СПОСОБ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ ВИНОГРАДА IN VITRO С ДЕКОНТАМИНАЦИЕЙ ОТ МИКОПЛАЗМЕННОЙ ИНФЕКЦИИ Российский патент 2015 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к способам размножения растений, а именно к селекции растений и селекционным биотехнологиям. Изобретение может быть использовано в виноградарстве для оздоровления растений от вирусной и бактериальной инфекции при производстве базового и сертифицированного посадочного материала, в исследованиях по физиологии винограда. Служит охране окружающей среды.

Проблема контаминации распространяется на все области клеточной биологии и имеет непосредственное отношение к культивированию растений in vitro, так как питательные среды являются отличным субстратом для развития бактериальной и грибной микрофлоры. Источником контаминации может быть инфицированный эксплант, компоненты питательных сред, внутрилабораторная передача инфекции из воздуха, от персонала, от используемых лабораторных препаратов и от одной культуры клеток к другим. Совместное культивирование в одном помещении контаминированных и свободных от микоплазм клеток уже через 1-2 пассажа приводит к инфицированию последних и гибели.

Для деконтаминации используют антимикоплазменные антибиотики, но применение их для повседневного культивирования приводит к появлению устойчивых штаммов микоплазм. Увеличение дозы этих антибиотиков способствует снижению степени контаминации, но при этом происходит угнетение морфогенеза растений.

Известен способ введения в питательную среду антибиотиков для получения стерильных культур тканей (Р.Г. Бутенко «Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений», Москва, 1964, с.27-28).

Недостатком этого способа является то, что концентрации, угнетающие рост ткани или вызывающие нарушение ее обмена, бывают недостаточными для подавления развития инфекционных микроорганизмов.

При культивировании сирени для стерилизации растительных эксплантов, инфицированных бактериями, в питательную среду добавляли антибиотики из группы ластамных - пенициллин, ампициллин, цефатоксим, тикарциллин; из группы аминогликозидов - стрептомицин; из группы тетрациклинов - тетрациклин, ванкомицин (патент РФ №2457669).

В примерах приведены наиболее удачные варианты оптимальных концентраций минеральных и органических компонентов питательной среды, регуляторов роста растений и антибиотиков, но в тоже время отмечено, что статистически достоверных различий не выявлено.

Для оптимизации этапов клонального микроразмножения гибридов вишни применяли антибиотики цефотаксим, канамицин, тетрациклин и нистатин. Выделены антибиотики и оптимальные концентрации их для уменьшения средовой и посадочной инфекции (Майорова Ю.А. Оптимизация этапов клонального микроразмножения гибридов вишни на основе применения новых биологических активных веществ. Автореферат диссертации на соискание уч. степени канд. биолог, наук, Краснодар, 2009 г.).

Недостатком этого способа является добавление антибиотиков в питательную среду перед автоклавированием, что приводит к их разрушению, а также непродолжительное культивирование на питательной среде с антибиотиками не дает полной картины их действия.

При введении в культуру эксплантов земляники и яблони выявлен положительный эффект от применения антибиотика нистатин при нулевом эффекте от антибиотиков аугментин, ксенаквин, макропен, цефипим (Бунцевич Л.Л., Палецкая Е.Н., Костюк М.А., Медведева Н.И. «Исследование эффективности антибиотиков и стерилизаторов нового поколения для подавления бактериальной и грибной контаминации среды и эксплантов», тематический сетевой электронный научный журнал СКЗНИИСиВ, 2012, №16(4). - С-10).

Недостатком способа является внесение антибиотиков предварительно перед автоклавированием питательной среды. Кроме этого нистатин является противогрибковым средством и в отношении бактерий неактивен.

Установлено, что морфологические типы бактерий, выделенных из культуральной среды растений вишни и черешни, представляют смесь различных видов. Изучено 32 клона контаминат и выявлено, что источниками заражения являются ризосферная, эпифитная и эндофитная микрофлора растений и болезнетворная микрофлора человека (Бургутин А.Б., Феактистов Н.В., Пунина Н.В. Игнатов А.И. и др. Определение видовой принадлежности контаминирующих культур древесных растений in vitro, Звенигород, 2008, С. - 60).

