ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США с регистрационным № 62/095734, поданной 22 декабря 2014 года; полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к способам биотехнологии и производства рекомбинантных белков.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Клетки млекопитающих, содержащие нуклеиновую кислоту, которая кодирует рекомбинантный белок, часто применяют для получения белков, важных с терапевтической или коммерческой точки зрения. В сложившихся условиях процессов производства различных продуктов биотехнологическим компаниям все в большей степени приходится разрабатывать инновационные решения для очень гибкого и экономически эффективного производства лекарственных веществ на основе терапевтического белка.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ
Настоящее изобретение основано по меньшей мере частично на открытии того, что клетки млекопитающего, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный белок, являются жизнеспособными и пролиферируют в культуральных средах, содержащих полоксамер-188 в концентрации 1,8 г/л или в концентрации более 1,8 г/л (например, более 2,0 г/л, более 2,5 г/л, более 3,0 г/л, более 3,5 г/л, более 4,0 г/л, более 4,5 г/л, более 5,0 г/л, более 5,5 г/л, более 6,0 г/л, более 6,5 г/л или более 7,0 г/л полоксамера-188), что оптимальный рост клеток достигается при определенном соотношении полоксамера-188 и пеногасителя, что высокие плотности клеток могут быть достигнуты путем повышения концентрации полоксамера-188 в культуре клеток с учетом плотности жизнеспособных клеток, и что оптимальная концентрация полоксамера-188, добавляемого в культуру клеток для ускорения пролиферации клеток, зависит от одного или нескольких факторов из группы: размер пор, тип пор, скорость газового потока, плотность жизнеспособных клеток в среде и маркеры, связанные с клеточным стрессом.
В данном документе представлены способы культивирования клетки млекопитающего, которые включают перфузионное культивирование клетки млекопитающего, содержащей кодирующую рекомбинантный белок нуклеиновую кислоту, в условиях, достаточных для получения рекомбинантного белка, где перфузионное культивирование предусматривает культивирование в жидкой среде, содержащей полоксамер-188 в концентрации 1,8 г/л или в концентрации более 1,8 г/л, и где полоксамер-188 присутствует в среде, и/или его добавляют к среде перед стадией культивирования, и/или добавляют к среде во время стадии культивирования. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления любого из способов, описанных в данном документе, среда содержит полоксамер-188 в концентрации 1,8 г/л или в концентрации более 1,8 г/л (например, в концентрации 2,8 г/л или в концентрации более 2,8 г/л, в концентрации 4,0 г/л или в концентрации более 4,0 г/л, в концентрации 6,0 г/л или в концентрации более 6,0 г/л, в концентрации 8,0 г/л или в концентрации более 8,0 г/л, или в концентрации 10,0 г/л, или в концентрации более 10,0 г/л).
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления любого из способов, описанных в данном документе, среда дополнительно содержит пеногаситель, при этом соотношение пеногасителя (г/л) и полоксамера-188 (г/л) в среде составляет от приблизительно 0,5% до приблизительно 6,0% (например, от приблизительно 1,0% до приблизительно 5,5% или от приблизительно 1,5% до приблизительно 5,0%) в жидкой среде. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления любого из способов, описанных в данном документе, способ включает добавление полоксамера-188 к среде перед стадией культивирования и/или добавление полоксамера-188 к среде во время стадии культивирования с обеспечением в среде концентрации полоксамера-188, составляющей 1,8 г/л, или концентрации, составляющей более 1,8 г/л. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления любого из способов, представленных в данном документе, полоксамер-188 присутствует в среде. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления любого из способов, описанных в данном документе, способ включает добавление полоксамера-188 к среде перед стадией культивирования и/или добавление полоксамера-188 к среде во время стадии культивирования с обеспечением в среде концентрации полоксамера-188, составляющей 2,8 г/л, или концентрации, составляющей более 2,8 г/л (например, концентрации, составляющей 4,0 г/л, или концентрации, составляющей более 4,0 г/л, концентрации, составляющей 6,0 г/л, или концентрации, составляющей более 6,0 г/л, концентрации, составляющей 8,0 г/л, или концентрации, составляющей более 8,0 г/л, или концентрации, составляющей 10,0 г/л, или концентрации, составляющей более 10,0 г/л).
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления любого из способов, описанных в данном документе, способ включает обеспечение повышения концентрации полоксамера-188 в среде с течением времени. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления любого из способов, описанных в данном документе, основанием для повышения концентрации полоксамера-188 с течением времени является плотность жизнеспособных клеток в среде. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления любого из способов, описанных в данном документе, способ включает обеспечение повышения концентрации полоксамера-188 в среде до более 1,8 г/л (например, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 3,0 г/л или от приблизительно 2,3 г/л до приблизительно 3,0 г/л), когда плотность жизнеспособных клеток в среде составляет от приблизительно 35×106 клеток/мл до приблизительно 60×106 клеток/мл. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления любого из способов, описанных в данном документе, способ включает обеспечение повышения концентрации полоксамера-188 в среде до более 3,0 г/л (например, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 6,0 г/л или от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 6,0 г/л), когда плотность жизнеспособных клеток в среде составляет от приблизительно 60×106 клеток/мл до приблизительно 90×106 клеток/мл. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления любого из способов, описанных в данном документе, способ включает обеспечение повышения концентрации полоксамера-188 в среде до более 6,0 г/л (например, более 7,0 г/л, более 8,0 г/л или более 10,0 г/л), когда плотность жизнеспособных клеток в среде составляет более 90×106 клеток/мл. Некоторые варианты осуществления любого из способов, описанных в данном документе, включают обеспечение повышения концентрации полоксамера-188 в среде в диапазоне от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 3,0 г/л, когда плотность жизнеспособных клеток в среде составляет от приблизительно 35×106 клеток/мл до приблизительно 60×106 клеток/мл; обеспечение повышения концентрации полоксамера-188 в среде в диапазоне от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 6,0 г/л, когда плотность жизнеспособных клеток в среде составляет от приблизительно 60×106 клеток/мл до приблизительно 90×106 клеток/мл; и обеспечение повышения концентрации полоксамера-188 в среде до более 6,0 г/л, когда плотность жизнеспособных клеток в среде составляет более 90×106 клеток/мл. Некоторые варианты осуществления любого из способов, описанных в данном документе, включают определение плотности жизнеспособных клеток в среде в один или несколько моментов времени в ходе культивирования.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления любого из способов, описанных в данном документе, перфузионное культивирование включает обеспечение сосуда, содержащего клетки млекопитающего, помещенные в первую жидкую среду; инкубирование сосуда при перемешивании и в течение периода культивирования, составляющего по меньшей мере приблизительно 7 дней, при температуре от приблизительно 32°C до приблизительно 40°C; и спустя первые 48-96 часов периода культивирования удаление первого объема первой жидкой среды и добавление к первой жидкой среде второго объема второй жидкой среды непрерывным или периодическим способом, где первый и второй объемы являются приблизительно равными. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления любого из способов, описанных в данном документе, вторая жидкая среда содержит полоксамер-188 в более высокой концентрации, чем таковая в первой жидкой среде. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления любого из способов, описанных в данном документе, первая жидкая среда содержит полоксамер-188 в концентрации 1,8 г/л или в концентрации менее 1,8 г/л, а вторая жидкая среда содержит полоксамер-188 в концентрации более 1,8 г/л (например, в концентрации более 2,8 г/л, концентрации более 4,0 г/л, концентрации более 6,0 г/л, концентрации более 8,0 г/л или концентрации более 10,0 г/л). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления любого из способов, описанных в данном документе, способ включает, до или после добавления второго объема второй жидкой среды к первой жидкой среде, добавление полоксамера-188 ко второй жидкой среде с обеспечением во второй среде концентрации полоксамера-188, составляющей 1,8 г/л, или концентрации, составляющей более 1,8 г/л (например, концентрации, составляющей более 2,8 г/л, концентрации, составляющей более 4,0 г/л, концентрации, составляющей более 6,0 г/л, концентрации, составляющей более 8,0 г/л, или концентрации, составляющей более 10,0 г/л).
Некоторые варианты осуществления любого из способов, описанных в данном документе, дополнительно включают осуществление сбора рекомбинантного белка из клеток млекопитающего, из первой жидкой среды, или второй жидкой среды, или любой их комбинации. Некоторые варианты осуществления любого из способов, описанных в данном документе, дополнительно включают составление собранного рекомбинантного белка в фармацевтическую композицию. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления любого из способов, описанных в данном документе, сбор выполняют после достижения в результате культивирования плотности жизнеспособных клеток более 30×106 клеток/мл (например, более 50×106 клеток/мл, более 100×106 клеток/мл, более 150×106 клеток/мл или более 200×106 клеток/мл).
В данном документе также представлены способы культивирования клетки млекопитающего, которые включают обеспечение системы культивирования, включающей в себя сосуд, жидкую среду, помещенную в сосуд, и барботер, помещенный в сосуд, содержащий множество пор, предназначенных для распределения газа через барботер в жидкую среду; и осуществление перфузионного культивирования клетки млекопитающего, содержащей кодирующую рекомбинантный белок нуклеиновую кислоту, в системе культивирования в условиях и при скорости газового потока, достаточных для получения рекомбинантного белка в системе, где среда содержит полоксамер-188 в концентрации, которая выбрана на основании одного или нескольких факторов, выбранных из группы: размер пор, тип пор, скорость газового потока, плотность жизнеспособных клеток в среде и маркеры, связанные с клеточным стрессом. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления любого из способов, описанных в данном документе, достижение выбранной концентрации полоксамера-188 обеспечивают путем добавления полоксамера-188 к среде перед стадией культивирования и/или добавления полоксамера-188 к среде во время стадии культивирования.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления любого из способов, описанных в данном документе, фактором является тип пор, при этом тип пор относится к поре, полученной в результате спекания, или поре, полученной в результате перфорации. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления любого из способов, описанных в данном документе, способ включает осуществление выбора на основании типа пор и размера пор концентрации полоксамера-188 от приблизительно 2,3 г/л до приблизительно 3,3 г/л, в случае типа пор, относящегося к поре, полученной в результате перфорации, и размера пор, составляющего от приблизительно 750 мкм до приблизительно 1,5 мм, или концентрации полоксамера-188 от приблизительно 2,5 г/л до приблизительно 3,1 г/л, в случае типа пор, относящегося к поре, полученной в результате перфорации, и размера пор, составляющего от приблизительно 900 мкм до приблизительно 1,1 мм. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления любого из способов, описанных в данном документе, способ включает осуществление выбора на основании типа пор и размера пор концентрации полоксамера-188 от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 4,3 г/л, в случае типа пор, относящегося к поре, полученной в результате перфорации, и размера пор, составляющего от приблизительно 250 мкм до приблизительно 750 мкм, или концентрации полоксамера-188 от приблизительно 3,5 г/л до приблизительно 4,1 г/л, в случае типа пор, относящегося к поре, полученной в результате перфорации, и размера пор, составляющего от приблизительно 400 мкм до приблизительно 600 мкм. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления любого из способов, описанных в данном документе, способ включает осуществление выбора на основании типа пор и размера пор концентрации полоксамера-188 более 4,3 г/л (например, концентрации более 5,0 г/л, концентрации более 6,0 г/л, концентрации более 8,0 г/л или концентрации более 10,0 г/л), в случае типа пор, относящегося к поре, полученной в результате перфорации, и размера пор, составляющего от приблизительно 1 мкм до приблизительно 250 мкм (например, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 200 мкм, от приблизительно 160 мкм до приблизительно 190 мкм или от приблизительно 170 мкм до приблизительно 180 мкм).
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления любого из способов, описанных в данном документе, способ включает осуществление выбора на основании типа пор и размера пор концентрации полоксамера-188 от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 3,3 г/л, в случае типа пор, относящегося к поре, полученной в результате спекания, и размера пор, составляющего более 150 мкм. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления любого из способов, описанных в данном документе, способ включает осуществление выбора на основании типа пор и размера пор концентрации полоксамера-188 от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 4,3 г/л, в случае типа пор, относящегося к поре, полученной в результате спекания, и размера пор, составляющего от приблизительно 80 мкм до приблизительно 150 мкм, или концентрации полоксамера-188 от приблизительно 3,5 г/л до приблизительно 4,1 г/л, в случае типа пор, относящегося к поре, полученной в результате спекания, и размера пор, составляющего от приблизительно 90 мкм до приблизительно 110 мкм. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления любого из способов, описанных в данном документе, способ включает осуществление выбора на основании типа пор и размера пор концентрации полоксамера-188 более 4,5 г/л (например, концентрации более 5,0 г/л, концентрации более 6,0 г/л, концентрации более 8,0 г/л или концентрации более 10,0 г/л), в случае типа пор, относящегося к поре, полученной в результате спекания, и размера пор, составляющего от приблизительно 1 мкм до приблизительно 80 мкм.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления любого из способов, описанных в данном документе, перфузионное культивирование включает инкубирование системы культивирования, содержащей первую жидкую среду, при перемешивании и в течение периода культивирования, составляющего по меньшей мере приблизительно 7 дней, при температуре от приблизительно 32°C до приблизительно 40°C; и спустя первые 48-96 часов периода культивирования удаление первого объема первой жидкой среды и добавление к первой жидкой среде второго объема второй жидкой среды непрерывным или периодическим способом. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления любого из способов, описанных в данном документе, вторая жидкая среда содержит полоксамер-188 в более высокой концентрации, чем концентрация полоксамера-188 в первой жидкой среде. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления любого из способов, описанных в данном документе, вторая среда содержит полоксамер-188 в выбранной концентрации.
Некоторые варианты осуществления любого из способов, описанных в данном документе, включают осуществление сбора рекомбинантного белка из внутренней части клеток млекопитающего, из первой жидкой среды, или второй жидкой среды, или любой их комбинации. Некоторые варианты осуществления любого из способов, описанных в данном документе, дополнительно включают составление собранного рекомбинантного белка в фармацевтическую композицию.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления любого из способов, описанных в данном документе, сосудом является перфузионный биореактор. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления любого из способов, описанных в данном документе, перфузионный биореактор имеет объем от приблизительно 1,5 л до приблизительно 25000 л. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления любого из способов, описанных в данном документе, период культивирования составляет более 10 дней. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления любого из способов, описанных в данном документе, удаление первого объема первой жидкой среды и добавление второго объема второй жидкой среды на стадии (c) выполняют непрерывным способом. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления любого из способов, описанных в данном документе, удаление первого объема первой жидкой среды и добавление второго объема второй жидкой среды на стадии (c) выполняют периодическим способом. В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных в данном документе, первый объем удаляемой первой жидкой среды и второй объем добавляемой второй жидкой среды на стадии (c) увеличивают с течением времени. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления любого из способов, описанных в данном документе, первая жидкая среда и/или вторая жидкая среда выбраны из группы: жидкая культуральная среда с определенным химическим составом, жидкая культуральная среда, не содержащая сыворотку, жидкая культуральная среда, содержащая сыворотку, жидкая культуральная среда, не содержащая компонентов животного происхождения, и среда, не содержащая белков. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления любого из способов, описанных в данном документе, спустя приблизительно первые 48-96 часов периода времени, в каждый 24-часовой период, первый объем удаляемой первой жидкой среды и второй объем добавляемой второй жидкой среды на стадии (с) составляют от приблизительно 0,3x до приблизительно 10x объема первой жидкой среды или объема сосуда.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления любого из способов, описанных в данном документе, клетка млекопитающего представляет собой клетку яичника китайского хомячка (CHO), клетку эмбриональной почки человека (HEK), клетку NSO, клетку почки новорожденного хомячка (BHK), клетку PerC6, клетку Vero или линию клеток HT-1080. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления любого из способов, описанных в данном документе, рекомбинантный белок представляет собой иммуноглобулин, фермент, фактор роста, фрагмент белка или сконструированный белок.
В контексте данного документа единственное число существительного обозначает один или несколько объектов конкретного существительного. Например, фраза "клетка млекопитающего" обозначает "одну или несколько клеток млекопитающего".
Термин "клетка млекопитающего" означает любую клетку любого млекопитающего или любую клетку, полученную из любого млекопитающего (например, человека, хомячка, мыши, зеленой мартышки, крысы, свиньи, коровы или кролика). Например, клетка млекопитающего может представлять собой иммортализованную клетку. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления клетка млекопитающего представляет собой дифференцированную или недифференцированную клетку. Неограничивающие примеры клеток млекопитающих описаны в данном документе. Дополнительные примеры клеток млекопитающих известны из уровня техники.
Термин "культивирование" или "культивирование клетки" означает поддержание или пролиферацию клетки млекопитающего при контролируемой совокупности физических условий.
Термин "культура клеток млекопитающего", "культура" или "культура клеток" означает жидкую среду, содержащую множество клеток млекопитающего, которые поддерживаются или пролиферируют при контролируемой совокупности физических условий.
Термин "жидкая культуральная среда" или "жидкая среда" означает текучую среду, которая содержит достаточно питательных веществ для обеспечения возможности роста или пролиферации клетки (например, клетки млекопитающего) in vitro. Например, жидкая среда может содержать одно или несколько из аминокислот (например, 20 аминокислот), пурина (например, гипоксантина), пиримидина (например, тимидина), холина, инозитола, тиамина, фолиевой кислоты, биотина, кальция, никотинамида, пиридоксина, рибофлавина, тимидина, цианокобаламина, пирувата, липоевой кислоты, магния, глюкозы, натрия, калия, железа, меди, цинка и бикарбоната натрия. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления жидкая среда может содержать сыворотку от млекопитающего. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления жидкая среда не содержит сыворотку или другой экстракт от млекопитающего (жидкая среда с определенным составом). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления жидкая среда может содержать металлы в следовых количествах, гормон роста млекопитающего и/или фактор роста млекопитающего. Другим примером жидкой среды является минимальная среда (например, среда, содержащая только неорганические соли, источник углерода и воду). Неограничивающие примеры жидкой среды описаны в данном документе. Дополнительные примеры жидкой среды известны из уровня техники и являются коммерчески доступными. Жидкая среда может содержать клетки млекопитающего при любой плотности. Например, в контексте данного документа объем жидкой среды, удаляемой из биореактора, может, по сути, не содержать клеток млекопитающего.
Термин "жидкая культуральная среда, не содержащая компонентов животного происхождения" означает жидкую среду, которая не содержит каких-либо компонентов (например, белков или сыворотки), полученных от млекопитающего.
Термин "жидкая культуральная среда, не содержащая сыворотку" означает жидкую среду, которая не содержит сыворотку млекопитающего.
Термин "жидкая культуральная среда, содержащая сыворотку" означает жидкую среду, которая содержит сыворотку млекопитающего.
Термин "жидкая культуральная среда с определенным химическим составом" является специальным в данной области термином и означает жидкую среду, в которой все химические компоненты известны. Например, жидкая среда с определенным химическим составом не содержит фетальную бычью сыворотку, альбумин бычьей сыворотки или альбумин человеческой сыворотки, поскольку эти препараты, как правило, содержат сложную смесь альбуминов и липидов.
Термин "жидкая культуральная среда, не содержащая белков" означает жидкую среду, которая не содержит каких-либо белков (например, каких-либо выявляемых белков).
Термин "перемешивание" означает помешивание или иное перемещение части жидкой среды в сосуде. Его осуществляют, например, для повышения концентрации растворенного O2 в жидкой среде в биореакторе. Перемешивание можно осуществлять с применением любого способа, известного из уровня техники, например, с применением аппарата или пропеллерной мешалки. Иллюстративные устройства и способы, которые можно применять для осуществления перемешивания части жидкой среды в биореакторе, известны из уровня техники.
Термин "иммуноглобулин" означает полипептид, содержащий аминокислотную последовательность по меньшей мере из 15 аминокислот (например, по меньшей мере из 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 аминокислот) белка-иммуноглобулина (например, последовательность вариабельного домена, последовательность каркаса или последовательность константного домена). Иммуноглобулин может содержать, например, по меньшей мере 15 аминокислот из легкой цепи иммуноглобулина, например, по меньшей мере 15 аминокислот из тяжелой цепи иммуноглобулина. Иммуноглобулин может представлять собой выделенное антитело (например, IgG, IgE, IgD, IgA или IgM). Иммуноглобулин может относиться к подклассу IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4). Иммуноглобулин может представлять собой фрагмент антитела, например, Fab-фрагмент, F(ab′)2-фрагмент или scFv-фрагмент. Иммуноглобулин также может представлять собой биспецифическое антитело или триспецифическое антитело, или димерное, тримерное или мультимерное антитело, или диатело, Affibody® или Nanobody®. Иммуноглобулин также может представлять собой сконструированный белок, содержащий по меньшей мере один домен иммуноглобулина (например, слитый белок). Неограничивающие примеры иммуноглобулинов описаны в данном документе, а дополнительные примеры иммуноглобулинов известны из уровня техники. Рекомбинантный иммуноглобулин можно получить с применением любого из способов, описанных в данном документе.
Термин "фрагмент белка" или "фрагмент полипептида" означает часть полипептидной последовательности длиной по меньшей мере или приблизительно 4 аминокислоты, по меньшей мере или приблизительно 5 аминокислот, по меньшей мере или приблизительно 6 аминокислот, по меньшей мере или приблизительно 7 аминокислот, по меньшей мере или приблизительно 8 аминокислот, по меньшей мере или приблизительно 9 аминокислот, по меньшей мере или приблизительно 10 аминокислот, по меньшей мере или приблизительно 11 аминокислот, по меньшей мере или приблизительно 12 аминокислот, по меньшей мере или приблизительно 13 аминокислот, по меньшей мере или приблизительно 14 аминокислот, по меньшей мере или приблизительно 15 аминокислот, по меньшей мере или приблизительно 16 аминокислот, по меньшей мере или приблизительно 17 аминокислот, по меньшей мере или приблизительно 18 аминокислот, по меньшей мере или приблизительно 19 аминокислот, или по меньшей мере или приблизительно 20 аминокислот, или длиной более 20 аминокислот. Фрагмент рекомбинантного белка можно получить с применением любого из способов, описанных в данном документе.
Термин "сконструированный белок" означает полипептид, который в естественных условиях не кодируется эндогенной нуклеиновой кислотой, находящейся в организме (например, млекопитающем). Примеры сконструированных белков включают ферменты (например, с одной или несколькими аминокислотными заменами, делециями, вставками или добавлениями, которые приводят к повышенной стабильности и/или каталитической активности сконструированного фермента), слитые белки, антитела (например, бивалентные антитела, тривалентные антитела или диатело) и антигенсвязывающие белки, которые содержат по меньшей мере одну рекомбинантную каркасную последовательность. Рекомбинантный сконструированный белок можно получить с применением любого из способов, описанных в данном документе.
Термин "секретируемый белок" или "секретируемый рекомбинантный белок" означает белок (например, рекомбинантный белок), который изначально содержит по меньшей мере одну сигнальную последовательность секреции при своей трансляции внутри клетки млекопитающего, и в результате по меньшей мере частичного ферментативного отщепления сигнальной последовательности секреции в клетке млекопитающего он секретируется по меньшей мере частично во внеклеточное пространство (например, жидкую среду). Квалифицированным специалистам-практикам будет понятно, что "секретируемый" белок не должен быть полностью отделен от клетки, чтобы считаться секретируемым белком.
Термин "перфузионный биореактор" означает биореактор, содержащий множество клеток (например, клеток млекопитающего) в первой жидкой среде, где культивирование клеток, находящихся в биореакторе, включает периодическое или непрерывное удаление первой жидкой среды и одновременное добавление или вскоре после удаления добавление в биореактор практически такого же объема второй жидкой среды. В некоторых примерах постепенно изменяют (например, увеличивают или уменьшают) объем первой жидкой среды, удаляемой и добавляемой в течение дополнительных периодов (например, приблизительно 24-часовой период, период от приблизительно 1 минуты до приблизительно 24 часов, или период более 24 часов) во время периода культивирования (например, скорость повторной подпитки жидкой среды ежесуточно). Фракция сред, которые удаляют и заменяют каждый день, может меняться в зависимости от конкретных культивируемых клеток, исходной плотности посева и плотности клеток в конкретный момент времени. "RV" или "объем реактора" означает объем жидкой среды, имеющийся в начале процесса культивирования (например, общий объем жидкой среды, имеющийся после посева).
Термин "биореактор периодического действия с подпиткой" является специальным в данной области термином и означает биореактор, содержащий множество клеток (например, клеток млекопитающего) в первой жидкой среде, где культивирование клеток, находящихся в биореакторе, включает периодическое или непрерывное добавление второй жидкой среды к первой жидкой среде без существенного или значительного удаления первой жидкой среды или второй жидкой среды из культуры клеток. Вторая жидкая среда может быть такой же, как и первая жидкая среда. В некоторых примерах культуры с периодической подпиткой вторая жидкая среда представляет собой концентрированную форму первой жидкой среды. В некоторых примерах культуры с периодической подпиткой вторую жидкую среду добавляют в виде сухого порошка.
Термин "барботер" является специальным в данной области термином и означает устройство, имеющее входное отверстие, корпус и поверхность, имеющую одну или несколько пор, при этом входное отверстие, корпус и одну или несколько пор разрабатывают таким образом, чтобы обеспечить поток газа через входное отверстие, через корпус и из одной или нескольких пор. При применении барботеров в культуре клеток одно из одной или нескольких пор приводят в контакт с культурой клеток так, чтобы газ выходил из по меньшей мере одной поры в культуру клеток. Барботеры часто характеризуют по размеру их пор и типу пор. Неограничивающие примеры барботеров, характеризующихся различными комбинациями размеров пор и типов пор, описаны в данном документе.
Термин "размер пор" является специальным в данной области термином и относится к диаметру одной поры в барботере, имеющем одну пору, или среднему диаметру двух или более пор в барботере, имеющем две или более пор.
Термин "маркер, связанный с клеточным стрессом" является специальным в данной области термином и означает биологическую молекулу, которая высвобождается клеткой при физиологическом стрессе (например, клеткой, подвергающейся некрозу или апоптозу) в жидкую среду, или биологическую молекулу, вырабатываемую клеткой при физиологическом стрессе или характеризующуюся повышенными уровнями в клетке при физиологическом стрессе (например, клетке, подвергающейся некрозу или апоптозу). Неограничивающие примеры маркеров, связанных с клеточным стрессом, которые высвобождаются клеткой при физиологическом стрессе, включают протеазы (например, активированные каспазы), лактатдегидрогеназу, геномную ДНК (например, нуклеосомную ДНК), цитохром c и активированную PARP. Неограничивающие примеры маркеров, связанных с клеточным стрессом, которые вырабатываются клеткой при физиологическом стрессе или характеризуются повышенными уровнями в клетке при физиологическом стрессе, включают активированные каспазы, цитохром c, активированную PARP и экстернализированный фосфатидилсерин.
"Удельная продуктивность" или "SPR" является специальным в данной области термином и в контексте данного документе относится к массе или ферментативной активности рекомбинантного белка, вырабатываемого одной клеткой млекопитающего за день. SPR для рекомбинантного терапевтического антитела обычно измеряется в виде масса/клетка/день. SPR для рекомбинантного терапевтического фермента обычно измеряется в виде единицы/клетка/день или (единицы/масса)/клетка/день.
"Объемная продуктивность" или "VPR" является специальным в данной области термином и в контексте данного документа относится к массе или ферментативной активности рекомбинантного белка, вырабатываемого на единицу объема культуры (например, на литр объема биореактора, сосуда или пробирки) за день. VPR для рекомбинантного терапевтического антитела обычно измеряется в виде масса/л/день. VPR для рекомбинантного терапевтического фермента обычно измеряется в виде единицы/л/день или масса/л/день.
Фразы "полоксамер-188 в концентрации" и "концентрация полоксамера-188" применяются в данном документе взаимозаменяемо. Фразы "X г/л или более полоксамера-188" и "полоксамер-188 в концентрации X г/л или в концентрации более X г/л" применяются в данном документе взаимозаменяемо.
Если не указано иное, все технические и научные термины, применяемые в данном документе, имеют такое же значение, которое обычно понятно специалисту в данной области, к которой относится настоящее изобретение. Способы и материалы описаны в данном документе для применения в настоящем изобретении; при этом также можно применять и другие подходящие способы и материалы, известные из уровня техники. Материалы, способы и примеры являются лишь иллюстративными и не предназначены для ограничения. Все публикации, патентные заявки, патенты, последовательности, записи в базах данных и другие ссылки, упомянутые в данном документе, включены посредством ссылки во всей своей полноте. В случае противоречий настоящее описание, включая определения, будет иметь преимущественную силу.
Другие признаки и преимущества настоящего изобретения станут очевидными из нижеследующих подробного описания и фигур, а также из формулы изобретения.
ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На фигуре 1 представлен график, демонстрирующий плотность жизнеспособных клеток в зависимости от времени в цикле перфузионного культирования клеток, выполняемом с применением жидкой среды, не содержащей дополнительное количество полоксамера-188 в течение периода культивирования (постоянная концентрация полоксамера-188, составляющая 1,8 г/л, в течение периода культивирования) (данные представлены в сером цвете), и цикле перфузионного культивирования клеток, выполняемом с применением жидких культуральных сред, которые содержали полоксамер-188 с возрастанием его количества в течение периода культивирования (возрастание количества полоксамера-188 от 1,8 г/л до 6,8 г/л в течение периода культивирования) (данные представлены в черном цвете).
На фигуре 2 представлен график, демонстрирующий удельную скорость роста в зависимости от времени в цикле перфузионного культивирования клеток, выполняемом с применением жидких культуральных сред, которые содержали полоксамер-188 с возрастанием его количества в течение периода культивирования (возрастание количества полоксамера-188 от 1,8 г/л до 6,8 г/л в течение периода культивирования).
На фигуре 3 представлен график, демонстрирующий процент жизнеспособных клеток в двух циклах перфузионного культирования клеток, выполняемых с применением жидкой среды, не содержащей дополнительного количества полоксамера-188 в течение периода культивирования (постоянная концентрация полоксамера-188, составляющая 1,8 г/л, в течение периода культивирования) (данные представлены в сером цвете), и цикле перфузионного культивирования клеток, выполняемом с применением жидких культуральных сред, которые содержали полоксамер-188 с возрастанием его количества в течение периода культивирования (возрастание количества полоксамера-188 от 1,8 г/л до 6,8 г/л в течение периода культивирования) (данные представлены в черном цвете).
На фигуре 4 представлен график, демонстрирующий объемную продуктивность в зависимости от времени в цикле перфузионного культивирования клеток, выполняемом с применением жидких культуральных сред, которые содержали полоксамер-188 с возрастанием его количества в течение периода культивирования (возрастание количества полоксамера-188 от 1,8 г/л до 6,8 г/л в течение периода культивирования).
На фигуре 5 представлен график, демонстрирующий удельную продуктивность в зависимости от времени в цикле перфузионного культивирования клеток, выполняемом с применением жидких культуральных сред, которые содержали полоксамер-188 с возрастанием его количества в течение периода культивирования (возрастание количества полоксамера-188 от 1,8 г/л до 6,8 г/л в течение периода культивирования).
На фигуре 6 представлена пластина геля Bis-Tris, на которой показаны продукты расщепления рекомбинантного антитела, присутствующего в осветленной жидкой среде, собранной из перфузионной культуры клеток, содержащей 6,8 г/л полоксамера-188 (полоса 1); осветленной жидкой среде, собранной из перфузионной культуры клеток, содержащей 6,8 г/л полоксамера-188, которую инкубировали в течение 7 дней при комнатной температуре (полоса 1a); осветленной жидкой среде, собранной из перфузионной культуры клеток, содержащей 3,95 г/л полоксамера-188 (полоса 2); осветленной жидкой среде, собранной из перфузионной культуры клеток, содержащей 3,95 г/л полоксамера-188 и инкубированной в течение 7 дней при комнатной температуре (полоса 2a); осветленной жидкой среде, собранной из перфузионной культуры клеток, содержащей 3,95 г/л полоксамера-188, дополненной полоксамером-188 для достижения концентрации полоксамера-188 6,8 г/л и инкубированной при комнатной температуре в течение 9 дней (полоса 2b); осветленной жидкой среде, собранной из перфузионной культуры клеток, содержащей 3,0 г/л полоксамера-188 (полоса 3); осветленной жидкой среде, собранной из перфузионной культуры клеток, содержащей 3,0 г/л полоксамера-188 и инкубированной при комнатной температуре в течение 7 дней (полоса 3a); и осветленной жидкой среде, собранной из перфузионной культуры клеток, содержащей 3,0 г/л полоксамера-188, дополненной полоксамером-188 для достижения концентрации полоксамера-188 6,8 г/л и инкубированной в течение 9 дней при комнатной температуре (полоса 3b).
На фигуре 7 представлен график, демонстрирующий плотность жизнеспособных клеток в зависимости от времени для цикла перфузионного культивирования клеток, выполняемого с применением барботера с порой, полученной в результате спекания, размером 20 мкм и культуральных сред, которые содержали полоксамер-188 в возрастающих количествах в течение периода культивирования (возрастание количества полоксамера-188 от 1,8 г/л до 5,8 г/л в течение периода культивирования) (квадратики); цикла перфузионного культивирования клеток, выполняемого с применением барботера с порой, полученной в результате перфорации, размером 200 мкм и культуральных сред, которые содержали полоксамер-188 в возрастающих количествах в течение периода культивирования (возрастание количества от 1,8 г/л до 4,8 г/л в течение периода культивирования) (треугольники); и цикла перфузионного культивирования клеток, выполняемого с применением барботера с порой, полученной в результате перфорации, размером 500 мкм и культуральных сред, которые содержали полоксамера-188 в возрастающих количествах в течение периода культивирования (возрастание количества от 1,8 г/л до 3,8 г/л) (кружочки).
На фигуре 8 представлен график, демонстрирующий удельную скорость роста в зависимости от времени для цикла перфузионного культивирования клеток, выполняемого с применением барботера с порой, полученной в результате спекания, размером 20 мкм и культуральных сред, которые содержали полоксамер-188 в возрастающих количествах в течение периода культивирования (возрастание количества полоксамера-188 от 1,8 г/л до 5,8 г/л в течение периода культивирования) (квадратики); цикла перфузионного культивирования клеток, выполняемого с применением барботера с порой, полученной в результате перфорации, размером 200 мкм и культуральных сред, которые содержали полоксамер-188 в возрастающих количествах в течение периода культивирования (возрастание количества от 1,8 г/л до 4,8 г/л в течение периода культивирования) (треугольники); и цикла перфузионного культивирования клеток, выполняемого с применением барботера с порой, полученной в результате перфорации, размером 500 мкм и культуральных сред, которые содержали полоксамера-188 в возрастающих количествах в течение периода культивирования (возрастание количества от 1,8 г/л до 3,8 г/л) (кружочки).
На фигуре 9 представлен график, демонстрирующий удельную продуктивность лактатдегидрогеназы в зависимости от времени для цикла перфузионного культивирования клеток, выполняемого с применением барботера с порой, полученной в результате спекания, размером 20 мкм и культуральных сред, которые содержали полоксамер-188 в возрастающих количествах в течение периода культивирования (возрастание количества полоксамера-188 от 1,8 г/л до 5,8 г/л в течение периода культивирования) (квадратики); цикла перфузионного культивирования клеток, выполняемого с применением барботера с порой, полученной в результате перфорации, размером 200 мкм и культуральных сред, которые содержали полоксамер-188 в возрастающих количествах в течение периода культивирования (возрастание количества от 1,8 г/л до 4,8 г/л в течение периода культивирования) (треугольники); и цикла перфузионного культивирования клеток, выполняемого с применением барботера с порой, полученной в результате перфорации, размером 500 мкм и культуральных сред, которые содержали полоксамера-188 в возрастающих количествах в течение периода культивирования (возрастание количества от 1,8 г/л до 3,8 г/л) (кружочки).
На фигуре 10 представлен график, демонстрирующий процент жизнеспособных клеток в зависимости от времени для цикла перфузионного культивирования клеток, выполняемого с применением барботера с порой, полученной в результате спекания, размером 20 мкм и культуральных сред, которые содержали полоксамер-188 в возрастающих количествах в течение периода культивирования (возрастание количества полоксамера-188 от 1,8 г/л до 5,8 г/л в течение периода культивирования) (квадратики); цикла перфузионного культивирования клеток, выполняемого с применением барботера с порой, полученной в результате перфорации, размером 200 мкм и культуральных сред, которые содержали полоксамер-188 в возрастающих количествах в течение периода культивирования (возрастание количества от 1,8 г/л до 4,8 г/л в течение периода культивирования) (треугольники); и цикла перфузионного культивирования клеток, выполняемого с применением барботера с порой, полученной в результате перфорации, размером 500 мкм и культуральных сред, которые содержали полоксамера-188 в возрастающих количествах в течение периода культивирования (возрастание количества от 1,8 г/л до 3,8 г/л) (кружочки).
На фигуре 11 представлен график, демонстрирующий удельную продуктивность лактатдегидрогеназы в зависимости от времени для цикла перфузионного культивирования клеток, выполняемого с применением барботера с порой, полученной в результате спекания, размером 20 мкм и культуральных сред, которые содержали 1,8 г/л полоксамера-188 в течение периода культивирования (незакрашенные кружочки); цикла перфузионного культивирования клеток, выполняемого с применением барботера с порой, полученной в результате спекания, размером 20 мкм и культуральных сред, которые содержали полоксамер-188 в возрастающих количествах в течение периода культивирования (возрастание количества полоксамера-188 от 1,8 г/л до 5,8 г/л в течение периода культивирования) (квадратики); цикла перфузионного культивирования клеток, выполняемого с применением барботера с порой, полученной в результате перфорации, размером 200 мкм и культуральных сред, которые содержали полоксамер-188 в возрастающих количествах в течение периода культивирования (возрастание количества от 1,8 г/л до 4,8 г/л в течение периода культивирования) (треугольники); и цикла перфузионного культивирования клеток, выполняемого с применением барботера с порой, полученной в результате перфорации, размером 500 мкм и культуральных сред, которые содержали полоксамера-188 в возрастающих количествах в течение периода культивирования (возрастание количества от 1,8 г/л до 3,8 г/л) (закрашенные кружочки).
На фигуре 12 представлен график, демонстрирующий объемную продуктивность в зависимости от времени для цикла перфузионного культивирования клеток, выполняемого с применением барботера с порой, полученной в результате спекания, размером 20 мкм и культуральных сред, которые содержали полоксамер-188 в возрастающих количествах в течение периода культивирования (возрастание количества полоксамера-188 от 1,8 г/л до 5,8 г/л в течение периода культивирования) (квадратики); цикла перфузионного культивирования клеток, выполняемого с применением барботера с порой, полученной в результате перфорации, размером 200 мкм и культуральных сред, которые содержали полоксамер-188 в возрастающих количествах в течение периода культивирования (возрастание количества от 1,8 г/л до 4,8 г/л в течение периода культивирования) (треугольники); и цикла перфузионного культивирования клеток, выполняемого с применением барботера с порой, полученной в результате перфорации, размером 500 мкм и культуральных сред, которые содержали полоксамера-188 в возрастающих количествах в течение периода культивирования (возрастание количества от 1,8 г/л до 3,8 г/л) (кружочки).
На фигуре 13 представлен график, демонстрирующий аэробное потребление глюкозы в зависимости от времени для цикла перфузионного культивирования клеток, выполняемого с применением барботера с порой, полученной в результате спекания, размером 20 мкм и культуральных сред, которые содержали полоксамер-188 в возрастающих количествах в течение периода культивирования (возрастание количества полоксамера-188 от 1,8 г/л до 5,8 г/л в течение периода культивирования) (квадратики); цикла перфузионного культивирования клеток, выполняемого с применением барботера с порой, полученной в результате перфорации, размером 200 мкм и культуральных сред, которые содержали полоксамер-188 в возрастающих количествах в течение периода культивирования (возрастание количества от 1,8 г/л до 4,8 г/л в течение периода культивирования) (треугольники); и цикла перфузионного культивирования клеток, выполняемого с применением барботера с порой, полученной в результате перфорации, размером 500 мкм и культуральных сред, которые содержали полоксамера-188 в возрастающих количествах в течение периода культивирования (возрастание количества от 1,8 г/л до 3,8 г/л) (кружочки).
На фигуре 14 представлен график, демонстрирующий плотность жизнеспособных клеток в зависимости от времени для различных циклов периодического культивирования клеток во встряхиваемой колбе, выполняемых с применением жидкой среды CD-CHO, содержащей пеногаситель-c и полоксамер-188 в соотношении 0% (закрашенные кружочки), пеногаситель-c и полоксамер-188 в соотношении 5,6% (незакрашенные кружочки), пеногаситель-c и полоксамер-188 в соотношении 11,1% (закрашенные квадратики), пеногаситель-c и полоксамер-188 в соотношении 27,8% (незакрашенные квадратики) или пеногаситель-c и полоксамер-188 в соотношении 55,6% (закрашенные треугольники).
