ШТАММ МИКРОМИЦЕТА CLONOSTACHYS CANDELABRUM F-1466, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУЛЯРЕМИИ FRANCISELLA TULARENSIS 15/10 Российский патент 2015 года по МПК C12N1/14 C12N1/20 A61K35/66 

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и биотехнологии.

Среди микробов, подавляющих развитие возбудителя туляремии, грибы являются наименее изученной группой микроорганизмов. В научной литературе известны лишь единичные работы, посвященные данной проблеме. Из них заслуживает внимание работа по поиску новых антибиотиков из метаболитов высших грибов, обладающих бактерицидным действием в отношении возбудителя туляремии [Шариков, A.M. Выраженность бактерицидной активности гриба Inonotus obliouus pilot в отношении Francisella tularensis линии 15 НИИЭГ / A.M. Шариков, Н.В. Пашенова, И.А. Новицкий // Сибирское медицинское обозрение. - Красноярск, 2008. - №1]. Среди микромицетов выявлено 95 культур, обладающих антагонистическими свойствами в отношении Francisella tularensis, из них 41 культура показала высокую активность [Юскевич В.В. Формирование коллекции природных микромицетов и выявление штаммов с антибактериальными и москтитоцидными свойствами // Автореферат канд. дис. - Оболенск, 2012]. В этой же работе приводится перечень 27 родов, в которых отмечены активные штаммы грибов. Указывается, что наиболее высокую активность проявляют следующие виды грибов: Beauveria bassiana, Acremonium pteridii, Calcarisporum arbuscula, Cosmospora berkeleyana, Clonostachys candelabrum, Fusarium oxysporum, Humicola fuscoatra, Penicillium vulpinum, P. chrysogenum, P. lilacinum, Trichoderma harzianum, T. asperellum. Однако в приведенной работе отсутствуют данные по изучению биотехнологических свойств штаммов грибов, активных в отношении возбудителя туляремии.

Известно, что грибы являются продуцентами многих биологически активных веществ, нашедших в настоящее время широкое применение в фармакологии [Петров, П.Т. Новые лекарственные средства на основе биологически активных соединений мицелиальных грибов / П.Т. Петров, А.Д. Скрипко, Е.В. Литвинова, Н.А. Дедюшко, Л.Н. Гриневич // Успехи медицинской микологии. - М., 2006. - Т. 7. - С. 198-199]. К настоящему времени только из анаморфных видов грибов выделено около 1500 антибиотиков [Дудник Ю.В. Вторичные метаболиты грибов // Современная микология в России. Первый съезд микологов России. Тезисы докладов. М: 2002 г., с. 263-264].

Известно, что по сравнению с продуктами химического синтеза грибные метаболиты менее токсичны и более эффективны при применении в медицинской практике [Holliday, J. Medicinal value of the Caterpillar fungi species of the genus Cordyceps (Fr.) Link (Ascomycetes). A review / J. Holliday, M. Cleaver // International Journal of Medicinal Mushrooms. - 2008. - Vol. 10, N3. - P. 219-234].

Развитие биотехнологии и микологии привело к появлению новой отрасли - фармацевтической микологии, разрабатывающей и создающей лекарственные препараты на основе природных соединений мицелиальных грибов [Феофилова, Е.П. Вклад современной микологии в создание биотехнологий медицинского назначения / Е.П. Феофилова, А.А. Алексеев, В.М. Терешина, А.С. Меморская // Успехи медицинской микологии. - М., 2004. - Т. 1 - С. 139-141].

Установлено, что на долю метаболитов грибного синтеза приходится более 50% от всех вновь открываемых биологически активных природных соединений [Бибикова, М.В. Биотехнология микромицетов - реальность и перспектива. Современная микология в России. Т. 2 / М.В. Бибикова, А.В. Катлинский // Материалы 2-го съезда микологов России. - М.: Национальная академия микологии, 2008]. Поэтому поиск грибов в качестве продуцентов биологически активных веществ, подавляющих возбудителя туляремии, является актуальной задачей современной медицинской биотехнологии.

Задачей изобретения является получение нового штамма микромицета Clonostachys candelabrum (Bonoren) Schroers с выраженными антибактериальными свойствами в отношении возбудителя туляремии Francisella tularensis.

Штамм гриба Clonostachys candelabrum AS-2011 выделен из почвы Звенигородкой биостанции МГУ (Одинцовский район Московской области) в августе 2011 года. Штамм депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур (ГКПМ - Оболенск). Свидетельство о депонировании №393 от 25.05.2012. Штамму присвоен регистрационный номер F-1466. Штамм отобран для исследования его антибактериальных свойств путем скрининга свыше 500 штаммов 48 родов микромицетов из рабочей коллекции ГНЦ ПМБ.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические особенности штамма