Исходя из этого для деконтаминации питательной среды необходимо применять антибиотики из группы аминогликозидов с широким спектром действия, но их недостаток - высокая токсичность. Следовательно, необходимо подбирать оптимальную концентрацию, чтобы элиминировать бактерии, не повреждая растения. Следует учитывать, что в лабораторных условиях возможны случаи отравления растений даже слаботоксичными антибиотиками, которые применяются длительно и бессистемно.

Известен способ микроклонального размножения винограда in vitro, включающий микрочеренкование пробирочных растений, высадку их на питательную среду Мурасиге и Скуга без ростовых веществ и с уменьшенным количеством макроэлементов, при этом посадку и культивирование осуществляют на жидкой питательной среде с добавлением индолилуксусной кислоты 0,1-0,3 мг/л и эмистима в концентрации 10^-7-10^-10 мл/л (патент РФ №2264706). Эмистим оказывает двоякое действие на микрочеренки: способствует индукции ризогенеза и кроме этого оказывает влияние на конус нарастания почек глазка, способствуя делению клеток и вытягиванию в длину клеток всех тканей. В результате его применения происходит оптимизация метаболических процессов, усиливаются функции иммунитета у растений, активизируются защитные механизмы растений против многих патогенов.

Однако при этом не уничтожается бактериальная инфекция (мико-плазмы), которая угнетает растения и даже может привести к их гибели.

Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является повышение эффективности клонального микроразмножения растений винограда в культуре in vitro за счет повышения приживаемости и выхода оздоровленных от микоплазм растений, улучшения морфогенеза и качественных характеристик оздоровленных растений.

Поставленная задача достигается тем, что в предложенном способе клонального микроразмножения винограда in vitro с деконтаминацией от микоплазменной инфекции, включающем микрочеренкование пробирочных растений, высадку их на твердую питательную среду Мурасиге и Скуга без ростовых веществ и с уменьшенным количеством макроэлементов. При этом в состав питательной среды дополнительно вводится антибиотик гентамицин в два этапа: при первом субкультивировании гентамицин вводится в питательную среду в концентрациях 0,05-0,3 мл/л; при втором - в концентрациях 0,01-0,04 мл/л с дополнительным введением препарата эмистим в разведении 10^-6-10^-12 мл/л.

Новым в предложенном способе является то, что микрочеренки пробирочных растений высаживают на твердую модифицированную питательную среду с добавлением антибиотика гентамицин в концентрации 0,01-0,3 мл/л. Гентамицин является антибиотиком широкого спектра действия, относящегося к группе аминогликозидов, быстро проникает сквозь клеточную мембрану микроорганизмов, успешно соединяется с субъединицей рибосом клеток микроорганизмов, что блокирует синтез белка, препятствуя образованию комплекса транспортной и информационной РНК, при этом происходит ошибочное считывание РНК и образование нефункциональных белков. Гентамицин обладает бактерицидным действием - в больших концентрациях снижает барьерные функции цитоплазматических мембран и вызывает гибель микроорганизмов, оказывает антисептическое влияние по отношению к большинству грамположительных и грамотрицательных бактерий, в том числе на мутированных микробов, приспособившихся к другим антибиотикам.

Отличительными признаками предлагаемого способа является то, что предлагается система применения гентамицина, заключающаяся в ступенчатом двукратном применении антибиотика в двух субкультивациях. При этом в первом субкультивировании используются повышенные концентрации антибиотика - 0,1-0,3 мл/л и в последующем втором - пониженные - 0,01-0,03 мл/л с добавлением в состав питательной среды препарата эмистим в разведении 10^-6-10^-12 мл/л для снижения токсикации от применения гентамицина, улучшения регенерации растений из микрочеренков, процессов роста растений.