На фигуре 15 представлен график, демонстрирующий удельную продуктивность лактатдегидрогеназы в зависимости от времени для различных циклов периодического культивирования клеток во встряхиваемой колбе, выполняемых с применением жидкой среды CD-CHO, содержащей пеногаситель-c и полоксамер-188 в соотношении 0% (закрашенные кружочки), пеногаситель-c и полоксамер-188 в соотношении 5,6% (незакрашенные кружочки), пеногаситель-c и полоксамер-188 в соотношении 11,1% (закрашенные квадратики), пеногаситель-c и полоксамер-188 в соотношении 27,8% (незакрашенные квадратики) или пеногаситель-c и полоксамер-188 в соотношении 55,6% (закрашенные треугольники).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
В данном документе представлены способы культивирования клетки млекопитающего, которые включают культивирование клетки млекопитающего, содержащей кодирующую рекомбинантный белок нуклеиновую кислоту, в условиях, достаточных для получения рекомбинантного белка, где культивирование предусматривает культивирование в жидкой среде, содержащей полоксамер-188 в концентрации 1,8 г/л или в концентрации более 1,8 г/л, и где полоксамер-188 присутствует в среде, и/или его добавляют к среде перед стадией культивирования, и/или добавляют к среде во время стадии культивирования. Также представлены способы культивирования клетки млекопитающего, которые включают обеспечение системы культивирования, включающей в себя сосуд, жидкую среду, помещенную в сосуд, и барботер, помещенный в сосуд, содержащий множество пор, предназначенных для распределения газа через барботер в жидкую среду, и осуществление культивирования клетки млекопитающего, содержащей кодирующую рекомбинантный белок нуклеиновую кислоту, в системе культивирования в условиях и при скорости газового потока, достаточных для получения рекомбинантного белка в системе, где среда содержит полоксамер-188 в концентрации, которая выбрана на основании одного или нескольких факторов, выбранных из группы: размер пор, тип пор, скорость газового потока, плотность жизнеспособных клеток в среде и маркеры, связанные с клеточным стрессом. Иллюстративные неограничивающие аспекты данных способов описаны ниже.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления с помощью способов, представленных в данном документе, можно получить культуру клеток с плотностью жизнеспособных клеток более 20×106 клеток/мл, более 25×106 клеток/мл, более 30×106 клеток/мл, более 35×106 клеток/мл, более 40×106 клеток/мл, более 45×106 клеток/мл, более 50×106 клеток/мл, более 55×106 клеток/мл, более 60×106 клеток/мл, более 65×106 клеток/мл, более 70×106 клеток/мл, более 75×106 клеток/мл, более 80×106 клеток/мл, более 85×106 клеток/мл, более 90×106 клеток/мл, более 95×106 клеток/мл, более 100×106 клеток/мл, более 105×106 клеток/мл, более 110×106 клеток/мл, более 115×106 клеток/мл, более 120×106 клеток/мл, более 125×106 клеток/мл, более 130×106 клеток/мл, более 135×106 клеток/мл, более 140×106 клеток/мл, более 145×106 клеток/мл, более 150×106 клеток/мл, более 155×106 клеток/мл, более 160×106 клеток/мл, более 165×106 клеток/мл, более 170×106 клеток/мл, более 175×106 клеток/мл, более 180×106 клеток/мл, более 185×106 клеток/мл, более 190×106 клеток/мл, более 195×106 клеток/мл, более 200×106 клеток/мл, более 205×106 клеток/мл, более 210×106 клеток/мл, более 215×106 клеток/мл, более 220×106 клеток/мл, более 225×106 клеток/мл, более 230×106 клеток/мл, более 235×106 клеток/мл, более 240×106 клеток/мл, более 245×106 клеток/мл или более 250×106 клеток/мл. Способы определения плотности жизнеспособных клеток в культуре клеток хорошо известны из уровня техники.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления с помощью способов, представленных в данном документе, получают культуру клеток с процентом жизнеспособных клеток, который составляет более 75% (например, более 80%, более 85% или более 90%) в течение периода культивирования по меньшей мере 5 дней (например, по меньшей 10 дней, по меньшей мере 15 дней, по меньшей мере 20 дней, по меньшей мере 25 дней, по меньшей мере 30 дней, по меньшей мере 35 дней, по меньшей мере 40 дней, по меньшей мере 45 дней, по меньшей мере 50 дней, по меньшей мере 55 дней, по меньшей мере 60 дней, по меньшей мере 65 дней или по меньше мере 70 дней).
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления c помощью способов, представленных в данном документе, можно получить культуру, характеризующуюся объемной продуктивностью (VPR) по меньшей мере 1,5 г/л/день (например, по меньшей мере 1,6 г/л/день, по меньшей мере 1,7 г/л/день, по меньшей мере 1,8 г/л/день, по меньшей мере 1,9 г/л/день, по меньшей мере 2,0 г/л/день, по меньшей мере 2,1 г/л/день, по меньшей мере 2,2 г/л/день, по меньшей мере 2,3 г/л/день, по меньшей мере 2,4 г/л/день, по меньшей мере 2,5 г/л/день, по меньшей мере 2,6 г/л/день, по меньшей мере 2,7 г/л/день, по меньшей мере 2,8 г/л/день, по меньшей мере 2,9 г/л/день, по меньшей мере 3,0 г/л/день, по меньшей мере 3,1 г/л/день, по меньшей мере 3,2 г/л/день, по меньшей мере 3,3 г/л/день, по меньшей мере 3,4 г/л/день, по меньшей мере 3,5 г/л/день, по меньшей мере 3,6 г/л/день, по меньшей мере 3,7 г/л/день, по меньшей мере 3,8 г/л/день, по меньшей мере 3,9 г/л/день, по меньшей мере 4,0 г/л/день, по меньшей мере 4,1 г/л/день, по меньшей мере 4,2 г/л/день, по меньшей мере 4,3 г/л/день, по меньшей мере 4,4 г/л/день или по меньшей мере 4,5 г/л/день) в течение по меньшей мере 5 дней (например, по меньшей мере 10 дней, по меньшей мере 15 дней, по меньшей мере 20 дней, по меньшей мере 25 дней, по меньшей мере 30 дней, по меньшей мере 35 дней, по меньшей мере 40 дней, по меньшей мере 45 дней, по меньшей мере 50 дней, по меньшей мере 55 дней, по меньшей мере 60 дней, по меньшей мере 65 дней или по меньшей мере 70 дней), начиная с любого момента времени во время периода культивирования.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления способы, представленные в данном документе, приводят к получению рекомбинантного белка, который после сбора характеризуется сниженным уровнем (например, снижение на приблизительно или менее 5%, снижение на приблизительно или менее 10%, снижение на приблизительно или менее 15%, снижение на приблизительно или менее 20%, снижение на приблизительно или менее 25%, снижение на приблизительно или менее 30%, снижение на приблизительно или менее 35%, снижение на приблизительно или менее 40%, снижение на приблизительно или менее 45%, снижение на приблизительно или менее 50%, снижение на приблизительно или менее 55%, снижение на приблизительно или менее 60%, снижение на приблизительно или менее 65%, снижение на приблизительно или менее 70%, снижение на приблизительно или менее 75%, снижение на приблизительно или менее 80%, снижение на приблизительно или менее 80%, снижение на приблизительно или менее 85% или снижение на приблизительно или менее 90%) расщепления (по сравнению с рекомбинантным белком, полученным с помощью подобного способа, который не включает культивирование в жидкой среде, содержащей 1,8 г/л или большее количество полоксамера-188). Уровень расщепления рекомбинантного белка, собранного из культуры клеток, можно определить, например, с помощью гель-электрофореза и/или иммуноблоттинга.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления способы приводят к получению культуры клеток, которая характеризуется удельной продуктивностью лактатдегидрогеназы менее 60 нЕД/клетка/день (например, менее 55 нЕД/клетка/день, менее 50 нЕД/клетка/день, менее 45 нЕД/клетка/день, менее 40 нЕД/клетка/день, менее 35 нЕД/клетка/день, менее 30 нЕД/клетка/день, менее 25 нЕД/клетка/день или менее 20 нЕД/клетка/день) в течение по меньшей мере приблизительно 5 (например, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50, по меньшей мере 55, по меньшей мере 60, по меньшей мере 65 или по меньшей мере 70) последовательных дней, начиная с любого момента времени в пределах периода культивирования.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления способы приводят к поддержанию клеток в равновесном состоянии (стационарной фазе) в течение по меньшей мере 5 дней (например, по меньшей мере 10 дней, по меньшей мере 15 дней, по меньшей мере 20 дней, по меньшей мере 25 дней, по меньшей мере 30 дней, по меньшей мере 35 дней, по меньшей мере 40 дней, по меньшей мере 45 дней или по меньшей мере 50 дней), например, при плотности жизнеспособных клеток приблизительно или более 30×106 клеток/мл, приблизительно или более 35×106 клеток/мл, приблизительно или более 40×106 клеток/мл, приблизительно или более 45×106 клеток/мл, приблизительно или более 50×106 клеток/мл, приблизительно или более 55×106 клеток/мл, приблизительно или более 60×106 клеток/мл, приблизительно или более 65×106 клеток/мл, приблизительно или более 70×106 клеток/мл, приблизительно или более 75×106 клеток/мл, приблизительно или более 80×106 клеток/мл, приблизительно или более 85×106 клеток/мл, приблизительно или более 90×106 клеток/мл, приблизительно или более 95×106 клеток/мл, приблизительно или более 100×106 клеток/мл, приблизительно или более 105×106 клеток/мл, приблизительно или более 110×106 клеток/мл, приблизительно или более 115×106 клеток/мл, приблизительно или более 120×106 клеток/мл, приблизительно или более 125×106 клеток/мл, приблизительно или более 130×106 клеток/мл, приблизительно или более 135×106 клеток/мл, приблизительно или более 140×106 клеток/мл, приблизительно или более 145×106 клеток/мл, приблизительно или более 150×106 клеток/мл, приблизительно или более 155×106 клеток/мл, приблизительно или более 160×106 клеток/мл, приблизительно или более 165×106 клеток/мл, приблизительно или более 170×106 клеток/мл, приблизительно или более 175×106 клеток/мл, приблизительно или более 180×106 клеток/мл, приблизительно или более 185×106 клеток/мл, приблизительно или более 190×106 клеток/мл, приблизительно или более 195×106 клеток/мл или приблизительно или более 200×106 клеток/мл.
Объемы культур
Стадия культивирования (например, стадия перфузионного культивирования) в любом из описанных способов может предусматривать инкубирование культуры клеток, имеющей объем от 20 л до приблизительно 8000 л (например, от приблизительно 20 л до приблизительно 7000 л, от приблизительно 20 л до приблизительно 6000 л, от приблизительно 20 л до приблизительно 5000 л, от приблизительно 20 л до приблизительно 4000 л, от приблизительно 20 л до приблизительно 3000 л, от приблизительно 20 л до приблизительно 2500 л, от приблизительно 20 л до приблизительно 2000 л, от приблизительно 20 л до приблизительно 1500 л, от приблизительно 20 л до приблизительно 1000 л, от приблизительно 20 л до приблизительно 500 л, от приблизительно 20 л до приблизительно 200 л, от приблизительно 20 л до приблизительно 100 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 8000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 7000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 6000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 5000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 4000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 3000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 2000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 1500 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 1000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 800 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 700 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 600 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 500 л,
от приблизительно 100 л до приблизительно 400 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 300 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 200 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 8000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 7000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 6000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 5000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 4000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 3000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 2000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 1500 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 1000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 750 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 8000 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 7000 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 6000 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 5000 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 4000 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 3000 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 2000 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 1500 л, от приблизительно 2000 л до приблизительно 8000 л, от приблизительно 2000 л до приблизительно 7000 л, от приблизительно 2000 л до приблизительно 6000 л, от приблизительно 2000 л до приблизительно 5000 л, от приблизительно 2000 л до приблизительно 4000 л, от приблизительно 2000 л до приблизительно 3000 л, от приблизительно 3000 л до приблизительно 8000 л,
от приблизительно 3000 л до приблизительно 7000 л, от приблизительно 3000 л до приблизительно 6000 л, от приблизительно 3000 л до приблизительно 5000 л, от приблизительно 3000 л до приблизительно 4000 л, от приблизительно 4000 л до приблизительно 8000 л, от приблизительно 4000 л до приблизительно 7000 л, от приблизительно 4000 л до приблизительно 6000 л, от приблизительно 4000 л до приблизительно 5000 л, от приблизительно 5000 л до приблизительно 8000 л, от приблизительно 5000 л до приблизительно 7000 л, от приблизительно 5000 л до приблизительно 6000 л, от приблизительно 6000 л до приблизительно 8000 л, от приблизительно 6000 л до приблизительно 7000 л или от приблизительно 7000 л или приблизительно 8000 л), в условиях, которые обеспечивают поддержание и пролиферацию клеток в культуре.
Как известно в данной области техники, объем культуры клеток может оставаться практически одинаковым или может повышаться с течением времени во время периода культивирования (например, как описано ниже).
Период культивирования
Культивирование (например, перфузионное культивирование) в любом из способов, описанных в данном документе, можно выполнять в течение периода времени от приблизительно 3 дней до приблизительно 100 дней (например, от приблизительно 3 дней до приблизительно 95 дней, от приблизительно 3 дней до приблизительно 90 дней, от приблизительно 3 дней до приблизительно 85 дней, от приблизительно 3 дней до приблизительно 80 дней, от приблизительно 3 дней до приблизительно 75 дней, от приблизительно 3 дней до приблизительно 70 дней, от приблизительно 3 дней до приблизительно 65 дней, от приблизительно 3 дней до приблизительно 60 дней, от приблизительно 3 дней до приблизительно 55 дней, от приблизительно 3 дней до приблизительно 50 дней, от приблизительно 3 дней до приблизительно 45 дней, от приблизительно 3 дней до приблизительно 40 дней, от приблизительно 3 дней до приблизительно 35 дней, от приблизительно 3 дней до приблизительно 30 дней, от приблизительно 3 дней до приблизительно 25 дней, от приблизительно 3 дней до приблизительно 20 дней, от приблизительно 3 дней до приблизительно 15 дней, от приблизительно 3 дней до приблизительно 10 дней, от приблизительно 5 дней до приблизительно 100 дней, от приблизительно 5 дней до приблизительно 95 дней,
от приблизительно 5 дней до приблизительно 90 дней, от приблизительно 5 дней до приблизительно 85 дней, от приблизительно 5 дней до приблизительно 80 дней, от приблизительно 5 дней до приблизительно 75 дней, от приблизительно 5 дней до приблизительно 70 дней, от приблизительно 5 дней до приблизительно 65 дней, от приблизительно 5 дней до приблизительно 60 дней, от приблизительно 5 дней до приблизительно 55 дней, от приблизительно 5 дней до приблизительно 50 дней, от приблизительно 5 дней до приблизительно 45 дней, от приблизительно 5 дней до приблизительно 40 дней, от приблизительно 5 дней до приблизительно 35 дней, от приблизительно 5 дней до приблизительно 30 дней, от приблизительно 5 дней до приблизительно 25 дней, от приблизительно 5 дней до приблизительно 20 дней, от приблизительно 5 дней до приблизительно 15 дней, от приблизительно 5 дней до приблизительно 10 дней, от приблизительно 10 дней до приблизительно 100 дней, от приблизительно 10 дней до приблизительно 95 дней, от приблизительно 10 дней до приблизительно 90 дней, от приблизительно 10 дней до приблизительно 85 дней, от приблизительно 10 дней до приблизительно 80 дней, от приблизительно 10 дней до приблизительно 75 дней, от приблизительно 10 дней до приблизительно 70 дней, от приблизительно 10 дней до приблизительно 65 дней, от приблизительно 10 дней до приблизительно 60 дней, от приблизительно 10 дней до приблизительно 55 дней, от приблизительно 10 дней до приблизительно 50 дней, от приблизительно 10 дней до приблизительно 45 дней, от приблизительно 10 дней до приблизительно 40 дней, от приблизительно 10 дней до приблизительно 35 дней, от приблизительно 10 дней до приблизительно 30 дней,
от приблизительно 10 дней до приблизительно 25 дней, от приблизительно 10 дней до приблизительно 20 дней, от приблизительно 10 дней до приблизительно 15 дней, от приблизительно 15 дней до приблизительно 100 дней, от приблизительно 15 дней до приблизительно 95 дней, от приблизительно 15 дней до приблизительно 90 дней, от приблизительно 15 дней до приблизительно 85 дней, от приблизительно 15 дней до приблизительно 80 дней, от приблизительно 15 дней до приблизительно 75 дней, от приблизительно 15 дней до приблизительно 70 дней, от приблизительно 15 дней до приблизительно 65 дней, от приблизительно 15 дней до приблизительно 60 дней, от приблизительно 15 дней до приблизительно 55 дней, от приблизительно 15 дней до приблизительно 50 дней, от приблизительно 15 дней до приблизительно 45 дней, от приблизительно 15 дней до приблизительно 40 дней, от приблизительно 15 дней до приблизительно 35 дней, от приблизительно 15 дней до приблизительно 30 дней, от приблизительно 15 дней до приблизительно 25 дней, от приблизительно 15 дней до приблизительно 20 дней, от приблизительно 20 дней до приблизительно 100 дней, от приблизительно 20 дней до приблизительно 95 дней,
от приблизительно 20 дней до приблизительно 90 дней, от приблизительно 20 дней до приблизительно 85 дней, от приблизительно 20 дней до приблизительно 80 дней, от приблизительно 20 дней до приблизительно 75 дней, от приблизительно 20 дней до приблизительно 70 дней, от приблизительно 20 дней до приблизительно 65 дней, от приблизительно 20 дней до приблизительно 60 дней, от приблизительно 20 дней до приблизительно 55 дней, от приблизительно 20 дней до приблизительно 50 дней, от приблизительно 20 дней до приблизительно 45 дней, от приблизительно 20 дней до приблизительно 40 дней, от приблизительно 20 дней до приблизительно 35 дней, от приблизительно 20 дней до приблизительно 30 дней, от приблизительно 20 дней до приблизительно 25 дней, от приблизительно 25 дней до приблизительно 100 дней, от приблизительно 25 дней до приблизительно 95 дней, от приблизительно 25 дней до приблизительно 90 дней, от приблизительно 25 дней до приблизительно 85 дней, от приблизительно 25 дней до приблизительно 80 дней, от приблизительно 25 дней до приблизительно 75 дней, от приблизительно 25 дней до приблизительно 70 дней, от приблизительно 25 дней до приблизительно 65 дней, от приблизительно 25 дней до приблизительно 60 дней, от приблизительно 25 дней до приблизительно 55 дней,
от приблизительно 25 дней до приблизительно 50 дней, от приблизительно 25 дней до приблизительно 45 дней, от приблизительно 25 дней до приблизительно 40 дней, от приблизительно 25 дней до приблизительно 35 дней, от приблизительно 25 дней до приблизительно 30 дней, от приблизительно 30 дней до приблизительно 100 дней, от приблизительно 30 дней до приблизительно 90 дней, от приблизительно 30 дней до приблизительно 80 дней, от приблизительно 30 дней до приблизительно 70 дней, от приблизительно 30 дней до приблизительно 60 дней, от приблизительно 30 дней до приблизительно 50 дней, от приблизительно 30 дней до приблизительно 40 дней, от приблизительно 40 дней до приблизительно 100 дней, от приблизительно 40 дней до приблизительно 90 дней, от приблизительно 40 дней до приблизительно 80 дней, от приблизительно 40 дней до приблизительно 70 дней, от приблизительно 40 дней до приблизительно 60 дней, от приблизительно 40 дней до приблизительно 50 дней, от приблизительно 50 дней до приблизительно 100 дней, от приблизительно 50 дней до приблизительно 90 дней, от приблизительно 50 дней до приблизительно 80 дней, от приблизительно 50 дней до приблизительно 70 дней, от приблизительно 50 дней до приблизительно 60 дней, от приблизительно 60 дней до приблизительно 100 дней, от приблизительно 60 дней до приблизительно 90 дней, от приблизительно 60 дней до приблизительно 80 дней, от приблизительно 60 дней до приблизительно 70 дней, от приблизительно 70 дней до приблизительно 100 дней, от приблизительно 70 дней до приблизительно 90 дней, от приблизительно 70 дней до приблизительно 80 дней, от приблизительно 80 дней до приблизительно 100 дней, от приблизительно 80 дней до приблизительно 90 дней или от приблизительно 90 дней до приблизительно 100 дней).
Клетки млекопитающего
Клеткой млекопитающего, культивируемой (например, перфузионно культивируемой) согласно способам, представленным в данном документе, может быть клетка, которая растет в суспензии, или адгезивная клетка. Неограничивающие примеры клеток млекопитающего, которые можно культивировать согласно любому из способов, описанных в данном документе, включают клетки яичника китайского хомячка (СНО) (например, клетки СНО DG44 или клетки CHO-K1s), Sp2.0, клетки миеломы (например, NS/0), В-клетки, клетки гибридомы, Т-клетки, клетки эмбриональной почки человека (НЕК) (например, НЕК 293E и НЕК 293F), эпителиальные клетки почки африканской зеленой мартышки (клетки Vero), клетку NSO, клетку почти новорожденного хомячка (BHK), клетку PerC6, клетки Vero, клетку HT-1080 и эпителиальные клетки почки Madin-Darby собаки (кокер-спаниель) (клетки MDCK). В некоторых примерах, где культивируют адгезивную клетку, культура также может содержать множество микроносителей (например, микроносителей, которые содержат одну или несколько пор). Дополнительные клетки млекопитающего, которые можно культивировать согласно любому из способов, описанных в данном документе, известны из уровня техники.
Клетка млекопитающего может содержать рекомбинантную нуклеиновую кислоту (например, нуклеиновую кислоту, стабильно интегрированную в геном клетки млекопитающего), которая кодирует рекомбинантный белок. Неограничивающие примеры рекомбинантных нуклеиновых кислот, которые кодируют иллюстративные рекомбинантные белки, описаны ниже, как и рекомбинантные белки, которые можно получить с применением способов, описанных в данном документе. В некоторых случаях клетку млекопитающего, которую культивируют в биореакторе (например, в любом из биореакторов, описанных в данном документе), получили из более крупной культуры.
Нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный белок, можно вводит в клетку млекопитающего с применением целого ряда способов, известных в области молекулярной биологии и молекулярной генетики. Неограничивающие примеры включают трансфекцию (например, липофекцию), трансдукцию (например, инфекцию лентивирусом, аденовирусом или ретровирусом) и электропорацию. В некоторых случаях нуклеиновая кислота, которая кодирует рекомбинантный белок, не интегрирована стабильно в хромосому клетки млекопитающего (транзиентная трансфекция), тогда как в других случаях эта нуклеиновая кислота интегрирована в хромосому. В качестве альтернативы или дополнения, нуклеиновая кислота, кодирующая рекомбинантный белок, может находится в плазмиде и/или в искусственной хромосоме млекопитающего (например, человеческой искусственной хромосоме). В качестве альтернативы или дополнения, нуклеиновую кислоту можно вводить в клетку с применением вирусного вектора (например, лентивирусного, ретровирусного или аденовирусного векторов). Нуклеиновая кислота может быть функционально связана с последовательностью промотора (например, сильного промотора, такого как промотор β-актина и промотор CMV, или индуцируемого промотора). Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, может при необходимости также содержать селектируемый маркер (например ген, который придает клетке млекопитающего устойчивость к гигромицину, пуромицину или неомицину).
В некоторых случаях рекомбинантный белок является секретируемым белком и высвобождается клеткой млекопитающего во внеклеточную среду (например, первую и/или вторую жидкую среду при перфузионном культивировании или первую жидкую среду и/или подпиточную жидкую среду при культивировании с периодической подпиткой). Например, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая растворимый рекомбинантный белок, может содержать последовательность, которая кодирует сигнальный пептид для секреции на N- или С-конце рекомбинантного белка, который отщепляется ферментом, присутствующим в клетке млекопитающего, и затем высвобождается во внеклеточную среду (например, первую и/или вторую жидкую среду).
Биореакторы
Стадию культивирования в любом из способов, описанных в данном документе, можно выполнять с применением биореактора (например, перфузионного биореактора или биореактора периодического действия с подпиткой). Биореактор (например, перфузионный биореактор или биореактор периодического действия с подпиткой), применяемый для выполнения стадии культивирования, может иметь внутренний объем (емкость) от приблизительно 24 л до приблизительно 25000 л (например, от приблизительно 24 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 15000 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 10000 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 9500 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 9000 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 8500 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 8000 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 7500 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 7000 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 6500 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 6000 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 5500 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 5000 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 4500 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 4000 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 3500 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 3000 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 2500 л,
от приблизительно 24 л до приблизительно 2000 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 1500 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 1000 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 900 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 800 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 700 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 600 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 500 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 400 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 300 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 200 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 100 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 25000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 15000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 10000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 9500 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 9000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 8500 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 8000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 7500 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 7000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 6500 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 6000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 5500 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 5000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 4500 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 4000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 3500 л,
от приблизительно 100 л до приблизительно 3000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 2500 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 2000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 1500 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 1000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 900 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 800 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 700 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 600 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 500 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 400 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 300 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 200 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 25000 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 15000 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 10000 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 9500 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 9000 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 8500 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 8000 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 7500 л,
от приблизительно 200 л до приблизительно 7000 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 6500 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 6000 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 5500 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 5000 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 4500 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 4000 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 3500 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 3000 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 2500 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 2000 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 1500 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 1000 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 900 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 800 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 700 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 600 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 500 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 400 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 300 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 25000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 15000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 10000 л,
от приблизительно 500 л до приблизительно 9500 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 9000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 8500 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 8000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 7500 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 7000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 6500 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 6000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 5500 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 5000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 4500 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 4000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 3500 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 3000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 2500 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 2000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 1500 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 1000 л,
от приблизительно 500 л до приблизительно 900 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 800 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 700 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 600 л,
от приблизительно 1000 л до приблизительно 25000 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 15000 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 10000 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 9500 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 9000 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 8500 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 8000 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 7500 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 7000 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 6500 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 6000 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 5500 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 5000 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 4500 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 4000 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 3500 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 3000 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 2500 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 2000 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 1500 л, от приблизительно 2000 л
до приблизительно 25000 л, от приблизительно 2000 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 2000 л до приблизительно 15000 л, от приблизительно 2000 л до приблизительно 10000 л, от приблизительно 2000 л до приблизительно 9500 л, от приблизительно 2000 л до приблизительно 9000 л, от приблизительно 2000 л до приблизительно 8500 л, от приблизительно 2000 л до приблизительно 8000 л, от приблизительно 2000 л до приблизительно 7500 л, от приблизительно 2000 л до приблизительно 7000 л, от приблизительно 2000 л до приблизительно 6500 л, от приблизительно 2000 л до приблизительно 6000 л, от приблизительно 2000 л до приблизительно 5500 л, от приблизительно 2000 л до приблизительно 5000 л, от приблизительно 2000 л до приблизительно 4500 л, от приблизительно 2000 л до приблизительно 4000 л, от приблизительно 2000 л до приблизительно 3500 л, от приблизительно 2000 л до приблизительно 3000 л, от приблизительно 2000 л до приблизительно 2500 л, от приблизительно 3000 л до приблизительно 25000 л,
от приблизительно 3000 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 3000 л до приблизительно 15000 л, от приблизительно 3000 л до приблизительно 10000 л, от приблизительно 3000 л до приблизительно 9500 л, от приблизительно 3000 л до приблизительно 9000 л, от приблизительно 3000 л до приблизительно 8500 л, от приблизительно 3000 л до приблизительно 8000 л, от приблизительно 3000 л до приблизительно 7500 л, от приблизительно 3000 л до приблизительно 7000 л, от приблизительно 3000 л до приблизительно 6500 л, от приблизительно 3000 л до приблизительно 6000 л, от приблизительно 3000 л до приблизительно 5500 л, от приблизительно 3000 л до приблизительно 5000 л, от приблизительно 3000 л до приблизительно 4500 л, от приблизительно 3000 л до приблизительно 4000 л, от приблизительно 3000 л до приблизительно 3500 л, от приблизительно 4000 л до приблизительно 9000 л, от приблизительно 4000 л до приблизительно 25000 л, от приблизительно 4000 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 4000 л до приблизительно 15000 л, от приблизительно 4000 л до приблизительно 10000 л,
от приблизительно 4000 л до приблизительно 9500 л, от приблизительно 4000 л до приблизительно 9000 л, от приблизительно 4000 л до приблизительно 8500 л, от приблизительно 4000 л до приблизительно 8000 л, от приблизительно 4000 л до приблизительно 7500 л, от приблизительно 4000 л до приблизительно 7000 л, от приблизительно 4000 л до приблизительно 6500 л, от приблизительно 4000 л до приблизительно 6000 л, от приблизительно 4000 л до приблизительно 5500 л, от приблизительно 4000 л до приблизительно 5000 л, от приблизительно 4000 л до приблизительно 4500 л, от приблизительно 5000 л до приблизительно 25000 л, от приблизительно 5000 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 5000 л до приблизительно 15000 л, от приблизительно 5000 л до приблизительно 10000 л, от приблизительно 5000 л до приблизительно 9500 л, от приблизительно 5000 л до приблизительно 9000 л, от приблизительно 5000 л до приблизительно 8500 л, от приблизительно 5000 л до приблизительно 8000 л, от приблизительно 5000 л до приблизительно 7500 л, от приблизительно 5000 л до приблизительно 7000 л, от приблизительно 5000 л до приблизительно 6500 л, от приблизительно 5000 л до приблизительно 6000 л, от приблизительно 5000 л
до приблизительно 5500 л, от приблизительно 6000 л до приблизительно 25000 л, от приблизительно 6000 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 6000 л до приблизительно 15000 л, от приблизительно 6000 л до приблизительно 10000 л, от приблизительно 6000 л до приблизительно 9500 л, от приблизительно 6000 л до приблизительно 9000 л, от приблизительно 6000 л до приблизительно 8500 л, от приблизительно 6000 л до приблизительно 8000 л, от приблизительно 6000 л до приблизительно 7500 л, от приблизительно 6000 л до приблизительно 7000 л, от приблизительно 6000 л до приблизительно 6500 л, от приблизительно 7000 л до приблизительно 25000 л, от приблизительно 7000 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 7000 л до приблизительно 15000 л, от приблизительно 7000 л до приблизительно 10000 л, от приблизительно 7000 л до приблизительно 9500 л, от приблизительно 7000 л до приблизительно 9000 л, от приблизительно 7000 л до приблизительно 8500 л, от приблизительно 7000 л до приблизительно 8000 л,
от приблизительно 7000 л до приблизительно 7500 л, от приблизительно 8000 л до приблизительно 25000 л, от приблизительно 8000 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 8000 л до приблизительно 15000 л, от приблизительно 8000 л до приблизительно 10000 л, от приблизительно 8000 л до приблизительно 9500 л, от приблизительно 8000 л до приблизительно 9000 л, от приблизительно 8000 л до приблизительно 8500 л, от приблизительно 9000 л до приблизительно 25000 л, от приблизительно 9000 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 9000 л до приблизительно 15000 л, от приблизительно 9000 л до приблизительно 10000 л, от приблизительно 9000 л до приблизительно 9500 л, от приблизительно 10000 л до приблизительно 25000 л, от приблизительно 10000 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 10000 л до приблизительно 15000 л, от приблизительно 15000 л до приблизительно 25000 л, от приблизительно 15000 л до приблизительно 20000 л или от приблизительно 20000 л до приблизительно 25000 л).
Системы культивирования
В некоторых из способов, описанных в данном документе, применяют систему культивирования (например, систему перфузионного культивирования), которая включает в себя сосуд, жидкую среду, помещенную в сосуд (например, любую из культуральных сред, описанных в данном документе), и барботер, помещенный в сосуд, содержащий множество пор, предназначенных для распределения газа через барботер в жидкую среду. Сосуд может иметь внутренний объем (емкость) от приблизительно 24 л до приблизительно 20000 л (например, от приблизительно 24 л до приблизительно 15000 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 10000 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 9500 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 9000 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 8500 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 8000 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 7500 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 7000 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 6500 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 6000 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 5500 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 5000 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 4500 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 4000 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 3500 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 3000 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 2500 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 2000 л,
от приблизительно 24 л до приблизительно 1500 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 1000 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 900 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 800 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 700 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 600 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 500 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 400 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 300 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 200 л, от приблизительно 24 л до приблизительно 100 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 15000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 10000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 9500 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 9000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 8500 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 8000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 7500 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 7000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 6500 л,
от приблизительно 100 л до приблизительно 6000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 5500 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 5000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 4500 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 4000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 3500 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 3000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 2500 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 2000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 1500 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 1000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 900 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 800 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 700 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 600 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 500 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 400 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 300 л,
от приблизительно 100 л до приблизительно 200 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 15000 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 10000 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 9500 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 9000 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 8500 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 8000 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 7500 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 7000 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 6500 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 6000 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 5500 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 5000 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 4500 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 4000 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 3500 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 3000 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 2500 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 2000 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 1500 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 1000 л,
от приблизительно 200 л до приблизительно 900 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 800 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 700 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 600 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 500 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 400 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 300 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 15000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 10000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 9500 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 9000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 8500 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 8000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 7500 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 7000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 6500 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 6000 л,
от приблизительно 500 л до приблизительно 5500 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 5000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 4500 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 4000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 3500 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 3000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 2500 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 2000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 1500 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 1000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 900 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 800 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 700 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 600 л,
от приблизительно 1000 л до приблизительно 25000 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 15000 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 10000 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 9500 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 9000 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 8500 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 8000 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 7500 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 7000 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 6500 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 6000 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 5500 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 5000 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 4500 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 4000 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 3500 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 3000 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 2500 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 2000 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 1500 л, от приблизительно 2000 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 2000 л до приблизительно 15000 л,
от приблизительно 2000 л до приблизительно 10000 л, от приблизительно 2000 л до приблизительно 9500 л, от приблизительно 2000 л до приблизительно 9000 л, от приблизительно 2000 л до приблизительно 8500 л, от приблизительно 2000 л до приблизительно 8000 л, от приблизительно 2000 л до приблизительно 7500 л, от приблизительно 2000 л до приблизительно 7000 л, от приблизительно 2000 л до приблизительно 6500 л, от приблизительно 2000 л до приблизительно 6000 л, от приблизительно 2000 л до приблизительно 5500 л, от приблизительно 2000 л до приблизительно 5000 л, от приблизительно 2000 л до приблизительно 4500 л, от приблизительно 2000 л до приблизительно 4000 л, от приблизительно 2000 л до приблизительно 3500 л, от приблизительно 2000 л до приблизительно 3000 л, от приблизительно 2000 л до приблизительно 2500 л, от приблизительно 3000 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 3000 л до приблизительно 15000 л, от приблизительно 3000 л до приблизительно 10000 л, от приблизительно 3000 л до приблизительно 9500 л, от приблизительно 3000 л до приблизительно 9000 л, от приблизительно 3000 л до приблизительно 8500 л, от приблизительно 3000 л до приблизительно 8000 л, от приблизительно 3000 л до приблизительно 7500 л, от приблизительно 3000 л до приблизительно 7000 л, от приблизительно 3000 л до приблизительно 6500 л, от приблизительно 3000 л до приблизительно 6000 л, от приблизительно 3000 л до приблизительно 5500 л, от приблизительно 3000 л до приблизительно 5000 л, от приблизительно 3000 л до приблизительно 4500 л, от приблизительно 3000 л до приблизительно 4000 л, от приблизительно 3000 л до приблизительно 3500 л, от приблизительно 4000 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 4000 л
до приблизительно 15000 л, от приблизительно 4000 л до приблизительно 10000 л, от приблизительно 4000 л до приблизительно 9500 л, от приблизительно 4000 л до приблизительно 9000 л, от приблизительно 4000 л до приблизительно 8500 л, от приблизительно 4000 л до приблизительно 8000 л, от приблизительно 4000 л до приблизительно 7500 л, от приблизительно 4000 л до приблизительно 7000 л, от приблизительно 4000 л до приблизительно 6500 л, от приблизительно 4000 л до приблизительно 6000 л, от приблизительно 4000 л до приблизительно 5500 л, от приблизительно 4000 л до приблизительно 5000 л, от приблизительно 4000 л до приблизительно 4500 л, от приблизительно 5000 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 5000 л до приблизительно 15000 л, от приблизительно 5000 л до приблизительно 10000 л, от приблизительно 5000 л до приблизительно 9500 л, от приблизительно 5000 л до приблизительно 9000 л, от приблизительно 5000 л до приблизительно 8500 л, от приблизительно 5000 л до приблизительно 8000 л, от приблизительно 5000 л до приблизительно 7500 л, от приблизительно 5000 л до приблизительно 7000 л, от приблизительно 5000 л до приблизительно 6500 л, от приблизительно 5000 л до приблизительно 6000 л, от приблизительно 5000 л до приблизительно 5500 л, от приблизительно 6000 л до приблизительно 20000 л,
от приблизительно 6000 л до приблизительно 10000 л, от приблизительно 6000 л до приблизительно 9500 л, от приблизительно 6000 л до приблизительно 9000 л, от приблизительно 6000 л до приблизительно 8500 л, от приблизительно 6000 л до приблизительно 8000 л, от приблизительно 6000 л до приблизительно 7500 л, от приблизительно 6000 л до приблизительно 7000 л, от приблизительно 6000 л до приблизительно 6500 л, от приблизительно 7000 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 7000 л до приблизительно 15000 л, от приблизительно 7000 л до приблизительно 10000 л, от приблизительно 7000 л до приблизительно 9500 л, от приблизительно 7000 л до приблизительно 9000 л, от приблизительно 7000 л до приблизительно 8500 л, от приблизительно 7000 л до приблизительно 8000 л, от приблизительно 7000 л до приблизительно 7500 л, от приблизительно 8000 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 8000 л
до приблизительно 15000 л, от приблизительно 8000 л до приблизительно 10000 л, от приблизительно 8000 л до приблизительно 9500 л, от приблизительно 8000 л до приблизительно 9000 л, от приблизительно 8000 л до приблизительно 8500 л, от приблизительно 9000 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 9000 л до приблизительно 15000 л, от приблизительно 9000 л до приблизительно 10000 л, от приблизительно 9000 л до приблизительно 9500 л, от приблизительно 10000 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 10000 л до приблизительно 15000 л или от приблизительно 15000 л до приблизительно 20000 л). Сосуд может быть изготовлен из металла (например, нержавеющий стали), пластика, или стекла, или любой их комбинации.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления одна или несколько пор барботера могут характеризоваться размером пор от приблизительно 750 мкм до приблизительно 1,5 мм (например, от приблизительно 750 мкм до приблизительно 1,45 мм, от приблизительно 750 мкм до приблизительно 1,4 мм, от приблизительно 750 мкм до приблизительно 1,35 мм, от приблизительно 750 мкм до приблизительно 1,3 мм, от приблизительно 750 мкм до приблизительно 1,25 мм, от приблизительно 750 мкм до приблизительно 1,2 мм, от приблизительно 750 мкм до приблизительно 1,15 мм, от приблизительно 750 мкм до приблизительно 1,1 мм, от приблизительно 750 мкм до приблизительно 1,05 мм, от приблизительно 750 мкм до приблизительно 1,0 мм, от приблизительно 750 мкм до приблизительно 950 мкм, от приблизительно 750 мкм до приблизительно 900 мкм, от приблизительно 750 мкм до приблизительно 850 мкм, от приблизительно 750 мкм до приблизительно 800 мкм, от приблизительно 800 мкм до приблизительно 1,5 мм, от приблизительно 800 мкм до приблизительно 1,45 мм, от приблизительно 800 мкм
до приблизительно 1,4 мм, от приблизительно 800 мкм до приблизительно 1,35 мм, от приблизительно 800 мкм до приблизительно 1,3 мм, от приблизительно 800 мкм до приблизительно 1,25 мм, от приблизительно 800 мкм до приблизительно 1,2 мм, от приблизительно 800 мкм до приблизительно 1,15 мм, от приблизительно 800 мкм до приблизительно 1,1 мм, от приблизительно 800 мкм до приблизительно 1,05 мм, от приблизительно 800 мкм до приблизительно 1,0 мм, от приблизительно 800 мкм до приблизительно 950 мкм, от приблизительно 800 мкм до приблизительно 900 мкм, от приблизительно 800 мкм до приблизительно 850 мкм, от приблизительно 850 мкм до приблизительно 1,5 мм, от приблизительно 850 мкм до приблизительно 1,45 мм, от приблизительно 850 мкм до приблизительно 1,4 мм, от приблизительно 850 мкм до приблизительно 1,35 мм, от приблизительно 850 мкм до приблизительно 1,3 мм, от приблизительно 850 мкм до приблизительно 1,25 мм, от приблизительно 850 мкм
до приблизительно 1,2 мм, от приблизительно 850 мкм до приблизительно 1,15 мм, от приблизительно 850 мкм до приблизительно 1,1 мм, от приблизительно 850 мкм до приблизительно 1,05 мм, от приблизительно 850 мкм до приблизительно 1,0 мм, от приблизительно 850 мкм до приблизительно 950 мкм, от приблизительно 850 мкм до приблизительно 900 мкм, от приблизительно 900 мкм до приблизительно 1,5 мм, от приблизительно 900 мкм до приблизительно 1,45 мм, от приблизительно 900 мкм до приблизительно 1,4 мм, от приблизительно 900 мкм до приблизительно 1,35 мм, от приблизительно 900 мкм до приблизительно 1,3 мм, от приблизительно 900 мкм до приблизительно 1,25 мм, от приблизительно 900 мкм до приблизительно 1,2 мм, от приблизительно 900 мкм до приблизительно 1,15 мм, от приблизительно 900 мкм до приблизительно 1,1 мм, от приблизительно 900 мкм до приблизительно 1,05 мм, от приблизительно 900 мкм до приблизительно 1,0 мм, от приблизительно 900 мкм до приблизительно 950 мкм, от приблизительно 950 мкм до приблизительно 1,5 мм, от приблизительно 950 мкм до приблизительно 1,45 мм, от приблизительно 950 мкм до приблизительно 1,4 мм, от приблизительно 950 мкм до приблизительно 1,35 мм, от приблизительно 950 мкм до приблизительно 1,3 мм, от приблизительно 950 мкм до приблизительно 1,25 мм, от приблизительно 950 мкм до приблизительно 1,2 мм, от приблизительно 950 мкм до приблизительно 1,15 мм, от приблизительно 950 мкм до приблизительно 1,1 мм, от приблизительно 950 мкм до приблизительно 1,05 мм, от приблизительно 950 мкм до приблизительно 1,0 мм, от приблизительно 1,0 мм до приблизительно 1,5 мм, от приблизительно 1,0 мм до приблизительно 1,45 мм, от приблизительно 1,0 мм до приблизительно 1,4 мм, от приблизительно 1,0 мм до приблизительно 1,35 мм, от приблизительно 1,0 мм до приблизительно 1,3 мм, от приблизительно 1,0 мм до приблизительно 1,25 мм, от приблизительно 1,0 мм до приблизительно 1,2 мм, от приблизительно 1,0 мм до приблизительно 1,15 мм, от приблизительно 1,0 мм до приблизительно 1,1 мм, от приблизительно 1,0 мм до приблизительно 1,05 мм,
от приблизительно 1,05 мм до приблизительно 1,5 мм, от приблизительно 1,05 мм до приблизительно 1,45 мм, от приблизительно 1,05 мм до приблизительно 1,4 мм, от приблизительно 1,05 мм до приблизительно 1,35 мм, от приблизительно 1,05 мм до приблизительно 1,3 мм, от приблизительно 1,05 мм до приблизительно 1,25 мм, от приблизительно 1,05 мм до приблизительно 1,2 мм, от приблизительно 1,05 мм до приблизительно 1,15 мм, от приблизительно 1,05 мм до приблизительно 1,1 мм, от приблизительно 1,1 мм до приблизительно 1,5 мм, от приблизительно 1,1 мм до приблизительно 1,45 мм, от приблизительно 1,1 мм до приблизительно 1,4 мм, от приблизительно 1,1 мм до приблизительно 1,35 мм, от приблизительно 1,1 мм до приблизительно 1,3 мм, от приблизительно 1,1 мм до приблизительно 1,25 мм, от приблизительно 1,1 мм до приблизительно 1,2 мм, от приблизительно 1,1 мм до приблизительно 1,15 мм, от приблизительно 1,15 мм до приблизительно 1,5 мм, от приблизительно 1,15 мм до приблизительно 1,45 мм,
от приблизительно 1,15 мм до приблизительно 1,4 мм, от приблизительно 1,15 мм до приблизительно 1,35 мм, от приблизительно 1,15 мм до приблизительно 1,3 мм, от приблизительно 1,15 мм до приблизительно 1,25 мм, от приблизительно 1,15 мм до приблизительно 1,2 мм, от приблизительно 1,2 мм до приблизительно 1,5 мм, от приблизительно 1,2 мм до приблизительно 1,45 мм, от приблизительно 1,2 мм до приблизительно 1,4 мм, от приблизительно 1,2 мм до приблизительно 1,35 мм, от приблизительно 1,2 мм до приблизительно 1,3 мм, от приблизительно 1,2 мм до приблизительно 1,25 мм, от приблизительно 1,25 мм до приблизительно 1,5 мм, от приблизительно 1,25 мм до приблизительно 1,45 мм, от приблизительно 1,25 мм до приблизительно 1,4 мм, от приблизительно 1,25 мм до приблизительно 1,35 мм,
от приблизительно 1,25 мм до приблизительно 1,3 мм, от приблизительно 1,3 мм до приблизительно 1,5 мм, от приблизительно 1,3 мм до приблизительно 1,45 мм, от приблизительно 1,3 мм до приблизительно 1,4 мм, от приблизительно 1,3 мм до приблизительно 1,35 мм, от приблизительно 1,35 мм до приблизительно 1,5 мм, от приблизительно 1,35 мм до приблизительно 1,45 мм, от приблизительно 1,35 мм до приблизительно 1,4 мм, от приблизительно 1,4 мм до приблизительно 1,5 мм, от приблизительно 1,4 мм до приблизительно 1,45 мм или от приблизительно 1,45 мм до приблизительно 1,5 мм).
