от расстояния между разделителями (IDS) для различных пластин и материалов, различной толщины пластин и различных образцов. Разделители представлены в виде периодического массива и имеют высоту разделителя 5 мкм, ровную верхнюю поверхность и квадратную форму (горизонтальный размер столбика 10×10 мкм, практически однородное поперечное сечение и закругленные углы). IDS составляло 20 мкм, 50 мкм, 100 мкм, 200 мкм и 500 мкм соответственно. Подложкой являлась необработанная пластина из РММА толщиной 250 мкм с ровной поверхностью (площадью 1 дюйм × 1 дюйм). Х-пластины, на которых были непосредственно изготовлены разделители, представляли собой, соответственно, необработанную пластину из РММА толщиной 175 мкм и 50 мкм и необработанный PS толщиной 125 мкм и 25 мкм. Образец представлял собой, соответственно, 2 мкл крови (раскапывали при прямом контакте с пальцем), слюны или PBS (раскапывали пипеткой). Устройства для CROF сдавливали с помощью сдавливания руками и растирания площади 1 дюйм на 1 дюйм и они самоудерживались после сдавливания. Толщину образца измеряли при закрытой конфигурации устройств для CROF.

На фиг. 18 показано, что для данных условий эксперимента и для разделителя квадратной формы (горизонтальный размер столбика 10×10 мкм, практически однородное поперечное сечение и закругленные углы):

(1) если ISD составляет 20 мкм, 50 мкм, 100 мкм, то средняя итоговая толщина образца составляет от 5,1 мкм до 5,2 мкм, что очень близко к предварительно заданной высоте разделителя в 5 мкм, и характеризуется отклонением толщины и однородностью менее 4% (а именно, если ISD равно или меньше приблизительно 120 мкм, то отклонение и однородность могут быть менее 4%).

(2) Но если ISD составляет 200 мкм и 500 мкм, то средняя итоговая толщина образца составляет 4,3 мкм и 3,5 мкм соответственно, что значительно меньше предварительно заданной высоты разделителей (5 мкм) и имеет отклонение толщины -13,9% и -30,9% и однородность 10,9% и 27,7% соответственно. Это означает, что если ISD больше приблизительно 200 мкм, то значительно уменьшается не только среднее значение толщины, но и однородность становится неудовлетворительной.

Если для массива разделителей с размером столбика в горизонтальной проекции 40 мкм на 40 мкм (фиг. 18) ISD составляет 60 мкм, 150 мкм, 100 мкм, то средняя итоговая толщина образца составляет от 5,1 мкм до 5,2 мкм, что очень близко к предварительно заданной высоте разделителя 5 мкм и имеет отклонение толщины и однородность менее 4% (а именно, если ISD равно или менее приблизительно 100 мкм, то отклонение и однородность могут быть менее 4%).

Е-1.2 Влияние IDS/(Eb^∧3) на толщину образца

В данных экспериментах показано (например, на фиг. 19), что для достижения небольшого отклонения толщины образца и надлежащей однородности значение SD⁴/(h^xE) (х=1 на графике) Х-пластин должно быть менее 10^∧6 мкм Λ3/ГПа, где ISD представляет собой расстояние между разделителями, h представляет собой высоту (толщину) материала и Е представляет собой модуль Юнга для материала.

Во всех способах и устройствах, в которых используют CROF, в определенных вариантах осуществления значение SD⁴/(h^xE) (х=1 на графике) составляет менее 10^∧6 мкм Λ3/ГПа, менее 5×10^∧5, менее 1×10^∧6, менее 5×10^∧6 и т.д.

В любом варианте осуществления гибкие пластины могут иметь толщину в диапазоне от 20 мкм до 250 мкм (например, в диапазоне от 50 мкм до 150 мкм) и модуль Юнга в диапазоне от 0,1 до 5 ГПа (например, в диапазоне 0,5-2 ГПа).

В любом варианте осуществления произведение толщины гибкой пластины и модуля Юнга гибкой пластины находится в диапазоне от 60 до 750 ГПа-мкм.

Е-1.3 Влияние размера и высоты разделителя на толщину образца В данных экспериментах показано (например, фиг. 20), что для достижения небольшого отклонения толщины образца и для данной толщины пластины, образца и надавливания IDS должно составлять приблизительно 150 мкм или меньше.

Е-1.4 Влияние соотношения ширины и высоты разделителя на толщину образца В данных экспериментах показано (например, фиг. 21), что для достижения небольшого отклонения толщины образца для данной толщины пластины, образца и надавливания, и для ISD от 20 мкм до 150 мкм соотношение ширины и толщины столбика (WRH) должно быть более 1, а в определенных вариантах осуществления предпочтительно быть равным более 2.

Это указывает на то, что при WHR ~1 или выше разделители являются достаточно крепкими, чтобы выдерживать сдавливание и растирание при сдавливании руками, в противном случае в целом отклонение будет большим, а однородность слабой для всех ISD.

Е-1.5 Влияние коэффициентов заполнения для разделителя на толщину образца

В данных экспериментах показано (например, фиг. 22), что для достижения небольшого отклонения толщины образца и надлежащей однородности толщины для данной толщины пластины, образца коэффициент заполнения для разделителя должен составлять приблизительно 2,3 или больше.

Например, достигнутые отклонение и однородность менее 4%, показанные на фиг. 22, предполагают, что для данной площади столбика и IDS, а также для данного коэффициента заполнения площади для разделителя (т.е. соотношение горизонтальной площади столбика к общей площади) столбики из PS являются достаточно крепкими, чтобы выдерживать сдавливание и растирание при сдавливании руками. Деформацию столбика из PS можно оценить следующим образом: давление большого пальца составляет приблизительно 1-10 кг/см2 (10^∧5 Па), модуль Юнга для PS составляет ~3 ГПа, а коэффициент заполнения для разделителя-столбика шириной 20 мкм и ISD 100 мкм составляет ~4%, приводя к относительной деформации (растяжению) столбика под давлением большого пальца от 1% до 0,1%, что согласуется с нашим экспериментальным наблюдением.

Е-1.6 Влияние толщины пластины на толщину образца

В данных экспериментах показано (например, фиг. 23), что (i) для достижения небольшого отклонения толщины образца (равного или меньше 5%) и надлежащей однородности толщины для данной толщины пластины, образца, по меньшей мере одна из пластин должна иметь толщину пластины менее 200 мкм; и (ii) если Х-пластина и подложка толще 200 мкм, то они слишком жесткие, что не позволит преодолеть загрязнение пылью, приводя к ухудшению однородности/отклонения разделителей.

Е-1.7. Влияние пластины-подложки на толщину образца

В данных экспериментах обнаружили (например, фиг. 25), что если использовать более толстую (1 мм) стеклянную пластину-подложку, то максимальное IDS для меньшего отклонения толщины образца и надлежащей однородности толщины образца может начинаться от 150 мкм до 200 мкм для подложки из РММА.

Е-1.8 Модификация свойств смачивания поверхности пластины и влияние на самоудерживание

В данных экспериментах обнаружили (например, фиг. 24), что: (1) для надлежащего самоудерживания в устройстве для CROF требуется, чтобы по меньшей мере одна из двух внутренних поверхностей устройства для CROF была гидрофильной. (2) Если обе внутренние поверхности устройства для CROF являются гидрофильными, то это обеспечивает наилучшее самоудерживание и регуляцию и однородность толщины образца. (3) Если одна внутренняя поверхность устройства для CROF является гидрофильной, а другая внутренняя поверхность является гидрофобной, то площадь образца должна быть больше 0,5 см2 для получения надлежащего самоудержания. (4) Если обе внутренние поверхности являются гидрофобными, то самоудерживание либо слабое, либо недостаточное (неустойчивое). (Линии на фигурах предназначены для зрительной ориентации).

Е-1.9 Влияние времени ручного сдавливания на толщину образца

В данных экспериментах обнаружено, что устройство для CROF может самоудерживаться при времени сдавливания от 1 с до 60 с и иметь аналогичные надлежащие характеристики. Устройство для CROF имеет неудовлетворительные характеристики и не может самоудерживаться, если не сдавить (сдавить 0 с).

Е-1.10. Сравнение влияния периодических столбиков-разделителей и случайных сферических разделителей на толщину образца

Измерения на фиг. 27 показывают, что для данных экспериментальных условий устройство для CROF с периодическими столбиками-разделителями имеет гораздо меньшее отклонение толщины образца и лучшую однородность (оба менее 5%), чем со случайными сферическими разделителями (т.е. гранулами). В частности, для ISD 20 мкм, 50 мкм и 100 мкм среднее отклонение толщины и однородность с использованием периодических столбиков-разделителей с однородным поперечным сечением составляли 2,3% и ~3,4%. Однако при использовании случайных сферических разделителей со средним ISD 20 мкм, 50 мкм и 100 мкм среднее отклонение толщины и однородность составляли 11,2% и 12,5% при использовании стеклянной покровной пластины толщиной 220 мкм и 10,8% и 20% при использовании покровной пластины из РММА толщиной 175 мкм, при этом данные результаты в приблизительно 5 раз больше в отклонении толщины образца и выражают более слабую однородность.

Е1.12. Другие результаты

На фиг. 28 показано влияние различной толщины X-Plate и толщины подложки на толщину образца.

В данных экспериментах обнаружено, что жидкость, раскапываемая пипеткой сразу при отборе из пальца, имеет аналогичные характеристики итоговой толщины образца и однородности.

В данных экспериментах также показано, что жидкость, раскапываемая на подложку или на Х-пластине, имеет сходные характеристики измеренной толщины образца и однородности.

32.2 Клинический анализ крови в неразбавленной цельной крови с использованием CROP с самоудержанием

Е2.1 Используемые устройства для CROF

Устройства для CROF, используемые во всех тестах в примере 32.2, содержали X-пластину и стеклянную пластину с ровной поверхностью. Х-пластина представляла собой пленку РММА толщиной 175 мкм, площадью 2,5 см на 2,5 см, с массивом периодических разделителей в области контакта с образцом. Стеклянная пластина имела толщину 1 мм и характеризовалась плоской поверхностью и площадью 3 см на 5 см. Разделители на X-пластине получали непосредственным тиснением на пленке РММА с исходно ровной поверхностью, следовательно, они были изготовлены из РММА (тот же материал, что и для Х-пластины) и были присоединены к Х-пластине.

Каждый разделитель представляет собой столбик, который имеет практически однородное горизонтальное поперечное сечение, ровную верхнюю поверхность и прямоугольную форму шириной 40 мкм и 30 мкм в горизонтальном направлении х и у соответственно. Все разделители на данной Х-пластины имеют одинаковую высоту разделителя. Массив периодических разделителей характеризовался решеткой со структурой в виде прямоугольника с постоянным интервалом 120 мкм и 1 10 мкм (по х и у соответственно), что давало постоянное пространство между разделителями (IDS) в 80 мкм.

Поверхности Х-пластины и стеклянной пластины не обработаны и являются гидрофильными для человеческой крови, раскапываемой на поверхности с углом смачивания в приблизительно 40-50 градусов. Обе пластины прозрачны для видимого света.

Е2.2 Образец, получение, нанесение, способ CROF, самоудерживание

Если не указано иное, то все образцы крови были получены от здоровых субъектов, которые в свежем виде и непосредственно наносили на пластину для CROF без разведения и без добавления антикоагулянтов.