Технический результат выражается в том, что согласно предложенному способу в процессе его применения происходит элиминация бактерий, снижается токсичное действие антибиотика, отсутствует угнетение морфогенеза, что способствует улучшению приживаемости, качественных характеристик растений и повышению эффективности клонального микроразмножения. Применение предложенного способа обеспечивает дальнейшее продолжительное культивирование растений без применения антибиотиков.

Способ осуществляется следующим образом.

Отбирают растения винограда, регенерированные из апикальных меристем размером 0,1-0,2 мм и размноженные в культуре in vitro. Растения должны иметь 8-10 междоузлий. Затем готовят твердую питательную среду Мурасиге и Скуга следующего состава, мг/л: макроэлементы - аммоний азотнокислый - NH₄NO₃ - 138, калий азотнокислый - KNO₃ - 950, - магний сернокислый · 7-водный - MgSO₄·7H₂O - 185, калий фосфорнокислый однозамещенный - KH₂PO₄ - 68, кальций хлористый 2-водный - CaCl₂ 2H₂O - 296; микроэлементы-борная кислота - H₃BO₃ - 6.2, марганец сернокислый · 4-водный - MnSO₄·4H₂O - 22.3; медь сернокислая 5-водная - CuSO₄ - 0.025, кобальт хлористый 6-водный - CoCl₂·6H₂O - 0.025; цинк сернокислый 4-водный - ZnSO₄·4H₂O - 8.6, натрий молибденовокислый 2-водный-Na₂MoO₄ 2H₂O - 0.25, калий иодистый-KJ - 0.86, хелат железа: железо сернокислое · 7-водное - FeSO₄·7H₂O - 27.8, трилон-Б - Na₂ЭДТА - 37.3; витамины-мезоинозит - 50, тиамин HCl - 0,2; ИУК - 0,1-3 мг/л; pH среды перед автоклавированием 5,7-5,9.

Антибиотик добавляют в твердую питательную среду после автоклавирования, что обеспечивает его максимальное воздействие на микоплазмы. В боксе после остывания до +55°C питательную среду помещают в стерильные пробирки.

Микрочеренкование осуществляют в операционной комнате в ламинарном боксе «Фортран». Побеги, имеющие 8-10 междоузлий, при помощи пинцета извлекают из пробирки, помещают на стерильную чашку Петри, разрезают на микрочеренки, имеющие глазок с листом. Длина микрочеренка 10-12 мм, 2 мм над глазком, остальные под глазком. Полученные микрочеренки высаживают в пробирки на твердую питательную среду. Культивирование осуществляют в культуральной комнате при освещенности 2,0-3,0 тыс. люксов, фотопериоде - 16 часов, температуре 25-27±2°C, влажности воздуха 70-75%.

В таблицах представлены результаты конкретных экспериментов по осуществлению заявленного способа.

Результаты влияния антибиотика гентамицина в концентрациях 0,1-0,5 мл/л в составе питательной среды на этапе микрочеренкования (первое субкультивирование) на качественные характеристики растений на примере сорта Феркаль представлены в Табл.1.

Таблица 1 Вариант, мл/л Приживаемость, %% Корни Высота, см Листьев, шт. Скорость, мм/сут число, шт. длина, см ризог. зона, см 45 дней дней культивирования Контроль 40,5 1,5 0,77 0,19 0,2 - 0,04 ГМ-0,1 95,0 2,0 0,75 0,15 0,2 - 0,04 ГМ-0,3 95,0 0,2 0,2 0,04 1,2 - 0,02 ГМ-0,5 97,6 0,1 0,5 0,05 0,07 - 0,02 60 дней культивирования Контроль 30,9 2,0 4,9 9,8 4,5 1,0 0,075 ГМ-0,1 83,0 3,2 0,9 2,9 1,7 1,9 0,03 ГМ-0,3 73,8 0,3 0,2 0,06 0,2 0,3 0,04 ГМ-0,5 76,2 0,4 0,7 0,3 0,05 0,1 0,02 85 дней культивирования Контроль 28,6 3,5 3,1 10,7 5,4 3,0 0,06 ГМ-0,1 76,2 4,7 1,2 5,6 3,3 3,4 0,04 ГМ-0,3 73,8 0,5 0,8 0,4 0,6 0,9 0,007 ГМ-0,5 50,0 1,0 0,9 0,8 0,1 0,4 0,002

Выявлено, что гентамицин способствовал улучшению приживаемости микрочеренков и регенерации растений. При введении его в состав питательной среды приживаемость и сохранность растений возрастала в 2-3 раза по сравнению с контрольным вариантом.