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления одна или несколько пор барботера могут характеризоваться размером пор от приблизительно 250 мкм до приблизительно 750 мкм (например, от приблизительно 250 мкм до приблизительно 700 мкм, от приблизительно 250 мкм до приблизительно 650 мкм, от приблизительно 250 мкм до приблизительно 600 мкм, от приблизительно 250 мкм до приблизительно 550 мкм, от приблизительно 250 мкм до приблизительно 500 мкм, от приблизительно 250 мкм до приблизительно 450 мкм, от приблизительно 250 мкм до приблизительно 400 мкм, от приблизительно 250 мкм до приблизительно 350 мкм, от приблизительно 250 мкм до приблизительно 300 мкм, от приблизительно 300 мкм до приблизительно 750 мкм, от приблизительно 300 мкм до приблизительно 650 мкм, от приблизительно 300 мкм до приблизительно 600 мкм, от приблизительно 300 мкм до приблизительно 550 мкм, от приблизительно 300 мкм до приблизительно 500 мкм, от приблизительно 300 мкм до приблизительно 450 мкм, от приблизительно 300 мкм до приблизительно 400 мкм,
от приблизительно 300 мкм до приблизительно 350 мкм, от приблизительно 350 мкм до приблизительно 750 мкм, от приблизительно 350 мкм до приблизительно 700 мкм, от приблизительно 350 мкм до приблизительно 650 мкм, от приблизительно 350 мкм до приблизительно 600 мкм, от приблизительно 350 мкм до приблизительно 550 мкм, от приблизительно 350 мкм до приблизительно 500 мкм, от приблизительно 350 мкм до приблизительно 450 мкм, от приблизительно 350 мкм до приблизительно 400 мкм, от приблизительно 400 мкм до приблизительно 750 мкм, от приблизительно 400 мкм до приблизительно 700 мкм, от приблизительно 400 мкм до приблизительно 650 мкм, от приблизительно 400 мкм до приблизительно 600 мкм, от приблизительно 400 мкм до приблизительно 550 мкм, от приблизительно 400 мкм до приблизительно 500 мкм, от приблизительно 400 мкм до приблизительно 450 мкм, от приблизительно 450 мкм до приблизительно 750 мкм, от приблизительно 450 мкм до приблизительно 700 мкм, от приблизительно 450 мкм до приблизительно 650 мкм, от приблизительно 450 мкм до приблизительно 600 мкм, от приблизительно 450 мкм до приблизительно 550 мкм, от приблизительно 450 мкм до приблизительно 500 мкм,
от приблизительно 500 мкм до приблизительно 750 мкм, от приблизительно 500 мкм до приблизительно 700 мкм, от приблизительно 500 мкм до приблизительно 650 мкм, от приблизительно 500 мкм до приблизительно 600 мкм, от приблизительно 500 мкм до приблизительно 550 мкм, от приблизительно 550 мкм до приблизительно 750 мкм, от приблизительно 550 мкм до приблизительно 700 мкм, от приблизительно 550 мкм до приблизительно 650 мкм, от приблизительно 550 мкм до приблизительно 600 мкм, от приблизительно 600 мкм до приблизительно 750 мкм, от приблизительно 600 мкм до приблизительно 700 мкм, от приблизительно 600 мкм до приблизительно 650 мкм, от приблизительно 650 мкм до приблизительно 750 мкм, от приблизительно 650 мкм до приблизительно 700 мкм или от приблизительно 700 мкм до приблизительно 750 мкм).
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления одна или несколько пор барботера могут характеризоваться размером пор от приблизительно 1 мкм до приблизительно 250 мкм (например, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 240 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 230 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 220 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 210 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 200 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 190 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 180 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 170 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 160 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 150 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 140 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 130 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 125 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 120 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 115 мкм,
от приблизительно 1 мкм до приблизительно 110 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 105 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 100 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 95 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 90 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 85 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 80 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 75 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 70 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 65 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 60 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 55 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 50 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 45 мкм,
от приблизительно 1 мкм до приблизительно 40 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 35 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 30 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 25 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 20 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 15 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 10 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 5 мкм, от приблизительно 10 мкм до приблизительно 250 мкм, от приблизительно 10 мкм до приблизительно 240 мкм, от приблизительно 10 мкм до приблизительно 230 мкм, от приблизительно 10 мкм до приблизительно 220 мкм, от приблизительно 10 мкм до приблизительно 210 мкм, от приблизительно 10 мкм до приблизительно 200 мкм, от приблизительно 10 мкм до приблизительно 190 мкм, от приблизительно 10 мкм до приблизительно 180 мкм, от приблизительно 10 мкм до приблизительно 170 мкм, от приблизительно 10 мкм до приблизительно 160 мкм, от приблизительно 10 мкм до приблизительно 150 мкм, от приблизительно 10 мкм до приблизительно 140 мкм, от приблизительно 10 мкм до приблизительно 130 мкм, от приблизительно 10 мкм до приблизительно 120 мкм, от приблизительно 10 мкм до приблизительно 110 мкм, от приблизительно 10 мкм до приблизительно 100 мкм, от приблизительно 10 мкм до приблизительно 90 мкм, от приблизительно 10 мкм до приблизительно 80 мкм, от приблизительно 10 мкм до приблизительно 70 мкм,
от приблизительно 10 мкм до приблизительно 60 мкм, от приблизительно 10 мкм до приблизительно 50 мкм, от приблизительно 10 мкм до приблизительно 40 мкм, от приблизительно 10 мкм до приблизительно 30 мкм, от приблизительно 10 мкм до приблизительно 20 мкм, от приблизительно 20 мкм до приблизительно 250 мкм, от приблизительно 20 мкм до приблизительно 240 мкм, от приблизительно 20 мкм до приблизительно 230 мкм, от приблизительно 20 мкм до приблизительно 220 мкм, от приблизительно 20 мкм до приблизительно 210 мкм, от приблизительно 20 мкм до приблизительно 200 мкм, от приблизительно 20 мкм до приблизительно 190 мкм, от приблизительно 20 мкм до приблизительно 180 мкм, от приблизительно 20 мкм до приблизительно 170 мкм, от приблизительно 20 мкм до приблизительно 160 мкм, от приблизительно 20 мкм до приблизительно 150 мкм, от приблизительно 20 мкм до приблизительно 140 мкм, от приблизительно 20 мкм до приблизительно 130 мкм, от приблизительно 20 мкм до приблизительно 120 мкм, от приблизительно 20 мкм до приблизительно 110 мкм, от приблизительно 20 мкм до приблизительно 100 мкм, от приблизительно 20 мкм до приблизительно 90 мкм, от приблизительно 20 мкм до приблизительно 80 мкм, от приблизительно 20 мкм до приблизительно 70 мкм,
от приблизительно 20 мкм до приблизительно 60 мкм, от приблизительно 20 мкм до приблизительно 50 мкм, от приблизительно 20 мкм до приблизительно 40 мкм, от приблизительно 20 мкм до приблизительно 30 мкм, от приблизительно 30 мкм до приблизительно 250 мкм, от приблизительно 30 мкм до приблизительно 240 мкм, от приблизительно 30 мкм до приблизительно 230 мкм, от приблизительно 30 мкм до приблизительно 220 мкм, от приблизительно 30 мкм до приблизительно 210 мкм, от приблизительно 30 мкм до приблизительно 200 мкм, от приблизительно 30 мкм до приблизительно 190 мкм, от приблизительно 30 мкм до приблизительно 180 мкм, от приблизительно 30 мкм до приблизительно 170 мкм, от приблизительно 30 мкм до приблизительно 160 мкм, от приблизительно 30 мкм до приблизительно 150 мкм, от приблизительно 30 мкм до приблизительно 140 мкм, от приблизительно 30 мкм до приблизительно 130 мкм, от приблизительно 30 мкм до приблизительно 120 мкм, от приблизительно 30 мкм до приблизительно 110 мкм, от приблизительно 30 мкм до приблизительно 110 мкм, от приблизительно 30 мкм до приблизительно 100 мкм, от приблизительно 30 мкм до приблизительно 90 мкм,
от приблизительно 30 мкм до приблизительно 80 мкм, от приблизительно 30 мкм до приблизительно 70 мкм, от приблизительно 30 мкм до приблизительно 60 мкм, от приблизительно 30 мкм до приблизительно 50 мкм, от приблизительно 30 мкм до приблизительно 40 мкм, от приблизительно 40 мкм до приблизительно 250 мкм, от приблизительно 40 мкм до приблизительно 240 мкм, от приблизительно 40 мкм до приблизительно 230 мкм, от приблизительно 40 мкм до приблизительно 220 мкм, от приблизительно 40 мкм до приблизительно 210 мкм, от приблизительно 40 мкм до приблизительно 200 мкм, от приблизительно 40 мкм до приблизительно 190 мкм, от приблизительно 40 мкм до приблизительно 180 мкм, от приблизительно 40 мкм до приблизительно 170 мкм, от приблизительно 40 мкм до приблизительно 160 мкм, от приблизительно 40 мкм до приблизительно 150 мкм, от приблизительно 40 мкм до приблизительно 140 мкм, от приблизительно 40 мкм до приблизительно 130 мкм, от приблизительно 40 мкм до приблизительно 120 мкм, от приблизительно 40 мкм до приблизительно 110 мкм,
от приблизительно 40 мкм до приблизительно 100 мкм, от приблизительно 40 мкм до приблизительно 90 мкм, от приблизительно 40 мкм до приблизительно 80 мкм, от приблизительно 40 мкм до приблизительно 70 мкм, от приблизительно 40 мкм до приблизительно 60 мкм, от приблизительно 40 мкм до приблизительно 50 мкм, от приблизительно 50 мкм до приблизительно 250 мкм, от приблизительно 50 мкм до приблизительно 240 мкм, от приблизительно 50 мкм до приблизительно 230 мкм, от приблизительно 50 мкм до приблизительно 220 мкм, от приблизительно 50 мкм до приблизительно 210 мкм, от приблизительно 50 мкм до приблизительно 200 мкм, от приблизительно 50 мкм до приблизительно 190 мкм, от приблизительно 50 мкм до приблизительно 180 мкм, от приблизительно 50 мкм до приблизительно 170 мкм, от приблизительно 50 мкм до приблизительно 160 мкм, от приблизительно 50 мкм до приблизительно 150 мкм, от приблизительно 50 мкм до приблизительно 140 мкм, от приблизительно 50 мкм до приблизительно 130 мкм, от приблизительно 50 мкм до приблизительно 120 мкм, от приблизительно 50 мкм до приблизительно 110 мкм, от приблизительно 50 мкм до приблизительно 100 мкм,
от приблизительно 50 мкм до приблизительно 90 мкм, от приблизительно 50 мкм до приблизительно 80 мкм, от приблизительно 50 мкм до приблизительно 70 мкм, от приблизительно 50 мкм до приблизительно 60 мкм, от приблизительно 60 мкм до приблизительно 250 мкм, от приблизительно 60 мкм до приблизительно 240 мкм, от приблизительно 60 мкм до приблизительно 230 мкм, от приблизительно 60 мкм до приблизительно 220 мкм, от приблизительно 60 мкм до приблизительно 210 мкм, от приблизительно 60 мкм до приблизительно 200 мкм, от приблизительно 60 мкм до приблизительно 190 мкм, от приблизительно 60 мкм до приблизительно 180 мкм, от приблизительно 60 мкм до приблизительно 170 мкм, от приблизительно 60 мкм до приблизительно 160 мкм, от приблизительно 60 мкм до приблизительно 150 мкм, от приблизительно 60 мкм до приблизительно 140 мкм, от приблизительно 60 мкм до приблизительно 130 мкм, от приблизительно 60 мкм до приблизительно 120 мкм, от приблизительно 60 мкм до приблизительно 110 мкм, от приблизительно 60 мкм до приблизительно 100 мкм, от приблизительно 60 мкм до приблизительно 90 мкм, от приблизительно 60 мкм до приблизительно 80 мкм,
от приблизительно 60 мкм до приблизительно 70 мкм, от приблизительно 70 мкм до приблизительно 250 мкм, от приблизительно 70 мкм до приблизительно 240 мкм, от приблизительно 70 мкм до приблизительно 230 мкм, от приблизительно 70 мкм до приблизительно 220 мкм, от приблизительно 70 мкм до приблизительно 210 мкм, от приблизительно 70 мкм до приблизительно 200 мкм, от приблизительно 70 мкм до приблизительно 190 мкм, от приблизительно 70 мкм до приблизительно 180 мкм, от приблизительно 70 мкм до приблизительно 170 мкм, от приблизительно 70 мкм до приблизительно 160 мкм, от приблизительно 70 мкм до приблизительно 150 мкм, от приблизительно 70 мкм до приблизительно 140 мкм, от приблизительно 70 мкм до приблизительно 130 мкм, от приблизительно 70 мкм до приблизительно 120 мкм, от приблизительно 70 мкм до приблизительно 110 мкм, от приблизительно 70 мкм до приблизительно 100 мкм, от приблизительно 70 мкм до приблизительно 90 мкм, от приблизительно 70 мкм до приблизительно 80 мкм, от приблизительно 80 мкм до приблизительно 250 мкм, от приблизительно 80 мкм до приблизительно 240 мкм, от приблизительно 80 мкм до приблизительно 230 мкм,
от приблизительно 80 мкм до приблизительно 220 мкм, от приблизительно 80 мкм до приблизительно 210 мкм, от приблизительно 80 мкм до приблизительно 200 мкм, от приблизительно 80 мкм до приблизительно 190 мкм, от приблизительно 80 мкм до приблизительно 180 мкм, от приблизительно 80 мкм до приблизительно 170 мкм, от приблизительно 80 мкм до приблизительно 160 мкм, от приблизительно 80 мкм до приблизительно 150 мкм, от приблизительно 80 мкм до приблизительно 140 мкм, от приблизительно 80 мкм до приблизительно 130 мкм, от приблизительно 80 мкм до приблизительно 120 мкм, от приблизительно 80 мкм до приблизительно 110 мкм, от приблизительно 80 мкм до приблизительно 100 мкм, от приблизительно 80 мкм до приблизительно 90 мкм, от приблизительно 90 мкм до приблизительно 250 мкм, от приблизительно 90 мкм до приблизительно 240 мкм, от приблизительно 90 мкм до приблизительно 230 мкм, от приблизительно 90 мкм до приблизительно 220 мкм, от приблизительно 90 мкм до приблизительно 210 мкм, от приблизительно 90 мкм до приблизительно 200 мкм,
от приблизительно 90 мкм до приблизительно 190 мкм, от приблизительно 90 мкм до приблизительно 180 мкм, от приблизительно 90 мкм до приблизительно 170 мкм, от приблизительно 90 мкм до приблизительно 160 мкм, от приблизительно 90 мкм до приблизительно 150 мкм, от приблизительно 90 мкм до приблизительно 140 мкм, от приблизительно 90 мкм до приблизительно 130 мкм, от приблизительно 90 мкм до приблизительно 120 мкм, от приблизительно 90 мкм до приблизительно 110 мкм, от приблизительно 90 мкм до приблизительно 100 мкм, от приблизительно 100 мкм до приблизительно 250 мкм, от приблизительно 100 мкм до приблизительно 240 мкм, от приблизительно 100 мкм до приблизительно 230 мкм, от приблизительно 100 мкм до приблизительно 220 мкм, от приблизительно 100 мкм до приблизительно 210 мкм, от приблизительно 100 мкм до приблизительно 200 мкм, от приблизительно 100 мкм до приблизительно 190 мкм, от приблизительно 100 мкм до приблизительно 180 мкм, от приблизительно 100 мкм до приблизительно 170 мкм, от приблизительно 100 мкм до приблизительно 160 мкм, от приблизительно 100 мкм до приблизительно 150 мкм, от приблизительно 100 мкм до приблизительно 140 мкм, от приблизительно 100 мкм до приблизительно 130 мкм, от приблизительно 100 мкм до приблизительно 120 мкм,
от приблизительно 100 мкм до приблизительно 110 мкм, от приблизительно 110 мкм до приблизительно 250 мкм, от приблизительно 110 мкм до приблизительно 240 мкм, от приблизительно 110 мкм до приблизительно 230 мкм, от приблизительно 110 мкм до приблизительно 220 мкм, от приблизительно 110 мкм до приблизительно 210 мкм, от приблизительно 110 мкм до приблизительно 200 мкм, от приблизительно 100 мкм до приблизительно 190 мкм, от приблизительно 100 мкм до приблизительно 180 мкм, от приблизительно 100 мкм до приблизительно 170 мкм, от приблизительно 100 мкм до приблизительно 160 мкм, от приблизительно 100 мкм до приблизительно 150 мкм, от приблизительно 100 мкм до приблизительно 140 мкм, от приблизительно 100 мкм до приблизительно 130 мкм, от приблизительно 100 мкм до приблизительно 120 мкм, от приблизительно 100 мкм до приблизительно 110 мкм, от приблизительно 110 мкм до приблизительно 250 мкм, от приблизительно 110 мкм до приблизительно 240 мкм, от приблизительно 110 мкм до приблизительно 230 мкм, от приблизительно 110 мкм до приблизительно 220 мкм, от приблизительно 110 мкм до приблизительно 210 мкм, от приблизительно 110 мкм до приблизительно 200 мкм, от приблизительно 110 мкм до приблизительно 190 мкм, от приблизительно 110 мкм до приблизительно 180 мкм,
от приблизительно 110 мкм до приблизительно 170 мкм, от приблизительно 110 мкм до приблизительно 160 мкм, от приблизительно 110 мкм до приблизительно 150 мкм, от приблизительно 110 мкм до приблизительно 140 мкм, от приблизительно 110 мкм до приблизительно 130 мкм, от приблизительно 110 мкм до приблизительно 120 мкм, от приблизительно 120 мкм до приблизительно 250 мкм, от приблизительно 120 мкм до приблизительно 240 мкм, от приблизительно 120 мкм до приблизительно 230 мкм, от приблизительно 120 мкм до приблизительно 220 мкм, от приблизительно 120 мкм до приблизительно 210 мкм, от приблизительно 120 мкм до приблизительно 200 мкм, от приблизительно 120 мкм до приблизительно 190 мкм, от приблизительно 120 мкм до приблизительно 180 мкм, от приблизительно 120 мкм до приблизительно 170 мкм, от приблизительно 120 мкм до приблизительно 160 мкм, от приблизительно 120 мкм до приблизительно 150 мкм, от приблизительно 120 мкм до приблизительно 140 мкм, от приблизительно 120 мкм до приблизительно 130 мкм, от приблизительно 130 мкм до приблизительно 250 мкм, от приблизительно 130 мкм до приблизительно 240 мкм, от приблизительно 130 мкм до приблизительно 230 мкм, от приблизительно 130 мкм до приблизительно 220 мкм, от приблизительно 130 мкм до приблизительно 210 мкм, от приблизительно 130 мкм до приблизительно 200 мкм, от приблизительно 130 мкм до приблизительно 190 мкм,
от приблизительно 130 мкм до приблизительно 180 мкм, от приблизительно 130 мкм до приблизительно 170 мкм, от приблизительно 130 мкм до приблизительно 160 мкм, от приблизительно 130 мкм до приблизительно 150 мкм, от приблизительно 130 мкм до приблизительно 140 мкм, от приблизительно 140 мкм до приблизительно 250 мкм, от приблизительно 140 мкм до приблизительно 240 мкм, от приблизительно 140 мкм до приблизительно 230 мкм, от приблизительно 140 мкм до приблизительно 220 мкм, от приблизительно 140 мкм до приблизительно 210 мкм, от приблизительно 140 мкм до приблизительно 200 мкм, от приблизительно 140 мкм до приблизительно 190 мкм, от приблизительно 140 мкм до приблизительно 180 мкм, от приблизительно 140 мкм до приблизительно 170 мкм, от приблизительно 140 мкм до приблизительно 160 мкм, от приблизительно 140 мкм до приблизительно 150 мкм, от приблизительно 150 мкм до приблизительно 250 мкм, от приблизительно 150 мкм до приблизительно 240 мкм, от приблизительно 150 мкм до приблизительно 230 мкм, от приблизительно 150 мкм до приблизительно 220 мкм, от приблизительно 150 мкм до приблизительно 210 мкм, от приблизительно 150 мкм до приблизительно 200 мкм,
от приблизительно 150 мкм до приблизительно 190 мкм, от приблизительно 150 мкм до приблизительно 180 мкм, от приблизительно 150 мкм до приблизительно 170 мкм, от приблизительно 150 мкм до приблизительно 160 мкм, от приблизительно 160 мкм до приблизительно 250 мкм, от приблизительно 160 мкм до приблизительно 240 мкм, от приблизительно 160 мкм до приблизительно 230 мкм, от приблизительно 160 мкм до приблизительно 220 мкм, от приблизительно 160 мкм до приблизительно 210 мкм, от приблизительно 160 мкм до приблизительно 200 мкм, от приблизительно 160 мкм до приблизительно 190 мкм, от приблизительно 160 мкм до приблизительно 180 мкм, от приблизительно 160 мкм до приблизительно 170 мкм, от приблизительно 170 мкм до приблизительно 250 мкм, от приблизительно 170 мкм до приблизительно 240 мкм, от приблизительно 170 мкм до приблизительно 230 мкм, от приблизительно 170 мкм до приблизительно 220 мкм, от приблизительно 170 мкм до приблизительно 210 мкм, от приблизительно 170 мкм до приблизительно 200 мкм, от приблизительно 170 мкм до приблизительно 190 мкм,
от приблизительно 170 мкм до приблизительно 180 мкм, от приблизительно 180 мкм до приблизительно 250 мкм, от приблизительно 180 мкм до приблизительно 240 мкм, от приблизительно 180 мкм до приблизительно 230 мкм, от приблизительно 180 мкм до приблизительно 220 мкм, от приблизительно 180 мкм до приблизительно 210 мкм, от приблизительно 180 мкм до приблизительно 200 мкм, от приблизительно 180 мкм до приблизительно 190 мкм, от приблизительно 190 мкм до приблизительно 250 мкм, от приблизительно 190 мкм до приблизительно 240 мкм, от приблизительно 190 мкм до приблизительно 230 мкм, от приблизительно 190 мкм до приблизительно 220 мкм, от приблизительно 190 мкм до приблизительно 210 мкм, от приблизительно 190 мкм до приблизительно 200 мкм,
от приблизительно 200 мкм до приблизительно 250 мкм, от приблизительно 200 мкм до приблизительно 240 мкм, от приблизительно 200 мкм до приблизительно 230 мкм, от приблизительно 200 мкм до приблизительно 220 мкм, от приблизительно 200 мкм до приблизительно 210 мкм, от приблизительно 210 мкм до приблизительно 250 мкм, от приблизительно 210 мкм до приблизительно 240 мкм, от приблизительно 210 мкм до приблизительно 230 мкм, от приблизительно 210 мкм до приблизительно 220 мкм, от приблизительно 220 мкм до приблизительно 250 мкм, от приблизительно 220 мкм до приблизительно 240 мкм, от приблизительно 220 мкм до приблизительно 230 мкм, от приблизительно 230 мкм до приблизительно 250 мкм, от приблизительно 230 мкм до приблизительно 240 мкм или от приблизительно 240 мкм до приблизительно 250 мкм).
Одна или несколько пор барботера могут характеризоваться типом пор, представляющим собой, например, пору, полученную в результате перфорации, или пору, полученную в результате спекания. Система культивирования может содержать устройство для перемешивания жидкой среды, помещенной в сосуд (например, импеллер и ротор, который вращает импеллер). Сосуд может содержать один или несколько патрубков (и необязательно насосов), которые обеспечивают возможность добавления материала (например, жидкой среды, полоксамера-188, основания или кислоты (при необходимости регулирования pH) и/или пеногасителя) к жидкой среде, помещенной в сосуд, и/или удаления жидкой среды (например, осветленной жидкой среды или образца культуры клеток). Система культивирования может также содержать один или несколько датчиков для контроля pH, растворен. O2, температуры и растворен. CO2 в жидкой среде во время периода культивирования. Система культивирования может включать в себя фильтрационное устройство (например, устройство, в котором осуществляется фильтрация с переменным тангенциальным потоком или фильтрация с тангенциальным потоком), с помощью которого обрабатывается объем культуры клеток с получением осветленной жидкой среды, которая, по сути, не содержит клеток. Система культивирования может содержать нагревательное/охлаждающее устройство, которое обеспечивает возможность регулирования температуры жидкой среды, помещенной в сосуд. Дополнительные характеристики систем культивирования клеток хорошо известны из уровня техники.
Перфузионное культивирование
В любом из способов, описанных в данном документе, стадией культивирования может быть перфузионное культивирование. Как известно в данной области техники, перфузионное культивирование включает удаление из биореактора первого объема первой жидкой среды и добавление в биореактор второго объема второй жидкой среды, где первый объем и второй объем являются приблизительно равными. Клетки млекопитающего удерживаются в биореакторе с помощью определенного устройства для удерживания клеток или посредством методик, таких как осаждение клеток в осадительном конусе.
Как известно в данной области техники, перфузионное культивирование отличается от культивирования с периодической подпиткой, и культуральные среды и/или условия культивирования, используемые при перфузионном культивировании, зачатую отличаются от используемых при культивировании с периодической подпиткой.
Удаление и добавление сред при перфузионном культивировании можно выполнять одновременно, или последовательно, или путем какого-либо комбинирования двух вышеперечисленных. Кроме того, удаление и добавление можно выполнять непрерывно, например, со скоростью, с которой удаляют и замещают объем, составляющий от 0,1% до 800%, от 1% до 700%, от 1% до 600%, от 1% и 500%, от 1% и 400%, от 1% до 350%, от 1% до 300%, от 1% до 250%, от 1% до 100%, от 100% до 200%, от 5% до 150%, от 10% до 50%, от 15% до 40%, от 8% до 80% или от 4% до 30% объема биореактора.
Первый объем первой удаляемой жидкой среды и второй объем второй добавляемой жидкой среды можно в некоторых случаях поддерживать примерно одинаковым в течение каждого 24-часового периода. Как известно в данной области техники, скорость, с которой удаляют первый объем первой жидкой среды (объем/единица времени), и скорость, с которой добавляют второй объем второй жидкой среды (объем/единица времени), могут варьировать, и они зависят от условий конкретной системы культивирования клеток. Скорость, с которой удаляют первый объем первой жидкой среды (объем/единица времени), и скорость, с которой добавляют второй объем второй жидкой среды (объем/единица времени), могут быть приблизительно одинаковыми или могут быть разными.
В качестве альтернативы, удаляемый и добавляемый объем можно изменять при постепенном повышении в течение каждого 24-часового периода. Например, объем первой удаляемой жидкой среды и объем второй добавляемой жидкой среды в течение каждого 24-часового периода можно повышать в течение периода культивирования. Объем можно повышать в течение периода культивирования от объема, который составляет от 0,5% до приблизительно 20% объема биореактора. Объем можно повышать в течение периода культивирования до объема, составляющего от приблизительно 25% до приблизительно 150% емкости биореактора или объема культуры клеток в начале периода культивирования.
В некоторых примерах способов, описанных в данном документе, спустя первые 48-96 часов периода культивирования в каждый 24-часовой период (в пределах периода культивирования) первый объем первой удаляемой жидкой среды и второй объем второй добавляемой жидкой среды составляет от приблизительно 10% до приблизительно 95%, от приблизительно 10% до приблизительно 20%, от приблизительно 20% до приблизительно 30%, от приблизительно 30% до приблизительно 40%, от приблизительно 40% до приблизительно 50%, от приблизительно 50% до приблизительно 60%, от приблизительно 60% до приблизительно 70%, от приблизительно 70% до приблизительно 80%, от приблизительно 80% до приблизительно 90%, от приблизительно 85% до приблизительно 95%, от приблизительно 60% до приблизительно 80% или приблизительно 70% объема культуры клеток в начале периода культивирования.
Квалифицированным специалистам-практикам будет понятно, что первая жидкая среда и вторая жидкая среда могут быть средами одного и того же типа. В других случаях, первая жидкая среда и вторая жидкая среда могут отличаться. Вторая жидкая среда может быть более концентрированной по отношению к одному или нескольким компонентам сред.
Первый объем первой жидкой среды можно удалять с помощью автоматической системы. Например, можно использовать систему фильтрации с переменным тангенциальным потоком. В качестве альтернативы, первый объем первой жидкой среды можно удалять посредством протекания или пропускания самотеком первого объема первой жидкой среды через стерильную мембрану с отсечением по молекулярной массе, которое исключает прохождение клетки млекопитающего. В качестве альтернативы, первый объем первой жидкой среды можно удалять путем остановки или значительного снижения скорости перемешивания в течение периода по меньшей мере 1 минуты, по меньшей мере 2 минут, 3 минут, 4 минут, 5 минут, 10 минут, 15 минут, 20 минут, 25 минут, 30 минут, 40 минут, 50 минут или 1 часа, и удаления или аспирации первого объема первой жидкой среды из верхней части биореактора.
Второй объем второй жидкой среды можно добавлять к первой жидкой среде, например, с помощью насоса. Вторую жидкую среду можно добавлять к первой жидкой среде вручную, например, путем пипетирования или впрыскивания второго объема второй жидкой среды непосредственно в первую жидкую среду, или автоматически.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления способы, описанные в данном документе, включают (необязательно обеспечение сосуда, содержащего клетки млекопитающего, помещенные в первую жидкую среду, и) инкубирование сосуда при перемешивании и в течение периода культивирования, составляющего по меньшей мере приблизительно 7 дней, при температуре от приблизительно 32°C до приблизительно 40°C; и спустя первые 48-96 часов периода культивирования удаление первого объема первой жидкой среды и добавление к первой жидкой среде второго объема второй жидкой среды непрерывным или периодическим способом, где первый и второй объемы являются приблизительно равными. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления спустя приблизительно первые 48-96 часов периода культивирования в каждый 24-часовой период первый объем удаляемой первой жидкой среды и второй объем добавляемой второй жидкой среды составляют от приблизительно 0,3x до приблизительно 10x объема первой жидкой среды или объема сосуда.
Некоторые примеры перфузионного культивирования включают инкубирование системы культивирования, содержащей первую жидкую среду, при перемешивании и в течение периода культивирования, составляющего по меньшей мере приблизительно 7 дней, при температуре от приблизительно 32°C до приблизительно 40°C; и спустя первые 48-96 часов периода культивирования удаление первого объема первой жидкой среды и добавление к первой жидкой среде второго объема второй жидкой среды непрерывным или периодическим способом.
Культивирование с периодической подпиткой
Стадия культивирования в способах, описанных в данном документе, может предусматривать культивирование с периодической подпиткой. Как известно в данной области техники, культивирование с периодической подпиткой включает постепенное или непрерывное добавление подпиточной жидкой среды в исходную культуру клеток без существенного или значительного удаления первой жидкой среды из культуры клеток. В некоторых случаях подпиточная жидкая среда является такой же, как и первая жидкая среда. Подпиточная среда может находиться либо в жидкой форме (подпиточная жидкая среда), либо в виде сухого порошка. В других случаях подпиточная жидкая среда представляет собой концентрированную форму первой жидкой среды и/или добавляется в виде сухого порошка.
Подпиточную жидкую среду можно добавлять к исходной культуре клеток в определенный момент времени или несколько моментов времени в течение периода культивирования. Например, подпиточную жидкую среду можно добавлять к исходной культуре клеток в момент времени, который составляет от 6 часов до 7 дней, от приблизительно 6 часов до приблизительно 6 дней, от приблизительно 6 часов до приблизительно 5 дней, от приблизительно 6 часов до приблизительно 4 дней, от приблизительно 6 часов до приблизительно 3 дней, от приблизительно 6 часов до приблизительно 2 дней, от приблизительно 6 часов до приблизительно 1 дня, от приблизительно 12 часов до приблизительно 7 дней, от приблизительно 12 часов до приблизительно 6 дней, от приблизительно 12 часов до приблизительно 5 дней, от приблизительно 12 часов до приблизительно 4 дней, от приблизительно 12 часов до приблизительно 3 дней, от приблизительно 12 часов до приблизительно 2 дней, от приблизительно 1 дня до приблизительно 7 дней, от приблизительно 1 дня до приблизительно 6 дней, от приблизительно 1 дня до приблизительно 5 дней, от приблизительно 1 дня до приблизительно 4 дней, от приблизительно 1 дня до приблизительно 3 дней, от приблизительно 1 дня до приблизительно 2 дней, от приблизительно 2 дней до приблизительно 7 дней, от приблизительно 2 дней до приблизительно 6 дней, от приблизительно 2 дней до приблизительно 5 дней, от приблизительно 2 дней до приблизительно 4 дней, от приблизительно 2 дней до приблизительно 3 дней, от приблизительно 3 дней до приблизительно 7 дней, от приблизительно 3 дней до приблизительно 6 дней, от приблизительно 3 дней до приблизительно 5 дней, от приблизительно 3 дней до приблизительно 4 дней, от приблизительно 4 дней до приблизительно 7 дней, от приблизительно 4 дней до приблизительно 6 дней, от приблизительно 4 дней до приблизительно 5 дней, от приблизительно 5 дней до приблизительно 7 дней или от приблизительно 5 дней до приблизительно 6 дней после начала периода культивирования.
Подпиточную жидкую среду можно непрерывно добавлять к исходной культуре клеток, или ее можно периодически (например, ежедневно) добавлять к исходной культуре клеток в течение периода культивирования. В некоторых примерах, если подпиточную жидкую среду периодически добавляют к исходной культуре клеток, то подпиточную жидкую среду можно добавлять один раз, два раза, три раза, четыре раза или пять раз. Объем подпиточной жидкой среды или количество подпиточной твердой среды, добавляемой к исходной культуре клеток, можно менять (например, повышать) в течение периода культивирования. Объем подпиточной жидкой среды, добавляемой к исходной культуре клеток за любой 24-часовой период в течение периода культивирования может представлять собой некоторую долю емкости биореактора. Объем подпиточной жидкой среды, добавляемой к исходной культуре клеток за любой 24-часовой период в течение периода культивирования, может составлять от 0,01X до приблизительно 0,3X (например, от приблизительно 0,01X до приблизительно 0,28X, от приблизительно 0,01X до приблизительно 0,26X, от приблизительно 0,01X до приблизительно 0,24X, от приблизительно 0,01X до приблизительно 0,22X, от приблизительно 0,01X до приблизительно 0,20X, от приблизительно 0,01X до приблизительно 0,18X, от приблизительно 0,01X до приблизительно 0,16X, от приблизительно 0,01X до приблизительно 0,14X, от приблизительно 0,01X до приблизительно 0,12X, от приблизительно 0,01X до приблизительно 0,10X, от приблизительно 0,01X до приблизительно 0,08X, от приблизительно 0,01X до приблизительно 0,06X, от приблизительно 0,01X до приблизительно 0,04X, от приблизительно 0,025X до приблизительно 0,3X, от приблизительно 0,025X до приблизительно 0,28X, от приблизительно 0,025X до приблизительно 0,26X, от приблизительно 0,025X до приблизительно 0,24X, от приблизительно 0,025X до приблизительно 0,22X, от приблизительно 0,025X до приблизительно 0,20X, от приблизительно 0,025X до приблизительно 0,18X, от приблизительно 0,025X до приблизительно 0,16X, от приблизительно 0,025X до приблизительно 0,14X, от приблизительно 0,025X до приблизительно 0,12X, от приблизительно 0,025X до приблизительно 0,10X, от приблизительно 0,025X до приблизительно 0,08X, от приблизительно 0,025X до приблизительно 0,06X,
от приблизительно 0,025X до приблизительно 0,04X, от приблизительно 0,05X до приблизительно 0,3X, от приблизительно 0,05X до приблизительно 0,28X, от приблизительно 0,05X до приблизительно 0,26X, от приблизительно 0,05X до приблизительно 0,24X, от приблизительно 0,05X до приблизительно 0,22X, от приблизительно 0,05X до приблизительно 0,20X, от приблизительно 0,05X до приблизительно 0,18X, от приблизительно 0,05X до приблизительно 0,16X, от приблизительно 0,05X до приблизительно 0,14X, от приблизительно 0,05X до приблизительно 0,12X, от приблизительно 0,05X до приблизительно 0,10X, от приблизительно 0,1X до приблизительно 0,3X, от приблизительно 0,1X до приблизительно 0,28X, от приблизительно 0,1X до приблизительно 0,26X, от приблизительно 0,1X до приблизительно 0,24X, от приблизительно 0,1X до приблизительно 0,22X, от приблизительно 0,1X до приблизительно 0,20X, от приблизительно 0,1X до приблизительно 0,18X, от приблизительно 0,1X до приблизительно 0,16X, от приблизительно 0,1X до приблизительно 0,14X, от приблизительно 0,1X, от приблизительно 0,15X до приблизительно 0,3X, от приблизительно 0,15X до приблизительно 0,2X, от приблизительно 0,2X до приблизительно 0,3X или от приблизительно 0,25X до приблизительно 0,3X) емкости биореактора, содержащего культуру.
В соответствии с другими вариантами осуществления объем подпиточной жидкой среды, добавляемой к исходной культуре клеток за любой 24-часовой период в течение периода культивирования, может составлять от 0,02X до приблизительно 1,0X (например, от приблизительно 0,02X до приблизительно 0,9X, от приблизительно 0,02X до приблизительно 0,8X, от приблизительно 0,02X до приблизительно 0,7X, от приблизительно 0,02X до приблизительно 0,6X, от приблизительно 0,02X до приблизительно 0,5X, от приблизительно 0,02X до приблизительно 0,4X, от приблизительно 0,02X до приблизительно 0,3X, от приблизительно 0,02X до приблизительно 0,2X, от приблизительно 0,02X до приблизительно 0,1X, от приблизительно 0,05X до приблизительно 1,0X, от приблизительно 0,05X до приблизительно 0,8X, от приблизительно 0,05X до приблизительно 0,7X, от приблизительно 0,05X до приблизительно 0,6X, от приблизительно 0,05X до приблизительно 0,5X, от приблизительно 0,05X до приблизительно 0,4X, от приблизительно 0,05X до приблизительно 0,3X, от приблизительно 0,05X до приблизительно 0,2X, от приблизительно 0,05X до приблизительно 0,1X, от приблизительно 0,1X до приблизительно 1,0X,
от приблизительно 0,1X до приблизительно 0,9X, от приблизительно 0,1X до приблизительно 0,8X, от приблизительно 0,1X до приблизительно 0,7X, от приблизительно 0,1X до приблизительно 0,6X, от приблизительно 0,1X до приблизительно 0,5X, от приблизительно 0,1X до приблизительно 0,4X, от приблизительно 0,1X до приблизительно 0,3X, от приблизительно 0,1X до приблизительно 0,2X, от приблизительно 0,2X до приблизительно 1,0X, от приблизительно 0,2X до приблизительно 0,9X, от приблизительно 0,2X до приблизительно 0,8X, от приблизительно 0,2X до приблизительно 0,7X, от приблизительно 0,2X до приблизительно 0,6X, от приблизительно 0,2X до приблизительно 0,5X или от приблизительно 0,2X до приблизительно 0,4X) объема культуры клеток в начале периода культивирования.