Во всех экспериментах, приведенных в примере 3, если специально не указано иное, кровь поступала из проколотого пальца человека, и эту кровь наносили на пластину для CROF путем непосредственного соприкосновения крови и пластины. Как правило, при непосредственном соприкосновении с поверхностью пластины наносится объем крови в приблизительно 0,1-1 мкл. В течение приблизительно 60 секунд после нанесения крови использовали способ CROF, чтобы сжать образец крови в тонкую пленку, а затем провести измерения. Если не указано специально, то ни средства против агглютинации, ни жидкие разбавители не добавляли в образец крови.

В определенных экспериментах, где необходимо проводить окрашивание WBC перед анализом крови, реагент - слой сухой красителя акридинового оранжевого -предварительно наносили на внутреннюю поверхность (поверхность контакта с образцом) одной из пластин устройства для CROF. Нанесение покрытия из сухого слоя красителя включало следующие стадии: (а) раскапывание 30 мкл красителя акридинового оранжевого в воде при концентрации 20 мкг/мл на стеклянную пластину, (b) распределение его по площади ~ 1 см², и (с) высушивание в течение приблизительно 1 часа.

Независимо от способов нанесения приблизительно 1 мкл или меньшего объема крови на одну из пластин для CROF, нанесенная на пластину кровь образует на пластине лужицу диаметром несколько миллиметров или меньше. Затем две пластины устройства для CROF приводили вручную в закрытую конфигурацию и сдавливали вручную в течение нескольких секунд, где исходную лужицу крови сжимали двумя пластинами в тонкую пленку крови большой площади (с горизонтальным размером приблизительно 1-3 см). Выявили, что во всем примере 3, если не указано иное, устройства для CROF, сдавленные вручную, имели однородную толщину образца, регулируемую разделителями, и были в состоянии самостоятельно удерживать однородную толщину образца после того, как убрали сдавливание руками. Образцы наносили при обычных условиях помещения. Обнаружили, что пыль не повлияла на достижение предварительно заданной конечной толщины образца на большой площади образца. Также обнаружили, что итоговый образец крови распределен с принятием прямоугольной формы с закругленными углами, что, по нашему мнению, обусловлено решеткой со структурой в виде прямоугольника из периодических разделителей. Данная стадия проиллюстрирована на фиг. 15.

Что касается применения образца с использованием сухого красителя на пластине, то данный образец выдерживали 30 секунд перед проведением любых измерений.

Образец крови, непосредственно нанесенный на пластину, вообще не разбавляли жидкостью (т.е. без разведения жидкостью), при этом он смешивался с сухим реагентом, покрывающим пластину.

Все разделители имели одинаковую прямоугольную форму с одинаковой высотой разделителя 2 мкм.

Высоту разделителя 2 мкм выбирали таким образом, чтобы итоговый размер образца крови при закрытой конфигурации устройства для CROF составлял приблизительно 2 мкм, что приблизительно равно толщине эритроцитов (RBC) (2-2,5 мкм), но намного меньше диаметра RBC (6,2-8,2 мкм). Такая итоговая толщина образца приводила к тому, что при закрытой конфигурации CROF каждый RBC хорошо отделен от других и между разными RBC отсутствовало перекрытие или не образовывались столбики, что позволяет точно подсчитать RBC при получении изображения площади образца.

Е2.3 Визуализация клеток крови

Если не указано иное, визуализацию образцов крови в примере 3 проводили с образцами между двумя пластинами CROP, которые находились в закрытой конфигурации, и с использованием коммерческой камеры DSLR (Nikon) и iPhone соответственно. Результаты от каждого типа камер являются сопоставимыми. Если не указано иное, изображения представляют собой вид сверху образцов через одну из пластин, которая является прозрачной (т.е. двухмерные изображения образца в плоскости, параллельной поверхности пластин).

Камера Nikon. Образцы наблюдают с помощью обычной коммерческой DSLR-камеры (Nikon) с двумя фильтрами (полосовой фильтр 470±20 нм в качестве фильтра возбуждения и высокочастотный фильтр 500 нм в качестве фильтра испускания), одним источником света (ксеноновая лампа) и комплектом линз для увеличения/фокуса. В режиме светлого поля широкополосный источник белого света без использования каких-либо фильтров. В режиме флуоресценции фильтр 470±20 нм помещали перед ксеноновой лампой для создания узкополосного источника возбуждения с длиной волны около 470 нм, а высокочастотный фильтр 500 нм помещали перед камерой для блокировки входящего в камеру света с длиной волны менее 500 нм.

Мобильный телефон. Для наших экспериментов использовали iPhone-6.

Е2.4 Высота разделителя (толщина образца). Влияние на клетки крови и подсчет RBC

В данных экспериментах толщину образцов контролировали таким образом, чтобы она была такой же, как и высота разделителя. Экспериментально исследовали влияние высоты разделителя (а, следовательно, толщины образца) в способе CROF на клетки крови, а также на их визуализацию и подсчет. Устройства для CROF и используемый способ и нанесение крови были такими, как описано в начале этого раздела в примере 2. Образцы крови были от одного и того же здорового субъекта. В одном из наших экспериментов тестировали четыре разные высоты разделителей (1 мкм, 2 мкм, 3 мкм и 5 мкм).

На фиг. 29 показаны оптические микрофотографии вида сверху (оптический микроскоп со светльм полем) образца крови, который был подвергнут процессу CROF внутри четырех различных устройств для CROF, где каждое устройство для CROF имеет решетку со структурой в виде прямоугольника из периодических разделителей и отличающуюся постоянную высоту разделителя: 1 мкм (а), 2 мкм (b), 3 мкм (с) и 5 мкм (d). Образец крови непосредственно наносили из пальца субъекта на пластину устройства для CROF и в кровь не добавляли ни средство против агглютинации, ни жидкий разбавитель.

При светлопольной оптической микроскопии намного проще увидеть клетки RBC, чем WBC. Эритроциты (RBC), также называемые красными кровяными тельцами, имеют диаметр диска приблизительно 6,2-8,2 мкм, и толщину в точке с наибольшей толщиной 2-2,5 мкм (около края диска), и минимальную толщину в центре 0,8-1 мкм.

Наблюдение в оптическом микроскопе показало, что при высоте разделителя 1 мкм ~99% RBC лизируются. Например, на фиг. 29(а) показано, что в поле наблюдения остались только RBC. Высота разделителя 1 мкм существенно меньше средней толщины RBC. Этот эксперимент показал, что устройства и способ CROF можно использовать для лизирования клетки, делая конечный разделитель пластины (посредством контроля высоты разделителя) меньше минимального размера клетки.

Наблюдение в оптическом микроскопе (например, на фиг. 29) показало, что при высоте разделителя 2 мкм (толщина образца) RBC отделены друг от друга, практически не перекрываются между собой и имеют практически круглую и симметричную форму. Разделение между каждым RBC хорошо видно по полностью круглой темной граничной линии каждого RBC (т.е. граничная линия полностью окружает каждую (и только одну) клетку) на 2D-изображении микроскопа

Кроме того, наблюдение под микроскопом также показало, что RBC темнее в центре клетки, чем у края, указывая на то, что при высоте разделителя 2 мкм (толщина образца) в центре RBC по-прежнему тоньше, чем у края.

Наблюдение в оптическом микроскопе показало (например, фиг. 29), что если высота разделителя (следовательно, толщина образца) составляла 3 мкм, то изображение образца крови резко отличалось от изображения при высоте разделителя 2 мкм по несколькими причинам, включая без ограничения: (1) RBC в значительной степени перекрывались и у большинства RBC отсутствовала полностью круглая темная граничная линия, которая отделяет каждую клетку, которая существует при высоте разделителя 2 мкм, но несколько RBC вместе делили одну темную граничную линию, которая больше не являлась круглой; и (2) некоторые из RBC не имели такой практически закругленной формы, как при высоте разделителя 2 мкм, а скорее имели эллипсоидную форму, и при этом центральный темный диск каждого RBC, который был прозрачным при высоте разделителя 2 мкм, с трудом поддавался визуализации. Когда высота разделителя составляла 5 мкм, то у RBC было больше перекрытий и большее количество RBC имело некруглую форму и практически невидимый темный центр (например, фиг. 29).

Хорошо известно, что в крови без ограничения в пространстве RBC могут перекрываться друг с другом (образуя, например, столбики). При ограничении образца крови между двумя плоскими пластинами с пространством 2 мкм с использованием высоты разделителей и пластин толщина крови равна приблизительно толщине в точке с наибольшей толщиной RBC (которая составляет 2-2,5 мкм), таким образом, в данном местоположении на поверхности пластины ограничение вынуждает только один RBC пройти между двумя пластинами и заставляет RBC ориентировать его диск параллельно поверхности пластины, что приводит к надлежащему разделению RBC, образованию полной круглой темной граничной линии и практически круглой форме при осмотре сверху с использованием оптической микроскопии.

Поскольку высота разделителя и, следовательно, толщина образца становятся больше, как, например, при высоте разделителя 3 мкм и 5 мкм, толщина образца позволяет более чем одному RBC находиться между двумя пластинами в местоположении пластин, что приводит к перекрыванию RBC и исчезновению четко выраженных границ каждого RBC; и позволяет RBC вращаться между двумя пластинами и вращаться параллельно местоположению поверхности пластины, что приводит к некруглой форме на изображении вида сверху RBC.

Для подсчета количества RBC (например, для измерения концентрации RBC) в нашем эксперименте четко показано, что делая толщину образца до 2 мкм (например, при использовании высоты разделителя 2 мкм), можно подсчитать проще и точнее, чем при толщине образца 3 мкм и 5 мкм.

При высоте разделителя (следовательно, пространстве между двумя пластинами и толщине образца крови) в приблизительно 2 мкм, что приблизительно равно толщине эритроцитов (RBC) (2-2,5 мкм), но намного меньше диаметра RBC (6,2-8,2 мкм), подсчет клеток крови существенно проще и точнее, чем при большей толщине образца.

При конечной толщине образца (2-2,5 мкм) или предпочтительно от 1,9 до 2,2 мкм, которая имела место при закрытой конфигурации CROF, каждый RBC хорошо отделен от других и между разными RBC отсутствовало перекрытие или не образовывались столбики, что позволяло точно подсчитать RBC при получении изображения площади образца.

С другой стороны, наблюдали, что в устройстве для CROF с высотой разделителя 1 мкм большая часть RBC лизировалась, но не WBC или тромбоциты. В данных экспериментах с помощью оптической визуализации сверху CROF (т.е. пластины для CROF практически параллельны плоскости визуализации системы формирования изображений микроскопа или камеры) определяли (а) количество клеток на площади и (b) точный горизонтальный размер площади. Горизонтальный размер устройства для CROF можно определить путем предварительной калибровки. Или горизонтальный размер площади устройства для CROF можно определить во время визуализации, используя горизонтальный размер разделителя в качестве маркера. В данных экспериментах использовали оба варианта.

В эксперименте примера 2 для данных пластин для CROF пространством между двумя пластинами для CROF (следовательно, толщина образца крови) было таким же, как высота разделителя в пределах 5% или лучше. Используя эту информацию о толщине образца вместе с горизонтальными размерами данной площади, определенными с помощью оптической визуализации, определяли объем образца, связанный с данной площадью, который равен площади поперечного сечения образца, умноженной на толщину образца. Зная объем образца и количество клеток в объеме (определяемое путем визуализации), могли определить концентрацию клеток в этом объеме образца.