Культурально-морфологические свойства штамма гриба Clonostachys candelabrum F-1466 исследовали после культивирования его при 24°C в течение 7 суток на овсяном агаре, агаре Чапека, агаре Сабуро. Колонии достигают 30 мм в диаметре через 7 дней при 24°C. Обратная сторона колонии от бледно-желтоватой до бледно-оранжевой. Поверхность колонии белая, порошистая до гранулированной из-за конидиофоров и конидиальных масс, воздушный мицелий скудный или отсутствует. Конидиофоры мономорфные, кисточковидные или мутовчатые, по 3-4 в мутовке. Ножка до 100 µм высотой, до 4 µм шириной в основании, кисточки до 130 µм высотой и шириной. Первичные веточки расходящиеся, формирующие свободные боковые веточки; конечные веточки и фиалиды расходящиеся или прижатые, промежуточные фиалиды под одиночными конечными фиалидами в мутовках, иногда в мутовках вместе с конечными фиалидами, почти цилиндрические, по размеру близки к конечным фиалидам. Фиалиды бутылевидные или цилиндрические, сужающиеся в верхней части, 5-8-12 µм длиной, 3-4 µм в самой широкой части и около 1 µм шириной в верхней точке, иногда деградирующие в относительно молодых колониях. Конидии в белых колонках внахлест, гладкостенные, одноклеточные от эллипсоидных до субшаровидных, 3-5,5×1,8-3,4 µм.

Биохимические особенности штамма

Штамм гриба Clonostachys candelabrum F-1466 утилизирует глюкозу, мальтозу, сахарозу, трегалозу, не утилизирует арабинозу, ксилозу, лактозу, маннит, маннозу, сорбит. Не разлагает эскулин и салицин. Продуцирует фермент протеазу. Из источников азота лучше всего усваивает дрожжевой экстракт. В глубинной культуре на третьи сутки образуется пигмент желтого цвета.

Оптимальные условия и состав среды для культивирования

Плотные питательные среды: ММС, агар Чапека, агар Сабуро, сусло-агар. Оптимальная температура для роста 18-24°С, максимальная - 30°С. Длительность культивирования до массовой споруляции 7-15 суток, в зависимости от состава среды и температуры культивирования. Жидкая питательная среда: соевая мука 20 г/л, дрожжевой экстракт - 8 г/л, глюкоза - 30 г/л, KH₂PO₄ - 3 г/л, MgSO₄ - 0.7 г/л. Глубинное культивирование при 25°С в течение 3-4 суток на качалке со скоростью вращения мешалки 220 об/мин.

Антагонистические свойства

Штамм гриба Clonostachys candelabrum F-1466 обладает антагонистической активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Способ, условия и состав сред для длительного хранения

1. В обезвоженном состоянии на ионообменной смоле, хранение при температуре (4-8)°С, перезакладка через 3 года.

2. Под минеральным маслом на агаре Чапека, хранение при температуре(4-8)°С, перезакладка через 1 год.

3. В жидком азоте, срок хранения не ограничен.

4. В лиофилизированном виде, хранение при температуре (4-8)°С, не менее трех лет.

Пример 1. Выращивание штамма Clonostachys candelabrum F-1466 на твердой питательной среде и оценка его антимикробного спектра действия

Для определения антимикробного спектра действия грибной культуры Clonostachys candelabrum F-1466 использовали метод агаровых блоков, основанный на способности веществ диффундировать в толщу агара и задерживать рост тест-объектов, находящихся в зоне диффузии. Гриб выращивают на плотной питательной микологической среде следующего состава (г/л): пептон - 5,0; дрожжевой экстракт - 5,0; агар - 15,0; глюкоза - 10,0; мальтоза - 10, NaNO₃ - 2,0; KCl - 0,5; FeSO₄×7H₂O - 0,01; MgSO₄×7H₂O - 0,5; K₂HPO₄ - 1,0; гентамицин - мкг/мл. Штамм выращивают в течение 5-13 дней в термостате при температуре (24±0,5)°С. Затем из агара с исследуемой культурой Clonostachys candelabrum F-1466 пробочным сверлом вырезают блоки диаметром 5 мм и помещают на засеянные и подсушенные газоны тест-культур.

Для приготовления газонов тест-объектов используют суточные культуры, полученные из музея ГНЦ ПМБ, которые выращивают на чашках Петри со средой ГРМ (гидролизат рыбной муки). Опытным путем подбирают концентрацию микроорганизмов для получения на чашках Петри сплошного, но не густого газона. Стандартизацию проводят по шкале McFarlanda, используют стандарты мутности. Суспензии суточных тест-культур плотностью 10⁶ кл/мл высевали на чашки Петри диаметром 90 мм по 0,2 мл, растирали шпателем для получения однородного газона и оставляли на 30 мин для полного впитывания в агар. Параллельно используют метод глубинного посева. В чашки Петри предварительно разливают по 10 мл питательной среды ГРМ и оставляют на сутки в термостате (для проверки на контаминацию). На следующие сутки в расплавленный агар - 100 мл добавляют 2 мл суспензии суточной тест-культуры плотностью 10⁸ кл/мл, тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в чашки Петри. Диски с культурой гриба помещают на поверхность второго слоя агара после застывания. Каждый опыт проводили в трех повторностях.