Скорость роста растений при применении гентамицина снижалась и ухудшались их ростовые характеристики. Эти отрицательные явления наиболее существенно проявились при концентрациях 0,3-0,5 мл/л. При концентрации 0,1 мл/л несмотря на замедление роста происходило удовлетворительное развитие как ризогенной зоны, так и побегов, растения имели здоровый вид.

Результаты влияния антибиотика гентамицина в концентрациях 0,05-0,3 мл/л в составе питательной среды на этапе микрочеренкования (первое субкультивирование) на качественные характеристики растений на примере сорта Феркаль представлены в Табл.2.

Таблица 2 Вариант, мл/л Приживаемость, %% Корни Высота, см Листьев, шт. Скорость, мм/сут число, шт. длина, см ризог. зона, см 15 дней культивирования Контроль 9,5 4,0 2,8 11,2 3,1 3,0 0,2 ГМ 0,05 88,0 2,6 0,8 1,9 0,6 0,6 0,04 ГМ-0,1 64,3 1,4 0,7 1,0 0,1 - 0,006

ГМ-0,2 71,4 0,4 0,2 0,08 0,1 0,2 0,006 ГМ-0,3 45,0 0,2 0,2 0,04 0,1   0,006 28 дней культивирования Контроль 9,5 4,0 2,8 11,2 3,1 3,0 0,1 ГМ-0,05 81,0 3,0 1,4 4,2 2,1 2,2 0,08 ГМ-0,1 57,0 2,5 1,0 2,5 1,5 1,4 0,07 ГМ-0,2 71,4 0,2 0,8 0,2 0,4 0,9 0,05 ГМ-0,3 14,3 0,4 0,3 0,1 0,04 0,08 0,01 44 дня культивирования Контроль 7,1 4,0 3,6 14,4 6,3 4,0 0,14 ГМ-0,05 81,0 3,7 1,3 4,8 3,4 3,0 0,08 ГМ-0,1 47,6 3,7 1,1 4,1 2,3 2,6 0,05 ГМ-0,2 66,7 1,1 0,6 0,7 0,7 1,4 0,02 ГМ-0,3 9,5 0,8 0,2 0,2 0,2 0,5 0,004 63 дня культивирования Контроль 7,1 3,5 4,6 16,1 8,0 7,0 0,13 ГМ-0,05 71,4 6,1 1,4 8,7 5,2 5,6 0,08 ГМ-0,1 33,3 6,0 0,1 5,9 3,9 4,8 0,06 ГМ-0,2 64,3 6,9 0,9 6,2 1,6 3,4 0,03 ГМ-0,3 7,1 11,0 1,0 11,0 1,7 3,8 0,03 91 день культивирования Контроль 7,1 5,5 5,4 29,7 12,0 8,5 0,13 ГМ-0,05 61,9 7,9 1,5 12,2 9,0 9,3 0,10 ГМ-0,1 30,9 7,6 1,3 10,1 6,7 8,6 0,07 ГМ-0,2 61,9 12,6 1,0 12,7 3,9 6,3 0,04 ГМ-0,3 7,1 12,1 0,9 10,9 2,1 4,5 0,02

При концентрациях 0,05; 0,1; 0,2 и 0,3 мл/л также подтвердилось положительное влияние гентамицина на оздоровление питательной среды от микозов, что способствовало повышению приживаемости микрочеренков и развитию их в растения. Через 44 дня культивирования приживаемость в контрольном варианте составила 7,1%, а при введении в состав питательной среды гентамицина (0,05 мл/л)-81,0%, то есть улучшилась в 11,5 раз. Значительное улучшение приживаемости отмечено и при концентрациях антибиотика 0,2 и 0,3 мл/л. Проявилось токсическое влияние антибиотика на образование и рост корней, рост побегов, образование и рост листьев. Менее всего пострадали от гентамицина растения при минимальной концентрации 0,05 мл/л. При культивировании они отличались по размерным характеристикам от контрольных растений, но имели более здоровый, жизнеспособный вид.