Полоксамер-188
Полоксамер-188 представляет собой молекулу, известную из уровня техники. Полоксамер-188 представляет собой неионный синтетический блок-сополимер этиленоксида и пропиленоксида. Полоксамер-188 имеет средний молекулярный вес от приблизительно 7680 до приблизительно 9510, и приблизительно 81,8% ± 1,9% его состава по весу представлено оксиэтиленом. Например, полоксамер-188 имеет структуру, изображенную в формуле I ниже, где a равняется 80, и b равняется 27. Полоксамер-188 имеет номер CAS 9003-11-6.
Полоксамер-188 коммерчески доступен от ряда различных поставщиков, в том числе, например, Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури), Mediatech, Inc. (Манассас, Виргиния), MAST Therapeutics, Inc. (Сан-Диего, Калифорния), EMD Millipore (Билерика, Массачусетс), BASF (Людвигсваген, Германия), от Life Technologies под названием Pluronic® F-68 (Карлсбад, Калифорния) и PhytoTechnology Laboratories, LLC (Шони-Мишн, Канзас).
Способы, представленные в данном документе, включают культивирование клетки млекопитающего (например, клетки млекопитающего, содержащей кодирующую рекомбинантный белок нуклеиновую кислоту) в жидкой среде, которая содержит полоксамер-188 в концентрации приблизительно 1,8 г/л или в концентрации более 1,8 г/л (например, концентрации приблизительно 1,9 г/л или концентрации более 1,9 г/л, концентрации приблизительно 2,0 г/л или концентрации более 2,0 г/л, концентрации приблизительно 2,1 г/л или концентрации более 2,1 г/л, концентрации приблизительно 2,2 г/л или концентрации более 2,2 г/л, концентрации приблизительно 2,3 г/л или концентрации более 2,3 г/л, концентрации приблизительно 2,4 г/л или концентрации более 2,4 г/л, концентрации приблизительно 2,5 г/л или концентрации более 2,5 г/л, концентрации приблизительно 2,6 г/л или концентрации более 2,6 г/л, концентрации приблизительно 2,7 г/л или концентрации более 2,7 г/л, концентрации приблизительно 2,8 г/л или концентрации более 2,8 г/л, концентрации приблизительно 2,9 г/л или концентрации более 2,9 г/л,
концентрации приблизительно 3,0 г/л или концентрации более 3,0 г/л, концентрации приблизительно 3,1 г/л или концентрации более 3,1 г/л, концентрации приблизительно 3,2 г/л или концентрации более 3,2 г/л, концентрации приблизительно 3,3 г/л или концентрации более 3,3 г/л, концентрации приблизительно 3,4 г/л или концентрации более 3,4 г/л, концентрации приблизительно 3,5 г/л или концентрации более 3,5 г/л, концентрации приблизительно 3,6 г/л или концентрации более 3,6 г/л, концентрации приблизительно 3,7 г/л или концентрации более 3,7 г/л, концентрации приблизительно 3,8 г/л или концентрации более 3,8 г/л, концентрации приблизительно 3,9 г/л или концентрации более 3,9 г/л, концентрации приблизительно 4,0 г/л или концентрации более 4,0 г/л, концентрации приблизительно 4,1 г/л или концентрации более 4,1 г/л, концентрации приблизительно 4,2 г/л или концентрации более 4,2 г/л, концентрации приблизительно 4,3 г/л или концентрации более 4,3 г/л, концентрации приблизительно 4,4 г/л или концентрации более 4,4 г/л, концентрации приблизительно 4,5 г/л или концентрации более 4,5 г/л,
концентрации приблизительно 4,6 г/л или концентрации более 4,6 г/л, концентрации приблизительно 4,7 г/л или концентрации более 4,7 г/л, концентрации приблизительно 4,8 г/л или концентрации более 4,8 г/л, концентрации приблизительно 4,9 г/л или концентрации более 4,9 г/л, концентрации приблизительно 5,0 г/л или концентрации более 5,0 г/л, концентрации приблизительно 5,1 г/л или концентрации более 5,1 г/л, концентрации приблизительно 5,2 г/л или концентрации более 5,2 г/л, концентрации приблизительно 5,3 г/л или концентрации более 5,3 г/л,
концентрации приблизительно 5,4 г/л или концентрации более 5,4 г/л, концентрации приблизительно 5,5 г/л или концентрации более 5,5 г/л, концентрации приблизительно 5,6 г/л или концентрации более 5,6 г/л, концентрации приблизительно 5,7 г/л или концентрации более 5,7 г/л, концентрации приблизительно 5,8 г/л или концентрации более 5,8 г/л, концентрации приблизительно 5,9 г/л или концентрации более 5,9 г/л, концентрации приблизительно 6,0 г/л или концентрации более 6,0 г/л, концентрации приблизительно 6,1 г/л или концентрации более 6,1 г/л, концентрации приблизительно 6,2 г/л или концентрации более 6,2 г/л, концентрации приблизительно 6,3 г/л или концентрации более 6,3 г/л, концентрации приблизительно 6,4 г/л или концентрации более 6,4 г/л, концентрации приблизительно 6,5 г/л или концентрации более 6,5 г/л, концентрации приблизительно 6,6 г/л или концентрации более 6,6 г/л, концентрации приблизительно 6,7 г/л или концентрации более 6,7 г/л, концентрации приблизительно 6,8 г/л или концентрации более 6,8 г/л, концентрации приблизительно 6,9 г/л или концентрации более 6,9 г/л,
концентрации приблизительно 7,0 г/л или концентрации более 7,0 г/л, концентрации приблизительно 7,1 г/л или концентрации более 7,1 г/л, концентрации приблизительно 7,2 г/л или концентрации более 7,2 г/л, концентрации приблизительно 7,3 г/л или концентрации более 7,3 г/л, концентрации приблизительно 7,4 г/л или концентрации более 7,4 г/л, концентрации приблизительно 7,5 г/л или концентрации более 7,5 г/л, концентрации приблизительно 7,6 г/л или концентрации более 7,6 г/л, концентрации приблизительно 7,7 г/л или концентрации более 7,7 г/л,
концентрации приблизительно 7,8 г/л или концентрации более 7,8 г/л, концентрации приблизительно 7,9 г/л или концентрации более 7,9 г/л, концентрации приблизительно 8,0 г/л или концентрации более 8,0 г/л, концентрации приблизительно 8,1 г/л или концентрации более 8,1 г/л, концентрации приблизительно 8,2 г/л или концентрации более 8,2 г/л, концентрации приблизительно 8,3 г/л или концентрации более 8,3 г/л, концентрации приблизительно 8,4 г/л или концентрации более 8,4 г/л, концентрации приблизительно 8,5 г/л или концентрации более 8,5 г/л, концентрации приблизительно 8,6 г/л или концентрации более 8,6 г/л, концентрации приблизительно 8,7 г/л или концентрации более 8,7 г/л, концентрации приблизительно 8,8 г/л или концентрации более 8,8 г/л, концентрации приблизительно 8,9 г/л или концентрации более 8,9 г/л, концентрации приблизительно 9,0 г/л или концентрации более 9,0 г/л, концентрации приблизительно 9,1 г/л или концентрации более 9,1 г/л, концентрации приблизительно 9,2 г/л или концентрации более 9,2 г/л, концентрации приблизительно 9,3 г/л или концентрации более 9,3 г/л,
концентрации приблизительно 9,4 г/л или концентрации более 9,4 г/л, концентрации приблизительно 9,5 г/л или концентрации более 9,5 г/л, концентрации приблизительно 9,6 г/л или концентрации более 9,6 г/л, концентрации приблизительно 9,7 г/л или концентрации более 9,7 г/л, концентрации приблизительно 9,8 г/л или концентрации более 9,8 г/л, концентрации приблизительно 9,9 г/л или концентрации более 9,9 г/л, концентрации приблизительно 10,0 г/л или концентрации более 10,0 г/л, концентрации приблизительно 10,1 г/л или концентрации более 10,1 г/л, концентрации приблизительно 10,2 г/л или концентрации более 10,2 г/л, концентрации приблизительно 10,3 г/л или концентрации более 10,3 г/л, концентрации приблизительно 10,4 г/л или концентрации более 10,4 г/л, концентрации приблизительно 10,5 г/л или концентрации более 10,5 г/л, концентрации приблизительно 10,6 г/л или концентрации более 10,6 г/л, концентрации приблизительно 10,7 г/л или концентрации более 10,7 г/л, концентрации приблизительно 10,8 г/л или концентрации более 10,8 г/л, концентрации приблизительно 10,9 г/л или концентрации более 10,9 г/л, концентрации приблизительно 11,0 г/л или концентрации более 11,0 г/л, концентрации приблизительно 11,1 г/л
или концентрации более 11,1 г/л, концентрации приблизительно 11,2 г/л или концентрации более 11,2 г/л, концентрации приблизительно 11,3 г/л или концентрации более 11,3 г/л, концентрации приблизительно 11,4 г/л или концентрации более 11,4 г/л, концентрации приблизительно 11,5 г/л или концентрации более 11,5 г/л, концентрации приблизительно 11,6 г/л или концентрации более 11,6 г/л, концентрации приблизительно 11,7 г/л или концентрации более 11,7 г/л, концентрации приблизительно 11,8 г/л или концентрации более 11,8 г/л, концентрации приблизительно 11,9 г/л или концентрации более 11,9 г/л, концентрации приблизительно 12,0 г/л или концентрации более 12,0 г/л, концентрации приблизительно 12,1 г/л или концентрации более 12,1 г/л, концентрации приблизительно 12,2 г/л или концентрации более 12,2 г/л, концентрации приблизительно 12,3 г/л или концентрации более 12,3 г/л, концентрации приблизительно 12,4 г/л или концентрации более 12,4 г/л, концентрации приблизительно 12,5 г/л или концентрации более 12,5 г/л, концентрации приблизительно 12,6 г/л или концентрации более 12,6 г/л, концентрации приблизительно 12,7 г/л или концентрации более 12,7 г/л, концентрации приблизительно 12,8 г/л
или концентрации более 12,8 г/л, концентрации приблизительно 12,9 г/л или концентрации более 12,9 г/л, концентрации приблизительно 13,0 г/л или концентрации более 13,0 г/л, концентрации приблизительно 13,1 г/л или концентрации более 13,1 г/л, концентрации приблизительно 13,2 г/л или концентрации более 13,2 г/л, концентрации приблизительно 13,3 г/л или концентрации более 13,3 г/л, концентрации приблизительно 13,4 г/л или концентрации более 13,4 г/л, концентрации приблизительно 13,5 г/л или концентрации более 13,5 г/л, концентрации приблизительно 13,6 г/л или концентрации более 13,6 г/л, концентрации приблизительно 13,7 г/л или концентрации более 13,7 г/л, концентрации приблизительно 13,8 г/л или концентрации более 13,8 г/л, концентрации приблизительно 13,9 г/л или концентрации более 13,9 г/л, концентрации приблизительно 14,0 г/л или концентрации более 14,0 г/л, концентрации приблизительно 14,1 г/л или концентрации более 14,1 г/л, концентрации приблизительно 14,2 г/л или концентрации более 14,2 г/л, концентрации приблизительно 14,3 г/л или концентрации более 14,3 г/л, концентрации приблизительно 14,4 г/л или концентрации более 14,4 г/л, концентрации приблизительно 14,5 г/л или концентрации более 14,5 г/л, концентрации приблизительно 14,6 г/л или концентрации более 14,6 г/л, концентрации приблизительно 14,7 г/л или концентрации более 14,7 г/л, концентрации приблизительно 14,8 г/л или концентрации более 14,8 г/л, концентрации приблизительно 14,9 г/л или концентрации более 14,9 г/л или концентрации приблизительно 15,0 г/л или концентрации более 15,0 г/л).
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления способы, представленные в данном документе, включают культивирование клетки млекопитающего (например, клетки млекопитающего, содержащей кодирующую рекомбинантный белок нуклеиновую кислоту) в жидкой среде, которая содержит полоксамер-188 в концентрации от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 16,0 г/л (например, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 15,8 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 15,6 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 15,4 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 15,2 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 14,8 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 14,6 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 14,4 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 14,2 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 14,0 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 13,8 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 13,6 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 13,4 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 13,2 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 13,0 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 12,8 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 12,6 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 12,4 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 12,2 г/л,
от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 12,0 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 11,8 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 11,6 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 11,4 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 11,2 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 11,0 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 10,8 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 10,6 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 10,4 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 10,2 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 10,0 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 9,8 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 9,6 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 9,4 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 9,2 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 9,0 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 8,8 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 8,6 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 8,4 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 8,2 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 8,0 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 7,8 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 7,6 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 7,4 г/л,
от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 7,2 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 7,0 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 6,8 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 6,6 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 6,4 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 6,2 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 6,0 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 5,8 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 5,6 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 5,4 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 5,2 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 5,0 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 4,8 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 4,6 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 4,4 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 4,2 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 4,0 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 3,8 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 3,6 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 3,4 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 3,2 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 3,0 г/л,
от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 2,8 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 15,8 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 15,6 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 15,4 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 15,2 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 14,8 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 14,6 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 14,4 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 14,2 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 14,0 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 13,8 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 13,6 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 13,4 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 13,2 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 13,0 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 12,8 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 12,6 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 12,4 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 12,2 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 12,0 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 11,8 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 11,6 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 11,4 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 11,2 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 11,0 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 10,8 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 10,6 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 10,4 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 10,2 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 10,0 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 9,8 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 9,6 г/л,
от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 9,4 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 9,2 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 9,0 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 8,8 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 8,6 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 8,4 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 8,2 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 8,0 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 7,8 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 7,6 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 7,4 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 7,2 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 7,0 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 6,8 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 6,6 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 6,4 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 6,2 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 6,0 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 5,8 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 5,6 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 5,4 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 5,2 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 5,0 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 4,8 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 4,6 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 4,4 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 4,2 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 4,0 г/л,
от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 3,8 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 3,6 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 3,4 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 3,2 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 3,0 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 15,8 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 15,6 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 15,4 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 15,2 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 14,8 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 14,6 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 14,4 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 14,2 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 14,0 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 13,8 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 13,6 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 13,4 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 13,2 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 13,0 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 12,8 г/л,
от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 12,6 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 12,4 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 12,2 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 12,0 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 11,8 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 11,6 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 11,4 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 11,2 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 11,0 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 10,8 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 10,6 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 10,4 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 10,2 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 10,0 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 9,8 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 9,6 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 9,4 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 9,2 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 9,0 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 8,8 г/л,
от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 8,6 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 8,4 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 8,2 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 8,0 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 7,8 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 7,6 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 7,4 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 7,2 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 7,0 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 6,9 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 6,8 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 6,6 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 6,4 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 6,2 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 6,0 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 5,8 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 5,6 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 5,4 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 5,2 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 5,0 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 4,8 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 4,6 г/л,
от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 4,4 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 4,2 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 4,0 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 3,8 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 3,6 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 3,4 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 3,2 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 15,8 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 15,6 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 15,4 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 15,2 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 14,8 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 14,6 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 14,4 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 14,2 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 14,0 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 13,8 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 13,6 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 13,4 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 13,2 г/л,
от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 13,0 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 12,8 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 12,6 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 12,4 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 12,2 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 12,0 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 11,8 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 11,6 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 11,4 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 11,2 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 11,0 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 10,8 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 10,6 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 10,4 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 10,2 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 10,0 г/л,
от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 9,8 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 9,6 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 9,4 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 9,2 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 9,0 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 8,8 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 8,6 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 8,4 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 8,2 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 8,0 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 7,8 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 7,6 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 7,4 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 7,2 г/л,
от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 7,0 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 6,9 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 6,8 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 6,6 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 6,4 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 6,2 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 6,0 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 5,8 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 5,6 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 5,4 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 5,2 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 5,0 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 4,8 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 4,6 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 4,4 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 4,2 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 4,0 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 3,8 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 3,6 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 3,4 г/л,
от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 15,8 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 15,6 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 15,4 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 15,2 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 14,8 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 14,6 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 14,4 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 14,2 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 14,0 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 13,8 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 13,6 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 13,4 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 13,2 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 13,0 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 12,8 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 12,6 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 12,4 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 12,2 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 12,0 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 11,8 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 11,6 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 11,4 г/л,
от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 11,2 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 11,0 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 10,8 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 10,6 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 10,4 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 10,2 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 10,0 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 9,8 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 9,6 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 9,4 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 9,2 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 9,0 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 8,8 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 8,6 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 8,4 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 8,2 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 8,0 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 7,8 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 7,6 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 7,4 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 7,2 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 7,0 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 6,9 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 6,8 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 6,6 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 6,4 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 6,2 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 6,0 г/л,
от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 5,8 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 5,6 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 5,4 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 5,2 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 5,0 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 4,8 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 4,6 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 4,4 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 4,2 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 4,0 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 3,8 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 3,6 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 15,8 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 15,6 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 15,4 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 15,2 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 14,8 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 14,6 г/л,
от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 14,4 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 14,2 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 14,0 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 13,8 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 13,6 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 13,4 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 13,2 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 13,0 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 12,8 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 12,6 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 12,4 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 12,2 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 12,0 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 11,8 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 11,6 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 11,4 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 11,2 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 11,0 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 10,8 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 10,6 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 10,4 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 10,2 г/л,
от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 10,0 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 9,8 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 9,6 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 9,4 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 9,2 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 9,0 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 8,8 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 8,6 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 8,4 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 8,2 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 8,0 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 7,8 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 7,6 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 7,4 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 7,2 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 7,0 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 6,9 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 6,8 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 6,6 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 6,4 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 6,2 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 6,0 г/л,
от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 5,8 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 5,6 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 5,4 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 5,2 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 5,0 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 4,8 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 4,6 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 4,4 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 4,2 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 4,0 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 3,8 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 15,8 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 15,6 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 15,4 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 15,2 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 14,8 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 14,6 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 14,4 г/л,
от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 14,2 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 14,0 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 13,8 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 13,6 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 13,4 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 13,2 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 13,0 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 12,8 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 12,6 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 12,4 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 12,2 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 12,0 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 11,8 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 11,6 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 11,4 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 11,2 г/л,
от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 11,0 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 10,8 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 10,6 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 10,4 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 10,2 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 10,0 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 9,8 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 9,6 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 9,4 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 9,2 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 9,0 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 8,8 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 8,6 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 8,4 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 8,2 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 8,0 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 7,8 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 7,6 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 7,4 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 7,2 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 7,0 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 6,9 г/л,
от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 6,8 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 6,6 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 6,4 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 6,2 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 6,0 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 5,8 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 5,6 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 5,4 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 5,2 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 5,0 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 4,8 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 4,6 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 4,4 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 4,2 г/л,
от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 4,0 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 15,8 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 15,6 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 15,4 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 15,2 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 14,8 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 14,6 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 14,4 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 14,2 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 14,0 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 13,8 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 13,6 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 13,4 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 13,2 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 13,0 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 12,8 г/л,
от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 12,6 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 12,4 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 12,2 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 12,0 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 11,8 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 11,6 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 11,4 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 11,2 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 11,0 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 10,8 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 10,6 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 10,4 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 10,2 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 10,0 г/л,
от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 9,8 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 9,6 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 9,4 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 9,2 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 9,0 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 8,8 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 8,6 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 8,4 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 8,2 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 8,0 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 7,8 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 7,6 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 7,4 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 7,2 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 7,0 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 6,9 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 6,8 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 6,6 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 6,4 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 6,2 г/л,
от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 6,0 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 5,8 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 5,6 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 5,4 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 5,2 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 5,0 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 4,8 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 4,6 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 4,4 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 4,2 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 15,8 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 15,6 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 15,4 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 15,2 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 14,8 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 14,6 г/л,
от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 14,4 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 14,2 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 14,0 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 13,8 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 13,6 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 13,4 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 13,2 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 13,0 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 12,8 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 12,6 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 12,4 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 12,2 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 12,0 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 11,8 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 11,6 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 11,4 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 11,2 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 11,0 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 10,8 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 10,6 г/л,
от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 10,4 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 10,2 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 10,0 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 9,8 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 9,6 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 9,4 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 9,2 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 9,0 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 8,8 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 8,6 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 8,4 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 8,2 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 8,0 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 7,8 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 7,6 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 7,4 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 7,2 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 7,0 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 6,9 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 6,8 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 6,6 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 6,4 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 6,2 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 6,0 г/л,
от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 5,8 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 5,6 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 5,4 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 5,2 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 5,0 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 4,8 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 4,6 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 4,4 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 15,8 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 15,6 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 15,4 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 15,2 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 14,8 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 14,6 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 14,4 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 14,2 г/л,
от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 14,0 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 13,8 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 13,6 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 13,4 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 13,2 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 13,0 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 12,8 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 12,6 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 12,4 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 12,2 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 12,0 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 11,8 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 11,6 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 11,4 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 11,2 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 11,0 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 10,8 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 10,6 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 10,4 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 10,2 г/л,
от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 10,0 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 9,8 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 9,6 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 9,4 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 9,2 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 9,0 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 8,8 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 8,6 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 8,4 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 8,2 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 8,0 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 7,8 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 7,6 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 7,4 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 7,2 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 7,0 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 6,9 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 6,8 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 6,6 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 6,4 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 6,2 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 6,0 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 5,8 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 5,6 г/л,
от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 5,4 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 5,2 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 5,0 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 4,8 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 4,6 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 15,8 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 15,6 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 15,4 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 15,2 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 14,8 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 14,6 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 14,4 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 14,2 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 14,0 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 13,8 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 13,6 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 13,4 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 13,2 г/л,
от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 13,0 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 12,8 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 12,6 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 12,4 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 12,2 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 12,0 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 11,8 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 11,6 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 11,4 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 11,2 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 11,0 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 10,8 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 10,6 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 10,4 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 10,2 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 10,0 г/л,
от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 9,8 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 9,6 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 9,4 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 9,2 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 9,0 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 8,8 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 8,6 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 8,4 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 8,2 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 8,0 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 7,8 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 7,6 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 7,4 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 7,2 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 7,0 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 6,9 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 6,8 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 6,6 г/л,
от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 6,4 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 6,2 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 6,0 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 5,8 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 5,6 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 5,4 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 5,2 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 5,0 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 4,8 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 15,8 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 15,6 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 15,4 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 15,2 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 14,8 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 14,6 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 14,4 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 14,2 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 14,0 г/л,
от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 13,8 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 13,6 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 13,4 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 13,2 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 13,0 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 12,8 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 12,6 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 12,4 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 12,2 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 12,0 г/л,
от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 11,8 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 11,6 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 11,4 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 11,2 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 11,0 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 10,8 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 10,6 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 10,4 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 10,2 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 10,0 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 9,8 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 9,6 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 9,4 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 9,2 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 9,0 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 8,8 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 8,6 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 8,4 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 8,2 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 8,0 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 7,8 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 7,6 г/л,
от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 7,4 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 7,2 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 7,0 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 6,9 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 6,8 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 6,6 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 6,4 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 6,2 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 6,0 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 5,8 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 5,6 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 5,4 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 5,2 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 5,0 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 15,8 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 15,6 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 15,4 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 15,2 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 15,0 г/л,
от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 14,8 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 14,6 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 14,4 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 14,2 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 14,0 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 13,8 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 13,6 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 13,4 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 13,2 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 13,0 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 12,8 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 12,6 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 12,4 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 12,2 г/л,
от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 12,0 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 11,8 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 11,6 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 11,4 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 11,2 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 11,0 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 10,8 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 10,6 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 10,4 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 10,2 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 10,0 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 9,8 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 9,6 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 9,4 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 9,2 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 9,0 г/л,
от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 8,8 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 8,6 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 8,4 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 8,2 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 8,0 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 7,8 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 7,6 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 7,4 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 7,2 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 7,0 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 6,9 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 6,8 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 6,6 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 6,4 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 6,2 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 6,0 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 5,8 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 5,6 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 5,4 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 5,2 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 15,8 г/л,
от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 15,6 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 15,4 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 15,2 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 14,8 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 14,6 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 14,4 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 14,2 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 14,0 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 13,8 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 13,6 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 13,4 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 13,2 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 13,0 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 12,8 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 12,6 г/л,
от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 12,4 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 12,2 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 12,0 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 11,8 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 11,6 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 11,4 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 11,2 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 11,0 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 10,8 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 10,6 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 10,4 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 10,2 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 10,0 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 9,8 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 9,6 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 9,4 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 9,2 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 9,0 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 8,8 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 8,6 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 8,4 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 8,2 г/л,
от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 8,0 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 7,8 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 7,6 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 7,4 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 7,2 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 7,0 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 6,9 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 6,8 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 6,6 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 6,4 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 6,2 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 6,0 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 5,8 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 5,6 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 5,4 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 15,8 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 15,6 г/л,
от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 15,4 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 15,2 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 14,8 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 14,6 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 14,4 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 14,2 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 14,0 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 13,8 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 13,6 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 13,4 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 13,2 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 13,0 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 12,8 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 12,6 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 12,4 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 12,2 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 12,0 г/л,
от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 11,8 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 11,6 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 11,4 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 11,2 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 11,0 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 10,8 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 10,6 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 10,4 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 10,2 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 10,0 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 9,8 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 9,6 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 9,4 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 9,2 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 9,0 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 8,8 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 8,6 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 8,4 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 8,2 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 8,0 г/л,
от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 7,8 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 7,6 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 7,4 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 7,2 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 7,0 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 6,9 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 6,8 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 6,6 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 6,4 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 6,2 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 6,0 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 5,8 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 5,6 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 16,0 г/л,
от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 15,8 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 15,6 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 15,4 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 15,2 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 14,8 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 14,6 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 14,4 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 14,2 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 14,0 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 13,8 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 13,6 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 13,4 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 13,2 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 13,0 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 12,8 г/л,
от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 12,6 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 12,4 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 12,2 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 12,0 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 11,8 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 11,6 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 11,4 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 11,2 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 11,0 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 10,8 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 10,6 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 10,4 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 10,2 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 10,0 г/л,
от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 9,8 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 9,6 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 9,4 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 9,2 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 9,0 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 8,8 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 8,6 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 8,4 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 8,2 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 8,0 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 7,8 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 7,6 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 7,4 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 7,2 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 7,0 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 6,9 г/л,
от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 6,8 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 6,6 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 6,4 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 6,2 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 6,0 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 5,8 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 15,8 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 15,6 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 15,4 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 15,2 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 14,8 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 14,6 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 14,4 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 14,2 г/л,
от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 14,0 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 13,8 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 13,6 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 13,4 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 13,2 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 13,0 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 12,8 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 12,6 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 12,4 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 12,2 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 12,0 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 11,8 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 11,6 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 11,4 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 11,2 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 11,0 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 10,8 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 10,6 г/л,
от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 10,4 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 10,2 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 10,0 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 9,8 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 9,6 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 9,4 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 9,2 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 9,0 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 8,8 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 8,6 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 8,4 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 8,2 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 8,0 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 7,8 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 7,6 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 7,4 г/л,