На фиг. 29b показано (b) соотношение площади эритроцитов (измеренное по 2D-изображению вида сверху) и общей площади в горизонтальной проекции пластины для CROF. Максимальное значение при пространстве между пластинами 2 мкм (т.е. толщине образца), поскольку ниже 2 мкм некоторые RBC лизируются, а выше 2 мкм RBC перекрываются и вращаются, при этом все из них дают меньшую площадь RBC на 2D-изображении.

Один из результатов следующих экспериментов заключается в том, что размер оптимизированного пространства в устройстве для CROF для подсчета клеток крови (RBC и WBC) составляет 1,9 мкм - 2,2 мкм, или от 2 мкм до 2,2 мкм, или от 2 мкм до 2,1 мкм.

Другой экспериментальный вывод заключается в том, что в устройстве для CROF с пространством 1 мкм между двумя пластинами лизируется большая часть RBC, но не лизируются WBC: устройство для CROF

Было обнаружено, что, если размер пространства в устройстве для CROF намного меньше толщины RBC (например, расстояние между пластинами 1 мкм), то RBC лизируются. WBC более эластичен, большинство из них по прежнему могут наблюдаться и, возможно, не быть лизированы.

Е3.5 Подсчет RBC (эритроцитов)

В одном варианте осуществления RBC подсчитывали в светлопольном режиме без какого-либо фильтра. Для получения изображений использовали коэффициенты увеличения 4х, 10х, 20х или 40х. Поскольку известно, что как размер пространства X-пластины (t), так и поле зрения (А) для каждого увеличения (разделители и их периоды использовали в качестве масштабных меток (т.е. отметок), рассчитывали концентрацию RBC в образце крови. Например, для подсчета N RBC в одном поле зрения концентрация RBC (С) в крови составляла С=N/t/A. Данный метод расчета являлся одинаковым для измерений концентрации WBC, PLT.

Е2.6. Подсчет WBC и тромбоцитов

Каждый лейкоцит (WBC), также называемый белой клеткой крови, имеет типичный диаметр диска в примерно 10-15 мкм. Типичный тромбоцит (PLT) имеет типичный размер 1-2 мкм. Поскольку WBC и PLT не имеют видимого пигмента сами по себе, они труднее поддаются обнаружению при обычной микроскопии чем RBC. Чтобы сделать WBC и PTL более заметными при подсчете, в одном варианте осуществления их окрашивают красителем акридиновый оранжевый (АО).

Акридиновый оранжевый является стабильным красителем, который имеет естественное сродство к нуклеиновым кислотам. При связывании с ДНК АО интеркалирует с ДНК в виде мономера и дает интенсивную зеленую флуоресценцию при возбуждении синим светом (возбуждение 470 нм, испускание в зеленой области спектра 525 нм для WBC). При связывании с РНК и белками он образует электростатический комплекс в полимерной форме, который дает красную флуоресценцию при возбуждении синим светом (возбуждение 470 нм, испускание в красной области спектра 685 нм для WBC, PLT). У RBC отсутствуют нуклеиновые кислоты, поэтому их нельзя окрасить. WBC имеют ядра, как ДНК, так и РНК, поэтому они интенсивно окрашиваются. PLT имеют небольшое количество РНК, поэтому они слабо окрашиваются. См. фиг. 33.

WBC подсчитывали в режиме флуоресценции с помощью фильтра возбуждения 470±20 нм, а фильтр испускания представляет собой 500 нм высокочастотный фильтр, и выбирали коэффициенты увеличения 4х, 10х, 20х или 40х для получения изображений. Путем использования этих вариантов осуществления надлежащим образом подсчитывали WBC и PLT.

Е2.7 Измерения различных WBC

WBC можно разделить на пять основных подклассов: нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, лимфоциты и моноциты; или иногда три основных класса: гранулоциты, лимфоциты и моноциты. Количество каждого класса в крови субъекта может иметь клиническое значение, поскольку различные инфекции вирусами, бактериями или грибами, или аллергия, могут изменять количество определенного подкласса WBC.

WBC содержат ядро, что отличает их от безъядерных эритроцитов и тромбоцитов. Кроме того, разные подклассы WBC характеризуются различным соотношением ДНК/РНК и белков, их можно дифференцировать в соответствии с этим, используя подходящий краситель для окрашивания ДНК и РНК по отдельности.

Например, краситель АО интеркалирует с ДНК в виде мономера и дает интенсивную зеленую флуоресценцию при возбуждении синим светом (возбуждение 470 нм, испускание в зеленой области спектра 525 нм для WBC). При связывании с РНК и белками он образует электростатический комплекс в полимерной форме, который дает красную флуоресценцию при возбуждении синим светом (возбуждение 470 нм, испускание в красной области спектра 685 нм для WBC, PLT). Таким образом, различные WBC будут иметь разное соотношение цветов R/G (испускание в красной области спектра против испускания в зеленой области спектра) после окрашивания красителем АО.

С помощью красителя АО можно потенциально дифференцировать 3 вида WBC:

гранулоциты (нейтрофилы, эозинофилы, базофилы), лимфоциты, моноциты. Кроме того, можно непосредственно использовать встроенный RGB-фильтр камеры (или iPphone), чтобы отличать испускание в зеленой и красной области спектра из канала G и канала R одной полученной фотографии. Таким образом, не нужно использовать 2 отдельных набора фильтров (как полосовой фильтр 525 нм и 685 нм).

Как показано на фиг. 34, всего подсчитано и отображено 594 WBC. Можно отчетливо заметить, что клетки группируются в три различные участки (заштрихованные области, представленные в качестве ориентиров для глаза), соответствующие трем основным субпопуляциям лейкоцитов. Процент каждой субпопуляции приведен в таблице и хорошо соответствует нормальным значениям человеческой крови.

Е2.8. Измерения гематокрита

Гематокрит (Ht или НСТ), также известный как объем осажденных клеток (PCV) или объемная доля красных кровяных телец (EVF), представляет собой объемное содержание в процентах (%) эритроцитов в крови. При настройке Х-СВС использовали размер пространства 2 мкм, в котором каждый RBC будет плотно уложен с помощью подложки и Х-пластины. Таким образом, НСТ в этом случае равен объему RBC в общем объеме крови.

Е2.10. Высушенный краситель АО быстро окрашивает WBC

WBC окрашивали сухим красителем АО через 30 с, 10 мин., 30 мин., 90 мин. В способе CROF с высушенным красителем АО на поверхности пластины краситель АО может полностью окрашивать WBC менее чем за 1 мин. и не будет влиять на другие или чрезмерно окрашивать другую область после продолжительного времени. Кроме того, поскольку связанный АО флуоресцирует более интенсивно, чем несвязанный краситель, стадия промывки не требуется.

Е2.11. Другие не флуоресцентные красители для окрашивания WBC

Краситель, не являющийся флуоресцентным, для окрашивания WBC может упростить процедуру подсчета WBC. Кристаллвиолет или генцианвиолет (также известный как метилвиолет 10В или гексаметилпарарозанилинхлорид) представляет собой триарилметановый краситель, который можно использовать для окрашивания ядра WBC. Подобно красителю АО, сушили 30 мкл при 1 мг/мл красителя акридинового оранжевого в воде на предметном стекле площадью 1 см² в течение 1 часа. Затем повторяли процесс эксперимента Х-СВС.WBC будут окрашиваться в фиолетовый цвет. Одним из недостатков данного способа является сложность с дифференциацией субпопуляций WBC.

Е2.12. Не требовалось каких-либо антикоагулянтов в анализе крови с помощью CROP

Одно из преимуществ настоящего изобретения заключается в том, что отсутствует необходимость в применении антикоагулянтных реагентов для подсчета, как это наблюдали в ходе эксперимента. В данных экспериментах Х-пластины с расстоянием 2 мкм, 3 мкм и 10 мкм и площадью крови 1 см х 1 см тестировали в устройстве для образца крови CROF. При продолжительности от 0 мин до 80 мин каждые 10 мин проводили фотографирование в 5 типичных точках от центра к краю образца. Все тестируемые образцы не содержали антикоагулянтных реагентов. Было отмечено, что при данных экспериментальных условиях в течение периода наблюдения отсутствовала агглютинация образца крови при закрытой конфигурации. Это связано с тем, что (1) в ходе CROF с пространством ~2 мкм (толщина образца при закрытой конфигурации) происходит разделение клеток крови друг от друга и (2) пластины для CROF защищают большую часть клеток крови от кислорода.

Е2.13. Дополнительные эксперименты по подсчету клеток крови с использованием CROF и iPhone.

В других экспериментах тестировали и валидировали технологию и компактное, простое в использовании устройство, которое позволяет человеку самостоятельно полностью выполнять подсчет клеток крови за менее чем 20 секунд, используя смартфон с объемом образца меньше капли крови (<1 мкл). Все, что требуется от лица, это позволить крошечному количеству (произвольному неизвестному объему) крови из проколотого пальца прикоснуться к карте, закрыть карту и сфотографировать смартфоном.

Одним из аспектов настоящего изобретения является наблюдение того, что путем точной перестройки капли крови в однородный слой крови, который имеет толщину в один эритроцит (~ 2 мкм) и заключен между двумя пластинами, оно предлагает беспрецедентные преимущества в подсчете клеток крови. Преимущества включают следующее: (i) для свежей неразбавленной цельной крови без добавления какого-либо антикоагулянта клетки крови будут хорошо отделяться друг от друга, не коагулироваться и таким образом легко идентифицироваться с помощью визуализации; и (ii) образец характеризуется практически нулевым испарением (в области тестирования) с сохранением постоянной концентрации клеток крови в течение длительного периода времени. Вторая ключевая технология, которую разработали, называется «сжатый регулируемый открытый поток» (CROF), в котором используют карту для CROF (складную, одноразовую, размером с почтовую марку (1 дюйм шириной, толщиной как бумага) пластмассовую пленку, приводимую в действие вручную) для выполнения трансформации крови, измерения толщины (следовательно, объема) образца трансформированной крови и смешивания (при необходимости) предварительно нанесенных сухих реагентов в крови (и выполнения всех функций одним движением и менее чем за 5 секунд). Последние две методики, описанные в данном документе, представляют собой небольшой, размером со спичечный коробок оптический адаптер для визуализации с помощью смартфона, а также программное обеспечение для управления смартфоном и анализа изображений. Способ («подсчет клеток крови с использованием CROF и визуализации» или BCI) с помощью смартфона валидировали по сравнению со стандартным промышленным образцом, коммерческим ручным гемоцитометром, и визуализацией с помощью микроскопа (вместо смартфона). Для каждого способа проводили свыше 42 тестов с использованием двух типов крови (хранимой и свежей от субъекта) и измеряли количество эритроцитов (RBC), лейкоцитов (WBC), тромбоцитов, трех разных видов WBC, гематокрит (НСТ) и средний клеточный объем (MCV). Валидация показывает, что BCI с помощью смартфона имеет такую же точность, или даже лучшую, чем точность коммерчески доступного ручного гемоцитометра (может быть дополнительно улучшен), и такую же ежедневную стабильность, как и коммерчески доступные измерительные приборы. Очевидно, что технология BCI характеризуется широкими и значимыми применениями в визуализации клеток, иммунологических анализах, анализах нуклеиновых кислот, мониторинге личного здоровья и другой биохимической диагностике.