Результаты сравнительных характеристик концентраций гентамицина в составе питательной среды на этапе микрочеренкования (первое субкультивирование) на примере подвойных сортов винограда приведены в Табл.3.

Таблица 3 Вариант, мл/л Приживаемость, % Корни Высота растений, см Число листьев, шт. число, шт. длина, шт. ризог. зона, см 25 дней культивирования Гравесак Гентамицин 0,05 78,5 3,9 0,4 1,6 2,0 2,6 Гентамицин 0,1 78,5 3,5 0,3 1,0 1,6 2,4 Телеки-5C Гентамицин 0,05 76,2 2,9 0,3 0,9 1,1 2,3 Гентамицин 0,1 90,4 2,6 0,3 0,8 1,0 1,9 73 дня культивирования Гравесак Гентамицин 0,05 69,0 5,6 0,6 3,3 7,6 6,4 Гентамицин 0,1 71,4 4,3 0,7 3,1 7,0 5,9 Телеки-5C Гентамицин 0,05 66,6 3,2 0,6 1,9 3,0 4,1 Гентамицин 0,1 90,4 3,2 0,4 1,2 3,6 4,1 66 дней культивирования Презент Гентамицин 0,05 54,8 6,8 1,0 6,8 3,3 6,7 Гентамицин 0,1 90,4 4,8 0,6 2,9 2,3 5,7 Кобер 5ББ Гентамицин 0,05 47,6 5,7 1,3 7,4 5,7 6,8 Гентамицин 0,1 80,9 5,1 0,7 3,6 2,7 5,6

Сравнительное изучение концентраций гентамицина в составе питательной среды при культивировании подвойных сортов винограда показало улучшение приживаемости растений при концентрации гентамицина 0,1 мл/л и улучшение морфогенеза растений при концентрации 0,05 мл/л.

Повышение приживаемости растений при концентрации антибиотика 0,1 мл/л и улучшение развития растений при концентрации 0,05 мл/л также отмечено у аборигенных сортов винограда Красностоп золотовский и Кумшацкий белый.

Результаты влияния антибиотика гентамицина в концентрациях 0,01; 0,05 и 0,1 мл/л в составе питательной среды на этапе микрочеренкования (первое субкультивирование) на качественные характеристики растений на примере сорта Фиолетовый ранний представлены в Табл.4.

Таблица 4 Вариант, мл/л Приживаем., %% Корни Высота растений, см Число листьев, шт. Скорость роста, м/сутки число, шт. длина, см ризоген. зона. см 35 дней культивирования Контроль 26,2 5,2 1,9 9,9 3,1 3,4 0,09 ГМ-0,01 73,8 5,8 1,9 11,0 2,9 3,1 0,08 ГМ-0,05 78,6 6,6 0,9 5,8 2,9 3,9 0,08 ГМ-0,1 78,6 0,3 0,6 1,8 2,0 2,0 0,02 71 день культивирования Контроль 21,4 8,2 2,2 18,0 7,5 8,0 0,1 ГМ-0,01 73,8 7,2 3,4 24,4 8,1 8,1 0,1 ГМ-0,05 72,6 7,8 0,9 7,0 6,6 7,1 0,09 ГМ-0,1 38,1 3,7 1,0 3,7 1,6 3,2 0,02 160 дней культивирования Контроль 16,7 8,0 2,5 20,0 16,6 14,9 0,1