от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 7,2 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 7,0 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 6,9 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 6,8 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 6,6 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 6,4 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 6,2 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 6,0 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 15,8 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 15,6 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 15,4 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 15,2 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 14,8 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 14,6 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 14,4 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 14,2 г/л,
от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 14,0 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 13,8 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 13,6 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 13,4 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 13,2 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 13,0 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 12,8 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 12,6 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 12,4 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 12,2 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 12,0 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 11,8 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 11,6 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 11,4 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 11,2 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 11,0 г/л,
от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 10,8 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 10,6 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 10,4 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 10,2 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 10,0 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 9,8 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 9,6 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 9,4 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 9,2 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 9,0 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 8,8 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 8,6 г/л,
от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 8,4 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 8,2 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 8,0 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 7,8 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 7,6 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 7,4 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 7,2 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 7,0 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 6,9 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 6,8 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 6,6 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 6,4 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 6,2 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 6,1 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 15,8 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 15,6 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 15,4 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 15,2 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 14,8 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 14,6 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 14,4 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 14,2 г/л,
от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 14,0 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 13,8 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 13,6 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 13,4 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 13,2 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 13,0 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 12,8 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 12,6 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 12,4 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 12,2 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 12,0 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 11,8 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 11,6 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 11,4 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 11,2 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 11,0 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 10,8 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 10,6 г/л,
от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 10,4 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 10,2 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 10,0 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 9,8 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 9,6 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 9,4 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 9,2 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 9,0 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 8,8 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 8,6 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 8,4 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 8,2 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 8,0 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 7,8 г/л,
от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 7,6 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 7,4 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 7,2 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 7,0 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 6,9 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 6,8 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 6,6 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 6,4 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 6,2 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 15,8 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 15,6 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 15,4 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 15,2 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 14,8 г/л,
от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 14,6 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 14,4 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 14,2 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 14,0 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 13,8 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 13,6 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 13,4 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 13,2 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 13,0 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 12,8 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 12,6 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 12,4 г/л,
от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 12,2 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 12,0 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 11,8 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 11,6 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 11,4 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 11,2 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 11,0 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 10,8 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 10,6 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 10,4 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 10,2 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 10,0 г/л,
от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 9,8 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 9,6 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 9,4 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 9,2 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 9,0 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 8,8 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 8,6 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 8,4 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 8,2 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 8,0 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 7,8 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 7,6 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 7,4 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 7,2 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 7,0 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 6,9 г/л,
от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 6,8 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 6,6 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 6,4 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 15,8 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 15,6 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 15,4 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 15,2 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 14,8 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 14,6 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 14,4 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 14,2 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 14,0 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 13,8 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 13,6 г/л,
от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 13,4 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 13,2 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 13,0 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 12,8 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 12,6 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 12,4 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 12,2 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 12,0 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 11,8 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 11,6 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 11,4 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 11,2 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 11,0 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 10,8 г/л,
от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 10,6 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 10,4 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 10,2 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 10,0 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 9,8 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 9,6 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 9,4 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 9,2 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 9,0 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 8,8 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 8,6 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 8,4 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 8,2 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 8,0 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 7,8 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 7,6 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 7,4 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 7,2 г/л,
от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 7,0 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 6,9 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 6,8 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 6,6 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 15,8 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 15,6 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 15,4 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 15,2 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 14,8 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 14,6 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 14,4 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 14,2 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 14,0 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 13,8 г/л,
от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 13,6 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 13,4 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 13,2 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 13,0 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 12,8 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 12,6 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 12,4 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 12,2 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 12,0 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 11,8 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 11,6 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 11,4 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 11,2 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 11,0 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 10,8 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 10,6 г/л,
от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 10,4 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 10,2 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 10,0 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 9,8 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 9,6 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 9,4 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 9,2 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 9,0 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 8,8 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 8,6 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 8,4 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 8,2 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 8,0 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 7,8 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 7,6 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 7,4 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 7,2 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 7,0 г/л,
от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 6,9 г/л, от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 6,8 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 15,8 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 15,6 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 15,4 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 15,2 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 14,8 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 14,6 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 14,4 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 14,2 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 14,0 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 13,8 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 13,6 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 13,4 г/л,
от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 13,2 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 13,0 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 12,8 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 12,6 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 12,4 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 12,2 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 12,0 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 11,8 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 11,6 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 11,4 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 11,2 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 11,0 г/л,
от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 10,8 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 10,6 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 10,4 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 10,2 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 10,0 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 9,8 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 9,6 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 9,4 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 9,2 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 9,0 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 8,8 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 8,6 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 8,4 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 8,2 г/л,
от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 8,0 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 7,8 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 7,6 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 7,4 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 7,2 г/л, от приблизительно 6,0 г/л до приблизительно 7,0 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 15,8 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 15,6 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 15,4 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 15,2 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 14,8 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 14,6 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 14,4 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 14,2 г/л,
от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 14,0 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 13,8 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 13,6 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 13,4 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 13,2 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 13,0 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 12,8 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 12,6 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 12,4 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 12,2 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 12,0 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 11,8 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 11,6 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 11,4 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 11,2 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 11,0 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 10,8 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 10,6 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 10,4 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 10,2 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 10,0 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 9,8 г/л,
от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 9,6 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 9,4 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 9,2 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 9,0 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 8,8 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 8,6 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 8,4 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 8,2 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 8,0 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 7,8 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 7,6 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 7,4 г/л, от приблизительно 6,2 г/л до приблизительно 7,2 г/л, от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 15,8 г/л, от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 15,6 г/л,
от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 15,4 г/л, от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 15,2 г/л, от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 14,8 г/л, от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 14,6 г/л, от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 14,4 г/л, от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 14,2 г/л, от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 14,0 г/л, от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 13,8 г/л, от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 13,6 г/л, от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 13,4 г/л, от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 13,2 г/л, от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 13,0 г/л, от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 12,8 г/л, от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 12,6 г/л, от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 12,4 г/л,
от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 12,2 г/л, от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 12,0 г/л, от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 11,8 г/л, от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 11,6 г/л, от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 11,4 г/л, от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 11,2 г/л, от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 11,0 г/л, от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 10,8 г/л, от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 10,6 г/л, от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 10,4 г/л, от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 10,2 г/л, от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 10,0 г/л, от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 9,8 г/л, от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 9,6 г/л, от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 9,4 г/л, от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 9,2 г/л, от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 9,0 г/л, от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 8,8 г/л,
от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 8,6 г/л, от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 8,4 г/л, от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 8,2 г/л, от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 8,0 г/л, от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 7,8 г/л, от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 7,6 г/л, от приблизительно 6,4 г/л до приблизительно 7,4 г/л, от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 15,8 г/л, от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 15,6 г/л, от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 15,4 г/л, от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 15,2 г/л, от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 14,8 г/л, от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 14,6 г/л, от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 14,4 г/л, от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 14,2 г/л, от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 14,0 г/л, от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 13,8 г/л, от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 13,6 г/л,
от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 13,4 г/л, от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 13,2 г/л, от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 13,0 г/л, от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 12,8 г/л, от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 12,6 г/л, от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 12,4 г/л, от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 12,2 г/л, от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 12,0 г/л, от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 11,8 г/л, от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 11,6 г/л, от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 11,4 г/л, от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 11,2 г/л, от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 11,0 г/л, от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 10,8 г/л, от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 10,6 г/л, от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 10,4 г/л, от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 10,2 г/л, от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 10,0 г/л,
от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 9,8 г/л, от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 9,6 г/л, от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 9,4 г/л, от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 9,2 г/л, от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 9,0 г/л, от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 8,8 г/л, от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 8,6 г/л, от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 8,4 г/л, от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 8,2 г/л, от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 8,0 г/л, от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 7,8 г/л, от приблизительно 6,6 г/л до приблизительно 7,6 г/л, от приблизительно 6,8 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 6,8 г/л до приблизительно 15,8 г/л,
от приблизительно 6,8 г/л до приблизительно 15,6 г/л, от приблизительно 6,8 г/л до приблизительно 15,4 г/л, от приблизительно 6,8 г/л до приблизительно 15,2 г/л, от приблизительно 6,8 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 6,8 г/л до приблизительно 14,8 г/л, от приблизительно 6,8 г/л до приблизительно 14,6 г/л, от приблизительно 6,8 г/л до приблизительно 14,4 г/л, от приблизительно 6,8 г/л до приблизительно 14,2 г/л, от приблизительно 6,8 г/л до приблизительно 14,0 г/л, от приблизительно 6,8 г/л до приблизительно 13,8 г/л, от приблизительно 6,8 г/л до приблизительно 13,6 г/л, от приблизительно 6,8 г/л до приблизительно 13,4 г/л, от приблизительно 6,8 г/л до приблизительно 13,2 г/л, от приблизительно 6,8 г/л до приблизительно 13,0 г/л, от приблизительно 6,8 г/л до приблизительно 12,8 г/л, от приблизительно 6,8 г/л до приблизительно 12,6 г/л,
от приблизительно 6,8 г/л до приблизительно 12,4 г/л, от приблизительно 6,8 г/л до приблизительно 12,2 г/л, от приблизительно 6,8 г/л до приблизительно 12,0 г/л, от приблизительно 6,8 г/л до приблизительно 11,8 г/л, от приблизительно 6,8 г/л до приблизительно 11,6 г/л, от приблизительно 6,8 г/л до приблизительно 11,4 г/л, от приблизительно 6,8 г/л до приблизительно 11,2 г/л, от приблизительно 6,8 г/л до приблизительно 11,0 г/л, от приблизительно 6,8 г/л до приблизительно 10,8 г/л, от приблизительно 6,8 г/л до приблизительно 10,6 г/л, от приблизительно 6,8 г/л до приблизительно 10,4 г/л, от приблизительно 6,8 г/л до приблизительно 10,2 г/л, от приблизительно 6,8 г/л до приблизительно 10,0 г/л, от приблизительно 6,8 г/л до приблизительно 9,8 г/л, от приблизительно 6,8 г/л до приблизительно 9,6 г/л, от приблизительно 6,8 г/л до приблизительно 9,4 г/л,
от приблизительно 6,8 г/л до приблизительно 9,2 г/л, от приблизительно 6,8 г/л до приблизительно 9,0 г/л, от приблизительно 6,8 г/л до приблизительно 8,8 г/л, от приблизительно 6,8 г/л до приблизительно 8,6 г/л, от приблизительно 6,8 г/л до приблизительно 8,4 г/л, от приблизительно 6,8 г/л до приблизительно 8,2 г/л, от приблизительно 6,8 г/л до приблизительно 8,0 г/л, от приблизительно 6,8 г/л до приблизительно 7,8 г/л, от приблизительно 7,0 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 7,0 г/л до приблизительно 15,8 г/л, от приблизительно 7,0 г/л до приблизительно 15,6 г/л, от приблизительно 7,0 г/л до приблизительно 15,4 г/л, от приблизительно 7,0 г/л до приблизительно 15,2 г/л, от приблизительно 7,0 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 7,0 г/л до приблизительно 14,8 г/л, от приблизительно 7,0 г/л до приблизительно 14,6 г/л,
от приблизительно 7,0 г/л до приблизительно 14,4 г/л, от приблизительно 7,0 г/л до приблизительно 14,2 г/л, от приблизительно 7,0 г/л до приблизительно 14,0 г/л, от приблизительно 7,0 г/л до приблизительно 13,8 г/л, от приблизительно 7,0 г/л до приблизительно 13,6 г/л, от приблизительно 7,0 г/л до приблизительно 13,4 г/л, от приблизительно 7,0 г/л до приблизительно 13,2 г/л, от приблизительно 7,0 г/л до приблизительно 13,0 г/л, от приблизительно 7,0 г/л до приблизительно 12,8 г/л, от приблизительно 7,0 г/л до приблизительно 12,6 г/л, от приблизительно 7,0 г/л до приблизительно 12,4 г/л, от приблизительно 7,0 г/л до приблизительно 12,2 г/л, от приблизительно 7,0 г/л до приблизительно 12,0 г/л, от приблизительно 7,0 г/л до приблизительно 11,8 г/л,
от приблизительно 7,0 г/л до приблизительно 11,6 г/л, от приблизительно 7,0 г/л до приблизительно 11,4 г/л, от приблизительно 7,0 г/л до приблизительно 11,2 г/л, от приблизительно 7,0 г/л до приблизительно 11,0 г/л, от приблизительно 7,0 г/л до приблизительно 10,8 г/л, от приблизительно 7,0 г/л до приблизительно 10,6 г/л, от приблизительно 7,0 г/л до приблизительно 10,4 г/л, от приблизительно 7,0 г/л до приблизительно 10,2 г/л, от приблизительно 7,0 г/л до приблизительно 10,0 г/л, от приблизительно 7,0 г/л до приблизительно 9,8 г/л, от приблизительно 7,0 г/л до приблизительно 9,6 г/л, от приблизительно 7,0 г/л до приблизительно 9,4 г/л, от приблизительно 7,0 г/л до приблизительно 9,2 г/л, от приблизительно 7,0 г/л до приблизительно 9,0 г/л, от приблизительно 7,0 г/л до приблизительно 8,8 г/л, от приблизительно 7,0 г/л до приблизительно 8,6 г/л, от приблизительно 7,0 г/л до приблизительно 8,4 г/л, от приблизительно 7,0 г/л до приблизительно 8,2 г/л, от приблизительно 7,0 г/л до приблизительно 8,0 г/л, от приблизительно 7,2 г/л до приблизительно 16,0 г/л,
от приблизительно 7,2 г/л до приблизительно 15,8 г/л, от приблизительно 7,2 г/л до приблизительно 15,6 г/л, от приблизительно 7,2 г/л до приблизительно 15,4 г/л, от приблизительно 7,2 г/л до приблизительно 15,2 г/л, от приблизительно 7,2 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 7,2 г/л до приблизительно 14,8 г/л, от приблизительно 7,2 г/л до приблизительно 14,6 г/л, от приблизительно 7,2 г/л до приблизительно 14,4 г/л, от приблизительно 7,2 г/л до приблизительно 14,2 г/л, от приблизительно 7,2 г/л до приблизительно 14,0 г/л, от приблизительно 7,2 г/л до приблизительно 13,8 г/л, от приблизительно 7,2 г/л до приблизительно 13,6 г/л, от приблизительно 7,2 г/л до приблизительно 13,4 г/л, от приблизительно 7,2 г/л до приблизительно 13,2 г/л,
от приблизительно 7,2 г/л до приблизительно 13,0 г/л, от приблизительно 7,2 г/л до приблизительно 12,8 г/л, от приблизительно 7,2 г/л до приблизительно 12,6 г/л, от приблизительно 7,2 г/л до приблизительно 12,4 г/л, от приблизительно 7,2 г/л до приблизительно 12,2 г/л, от приблизительно 7,2 г/л до приблизительно 12,0 г/л, от приблизительно 7,2 г/л до приблизительно 11,8 г/л, от приблизительно 7,2 г/л до приблизительно 11,6 г/л, от приблизительно 7,2 г/л до приблизительно 11,4 г/л, от приблизительно 7,2 г/л до приблизительно 11,2 г/л, от приблизительно 7,2 г/л до приблизительно 11,0 г/л, от приблизительно 7,2 г/л до приблизительно 10,8 г/л, от приблизительно 7,2 г/л до приблизительно 10,6 г/л, от приблизительно 7,2 г/л до приблизительно 10,4 г/л, от приблизительно 7,2 г/л до приблизительно 10,2 г/л, от приблизительно 7,2 г/л до приблизительно 10,0 г/л, от приблизительно 7,2 г/л до приблизительно 9,8 г/л, от приблизительно 7,2 г/л до приблизительно 9,6 г/л, от приблизительно 7,2 г/л до приблизительно 9,4 г/л, от приблизительно 7,2 г/л до приблизительно 9,2 г/л,
от приблизительно 7,2 г/л до приблизительно 9,0 г/л, от приблизительно 7,2 г/л до приблизительно 8,8 г/л, от приблизительно 7,2 г/л до приблизительно 8,6 г/л, от приблизительно 7,2 г/л до приблизительно 8,4 г/л, от приблизительно 7,2 г/л до приблизительно 8,2 г/л, от приблизительно 7,4 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 7,4 г/л до приблизительно 15,8 г/л, от приблизительно 7,4 г/л до приблизительно 15,6 г/л, от приблизительно 7,4 г/л до приблизительно 15,4 г/л, от приблизительно 7,4 г/л до приблизительно 15,2 г/л, от приблизительно 7,4 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 7,4 г/л до приблизительно 14,8 г/л, от приблизительно 7,4 г/л до приблизительно 14,6 г/л, от приблизительно 7,4 г/л до приблизительно 14,4 г/л,
от приблизительно 7,4 г/л до приблизительно 14,2 г/л, от приблизительно 7,4 г/л до приблизительно 14,0 г/л, от приблизительно 7,4 г/л до приблизительно 13,8 г/л, от приблизительно 7,4 г/л до приблизительно 13,6 г/л, от приблизительно 7,4 г/л до приблизительно 13,4 г/л, от приблизительно 7,4 г/л до приблизительно 13,2 г/л, от приблизительно 7,4 г/л до приблизительно 13,0 г/л, от приблизительно 7,4 г/л до приблизительно 12,8 г/л, от приблизительно 7,4 г/л до приблизительно 12,6 г/л, от приблизительно 7,4 г/л до приблизительно 12,4 г/л, от приблизительно 7,4 г/л до приблизительно 12,2 г/л, от приблизительно 7,4 г/л до приблизительно 12,0 г/л, от приблизительно 7,4 г/л до приблизительно 11,8 г/л, от приблизительно 7,4 г/л до приблизительно 11,6 г/л, от приблизительно 7,4 г/л до приблизительно 11,4 г/л, от приблизительно 7,4 г/л до приблизительно 11,2 г/л,
от приблизительно 7,4 г/л до приблизительно 11,0 г/л, от приблизительно 7,4 г/л до приблизительно 10,8 г/л, от приблизительно 7,4 г/л до приблизительно 10,6 г/л, от приблизительно 7,4 г/л до приблизительно 10,4 г/л, от приблизительно 7,4 г/л до приблизительно 10,2 г/л, от приблизительно 7,4 г/л до приблизительно 10,0 г/л, от приблизительно 7,4 г/л до приблизительно 9,8 г/л, от приблизительно 7,4 г/л до приблизительно 9,6 г/л, от приблизительно 7,4 г/л до приблизительно 9,4 г/л, от приблизительно 7,4 г/л до приблизительно 9,2 г/л, от приблизительно 7,4 г/л до приблизительно 9,0 г/л, от приблизительно 7,4 г/л до приблизительно 8,8 г/л, от приблизительно 7,4 г/л до приблизительно 8,6 г/л, от приблизительно 7,4 г/л до приблизительно 8,4 г/л, от приблизительно 7,6 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 7,6 г/л до приблизительно 15,8 г/л, от приблизительно 7,6 г/л до приблизительно 15,6 г/л, от приблизительно 7,6 г/л до приблизительно 15,4 г/л,
от приблизительно 7,6 г/л до приблизительно 15,2 г/л, от приблизительно 7,6 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 7,6 г/л до приблизительно 14,8 г/л, от приблизительно 7,6 г/л до приблизительно 14,6 г/л, от приблизительно 7,6 г/л до приблизительно 14,4 г/л, от приблизительно 7,6 г/л до приблизительно 14,2 г/л, от приблизительно 7,6 г/л до приблизительно 14,0 г/л, от приблизительно 7,6 г/л до приблизительно 13,8 г/л, от приблизительно 7,6 г/л до приблизительно 13,6 г/л, от приблизительно 7,6 г/л до приблизительно 13,4 г/л, от приблизительно 7,6 г/л до приблизительно 13,2 г/л, от приблизительно 7,6 г/л до приблизительно 13,0 г/л, от приблизительно 7,6 г/л до приблизительно 12,8 г/л, от приблизительно 7,6 г/л до приблизительно 12,6 г/л, от приблизительно 7,6 г/л до приблизительно 12,4 г/л, от приблизительно 7,6 г/л до приблизительно 12,2 г/л, от приблизительно 7,6 г/л до приблизительно 12,0 г/л, от приблизительно 7,6 г/л до приблизительно 11,8 г/л, от приблизительно 7,6 г/л до приблизительно 11,6 г/л, от приблизительно 7,6 г/л до приблизительно 11,4 г/л,
от приблизительно 7,6 г/л до приблизительно 11,2 г/л, от приблизительно 7,6 г/л до приблизительно 11,0 г/л, от приблизительно 7,6 г/л до приблизительно 10,8 г/л, от приблизительно 7,6 г/л до приблизительно 10,6 г/л, от приблизительно 7,6 г/л до приблизительно 10,4 г/л, от приблизительно 7,6 г/л до приблизительно 10,2 г/л, от приблизительно 7,6 г/л до приблизительно 10,0 г/л, от приблизительно 7,6 г/л до приблизительно 9,8 г/л, от приблизительно 7,6 г/л до приблизительно 9,6 г/л, от приблизительно 7,6 г/л до приблизительно 9,4 г/л, от приблизительно 7,6 г/л до приблизительно 9,2 г/л, от приблизительно 7,6 г/л до приблизительно 9,0 г/л, от приблизительно 7,6 г/л до приблизительно 8,8 г/л, от приблизительно 7,6 г/л до приблизительно 8,6 г/л, от приблизительно 7,8 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 7,8 г/л до приблизительно 15,8 г/л, от приблизительно 7,8 г/л до приблизительно 15,6 г/л, от приблизительно 7,8 г/л до приблизительно 15,4 г/л, от приблизительно 7,8 г/л до приблизительно 15,2 г/л, от приблизительно 7,8 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 7,8 г/л до приблизительно 14,8 г/л, от приблизительно 7,8 г/л до приблизительно 14,6 г/л, от приблизительно 7,8 г/л до приблизительно 14,4 г/л, от приблизительно 7,8 г/л до приблизительно 14,2 г/л, от приблизительно 7,8 г/л до приблизительно 14,0 г/л, от приблизительно 7,8 г/л до приблизительно 13,8 г/л, от приблизительно 7,8 г/л до приблизительно 13,6 г/л, от приблизительно 7,8 г/л до приблизительно 13,4 г/л, от приблизительно 7,8 г/л до приблизительно 13,2 г/л, от приблизительно 7,8 г/л до приблизительно 13,0 г/л,
от приблизительно 7,8 г/л до приблизительно 12,8 г/л, от приблизительно 7,8 г/л до приблизительно 12,6 г/л, от приблизительно 7,8 г/л до приблизительно 12,4 г/л, от приблизительно 7,8 г/л до приблизительно 12,2 г/л, от приблизительно 7,8 г/л до приблизительно 12,0 г/л, от приблизительно 7,8 г/л до приблизительно 11,8 г/л, от приблизительно 7,8 г/л до приблизительно 11,6 г/л, от приблизительно 7,8 г/л до приблизительно 11,4 г/л, от приблизительно 7,8 г/л до приблизительно 11,2 г/л, от приблизительно 7,8 г/л до приблизительно 11,0 г/л, от приблизительно 7,8 г/л до приблизительно 10,8 г/л, от приблизительно 7,8 г/л до приблизительно 10,6 г/л, от приблизительно 7,8 г/л до приблизительно 10,4 г/л, от приблизительно 7,8 г/л до приблизительно 10,2 г/л, от приблизительно 7,8 г/л до приблизительно 10,0 г/л, от приблизительно 7,8 г/л до приблизительно 9,8 г/л,
от приблизительно 7,8 г/л до приблизительно 9,6 г/л, от приблизительно 7,8 г/л до приблизительно 9,4 г/л, от приблизительно 7,8 г/л до приблизительно 9,2 г/л, от приблизительно 7,8 г/л до приблизительно 9,0 г/л, от приблизительно 7,8 г/л до приблизительно 8,8 г/л, от приблизительно 8,0 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 8,0 г/л до приблизительно 15,8 г/л, от приблизительно 8,0 г/л до приблизительно 15,6 г/л, от приблизительно 8,0 г/л до приблизительно 15,4 г/л, от приблизительно 8,0 г/л до приблизительно 15,2 г/л, от приблизительно 8,0 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 8,0 г/л до приблизительно 14,8 г/л, от приблизительно 8,0 г/л до приблизительно 14,6 г/л, от приблизительно 8,0 г/л до приблизительно 14,4 г/л,
от приблизительно 8,0 г/л до приблизительно 14,2 г/л, от приблизительно 8,0 г/л до приблизительно 14,0 г/л, от приблизительно 8,0 г/л до приблизительно 13,8 г/л, от приблизительно 8,0 г/л до приблизительно 13,6 г/л, от приблизительно 8,0 г/л до приблизительно 13,4 г/л, от приблизительно 8,0 г/л до приблизительно 13,2 г/л, от приблизительно 8,0 г/л до приблизительно 13,0 г/л, от приблизительно 8,0 г/л до приблизительно 12,8 г/л, от приблизительно 8,0 г/л до приблизительно 12,6 г/л, от приблизительно 8,0 г/л до приблизительно 12,4 г/л, от приблизительно 8,0 г/л до приблизительно 12,2 г/л, от приблизительно 8,0 г/л до приблизительно 12,0 г/л, от приблизительно 8,0 г/л до приблизительно 11,8 г/л, от приблизительно 8,0 г/л до приблизительно 11,6 г/л, от приблизительно 8,0 г/л до приблизительно 11,4 г/л, от приблизительно 8,0 г/л до приблизительно 11,2 г/л,
от приблизительно 8,0 г/л до приблизительно 11,0 г/л, от приблизительно 8,0 г/л до приблизительно 10,8 г/л, от приблизительно 8,0 г/л до приблизительно 10,6 г/л, от приблизительно 8,0 г/л до приблизительно 10,4 г/л, от приблизительно 8,0 г/л до приблизительно 10,2 г/л, от приблизительно 8,0 г/л до приблизительно 10,0 г/л, от приблизительно 8,0 г/л до приблизительно 9,8 г/л, от приблизительно 8,0 г/л до приблизительно 9,6 г/л, от приблизительно 8,0 г/л до приблизительно 9,4 г/л, от приблизительно 8,0 г/л до приблизительно 9,2 г/л, от приблизительно 8,0 г/л до приблизительно 9,0 г/л, от приблизительно 8,5 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 8,5 г/л до приблизительно 15,5 г/л, от приблизительно 8,5 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 8,5 г/л до приблизительно 14,5 г/л, от приблизительно 8,5 г/л до приблизительно 14,0 г/л, от приблизительно 8,5 г/л до приблизительно 13,5 г/л, от приблизительно 8,5 г/л до приблизительно 13,0 г/л, от приблизительно 8,5 г/л до приблизительно 12,5 г/л, от приблизительно 8,5 г/л до приблизительно 12,0 г/л, от приблизительно 8,5 г/л до приблизительно 11,5 г/л, от приблизительно 8,5 г/л до приблизительно 11,0 г/л,
от приблизительно 8,5 г/л до приблизительно 10,5 г/л, от приблизительно 8,5 г/л до приблизительно 10,0 г/л, от приблизительно 8,5 г/л до приблизительно 9,5 г/л, от приблизительно 9,0 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 9,0 г/л до приблизительно 15,5 г/л, от приблизительно 9,0 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 9,0 г/л до приблизительно 14,5 г/л, от приблизительно 9,0 г/л до приблизительно 14,0 г/л, от приблизительно 9,0 г/л до приблизительно 13,5 г/л, от приблизительно 9,0 г/л до приблизительно 13,0 г/л, от приблизительно 9,0 г/л до приблизительно 12,5 г/л, от приблизительно 9,0 г/л до приблизительно 12,0 г/л, от приблизительно 9,0 г/л до приблизительно 11,5 г/л, от приблизительно 9,0 г/л до приблизительно 11,0 г/л, от приблизительно 9,0 г/л до приблизительно 10,5 г/л, от приблизительно 9,0 г/л до приблизительно 10,0 г/л,
от приблизительно 9,5 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 9,5 г/л до приблизительно 15,5 г/л, от приблизительно 9,5 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 9,5 г/л до приблизительно 14,5 г/л, от приблизительно 9,5 г/л до приблизительно 14,0 г/л, от приблизительно 9,5 г/л до приблизительно 13,5 г/л, от приблизительно 9,5 г/л до приблизительно 13,0 г/л, от приблизительно 9,5 г/л до приблизительно 12,5 г/л, от приблизительно 9,5 г/л до приблизительно 12,0 г/л, от приблизительно 9,5 г/л до приблизительно 11,5 г/л, от приблизительно 9,5 г/л до приблизительно 11,0 г/л, от приблизительно 9,5 г/л до приблизительно 10,5 г/л, от приблизительно 10,0 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 10,0 г/л до приблизительно 15,5 г/л, от приблизительно 10,0 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 10,0 г/л до приблизительно 14,5 г/л, от приблизительно 10,0 г/л до приблизительно 14,0 г/л, от приблизительно 10,0 г/л до приблизительно 13,5 г/л, от приблизительно 10,0 г/л до приблизительно 13,0 г/л, от приблизительно 10,0 г/л до приблизительно 12,5 г/л, от приблизительно 10,0 г/л до приблизительно 12,0 г/л, от приблизительно 10,0 г/л до приблизительно 11,5 г/л, от приблизительно 10,0 г/л до приблизительно 11,0 г/л, от приблизительно 10,5 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 10,5 г/л до приблизительно 15,5 г/л, от приблизительно 10,5 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 10,5 г/л до приблизительно 14,5 г/л,
от приблизительно 10,5 г/л до приблизительно 14,0 г/л, от приблизительно 10,5 г/л до приблизительно 13,5 г/л, от приблизительно 10,5 г/л до приблизительно 13,0 г/л, от приблизительно 10,5 г/л до приблизительно 12,5 г/л, от приблизительно 10,5 г/л до приблизительно 12,0 г/л, от приблизительно 10,5 г/л до приблизительно 11,5 г/л, от приблизительно 11,0 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 11,0 г/л до приблизительно 15,5 г/л, от приблизительно 11,0 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 11,0 г/л до приблизительно 14,5 г/л, от приблизительно 11,0 г/л до приблизительно 14,0 г/л, от приблизительно 11,0 г/л до приблизительно 13,5 г/л, от приблизительно 11,0 г/л до приблизительно 13,0 г/л, от приблизительно 11,0 г/л до приблизительно 12,5 г/л, от приблизительно 11,0 г/л до приблизительно 12,0 г/л,
от приблизительно 11,5 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 11,5 г/л до приблизительно 15,5 г/л, от приблизительно 11,5 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 11,5 г/л до приблизительно 14,5 г/л, от приблизительно 11,5 г/л до приблизительно 14,0 г/л, от приблизительно 11,5 г/л до приблизительно 13,5 г/л, от приблизительно 11,5 г/л до приблизительно 13,0 г/л, от приблизительно 11,5 г/л до приблизительно 12,5 г/л, от приблизительно 12,0 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 12,0 г/л до приблизительно 15,5 г/л, от приблизительно 12,0 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 12,0 г/л до приблизительно 14,5 г/л, от приблизительно 12,0 г/л до приблизительно 14,0 г/л, от приблизительно 12,0 г/л до приблизительно 13,5 г/л, от приблизительно 12,0 г/л до приблизительно 13,0 г/л,
от приблизительно 12,5 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 12,5 г/л до приблизительно 15,5 г/л, от приблизительно 12,5 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 12,5 г/л до приблизительно 14,5 г/л, от приблизительно 12,5 г/л до приблизительно 14,0 г/л, от приблизительно 12,5 г/л до приблизительно 13,5 г/л, от приблизительно 13,0 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 13,0 г/л до приблизительно 15,5 г/л, от приблизительно 13,0 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 13,0 г/л до приблизительно 14,5 г/л, от приблизительно 13,0 г/л до приблизительно 14,0 г/л, от приблизительно 13,5 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 13,5 г/л до приблизительно 15,5 г/л, от приблизительно 13,5 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 13,5 г/л до приблизительно 14,5 г/л,
от приблизительно 14,0 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 14,0 г/л до приблизительно 15,5 г/л, от приблизительно 14,0 г/л до приблизительно 15,0 г/л, от приблизительно 14,5 г/л до приблизительно 16,0 г/л, от приблизительно 14,5 г/л до приблизительно 15,5 г/л или от приблизительно 15,0 г/л до приблизительно 16,0 г/л).
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления полоксамер-188 присутствует в среде, и/или его добавляют к среде перед стадией культивирования, и/или добавляют к среде во время стадии культивирования. Например, способы, представленные в данном документе, могут дополнительно включать добавление полоксамера-188 перед и/или во время стадии культивирования с обеспечением в среде концентрации 1,8 г/л или более (например, любой из иллюстративных концентраций полоксамера-188 или диапазонов концентраций полоксамера-188, описанных в данном документе). В некоторых примерах дополнительное количество полоксамера-188 добавляют к среде, содержащей некоторое количество полоксамера-188, с обеспечением концентрации полоксамера-188, составляющей 1,8 г/л или более (например, любой из иллюстративных концентраций полоксамера-188 или диапазонов концентраций полоксамера-188, описанных в данном документе). Например, полоксамер-188 можно добавлять к первой жидкой среде, второй жидкой среде и/или подпиточной жидкой среде перед и/или во время стадии культивирования.
В некоторых примерах полоксамер-188 добавляют к среде в одной или нескольких (например, двух, трех, четырех или пяти) аликвотах во время стадии культивирования. Полоксамер-188 можно добавлять к среде непрерывно. В некоторых примерах первая жидкая среда может содержать полоксамер-188, при этом дополнительное количество полоксамера-188 добавляют к среде во время периода культивирования. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления полоксамер-188 присутствует в среде.
Если стадия культивирования предусматривает перфузионное культивирование, то вторая жидкая среда может содержать полоксамер-188 в более высокой концентрации, чем таковая в первой жидкой среде. Например, первая жидкая среда может содержать полоксамер-188 в концентрации 1,8 г/л или в концентрации менее 1,8 г/л, при этом вторая жидкая среда содержит полоксамер-188 в концентрации более 1,8 г/л (например, любой из концентраций или диапазонов концентраций полоксамера-188, описанных в данном документе, например, концентрации более 1,9 г/л, концентрации более 2,0 г/л, концентрации более 2,1 г/л, концентрации более 2,2 г/л, концентрации более 2,3 г/л, концентрации более 2,4 г/л, концентрации более 2,5 г/л, концентрации более 2,6 г/л, концентрации более 2,7 г/л, концентрации более 2,8 г/л, концентрации более 2,9 г/л, концентрации более 3,0 г/л, концентрации более 3,1 г/л, концентрации более 3,2 г/л, концентрации более 3,3 г/л, концентрации более 3,4 г/л, концентрации более 3,5 г/л, концентрации более 3,6 г/л, концентрации более 3,7 г/л, концентрации более 3,8 г/л, концентрации более 3,9 г/л, концентрации более 4,0 г/л, концентрации более 4,1 г/л, концентрации более 4,2 г/л, концентрации более 4,3 г/л, концентрации более 4,4 г/л,
концентрации более 4,5 г/л, концентрации более 4,6 г/л, концентрации более 4,7 г/л, концентрации более 4,8 г/л, концентрации более 4,9 г/л, концентрации более 5,0 г/л, концентрации более 5,1 г/л, концентрации более 5,2 г/л, концентрации более 5,3 г/л, концентрации более 5,4 г/л, концентрации более 5,5 г/л, концентрации более 5,6 г/л, концентрации более 5,7 г/л, концентрации более 5,8 г/л, концентрации более 5,9 г/л, концентрации более 6,0 г/л, концентрации более 6,1 г/л, концентрации более 6,2 г/л, концентрации более 6,3 г/л, концентрации более 6,4 г/л, концентрации более 6,5 г/л, концентрации более 6,6 г/л, концентрации более 6,7 г/л, концентрации более 6,8 г/л,
концентрации более 6,9 г/л, концентрации более 7,0 г/л, концентрации более 7,1 г/л, концентрации более 7,2 г/л, концентрации более 7,3 г/л, концентрации более 7,4 г/л, концентрации более 7,5 г/л, концентрации более 7,6 г/л, концентрации более 7,7 г/л, концентрации более 7,8 г/л, концентрации более 7,9 г/л, концентрации более 8,0 г/л, концентрации более 8,1 г/л, концентрации более 8,2 г/л, концентрации более 8,3 г/л, концентрации более 8,4 г/л, концентрации более 8,5 г/л, концентрации более 8,6 г/л, концентрации более 8,7 г/л, концентрации более 8,8 г/л,
концентрации более 8,9 г/л, концентрации более 9,0 г/л, концентрации более 9,1 г/л, концентрации более 9,2 г/л, концентрации более 9,3 г/л, концентрации более 9,4 г/л, концентрации более 9,5 г/л, концентрации более 9,6 г/л, концентрации более 9,7 г/л, концентрации более 9,8 г/л, концентрации более 9,9 г/л, концентрации более 10,0 г/л, концентрации более 10,1 г/л, концентрации более 10,2 г/л,
концентрации более 10,3 г/л, концентрации более 10,4 г/л, концентрации более 10,5 г/л, концентрации более 10,6 г/л, концентрации более 10,7 г/л, концентрации более 10,8 г/л, концентрации более 10,9 г/л, концентрации более 11,0 г/л, концентрации более 11,1 г/л, концентрации более 11,2 г/л, концентрации более 11,3 г/л, концентрации более 11,4 г/л, концентрации более 11,5 г/л, концентрации более 11,6 г/л, концентрации более 11,7 г/л, концентрации более 11,8 г/л, концентрации более 11,9 г/л, концентрации более 12,0 г/л,
концентрации более 12,1 г/л, концентрации более 12,2 г/л, концентрации более 12,3 г/л, концентрации более 12,4 г/л, концентрации более 12,5 г/л, концентрации более 12,6 г/л, концентрации более 12,7 г/л, концентрации более 12,8 г/л, концентрации более 12,9 г/л, концентрации более 13,0 г/л, концентрации более 13,1 г/л, концентрации более 13,2 г/л, концентрации более 13,3 г/л, концентрации более 13,4 г/л, концентрации более 13,5 г/л, концентрации более 13,6 г/л, концентрации более 13,7 г/л, концентрации более 13,8 г/л, концентрации более 13,9 г/л, концентрации более 14,0 г/л, концентрации более 14,1 г/л, концентрации более 14,2 г/л,
концентрации более 14,3 г/л, концентрации более 14,4 г/л, концентрации более 14,5 г/л, концентрации более 14,6 г/л, концентрации более 14,7 г/л, концентрации более 14,8 г/л, концентрации более 14,9 г/л, концентрации более 15,0 г/л, концентрации более 15,1 г/л, концентрации более 15,2 г/л, концентрации более 15,3 г/л, концентрации более 15,4 г/л, концентрации более 15,5 г/л, концентрации более 15,6 г/л, концентрации более 15,7 г/л, концентрации более 15,8 г/л, концентрации более 15,9 г/л или концентрации более 16,0 г/л полоксамера-188).
Если стадия культивирования предусматривает культивирование с периодической подпиткой, то подпиточная жидкая среда может содержать полоксамер-188 в более высокой концентрации, чем таковая в первой жидкой среде. Например, первая жидкая среда может содержать полоксамер-188 в концентрации 1,8 г/л или в концентрации менее 1,8 г/л, при этом подпиточная жидкая среда содержит полоксамер-188 в концентрации более 1,8 г/л (например, концентрации более 2,0 г/л, концентрации более 2,5 г/л, концентрации более 3,0 г/л, концентрации более 3,5 г/л, концентрации более 4,0 г/л, концентрации более 4,5 г/л, концентрации более 5,0 г/л, концентрации более 5,5 г/л, концентрации более 6,0 г/л, концентрации более 6,5 г/л, концентрации более 7,0 г/л, концентрации более 7,5 г/л, концентрации более 8,0 г/л, концентрации более 8,5 г/л, концентрации более 9,0 г/л, концентрации более 9,5 г/л, концентрации более 10 г/л, концентрации более 10,5 г/л, концентрации более 11,0 г/л, концентрации более 11,5 г/л,
концентрации более 12,0 г/л, концентрации более 12,5 г/л, концентрации более 13,0 г/л, концентрации более 13,5 г/л, концентрации более 14,0 г/л, концентрации более 14,5 г/л, концентрации более 15,0 г/л, концентрации более 15,5 г/л, концентрации более 16,0 г/л, концентрации более 16,5 г/л, концентрации более 17,0 г/л, концентрации более 17,5 г/л, концентрации более 18,0 г/л, концентрации более 18,5 г/л, концентрации более 19,0 г/л, концентрации более 19,5 г/л, концентрации более 20,0 г/л, концентрации более 20,5 г/л, концентрации более 21,0 г/л, концентрации более 21,5 г/л, концентрации более 22,0 г/л, концентрации более 22,5 г/л,
концентрации более 23,0 г/л, концентрации более 23,5 г/л, концентрации более 24,0 г/л, концентрации более 24,5 г/л, концентрации более 25,0 г/л, концентрации более 25,5 г/л, концентрации более 26,0 г/л, концентрации более 26,5 г/л, концентрации более 27,0 г/л, концентрации более 28,0 г/л, концентрации более 28,5 г/л, концентрации более 29,0 г/л, концентрации более 29,5 г/л, концентрации более 30,0 г/л, концентрации более 30,5 г/л, концентрации более 31,0 г/л,
концентрации более 31,5 г/л, концентрации более 32,0 г/л, концентрации более 32,5 г/л, концентрации более 33,0 г/л, концентрации более 33,5 г/л, концентрации более 34,0 г/л, концентрации более 34,5 г/л, концентрации более 35,0 г/л, концентрации более 35,5 г/л, концентрации более 36,0 г/л, концентрации более 36,5 г/л, концентрации более 37,0 г/л, концентрации более 37,5 г/л, концентрации более 38,0 г/л, концентрации более 38,5 г/л, концентрации более 39,0 г/л, концентрации более 39,5 г/л или концентрации более 40,0 г/л).
Некоторые варианты осуществления любого из способов, представленных в данном документе, включают обеспечение повышения концентрации полоксамера-188 в культуре с течением времени. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления среда содержит полоксамер-188 в концентрации, которую выбирают на основании одного или нескольких факторов, выбранных из группы: размер пор, тип пор, скорость газового потока, плотность жизнеспособных клеток в среде и маркеры, связанные с клеточным стрессом. В этих способах выбранная концентрация полоксамера-188 в среде может быть достигнута путем добавления полоксамера-188 к среде перед стадией культивирования и/или добавления полоксамера-188 к среде во время стадии культивирования. Выбранная концентрация полоксамера-188 может представлять собой любую из иллюстративных концентраций или диапазонов концентраций полоксамера-188, описанных в данном документе.
Выбор концентрации полоксамера-188 на основании одного или нескольких факторов
Некоторые варианты осуществления способов, описанных в данном документе, включают культивирование клетки млекопитающего в жидкой среде, содержащей полоксамер-188 в концентрации, которую выбирают на основании одного или нескольких факторов, выбранных из группы: размер пор, тип пор, скорость газового потока, плотность жизнеспособных клеток в среде и маркеры, связанные с клеточным стрессом.
Различные примеры типов пор известны из уровня техники. Неограничивающие примеры типов пор представляют собой поры, полученные в результате спекания, и поры, полученные в результате перфорации.
Разнообразные значения скорости газового потока, подходящие для культивирования клеток, известны из уровня техники. Как правило, более высокая скорость газового потока указывает на то, что необходимо выбирать более высокую концентрацию полоксамера-188 (по сравнению со стадией культивирования с применением более низкой скорости газового потока), и более низкая скорость газового потока указывает на то, что необходимо выбирать более низкую концентрацию полоксамера-188 (по сравнению со стадией культивирования с применением более высокой скорости газового потока).
Разнообразные неограничивающие значения плотности жизнеспособных клеток описаны в данном документе. Как правило, более высокая плотность жизнеспособных клеток указывает на то, что необходимо выбирать более высокую концентрацию полоксамера-188 (по сравнению со средой, характеризующейся более низкой плотностью жизнеспособных клеток), и более низкая плотность жизнеспособных клеток указывает на то, что необходимо выбирать более низкую концентрацию полоксамера-188 (по сравнению со средой, характеризующейся более высокой плотностью жизнеспособных клеток).
Иллюстративные маркеры клеточного стресса, которые высвобождаются клеткой при физиологическом стрессе, включают протеазы (например, активированные каспазы), лактатдегидрогеназу, геномную ДНК (например, нуклеосомную ДНК), цитохром c и активированную PARP. Неограничивающие примеры маркеров, связанных с клеточным стрессом, которые вырабатываются клеткой при физиологическом стрессе или характеризуются повышенными уровнями в клетке при физиологическом стрессе, включают активированные каспазы, цитохром c, активированную PARP и экстернализированный фосфатидилсерин. Повышенные уровни одного или нескольких (например, двух, трех, четырех, пяти, шести или семи) из любых этих маркеров клеточного стресса по сравнению с контрольным(контрольными) значением(значениями) указывают на то, что необходимо выбирать более высокую концентрацию полоксамера-188. Уровень(уровни) одного или нескольких маркеров клеточного стресса по сравнению с контрольным(контрольными) значением(значениями), которые приблизительно равны или ниже контрольного(контрольных) значения(значений), указывают на то, что необходимо выбирать более низкую концентрацию полоксамера-188. В любом из примеров, описанных в данном документе, контрольным уровнем может быть уровень в контрольной клетке, которая не подвергается апоптозу или не культивируется в условиях, которые вызывают некроз. Способы выявления уровня одного или нескольких маркеров клеточного стресса хорошо известны из уровня техники. Доступны коммерчески доступные наборы для измерения одного или нескольких маркеров клеточного стресса.
В соответствии с любым из вариантов осуществления, описанных в данном документе, достижение выбранной концентрации полоксамера-188 обеспечивают путем добавления полоксамера-188 к среде перед стадией культивирования и/или добавления полоксамера-188 к среде во время стадии культивирования. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления способы включают осуществление выбора на основании типа пор и размера пор концентрации полоксамера-188 от приблизительно 2,3 г/л до приблизительно 3,3 г/л (например, от приблизительно 2,3 г/л до приблизительно 3,2 г/л, от приблизительно 2,3 г/л до приблизительно 3,1 г/л, от приблизительно 2,3 г/л до приблизительно 3,0 г/л, от приблизительно 2,3 г/л до приблизительно 2,9 г/л, от приблизительно 2,3 г/л до приблизительно 2,8 г/л, от приблизительно 2,3 г/л до приблизительно 2,7 г/л, от приблизительно 2,3 г/л до приблизительно 2,6 г/л, от приблизительно 2,3 г/л до приблизительно 2,5 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 3,3 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 3,2 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 3,1 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 3,0 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 2,9 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 2,8 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 2,7 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 2,6 г/л, от приблизительно 2,5 г/л до приблизительно 3,3 г/л, от приблизительно 2,5 г/л до приблизительно 3,2 г/л, от приблизительно 2,5 г/л до приблизительно 3,1 г/л, от приблизительно 2,5 г/л до приблизительно 3,0
г/л, от приблизительно 2,5 г/л до приблизительно 2,9 г/л, от приблизительно 2,5 г/л до приблизительно 2,8 г/л, от приблизительно 2,5 г/л до приблизительно 2,7 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 3,3 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 3,2 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 3,1 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 3,0 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 2,9 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 2,8 г/л, от приблизительно 2,7 г/л до приблизительно 3,3 г/л, от приблизительно 2,7 г/л до приблизительно 3,2 г/л, от приблизительно 2,7 г/л до приблизительно 3,1 г/л, от приблизительно 2,7 г/л до приблизительно 3,0 г/л, от приблизительно 2,7 г/л до приблизительно 2,9 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 3,3 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 3,2 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 3,1 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 3,0 г/л, от приблизительно 2,9 г/л до приблизительно 3,3 г/л, от приблизительно 2,9 г/л до приблизительно 3,2 г/л, от приблизительно 2,9 г/л до приблизительно 3,1 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 3,3 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 3,2 г/л или от приблизительно 3,1 г/л до приблизительно 3,3
г/л), в случае типа пор, относящегося к поре, полученной в результате перфорации, и размера пор, составляющего от приблизительно 750 мкм до приблизительно 1,5 мм (например, от приблизительно 750 мкм до приблизительно 1,45 мм, от приблизительно 750 мкм до приблизительно 1,40 мм, от приблизительно 750 мкм до приблизительно 1,35 мм, от приблизительно 750 мкм до приблизительно 1,30 мм, от приблизительно 750 мкм до приблизительно 1,25 мм, от приблизительно 750 мкм до приблизительно 1,20 мм, от приблизительно 750 мкм до приблизительно 1,15 мм, от приблизительно 750 мкм до приблизительно 1,10 мм, от приблизительно 750 мкм до приблизительно 1,05 мм, от приблизительно 750 мкм до приблизительно 1,00 мм, от приблизительно 750 мкм до приблизительно 950 мкм, от приблизительно 750 мкм до приблизительно 900 мкм, от приблизительно 750 мкм до приблизительно 850 мкм, от приблизительно 750 мкм до приблизительно 800 мкм, от приблизительно 800 мкм до приблизительно 1,5 мм, от приблизительно 800 мкм до приблизительно 1,45 мм, от приблизительно 800 мкм до приблизительно 1,40 мм, от приблизительно 800 мкм до приблизительно 1,35 мм, от приблизительно 800 мкм до приблизительно 1,30 мм, от приблизительно 800 мкм до приблизительно 1,25 мм, от приблизительно 800 мкм
до приблизительно 1,20 мм, от приблизительно 800 мкм до приблизительно 1,15 мм, от приблизительно 800 мкм до приблизительно 1,10 мм, от приблизительно 800 мкм до приблизительно 1,05 мм, от приблизительно 800 мкм до приблизительно 1,00 мм, от приблизительно 800 мкм до приблизительно 950 мкм, от приблизительно 800 мкм до приблизительно 900 мкм, от приблизительно 800 мкм до приблизительно 850 мкм, от приблизительно 850 мкм до приблизительно 1,5 мм, от приблизительно 850 мкм до приблизительно 1,45 мм, от приблизительно 850 мкм до приблизительно 1,40 мм, от приблизительно 850 мкм до приблизительно 1,35 мм, от приблизительно 850 мкм до приблизительно 1,30 мм, от приблизительно 850 мкм до приблизительно 1,25 мм, от приблизительно 850 мкм до приблизительно 1,20 мм, от приблизительно 850 мкм до приблизительно 1,15 мм, от приблизительно 850 мкм до приблизительно 1,10 мм, от приблизительно 850 мкм до приблизительно 1,05 мм, от приблизительно 850 мкм до приблизительно 1,00 мм, от приблизительно 850 мкм до приблизительно 950 мкм, от приблизительно 850 мкм до приблизительно 900 мкм, от приблизительно 900 мкм до приблизительно 1,5 мм, от приблизительно 900 мкм до приблизительно 1,45 мм, от приблизительно 900 мкм до приблизительно 1,40 мм, от приблизительно 900 мкм до приблизительно 1,35 мм, от приблизительно 900 мкм
до приблизительно 1,30 мм, от приблизительно 900 мкм до приблизительно 1,25 мм, от приблизительно 900 мкм до приблизительно 1,20 мм, от приблизительно 900 мкм до приблизительно 1,15 мм, от приблизительно 900 мкм до приблизительно 1,10 мм, от приблизительно 900 мкм до приблизительно 1,05 мм, от приблизительно 900 мкм до приблизительно 1,00 мм, от приблизительно 900 мкм до приблизительно 950 мкм, от приблизительно 950 мкм до приблизительно 1,5 мм, от приблизительно 950 мкм до приблизительно 1,45 мм, от приблизительно 950 мкм до приблизительно 1,40 мм, от приблизительно 950 мкм до приблизительно 1,35 мм, от приблизительно 950 мкм до приблизительно 1,30 мм, от приблизительно 950 мкм до приблизительно 1,25 мм, от приблизительно 950 мкм до приблизительно 1,20 мм, от приблизительно 950 мкм до приблизительно 1,15 мм, от приблизительно 950 мкм до приблизительно 1,10 мм, от приблизительно 950 мкм до приблизительно 1,05 мм, от приблизительно 950 мкм до приблизительно 1,00 мм, от приблизительно 1,0 мм
до приблизительно 1,5 мм, от приблизительно 1,0 мм до приблизительно 1,45 мм, от приблизительно 1,0 мм до приблизительно 1,40 мм, от приблизительно 1,0 мм до приблизительно 1,35 мм, от приблизительно 1,0 мм до приблизительно 1,30 мм, от приблизительно 1,0 мм до приблизительно 1,25 мм, от приблизительно 1,0 мм до приблизительно 1,20 мм, от приблизительно 1,0 мм до приблизительно 1,15 мм, от приблизительно 1,0 мм до приблизительно 1,10 мм, от приблизительно 1,0 мм до приблизительно 1,05 мм, от приблизительно 1,05 мм до приблизительно 1,5 мм, от приблизительно 1,05 мм до приблизительно 1,45 мм, от приблизительно 1,05 мм до приблизительно 1,40 мм, от приблизительно 1,05 мм до приблизительно 1,35 мм, от приблизительно 1,05 мм до приблизительно 1,30 мм, от приблизительно 1,05 мм до приблизительно 1,25 мм, от приблизительно 1,05 мм до приблизительно 1,20 мм, от приблизительно 1,05 мм
до приблизительно 1,15 мм, от приблизительно 1,05 мм до приблизительно 1,10 мм, от приблизительно 1,10 мм до приблизительно 1,5 мм, от приблизительно 1,10 мм до приблизительно 1,45 мм, от приблизительно 1,10 мм до приблизительно 1,40 мм, от приблизительно 1,10 мм до приблизительно 1,35 мм, от приблизительно 1,10 мм до приблизительно 1,30 мм, от приблизительно 1,10 мм до приблизительно 1,25 мм, от приблизительно 1,10 мм до приблизительно 1,20 мм, от приблизительно 1,10 мм до приблизительно 1,15 мм, от приблизительно 1,15 мм до приблизительно 1,5 мм, от приблизительно 1,15 мм до приблизительно 1,45 мм, от приблизительно 1,15 мм до приблизительно 1,40 мм, от приблизительно 1,15 мм до приблизительно 1,35 мм, от приблизительно 1,15 мм до приблизительно 1,30 мм, от приблизительно 1,15 мм до приблизительно 1,25 мм, от приблизительно 1,15 мм до приблизительно 1,20 мм, от приблизительно 1,20 мм до приблизительно 1,5 мм, от приблизительно 1,20 мм до приблизительно 1,45 мм, от приблизительно 1,20 мм до приблизительно 1,40 мм, от приблизительно 1,20 мм до приблизительно 1,35 мм, от приблизительно 1,20 мм до приблизительно 1,30 мм, от приблизительно 1,20 мм до приблизительно 1,25 мм,
от приблизительно 1,25 мм до приблизительно 1,5 мм, от приблизительно 1,25 мм до приблизительно 1,45 мм, от приблизительно 1,25 мм до приблизительно 1,40 мм, от приблизительно 1,25 мм до приблизительно 1,35 мм, от приблизительно 1,25 мм до приблизительно 1,30 мм, от приблизительно 1,30 мм до приблизительно 1,5 мм, от приблизительно 1,30 мм до приблизительно 1,45 мм, от приблизительно 1,30 мм до приблизительно 1,40 мм, от приблизительно 1,30 мм до приблизительно 1,35 мм, от приблизительно 1,35 мм до приблизительно 1,5 мм, от приблизительно 1,35 мм до приблизительно 1,45 мм, от приблизительно 1,35 мм до приблизительно 1,40 мм, от приблизительно 1,40 мм до приблизительно 1,5 мм, от приблизительно 1,40 мм до приблизительно 1,45 мм или от приблизительно 1,45 мм до приблизительно 1,50 мм).