Устройство для BCI содержит три аппаратных компонента: одноразовую, размером с почтовую марку пластмассовую карту CROF (площадью 1 дюйм на 1 дюйм, толщиной как бумага), смартфон и оптический адаптер размером со спичечный коробок (1,5 х 1,5 дюйма х 0,7 дюйма (ДхШхВ)); и программное обеспечение, которое управляет смартфоном, создает пользовательский интерфейс и анализирует клетки крови. Все они (за исключением смартфона) сконструированы и разработаны авторами данной заявки. Оптический адаптер («адаптер»), который содержит линзы, зеркала и фильтры; и монтируется на смартфоне, делает вспышку и камеру смартфона источником света и системой формирования изображений для тестирования соответственно. Оптический адаптер также имеет гнездо для перемещения карты CROF-Card в правильное положение в передней части камеры (фиг. 30). В текущих наших тестах использовали iPhone-6.

При анализе крови с использованием BCI (фиг. 30) индивидуум сперва прокалывает свой палец, затем наносит небольшое количество (произвольный неизвестный объем) крови (например, менее одной капли (<1 мкл) непосредственно с пальца на карту CROF, прикоснувшись к карте, закрывает карту, вставляет карту в оптический адаптер и, наконец, фотографирует карту с использованием смартфона. По полученным снимкам программное обеспечение выполняет анализ и выдает результат по количеству клеток крови и другим параметрам. Общее время от нанесения крови на карту CROF до отображения результатов анализа крови на смартфоне составляет от ~12 до 19 секунд, где 1-2 с - для нанесения крови на карту CROF-Card, 3-5 с - для закрывания карты, ~2-4 с - для того, чтобы вставить карту в адаптер, ~3-5 с - для съемки и 3 с - для завершения анализа, чтобы показать результаты подсчета клеток крови.

Одним из ключевых новшеств BCI является разработанная авторами настоящего изобретения технология CROF-Card [ссылка]. Карта CROF состоит из двух кусочков тонкой пластмассы, каждый площадью приблизительно 1 дюйм х 1 дюйм, толщиной с бумагу, скрепленный на шарнирах с другой частью с одного края (фиг. 30) (обратите внимание, что шарнир не является необходимым, но обеспечивает удобство). Карта CROF предлагает следующие ключевые функции при обработке образца крови: (i) быстрое распределение (например, 1 сек) образца крови из нанесенной формы (например, лужицы диаметром 2 мм и высотой 0,4 мм) на однородную пленку толщиной 2 мкм (~ 1/200 от исходной толщины) по значительной площади (~ -500 мм2) и ограничение двумя пластинами для CROF; (ii) прекращение дальнейшего уменьшения толщины образца после достижения толщины 2 мкм; (iii) поддержание однородной толщины 2 мкм, даже если руки освобождают от сжатия (т.е. самоудерживание, которое обусловлено капиллярными силами между кровью и пластинами); и (iv) предотвращение испарения образца при такой тонкой толщине (т.е. при удерживании двумя пластинами испарение происходит только с края пленки крови, а область тестирования образца характеризуется нулевым испарением за весьма продолжительный период времени). Экспериментально с использованием оптической интерференции (т.е. эффекта резонатора Фабри-Перо из двух внутренних поверхностей карты CROF) обнаружили, что карта CROF от Essenlix может поддерживать однородную толщину 2 мкм с однородностью 5% (т.е. 100 нм) по меньшей мере на протяжении площади 20 мм на 20 мм.

Карта CROF предлагает несколько ключевых и беспрецедентных преимуществ для подсчета клеток крови над существующими способами. Наиболее существенное наблюдение авторов настоящего изобретения заключается в том, что когда капля крови трансформируется в однородный слой крови, который имеет толщину только в один эритроцит (~2 мкм) и ограничен между двумя пластинами, (i) то клетки крови в свежей неразбавленной цельной крови без какого-либо антикоагулянта хорошо отделены друг от друга, имеют нулевую коагуляцию, характеризуются гораздо меньшей подвижностью клеток крови и легко идентифицируются путем визуализации; и (ii) образец крови имеет почти нулевое испарение в области тестирования, следовательно, сохраняет концентрацию клеток крови в этой области постоянной в течение длительного периода времени.

Второе ключевое преимущество карты CROF заключается в «автоматическом» измерении объема образца крови (поскольку определяется толщина образца). Третье преимущество заключается в том, что используют наименьшее количество образца крови (поскольку отсутствует жидкостный вход или выход, или какие-либо каналы и/или устройства для переноса образца). Другие преимущества заключаются в том, что: (i) можно смешивать сухой реагент на поверхности карты CROF с образцом в течение нескольких секунд; (ii) карта проста и быстра и приводится в действие вручную, и (iii) она является удобной и недорогой.

Хотя способ анализа крови путем визуализации образца крови, заключенного между двумя пластинами, имеет более чем 150-летнюю историю и является основой коммерчески доступного ручного гемоцитометра, по имеющимся сведениям никто не проводил подсчет клеток крови, используя ограниченный пластинами слой крови однородной толщины, которая равна толщине лишь одного эритроцита, и никто не исследовал поведение клеток крови в однородном ограниченном образце крови, который имеет толщину, точно соответствующую одному эритроциту или примерно равную ей. В предыдущих подходах, основанных на визуализации, поскольку пространство ограничения образца крови больше толщины эритроцитов, образец крови должен быть разведен (часто используется антикоагулянт), чтобы избежать перекрывания (следовательно, ошибочного подсчета) эритроцитов. В нашем исследовании наблюдали необычный характер поведения клеток крови в образце цельной крови, который заключен между двумя пластинами и характеризуется однородной толщиной образца только в один эритроцит или незначительно больше или меньше этой толщины. Характер поведения клеток крови резко отличается в зависимости от ограничивающего промежутка карты CROF-Card (т.е. толщины образца).

Теперь рассмотрим цельную кровь, которая неразбавлена, свежеотобрана из проколотого пальца на карту CROF без добавления какого-либо антикоагулянта (фиг. 31.а). Для ограничивающего промежутка в пределах 2 мкм изображение, полученное с помощью оптической микроскопии, показывает, что все клетки крови (RBC, WBC, PLT) отделены друг от друга в плоскости образца (т.е. не перекрываются), и что каждый RBC имеет четко определенную границу, окружающую каждую клетку с затененным центром, и каждая граница не пересекает границу другого RBC. Кроме того, в ходе визуализации практически не наблюдали перемещений клеток. Одно из объяснений такого поведения заключается в том, что, поскольку ограничивающее пространство в 2 мкм незначительно меньше средней толщины эритроцита, то каждый РВС слегка зажимается ограничивающими пластинами, не оставляя места для других клеток, чтобы перекрываться, и не давая возможности двигаться.

Очевидно, что поведение клеток при промежутке 2 мкм дает оптимальное условие для подсчета клеток путем визуализации.

Однако при промежутке 2,2 мкм некоторые RBC начинают перекрываться с другими RBC, но при этом отсутствует наблюдаемое перекрывание тромбоцитов. Возможная причина заключается в недостатке места для перекрывания тромбоцитов с PLT. Для промежутков в 2,6 мкм и 3 мкм наблюдали больше перекрытий RBC, причем визуально различимыми становятся тройные перекрытия RBC, а тромбоциты перекрываются с RBC. Эти перекрытия увеличиваются с увеличением промежутка. Подсчет клеток крови путем визуализации возможен в промежутке 2,2, 2,6 и 3 мкм, но точность ухудшается с увеличением промежутка. При промежутке 5 мкм и 10 мкм перекрывается существенное количество клеток (например, коагулированы), видимы столбики из RBC и многие RBC имеют узкую эллиптическую форму, которая обусловлена вращением RBC относительно плоскости визуализации (большой промежуток делает вращение возможным). Ясно, что исключительно сложно, если это вообще возможно, точно подсчитать клетки крови в этих промежутках.

Теперь рассмотрим сохраненную неразбавленную цельную кровь с антикоагулянтом (отобрана у субъектов коммерческой службой (Bioreclamation Inc.)). Исследование авторов настоящего изобретения показало, что (фиг. 31.b) она характеризуется другой реакцией на ограничивающий промежуток карты CROF по сравнению со свежей неразбавленной кровью без антикоагулянта. Для промежутка в 2 мкм характер поведения клеток крови в сохраненной крови такой же, как и для свежей крови без антикоагулянта. Но для более крупных промежутков сохраненная кровь с антикоагулянтом характеризуется другой реакцией в 2D-изображении по сравнению со свежей кровью без антикоагулянта. При использовании антикоагулянта и при ограничивающем промежутке более 2 мкм, хотя RBC и не коагулируют вместе, они могут (а) перекрываться друг над другом и (b) вращаться в узкую эллипсоидную форму при 2D-визуализации вида сверху, причем все это значительно ухудшает точность подсчета клеток.

При подсчете клеток крови на смартфоне BCI, представленном в данном документе, ограничивающий промежуток для карты CROF (следовательно, толщину образца) устанавливали на 2 мкм с точностью лучше 5%. Объем образца определяли по толщине образца, заданной картой CROF-Card, и изображениям подходящей площади, полученными с помощью смартфона. Концентрации клеток крови (RBC, WBC, PLT) определяли путем подсчета клеток на подходящей площади с изображения, полученного с помощью смартфона, с последующим делением на подходящий объем. Средний клеточный объем (MCV) RBC определяли путем измерения площади каждого RBC на 2D-изображении вида сверху и среднего общего объема, связанного с каждым RBC, при использовании предварительно установленной толщины образца 2 мкм. Гематокрит определяли по произведению MCV и концентрации RBC.

Для подсчета трех различных видов WBC (гранудоциты, лимфоциты, моноциты) окрашивали образец крови, помещая высушенный слой красителя акридиновый оранжевый (АО) на одну из поверхностей карты CROF. Поскольку АО окрашивает нуклеиновые кислоты и окрашивает ДНК и РНК по-разному, окрашиваются только WBC и PLT, и они окрашиваются по-разному в зависимости от количества и соотношения ДНК и РНК в каждой клетке, тогда как RBC не окрашиваются. Отличие в окрашивании дает различные длины волн флуоресценции (например, испускание в зеленой области спектра 525 нм для окрашенной ДНК и испускание в красной области спектра 685 нм для окрашенной РНК) и интенсивность, что позволяет идентифицировать каждый из трех разных WBC и PLT. Обнаружили, что при использовании карты CROF-Card WBC окрашивались предварительно нанесенным слоем красителя АО менее чем за 5 секунд из-за малой толщины образца и таким образом короткого времени диффузии красителя. Окрашивание WBC красителем и его флуоресценция представляет, помимо светлопольной микроскопии, еще один способ измерения WBC, и его использовали в валидации ниже.

Оптический адаптер обеспечивает эффективное поле зрения 0,84 мм х 0,63 мм для RBC, 2,8 мм х 2,1 мм для WBC и радиус 0,2 мм для PLT. В настоящее время оптический адаптер должен перемещаться в слайдере для раздельного приема RBC и WBC, добавляя дополнительное время работы ~5 сек. В следующем поколении будет разработан комбинированный оптический адаптер без использования слайдера. Все программное обеспечение для анализа изображений, пользовательского интерфейса и управления iPhone построили путем написания собственных кодов и использования некоторых открытых исходных кодов. В данном документе весь анализ клеток крови, представленный в данном документе, проводили с использованием собственного программного обеспечения менее чем за 2 секунды от анализа изображения до подсчета клеток крови, за исключением анализа PLT, длительность которого будет менее 5 секунд в адаптере следующего поколения.