ГМ-0,01 73,8 7,1 3,6 26,6 16,4 13,0 0,1 ГМ-0,05 71,4 8,1 1,9 15,4 13,3 12,6 0,08 ГМ-0,1 30,9 5,1 1,7 8,7 4,0 5,7 0,02

Как следует из приведенных данных, при введении гентамицина в состав питательной среды приживаемость растений увеличилась через 35 дней культивирования с 26,2% в контроле до 73,8-78,6% в вариантах с антибиотиком, то есть 2,8-3,0 раза. При концентрациях 0,05-0,1 мл/л наблюдалось уменьшение корнеобразования, высоты растений и их облиственности, особенно значительное при содержании гентамицина в питательной среде - 0,1 мл/л. При концентрации 0,01 мл/л наблюдалось увеличение ризогенной зоны и некоторое улучшение ростовых процессов.

Растения сортов Цимлянский белый, Кобер 5ББ, Гравесак, Презент, Феркаль, клон Цимлянского черного (2-3) культивировали в течение 60 дней на питательной среде, с содержанием гентамицина 0,05 мл/л. Растения не имели внешних признаков бактериального заражения. Для того чтобы проверить, действительно ли они оздоровлены от микозов, растения были расчеренкованы и высажены на питательную среду Мурасиге и Скуга без содержания антибиотика. Одного субкультивирования на среде с гентамицином оказалось недостаточно, и растения проявили признаки бактериального заражения.

В связи с этим проведено сравнительное изучение повторного применения антибиотика гентамицин в пониженных концентрациях (Табл.5) на сорте Талисман. Были испытаны четыре концентрации: 0,01; 0,02; 0,03; 0,04 мл/л. При повторном применении антибиотика отмечена высокая приживаемость растений во всех вариантах опыта, что указывает на незначительное заражение микозами однократно оздоровленных гентамицином растений. Положительным является тот факт, что при минимальной концентрации антибиотика в сравнении со всеми другими наблюдалось существенное улучшение корнеобразования, высоты и облиственности растений, скорости их роста, то есть отсутствовала интоксикация.

На основании этого можно предположить, что гентамицин в минимальных концентрациях при повторном применении не оказывает токсического воздействия на растения, культивируемые in vitro.

Исследована возможность повторного применения пониженных концентраций гентамицина на сортах Памяти Кострикина, Кабашный, Красностоп золотовский, Кумшацкий. Выявлено, что даже при высокой инфицированности микозами растений сорта Памяти Кострикина гентамицин в концентрации 0,03 мл/л способствует более высокой приживаемости микрочеренков, ростовые процессы при этой концентрации также были более интенсивными, чем при концентрации 0,05 мл/л.

Результаты влияния антибиотика гентамицин в концентрациях 0,01-0,04 мл/л в составе питательной среды при повторном применении (второе субкультивирование) на качественные характеристики растений на примере сорта Талисман представлены в Табл.5.

Таблица5 Вариант, мл/л Приживаем., %% Корни Высота растений, см Число листьев, шт. Скорость роста см/сут число, шт. длина, см ризоген. зона, см 42 дня культивирования ГМ-0,01 97,6 8,3 1,3 10,8 5,5 6,0 0,13 ГМ-0,02 97,6 6,1 0,8 4,9 4,3 3,8 0,10 ГМ-0,03 95,2 7,2 0,6 4,3 2,8 3,1 0,06 ГМ-0,04 97,6 5,4 0,6 3,2 2,0 2,7 0,04 62 дня культивирования ГМ-0,01 97,6 9,3 1,3 12,6 9,2 8,4 0,14 ГМ-0,02 97,6 6,9 1,0 6,9 6,6 5,6 0,09 ГМ-0,03 95,2 7,0 0,5 3,5 3,8 4,0 0,06 ГМ-0,04 97,6 5,4 0,8 !Л11 3,3 3,6 0,05