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления способы включают осуществление выбора на основании типа пор и размера пор концентрации полоксамера-188 от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 4,3 г/л (например, от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 4,2 г/л, от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 4,1 г/л, от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 4,0 г/л, от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 3,9 г/л, от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 3,8 г/л, от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 3,7 г/л, от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 3,6 г/л, от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 3,5 г/л,
от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 4,3 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 4,2 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 4,1 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 4,0 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 3,9 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 3,8 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 3,7 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 3,6 г/л,
от приблизительно 3,5 г/л до приблизительно 4,3 г/л, от приблизительно 3,5 г/л до приблизительно 4,2 г/л, от приблизительно 3,5 г/л до приблизительно 4,1 г/л, от приблизительно 3,5 г/л до приблизительно 4,0 г/л, от приблизительно 3,5 г/л до приблизительно 3,9 г/л, от приблизительно 3,5 г/л до приблизительно 3,8 г/л, от приблизительно 3,5 г/л до приблизительно 3,7 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 4,3 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 4,2 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 4,1 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 4,0 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 3,9 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 3,8 г/л, от приблизительно 3,7 г/л до приблизительно 4,3 г/л, от приблизительно 3,7 г/л до приблизительно 4,2 г/л, от приблизительно 3,7 г/л до приблизительно 4,1 г/л, от приблизительно 3,7 г/л до приблизительно 4,0 г/л, от приблизительно 3,7 г/л до приблизительно 3,9 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 4,3 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 4,2 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 4,1 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 4,0 г/л, от приблизительно 3,9 г/л до приблизительно 4,3 г/л, от приблизительно 3,9 г/л до приблизительно 4,2 г/л, от приблизительно 3,9 г/л до приблизительно 4,1 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 4,3 г/л,
от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 4,2 г/л или от приблизительно 4,1 г/л до приблизительно 4,3 г/л), в случае типа пор, относящегося к поре, полученной в результате перфорации, и размера пор, составляющего от приблизительно 250 мкм до приблизительно 750 мкм (например, от приблизительно 250 мкм до приблизительно 700 мкм, от приблизительно 250 мкм до приблизительно 650 мкм, от приблизительно 250 мкм до приблизительно 600 мкм, от приблизительно 250 мкм до приблизительно 550 мкм, от приблизительно 250 мкм до приблизительно 500 мкм, от приблизительно 250 мкм до приблизительно 450 мкм, от приблизительно 250 мкм до приблизительно 400 мкм, от приблизительно 250 мкм до приблизительно 350 мкм, от приблизительно 250 мкм до приблизительно 300 мкм, от приблизительно 300 мкм до приблизительно 750 мкм, от приблизительно 300 мкм до приблизительно 700 мкм, от приблизительно 300 мкм до приблизительно 650 мкм, от приблизительно 300 мкм до приблизительно 600 мкм, от приблизительно 300 мкм до приблизительно 550 мкм, от приблизительно 300 мкм до приблизительно 500 мкм, от приблизительно 300 мкм до приблизительно 450 мкм, от приблизительно 300 мкм до приблизительно 400 мкм, от приблизительно 300 мкм до приблизительно 350 мкм, от приблизительно 350 мкм до приблизительно 750 мкм, от приблизительно 350 мкм до приблизительно 700 мкм, от приблизительно 350 мкм до приблизительно 650 мкм, от приблизительно 350 мкм до приблизительно 600 мкм, от приблизительно 350 мкм до приблизительно 550 мкм, от приблизительно 350
мкм до приблизительно 500 мкм, от приблизительно 350 мкм до приблизительно 450 мкм, от приблизительно 350 мкм до приблизительно 400 мкм, от приблизительно 400 мкм до приблизительно 750 мкм, от приблизительно 400 мкм до приблизительно 700 мкм, от приблизительно 400 мкм до приблизительно 650 мкм, от приблизительно 400 мкм до приблизительно 600 мкм, от приблизительно 400 мкм до приблизительно 550 мкм, от приблизительно 400 мкм до приблизительно 500 мкм, от приблизительно 400 мкм до приблизительно 450 мкм, от приблизительно 450 мкм до приблизительно 750 мкм, от приблизительно 450 мкм до приблизительно 700 мкм, от приблизительно 450 мкм до приблизительно 650 мкм, от приблизительно 450 мкм до приблизительно 600 мкм, от приблизительно 450 мкм до приблизительно 550 мкм, от приблизительно 450 мкм до приблизительно 500 мкм, от приблизительно 500 мкм до приблизительно 750 мкм, от приблизительно 500 мкм до приблизительно 700 мкм, от приблизительно 500 мкм до приблизительно 650 мкм, от приблизительно 500 мкм до приблизительно 600 мкм, от приблизительно 500 мкм до приблизительно 550 мкм, от приблизительно 550 мкм до приблизительно 750 мкм, от приблизительно 550 мкм до приблизительно 700 мкм, от приблизительно 550 мкм до приблизительно 650 мкм, от приблизительно 550 мкм до приблизительно 600 мкм, от приблизительно 600 мкм до приблизительно 750 мкм, от приблизительно 600 мкм до приблизительно 700 мкм, от приблизительно 600 мкм до приблизительно 650 мкм, от приблизительно 650 мкм до приблизительно 750 мкм, от приблизительно 650 мкм до приблизительно 700 мкм или от приблизительно 700 мкм до приблизительно 750 мкм).
Способы могут включать, например, осуществление выбора на основании типа пор и размера пор концентрации полоксамера-188 более приблизительно 4,3 г/л (например, концентрации более приблизительно 4,4 г/л, концентрации более приблизительно 4,5 г/л, концентрации более приблизительно 4,6 г/л, концентрации более приблизительно 4,7 г/л, концентрации более приблизительно 4,8 г/л, концентрации более приблизительно 4,9 г/л, концентрации более приблизительно 5,0 г/л, концентрации более приблизительно 5,1 г/л, концентрации более приблизительно 5,2 г/л, концентрации более приблизительно 5,3 г/л, концентрации более приблизительно 5,4 г/л, концентрации более приблизительно 5,5 г/л, концентрации более приблизительно 5,6 г/л, концентрации более приблизительно 5,7 г/л, концентрации более приблизительно 5,8 г/л, концентрации более приблизительно 5,9 г/л, концентрации более приблизительно 6,0 г/л, концентрации более приблизительно 6,1 г/л, концентрации более приблизительно 6,2 г/л, концентрации более приблизительно 6,3 г/л,
концентрации более приблизительно 6,4 г/л, концентрации более приблизительно 6,5 г/л, концентрации более приблизительно 6,6 г/л, концентрации более приблизительно 6,7 г/л, концентрации более приблизительно 6,8 г/л, концентрации более приблизительно 6,9 г/л, концентрации более приблизительно 7,0 г/л, концентрации более приблизительно 7,1 г/л, концентрации более приблизительно 7,2 г/л, концентрации более приблизительно 7,3 г/л, концентрации более приблизительно 7,4 г/л, концентрации более приблизительно 7,5 г/л, концентрации более приблизительно 7,6 г/л, концентрации более приблизительно 7,7 г/л, концентрации более приблизительно 7,8 г/л, концентрации более приблизительно 7,9 г/л, концентрации более приблизительно 8,0 г/л, концентрации более приблизительно 8,1 г/л, концентрации более приблизительно 8,2 г/л, концентрации более приблизительно 8,2 г/л, концентрации более приблизительно 8,3 г/л, концентрации более приблизительно 8,4 г/л, концентрации более приблизительно 8,5 г/л, концентрации более приблизительно 8,6 г/л, концентрации более приблизительно 8,7 г/л, концентрации более приблизительно 8,8 г/л, концентрации более приблизительно 8,9 г/л, концентрации более приблизительно 9,0 г/л, концентрации более приблизительно 9,1 г/л, концентрации более приблизительно 9,2 г/л, концентрации более приблизительно 9,3 г/л, концентрации более приблизительно 9,4 г/л,
концентрации более приблизительно 9,5 г/л, концентрации более приблизительно 9,6 г/л, концентрации более приблизительно 9,7 г/л, концентрации более приблизительно 9,8 г/л, концентрации более приблизительно 9,9 г/л или концентрации более приблизительно 10,0 г/л), в случае типа пор, относящегося к поре, полученной в результате перфорации, и размера пор, составляющего от приблизительно 1 мкм до приблизительно 250 мкм (например, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 200 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 150 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 100 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 50 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 25 мкм, от приблизительно 10 мкм до приблизительно 250 мкм, от приблизительно 10 мкм до приблизительно 200 мкм, от приблизительно 10 мкм до приблизительно 150 мкм, от приблизительно 10 мкм до приблизительно 100 мкм, от приблизительно 10 мкм до приблизительно 50 мкм,
от приблизительно 10 мкм до приблизительно 25 мкм, от приблизительно 25 мкм до приблизительно 250 мкм, от приблизительно 25 мкм до приблизительно 200 мкм, от приблизительно 25 мкм до приблизительно 150 мкм, от приблизительно 25 мкм до приблизительно 100 мкм, от приблизительно 25 мкм до приблизительно 50 мкм, от приблизительно 50 мкм до приблизительно 250 мкм, от приблизительно 50 мкм до приблизительно 200 мкм, от приблизительно 50 мкм до приблизительно 150 мкм, от приблизительно 50 мкм до приблизительно 100 мкм, от приблизительно 100 мкм до приблизительно 250 мкм, от приблизительно 100 мкм до приблизительно 200 мкм, от приблизительно 100 мкм до приблизительно 150 мкм, от приблизительно 150 мкм до приблизительно 250 мкм, от приблизительно 150 мкм до приблизительно 200 мкм или от приблизительно 200 мкм до приблизительно 250 мкм).
В некоторых примерах способы включают осуществление выбора на основании типа пор и размера пор концентрации полоксамера-188 более 4,3 г/л (например, концентрации более приблизительно 4,4 г/л, концентрации более приблизительно 4,5 г/л, концентрации более приблизительно 4,6 г/л, концентрации более приблизительно 4,7 г/л, концентрации более приблизительно 4,8 г/л, концентрации более приблизительно 4,9 г/л, концентрации более приблизительно 5,0 г/л, концентрации более приблизительно 5,1 г/л, концентрации более приблизительно 5,2 г/л, концентрации более приблизительно 5,3 г/л, концентрации более приблизительно 5,4 г/л, концентрации более приблизительно 5,5 г/л, концентрации более приблизительно 5,6 г/л, концентрации более приблизительно 5,7 г/л, концентрации более приблизительно 5,8 г/л, концентрации более приблизительно 5,9 г/л,
концентрации более приблизительно 6,0 г/л, концентрации более приблизительно 6,1 г/л, концентрации более приблизительно 6,2 г/л, концентрации более приблизительно 6,3 г/л, концентрации более приблизительно 6,4 г/л, концентрации более приблизительно 6,5 г/л, концентрации более приблизительно 6,6 г/л, концентрации более приблизительно 6,7 г/л, концентрации более приблизительно 6,8 г/л, концентрации более приблизительно 6,9 г/л, концентрации более приблизительно 7,0 г/л, концентрации более приблизительно 7,1 г/л, концентрации более приблизительно 7,2 г/л, концентрации более приблизительно 7,3 г/л, концентрации более приблизительно 7,4 г/л, концентрации более приблизительно 7,5 г/л, концентрации более приблизительно 7,6 г/л, концентрации более приблизительно 7,7 г/л, концентрации более приблизительно 7,8 г/л, концентрации более приблизительно 7,9 г/л, концентрации более приблизительно 8,0 г/л, концентрации более приблизительно 8,1 г/л, концентрации более приблизительно 8,2 г/л, концентрации более приблизительно 8,2 г/л,
концентрации более приблизительно 8,3 г/л, концентрации более приблизительно 8,4 г/л, концентрации более приблизительно 8,5 г/л, концентрации более приблизительно 8,6 г/л, концентрации более приблизительно 8,7 г/л, концентрации более приблизительно 8,8 г/л, концентрации более приблизительно 8,9 г/л, концентрации более приблизительно 9,0 г/л, концентрации более приблизительно 9,1 г/л, концентрации более приблизительно 9,2 г/л, концентрации более приблизительно 9,3 г/л, концентрации более приблизительно 9,4 г/л, концентрации более приблизительно 9,5 г/л, концентрации более приблизительно 9,6 г/л, концентрации более приблизительно 9,7 г/л, концентрации более приблизительно 9,8 г/л, концентрации более приблизительно 9,9 г/л или концентрации более приблизительно 10,0 г/л), в случае типа пор, относящегося к поре, полученной в результате перфорации, и размера пор, составляющего от приблизительно 160 мкм до приблизительно 190 мкм (например, от приблизительно 160 мкм до приблизительно 185 мкм, от приблизительно 160 мкм до приблизительно 180 мкм, от приблизительно 160 мкм до приблизительно 175 мкм, от приблизительно 160 мкм до приблизительно 170 мкм, от приблизительно 160 мкм до приблизительно 165 мкм, от приблизительно 165 мкм до приблизительно 190 мкм, от приблизительно 165 мкм до приблизительно 185 мкм, от приблизительно 165 мкм до приблизительно 180 мкм, от приблизительно 165 мкм до приблизительно 175 мкм, от приблизительно 165 мкм
до приблизительно 170 мкм, от приблизительно 170 мкм до приблизительно 190 мкм, от приблизительно 170 мкм до приблизительно 185 мкм, от приблизительно 170 мкм до приблизительно 180 мкм, от приблизительно 170 мкм до приблизительно 175 мкм, от приблизительно 175 мкм до приблизительно 190 мкм, от приблизительно 175 мкм до приблизительно 185 мкм, от приблизительно 175 мкм до приблизительно 180 мкм, от приблизительно 180 мкм до приблизительно 190 мкм, от приблизительно 180 мкм до приблизительно 185 мкм или от приблизительно 185 мкм до приблизительно 190 мкм).
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления способы включают осуществление выбора на основании типа пор и размера пор концентрации полоксамера-188 от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 3,3 г/л (например, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 3,2 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 3,1 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 3,0 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 2,9 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 2,8 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 2,7 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 2,6 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 2,5 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 2,4 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 2,3 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 2,2 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 2,1 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 2,0 г/л, от приблизительно 1,9 г/л до приблизительно
3,3 г/л, от приблизительно 1,9 г/л до приблизительно 3,2 г/л, от приблизительно 1,9 г/л до приблизительно 3,1 г/л, от приблизительно 1,9 г/л до приблизительно 3,0 г/л, от приблизительно 1,9 г/л до приблизительно 2,9 г/л, от приблизительно 1,9 г/л до приблизительно 2,8 г/л, от приблизительно 1,9 г/л до приблизительно 2,7 г/л, от приблизительно 1,9 г/л до приблизительно 2,6 г/л, от приблизительно 1,9 г/л до приблизительно 2,5 г/л, от приблизительно 1,9 г/л до приблизительно 2,4 г/л, от приблизительно 1,9 г/л до приблизительно 2,3 г/л, от приблизительно 1,9 г/л до приблизительно 2,2 г/л, от приблизительно 1,9 г/л до приблизительно 2,1 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 3,3 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 3,2 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 3,1 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 3,0 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 2,9 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 2,8 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 2,7 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 2,6 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 2,5 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 2,4 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 2,3 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 2,2 г/л, от приблизительно 2,1 г/л до приблизительно 3,3 г/л, от приблизительно 2,1 г/л до приблизительно 3,2 г/л, от приблизительно 2,1 г/л до приблизительно 3,1 г/л, от приблизительно 2,1 г/л до приблизительно 3,0 г/л, от приблизительно 2,1 г/л до приблизительно 2,9 г/л, от приблизительно 2,1 г/л до
приблизительно 2,8 г/л, от приблизительно 2,1 г/л до приблизительно 2,7 г/л, от приблизительно 2,1 г/л до приблизительно 2,6 г/л, от приблизительно 2,1 г/л до приблизительно 2,5 г/л, от приблизительно 2,1 г/л до приблизительно 2,4 г/л, от приблизительно 2,1 г/л до приблизительно 2,3 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 3,3 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 3,2 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 3,1 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 3,0 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 2,9 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 2,8 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 2,7 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 2,6 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 2,5 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 2,4 г/л, от приблизительно 2,3 г/л до приблизительно 3,3 г/л, от приблизительно 2,3 г/л до приблизительно 3,2 г/л, от приблизительно 2,3 г/л до приблизительно 3,1 г/л, от приблизительно 2,3 г/л до приблизительно 3,0 г/л, от приблизительно 2,3 г/л до
приблизительно 2,9 г/л, от приблизительно 2,3 г/л до приблизительно 2,8 г/л, от приблизительно 2,3 г/л до приблизительно 2,7 г/л, от приблизительно 2,3 г/л до приблизительно 2,6 г/л, от приблизительно 2,3 г/л до приблизительно 2,5 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 3,3 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 3,2 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 3,1 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 3,0 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 2,9 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 2,8 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 2,7 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 2,6 г/л, от приблизительно 2,5 г/л до приблизительно 3,3 г/л, от приблизительно 2,5 г/л до приблизительно 3,2 г/л, от приблизительно 2,5 г/л до приблизительно 3,1 г/л, от приблизительно 2,5 г/л до приблизительно 3,0 г/л, от приблизительно 2,5 г/л до приблизительно 2,9 г/л, от приблизительно 2,5 г/л до приблизительно 2,8 г/л, от приблизительно 2,5 г/л до приблизительно 2,7 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 3,3 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 3,2 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 3,1 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 3,0 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до
приблизительно 2,9 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 2,8 г/л, от приблизительно 2,7 г/л до приблизительно 3,3 г/л, от приблизительно 2,7 г/л до приблизительно 3,2 г/л, от приблизительно 2,7 г/л до приблизительно 3,1 г/л, от приблизительно 2,7 г/л до приблизительно 3,0 г/л, от приблизительно 2,7 г/л до приблизительно 2,9 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 3,3 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 3,2 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 3,1 г/л, от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 3,0 г/л, от приблизительно 2,9 г/л до приблизительно 3,3 г/л, от приблизительно 2,9 г/л до приблизительно 3,2 г/л, от приблизительно 2,9 г/л до приблизительно 3,1 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 3,3 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 3,2 г/л или от приблизительно 3,1 г/л до приблизительно 3,3 г/л), в случае типа пор, относящегося к поре, полученной в результате спекания, и размера пор, составляющего более 150 мкм (например, более 155 мкм, более 160 мкм, более 165 мкм, более 170 мкм, более 175 мкм, более приблизительно 180 мкм, более 185 мкм,
более приблизительно 190 мкм, более приблизительно 195 мкм, более приблизительно 200 мкм, более приблизительно 205 мкм, более приблизительно 210 мкм, более приблизительно 215 мкм, более приблизительно 220 мкм, более приблизительно 225 мкм, более приблизительно 230 мкм, более приблизительно 235 мкм, более приблизительно 240 мкм, более приблизительно 245 мкм, более приблизительно 250 мкм, более приблизительно 255 мкм, более приблизительно 260 мкм, более приблизительно 265 мкм, более приблизительно 270 мкм, более приблизительно 275 мкм, более приблизительно 280 мкм, более приблизительно 290 мкм, более приблизительно 300 мкм, более приблизительно 350 мкм, более приблизительно 400 мкм, более приблизительно 450 мкм или более приблизительно 500 мкм).
Способы могут включать, например, осуществление выбора на основании типа пор и размера пор концентрации полоксамера-188 от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 4,3 г/л (например, от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 4,2 г/л, от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 4,1 г/л, от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 4,0 г/л, от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 3,9 г/л, от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 3,8 г/л, от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 3,7 г/л, от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 3,6 г/л, от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 3,5 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 4,3 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 4,2 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 4,1 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 4,0 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 3,9 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 3,8 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 3,7 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 3,6 г/л, от приблизительно 3,5 г/л до приблизительно 4,3 г/л, от приблизительно 3,5 г/л до приблизительно 4,2 г/л,
от приблизительно 3,5 г/л до приблизительно 4,1 г/л, от приблизительно 3,5 г/л до приблизительно 4,0 г/л, от приблизительно 3,5 г/л до приблизительно 3,9 г/л, от приблизительно 3,5 г/л до приблизительно 3,8 г/л, от приблизительно 3,5 г/л до приблизительно 3,7 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 4,3 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 4,2 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 4,1 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 4,0 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 3,9 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 3,8 г/л, от приблизительно 3,7 г/л до приблизительно 4,3 г/л, от приблизительно 3,7 г/л до приблизительно 4,2 г/л, от приблизительно 3,7 г/л до приблизительно 4,1 г/л,
от приблизительно 3,7 г/л до приблизительно 4,0 г/л, от приблизительно 3,7 г/л до приблизительно 3,9 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 4,3 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 4,2 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 4,1 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 4,0 г/л, от приблизительно 3,9 г/л до приблизительно 4,3 г/л, от приблизительно 3,9 г/л до приблизительно 4,2 г/л, от приблизительно 3,9 г/л до приблизительно 4,1 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 4,3 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 4,2 г/л или от приблизительно 4,1 г/л до приблизительно 4,3 г/л), в случае типа пор, относящегося к поре, полученной в результате спекания, и размера пор, составляющего от приблизительно 80 мкм до приблизительно 150 мкм (например, от приблизительно 80 мкм до приблизительно 145 мкм, от приблизительно 80 мкм до приблизительно 140 мкм, от приблизительно 80 мкм до приблизительно 135 мкм, от приблизительно 80 мкм до приблизительно 130 мкм, от приблизительно 80 мкм до приблизительно 125 мкм, от приблизительно 80 мкм до приблизительно 120 мкм, от приблизительно 80 мкм до приблизительно 115 мкм, от приблизительно 80 мкм до приблизительно 110 мкм, от приблизительно 80 мкм до приблизительно 105 мкм, от приблизительно 80 мкм до приблизительно 100 мкм, от приблизительно 80 мкм до приблизительно 95 мкм, от приблизительно 80 мкм
до приблизительно 90 мкм, от приблизительно 80 мкм до приблизительно 85 мкм, от приблизительно 85 мкм до приблизительно 150 мкм, от приблизительно 85 мкм до приблизительно 145 мкм, от приблизительно 85 мкм до приблизительно 140 мкм, от приблизительно 85 мкм до приблизительно 135 мкм, от приблизительно 85 мкм до приблизительно 130 мкм, от приблизительно 85 мкм до приблизительно 125 мкм, от приблизительно 85 мкм до приблизительно 120 мкм, от приблизительно 85 мкм до приблизительно 115 мкм, от приблизительно 85 мкм до приблизительно 110 мкм, от приблизительно 85 мкм до приблизительно 105 мкм, от приблизительно 85 мкм до приблизительно 100 мкм, от приблизительно 85 мкм до приблизительно 95 мкм, от приблизительно 85 мкм до приблизительно 90 мкм, от приблизительно 90 мкм до приблизительно 150 мкм, от приблизительно 90 мкм до приблизительно 145 мкм, от приблизительно 90 мкм до приблизительно 140 мкм, от приблизительно 90 мкм до приблизительно 135 мкм, от приблизительно 90 мкм до приблизительно 130 мкм, от приблизительно 90 мкм до приблизительно 125 мкм, от приблизительно 90 мкм до приблизительно 120 мкм, от приблизительно 90 мкм до приблизительно 115 мкм, от приблизительно 90 мкм до приблизительно 110 мкм, от приблизительно 90 мкм до
приблизительно 105 мкм, от приблизительно 90 мкм до приблизительно 100 мкм, от приблизительно 90 мкм до приблизительно 95 мкм, от приблизительно 95 мкм до приблизительно 150 мкм, от приблизительно 95 мкм до приблизительно 145 мкм, от приблизительно 95 мкм до приблизительно 140 мкм, от приблизительно 95 мкм до приблизительно 135 мкм, от приблизительно 95 мкм до приблизительно 130 мкм, от приблизительно 95 мкм до приблизительно 125 мкм, от приблизительно 95 мкм до приблизительно 120 мкм, от приблизительно 95 мкм до приблизительно 115 мкм, от приблизительно 95 мкм до приблизительно 110 мкм, от приблизительно 95 мкм до приблизительно 105 мкм, от приблизительно 95 мкм до приблизительно 100 мкм, от приблизительно 100 мкм до приблизительно 150 мкм, от приблизительно 100 мкм до приблизительно 145 мкм, от приблизительно 100 мкм до приблизительно 140 мкм, от приблизительно 100 мкм до приблизительно 135 мкм, от приблизительно 100 мкм до приблизительно 130 мкм, от приблизительно 100 мкм до приблизительно 125 мкм, от приблизительно 100 мкм до приблизительно 120 мкм, от приблизительно 100 мкм до приблизительно 115 мкм, от приблизительно 100 мкм до
приблизительно 110 мкм, от приблизительно 100 мкм до приблизительно 105 мкм, от приблизительно 105 мкм до приблизительно 150 мкм, от приблизительно 105 мкм до приблизительно 145 мкм, от приблизительно 105 мкм до приблизительно 140 мкм, от приблизительно 105 мкм до приблизительно 135 мкм, от приблизительно 105 мкм до приблизительно 130 мкм, от приблизительно 105 мкм до приблизительно 125 мкм, от приблизительно 105 мкм до приблизительно 120 мкм, от приблизительно 105 мкм до приблизительно 115 мкм, от приблизительно 105 мкм до приблизительно 110 мкм, от приблизительно 110 мкм до приблизительно 150 мкм, от приблизительно 110 мкм до приблизительно 145 мкм, от приблизительно 110 мкм до приблизительно 140 мкм, от приблизительно 110 мкм до приблизительно 135 мкм, от приблизительно 110 мкм до приблизительно 130 мкм, от приблизительно 110 мкм до приблизительно 125 мкм, от приблизительно 110 мкм до приблизительно 120 мкм, от приблизительно 110 мкм до приблизительно 115 мкм, от приблизительно 115 мкм до приблизительно 150 мкм, от приблизительно 115 мкм до приблизительно 145 мкм, от приблизительно 115 мкм до приблизительно 140 мкм, от приблизительно 115 мкм до приблизительно 135 мкм, от приблизительно 115 мкм до приблизительно 130 мкм, от приблизительно 115 мкм до приблизительно 125 мкм, от приблизительно 115 мкм до приблизительно 120 мкм, от приблизительно 120 мкм до приблизительно 150 мкм, от приблизительно 120 мкм до приблизительно 145 мкм, от приблизительно 120 мкм до приблизительно 140 мкм, от приблизительно 120 мкм до приблизительно 135 мкм, от приблизительно 120 мкм до приблизительно 130 мкм, от приблизительно 120 мкм до приблизительно 125 мкм, от приблизительно 125 мкм до
приблизительно 150 мкм, от приблизительно 125 мкм до приблизительно 145 мкм, от приблизительно 125 мкм до приблизительно 140 мкм, от приблизительно 125 мкм до приблизительно 135 мкм, от приблизительно 125 мкм до приблизительно 130 мкм, от приблизительно 130 мкм до приблизительно 150 мкм, от приблизительно 130 мкм до приблизительно 145 мкм, от приблизительно 130 мкм до приблизительно 140 мкм, от приблизительно 130 мкм до приблизительно 135 мкм, от приблизительно 135 мкм до приблизительно 150 мкм, от приблизительно 135 мкм до приблизительно 145 мкм, от приблизительно 135 мкм до приблизительно 140 мкм, от приблизительно 140 мкм до приблизительно 150 мкм, от приблизительно 140 мкм до приблизительно 145 мкм или от приблизительно 145 мкм до приблизительно 150 мкм).
Способы могут включать, например, осуществление выбора на основании типа пор и размера пор концентрации полоксамера-188 приблизительно 4,5 г/л или концентрации более приблизительно 4,5 г/л (например, концентрации приблизительно 4,6 г/л или концентрации более 4,6 г/л, концентрации приблизительно 4,7 г/л или концентрации более 4,7 г/л, концентрации приблизительно 4,8 г/л или концентрации более 4,8 г/л, концентрации приблизительно 4,9 г/л или концентрации более 4,9 г/л, концентрации приблизительно 5,0 г/л или концентрации более 5,0 г/л, концентрации приблизительно 5,1 г/л или концентрации более 5,1 г/л, концентрации приблизительно 5,2 г/л или концентрации более 5,2 г/л, концентрации приблизительно 5,3 г/л или концентрации более 5,3 г/л, концентрации приблизительно 5,4 г/л или концентрации более 5,4 г/л, концентрации приблизительно 5,5 г/л или концентрации более 5,5 г/л, концентрации приблизительно 5,6 г/л или концентрации более 5,6 г/л,
концентрации приблизительно 5,7 г/л или концентрации более 5,7 г/л, концентрации приблизительно 5,8 г/л или концентрации более 5,8 г/л, концентрации приблизительно 6,0 г/л или концентрации более 6,0 г/л, концентрации приблизительно 6,1 г/л или концентрации более 6,1 г/л, концентрации приблизительно 6,2 г/л или концентрации более 6,2 г/л, концентрации приблизительно 6,3 г/л или концентрации более 6,3 г/л, концентрации приблизительно 6,4 г/л или концентрации более 6,4 г/л, концентрации приблизительно 6,5 г/л или концентрации более 6,5 г/л, концентрации приблизительно 6,6 г/л или концентрации более 6,6 г/л, концентрации приблизительно 6,7 г/л или концентрации более 6,7 г/л, концентрации приблизительно 6,8 г/л или концентрации более 6,8 г/л, концентрации приблизительно 6,9 г/л или концентрации более 6,9 г/л,
концентрации приблизительно 7,0 г/л или концентрации более 7,0 г/л, концентрации приблизительно 7,1 г/л или концентрации более 7,1 г/л, концентрации приблизительно 7,2 г/л или концентрации более 7,2 г/л, концентрации приблизительно 7,3 г/л или концентрации более 7,3 г/л, концентрации приблизительно 7,4 г/л или концентрации более 7,4 г/л, концентрации приблизительно 7,5 г/л или концентрации более 7,5 г/л, концентрации приблизительно 7,6 г/л или концентрации более 7,6 г/л, концентрации приблизительно 7,7 г/л или концентрации более 7,7 г/л, концентрации приблизительно 7,8 г/л или концентрации более 7,8 г/л, концентрации приблизительно 7,9 г/л или концентрации более 7,9 г/л, концентрации приблизительно 8,0 г/л или концентрации более 8,0 г/л,
концентрации приблизительно 8,1 г/л или концентрации более 8,1 г/л, в концентрации приблизительно 8,2 г/л или в концентрации более 8,2 г/л, концентрации приблизительно 8,3 г/л или концентрации более 8,3 г/л, концентрации приблизительно 8,4 г/л или концентрации более 8,4 г/л, концентрации приблизительно 8,5 г/л или концентрации более 8,5 г/л, концентрации приблизительно 8,6 г/л или концентрации более 8,6 г/л, концентрации приблизительно 8,7 г/л или концентрации более 8,7 г/л, концентрации приблизительно 8,8 г/л или концентрации более 8,8 г/л, концентрации приблизительно 8,9 г/л или концентрации более 8,9 г/л, концентрации приблизительно 9,0 г/л или концентрации более 9,0 г/л, концентрации приблизительно 9,1 г/л или концентрации более 9,1 г/л, концентрации приблизительно 9,2 г/л или концентрации более 9,2 г/л, концентрации приблизительно 9,3 г/л или концентрации более 9,3 г/л,
концентрации приблизительно 9,4 г/л или концентрации более 9,4 г/л, концентрации приблизительно 9,5 г/л или концентрации более 9,5 г/л, концентрации приблизительно 9,6 г/л или концентрации более 9,6 г/л, концентрации приблизительно 9,7 г/л или концентрации более 9,7 г/л, концентрации приблизительно 9,8 г/л или концентрации более 9,8 г/л, концентрации приблизительно 9,9 г/л или концентрации более 9,9 г/л или концентрации приблизительно 10,0 г/л или концентрации более 10,0 г/л), в случае типа пор, относящегося к поре, полученной в результате спекания, и размера пор, составляющего от приблизительно 1 мкм до приблизительно 80 мкм (например, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 50 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 25 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 10 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 5 мкм, от приблизительно 5 мкм до приблизительно 80 мкм, от приблизительно 5 мкм до приблизительно 50 мкм, от приблизительно 5 мкм до приблизительно 25 мкм, от приблизительно 5 мкм до приблизительно 10 мкм, от приблизительно 10 мкм до приблизительно 80 мкм, от приблизительно 10 мкм до приблизительно 50 мкм, от приблизительно 10 мкм до приблизительно 25 мкм, от приблизительно 25 мкм до приблизительно 80 мкм, от приблизительно 25 мкм до приблизительно 50 мкм или от приблизительно 50 мкм до приблизительно 80 мкм).
Если культивирование представляет собой перфузионное культивирование, то вторая жидкая среда может содержать полоксамер-188 в выбранной концентрации.
Повышение концентрации полоксамера-188 на основании плотности жизнеспособных клеток
Некоторые варианты осуществления любого из способов, описанных в данном документе, включают обеспечение повышения концентрации полоксамера-188 с течением времени на основании плотности жизнеспособных клеток в среде. Например, любой из способов, описанных в данном документе, может включать обеспечение повышения концентрации полоксамера-188 в среде до более 1,8 г/л (например, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 3,0 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 2,9 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 2,8 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 2,7 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 2,5 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 2,4 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 2,3 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 2,2 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 2,1 г/л, от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 2,0 г/л, от приблизительно 1,9 г/л до приблизительно 3,0 г/л, от приблизительно 1,9 г/л до приблизительно 2,9 г/л, от приблизительно 1,9 г/л до приблизительно 2,8 г/л, от приблизительно 1,9 г/л до приблизительно 2,7 г/л, от приблизительно 1,9 г/л до приблизительно 2,6 г/л, от приблизительно 1,9 г/л до приблизительно 2,5 г/л, от приблизительно 1,9 г/л до приблизительно 2,4 г/л, от приблизительно 1,9 г/л до приблизительно 2,3 г/л, от приблизительно 1,9 г/л до приблизительно 2,2 г/л, от приблизительно 1,9 г/л до приблизительно 2,1 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 3,0 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 2,9
г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 2,8 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 2,7 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 2,6 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 2,5 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 2,4 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 2,3 г/л, от приблизительно 2,0 г/л до приблизительно 2,2 г/л, от приблизительно 2,1 г/л до приблизительно 3,0 г/л, от приблизительно 2,1 г/л до приблизительно 2,9 г/л, от приблизительно 2,1 г/л до приблизительно 2,8 г/л, от приблизительно 2,1 г/л до приблизительно 2,7 г/л, от приблизительно 2,1 г/л до приблизительно 2,6 г/л, от приблизительно 2,1 г/л до приблизительно 2,5 г/л, от приблизительно 2,1 г/л до приблизительно 2,4 г/л, от приблизительно 2,1 г/л до приблизительно 2,3 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 3,0 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 2,9 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 2,8 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 2,7 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 2,6 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 2,5 г/л, от приблизительно 2,2 г/л до приблизительно 2,4 г/л, от приблизительно 2,3 г/л до приблизительно 3,0 г/л, от приблизительно 2,3 г/л до приблизительно 2,9
г/л, от приблизительно 2,3 г/л до приблизительно 2,8 г/л, от приблизительно 2,3 г/л до приблизительно 2,7 г/л, от приблизительно 2,3 г/л до приблизительно 2,6 г/л, от приблизительно 2,3 г/л до приблизительно 2,5 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 3,0 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 2,9 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 2,8 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 2,7 г/л, от приблизительно 2,4 г/л до приблизительно 2,6 г/л, от приблизительно 2,5 г/л до приблизительно 3,0 г/л, от приблизительно 2,5 г/л до приблизительно 2,9 г/л, от приблизительно 2,5 г/л до приблизительно 2,8 г/л, от приблизительно 2,5 г/л до приблизительно 2,7 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 3,0 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 2,9 г/л, от приблизительно 2,6 г/л до приблизительно 2,8 г/л, от приблизительно 2,7 г/л до приблизительно 3,0 г/л, от приблизительно 2,7 г/л до приблизительно 2,9 г/л или от приблизительно 2,8 г/л до приблизительно 3,0 г/л), когда плотность жизнеспособных клеток в среде составляет от приблизительно 20×106 клеток/мл до приблизительно 60×106 клеток/мл (например, от приблизительно 20×106 клеток/мл до приблизительно 58×106 клеток/мл, от приблизительно 20×106 клеток/мл до приблизительно 56×106 клеток/мл, от приблизительно 20×106 клеток/мл до приблизительно 54×106 клеток/мл, от приблизительно 20×106 клеток/мл до приблизительно 52×106 клеток/мл, от приблизительно 20×106 клеток/мл до приблизительно 50×106 клеток/мл, от приблизительно 20×106 клеток/мл до приблизительно 48×106 клеток/мл, от приблизительно 20×106 клеток/мл до приблизительно 46×106 клеток/мл, от приблизительно 20×106 клеток/мл до приблизительно 44×106 клеток/мл,
от приблизительно 20×106 клеток/мл до приблизительно 42×106 клеток/мл, от приблизительно 20×106 клеток/мл до приблизительно 40×106 клеток/мл, от приблизительно 20×106 клеток/мл до приблизительно 38×106 клеток/мл, от приблизительно 20×106 клеток/мл до приблизительно 36×106 клеток/мл, от приблизительно 20×106 клеток/мл до приблизительно 34×106 клеток/мл, от приблизительно 20×106 клеток/мл до приблизительно 32×106 клеток/мл, от приблизительно 20×106 клеток/мл до приблизительно 30×106 клеток/мл, от приблизительно 20×106 клеток/мл до приблизительно 28×106 клеток/мл, от приблизительно 20×106 клеток/мл до приблизительно 26×106 клеток/мл, от приблизительно 20×106 клеток/мл до приблизительно 24×106 клеток/мл, от приблизительно 20×106 клеток/мл до приблизительно 22×106 клеток/мл, от приблизительно 22×106 клеток/мл до приблизительно 60×106 клеток/мл,
от приблизительно 22×106 клеток/мл до приблизительно 58×106 клеток/мл, от приблизительно 22×106 клеток/мл до приблизительно 56×106 клеток/мл, от приблизительно 22×106 клеток/мл до приблизительно 54×106 клеток/мл, от приблизительно 22×106 клеток/мл до приблизительно 52×106 клеток/мл, от приблизительно 22×106 клеток/мл до приблизительно 50×106 клеток/мл, от приблизительно 22×106 клеток/мл до приблизительно 48×106 клеток/мл, от приблизительно 22×106 клеток/мл до приблизительно 46×106 клеток/мл, от приблизительно 22×106 клеток/мл до приблизительно 44×106 клеток/мл, от приблизительно 22×106 клеток/мл до приблизительно 42×106 клеток/мл, от приблизительно 22×106 клеток/мл до приблизительно 40×106 клеток/мл, от приблизительно 22×106 клеток/мл до приблизительно 38×106 клеток/мл, от приблизительно 22×106 клеток/мл до приблизительно 36×106 клеток/мл, от приблизительно 22×106 клеток/мл до приблизительно 34×106 клеток/мл, от приблизительно 22×106
клеток/мл до приблизительно 32×106 клеток/мл, от приблизительно 22×106 клеток/мл до приблизительно 30×106 клеток/мл, от приблизительно 22×106 клеток/мл до приблизительно 28×106 клеток/мл, от приблизительно 22×106 клеток/мл до приблизительно 26×106 клеток/мл, от приблизительно 22×106 клеток/мл до приблизительно 24×106 клеток/мл, от приблизительно 24×106 клеток/мл до приблизительно 60×106 клеток/мл, от приблизительно 24×106 клеток/мл до приблизительно 58×106 клеток/мл, от приблизительно 24×106 клеток/мл до приблизительно 56×106 клеток/мл, от приблизительно 24×106 клеток/мл до приблизительно 54×106 клеток/мл, от приблизительно 24×106 клеток/мл до приблизительно 52×106 клеток/мл, от приблизительно 24×106 клеток/мл до приблизительно 50×106 клеток/мл, от приблизительно 24×106 клеток/мл до приблизительно 48×106 клеток/мл, от приблизительно 24×106 клеток/мл до приблизительно 46×106 клеток/мл, от приблизительно 24×106 клеток/мл до приблизительно 44×106 клеток/мл, от приблизительно 24×106 клеток/мл до приблизительно 42×106 клеток/мл, от приблизительно 24×106 клеток/мл до приблизительно 40×106 клеток/мл, от приблизительно 24×106 клеток/мл до приблизительно 38×106 клеток/мл, от приблизительно 24×106 клеток/мл до приблизительно 36×106 клеток/мл, от приблизительно 24×106 клеток/мл до приблизительно 34×106 клеток/мл,
от приблизительно 24×106 клеток/мл до приблизительно 32×106 клеток/мл, от приблизительно 24×106 клеток/мл до приблизительно 30×106 клеток/мл, от приблизительно 24×106 клеток/мл до приблизительно 28×106 клеток/мл, от приблизительно 24×106 клеток/мл до приблизительно 26×106 клеток/мл, от приблизительно 26×106 клеток/мл до приблизительно 60×106 клеток/мл, от приблизительно 26×106 клеток/мл до приблизительно 58×106 клеток/мл, от приблизительно 26×106 клеток/мл до приблизительно 56×106 клеток/мл, от приблизительно 26×106 клеток/мл до приблизительно 54×106 клеток/мл, от приблизительно 26×106 клеток/мл до приблизительно 52×106 клеток/мл, от приблизительно 26×106 клеток/мл до приблизительно 50×106 клеток/мл, от приблизительно 26×106 клеток/мл до приблизительно 48×106 клеток/мл, от приблизительно 26×106 клеток/мл до приблизительно 46×106 клеток/мл,
от приблизительно 26×106 клеток/мл до приблизительно 44×106 клеток/мл, от приблизительно 26×106 клеток/мл до приблизительно 42×106 клеток/мл, от приблизительно 26×106 клеток/мл до приблизительно 40×106 клеток/мл, от приблизительно 26×106 клеток/мл до приблизительно 38×106 клеток/мл, от приблизительно 26×106 клеток/мл до приблизительно 36×106 клеток/мл, от приблизительно 26×106 клеток/мл до приблизительно 34×106 клеток/мл, от приблизительно 26×106 клеток/мл до приблизительно 32×106 клеток/мл, от приблизительно 26×106 клеток/мл до приблизительно 30×106 клеток/мл, от приблизительно 26×106 клеток/мл до приблизительно 28×106 клеток/мл, от приблизительно 28×106 клеток/мл до приблизительно 60×106 клеток/мл, от приблизительно 28×106 клеток/мл до приблизительно 58×106 клеток/мл, от приблизительно 28×106 клеток/мл до приблизительно 56×106 клеток/мл, от приблизительно 28×106 клеток/мл до приблизительно 54×106 клеток/мл, от приблизительно 28×106 клеток/мл до приблизительно 52×106 клеток/мл, от приблизительно 28×106 клеток/мл до приблизительно 50×106 клеток/мл, от приблизительно 28×106 клеток/мл до приблизительно 48×106 клеток/мл,
от приблизительно 28×106 клеток/мл до приблизительно 46×106 клеток/мл, от приблизительно 28×106 клеток/мл до приблизительно 44×106 клеток/мл, от приблизительно 28×106 клеток/мл до приблизительно 42×106 клеток/мл, от приблизительно 28×106 клеток/мл до приблизительно 40×106 клеток/мл, от приблизительно 28×106 клеток/мл до приблизительно 38×106 клеток/мл, от приблизительно 28×106 клеток/мл до приблизительно 36×106 клеток/мл, от приблизительно 28×106 клеток/мл до приблизительно 34×106 клеток/мл, от приблизительно 28×106 клеток/мл до приблизительно 32×106 клеток/мл, от приблизительно 28×106 клеток/мл до приблизительно 30×106 клеток/мл, от приблизительно 30×106 клеток/мл до приблизительно 60×106 клеток/мл, от приблизительно 30×106 клеток/мл до приблизительно 58×106 клеток/мл, от приблизительно 30×106 клеток/мл до приблизительно 56×106 клеток/мл, от приблизительно 30×106 клеток/мл до приблизительно 54×106 клеток/мл, от приблизительно 30×106
клеток/мл до приблизительно 52×106 клеток/мл, от приблизительно 30×106 клеток/мл до приблизительно 50×106 клеток/мл, от приблизительно 30×106 клеток/мл до приблизительно 48×106 клеток/мл, от приблизительно 30×106 клеток/мл до приблизительно 46×106 клеток/мл, от приблизительно 30×106 клеток/мл до приблизительно 44×106 клеток/мл, от приблизительно 30×106 клеток/мл до приблизительно 42×106 клеток/мл, от приблизительно 30×106 клеток/мл до приблизительно 40×106 клеток/мл, от приблизительно 30×106 клеток/мл до приблизительно 38×106 клеток/мл, от приблизительно 30×106 клеток/мл до приблизительно 36×106 клеток/мл, от приблизительно 30×106 клеток/мл до приблизительно 34×106 клеток/мл, от приблизительно 30×106 клеток/мл до приблизительно 32×106 клеток/мл, от приблизительно 32×106 клеток/мл до приблизительно 60×106 клеток/мл, от приблизительно 32×106 клеток/мл до приблизительно 58×106 клеток/мл, от приблизительно 32×106 клеток/мл до приблизительно 56×106 клеток/мл, от приблизительно 32×106 клеток/мл до приблизительно 54×106 клеток/мл, от приблизительно 32×106 клеток/мл до приблизительно 52×106 клеток/мл, от приблизительно 32×106 клеток/мл до приблизительно 50×106 клеток/мл, от приблизительно 32×106 клеток/мл до приблизительно 48×106 клеток/мл, от приблизительно 32×106 клеток/мл до приблизительно 46×106 клеток/мл,
от приблизительно 32×106 клеток/мл до приблизительно 44×106 клеток/мл, от приблизительно 32×106 клеток/мл до приблизительно 42×106 клеток/мл, от приблизительно 32×106 клеток/мл до приблизительно 40×106 клеток/мл, от приблизительно 32×106 клеток/мл до приблизительно 38×106 клеток/мл, от приблизительно 32×106 клеток/мл до приблизительно 36×106 клеток/мл, от приблизительно 32×106 клеток/мл до приблизительно 34×106 клеток/мл, от приблизительно 34×106 клеток/мл до приблизительно 60×106 клеток/мл, от приблизительно 34×106 клеток/мл до приблизительно 58×106 клеток/мл, от приблизительно 34×106 клеток/мл до приблизительно 56×106 клеток/мл, от приблизительно 34×106 клеток/мл до приблизительно 54×106 клеток/мл, от приблизительно 34×106 клеток/мл до приблизительно 52×106 клеток/мл, от приблизительно 34×106 клеток/мл до приблизительно 50×106 клеток/мл,
от приблизительно 34×106 клеток/мл до приблизительно 48×106 клеток/мл, от приблизительно 34×106 клеток/мл до приблизительно 46×106 клеток/мл, от приблизительно 34×106 клеток/мл до приблизительно 44×106 клеток/мл, от приблизительно 34×106 клеток/мл до приблизительно 42×106 клеток/мл, от приблизительно 34×106 клеток/мл до приблизительно 40×106 клеток/мл, от приблизительно 34×106 клеток/мл до приблизительно 38×106 клеток/мл, от приблизительно 34×106 клеток/мл до приблизительно 36×106 клеток/мл, от приблизительно 36×106 клеток/мл до приблизительно 60×106 клеток/мл, от приблизительно 36×106 клеток/мл до приблизительно 58×106 клеток/мл, от приблизительно 36×106 клеток/мл до приблизительно 56×106 клеток/мл, от приблизительно 36×106 клеток/мл до приблизительно 54×106 клеток/мл, от приблизительно 36×106 клеток/мл до приблизительно 52×106 клеток/мл, от приблизительно 36×106 клеток/мл до приблизительно 50×106 клеток/мл, от приблизительно 36×106 клеток/мл до приблизительно 48×106 клеток/мл, от приблизительно 36×106 клеток/мл до приблизительно 46×106 клеток/мл, от приблизительно 36×106 клеток/мл до приблизительно 44×106 клеток/мл,
от приблизительно 36×106 клеток/мл до приблизительно 42×106 клеток/мл, от приблизительно 36×106 клеток/мл до приблизительно 40×106 клеток/мл, от приблизительно 36×106 клеток/мл до приблизительно 38×106 клеток/мл, от приблизительно 38×106 клеток/мл до приблизительно 60×106 клеток/мл, от приблизительно 38×106 клеток/мл до приблизительно 58×106 клеток/мл, от приблизительно 38×106 клеток/мл до приблизительно 56×106 клеток/мл, от приблизительно 38×106 клеток/мл до приблизительно 54×106 клеток/мл, от приблизительно 38×106 клеток/мл до приблизительно 52×106 клеток/мл, от приблизительно 38×106 клеток/мл до приблизительно 50×106 клеток/мл, от приблизительно 38×106 клеток/мл до приблизительно 48×106 клеток/мл, от приблизительно 38×106 клеток/мл до приблизительно 46×106 клеток/мл, от приблизительно 38×106 клеток/мл до приблизительно 44×106 клеток/мл,
от приблизительно 38×106 клеток/мл до приблизительно 42×106 клеток/мл, от приблизительно 38×106 клеток/мл до приблизительно 40×106 клеток/мл, от приблизительно 40×106 клеток/мл до приблизительно 60×106 клеток/мл, от приблизительно 40×106 клеток/мл до приблизительно 58×106 клеток/мл, от приблизительно 40×106 клеток/мл до приблизительно 56×106 клеток/мл, от приблизительно 40×106 клеток/мл до приблизительно 54×106 клеток/мл, от приблизительно 40×106 клеток/мл до приблизительно 52×106 клеток/мл, от приблизительно 40×106 клеток/мл до приблизительно 50×106 клеток/мл, от приблизительно 40×106 клеток/мл до приблизительно 48×106 клеток/мл, от приблизительно 40×106 клеток/мл до приблизительно 46×106 клеток/мл, от приблизительно 40×106 клеток/мл до приблизительно 44×106 клеток/мл, от приблизительно 40×106 клеток/мл до приблизительно 42×106 клеток/мл,
от приблизительно 42×106 клеток/мл до приблизительно 60×106 клеток/мл, от приблизительно 42×106 клеток/мл до приблизительно 58×106 клеток/мл, от приблизительно 42×106 клеток/мл до приблизительно 56×106 клеток/мл, от приблизительно 42×106 клеток/мл до приблизительно 54×106 клеток/мл, от приблизительно 42×106 клеток/мл до приблизительно 52×106 клеток/мл, от приблизительно 42×106 клеток/мл до приблизительно 50×106 клеток/мл, от приблизительно 42×106 клеток/мл до приблизительно 48×106 клеток/мл, от приблизительно 42×106 клеток/мл до приблизительно 46×106 клеток/мл,
от приблизительно 42×106 клеток/мл до приблизительно 44×106 клеток/мл, от приблизительно 44×106 клеток/мл до приблизительно 60×106 клеток/мл, от приблизительно 44×106 клеток/мл до приблизительно 58×106 клеток/мл, от приблизительно 44×106 клеток/мл до приблизительно 56×106 клеток/мл, от приблизительно 44×106 клеток/мл до приблизительно 54×106 клеток/мл, от приблизительно 44×106 клеток/мл до приблизительно 52×106 клеток/мл, от приблизительно 44×106 клеток/мл до приблизительно 50×106 клеток/мл, от приблизительно 44×106 клеток/мл до приблизительно 48×106 клеток/мл,
от приблизительно 44×106 клеток/мл до приблизительно 46×106 клеток/мл, от приблизительно 46×106 клеток/мл до приблизительно 60×106 клеток/мл, от приблизительно 46×106 клеток/мл до приблизительно 58×106 клеток/мл, от приблизительно 46×106 клеток/мл до приблизительно 56×106 клеток/мл, от приблизительно 46×106 клеток/мл до приблизительно 54×106 клеток/мл, от приблизительно 46×106 клеток/мл до приблизительно 52×106 клеток/мл, от приблизительно 46×106 клеток/мл до приблизительно 50×106 клеток/мл, от приблизительно 46×106 клеток/мл до приблизительно 48×106 клеток/мл,
от приблизительно 48×106 клеток/мл до приблизительно 60×106 клеток/мл, от приблизительно 48×106 клеток/мл до приблизительно 58×106 клеток/мл, от приблизительно 48×106 клеток/мл до приблизительно 56×106 клеток/мл, от приблизительно 48×106 клеток/мл до приблизительно 54×106 клеток/мл, от приблизительно 48×106 клеток/мл до приблизительно 52×106 клеток/мл, от приблизительно 48×106 клеток/мл до приблизительно 50×106 клеток/мл, от приблизительно 50×106 клеток/мл до приблизительно 60×106 клеток/мл, от приблизительно 50×106 клеток/мл до приблизительно 58×106 клеток/мл,
от приблизительно 50×106 клеток/мл до приблизительно 56×106 клеток/мл, от приблизительно 50×106 клеток/мл до приблизительно 54×106 клеток/мл, от приблизительно 50×106 клеток/мл до приблизительно 52×106 клеток/мл, от приблизительно 52×106 клеток/мл до приблизительно 60×106 клеток/мл,
от приблизительно 52×106 клеток/мл до приблизительно 58×106 клеток/мл, от приблизительно 52×106 клеток/мл до приблизительно 56×106 клеток/мл, от приблизительно 52×106 клеток/мл до приблизительно 54×106 клеток/мл, от приблизительно 54×106 клеток/мл до приблизительно 60×106 клеток/мл, от приблизительно 54×106 клеток/мл до приблизительно 58×106 клеток/мл, от приблизительно 54×106 клеток/мл до приблизительно 56×106 клеток/мл, от приблизительно 56×106 клеток/мл до приблизительно 60×106 клеток/мл, от приблизительно 56×106 клеток/мл до приблизительно 58×106 клеток/мл или от приблизительно 58×106 клеток/мл до приблизительно 60×106 клеток/мл).