Чтобы осуществить валидацию BCI со смартфоном, сравнивали его со следующими четырьмя различными референтными способами (RM). В RM-1 использовали микроскоп высокого разрешения (Nikon Diaphot Inverted Microscope) и камеру DSLR (Nikon D5100) вместо iPhone и оптического адаптера для считывания карты CROF для той же области считывания, что и в текущем BCI iPhone. RM-2 представляет собой то же самое, что и RM-1, за исключением того, что область считывания на карте CROF расширена до массива 3 х 3 с интервалом 8 мм (всего 9 областей считывания), равномерно распределенных по площади CROF-Card 16 мм на 16 мм. В RM-3 использовали коммерчески доступный ручной гемоцитометр (приобретали у Sigma-Aldrich, Z3 59629) а также визуализацию с помощью того же микроскопа и камеры, что и в RM 1 и 2, но с областью визуализации 3 мм на 3 мм. Ручной гемоцитометр имеет две камеры, каждая 3 мм на 3 мм, в области измерений и промежуток 100 мкм). Это требует разбавления крови в 100 раз и лизирования RBC для измерения PLT. В RM-4 использовали коммерческий доступный прибор для подсчета клеток крови РоС (изготовленный одной из крупнейших компаний-производителей инструментов для анализа крови); в нем задействован проточный цитометр размером ~1 кубический фут, и весом ~20 фунтов, и стоимостью ~20000 долларов. В прибор для РоС требуется кровь в объеме по меньшей мере 10 мл (более 10 капель), разведение крови, три жидких реагента (для лизирования, разведения и очистки), время проведения анализа 5 минут и ежедневно 30 минут для калибровки. Сравнение позволяет нам оценивать каждую отдельную функцию, а также комбинированные эффекты карты CROF-Card, визуализацию с помощью оптического адаптера и смартфона, а также визуализацию с помощью микроскопа в отношении их эффективности в подсчете клеток крови.

При валидации использовали два типа крови: (i) сохраненную кровь, приобретенную у коммерческого поставщика (Boreclamation.inc), которая была смешана с антикоагулянтом (EDTA); и (ii) свежую кровь, которая представляла собой кровь, отобрунную из проколотого пальца двух добровольцев (во время каждого теста свежесобранную из проколотого пальца кровь немедленно и непосредственно наносили из пальца на (а) карту CROF для тестирования CROF и в (b) пробирку, покрытую EDTA, для анализа с использованием коммерческого инструмента в РоС и ручного гемоцитометра. Всего тестировали 42 образца для каждого способа в течение нескольких дней.

В общей сложности тестировали 24 образца в 4 разных дня (3, 3, 3 и 15 образцов), и образцы крови были из той же партии для тестов в первые три дня, но из другой партии в последний день. В свежих образцах крови в общей сложности 18 образцов тестировали в 3 разных дня (6, 6 и 6 образцов).

Результаты тестов выявили ряд важных фактов. (1) Для данного образца крови среднесуточное значение количества клеток крови для BCI со смартфоном (р-BCI) и всех четырех реферетных способов согласуется друг с другом в пределах своего перспективного суточного CV (коэффициент вариаций, соотношение стандартного отклонения и среднего).

(2) Сравнение р-BCI с RM-1 показало, что для данного образца CROF подсчет клеток крови с использованием iPhone и оптического адаптера, который разработали, обладает такой же точностью (CV), как и при использовании микроскопа с высоким разрешением и камеры DSLR (например, оба имеют CV ~ 12% для RBC) (фиг. 32).

(3) Сравнение RM-1 и RM-2 показало, что визуализация нескольких полей карты для CROF обеспечивает лучшую точность, чем текущая визуализация одного поля. CV для RBC улучшился с ~ 12% до ~ 6%. Возможность просмотра нескольких полей будет реализована в нашем новом поколении BCI со смартфоном для более высокой точности.

(4) Сравнение RM-2 и RM-3 показало, что (i) карта для CROF не только намного проще в использовании, но также обеспечивает точность подсчета клеток, которая является такой же или лучше, чем у коммерчески доступного ручного гемоцитометра при подсчете клеток крови, и, (ii) учитывая факт в (i) и сравнение RM1 и RM2, это приводит к выводу, что мультипольный BCI со смартфоном должен иметь такую же или даже лучшую точность, чем коммерчески доступный ручной гемоцитометр в подсчете клеток крови. Мы также хотели бы отметить, что источником вариабельности, хотя и одинаковой для настоящей карты CROF-Card и ручного гемоцитометра, являются разные причины. Для гемоцитометра вариабельность обеспечивается за счет разведения, лизирования и ручного подсчета. Но для карты CROF существующая вариабельность (~ 7% для RBC) в основном обусловлена вариабельностью толщины образца (~ 5%), которую можно дополнительно улучшить.

(5) В BCI со смартфоном можно идентифицировать каждый из трех различных видов WBC путем окрашивания и измерения величины интенсивности для каждой клетки WBC в зависимости от соотношения интенсивности флуоресценции зеленого цвета и красного цвета. Стандартное отклонение аналогично стандартному отклонению для других измерений клеток крови. Это связано с тем, что каждый подтип лейкоцитов имеет особое соотношение цветов флуоресценции (в зависимости от относительного количества и соотношения РНК (красная флуоресценция) и ДНК (зеленая флуоресценция); гранулоцит характеризуется большим количеством РНК и гранул (таким образом, высокой красной флуоресценцией и слабой зеленой флуоресценцией), лимфоцит характеризуется низким количеством РНК и большим количеством ДНК (таким образом, слабой красной, но сильной зеленой флуоресценцией), а моноцит характеризуется соотношением красной и зеленой между гранулоцитом и лимфоцитом.

(6) В пределах статистической значимости межсуточная (то есть ежедневная) вариабельность для всех пяти тестируемых способов, по сути, одинакова, указывая на то, что smart-BCI очень стабилен в течение периода нескольких дней, на протяжении которого проводили тесты.

И наконец, (7) при использовании нашего существующего оборудования и программного обеспечения для оптической визуализации подсчет клеток крови путем визуализации еще не столь точен, как у прибора, представляющего собой коммерчески доступный проточный цитометр РоС-образца (например, ~7% против 1% для RBC).

Однако нужно признать два важных факта: (i) с нынешней точностью уже продемонстрированный в данном документе р-BCI имеет важное значение в мониторинге здоровья и клинической ценности в отдаленной области или в развивающихся странах, и (ii) точность р-BCI можно дополнительно улучшить с получением лучшей точности. Несомненно, технология BCI характеризуется широкими и значимыми применениями в визуализации клеток, иммунологических анализах, анализах нуклеиновых кислот, мониторинге личного здоровья и другой биохимической дигностике.

Определенные аспекты настоящего изобретения были описаны в следующих документах, и все эти документы включены посредством ссылки для всех целей:

заявка на патент США с порядковым №13/838600, поданная 15 марта 2013 года (NSNR-003), которая испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США с порядковым №61/622226, поданной 10 апреля 2012 года, и является продолжением части заявки на патент США с порядковым №13/699270, поданной 13 июня 2013 года, которая является § 371, подаваемым в US 2011/037455, поданной 20 мая 2011 года, и испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США с порядковым №61/347178, поданной 21 мая 2010 года;

заявка на патент США с порядковым №13/699270, поданная 13 июня 2013 года (NSNR-001), которая является § 371, подаваемым в международной заявке с порядковым № US 2011/037455, поданной 20 мая 2011 года, которая испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США с порядковым №61/347178, поданной 21 мая 2010 года; и

предварительной заявки на патент США с порядковым №61/801424, поданной 3/15/2013 (NSNR-004PRV), предварительной заявки с порядковым №61/801096, поданной 3/15/2013 (NSNR-005PRV), предварительной заявки с порядковым №61/800915, поданной 3/15/2013 (NSNR-006PRV), предварительной заявки с порядковым №61/793092, поданной 3/15/2013 (NSNR-008PRV), предварительной заявки с порядковым №61/801933, поданной 3/15/2013 (NSNR-009PRV), предварительной заявки с порядковым №61/794317, поданной 3/15/2013 (NSNR-010PRV), предварительной заявки с порядковым №61/802020, поданной 3/15/2013 (NSNR-011PRV) и предварительной заявки с порядковым №61/802223, поданной 3/15/2013 (NSNR-012PRV).

Другие примеры объекта изобретения в соответствии с настоящим изобретением описаны в следующих пунктах.

Используемые в данном документе выражения «адаптированный» и «выполненный с возможностью» означают, что элемент, компонент или другой объект сконструирован и/или предназначен для выполнения определенной функции. Таким образом, применение выражений «адаптировано» и «выполнено с возможностью» не должно истолковываться как означающее, что определенный элемент, компонент или другой объект просто «способен» к выполнению определенной функции, но и также, что элемент, компонент и/или другой объект специально выбран, создан, реализован, использован, запрограммирован и/или предназначен для выполнения данной функции. Кроме того, в объеме настоящего раскрытия элементы, компоненты и/или другие перечисленные объекты, которые перечислены как адаптированные для выполнения конкретной функции, могут дополнительно или альтернативно описываться как выполненные с возможностью осуществления этой функции, и наоборот. Аналогичным образом объект, который перечислен как выполненный с возможностью осуществления конкретной функции, может быть дополнительно или альтернативно описан как выполняющий эту функцию.

Используемая в данном документе фраза «например», фраза «в качестве примера» и/или просто термины «пример» и «иллюстративный» при использовании со ссылкой на один или более компонентов, признаков, деталей, структур, вариантов осуществления и/или способов в соответствии с настоящим изобретением, предназначены для того, чтобы сообщить, что описанный компонент, признак, деталь, структура, вариант осуществления и/или способ являются иллюстративным, не исключающим примером компонентов, признаков, деталей, структур, вариантов осуществления и/или способов в соответствии с настоящим изобретением. Таким образом, описанный компонент, признак, деталь, структура, вариант осуществления и/или способ не предназначены для ограничения, необходимости или исключительного/исчерпывающего; и при этом другие компоненты, признаки, детали, структуры, варианты осуществления и/или способы, включая структурно и/или функционально похожие и/или эквивалентные компоненты, признаки, детали, структуры, варианты осуществления и/или способы, также входят в объем настоящего изобретения.

Используемые в данном документе фразы «по меньшей мере один из» и «один или несколько из» в отношении списка из более чем одного объекта означают любой один или несколько объектов в списке объектов и не ограничены по меньшей мере одним из каждого объекта и каждым объектом, конкретно указанным в списке объектов. Например, «по меньшей мере один из А и В» (или, что является эквивалентом, «по меньшей мере один из А или В» или, что является эквивалентом, «по меньшей мере один из А и/или В») может относиться только к А, только к В или к комбинации А и В.

Используемая в данном документе комбинация союзов «и/или», помещенная между первым объектом и вторым объектом, означает один из (1) первого объекта, (2) второго объекта и (3) первого объекта и второго объекта. Несколько объектов, перечисленных с использованием «и/или», должны толковаться таким же образом, т.е. «один или более» объектов, объединенных таким образом. Другой объект может необязательно присутствовать, помимо объекта, конкретно указанного в предложении с использованием «и/или», независимо от того, связаны они или не связаны со специально указанным объектом. Таким образом, в качестве неограничивающего примера ссылка на «А и/или В» при использовании в сочетании с неограничивающим выражением, например «содержащий», может относиться в некоторых вариантах осуществления только к А (необязательно включая объект, отличный от В); в определенных вариантах осуществления только к В (необязательно включая объект, отличный от А); в других определенных вариантах осуществления как для А, так и для В (необязательно включая другой объект). Эти объекты могут ссылаться на элементы, действия, структуры, стадии, технологические процессы, значения и им подобные

В том случае, если какие-либо патенты, заявки на патенты или другие ссылки включены в данный документ посредством ссылки и (1) определяют термин таким образом, который несовместим и/или (2) иным образом противоречат или невключенной части настоящего раскрытия или любым другим включенным ссылкам, то невключенную часть настоящего изобретения следует контролировать, а термин или включенное раскрытие в нем следует регулировать только в отношении ссылки, в которой этот термин определен и/или включенное раскрытие исходно присутствовало.