82 дня культивирования ГМ-0,01 97,6 9,7 1,4 13,6 12,0 10,7 0,14 ГМ-0,02 92,8 8,5 1,8 15,3 8,3 7,9 0.10 ГМ-0,03 95,2 .7,5 0,6 4,5 4,5 5,6 0,05 ГМ-0,04 97,6 5,8 0,8 4,6 4,2 5,2 0,05

Таким образом, при двукратном внесении антибиотика гентамицин отмечен положительный результат по приживаемости и ростовым процессам у растений сорта Талисман (0,01 мл/л); сорта Памяти Кострикина по приживаемости при концентрации 0,03 мл/л и развитию растений при 0,01 мл/л; сорта Кумшацкий по приживаемости (0,01 и 0,03 мл/л) и достаточно высоким показателям развития растений при концентрации 0,01 мл/л. Улучшение корнеобразования, показателей роста побегов на уровне контроля обнаружены у растений сорта Кабашный при концентрации 0,01 мл/л.

Результаты влияния антибиотика гентамицин в концентрациях 0,01-0,03 мл/л в составе питательной среды при повторном применении (второе субкультивирование) на качественные характеристики растений на примере сорта Красностоп золотовский представлены в Табл.6.

Таблица 6 Вариант, мл/л Приживаем., %% Корни Высота растений, см Число листьев, шт. Скорость роста, см/сут число, шт. длина, см ризоген. зона. см 27 дней культивирования Контроль 96,3 2,7 1,2 3,2 1,6 1,6 0,06 ГМ 0,01 96,3 3,5 1,2 4,2 1,8 1,6 0,07 ГМ 0,03 100,0 3,0 1,1 3,3 1,6 1,4 0,06 45 дней культивирования Контроль 92,6 3,8 1,9 7,2 3,0 3,2 0,07 ГМ 0,01 96,3 4,2 2,0 8,4 3,5 3,2 0,08 ГМ 0,03 100,0 4,3 2,0 8,6 3,6 2,8 0,08

57 дней культивирования Контроль 92,6 4,1 2,4 9.8 4,5 5,0 0,08 ГМ 0,01 96,3 5,0 2,4 12,0 5,0 5,0 0,09 ГМ 0,03 100,0 4,9 2,6 12,7 5,1 4,8 0,09

Улучшение качественных показателей растений после двукратного применения антибиотика можно объяснить деконтаминацией растений от микозов, что и было целью настоящего исследования.

Растения были выровненными, хорошо выглядели, имели крепкие прямостоячие стебли и листья ярко-зеленой окраски. На адаптацию было передано 92,0% растений сорта Кабашный, 80,9% сорта Красностоп золотовский; 94,0% растений сорта Кумшацкий. Это высокий результат культивирования.

Результаты влияния антибиотика гентамицин в концентрациях 0,01 мл/л и регулятора роста эмистим в разведении 10^-6-10^-12 мл/л в составе питательной среды при повторном применении (второе субкультивирование) на качественные характеристики растений на примере сорта Памяти Кострикина представлены в Табл.7.

Таблица 7 Вариант, мл/л Приживаем., %% Корни Высота растений, см Число листьев, шт. Скорость роста см/сут число, шт. длина, см ризоген. зона. см 36 дней культивирования Контроль 75 2,7 3,0 8,1 3,9 3,6 0,11 ГМ 0.01 100 3,4 0,9 3,2 2,2 2,3 0,06 ГМ +Э(-6) 96,4 4,0 0,9 3,8 2,5 2,3 0,07 ГМ +Э(-8) 92,8 3,6 0,8 2,9 2,2 2,4 0,06 ГМ +ЭС-10) 100 4,4 0,9 4,1 2,7 3,1 0,08

