СПОСОБ ОЦЕНКИ ПОПАРНЫХ МЕЖВИДОВЫХ БИОТИЧЕСКИХ ОТНОШЕНИЙ МИКРОМИЦЕТОВ Российский патент 2024 года по МПК C12N1/14 C12Q1/04 C12R1/645 

Изобретение относится к области экологии, фитопатологии, защиты растений. Предназначено для оценки попарных межвидовых биотических отношений микромицетов.

Микромицеты являются важным компонентом экостистем, выполняя в них различные функции - редуцентов, консументов разного уровня. Часть микромицетов, обладая фитопатогенными свойствами, причиняют существенный вред высшим растениям, вызывая различные патологические симптомы, частичную или полную гибель. Известно, что на больном растений могут одновременно паразитировать микромицеты разных видов и родов (сопряженные инфекции), составляя патогенный микоценоз. Например патогенный микоценоз семян зерновых культур включает Bipolaris sorokiniana, грибы родов Fusarium, Alternaria, Cladosporium и др. Сложная структура микоценозов ставит глобальную практическую задачу прогноза видового состава сообществ, выявления закономерностей реализации экологических ниш наиболее вредоносными микромицетами, смены доминирования видов. В этих процессах важную роль играют межвидовые отношения, отличающиеся многообразием и напряженностью.

Научную основу изучения межвидовых отношений в природных сообществах заложил Ч. Дарвин, который на многих ярких примерах показал, «как сложны и неожиданны препятствия и взаимные отношения между органическими существами, борющимися за жизнь в одной и той же стране».

Микромицеты, входящие в состав консортов высших растений взаимодействуют друг с другом, и эти взаимодействия являются важным фактором эволюции видов, их сукцессий, оказывают существенное влияние на состав ценозов. Факторы влияния одного микромицета на другой при их ассоциативном взаимодействии на питательной среде может быть связаны с конкуренцией за ресурсы (пассивный антагонизм) или с выделением продуктов метаболизма (активный антагонизм).

В настоящее время принята классификация взаимодействий между видами по следующим категориям: нейтрализм, аменсализм, комменсализм, конкуренция, хищничество (включая паразитизм) и др. [Burkholder P.R. Cooperation and conflict among primitive organisms. (Sigma Xi lecture) American Scientist. № 40. Р. 601-631]. Основной недостаток этой классификации состоит в оценке влияния видов друг на друга только по одному показателю - численности, а также в отсутствии количественной оценки взаимовлияний.

Попытка типизации биотических отношений между антагонистами рода Trichoderma и фитопатогенными микромицетами в форме буквенно-числовой шкалы были сделаны Ф.К. Алимовой [Алимова Ф.К. «Биологическое разнообразие видов рода Trichoderma (Fungi, Ascomycetes, Hypocreales) и их роль в функционировании микробиоты и защите растений в агроценозах различных почвенно - климатических зон на территории Республики Татарстан». / Ф.К. Алимова / Диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук. Казань. 2006. C.130-131]. Основной недостаток этой классификации состоит в ее узкой направленности - оценке взаимоотношений только между антагонистическими грибами из рода Trichoderma и фитопатогенами и оценке только одного показателя - характера роста колоний грибов рода Trichoderma (ограничение, обрастание) без количественной оценки взаимовлияния грибов.

В литературе отсутствуют сведения о количественных оценках напряженности биотических отношений микромицетов, хотя упоминания об актуальности таких исследований есть во многих современных публикациях.

Техническая задача - создание комплексного способа количественной оценки попарных межвидовых биотических отношений микромицетов, учитывающего морфологию колоний, скорость их роста, интенсивность размножения грибов, наличие зоны лизиса по шкале в баллах.

Предлагаемый способ основан на методике [Burkholder P.R. Cooperation and conflict among primitive organisms. (Sigma Xi lecture) American Scientist. № 40. Р. 601-631] (выбрана за прототип)

Исследователем P.R. Burkholder был предложен следующий способ оценки межвидовых биотических взаимодействий во встречных (парных) культурах, когда колонии двух изучаемых видов грибов растут на одной чашке Петри навстречу друг другу: каждой паре видов сопоставляется комбинация из двух символов, каждый из которых может быть плюсом («+»), нулем («0») или минусом («-»), в зависимости от направления влияния одного вида на скорость роста другого вида пары. После чего классификация проводится по таблице 1.