Считается, что в следующих пунктах формулы изобретения конкретно указаны определенные комбинации и подкомбинации, которые направлены на одно из раскрытых изобретений, и они являются новыми и не очевидными. Изобретения, воплощенные в других комбинациях и подкомбинациях признаков, функций, элементов и/или свойств, могут быть заявлены путем внесения изменений в формулу настоящего изобретения или представления новых пунктов формулы изобретения в данной или родственной заявке. Такие измененные или новые пункты формулы изобретения, независимо от того, направлены ли они на другое изобретение или направлены на одно и то же изобретение, независимо от того, являются ли они отличающимися, более широкими, более узкими или равными по объему исходной формуле изобретения, также считаются включенными в объект раскрытия настоящих изобретений.

Группа изобретений относится к области отбора образцов, обнаружения, проведения анализов при биохимических исследованиях и вариантам их применения. Представлено устройство для анализа аналита в образце, содержащее первую пластину и вторую пластину, перемещаемые относительно друг друга в разные конфигурации. При этом одна или обе пластины являются гибкими, каждая из пластин имеет на своей соответствующей поверхности область контакта с образцом, содержащим аналит. Пластины содержат разделители, которые закреплены на соответствующей пластине, при этом разделители имеют форму столбиков, плоскую верхнюю поверхность, заданную одинаковую высоту и заданное постоянное расстояние между разделителями. При этом по меньшей мере один из разделителей расположен внутри области контакта с образцом. Четвертая степень расстояния между разделителями (ISD), деленная на толщину (h) гибкой пластины и модуль Юнга (E) гибкой пластины, ISD⁴/(hE), равна или меньше 5х10⁶ мкм³/ГПа; а толщина гибкой пластины, умноженная на модуль Юнга гибкой пластины, составляет от 60 до 750 ГПа-мкм. Одна из конфигураций представляет собой открытую конфигурацию, в которой две пластины отделены друг от друга, пространство между пластинами не регулируется разделителями, а образец нанесен на одну или обе пластины. Другая из конфигураций представляет собой закрытую конфигурацию, которая конфигурируется после нанесения образца в открытой конфигурации. При этом по меньшей мере часть образца сжата двумя пластинами в слой равномерной толщины и является неподвижной по отношению к пластинам. Равномерная толщина слоя ограничена внутренними поверхностями двух пластин и регулируется пластинами и разделителями и имеет среднюю толщину, равную или меньшую чем 200 мкм. Также представлены система для ускоренного анализа образца с применением устройства мобильной связи, способ ускоренного анализа аналита в образце, способ ускоренного анализа аналита в образце с применением устройства мобильной связи и способ анализа образца. Достигается упрощение, ускорение и повышение надежности анализа при высокой чувствительности. 5 н. и 149 з.п. формулы, 2 табл., 34 ил.

1. Устройство для анализа аналита в образце, содержащее:

первую пластину и вторую пластину, причем:

i. пластины являются перемещаемыми относительно друг друга в разные конфигурации;

ii. одна или обе пластины являются гибкими;

iii. каждая из пластин имеет на своей соответствующей поверхности область контакта с образцом для осуществления контакта с образцом, содержащим аналит;

iv. одна или обе пластины содержат разделители, которые закреплены на соответствующей пластине, при этом разделители имеют форму столбиков, по существу плоскую верхнюю поверхность, заданную по существу одинаковую высоту и заданное постоянное расстояние между разделителями, при этом по меньшей мере один из разделителей расположен внутри области контакта с образцом;

v. четвертая степень расстояния между разделителями (ISD), деленная на толщину (h) гибкой пластины и модуль Юнга (E) гибкой пластины, ISD⁴/(hE), равна или меньше 5х10⁶ мкм³/ГПа; и

vi. толщина гибкой пластины, умноженная на модуль Юнга гибкой пластины, составляет от 60 до 750 ГПа-мкм,

при этом одна из конфигураций представляет собой открытую конфигурацию, в которой две пластины отделены друг от друга, пространство между пластинами не регулируется разделителями, а образец нанесен на одну или обе пластины;

другая из конфигураций представляет собой закрытую конфигурацию, которая конфигурируется после нанесения образца в открытой конфигурации; и в закрытой конфигурации по меньшей мере часть образца сжата двумя пластинами в слой по существу равномерной толщины и является по существу неподвижной по отношению к пластинам, при этом указанная по существу равномерная толщина слоя ограничена внутренними поверхностями двух пластин и регулируется пластинами и разделителями, и имеет среднюю толщину, равную или меньшую, чем 200 мкм.

2. Устройство по п. 1, которое дополнительно содержит детектор, который выявляет аналит.

3. Устройство по п. 1, которое дополнительно имеет на одной или обеих пластинах сухой участок связывания, имеющий заданную площадь, при этом сухой участок связывания связывает и иммобилизирует аналит в образце.

4. Устройство по п. 1, которое дополнительно содержит на одной или обеих пластинах высвобождаемый сухой реагент и материал для регулирования времени высвобождения, который задерживает время, через которое высвобождаемый сухой реагент высвобождается в образец.

5. Устройство по п. 4, в котором материал для регулирования времени высвобождения задерживает время, через которое сухой реагент начинает высвобождаться в образец, по меньшей мере на 3 секунды.

6. Устройство по п. 4, которое дополнительно содержит сухой реагент, нанесенный на одну или обе пластины и в котором реагент содержит окрашивающий (окрашивающие) реагент (реагенты).

7. Устройство по п. 4, которое дополнительно имеет на одной или обеих пластинах один или более сухих участков связывания и/или один или более участков реагента.

8. Устройство по п. 1, которое дополнительно содержит сухой реагент, нанесенный на одну или обе пластины.

9. Устройство по п. 1, в котором отношение расстояния между разделителями к средней ширине разделителей равно или более 2, а фактор заполнения разделителями, умноженный на модуль Юнга разделителей, равен или больше 2 МПа.

10. Устройство по п. 1, в котором аналит окрашен.

11. Устройство по п. 1, в котором у разделителей, регулирующих слой равномерной толщины, произведение модуля Юнга разделителей и фактора заполнения разделителями равно или больше 10 МПа, при этом фактор заполнения представляет собой отношение площади контакта разделителей к общей площади пластины.

12. Устройство по п. 1, в котором средняя толщина указанного слоя равномерной толщины составляет от 1,8 до 2,6 мкм и образец представляет собой цельную кровь без разведения другой жидкостью.

13. Устройство по п. 1, которое дополнительно содержит сухой реагент, нанесенный на одну или обе пластины и в котором реагент содержит антикоагулянт.

14. Устройство по п. 1, в котором для гибкой пластины четвертая степень расстояния между разделителями (ISD), деленная на толщину (h) гибкой пластины и модуль Юнга (E) гибкой пластины, ISD⁴/(hE), равна или меньше 10⁵ мкм³/ГПа.

15. Устройство по п. 1, в котором одна или обе пластины содержат метку местоположения либо на поверхности, либо внутри пластины, предоставляющую информацию о местоположении на пластине.

16. Устройство по п. 1, в котором одна или обе пластины содержат масштабную метку либо на поверхности, либо внутри пластины, предоставляющую информацию о размере структуры образца и/или пластины в горизонтальной проекции.

17. Устройство по п. 1, в котором одна или обе пластины содержат метку визуализации либо на поверхности, либо внутри пластины, что облегчает визуализацию образца.

18. Устройство по п. 1, в котором разделители функционируют в качестве метки местоположения, масштабной метки, метки визуализации или любой их комбинации.

19. Устройство по п. 1, в котором средняя толщина слоя равномерной толщины находится в диапазоне от 2 до 5 мкм.

20. Устройство по п. 1, в котором средняя толщина слоя равномерной толщины находится в диапазоне от 5 до 10 мкм.

21. Устройство по п. 1, в котором средняя толщина слоя равномерной толщины находится в диапазоне от 10 до 40 мкм.

22. Устройство по п. 1, в котором средняя толщина слоя равномерной толщины составляет 30 мкм.

23. Устройство по п. 1, в котором средняя толщина слоя равномерной толщины составляет 100 мкм или менее.

24. Устройство по п. 1, в котором средняя толщина слоя равномерной толщины равна минимальному размеру аналита в образце.

25. Устройство по п. 1, в котором расстояние между разделителями находится в диапазоне от 7 до 50 мкм.

26. Устройство по п. 1, в котором расстояние между разделителями находится в диапазоне от 50 до 120 мкм.

27. Устройство по п. 1, в котором расстояние между разделителями находится в диапазоне от 120 до 200 мкм.

28. Устройство по п. 1, в котором расстояние между соседними разделителями является по существу одинаковым.

29. Устройство по п. 1, в котором разделители представляют собой столбики с формой поперечного сечения, выбранной из округлой, многоугольной, круговой, квадратной, прямоугольной, овальной, эллиптической формы или любой их комбинации.

30. Устройство по п. 1, в котором разделители имеют форму столбиков и по существу плоскую верхнюю поверхность, при этом для каждого разделителя отношение горизонтального размера разделителя к его высоте составляет по меньшей мере 1.

31. Устройство по п. 1, в котором для каждого разделителя отношение горизонтального размера разделителя к его высоте составляет по меньшей мере 1.

32. Устройство по п. 1, в котором минимальный горизонтальный размер разделителя меньше или по существу равен минимальному размеру аналита в образце.

33. Устройство по п. 1, в котором минимальный горизонтальный размер разделителя находится в диапазоне от 0,5 до 100 мкм.

34. Устройство по п. 1, в котором минимальный горизонтальный размер разделителя находится в диапазоне от 0,5 до 10 мкм.

35. Устройство по п. 1, в котором разделители имеют форму столбика с по существу плоской верхней поверхностью, заданной по существу одинаковой высотой и заданным постоянным расстоянием между разделителями, которое по меньшей мере в 2 раза больше размера аналита, при этом произведение модуля Юнга разделителей и фактора заполнения разделителями равно или больше 2 МПа, при этом фактор заполнения представляет собой отношение площади контакта разделителей к общей площади пластины, и для каждого разделителя отношение горизонтального размера разделителя к его высоте равно по меньшей мере 1, причем четвертая степень расстояния между разделителями (ISD), деленная на толщину (h) и модуль Юнга (E) гибкой пластины (ISD⁴/(hE)) составляет 5х10⁵ мкм³/ГПа или менее.

36. Устройство по п. 1, в котором образец окрашен, причем для окрашивания использован краситель Романовского, краситель Лейшмана, краситель Май-Грюнвальда, краситель Гимза, краситель Дженнера, краситель Райта или любая их комбинация.

37. Устройство по п. 1, в котором образец окрашен, причем окрашивание представляет собой иммуногистохимическое окрашивание.

38. Устройство по п. 1, в котором образец представляет собой биологический образец, образец окружающей среды, химический образец или клинический образец.

39. Устройство по п. 1, в котором разделители имеют форму столбиков, а углы боковых стенок разделителей имеют закругленную форму с радиусом закругления по меньшей мере 1 мкм.

40. Устройство по п. 1, в котором разделители имеют плотность по меньшей мере 100/мм².