ГМ +Э(-12) 100 4,2 0,8 3,1 2,6 2,8 0,07 68 дней культивирования Контроль 75 3,4 2,9 9,9 8,1 7,9 0,12 ГМ 0.01 100 4,9 0,8 3,9 3,8 4,5 0,06 ГМ +Э(-6) 96,4 5,2 0,8 4,2 4,3 5,5 0,06 ГМ +Э(-8) 92,8 4,8 0,9 4,3 4,0 5,2 0,06 ГМ +Э(-10) 100 6,2 0,9 5,6 5,4 6,7 0,08 ГМ +ЭС-12) 100 6,0 0,8 4,8 4,8 5,6 0,07 97 дней культивирования Контроль 67,9 3,6 3,3 11,9 12,3 10,6 0,13 ГМО,01 96,4 5,6 0,8 4,5 5,3 6,7 0,05 ГМ+Э(-6) 96,4 6,1 0,8 4,9 6,6 7,9 0,07 ГМ+Э(-8) 92,8 5,8 1,0 5,8 6,4 6,9 0,07 М+Э(-10) 96,4 6,9 1,1 7,6 8,2 9,3 0,08 ГМ +Э-12) 100 6,6 0,9 5,9 7,4 8,6 0,08

Гентамицин оказал на растения сильное ингибирующее воздействие: длина ризогенной зоны уменьшилась в 2,5 раза, высота растений и их облиственность в 1,6-1,7 раза. В снижении этого негативного влияния положительную роль сыграл препарат Эмистим. При всех разведениях Эмистима улучшилось корнеобразование и развитие ризогенной зоны, рост и облиственность побегов. Лучшие результаты выявлены при разведении 10^-10.

Таким образом, чтобы уменьшить ингибирование ростовых процессов, в результате действия антибиотика гентамицин, необходимо добавлять в состав питательной среды препарат Эмистим в разведении 10^-10 мл/л, который способствует улучшению корнеобразования и развитию ризогенной зоны, росту и облиственности стебля, то есть улучшению качественных характеристики растений.

Таким образом, полученные результаты убедительно показали эффективность предлагаемого способа клонального микроразмножения винограда in vitro с деконтаминацией от микоплазменной инфекции: антибактериальная терапия при помощи антибиотика гентамицин из группы аминогликозидов с широким спектром действия. Для уменьшения токсичности антибиотика рекомендуется двухэтапный способ внесения его в питательную среду. При первом субкультивировании в питательную среду добавляется гентамицин в концентрациях 0,05-0,3 мл/л, что обеспечивает значительное оздоровление от микоплазм. При втором субкультивировании оздоровленных растений для полного оздоровления рекомендуется повторное применение гентамицина в пониженных концентрациях - 0,01-0,04 мл/л.

Для уменьшения ингибирования ростовых процессов в результате действия антибиотика гентамицин необходимо добавление в состав питательной среды препарата эмистим в разведении 10^-6-10^-12 мл/л.

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии. Изобретение представляет собой способ клонального микроразмножения винограда in vitro с деконтаминацией от микоплазменной инфекции, включающий микрочеренкование пробирочных растений, высадку их на твердую питательную среду Мурасиге и Скуга без ростовых веществ и с уменьшенным количеством макроэлементов. При этом в состав питательной среды дополнительно вводится антибиотик гентамицин в два этапа: при первом субкультивировании гентамицин вводится в концентрациях 0,05-0,3 мл/л; при втором - в концентрациях 0,01-0,04 мл/л одновременно с введением препарата эмистим в разведении 10^-6-10^-12 мл/л. Использование заявленного способа позволяет повысить эффективность клонального микроразмножения растений винограда в культуре in vitro, повысить приживаемость и выход оздоровленных от микоплазм растений с улучшенным морфогенезом и качественными характеристиками. 7 табл.

Способ клонального микроразмножения винограда in vitro с деконтаминацией от микоплазменной инфекции, включающий микрочеренкование пробирочных растений, высадку их на твердую питательную среду Мурасиге и Скуга без ростовых веществ и с уменьшенным количеством макроэлементов, отличающийся тем, что в состав питательной среды дополнительно вводится антибиотик гентамицин в два этапа: при первом субкультивировании гентамицин вводится в концентрациях 0,05-0,3 мл/л; при втором - в концентрациях 0,01-0,04 мл/л одновременно с введением препарата эмистим в разведении 10^-6-10^-12 мл/л.