Таблица 1. Классификация межвидовых биотических отношений в зависимости от влияния каждого из видов пары на скорость изменения численности другого* № Тип взаимодействий Влияние первого вида на второй второго вида на первый 1 Нейтрализм 0 0 2 Аменсализм - 0 3 Комменсализм + 0 4 Конкуренция - - 5 Жертва-эксплуататор + - 6 Мутуализм + +

* «+» - увеличение (уменьшение) численности одного вызывает увеличение (уменьшение) численности другого; «0» - отсутствие влияния; «-» увеличение (уменьшение) численности одного вызывает уменьшение (увеличение) численности другого.

Суть предлагаемого авторами метода состоит в следующем:

1.Культивируют культуры микромицетов в стерильных условиях в чашках Петри (чистую культуру каждого вида пары микромицетов - контроль, и культуры встречных моноизолятов - опытный вариант) [Дудка И.А., Вассер С.П., Элланская И.А. Методы экспериментальной микологии: справочник/ под ред. В.И. Билай: Киев, «Наукова думка», 1982, С. 119-120] Посев культур микромицетов проводят в боксовой комнате (ламинарном боксе) стерильной бактериологической иглой на поверхность застывшей питательной среды Чапека в стерильную чашку Петри. Для этого стерильную чашку Петри (9,5х9,5см) помещают на стол вблизи пламени газовой горелки (спиртовки), осторожно приоткрывают крышку пальцами левой руки, вносят правой рукой 20 мл расплавленной агаризованной среды Чапека и опускают крышку. После застывания среды на ее поверхность засевают культуру гриба одним уколом бактериологической иглы по центру (контроль) или в противоположные края чашки Петри (0,5 см от края) навстречу друг другу (опытные варианты- встречные культуры). На чашках Петри с посевами делают необходимые надписи перманентным маркером, помещают их в картонные коробки (или новые полиэтиленовые пакеты) реверсом вверх и переносят в термостат. Каждый вариант закладывают в пятикратной повторности. Инкубируют чашки в 10 суток при температуре +20-24°С.

2. Проводят наблюдения и измерения выращенных предлагаемым способом встречных и контрольных (моноизоляты) колоний микромицетов на 3,7,10 сутки культивации по ряду показателей (таблица 2).

Таблица 2. Наблюдения и измерения №
п/п Показатель Описание 1. Скорость радиального роста колоний Измерения проводить на 3, 7 и 10 сутки, вычисляя среднюю арифметическую скорость по 5 чашкам, на каждой чашке измеряют диаметр колонии от точки посева до конца зоны роста мицелия. Измерения проводят по двум взаимно перпендикулярным направлениям колонии, вычисляя среднее арифметическое. 2. Морфология колонии 2.1 пигментация реверса (цвет, интенсивность), 2.2 пигментация мицелия (цвет), 2.3 строение колонии (пушистая, волокнистая, бархатистая, клочковатая и т.д.), 2.4. характер края (зубчатый, гладкий, волокнистый, фестончатый, реснитчатый и т.д.), 2.5 структура колонии (однородная, волокнистая, зернистая), 2.6 консистенция колонии (мягкая, плотная), 2.7 поверхность колонии (гладкая, шероховатая), 2.8 профиль колонии (плоский, изогнутый, выпуклый), 2.9 форма колонии (круглая, концентрическая), 2.10 строение центральной части колонии (куполообразное, плоское, кратерообразное) 3. Наличие и ширина зоны лизиса Наличие и ширина свободной зоны на чашке Петри между встречными колониями, не занятой микромицетами 4. Изменение в любую строну интенсивности споруляции микромицетов Интенсивности споруляции микромицетов учитывать в динамике на 3, 7 и 10 сутки по образцам в центре колоний и на крае со стороны встречной колонии вычисляя среднее арифметическое

Определение споруляции фитопатогенных микромицетов:

Вырезать стерильным пробоотборником с диаметром 4 мм фрагмент колонии. Брать фрагменты у каждого вида из 2 мест колонии (центр, край). В чашках Петри с опытными вариантами вырезать центр и тот фрагмент, который максимально близко располагается к другому виду. Определить площадь (πd²/4) вырезанного фрагмента. Если диаметр пробоотборника составляет 4мм, то площадь составит 12,56мм². Фрагмент поместить в пробирку, добавить 1 мл стерильной воды дозатором, растереть стеклянной палочкой. На стекло раскапать дозатором 0,1 мл суспензии, подсушить и посчитать число спор микромицета. Расчитать число спор (шт.) на 1 см² колонии с определением среднего арифметического по пяти повторностям.

2. Оценивают характер и напряженность межвидовых биотических отношений микромицетов по предложенной шкале (таблица 3).