41. Устройство по п. 1, в котором разделители имеют плотность по меньшей мере 1000/мм².

42. Устройство по п. 1, в котором по меньшей мере одна из пластин является прозрачной.

43. Устройство по п. 1, в котором по меньшей мере одна из пластин изготовлена из гибкого полимера.

44. Устройство по п. 1, в котором в отношении давления, которое сжимает пластины, разделители являются несжимаемыми и/или, независимо, только одна из пластин является гибкой.

45. Устройство по п. 1, в котором гибкая пластина имеет толщину в диапазоне от 10 до 200 мкм.

46. Устройство по п. 1, в котором указанная по существу равномерная толщина слоя имеет вариацию менее 30%.

47. Устройство по п. 1, в котором указанная по существу равномерная толщина слоя имеет вариацию менее 10%.

48. Устройство по п. 1, в котором указанная по существу равномерная толщина слоя имеет вариацию менее 5%.

49. Устройство по п. 1, в котором первая и вторая пластины соединены и выполнены с возможностью перехода из открытой конфигурации в закрытую конфигурацию путем складывания пластин.

50. Устройство по п. 1, в котором первая и вторая пластины соединены посредством цилиндрического шарнира и выполнены с возможностью перехода из открытой конфигурации в закрытую конфигурацию путем складывания пластин при их повороте вокруг оси цилиндрического шарнира.

51. Устройство по п. 1, в котором первая и вторая пластины соединены цилиндрическим шарниром, который из материла, отличающегося от пластин, и выполнены с возможностью перехода из открытой конфигурации в закрытую конфигурацию путем складывания пластин при их повороте вокруг оси цилиндрического шарнира.

52. Устройство по п. 1, в котором первая и вторая пластины изготовлены из одного куска материала и выполнены с возможностью перехода из открытой конфигурации в закрытую конфигурацию путем складывания пластин.

53. Устройство по п. 1, в котором указанный слой образца равномерной толщины является равномерным на горизонтальной площади, которая составляет по меньшей мере 1 мм².

54. Устройство по п. 1, которое выполнено с возможностью проведения анализа образца за 60 секунд или менее.

55. Устройство по п. 1, в котором в закрытой конфигурации устройство с конечной толщиной образца выполнено с возможностью проведения анализа образца за 60 секунд или менее.

56. Устройство по п. 1, в котором при закрытой конфигурации устройство с конечной толщиной образца выполнено с возможностью проведения анализа образца за 10 секунд или менее.

57. Устройство по п. 3, в котором сухой участок связывания содержит средство для захвата.

58. Устройство по п. 3, в котором сухой участок связывания содержит антитело или нуклеиновую кислоту.

59. Устройство по п. 4, в котором высвобождаемый сухой реагент представляет собой меченый реагент.

60. Устройство по п. 4, в котором высвобождаемый сухой реагент представляет собой флуоресцентно-меченый реагент.

61. Устройство по п. 4, в котором высвобождаемый сухой реагент представляет собой флуоресцентно-меченое антитело.

62. Устройство по п. 4, в котором высвобождаемый сухой реагент представляет собой краситель клеток.

63. Устройство по п. 2, в котором детектор представляет собой оптический детектор, обнаруживающий оптический сигнал.

64. Устройство по п. 1, в котором разделители имеют форму столбиков, а отношение ширины к высоте столбиков больше или равно единице.

65. Устройство по п. 2, в котором детектор представляет собой электрический детектор, который выявляет электрический сигнал.

66. Устройство по п. 1, в котором разделители зафиксированы на пластине путем прямого тиснения пластины или литьевого формования пластины.

67. Устройство по п. 1, в котором материалы пластины и разделителей выбраны из полистирола, PMMA, PC, COC, COP.

68. Система для ускоренного анализа образца с применением устройства мобильной связи, содержащая:

(a) устройство по любому из предшествующих пунктов;

(b) устройство мобильной связи, содержащее:

i. одну или более камер для обнаружения и/или визуализации образца;

ii. электронику, процессоры обработки сигналов, аппаратные средства и программное обеспечение для приема и/или обработки выявленного сигнала и/или изображения образца и для удаленной связи; и

(c) источник света в устройстве мобильной связи или внешний источник света;

при этом детектор в устройстве по любому из предшествующих пунктов обеспечен устройством мобильной связи и выявляет аналит в образце при закрытой конфигурации.

69. Система по п. 68, в которой одна из пластин имеет участок связывания для связывания аналита, по меньшей мере часть слоя образца равномерной толщины расположена на участке связывания и является по существу меньше среднего линейного горизонтального размера участка связывания.

70. Система по п. 68, дополнительно содержащая:

корпус, сконфигурированный для удерживания образца и для монтажа на устройстве мобильной связи.

71. Система по п. 70, в которой корпус содержит оптические средства, способствующие визуализации и/или обработке сигнала от образца устройством мобильной связи, и крепление, выполненное с возможностью удерживания оптических средств на устройстве мобильной связи.

72. Система по п. 71, в которой элемент оптических средств в корпусе выполнен с возможностью перемещения относительно корпуса.

73. Система по п. 68, в которой устройство мобильной связи выполнено с возможностью передачи результатов теста медицинскому специалисту, в медицинское учреждение или в страховую компанию.

74. Система по п. 68, в которой устройство мобильной связи дополнительно выполнено с возможностью передачи информации о тесте и субъекте медицинскому специалисту, в медицинское учреждение или страховую компанию.

75. Система по п. 68, в которой устройство мобильной связи дополнительно выполнено с возможностью передачи информации о тесте в облачную сеть, и в облачной сети осуществляется обработка информации для уточнения результатов теста.

76. Система по п. 68, в которой устройство мобильной связи дополнительно выполнено с возможностью передачи информации о тесте и субъекте в облачную сеть, при этом в облачной сети осуществляется обработка информации для уточнения результатов теста, а уточненные результаты теста отсылаются обратно субъекту.

77. Система по п. 68, в которой устройство мобильной связи выполнено с возможностью приема назначения, диагноза или рекомендации от медицинского специалиста.

78. Система по п. 68, в которой устройство мобильной связи выполнено с возможностью применения аппаратных средств и программного обеспечения для:

(a) съемки изображения образца;

(b) анализа тестируемого местоположения и контрольного местоположения на изображении; и

(c) сравнения значения, полученного в результате анализа тестируемого местоположения, с пороговым значением, которое характеризует ускоренный диагностический тест.

79. Система по п. 68, в которой по меньшей мере одна из пластин имеет участок хранения, в котором хранятся реагенты для анализа.

80. Система по п. 68, в которой по меньшей мере одна из камер считывает сигнал от устройства для сжатого регулируемого открытого потока (CROF).

81. Система по п. 68, в которой устройство мобильной связи осуществляет обмен данными с удаленным местоположением посредством Wi-Fi или сети мобильной сотовой связи.

82. Способ ускоренного анализа аналита в образце, включающий:

(a) получение образца;

(b) получение первой и второй пластин, выполненных с возможностью перемещения относительно друг друга в различные конфигурации, причем каждая пластина по существу плоскую поверхность контакта с образцом, при этом одна или обе пластины являются гибкими, и одна или обе пластины содержат разделители, прочно связанные с соответствующей поверхностью контакта с образцом, при этом разделители имеют:

i. заданную по существу одинаковую высоту;

ii. форму столбика с по существу плоской верхней поверхностью;

iii. заданный постоянный интервал между разделителями, который по меньшей мере в 2 раза больше размера аналита и составляет до 200 мкм;

iv. модуль Юнга разделителей, умноженный на фактор заполнения разделителями, равен или больше 2 МПа; и

(c) нанесение образца на одну или обе пластины, когда пластины находятся в открытой конфигурации, при этом открытая конфигурация представляет собой конфигурацию, в которой обе пластины частично или полностью отделены друг от друга, а расстояние между пластинами не регулируется разделителями;

(d) после этапа (с) сведение двух пластин вместе в закрытую конфигурацию, в которой по меньшей мере часть образца преобразуется в слой по существу равномерной толщины, ограниченный поверхностями контакта пластин с образцом, при этом указанная равномерная толщина слоя регулируется разделителями и пластинами и имеет среднее значение в диапазоне от 1,8 до 3 мкм; и

(e) анализ аналита в указанном слое равномерной толщины при нахождении пластин в закрытой конфигурации;

причем фактор заполнения представляет собой отношение площади контакта разделителей к общей площади пластины,

при этом четвертая степень расстояния между разделителями (ISD), деленная на толщину (h) и модуль Юнга (E) гибкой пластины, ISD⁴/(hE), равна или меньше 5х10⁵ мкм³/ГПа; и толщина гибкой пластины, умноженная на модуль Юнга гибкой пластины, составляет от 60 до 750 ГПа-мкм.

83. Способ ускоренного анализа аналита в образце с использованием устройства мобильной связи, включающий:

(а) нанесение образца на устройство в системе по любому из предшествующих пунктов, относящихся к системе;

(b) анализ аналита в образце, нанесенном на устройство, для получения результата; и

(c) передачу результата с устройства мобильной связи в местоположение, удаленное от устройства мобильной связи.

84. Способ по п. 82 или 83, в котором аналит содержит молекулу, клетки, ткани, вирусы и наночастицы различных форм.

85. Способ по п. 82 или 83, в котором аналит содержит лейкоцит, эритроцит и тромбоциты.

86. Способ по п. 83, в котором проведение анализа включает в себя проведение дифференциального анализа лейкоцитов.

87. Способ по п. 82 или 83, включающий:

анализ результатов в удаленном местоположении с получением проанализированного результата; и

передачу проанализированного результата из удаленного местоположения в устройство мобильной связи.

88. Способ по п. 82 или 83, в котором медицинский специалист проводит анализ в удаленном местоположении.

89. Способ по п. 83, в котором устройство мобильной связи получает назначение, диагноз или рекомендацию от медицинского специалиста, находящегося в удаленном местоположении.

90. Способ по п. 82 или 83, в котором образец представляет собой физиологическую жидкость или выдыхаемый воздух.

91. Способ по п. 90, в котором физиологическая жидкость представляет собой кровь, слюну или мочу.

92. Способ по п. 82 или 83, в котором образец представляет собой цельную кровь без разжижения другой жидкостью.

93. Способ по п. 83, в котором этап проведения анализа включает в себя выявление аналита в образце.

94. Способ по п. 93, в котором аналит представляет собой биомаркер.

95. Способ по п. 93, в котором аналит представляет собой белок, нуклеиновую кислоту, клетку или метаболит.

96. Способ по п. 92, включающий в себя подсчет количества эритроцитов.

97. Способ по п. 92, включающий подсчет количества лейкоцитов.

98. Способ по п. 92, включающий окрашивание клеток в образце и подсчет количества нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов и базофилов.

99. Способ по п. 83, в котором анализ, проводимый на этапе (b), представляет собой анализ связывания или биохимический анализ.

100. Способ анализа образца, включающий:

получение устройства по любому из предшествующих пунктов, относящихся к устройству или системе;

нанесение образца на одну или обе пластины устройства;

перевод пластин в закрытую конфигурацию и приложение внешней силы к по меньшей мере части пластин; и

проведение анализа в слое равномерной толщины, когда пластины находятся в закрытой конфигурации.