Любой из способов, описанных в данном документе, может включать обеспечение повышения концентрации полоксамера-188 в среде в диапазоне от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 6,0 г/л (например, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 5,9 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 5,8 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 5,7 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 5,6 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 5,5 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 5,4 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 5,3 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 5,2 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 5,1 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 5,0 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 4,9 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 4,8 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 4,7 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 4,6 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 4,5 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 4,4 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 4,3 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 4,2 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 4,1 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 4,0 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 3,9 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 3,8 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 3,7 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 3,6 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 3,5 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 3,4 г/л,
от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 3,3 г/л, от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 3,2 г/л, от приблизительно 3,1 г/л до приблизительно 6,0 г/л, от приблизительно 3,1 г/л до приблизительно 5,9 г/л, от приблизительно 3,1 г/л до приблизительно 5,8 г/л, от приблизительно 3,1 г/л до приблизительно 5,7 г/л, от приблизительно 3,1 г/л до приблизительно 5,6 г/л, от приблизительно 3,1 г/л до приблизительно 5,5 г/л, от приблизительно 3,1 г/л до приблизительно 5,4 г/л, от приблизительно 3,1 г/л до приблизительно 5,3 г/л, от приблизительно 3,1 г/л до приблизительно 5,2 г/л, от приблизительно 3,1 г/л до приблизительно 5,1 г/л, от приблизительно 3,1 г/л до приблизительно 5,0 г/л, от приблизительно 3,1 г/л до приблизительно 4,9 г/л, от приблизительно 3,1 г/л до приблизительно 4,8 г/л, от приблизительно 3,1 г/л до приблизительно 4,7 г/л, от приблизительно 3,1 г/л до приблизительно 4,6 г/л, от приблизительно 3,1 г/л до приблизительно 4,5 г/л, от приблизительно 3,1 г/л до приблизительно 4,4 г/л, от приблизительно 3,1 г/л до приблизительно 4,3 г/л, от приблизительно 3,1 г/л до приблизительно 4,2 г/л, от приблизительно 3,1 г/л до приблизительно 4,1 г/л,
от приблизительно 3,1 г/л до приблизительно 4,0 г/л, от приблизительно 3,1 г/л до приблизительно 3,9 г/л, от приблизительно 3,1 г/л до приблизительно 3,8 г/л, от приблизительно 3,1 г/л до приблизительно 3,7 г/л, от приблизительно 3,1 г/л до приблизительно 3,6 г/л, от приблизительно 3,1 г/л до приблизительно 3,5 г/л, от приблизительно 3,1 г/л до приблизительно 3,4 г/л, от приблизительно 3,1 г/л до приблизительно 3,3 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 6,0 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 5,9 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 5,8 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 5,7 г/л,
от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 5,6 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 5,5 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 5,4 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 5,3 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 5,2 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 5,1 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 5,0 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 4,9 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 4,8 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 4,7 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 4,6 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 4,5 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 4,4 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 4,3 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 4,2 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 4,1 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 4,0 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 3,9 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 3,8 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 3,7 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 3,6 г/л, от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 3,5 г/л,
от приблизительно 3,2 г/л до приблизительно 3,4 г/л, от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 6,0 г/л, от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 5,9 г/л, от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 5,8 г/л, от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 5,7 г/л, от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 5,6 г/л, от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 5,5 г/л, от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 5,4 г/л, от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 5,3 г/л, от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 5,2 г/л, от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 5,1 г/л, от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 5,0 г/л,
от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 4,9 г/л, от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 4,8 г/л, от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 4,7 г/л, от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 4,6 г/л, от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 4,5 г/л, от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 4,4 г/л, от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 4,3 г/л, от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 4,2 г/л, от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 4,1 г/л, от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 4,0 г/л, от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 3,9 г/л, от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 3,8 г/л, от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 3,7 г/л, от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 3,6 г/л, от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 3,5 г/л,
от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 6,0 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 5,9 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 5,8 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 5,7 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 5,6 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 5,5 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 5,4 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 5,3 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 5,2 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 5,1 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 5,0 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 4,9 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 4,8 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 4,7 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 4,6 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 4,5 г/л,
от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 4,4 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 4,3 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 4,2 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 4,1 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 4,0 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 3,9 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 3,8 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 3,7 г/л, от приблизительно 3,4 г/л до приблизительно 3,6 г/л, от приблизительно 3,5 г/л до приблизительно 6,0 г/л, от приблизительно 3,5 г/л до приблизительно 5,9 г/л, от приблизительно 3,5 г/л до приблизительно 5,8 г/л, от приблизительно 3,5 г/л до приблизительно 5,7 г/л, от приблизительно 3,5 г/л до приблизительно 5,6 г/л, от приблизительно 3,5 г/л до приблизительно 5,5 г/л, от приблизительно 3,5 г/л до приблизительно 5,4 г/л,
от приблизительно 3,5 г/л до приблизительно 5,3 г/л, от приблизительно 3,5 г/л до приблизительно 5,2 г/л, от приблизительно 3,5 г/л до приблизительно 5,1 г/л, от приблизительно 3,5 г/л до приблизительно 5,0 г/л, от приблизительно 3,5 г/л до приблизительно 4,9 г/л, от приблизительно 3,5 г/л до приблизительно 4,8 г/л, от приблизительно 3,5 г/л до приблизительно 4,7 г/л, от приблизительно 3,5 г/л до приблизительно 4,6 г/л, от приблизительно 3,5 г/л до приблизительно 4,5 г/л, от приблизительно 3,5 г/л до приблизительно 4,4 г/л, от приблизительно 3,5 г/л до приблизительно 4,3 г/л, от приблизительно 3,5 г/л до приблизительно 4,2 г/л, от приблизительно 3,5 г/л до приблизительно 4,1 г/л, от приблизительно 3,5 г/л до приблизительно 4,0 г/л, от приблизительно 3,5 г/л до приблизительно 3,9 г/л, от приблизительно 3,5 г/л до приблизительно 3,8 г/л,
от приблизительно 3,5 г/л до приблизительно 3,7 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 6,0 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 5,9 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 5,8 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 5,7 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 5,6 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 5,5 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 5,4 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 5,3 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 5,2 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 5,1 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 5,0 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 4,9 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 4,8 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 4,7 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 4,6 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 4,5 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 4,4 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 4,3 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 4,2 г/л,
от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 4,1 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 4,0 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 3,9 г/л, от приблизительно 3,6 г/л до приблизительно 3,8 г/л,
от приблизительно 3,7 г/л до приблизительно 6,0 г/л, от приблизительно 3,7 г/л до приблизительно 5,9 г/л, от приблизительно 3,7 г/л до приблизительно 5,8 г/л, от приблизительно 3,7 г/л до приблизительно 5,7 г/л, от приблизительно 3,7 г/л до приблизительно 5,6 г/л, от приблизительно 3,7 г/л до приблизительно 5,5 г/л, от приблизительно 3,7 г/л до приблизительно 5,4 г/л, от приблизительно 3,7 г/л до приблизительно 5,3 г/л, от приблизительно 3,7 г/л до приблизительно 5,2 г/л, от приблизительно 3,7 г/л до приблизительно 5,1 г/л, от приблизительно 3,7 г/л до приблизительно 5,0 г/л, от приблизительно 3,7 г/л до приблизительно 4,9 г/л,
от приблизительно 3,7 г/л до приблизительно 4,8 г/л, от приблизительно 3,7 г/л до приблизительно 4,7 г/л, от приблизительно 3,7 г/л до приблизительно 4,6 г/л, от приблизительно 3,7 г/л до приблизительно 4,5 г/л, от приблизительно 3,7 г/л до приблизительно 4,4 г/л, от приблизительно 3,7 г/л до приблизительно 4,3 г/л, от приблизительно 3,7 г/л до приблизительно 4,2 г/л, от приблизительно 3,7 г/л до приблизительно 4,1 г/л, от приблизительно 3,7 г/л до приблизительно 4,0 г/л, от приблизительно 3,7 г/л до приблизительно 3,9 г/л,
от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 6,0 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 5,9 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 5,8 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 5,7 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 5,6 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 5,5 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 5,4 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 5,3 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 5,2 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 5,1 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 5,0 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 4,9 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 4,8 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 4,7 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 4,6 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 4,5 г/л,
от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 4,4 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 4,3 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 4,2 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 4,1 г/л, от приблизительно 3,8 г/л до приблизительно 4,0 г/л, от приблизительно 3,9 г/л до приблизительно 6,0 г/л, от приблизительно 3,9 г/л до приблизительно 5,9 г/л, от приблизительно 3,9 г/л до приблизительно 5,8 г/л, от приблизительно 3,9 г/л до приблизительно 5,7 г/л, от приблизительно 3,9 г/л до приблизительно 5,6 г/л, от приблизительно 3,9 г/л до приблизительно 5,5 г/л, от приблизительно 3,9 г/л до приблизительно 5,4 г/л, от приблизительно 3,9 г/л до приблизительно 5,3 г/л, от приблизительно 3,9 г/л до приблизительно 5,2 г/л, от приблизительно 3,9 г/л до приблизительно 5,1 г/л, от приблизительно 3,9 г/л до приблизительно 5,0 г/л, от приблизительно 3,9 г/л до приблизительно 4,9 г/л, от приблизительно 3,9 г/л до приблизительно 4,8 г/л, от приблизительно 3,9 г/л до приблизительно 4,7 г/л, от приблизительно 3,9 г/л до приблизительно 4,6 г/л,
от приблизительно 3,9 г/л до приблизительно 4,5 г/л, от приблизительно 3,9 г/л до приблизительно 4,4 г/л, от приблизительно 3,9 г/л до приблизительно 4,3 г/л, от приблизительно 3,9 г/л до приблизительно 4,2 г/л, от приблизительно 3,9 г/л до приблизительно 4,1 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 6,0 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 5,9 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 5,8 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 5,7 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 5,6 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 5,5 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 5,4 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 5,3 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 5,2 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 5,1 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 5,0 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 4,9 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 4,8 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 4,7 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 4,6 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 4,5 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 4,4 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 4,3 г/л, от приблизительно 4,0 г/л до приблизительно 4,2 г/л,
от приблизительно 4,1 г/л до приблизительно 6,0 г/л, от приблизительно 4,1 г/л до приблизительно 5,9 г/л, от приблизительно 4,1 г/л до приблизительно 5,8 г/л, от приблизительно 4,1 г/л до приблизительно 5,7 г/л, от приблизительно 4,1 г/л до приблизительно 5,6 г/л, от приблизительно 4,1 г/л до приблизительно 5,5 г/л, от приблизительно 4,1 г/л до приблизительно 5,4 г/л, от приблизительно 4,1 г/л до приблизительно 5,3 г/л, от приблизительно 4,1 г/л до приблизительно 5,2 г/л, от приблизительно 4,1 г/л до приблизительно 5,1 г/л, от приблизительно 4,1 г/л до приблизительно 5,0 г/л, от приблизительно 4,1 г/л до приблизительно 4,9 г/л, от приблизительно 4,1 г/л до приблизительно 4,8 г/л, от приблизительно 4,1 г/л до приблизительно 4,7 г/л, от приблизительно 4,1 г/л до приблизительно 4,6 г/л, от приблизительно 4,1 г/л до приблизительно 4,5 г/л, от приблизительно 4,1 г/л до приблизительно 4,4 г/л, от приблизительно 4,1 г/л до приблизительно 4,3 г/л,
от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 6,0 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 5,9 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 5,8 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 5,7 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 5,6 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 5,5 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 5,4 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 5,3 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 5,2 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 5,1 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 5,0 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 4,9 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 4,8 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 4,7 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 4,6 г/л, от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 4,5 г/л,
от приблизительно 4,2 г/л до приблизительно 4,4 г/л, от приблизительно 4,3 г/л до приблизительно 6,0 г/л, от приблизительно 4,3 г/л до приблизительно 5,9 г/л, от приблизительно 4,3 г/л до приблизительно 5,8 г/л, от приблизительно 4,3 г/л до приблизительно 5,7 г/л, от приблизительно 4,3 г/л до приблизительно 5,6 г/л, от приблизительно 4,3 г/л до приблизительно 5,5 г/л, от приблизительно 4,3 г/л до приблизительно 5,4 г/л, от приблизительно 4,3 г/л до приблизительно 5,3 г/л, от приблизительно 4,3 г/л до приблизительно 5,2 г/л, от приблизительно 4,3 г/л до приблизительно 5,1 г/л, от приблизительно 4,3 г/л до приблизительно 5,0 г/л, от приблизительно 4,3 г/л до приблизительно 4,9 г/л, от приблизительно 4,3 г/л до приблизительно 4,8 г/л, от приблизительно 4,3 г/л до приблизительно 4,7 г/л, от приблизительно 4,3 г/л до приблизительно 4,6 г/л, от приблизительно 4,3 г/л до приблизительно 4,5 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 6,0 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 5,9 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 5,8 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 5,7 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 5,6 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 5,5 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 5,4 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 5,3 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 5,2 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 5,1 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 5,0 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 4,9 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 4,8 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 4,7 г/л, от приблизительно 4,4 г/л до приблизительно 4,6 г/л,
от приблизительно 4,5 г/л до приблизительно 6,0 г/л, от приблизительно 4,5 г/л до приблизительно 5,9 г/л, от приблизительно 4,5 г/л до приблизительно 5,8 г/л, от приблизительно 4,5 г/л до приблизительно 5,7 г/л, от приблизительно 4,5 г/л до приблизительно 5,6 г/л, от приблизительно 4,5 г/л до приблизительно 5,5 г/л, от приблизительно 4,5 г/л до приблизительно 5,4 г/л, от приблизительно 4,5 г/л до приблизительно 5,3 г/л, от приблизительно 4,5 г/л до приблизительно 5,2 г/л, от приблизительно 4,5 г/л до приблизительно 5,1 г/л, от приблизительно 4,5 г/л до приблизительно 5,0 г/л, от приблизительно 4,5 г/л до приблизительно 4,9 г/л, от приблизительно 4,5 г/л до приблизительно 4,8 г/л, от приблизительно 4,5 г/л до приблизительно 4,7 г/л,
от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 6,0 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 5,9 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 5,8 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 5,7 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 5,6 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 5,5 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 5,4 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 5,3 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 5,2 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 5,1 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 5,0 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 4,9 г/л, от приблизительно 4,6 г/л до приблизительно 4,8 г/л, от приблизительно 4,7 г/л до приблизительно 6,0 г/л, от приблизительно 4,7 г/л до приблизительно 5,9 г/л, от приблизительно 4,7 г/л до приблизительно 5,8 г/л, от приблизительно 4,7 г/л до приблизительно 5,7 г/л, от приблизительно 4,7 г/л до приблизительно 5,6 г/л, от приблизительно 4,7 г/л до приблизительно 5,5 г/л, от приблизительно 4,7 г/л до приблизительно 5,4 г/л, от приблизительно 4,7 г/л до приблизительно 5,3 г/л, от приблизительно 4,7 г/л до приблизительно 5,2 г/л, от приблизительно 4,7 г/л до приблизительно 5,1 г/л, от приблизительно 4,7 г/л до приблизительно 5,0 г/л, от приблизительно 4,7 г/л до приблизительно 4,9 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 6,0 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 5,9 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 5,8 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 5,7 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 5,6 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 5,5 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 5,4 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 5,3 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 5,2 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 5,1 г/л, от приблизительно 4,8 г/л до приблизительно 5,0 г/л,
от приблизительно 4,9 г/л до приблизительно 6,0 г/л, от приблизительно 4,9 г/л до приблизительно 5,9 г/л, от приблизительно 4,9 г/л до приблизительно 5,8 г/л, от приблизительно 4,9 г/л до приблизительно 5,7 г/л, от приблизительно 4,9 г/л до приблизительно 5,6 г/л, от приблизительно 4,9 г/л до приблизительно 5,5 г/л, от приблизительно 4,9 г/л до приблизительно 5,4 г/л, от приблизительно 4,9 г/л до приблизительно 5,3 г/л, от приблизительно 4,9 г/л до приблизительно 5,2 г/л, от приблизительно 4,9 г/л до приблизительно 5,1 г/л,
от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 6,0 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 5,9 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 5,8 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 5,7 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 5,6 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 5,5 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 5,4 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 5,3 г/л, от приблизительно 5,0 г/л до приблизительно 5,2 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 6,0 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 5,9 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 5,8 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 5,7 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 5,6 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 5,5 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 5,4 г/л, от приблизительно 5,1 г/л до приблизительно 5,3 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 6,0 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 5,9 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 5,8 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 5,7 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 5,6 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 5,5 г/л, от приблизительно 5,2 г/л до приблизительно 5,4 г/л,
от приблизительно 5,3 г/л до приблизительно 6,0 г/л, от приблизительно 5,3 г/л до приблизительно 5,9 г/л, от приблизительно 5,3 г/л до приблизительно 5,8 г/л, от приблизительно 5,3 г/л до приблизительно 5,7 г/л, от приблизительно 5,3 г/л до приблизительно 5,6 г/л, от приблизительно 5,3 г/л до приблизительно 5,5 г/л,
от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 6,0 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 5,9 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 5,8 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 5,7 г/л, от приблизительно 5,4 г/л до приблизительно 5,6 г/л, от приблизительно 5,5 г/л до приблизительно 6,0 г/л, от приблизительно 5,5 г/л до приблизительно 5,9 г/л, от приблизительно 5,5 г/л до приблизительно 5,8 г/л, от приблизительно 5,5 г/л до приблизительно 5,7 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 6,0 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 5,9 г/л, от приблизительно 5,6 г/л до приблизительно 5,8 г/л,
от приблизительно 5,7 г/л до приблизительно 6,0 г/л, от приблизительно 5,7 г/л до приблизительно 5,9 г/л или от приблизительно 5,8 г/л до приблизительно 6,0 г/л), когда плотность жизнеспособных клеток в среде составляет от приблизительно 60×106 клеток/мл до приблизительно 90×106 клеток/мл (например, от приблизительно 60×106 клеток/мл до приблизительно 88×106 клеток/мл, от приблизительно 60×106 клеток/мл до приблизительно 86×106 клеток/мл, от приблизительно 60×106 клеток/мл до приблизительно 84×106 клеток/мл, от приблизительно 60×106 клеток/мл до приблизительно 82×106 клеток/мл, от приблизительно 60×106 клеток/мл до приблизительно 80×106 клеток/мл, от приблизительно 60×106 клеток/мл до приблизительно 78×106 клеток/мл, от приблизительно 60×106 клеток/мл до приблизительно 76×106 клеток/мл,
от приблизительно 60×106 клеток/мл до приблизительно 74×106 клеток/мл, от приблизительно 60×106 клеток/мл до приблизительно 72×106 клеток/мл, от приблизительно 60×106 клеток/мл до приблизительно 70×106 клеток/мл, от приблизительно 60×106 клеток/мл до приблизительно 68×106 клеток/мл, от приблизительно 60×106 клеток/мл до приблизительно 66×106 клеток/мл, от приблизительно 60×106 клеток/мл до приблизительно 64×106 клеток/мл, от приблизительно 60×106 клеток/мл до приблизительно 62×106 клеток/мл, от приблизительно 62×106 клеток/мл до приблизительно 90×106 клеток/мл,
от приблизительно 62×106 клеток/мл до приблизительно 88×106 клеток/мл, от приблизительно 62×106 клеток/мл до приблизительно 86×106 клеток/мл, от приблизительно 62×106 клеток/мл до приблизительно 84×106 клеток/мл, от приблизительно 62×106 клеток/мл до приблизительно 82×106 клеток/мл, от приблизительно 62×106 клеток/мл до приблизительно 80×106 клеток/мл, от приблизительно 62×106 клеток/мл до приблизительно 78×106 клеток/мл, от приблизительно 62×106 клеток/мл до приблизительно 76×106 клеток/мл, от приблизительно 62×106 клеток/мл до приблизительно 74×106 клеток/мл,
от приблизительно 62×106 клеток/мл до приблизительно 72×106 клеток/мл, от приблизительно 62×106 клеток/мл до приблизительно 70×106 клеток/мл, от приблизительно 62×106 клеток/мл до приблизительно 68×106 клеток/мл, от приблизительно 62×106 клеток/мл до приблизительно 66×106 клеток/мл, от приблизительно 62×106 клеток/мл до приблизительно 64×106 клеток/мл, от приблизительно 64×106 клеток/мл до приблизительно 90×106 клеток/мл, от приблизительно 64×106 клеток/мл до приблизительно 88×106 клеток/мл, от приблизительно 64×106 клеток/мл до приблизительно 86×106 клеток/мл, от приблизительно 64×106 клеток/мл до приблизительно 84×106 клеток/мл, от приблизительно 64×106 клеток/мл до приблизительно 82×106 клеток/мл, от приблизительно 64×106 клеток/мл до приблизительно 80×106 клеток/мл, от приблизительно 64×106 клеток/мл до приблизительно 78×106 клеток/мл,
от приблизительно 64×106 клеток/мл до приблизительно 76×106 клеток/мл, от приблизительно 64×106 клеток/мл до приблизительно 74×106 клеток/мл, от приблизительно 64×106 клеток/мл до приблизительно 72×106 клеток/мл, от приблизительно 64×106 клеток/мл до приблизительно 70×106 клеток/мл, от приблизительно 64×106 клеток/мл до приблизительно 68×106 клеток/мл, от приблизительно 64×106 клеток/мл до приблизительно 66×106 клеток/мл, от приблизительно 66×106 клеток/мл до приблизительно 90×106 клеток/мл, от приблизительно 66×106 клеток/мл до приблизительно 88×106 клеток/мл,
от приблизительно 66×106 клеток/мл до приблизительно 86×106 клеток/мл, от приблизительно 66×106 клеток/мл до приблизительно 84×106 клеток/мл, от приблизительно 66×106 клеток/мл до приблизительно 82×106 клеток/мл, от приблизительно 66×106 клеток/мл до приблизительно 80×106 клеток/мл, от приблизительно 66×106 клеток/мл до приблизительно 78×106 клеток/мл, от приблизительно 66×106 клеток/мл до приблизительно 76×106 клеток/мл, от приблизительно 66×106 клеток/мл до приблизительно 74×106 клеток/мл, от приблизительно 66×106 клеток/мл до приблизительно 72×106 клеток/мл, от приблизительно 66×106 клеток/мл до приблизительно 70×106 клеток/мл, от приблизительно 66×106 клеток/мл до приблизительно 68×106 клеток/мл, от приблизительно 68×106 клеток/мл до приблизительно 90×106 клеток/мл, от приблизительно 68×106 клеток/мл до приблизительно 88×106 клеток/мл,
от приблизительно 68×106 клеток/мл до приблизительно 86×106 клеток/мл, от приблизительно 68×106 клеток/мл до приблизительно 84×106 клеток/мл, от приблизительно 68×106 клеток/мл до приблизительно 82×106 клеток/мл, от приблизительно 68×106 клеток/мл до приблизительно 80×106 клеток/мл, от приблизительно 68×106 клеток/мл до приблизительно 78×106 клеток/мл, от приблизительно 68×106 клеток/мл до приблизительно 76×106 клеток/мл, от приблизительно 68×106 клеток/мл до приблизительно 74×106 клеток/мл, от приблизительно 68×106 клеток/мл до приблизительно 72×106 клеток/мл,
от приблизительно 68×106 клеток/мл до приблизительно 70×106 клеток/мл, от приблизительно 70×106 клеток/мл до приблизительно 90×106 клеток/мл, от приблизительно 70×106 клеток/мл до приблизительно 88×106 клеток/мл, от приблизительно 70×106 клеток/мл до приблизительно 86×106 клеток/мл, от приблизительно 70×106 клеток/мл до приблизительно 84×106 клеток/мл, от приблизительно 70×106 клеток/мл до приблизительно 82×106 клеток/мл, от приблизительно 70×106 клеток/мл до приблизительно 80×106 клеток/мл, от приблизительно 70×106 клеток/мл до приблизительно 78×106 клеток/мл, от приблизительно 70×106 клеток/мл до приблизительно 76×106 клеток/мл, от приблизительно 70×106 клеток/мл до приблизительно 74×106 клеток/мл, от приблизительно 70×106 клеток/мл до приблизительно 72×106 клеток/мл, от приблизительно 72×106 клеток/мл до приблизительно 90×106 клеток/мл,
от приблизительно 72×106 клеток/мл до приблизительно 88×106 клеток/мл, от приблизительно 72×106 клеток/мл до приблизительно 86×106 клеток/мл, от приблизительно 72×106 клеток/мл до приблизительно 84×106 клеток/мл, от приблизительно 72×106 клеток/мл до приблизительно 82×106 клеток/мл, от приблизительно 72×106 клеток/мл до приблизительно 80×106 клеток/мл, от приблизительно 72×106 клеток/мл до приблизительно 78×106 клеток/мл, от приблизительно 72×106 клеток/мл до приблизительно 76×106 клеток/мл, от приблизительно 72×106 клеток/мл до приблизительно 74×106 клеток/мл, от приблизительно 74×106 клеток/мл до приблизительно 90×106 клеток/мл, от приблизительно 74×106 клеток/мл до приблизительно 88×106 клеток/мл, от приблизительно 74×106 клеток/мл до приблизительно 86×106 клеток/мл, от приблизительно 74×106 клеток/мл до приблизительно 84×106 клеток/мл, от приблизительно 74×106 клеток/мл до приблизительно 82×106 клеток/мл, от приблизительно 74×106 клеток/мл до приблизительно 80×106 клеток/мл, от приблизительно 74×106 клеток/мл до приблизительно 78×106 клеток/мл, от приблизительно 74×106 клеток/мл до приблизительно 76×106 клеток/мл,
от приблизительно 76×106 клеток/мл до приблизительно 90×106 клеток/мл, от приблизительно 76×106 клеток/мл до приблизительно 88×106 клеток/мл, от приблизительно 76×106 клеток/мл до приблизительно 86×106 клеток/мл, от приблизительно 76×106 клеток/мл до приблизительно 84×106 клеток/мл, от приблизительно 76×106 клеток/мл до приблизительно 82×106 клеток/мл, от приблизительно 76×106 клеток/мл до приблизительно 80×106 клеток/мл, от приблизительно 76×106 клеток/мл до приблизительно 78×106 клеток/мл, от приблизительно 78×106 клеток/мл до приблизительно 90×106 клеток/мл,
от приблизительно 78×106 клеток/мл до приблизительно 88×106 клеток/мл, от приблизительно 78×106 клеток/мл до приблизительно 86×106 клеток/мл, от приблизительно 78×106 клеток/мл до приблизительно 84×106 клеток/мл, от приблизительно 78×106 клеток/мл до приблизительно 82×106 клеток/мл, от приблизительно 78×106 клеток/мл до приблизительно 80×106 клеток/мл, от приблизительно 80×106 клеток/мл до приблизительно 90×106 клеток/мл, от приблизительно 80×106 клеток/мл до приблизительно 88×106 клеток/мл, от приблизительно 80×106 клеток/мл до приблизительно 86×106 клеток/мл, от приблизительно 80×106 клеток/мл до приблизительно 84×106 клеток/мл, от приблизительно 80×106 клеток/мл до приблизительно 82×106 клеток/мл, от приблизительно 82×106 клеток/мл до приблизительно 90×106 клеток/мл, от приблизительно 82×106 клеток/мл до приблизительно 88×106 клеток/мл,
от приблизительно 82×106 клеток/мл до приблизительно 86×106 клеток/мл, от приблизительно 82×106 клеток/мл до приблизительно 84×106 клеток/мл, от приблизительно 84×106 клеток/мл до приблизительно 90×106 клеток/мл, от приблизительно 84×106 клеток/мл до приблизительно 88×106 клеток/мл, от приблизительно 84×106 клеток/мл до приблизительно 86×106 клеток/мл, от приблизительно 86×106 клеток/мл до приблизительно 90×106 клеток/мл, от приблизительно 86×106 клеток/мл до приблизительно 88×106 клеток/мл или от приблизительно 88×106 клеток/мл до приблизительно 90×106 клеток/мл).
Любой из способов, описанных в данном документе, может включать обеспечение повышения концентрации полоксамера-188 в среде до более 6,0 г/л (например, более 6,1 г/л, более 6,2 г/л, более 6,3 г/л, более 6,4 г/л, более 6,5 г/л, более 6,6 г/л, более 6,7 г/л, более 6,8 г/л, более 6,9 г/л, более 7,0 г/л, более 7,1 г/л, более 7,2 г/л, более 7,3 г/л, более 7,4 г/л, более 7,5 г/л, более 7,6 г/л, более 7,7 г/л, более 7,8 г/л, более 7,9 г/л, более 8,0 г/л, более 8,1 г/л, более 8,2 г/л, более 8,3 г/л, более 8,4 г/л, более 8,5 г/л,
более 8,6 г/л, более 8,7 г/л, более 8,8 г/л, более 8,9 г/л, более 9,0 г/л, более 9,1 г/л, более 9,2 г/л, более 9,3 г/л, более 9,4 г/л, более 9,5 г/л, более 9,6 г/л, более 9,7 г/л, более 9,8 г/л, более 9,9 г/л, более 10,0 г/л, более приблизительно 10,1 г/л, более приблизительно 10,2 г/л, более приблизительно 10,3 г/л, более приблизительно 10,4 г/л, более приблизительно 10,5 г/л, более приблизительно 10,6 г/л, более приблизительно 10,7 г/л, более приблизительно 10,8 г/л, более приблизительно 10,9 г/л или более приблизительно 11,0 г/л) полоксамера-188, когда плотность жизнеспособных клеток в среде составляет более приблизительно 90×106 клеток/мл (например, более приблизительно 91×106 клеток/мл,
более приблизительно 92×106 клеток/мл, более приблизительно 93×106 клеток/мл, более приблизительно 94×106 клеток/мл, более приблизительно 95×106 клеток/мл, более приблизительно 96×106 клеток/мл, более приблизительно 97×106 клеток/мл, более приблизительно 98×106 клеток/мл, более приблизительно 99×106 клеток/мл, более приблизительно 100×106 клеток/мл,
более приблизительно 101×106 клеток/мл, более приблизительно 102×106 клеток/мл, более приблизительно 103×106 клеток/мл, более приблизительно 104×106 клеток/мл, более приблизительно 105×106 клеток/мл, более приблизительно 106×106 клеток/мл, более приблизительно 107×106 клеток/мл, более приблизительно 108×106 клеток/мл, более приблизительно 109×106 клеток/мл, более приблизительно 110×106 клеток/мл, более приблизительно 111×106 клеток/мл, более приблизительно 112×106 клеток/мл, более приблизительно 113×106 клеток/мл, более приблизительно 114×106 клеток/мл, более приблизительно 115×106 клеток/мл, более приблизительно 116×106 клеток/мл, более приблизительно 117×106 клеток/мл, более приблизительно 118×106 клеток/мл, более приблизительно 119×106 клеток/мл или более приблизительно 120×106 клеток/мл).
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления способы включают обеспечение повышения концентрации полоксамера-188 в среде в диапазоне от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 3,0 г/л (например, любой из значений, промежуточных по отношению к диапазонам, описанным в данном документе), когда плотность жизнеспособных клеток в среде составляет от приблизительно 35×106 клеток/мл до приблизительно 60×106 клеток/мл (например, любую из значений, промежуточных по отношению к диапазонам, описанным в данном документе); обеспечение повышения концентрации полоксамера-188 в среде в диапазоне от приблизительно 3,0 г/л до приблизительно 6,0 г/л (например, любой из значений, промежуточных по отношению к диапазонам, описанным в данном документе), когда плотность жизнеспособных клеток в среде составляет от приблизительно 60×106 клеток/мл до приблизительно 90×106 клеток/мл (например, любую из значений, промежуточных по отношению к диапазонам, описанным в данном документе); и обеспечение повышения концентрации полоксамера-188 в среде до более 6,0 г/л (например, любой из концентраций более 6,0 г/л, описанных в данном документе), когда плотность жизнеспособных клеток в среде составляет более 90×106 клеток/мл (например, любую из значений плотности жизнеспособных клеток более 90×106 клеток/мл, описанных в данном документе). Некоторые варианты осуществления любого из способов, описанных в данном документе, дополнительно включают определение плотности жизнеспособных клеток в среде в один или несколько (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать или двадцать) моментов времени в ходе культивирования.