По каждой из четырех групп показателей, представленных в пункте 2 предложены четырехбалльные шкалы оценки конкурентоспособности микромицета - от 0 - минимальная конкурентоспособность, до 4 - сильный конкурент, не реагирует на наличие другого гриба. Баллы каждого вида суммировать по четырем группам показателей

Таблица 3. Шкала для оценки межвидовых отношений микромицетов методом встречных культур в баллах* Показатель Характеристика Балл 1. Замедление радиальной скорости роста колонии Замедления радиальной скорости роста по сравнению с контролем нет или она не превышает 10% 4 Замедление по сравнению с контролем небольшое, 11-20% 3 Замедление по сравнению с контролем умеренное, 21-30% 2 Замедление по сравнению с контролем сильное, 31-50% 1 Замедление скорости роста по сравнению с контролем очень сильное, более 50% 0 2. Изменение морфологии колоний (по таблице 2 пункт 2) Изменений морфологии по сравнению с контролем нет 4 Изменения по 1-2 признакам из 10 по сравнению с контролем 3 Изменение по 3-4 признакам из 10 по сравнению с контролем 2 Изменение по 5-6 признакам из 10 по сравнению с контролем 1 Изменение по 7-10 признакам по сравнению с контролем 0 3. Наличие зоны лизиса между встречными колониями Зона лизиса отсутствует, края колоний встречных культур имеют типичную форму и пигментацию в месте соприкосновения 4 Зона лизиса между колониями до 2 мм или у одной (или обеих) колоний отмечено усиление пигментации или изменение формы края по сравнению с контролем 3 Зона лизиса от 2 до 5 мм 2 Зона лизиса от 5 до 7 мм 1 Зона лизиса более 7 мм 0 4. Изменение интенсивности споруляции в сторону стимуляции или подавления Отклонения по сравнению с контролем нет или оно не превышает 10% 4 Отклонение по сравнению с контролем 11-20% 3 Отклонение по сравнению с контролем 21-30% 2 Отклонение по сравнению с контролем 31-50% 1 Отклонение по сравнению с контролем более 50% 0 Максимальная сумма баллов по всем блокам шкалы 16

* В качестве контроля используется колония моноизолята каждого гриба пары

Взаимодействие видов считай нейтральными, если оба набрали 10 и более баллов, а разница между видами не превышает 3 баллов. Если хотя бы один из видов набрал меньше 10 баллов или разница в набранных баллах между видами превышает 3, то отношения между видами следует признать конкурентными. По сумме набранных каждым видом баллов можно провести оценку его конкурентной способности по отношению к другому виду. Сравнение предлагаемого метода с прототипом представлено в таблице 4.

Таблица 4. Сравнение предлагаемого метода с прототипом Параметры сравнения Прототип Предлагаемое изобретение 1.Количество критериев для сравнения видов 1 4 2. Критерии сравнения видов Влияние одного вида на скорость роста другого 1. Влияние одного вида на скорость роста другого вида по сравнению с контролем
2. Изменение морфологии каждого вида под влиянием другого вида по сравнению с контролем
3. Наличие зоны лизиса между видами
4. Изменения в интенсивности споруляции каждого вида по сравнению с контролем 3.Результат оценки изменений «+»,
«-»,
«0» Результат представлен в баллах шкалы, с определенными четкими границами каждого балла 4.Учет изменения типа взаимодействия с течением времени (с возрастом) нет Да (учитываются 3 временных промежутка: молодость, зрелость, начало старения) 5. Возможность ранжирования разных видов по степени проявления признаков конкуренции нет да

Основные преимущества предлагаемого изобретения:

3. Бальная шкала оценки (с использованием баллов есть возможность определить тип взаимоотношений (нейтрализм, конкуренция) и сравнить уровень конкуренции между видами, есть возможность ранжировать виды по конкурентной способности друг к другу (в баллах)

2. Комплексный подход, высокая информативность (учитывается скорость роста, морфология колонии, интенсивность споруляции)

3. Простота использования, нет необходимости в покупке или изготовлении дорогостоящего оборудования, возможность использования при минимальном оснащении лаборатории

Литература:

Burkholder P.R. Cooperation and conflict among primitive organisms. (Sigma Xi lecture) American Scientist. № 40. Р. 601-631.

Алимова Ф.К. «Биологическое разнообразие видов рода Trichoderma (Fungi, Ascomycetes, Hypocreales) и их роль в функционировании микробиоты и защите растений в агроценозах различных почвенно - климатических зон на территории Республики Татарстан». / Ф.К. Алимова / Диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук. Казань. 2006. 435 с.