101. Способ по п. 100, включающий:

(a) получение образца;

(b) получение первой и второй пластин, выполненных с возможностью перемещения относительно друг друга в различные конфигурации, причем каждая пластина имеет по существу плоскую поверхность контакта с образцом, одна или обе пластины являются гибкими, при этом одна или обе пластины содержат разделители, которые прочно связаны с соответствующей поверхностью контакта с образцом, при этом разделители имеют:

i. заданную по существу одинаковую высоту,

ii. форму столбиков с плоской верхней поверхностью;

iii. отношение ширины к высоте, равное или большее единицы;

iv. заданное постоянное расстояние между разделителями, которое находится в диапазоне от 10 до 200 мкм;

v. произведение модуля Юнга и фактора заполнения разделителей, равное или большее 2 МПа, при этом фактор заполнения представляет собой отношение площади контакта разделителей к общей площади пластины; и

(c) нанесение образца на одну или обе пластины, когда пластины находятся в открытой конфигурации, причем открытая конфигурация представляет собой конфигурацию, в которой обе пластины частично или полностью отделены друг от друга, а пространство между пластинами не регулируется разделителями;

(d) после этапа (c) сжатие образца путем сведения двух пластин вместе в закрытую конфигурацию, в которой по меньшей мере часть образца формирует слой по существу равномерной толщины, ограниченный поверхностями контакта пластин с образцом, при этом указанная равномерная толщина слоя регулируется разделителями и пластинами и имеет среднее значение в диапазоне от 1,8 до 3 мкм; и

(e) анализ аналита в слое равномерной толщины, когда пластины находятся в закрытой конфигурации;

при этом фактор заполнения представляет собой отношение площади контакта разделителей к общей площади пластины.

102. Способ по п. 100, в котором образец является образцом крови и который включает снятие внешней силы после перевода пластин в закрытую конфигурацию; и

визуализацию клеток крови в слое равномерной толщины, когда пластины находятся в закрытой конфигурации; и

подсчет количества клеток крови в области изображения.

103. Способ по п. 101, в котором расстояние между разделителями находится в диапазоне от 20 до 200 мкм.

104. Способ по п. 101, в котором расстояние между разделителями находится в диапазоне от 5 до 20 мкм.

105. Способ по п. 101, в котором произведение фактора заполнения и модуля Юнга разделителей составляет 2 МПа или больше.

106. Способ по п. 100, в котором указанный слой по существу равномерной толщины имеет вариацию поверхности менее 30 нм.

107. Способ по п. 100, в котором образец представляет собой неразжиженную цельную кровь, в которую не добавляли антикоагулянт.

108. Способ по п. 100, в котором этап нанесения осуществляют путем:

i. прокалывания кожи человека с выделением капли крови на кожу, и

ii. приведения капли крови в контакт с одной или обеими пластинами без применения инструмента для переноса крови.

109. Способ по п. 100, в котором этап анализа включает подсчет количества эритроцитов.

110. Способ по п. 100, в котором устройство дополнительно содержит по меньшей мере пару масштабных меток, разнесенных на известное расстояние, в плоскости, параллельной горизонтальной площади.

111. Способ по п. 100, в котором этап анализа включает окрашивание клеток в образце и подсчет количества нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов и базофилов.

112. Способ по п. 102, в котором визуализацию и подсчет количества проводят путем:

i. подсветки клеток в слое равномерной толщины;

ii. получения одного или более изображений клеток с помощью ПЗС- или КМОП-датчика;

iii. идентификации клеток на изображении с применением компьютера; и

iv. подсчета количества клеток в области изображения.

113. Способ по п. 100, в котором внешнюю силу создают рукой человека.

114. Способ по п. 100, дополнительно включающий измерение натрия, калия, хлорида, бикарбоната, мочевины крови, азота, магния, креатинина, сахара, кальция, уровней HDL- и LDL-холестерина и/или уровней триглицеридов в слое равномерной толщины.

115. Способ по п. 100, в котором дополнительно на одну или обе пластины нанесен сухой реагент.

116. Способ по п. 100, в котором указанный слой образца равномерной толщины характеризуется равномерностью толщины до +/-5%.

117. Способ по п. 101, в котором разделители представляют собой столбики с формой поперечного сечения, выбранной из округлой, многоугольной, круговой, квадратной, прямоугольной, овальной, эллиптической формы или любой их комбинации.

118. Способ по п. 101, в котором расстояние между разделителями равно средней толщине эритроцитов (RBC).

119. Способ по п. 100, в котором образцом является образец крови и этап анализа включает визуализацию клеток в крови.

120. Способ по п. 119, в котором клетки представляют собой эритроциты, лейкоциты или тромбоциты.

121. Способ по п. 100, в котором образцом является образец крови и анализ крови включает визуализацию раковых клеток, вирусов или бактерий в крови.

122. Способ по п. 100, в котором анализ образца крови включает выявление белков или нуклеиновых кислот.

123. Способ по п. 100, в котором образцом является образец крови и анализ образца крови включает измерение гемоцитов, включающее в себя определение толщины образца с применением разделителя, определение горизонтальной площади путем визуализации и вычисление площади эритроцитов с помощью двумерного изображения.

124. Способ по п. 100, в котором образцом является образец крови и анализ крови включает измерение концентрации эритроцитов в крови.

125. Способ по п. 100, в котором образцом является образец крови и анализ образца крови включает измерение концентрации лейкоцитов в крови.

126. Способ по п. 100, в котором образцом является образец крови и анализ крови включает измерение концентрации тромбоцитов в крови.

127. Система по п. 68, в которой устройство мобильной связи представляет собой мобильный телефон.

128. Способ по п. 82, в котором образец представляет собой кровь, аналитами являются клетки крови, а равномерная толщина слоя составляет от 1,9 до 2,2 мкм.

129. Способ по п. 101, в котором сжатие производится рукой человека.

130. Способ по п. 101, в котором сжатие производится рукой человека, а толщина образца имеет вариацию 50% или менее.

131. Способ по п. 100, в котором по меньшей мере часть внутренней поверхности одной или обеих пластин является смачиваемой.

132. Способ по п. 100, в котором образец наносят на пластину непосредственно с субъекта без использования устройства для переноса.

133. Способ по п. 101, в котором после деформации образца в закрытой конфигурации образец сохраняет ту же конечную толщину, когда часть или всю сжимающую силу снимают.

134. Способ по п. 101, в котором разделители имеют форму столбиков и по существу одинаковое сечение.

135. Способ по п. 101, в котором разделители имеют форму столбиков, по существу плоскую верхнюю поверхность, заданную по существу одинаковую высоту и заданное постоянное расстояние между разделителями, которое по меньшей мере в два раза больше размера аналита, при этом произведение модуля Юнга разделителей и фактора заполнения разделителей равно или больше 2 МПа, при этом фактор заполнения представляет собой отношение площади контакта разделителей к общей площади пластины, при этом для каждого разделителя отношение горизонтального размера разделителя к его высоте равно по меньшей мере 1.

136. Способ по п. 101, в котором разделители имеют форму столбиков, по существу плоскую верхнюю поверхность, заданную по существу одинаковую высоту и заданное постоянное расстояние между разделителями, которое по меньшей мере в 2 раза больше размера аналита, причем произведение модуля Юнга разделителей и фактора заполнения разделителей равно или больше 2 МПа, при этом фактор заполнения представляет собой отношение площади контакта разделителей к общей площади пластины, при этом для каждого разделителя отношение горизонтального размера разделителя к его высоте равно по меньшей мере 1, при этом образец представляет собой кровь; аналит представляет собой эритроцит, лейкоцит или тромбоциты; и равномерная толщина слоя находится в диапазоне от 1,8 до 2,6 мкм.

137. Способ по п. 101, в котором этап анализа представляет собой выявление белков, пептидов, нуклеиновых кислот, искусственных соединений и неорганических соединений.

138. Способ по любому из пп. 82, 83 и 100, в котором образец, наносимый на одну или обе пластины, имеет неизвестный объем.

139. Способ по любому из пп. 82, 83, 100, в котором образец предназначен для обнаружения, очистки и количественной оценки химического соединения или биомолекулы, которое(ая) соотносится с заболеванием.

140. Способ по любому из пп. 82, 83, 100, в котором указанный образец относится к образцам, которые используются при инфекционных и паразитарных заболеваниях, травмах, сердечно-сосудистых заболеваниях, раке, психических расстройствах, нейропсихиатрических расстройствах, болезнях легких или почечных заболеваниях.

141. Способ по любому из пп. 82, 83, 100, в котором указанный образец относится к образцам, которые используются для обнаружения, очистки и количественной оценки микроорганизма.

142. Способ по любому из пп. 82, 83, 100, в котором указанный образец относится к образцам, которые содержат вирус, грибы и бактерии из окружающей среды.

143. Способ по любому из пп. 82, 83, 100, в котором указанный образец относится к образцам, которые используются для обнаружения и количественной оценки химических соединений или биологических образцов, которые представляют опасность для пищевых продуктов или для национальной безопасности.

144. Способ по любому из пп. 82, 83, 100, в котором указанный образец относится к образцам, которые используются для количественной оценки жизненно важных параметров при медицинском или физиологическом мониторинге.

145. Способ по любому из пп. 82, 83, 100, в котором указанный образец относится к образцам, которые используются для анализа сахара крови, уровня кислорода, общего количества эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов.

146. Способ по любому из пп. 82, 83, 100, в котором указанный образец относится к образцам, которые используются для обнаружения и количественной оценки конкретной ДНК или РНК из биообъектов.

147. Способ по любому из пп. 82, 83, 100, в котором указанный образец относится к образцам, которые используются для определения последовательностей и сравнения генетических последовательностей в ДНК в хромосомах и митохондриях для анализа генома.

148. Способ по любому из пп. 82, 83, 100, в котором указанный образец относится к образцам, которые используются для обнаружения продуктов реакции, во время синтеза или очистки фармацевтических препаратов.

149. Способ по любому из пп. 82, 83, 100, в котором образец представляет собой клетки, ткани, физиологические жидкости и кал.

150. Способ по любому из пп. 82, 83, 100, в котором образец представляет собой образец при определении белка, пептидов, нуклеиновых кислот, искусственных соединений и неорганических соединений.

151. Способ по любому из пп. 82, 83, 100, в котором образец представляет собой образец, имеющий отношение к человеку, ветеринарии, сельскому хозяйству, продуктам питания, окружающей среде и тестированию на наркотики.

152. Способ по любому из пп. 82, 83, 100, в котором образец представляет собой биологический образец, выбираемый из крови, сыворотки крови, плазмы, мазка из носа, носоглоточного смыва, слюны, мочи, желудочного сока, спинномозговой жидкости, слезы, кала, волос, слизи, пота, ушной серы, жира, секреции желёз, цереброспинальной жидкости, ткани, спермы, влагалищного отделяемого, интерстициональной жидкости, получаемой из опухолевых тканей, внутриглазной жидкости, ликвора, мазка из зева, выдыхаемого воздуха, дермы, биопсии, волоса, ногтей пальцев, плацентарной жидкости, околоплодной жидкости, пуповинной крови, лимфатических жидкостей, внутриполостных жидкостей, мокроты, гноя, микробиота, меконита, женского молока, спинномозговой жидкости, выдыхаемого конденсата, носоглоточного смыва, мазка из носа, мазка из зева, образцов кала, волоса, ногтя пальца, ушной серы, выдыхаемого воздуха, соединительной ткани, мышечной ткани, нервной ткани, эпителиальной ткани, хряща, образца раковых клеток или кости.

153. Способ по любому из пп. 82, 83, 100, в котором образец представляет собой кровь.

154. Способ по любому из пп. 82, 83, 100, в котором образец представляет собой биологический образец, образец, относящийся к окружающей среде, химический образец или клинический препарат.