Соотношение полоксамера-188 и пеногасителя
В соответствии с любым из вариантов осуществления, описанных в данном документе, жидкая среда содержит пеногаситель (например, пеногаситель-c), при этом соотношение пеногасителя (г/л) и полоксамера-188 (г/л) в среде составляет от приблизительно 0,5% до приблизительно 6,0% (например, от приблизительно 0,5% до приблизительно 5,5%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 5,0%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 4,5%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 4,0%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 3,5%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 3,0%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 2,5%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 2,0%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 1,5%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 1,0%, от приблизительно 1,0% до приблизительно 6,0%, от приблизительно 1,0% до приблизительно 5,5%, от приблизительно 1,0% до приблизительно 5,0%, от приблизительно 1,0% до приблизительно 4,5%, от приблизительно 1,0% до приблизительно 4,0%, от приблизительно 1,0% до приблизительно 3,5%,
от приблизительно 1,0% до приблизительно 3,0%, от приблизительно 1,0% до приблизительно 2,5%, от приблизительно 1,0% до приблизительно 2,0%, от приблизительно 1,0% до приблизительно 1,5%, от приблизительно 2,0% до приблизительно 6,0%, от приблизительно 2,0% до приблизительно 5,5%, от приблизительно 2,0% до приблизительно 5,0%, от приблизительно 2,0% до приблизительно 4,5%, от приблизительно 2,0% до приблизительно 4,0%, от приблизительно 2,0% до приблизительно 3,5%, от приблизительно 2,0% до приблизительно 3,0%, от приблизительно 2,0% до приблизительно 2,5%, от приблизительно 2,5% до приблизительно 6,0%, от приблизительно 2,5% до приблизительно 5,5%, от приблизительно 2,5% до приблизительно 5,0%, от приблизительно 2,5% до приблизительно 4,5%, от приблизительно 2,5% до приблизительно 4,0%, от приблизительно 2,5% до приблизительно 3,5%, от приблизительно 2,5% до приблизительно 3,0%, от приблизительно 3,0% до приблизительно 6,0%, от приблизительно 3,0% до приблизительно 5,5%, от приблизительно 3,0% до приблизительно 5,0%,
от приблизительно 3,0% до приблизительно 4,5%, от приблизительно 3,0% до приблизительно 4,0%, от приблизительно 3,0% до приблизительно 3,5%, от приблизительно 3,5% до приблизительно 6,0%, от приблизительно 3,5% до приблизительно 5,5%, от приблизительно 3,5% до приблизительно 5,0%, от приблизительно 3,5% до приблизительно 4,5%, от приблизительно 3,5% до приблизительно 4,0%, от приблизительно 4,0% до приблизительно 6,0%, от приблизительно 4,0% до приблизительно 5,5%, от приблизительно 4,0% до приблизительно 5,0%, от приблизительно 4,0% до приблизительно 4,5%, от приблизительно 4,5% до приблизительно 6,0%, от приблизительно 4,5% до приблизительно 5,5%, от приблизительно 4,5% до приблизительно 5,0%, от приблизительно 5,0% до приблизительно 6,0%, от приблизительно 5,0% до приблизительно 5,5% или от приблизительно 5,5% до приблизительно 6,0%).
Культуральные среды
Жидкие культуральные среды известны из уровня техники. Жидкие культуральные среды (например, первую и/или вторую жидкую среду) можно дополнять сывороткой млекопитающего (например, фетальной телячьей сывороткой и бычьей сывороткой) и/или гормоном роста или фактором роста (например, инсулином, трансферрином и эпидермальным фактором роста). В качестве альтернативы или дополнения, жидкие культуральные среды (например, первая и/или вторая жидкая среда) могут представлять собой жидкую культуральную среду с определенным химическим составом, жидкую культуральную среду, не содержащую компонентов животного происхождения, жидкую культуральную среду, не содержащую сыворотку, или жидкую культуральную среду, содержащую сыворотку. Неограничивающие примеры жидких культуральных сред с определенным химическим составом, жидких культуральных сред, не содержащих компонентов животного происхождения, жидких культуральных сред, не содержащих сыворотку, и жидких культуральных сред, содержащих сыворотку, являются коммерчески доступными.
Жидкая среда, как правило, содержит источник энергии (например, углевод, такой как глюкоза), незаменимые аминокислоты (например, набор из двадцати основных аминокислот плюс цистеин), витамины и/или другие органические соединения, требуемые в низких концентрациях, свободные жирные кислоты и/или микроэлементы. Жидкие культуральные среды (например, первую и/или вторую жидкую среду) можно при необходимости дополнить, например, гормоном или фактором роста млекопитающего (например, инсулином, трансферрином или эпидермальным фактором роста), солями и буферами (например, солями кальция, магния и фосфатами), нуклеозидами и основаниями (например, аденозином, тимидином и гипоксантином), белком и тканевыми гидролизатами и/или любой комбинацией таких добавок.
Множество различных жидких культуральных сред, которые можно применять для культивирования клеток (например, клеток млекопитающего) согласно любому из способов, описанных в данном документе, известно из уровня техники. Компоненты среды, которые также можно применять в способах по настоящему изобретению, включают без ограничения гидролизаты с определенным химическим составом (CD), например, CD-пептон, CD-полипептиды (из двух или более аминокислот) и CD-факторы роста. Дополнительные примеры жидкой среды и компонентов среды известны из уровня техники.
Квалифицированным специалистам-практикам будет понятно, что первая жидкая среда и вторая жидкая среда или подпиточная жидкая среда, описанные в данном документе, могут быть средами одного и того же типа или разными средами.
Жидкую среду, полученную из культуры клеток, можно фильтровать или осветлять с получением жидкой среды, которая, по сути, не содержит клеток и/или вирусов. Способы фильтрации или осветления жидкой среды для удаления клеток известны из уровня техники (например, фильтрация через поры размером 0,2 мкм или фильтрация с применением системы с переменным тангенциальным потоком (ATFTM)). Клетки млекопитающего также можно удалять из жидкой среды с помощью центрифугирования и удаления надосадочной жидкости, которая представляет собой жидкую среду, которая, по сути, не содержит клетки, или путем обеспечения осаждения клеток под действием силы тяжести на дно сосуда или биореактора, содержащего жидкую среду, и удаления жидкой среды (жидкой среды, которая, по сути, не содержит клетки), которая отдалена от осажденных рекомбинантных клеток.
Температура
Стадию культивирования клеток млекопитающего можно выполнять при температуре от приблизительно 31°C до приблизительно 40°C. Квалифицированным специалистам-практикам будет понятно, что в ходе стадии культивирования температуру можно изменять в определенный момент(моменты) времени, например, каждый час или каждые сутки. Например, температуру можно изменять или смещать (например, повышать или снижать) в пределах приблизительно одного дня, двух дней, трех дней, четырех дней, пяти дней, шести дней, семи дней, восьми дней, девяти дней, десяти дней, одиннадцати дней, двенадцати дней, четырнадцати дней, пятнадцати дней, шестнадцати дней, семнадцати дней, восемнадцати дней, девятнадцати дней или приблизительно двадцати дней или более после исходного посева клетки в биореактор (например, клетки млекопитающего). Например, температуру можно смещать в сторону повышения (например, изменять на значение, не превышающее или равное приблизительно 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, или на значение, не превышающее или равное приблизительно 20 градусов C). Например, температуру можно смещать в сторону понижения (например, изменять на значение, не превышающее или равное приблизительно 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, или на значение, не превышающее или равное приблизительно 20°C).
CO2
Стадия культивирования, описанная в данном документе, может дополнительно предусматривать подвергание жидкой среды в биореакторе воздействию атмосферы, содержащей не более чем или приблизительно 15% CO2 (например, не более чем или приблизительно 14% CO2, 12% CO2, 10% CO2, 8% CO2, 6% CO2, 5% CO2, 4% CO2, 3% CO2, 2% CO2 или не более чем или приблизительно 1% CO2).
Рекомбинантные белки
Неограничивающие примеры рекомбинантных белков, которые можно получить с помощью способов, представленных в данном документе, включают иммуноглобулины (в том числе легкие и тяжелые цепи иммуноглобулинов, антитела или фрагменты антител (например, любые из фрагментов антител, описанных в данном документе), ферменты (например, галактозидаза (например, альфа-галактозидаза), Myozyme или Cerezyme), белки (например, эритропоэтин человека, фактор некроза опухоли (TNF) или интерферон альфа или бета) или иммуногенные или антигенные белки или фрагменты белков (например, белки для применения в вакцине). Рекомбинантный белок может представлять собой сконструированный антигенсвязывающий полипептид, который содержит каркас по меньшей мере одного многофункционального рекомбинантного белка (см., например, рекомбинантные антигенсвязывающие белки, описанные в Gebauer et al., Current Opin. Chem. Biol. 13:245-255, 2009; и публикацию заявки на патент США № 2012/0164066 (включенную в данный документ посредством ссылки во всей полноте)). Неограничивающие примеры рекомбинантных белков, представляющих собой антитела, включают панитумумаб, омализумаб, абаговомаб, абциксимаб, актоксумаб, адалимумаб, адекатумумаб, афелимомаб, афутузумаб, алацизумаб, алацизумаб, алемтузумаб, алирокумаб, альтумомаб, аматуксимаб, аматуксимаб, анатумомаб, анрукинзумаб, аполизумаб, арцитумомаб, атинумаб, тоцилизумаб, базилизимаб, бектумомаб, белимумаб, бевацизумаб, безилезомаб, безлотоксумаб, бициромаб, канакинумаб, цертолизумаб, цетукцимаб, циксутумумаб, даклизумаб, деносумаб, денсумаб, экулизумаб, эдреколомаб, эфализумаб, эфунгумаб, эпратузумаб, эртумаксомаб, этарацизумаб, фигитумумаб, голимумаб, ибритутомаб тиуксетан, иговомаб, имгатузумаб, инфликсимаб, инолимомаб, инотузумаб, лабетузумаб, лебрикизумаб, моксетумомаб, натализумаб, обинутузумаб, ореговомаб, паливизумаб, панитумумаб, пертузумаб, ранибизумаб, ритуксимаб,
тоцилизумаб, тозитумомаб, тралокинумаб, тукотузумаб, трастузумаб, велтузумаб, залутумумаб и затуксимаб. Дополнительные примеры рекомбинантных антител, которые можно получить с помощью способов, описанных в данном документе, известны из уровня техники. Дополнительные неограничивающие примеры рекомбинантных белков, которые можно получить с помощью способов по настоящему изобретению, включают алглюкозидазу альфа, ларонидазу, абатацепт, галсульфазу, лютропин альфа, антигемофилический фактор, агалзидазу бета, интерферон бета-1a, дарбэпоэтин альфа, тенектеплазу, этанерцепт, фактор свертывания крови IX, фолликулостимулирующий гормон, интерферон бета-1a, имиглюцеразу, дорназу альфа, эпоэтин альфа, инсулин или аналоги инсулина, мекасермин, фактор VIII, фактор VIIa, антитромбин III, белок C, человеческий альбумин, эритропоэтин, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, интерлейкин-11, ларонидазу, идурсульфазу, галсульфазу, ингибитор α-1-протеиназы, лактазу, аденозиндезаминазу, тканевой активатор плазминогена, тиреотропин альфа (например, Thyrogen®) и альтеплазу. Дополнительные примеры рекомбинантных белков, которые можно получить с помощью способов по настоящему изобретению, включают кислую α-глюкозидазу, алглюкозидазу альфа (например, Myozyme® и Lumizyme®), α-L-идуронидазу (например, Aldurazyme®), идуронат-сульфатазу, гепаран-N-сульфатазу, галактоза-6-сульфатазу, кислую β-галактозидазу, β-глюкоронидазу, N-ацетилглюкозамин-1-фосфотрансферазу, α-N-ацетилгалактозаминидазу, кислую липазу, лизосомальную кислую церамидазу, кислую сфингомиелиназу, β-глюкозидазу (например, Cerezyme® и Ceredase®), галактозилцерамидазу, α-галактозидазу-A (например, Fabrazyme®), кислую β-галактозидазу, β-галактозидазу, нейраминидазу, гексозаминидазу A и гексозаминидазу B.
Секретируемый растворимый рекомбинантный белок можно извлекать из жидкой среды (например, первой и/или второй жидкой среды) путем удаления или иного физического отделения жидкой среды от клеток (например, клеток млекопитающего). Множество различных способов удаления жидкой среды от клеток (например, клеток млекопитающего) известны из уровня техники, в том числе, например, центрифугирование, фильтрация, пипетирование и/или аспирация. Затем секретируемый рекомбинантный белок может быть извлечен из жидкой среды и дополнительно очищен с помощью ряда биохимических методик, в том числе различных типов хроматографии (например, аффинной хроматографии, хроматографии на молекулярных ситах, катионообменной хроматографии или анионообменной хроматографии) и/или фильтрации (например, фильтрации с отсечением по молекулярной массе).
Сбор рекомбинантного белка
Некоторые варианты осуществления дополнительно включают осуществление сбора рекомбинантного белка (например, любого из рекомбинантных белков, описанных в данном документе). В некоторых примерах сбор предусматривает лизирование клеток млекопитающего. В других примерах сбор может предусматривать сбор рекомбинантного белка из среды (например, одной или обеих из первой и второй жидкой среды при осуществлении перфузионного культивирования, или одной или обеих из первой жидкой среды и подпиточной жидкой среды при осуществлении периодического культивирования).
Сбор можно выполнять после достижения в результате культивирования плотности жизнеспособных клеток, например, более приблизительно 30×106 клеток/мл, более приблизительно 32×106 клеток/мл, более приблизительно 34×106 клеток/мл, более приблизительно 36×106 клеток/мл, более приблизительно 38×106 клеток/мл, более приблизительно 40×106 клеток/мл, более приблизительно 42×106 клеток/мл, более приблизительно 44×106 клеток/мл, более приблизительно 46×106 клеток/мл, более приблизительно 48×106 клеток/мл, более приблизительно 50×106 клеток/мл, более приблизительно 52×106 клеток/мл, более приблизительно 54×106 клеток/мл, более приблизительно 56×106 клеток/мл, более приблизительно 58×106 клеток/мл, более приблизительно 60×106 клеток/мл, более приблизительно 62×106 клеток/мл, более приблизительно 64×106
клеток/мл, более приблизительно 66×106 клеток/мл, более приблизительно 68×106 клеток/мл, более приблизительно 70×106 клеток/мл, более приблизительно 72×106 клеток/мл, более приблизительно 74×106 клеток/мл, более приблизительно 76×106 клеток/мл, более приблизительно 78×106 клеток/мл, более приблизительно 80×106 клеток/мл, более приблизительно 82×106 клеток/мл, более приблизительно 84×106 клеток/мл, более приблизительно 86×106 клеток/мл,
более приблизительно 88×106 клеток/мл, более приблизительно 90×106 клеток/мл, более приблизительно 92×106 клеток/мл, более приблизительно 94×106 клеток/мл, более приблизительно 96×106 клеток/мл, более приблизительно 98×106 клеток/мл, более приблизительно 100×106 клеток/мл, более приблизительно 102×106 клеток/мл, более приблизительно 104×106 клеток/мл, более приблизительно 106×106 клеток/мл, более приблизительно 108×106 клеток/мл, более приблизительно 110×106 клеток/мл, более приблизительно 112×106 клеток/мл, более приблизительно 114×106 клеток/мл, более приблизительно 116×106 клеток/мл, более приблизительно 118×106 клеток/мл, более приблизительно 120×106 клеток/мл, более приблизительно 122×106 клеток/мл, более приблизительно 124×106 клеток/мл, более приблизительно 126×106 клеток/мл, более приблизительно 128×106 клеток/мл, более приблизительно 130×106 клеток/мл, более приблизительно 132×106
клеток/мл, более приблизительно 134×106 клеток/мл, более приблизительно 136×106 клеток/мл, более приблизительно 138×106 клеток/мл, более приблизительно 140×106 клеток/мл, более приблизительно 142×106 клеток/мл, более приблизительно 144×106 клеток/мл, более приблизительно 146×106 клеток/мл, более приблизительно 148×106 клеток/мл, более приблизительно 150×106 клеток/мл, более приблизительно 152×106 клеток/мл, более приблизительно 154×106 клеток/мл, более приблизительно 156×106 клеток/мл, более приблизительно 158×106 клеток/мл, более приблизительно 160×106 клеток/мл, более приблизительно 162×106 клеток/мл, более приблизительно 164×106 клеток/мл, более приблизительно 166×106 клеток/мл, более приблизительно 168×106 клеток/мл, более приблизительно 170×106 клеток/мл, более приблизительно 172×106
клеток/мл, более приблизительно 174×106 клеток/мл, более приблизительно 176×106 клеток/мл, более приблизительно 178×106 клеток/мл, более приблизительно 180×106 клеток/мл, более приблизительно 182×106 клеток/мл, более приблизительно 184×106 клеток/мл, более приблизительно 186×106 клеток/мл, более приблизительно 188×106 клеток/мл, более приблизительно 190×106 клеток/мл, более приблизительно 192×106 клеток/мл, более приблизительно 194×106 клеток/мл, более приблизительно 196×106 клеток/мл, более приблизительно 198×106 клеток/мл или более приблизительно 200×106 клеток/мл).
Составление рекомбинантного белка
Некоторые варианты осуществления любого из способов, описанных в данном документе, дополнительно включают стадию составления рекомбинантного белка (например, собранного рекомбинантного белка) в фармацевтическую композицию. Например, составление может включать добавление фармацевтически приемлемого наполнителя к рекомбинантному белку (например, собранному рекомбинантному белку). Составление может включать смешивание фармацевтически приемлемого наполнителя с рекомбинантным белком (например, собранным рекомбинантным белком). Примеры фармацевтически приемлемых наполнителей (например, не встречающихся в природе фармацевтически приемлемых наполнителей) хорошо известны из уровня техники. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления рекомбинантный белок (например, собранный рекомбинантный белок) составляют для внутривенного, внутриартериального, подкожного, интраперитонеального или внутримышечного введения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Влияние повышенных концентраций полоксамера-188 на перфузионную культуру клеток, вырабатывающих секретируемое рекомбинантное антитело
Данную серию экспериментов выполняли для исследования влияния возрастающих концентраций полоксамера-188 на клеточный рост и выработку рекомбинантных антител в перфузионной культуре клеток, в том числе клеток млекопитающего, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантное антитело. В этих экспериментах выполняли первый цикл перфузионного культивирования клеток, при котором использовали среды CD-CHO, содержащие 1,8 г/л полоксамера-188 в течение всего периода культивирования, и выполняли второй цикл перфузионного культивирования клеток, при котором использовали среды CD-CHO, содержащие полоксамер-188 в возрастающих концентрациях в течение периода культивирования (возрастание концентрации полоксамера-188 от 1,8 г/л до 6,8 г/л в течение периода культивирования). Для каждого цикла культивирования клеток перфузию выполняли со скоростью 4 объемов реактора (RV)/день с 12 дня по 33 день культивирования, переключаясь на скорость 6 RV/день с 33 дня по 63 день культивирования и переключаясь на скорость 7 RV/день с 63 дня по 72 день культивирования. Второй цикл культивирования клеток выполняли с применением среды CD-CHO, содержащей 1,8 г/л полоксамера-188, с 0 дня по 14 день культивирования, среды CD-CHO, содержащей 2,8 г/л полоксамера-188, с 15 дня по 34 день культивирования, среды CD-CHO, содержащей 3,8 г/л полоксамера-188, с 35 дня по 39 день культивирования, среды CD-CHO, содержащей 4,8 г/л полоксамера-188, с 40 дня по 56 день культивирования и среды CD-CHO, содержащей 5,8 г/л полоксамера-188, с 57 дня по 72 день культивирования.
Плотность жизнеспособных клеток, удельную скорость роста, процент жизнеспособных клеток, объемную продуктивность и удельную продуктивность определяли ежедневно как для первой, так и для второй перфузионных культур с помощью хорошо известных способов.
Данные показывают, что плотности жизнеспособных клеток, превышающие 100×106 клеток/мл, достигались при установлении в культуре концентрации полоксамера-188 более 1,8 г/л (фигура 1). В отличие от этого, в первом цикле культивирования клеток, при котором в культуральных средах использовали лишь 1,8 г/л полоксамера-188, лишь достигалась плотность жизнеспособных клеток 50×106 клеток/мл (фигура 1). Данные для второго цикла культивирования клеток также показывают, что установление в культуре концентрации полоксамера-188 более 1,8 г/л приводило к устойчивой удельной скорости роста, даже в случае, если культура клеток характеризовалась плотностью жизнеспособных клеток более 100×106 клеток/мл (фигура 2). Данные, представленные на фигуре 3, также показывают, что установление в культуре концентрации полоксамера-188 более 1,8 г/л приводило к высокому и постоянному проценту жизнеспособных клеток (свыше 80% на протяжении периода культивирования) по сравнению с циклом перфузионного культивирования клеток, при котором применяли среды, содержащие 1,8 г/л полоксамера-188, на протяжении периода культивирования (фигура 3).
Данные, представленные на фигурах 4 и 5, также показывают, что второй цикл перфузионного культивирования клеток, выполняемый с применением культуральных сред, содержащих полоксамер-188 в возрастающих концентрациях в течение периода культивирования (возрастание концентрации полоксамера-188 от 1,8 г/л до 6,8 г/л), характеризовался высокими значениями объемной продуктивности (более 3 г/л/день) и высокими значениями удельной продуктивности (от 15 пг/клетка/день до 42 пг/клетка/день) соответственно.
Пример 2. Влияние повышенных концентраций полоксамера-188 на стабильность рекомбинантного антитела в жидкой среде
Серию экспериментов выполняли с тем, чтобы определить, будут ли повышенные концентрации полоксамера-188 подавлять расщепление рекомбинантного белка, присутствующего в осветленной жидкой среде после сбора из культуры клеток. В этих экспериментах выполняли цикл перфузионного культивирования клеток, аналогичный второму циклу перфузионного культивирования клеток, описанному в примере 1, за исключением того, что после достижения в культуре концентрации полоксамера-188, составляющей 6,8 г/л, концентрацию полоксамера-188 в культуре снижали до 3,95 г/л полоксамера-188, а затем снова снижали до 3,0 г/л полоксамера-188. В этих экспериментах два или три образца жидкой среды удаляли из культуры в следующие моменты времени: первый момент времени, когда культура содержала 6,8 г/л полоксамера-188, второй момент времени, когда культура содержала полоксамер-188 в концентрации 3,95 г/л, и третий момент времени, когда культура содержала полоксамер-188 в концентрации 3,0 г/л. Один образец, собранный в каждый из данных моментов времени, хранили при 4°C, один образец, собранный в каждый из данных моментов времени, инкубировали в течение 7 дней при комнатной температуре перед помещением на хранение при 4°C, и для каждого из второго и третьего момента времени образец дополняли полоксамером-188 с достижением в каждом образце концентрации полоксамера-188, составляющей 6,8 г/л, а затем каждый образец инкубировали в течение 9 дней при комнатной температуре перед помещением на хранение при 4°C. Полученные необработанные и обработанные образцы прогоняли на 4-20% геле Bis-Tris и окрашивали красителем кумасси голубым.
Данные, представленные на фигуре 6, показывают, что все из необработанных образцов, содержащих 6,8 г/л, 3,95 г/л или 3,0 г/л полоксамера-188, характеризовались аналогичной стабильностью продукта (полосы 1, 2 и 3). Неожиданным образом, данные также показывают, что образец, содержащий 6,8 г/л полоксамера-188, не характеризовался значительным расщеплением после 7-дневной инкубации при комнатной температуре, в то время как каждый из образцов, содержащих 3,0 г/л или 3,95 г/л полоксамера-188, характеризовался выявляемым расщеплением после такой же инкубации (фигура 6; полосы 1a, 2a и 3a). Данные также демонстрируют, что добавление полоксамера-188 к образцу, содержащему низкое количество полоксамера-188, не повышало стабильность продукта (фигура 6; полосы 2b и 3b). Эти данные показывают, что применение в культуре полоксамера-188 в концентрациях более 1,8 г/л может снижать или подавлять расщепление рекомбинантных белков в культуре, и указывает на то, что при помощи полоксамера-188 можно достичь такого эффекта, обеспечивая более жизнеспособную культуру клеток.
Пример 3. Влияние типа и размера пор барботера на содержание полоксамера-188, необходимое для достижения благоприятного эффекта на рост и продуктивность культуры клеток
Серию экспериментов проводили для исследования влияния типа и размера пор барботера на содержание полоксамера-188, необходимое для достижения благоприятных характеристик роста и продуктивности в перфузионной культуре клеток. В этих экспериментах различные циклы перфузионного культивирования клеток выполняли с применением различных барботеров: барботера, имеющего пору, полученную в результате спекания, размером 20 мкм (1 реактор); барботера, имеющего пору, полученную в результате перфорации, размером 200 мкм (2 реактора); или барботера, имеющего пору, полученную в результате перфорации, размером 500 мкм (1 реактор). Для каждой перфузионной культуры изначально применяли среду CD CHO, содержащую 1,8 г/л полоксамера-188, и при необходимости полоксамер-188 добавляли к культуре в возрастающих концентрациях для поддержания жизнеспособности клеток и сведения к минимуму лизиса клеток. Плотность жизнеспособных клеток, удельную скорость роста, удельную продуктивность лактатдегидрогеназы, процент жизнеспособных клеток, объемную продуктивность и аэробное потребление глюкозы для каждой культуры клеток определяли в различные моменты времени в течение периода культивирования с помощью хорошо известных способов.
Данные показывают, что концентрация полоксамера-188 в культуре, составляющая 3,8 г/л, обеспечивала возможность поддержания плотности жизнеспособных клеток в цикле перфузионного культивирования клеток, выполняемого с применением барботера, имеющего пору, полученную в результате перфорации, размером 500 мкм, концентрация полоксамера-188, составляющая 4,8 г/л, обеспечивала возможность поддержания плотности жизнеспособных клеток в цикле перфузионного культивирования клеток, выполняемого с применением барботера, имеющего пору, полученную в результате перфорации, размером 200 мкм, и концентрация полоксамера-188, составляющая 5,8 г/л, обеспечивала возможность поддержания плотности жизнеспособных клеток в цикле перфузионного культивирования клеток, выполняемого с применением барботера, имеющего пору, полученную в результате спекания, размером 20 мкм (фигура 7).
Данные также показывают, что аналогичные значения удельной скорости роста (фигура 8), удельной продуктивности лактатдегидрогеназы (фигуры 9 и 11), процента жизнеспособных клеток (фигура 10), объемной продуктивности (фигура 12) и скорости аэробного поглощения глюкозы (фигура 13) достигались для цикла перфузионного культивирования клеток, выполняемого с применением 3,8 г/л полоксамера-188 и барботера, имеющего пору, полученную в результате перфорации, размером 500 мкм, для цикла перфузионного культивирования клеток, выполняемого с применением 4,8 г/л полоксамера-188 и барботера, имеющего пору, полученную в результате спекания, размером 200 мкм, и для цикла перфузионного культивирования клеток, выполняемого с применением 5,8 г/л полоксамера-188 и барботера, имеющего пору, полученную в результате спекания, размером 20 мкм.
Данные показывают, что все тестируемые барботеры можно применять для достижения плотности жизнеспособных клеток 60×106 клеток/мл, если полоксамер-188 присутствует в культуре в концентрации более 1,8 г/л. Например, плотность жизнеспособных клеток более 60×106 клеток/мл может быть достигнута в цикле перфузионного культивирования клеток с применением барботера с порой, полученной в результате перфорации, размером 1 мм при применении в культуре 2,8 г/л полоксамера-188, в цикле перфузионного культивирования клеток с применением барботера с порой, полученной в результате перфорации, размером 500 мкм при применении в культуре 3,8 г/л полоксамера-188, в цикле перфузионного культивирования клеток с применением барботера с порой, полученной в результате перфорации, размером 200 мкм при применении в культуре 4,8 г/л полоксамера-188, в цикле перфузионного культивирования клеток с применением барботера с порой, полученной в результате спекания, размером 100 мкм при применении в культуре 3,8 г/л полоксамера-188, и в цикле перфузионного культивирования клеток с применением барботера с порой, полученной в результате спекания, размером 20 мкм при применении в культуре 5,8 г/л полоксамера-188. Данные указывают на то, что чем меньше размер пор, тем больше требуется полоксамера-188 для поддержания жизнеспособной культуры.
Пример 4. Влияние типа пор, размера пор барботера и соотношения пеногасителя и полоксамера-188 на рост клеток при перфузионном культивировании
Дополнительную серию экспериментов проводили для определения равновесного клеточного роста в перфузионных культурах с применением барботеров с различными типами и размерами пор и различных соотношений пеногасителя и полоксамера-188 в культуре (показано в таблице 1 ниже).
Данные, приведенные в таблице 1, показывают, что требуются меньшие размеры пор, что к культуре необходимо добавлять больше пеногасителя-с для ослабления образования пены, что по мере увеличения скорости работы барботера требуется дополнительное количество пеногасителя-c, и что оптимальное соотношение пеногасителя-c и полоксамера-188 может составлять от 0 до < 5% (например, от приблизительно 1% до приблизительно 3%).
Таблица 1. Плотность жизнеспособных клеток в равновесном состоянии, достигнутая для исследуемых перфузионных культур
(г/л)
(CD-CHO=1,8 г/л)
день)
Пример 5. Влияние соотношения пеногасителя-C и полоксамера-188 на рост клеток в циклах периодического культивирования клеток
Серию экспериментов выполняли для исследования влияния соотношения пеногасителя-c и полоксамера-188 на рост клеток в циклах периодического культивирования клеток во встряхиваемой колбе с применением среды CD-CHO, содержащей пеногаситель-c и полоксамер-188 в соотношении 0%, пеногаситель-c и полоксамер-188 в соотношении 5,6%, пеногаситель-c и полоксамер-188 в соотношении 11,1%, пеногаситель-c и полоксамер-188 в соотношении 27,8% или пеногаситель-c и полоксамер-188 в соотношении 55,6%. Культуры клеток во встряхиваемой колбе перемешивали для пассивного образования пузырьков с целью стимуляции процесса в биореакторе. Плотность жизнеспособных клеток и удельную продуктивность лактатдегидрогеназы при каждом цикле культивирования клеток определяли ежедневно в течение периода культивирования с помощью хорошо известных способов.
Данные показывают, что при более низких соотношениях пеногасителя-c и полоксамера-188 наблюдаются повышенные значения плотности жизнеспособных клеток (фигура 14) и более низкие значения продуктивности лактатдегидрогеназы (фигура 15). Эти данные дополнительно указывают на то, что оптимальное соотношение пеногасителя-c и полоксамера-188 в культуре составляет от 0 до менее приблизительно 5% (например, от приблизительно 1% до приблизительно 3%).
ДРУГИЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Следует понимать, что, хотя настоящее изобретение было описано во взаимосвязи с его подробным описанием, вышеупомянутое описание предназначено для иллюстрации и не ограничивает объем изобретения, который определен объемом прилагаемой формулы изобретения. Другие аспекты, преимущества и модификации находятся в пределах объема нижеследующей формулы изобретения.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| СПОСОБЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТКИ МЛЕКОПИТАЮЩЕГО | 2015 |
|
RU2712746C2 |
| СПОСОБЫ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ КЛЕТОК | 2019 |
|
RU2786815C2 |
| СПОСОБ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ ВИНОГРАДА IN VITRO С ДЕКОНТАМИНАЦИЕЙ ОТ МИКОПЛАЗМЕННОЙ ИНФЕКЦИИ | 2013 |
|
RU2541769C1 |
| СПОСОБЫ СОЗДАНИЯ БАНКОВ КЛЕТОК СО СВЕРХВЫСОКОЙ ПЛОТНОСТЬЮ | 2015 |
|
RU2723129C2 |
| СПОСОБЫ ПЕРФУЗИОННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2015 |
|
RU2708919C2 |
| СПОСОБЫ ПЕРФУЗИОННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2015 |
|
RU2733539C2 |
| СПОСОБЫ СОЗДАНИЯ БАНКОВ КЛЕТОК СО СВЕРХВЫСОКОЙ ПЛОТНОСТЬЮ | 2015 |
|
RU2826038C2 |
| СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ В СИСТЕМЕ ПОСЕВНЫХ ФЕРМЕНТЕРОВ (ВАРИАНТЫ) | 2015 |
|
RU2694327C2 |
| ПРОЦЕССЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ В СИСТЕМЕ ПОСЕВНЫХ ФЕРМЕНТЕРОВ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2015 |
|
RU2786997C2 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИТЕЛА ИЛИ ЕГО ФРАГМЕНТА С ПОДПИТКОЙ (ВАРИАНТЫ) | 2007 |
|
RU2518289C2 |
Изобретение относится к биотехнологии, к способам культивирования клеток яичника китайского хомячка (СНО). Способ включает перфузионное культивирование клеток СНО, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный белок, в условиях, достаточных для получения рекомбинантного белка в жидкой среде, которую выбирают на основании одного или нескольких факторов, выбранных из группы: размер пор, тип пор, скорость газового потока, плотность жизнеспособных клеток в среде и маркеры, связанные с клеточным стрессом. Изобретение позволяет эффективно производить рекомбинантный белок. 2 н. и 28 з.п. ф-лы, 1 табл., 15 ил.
1. Способ культивирования клетки яичника китайского хомячка (CHO), при этом способ включает:
перфузионное культивирование клетки CHO, содержащей кодирующую рекомбинантный белок нуклеиновую кислоту, в условиях, достаточных для получения рекомбинантного белка, где
перфузионное культивирование предусматривает культивирование клетки CHO в жидкой среде, содержащей полоксамер-188 в концентрации от 6,0 до 16,0 г/л, и
где полоксамер-188 присутствует в жидкой среде, и/или его добавляют к жидкой среде перед стадией перфузионного культивирования, и/или его добавляют к жидкой среде во время стадии перфузионного культивирования.
2. Способ по п. 1, где жидкая среда дополнительно содержит пеногаситель, при этом соотношение пеногасителя (г/л) и полоксамера-188 (г/л) в жидкой среде составляет от 0,5 до 6,0% в жидкой среде.
3. Способ по п. 2, где соотношение пеногасителя (г/л) и полоксамера-188 (г/л) в жидкой среде составляет от 1,0 до 5,5%.
4. Способ по п. 3, где соотношение пеногасителя (г/л) и полоксамера-188 (г/л) в жидкой среде составляет от 1,5 до 5,0%.
5. Способ по любому из пп. 1-4, где способ включает добавление полоксамера-188 к жидкой среде перед стадией перфузионного культивирования и/или добавление полоксамера-188 к жидкой среде во время стадии перфузионного культивирования с обеспечением в жидкой среде концентрации полоксамера-188, составляющей от 6,0 до 8,0 г/л.
6. Способ по любому из пп. 1-4, где способ включает добавление полоксамера-188 к жидкой среде перед стадией перфузионного культивирования и/или добавление полоксамера-188 к жидкой среде во время стадии перфузионного культивирования с обеспечением в жидкой среде концентрации полоксамера-188, составляющей от 8,0 до 16,0 г/л.
7. Способ по любому из пп. 1-4, где способ включает добавление полоксамера-188 к жидкой среде перед стадией перфузионного культивирования и/или добавление полоксамера-188 к жидкой среде во время стадии перфузионного культивирования с обеспечением в жидкой среде концентрации полоксамера-188, составляющей от 10,0 до 16,0 г/л.
8. Способ по любому из пп. 1-4, где способ включает добавление полоксамера-188 к жидкой среде перед стадией перфузионного культивирования и/или добавление полоксамера-188 к жидкой среде во время стадии перфузионного культивирования с обеспечением в жидкой среде концентрации полоксамера-188, составляющей от 12,0 до 16,0 г/л.
9. Способ по любому из пп. 1-4, где способ включает добавление полоксамера-188 к жидкой среде перед стадией перфузионного культивирования и/или добавление полоксамера-188 к жидкой среде во время стадии перфузионного культивирования с обеспечением в жидкой среде концентрации полоксамера-188, составляющей от 14 до 16,0 г/л.
10. Способ по любому из пп. 1-9, где полоксамер-188 присутствует в жидкой среде.
11. Способ по любому из пп. 1-10, где способ включает обеспечение повышения концентрации полоксамера-188 в жидкой среде с течением времени.
12. Способ по п. 11, где основанием для повышения концентрации полоксамера-188 в жидкой среде с течением времени является плотность жизнеспособных клеток в жидкой среде.
13. Способ по п. 12, дополнительно включающий определение плотности жизнеспособных клеток в жидкой среде в один или более моментов времени в ходе стадии перфузионного культивирования.
14. Способ по любому из пп. 1-13, где перфузионное культивирование включает:
обеспечение сосуда, содержащего клетку CHO, помещенную в первую жидкую среду;
инкубирование сосуда при перемешивании и в течение периода культивирования, составляющего по меньшей мере 7 дней, при температуре от 32 до 40°C; и
спустя первые 48-96 часов периода культивирования удаление первого объема первой жидкой среды и добавление к первой жидкой среде второго объема второй жидкой среды непрерывным или периодическим способом, где первый и второй объемы являются равными.
15. Способ по п. 14, где вторая жидкая среда содержит полоксамер-188 в более высокой концентрации, чем таковая в первой жидкой среде.
16. Способ по п. 15, где первая жидкая среда содержит полоксамер-188 в концентрации 1,8 г/л или в концентрации менее 1,8 г/л, а вторая жидкая среда содержит полоксамер-188 в концентрации более 1,8 г/л.
17. Способ по любому из пп. 14-16, дополнительно включающий осуществление сбора рекомбинантного белка из клетки CHO, из первой жидкой среды или второй жидкой среды или любой их комбинации.
18. Способ по п. 17, дополнительно включающий включение в состав фармацевтической композиции собранного рекомбинантного белка.
19. Способ культивирования клетки CHO, при этом способ включает:
обеспечение системы культивирования, содержащей перфузионный биореактор, жидкую среду, помещенную в перфузионный биореактор, и барботер, помещенный в перфузионный биореактор, содержащий множество пор, предназначенных для распределения газа через барботер в жидкую среду; и
перфузионное культивирование клетки CHO, содержащей кодирующую рекомбинантный белок нуклеиновую кислоту, в системе культивирования в условиях и при скорости газового потока, достаточных для получения рекомбинантного белка в системе, где жидкая среда содержит полоксамер-188 в концентрации от 1,8 г/л или более 1,8 г/л, где концентрацию полоксамера-188 выбирают на основании одного или нескольких факторов, выбранных из группы, состоящей из размера пор, типа пор, скорости газового потока, плотности жизнеспособных клеток в жидкой среде и маркеров, связанных с клеточным стрессом.
20. Способ по п. 19, где жидкая среда дополнительно содержит пеногаситель, при этом соотношение пеногасителя (г/л) и полоксамера-188 (г/л) в жидкой среде составляет от 0,5 до 6,0% в жидкой среде.
21. Способ по п. 19 или 20, где достижение выбранной концентрации полоксамера-188 обеспечивают путем добавления полоксамера-188 к жидкой среде перед стадией культивирования и/или добавления полоксамера-188 к жидкой среде во время стадии культивирования.
22. Способ по любому из пп. 19-21, где способ включает осуществление выбора на основании типа пор и размера пор:
концентрации полоксамера-188 от 2,3 до 3,3 г/л в случае типа пор, относящегося к поре, полученной в результате перфорации, и размера пор, составляющего от 750 мкм до 1,5 мм;
концентрации полоксамера-188 от 3,3 до 4,3 г/л в случае типа пор, относящегося к поре, полученной в результате перфорации, и размера пор, составляющего от 250 мкм до 750 мкм;
концентрации полоксамера-188 более 4,3 г/л в случае типа пор, относящегося к поре, полученной в результате перфорации, и размера пор, составляющего от 1 мкм до 250 мкм;
концентрации полоксамера-188 от 1,8 до 3,3 г/л в случае типа пор, относящегося к поре, полученной в результате спекания, и размера пор, составляющего более 150 мкм; или
концентрации полоксамера-188 более 4,5 г/л в случае типа пор, относящегося к поре, полученной в результате спекания, и размера пор, составляющего от 1 мкм до 80 мкм.
23. Способ по любому из пп. 19-22, где перфузионное культивирование включает:
инкубирование системы культивирования, содержащей первую жидкую среду, при перемешивании и в течение периода культивирования, составляющего по меньшей мере 7 дней, при температуре от 32 до 40°C; и
спустя первые 48-96 часов периода культивирования удаление первого объема первой жидкой среды и добавление к первой жидкой среде второго объема второй жидкой среды непрерывным или периодическим способом.
24. Способ по п. 23, где вторая среда содержит полоксамер-188 в выбранной концентрации.
25. Способ по п. 23 или 24, дополнительно включающий осуществление сбора рекомбинантного белка из внутренней части клетки CHO, из первой жидкой среды или второй жидкой среды или любой их комбинации.
26. Способ по п. 25, дополнительно включающий включение в состав фармацевтической композиции собранного рекомбинантного белка.
27. Способ по любому из пп. 1-26, где рекомбинантный белок представляет собой иммуноглобулин, фермент, фактор роста, фрагмент белка или сконструированный белок.
28. Способ по п. 27, где фермент представляет собой галактозидазу.
29. Способ по п. 28, где галактозидаза представляет собой α-галактозидазу.
30. Способ по п. 29, где α-галактозидаза представляет собой α-галактозидазу-A.
| TORDAHL K, et al., Study of a perfusion process of Chinese Hamster Ovary cells by ATF filtration in bioreactor, Ovary cells by ATF filtration in bioreactor, 2009-09-11, XP0552474145, URL:http://kth.diva-portal.org/smash/record.jsf?pid=diva2%3A501675&dswid=2892; | |||
| KATAHAM M., et al., Effect of surfactants on the physical stability of recombinant |