Дудка И.А., Вассер С.П., Элланская И.А. Методы экспериментальной микологии: справочник/ под ред. В.И. Билай: Киев, «Наукова думка», 1982, 550 с.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ оценки попарных межвидовых биотических отношений микромицетов, включающий культивацию в стерильных условиях в чашках Петри при 24°С моноизолятов (контроль) пар грибов и их встречных культур, сравнение развития моноизолятов и встречных культур грибов на 3, 7, 10 сутки по радиальной скорости роста, по десяти морфологическим признакам колоний; интенсивности споруляции грибов; наличию и размеру зоны лизиса между встречными колониями; затем выполняют количественную оценку результатов наблюдений по предложенной шкале в баллах. Если оба вида набрали десять и более баллов по шкале, а разница между ними не превышает трех баллов - отношения нейтральные; если хотя бы один из видов набрал меньше десяти баллов или разница в набранных баллах между видами превышает три балла - отношения конкурентные. Изобретение обеспечивает количественную оценку напряженности биотических отношений микромицетов для прогноза видового состава сообществ. 4 табл.

Способ оценки попарных межвидовых биотических отношений микромицетов, включающий культивацию в стерильных условиях в чашках Петри при 24°С моноизолятов (контроль) пар грибов и их встречных культур, сравнение развития моноизолятов и встречных культур грибов на 3, 7, 10 сутки по радиальной скорости роста, по десяти морфологическим признакам колоний (пигментация реверса, пигментация мицелия, строение, характер края, структура, консистенция, поверхность, профиль, форма, строение центральной части колонии); интенсивности споруляции грибов; наличию и размеру зоны лизиса между встречными колониями; а также количественную оценку результатов наблюдений по предложенной шкале в баллах:

Показатель Характеристика Балл 1. Замедление радиальной скорости роста колонии Замедления радиальной скорости роста по сравнению с контролем нет или она не превышает 10% 4 Замедление по сравнению с контролем небольшое, 11-20% 3 Замедление по сравнению с контролем умеренное, 21-30% 2 Замедление по сравнению с контролем сильное, 31-50% 1 Замедление скорости роста по сравнению с контролем очень сильное, более 50% 0 2. Изменение морфологии колоний:
2.1 пигментация реверса (цвет, интенсивность);
2.2 пигментация мицелия (цвет);
2.3 строение колонии (пушистая, волокнистая, бархатистая, клочковатая и т.д.);
2.4. характер края (зубчатый, гладкий, волокнистый, фестончатый, реснитчатый и т.д.);
2.5 структура колонии (однородная, волокнистая, зернистая);
2.6 консистенция колонии (мягкая, плотная);
2.7 поверхность колонии (гладкая, шероховатая);
2.8 профиль колонии (плоский, изогнутый, выпуклый);
2.9 форма колонии (круглая, концентрическая);
2.10 строение центральной части колонии (куполообразное, плоское, кратерообразное) Изменений морфологии по сравнению с контролем нет 4 Изменения по 1-2 признакам из 10 по сравнению с контролем 3 Изменение по 3-4 признакам из 10 по сравнению с контролем 2 Изменение по 5-6 признакам из 10 по сравнению с контролем 1 Изменение по 7-10 признакам по сравнению с контролем 0 3. Наличие зоны лизиса между встречными колониями Зона лизиса отсутствует, края колоний встречных культур имеют типичную форму и пигментацию в месте соприкосновения 4 Зона лизиса между колониями до 2 мм или у одной (или обеих) колоний отмечено усиление пигментации или изменение формы края по сравнению с контролем 3 Зона лизиса от 2 до 5 мм 2 Зона лизиса от 5 до 7 мм 1 Зона лизиса более 7 мм 0 4. Изменение интенсивности споруляции в сторону стимуляции или подавления Отклонения по сравнению с контролем нет или оно не превышает 10% 4 Отклонение по сравнению с контролем 11-20% 3 Отклонение по сравнению с контролем 21-30% 2 Отклонение по сравнению с контролем 31-50% 1 Отклонение по сравнению с контролем более 50% 0 Максимальная сумма баллов по всем блокам шкалы 16

если оба вида набрали десять и более баллов по шкале, а разница между ними не превышает трех баллов – вид отношений нейтральные;

если хотя бы один из видов набрал меньше десяти баллов или разница в набранных баллах между видами превышает три балла – вид отношений конкурентные; сумма набранных каждым из конкурирующих грибов баллов дает количественную оценку способности подавлять развитие другого вида гриба пары.