Антимикробную активность Clonostachys candelabrum F-1466 определяли на следующих бактериальных тест-культурах: Bacillus cereus В-1447, Staphylococcus aureus В-4849, Bacillus anthracis (вакцинный штамм СТИ-1), Francisella tularensis (вакцинный штамм 15/10), дрожжеподобный гриб - Candida albicans В-4845. Активность штамма гриба определяли по диаметру зоны подавления роста микробных культур. Была принята следующая шкала активности: высокая активность - диаметр зоны подавления 21-30 мм и более; умеренная активность - диаметр зоны 10-20 мм; низкая активность - диаметр зоны 6-9 мм.

При изучении антибактериальных свойств Clonostachys candelabrum F-1466 в отношении возбудителя туляремии оказалось, что культура F.tularensis растет гораздо медленнее, чем культура гриба. В связи с этим возникало опасение, что мицелий гриба, проникая в питательную среду и обильно разрастаясь, затруднит процесс тестирования. Для устранения этого недостатка был опробован методический прием с применением целлофановой подложки под агаровый блок. Опыты показали, что целлофановая пленка препятствует проникновению мицелия гриба на поверхность питательной среды. Вместе с тем метаболиты грибов свободно проникали через подложку и оказывали воздействие на бактериальную культуру. Данные по тестированию штамма Clonostachys candelabrum F-1466 на различных микробных культурах представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Антимикробной спектр действия штамма гриба Clonostachys candelabrum F-1466 (диаметр зоны подавления тест - культур)

Из приведенных данных следует, что штамм гриба Clonostachys candelabrum F-1466 оказывает антагонистическое воздействие на патогенные микроорганизмы различных таксономических групп. Исходя из шкалы активности наибольшая антибактериальная активность штамма гриба отмечена в отношении возбудителя золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus) и особенно в отношении возбудителя туляремии (Francisella tularensis).

Пример 2. Выращивание штамма Clonostachys candelabrum F-1466 на жидкой питательной среде, получение грибной субстанции и ее испытание на активность в отношении возбудителя туляремии Francisella tularensis

Культуру С.candelabrum F-1466 предварительно оживляют путем засева пробирок с плотной питательной средой (агар Чапека, агар Сабуро, сусло - агар). Засеянные косяки выращивают в термостате при температуре +22-25°С в течение 5÷7 суток до массовой споруляции в зависимости от состава среды и температуры культивирования.

Для культивирования штамма в колбах используют питательную среду следующего состава (г/л):

Для засева питательной среды готовят 3-суточный инокулят. Для получения инокулята в среду помещали агаровый блок с газоном гриба, выращенного на среде Чапека. Для засева питательной среды используют инокулюм в количестве 5 мл. Культивирование осуществляют в качалочных колбах V=750 мл, содержащих 100 мл среды, при температуре 25°С на подвесной качалке со скоростью вращения 220 об/мин в течение 6 суток.

Культуральную жидкость каждой пробы центрифугировали при скорости вращения ротора 6000 об/мин в течение 20 мин. В результате центрифугирования получали фугат культуральной жидкости (ФКЖ), который использовали для определения бактерицидной активности в отношении возбудителя туляремии Francisella tularensis (вакцинный штамм 15/10).

Грибная субстанция в форме ФКЖ может служить источником получения грибных метаболитов посредством ее экстрагирования и фракционирования. Для определения активности ФКЖ использовали метод лунок, в которые закапывали по 0,1 мл (100 мкл) ФКЖ. Повторность опытов 4-кратная. При этом применяли следующую шкалу активности ФКЖ: высокая активность - диаметр зоны подавления 21-30 мм и более; умеренная активность - диаметр зоны 10-20 мм; низкая активность - диаметр зоны 6-9 мм.

Таблица 2 - Активность ФКЖ штамма Clonostachys candelabrum F-1466 в отношении вакцинного штамма Francisella tularensis 15/10

Из приведенных данных следует, что ЖКЖ штамма Clonostachys candelabrum F-1466, полученные в течение 1-2 суток культивирования, не обладают активностью. Начиная с третьих суток культивирования ФКЖ проявляет высокую активность, которая сохраняется на высоком уровне в течение последующих суток.

Таким образом, штамм микромицета Clonostachys candelabrum F-1466 обладает антибактериальной активностью в отношении возбудителя туляремии Francisella tularensis и может быть рекомендован для получения метаболитов грибного синтеза с антибиотическими свойствами.

Предложен штамм микромицета Clonostachys candelabrum, обладающий антибактериальной активностью в отношении возбудителя туляремии Francisella tularensis 15/10. Штамм микромицета выделен из почвы и депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов (ГКПМ-Оболенск) под регистрационным номером F-1466. Фугат культуральной жидкости штамма микромицета Clonostachys candelabrum проявляет высокую активность в отношении Francisella tularensis 15/10 начиная с третьих суток культивирования. При этом наибольшая активность достигается на четвертые сутки культивирования. Диаметр зоны подавления роста Francisella tularensis 15/10 на четвертые сутки составляет 45±5 мм. 2 табл., 2 пр.

Штамм микромицета Clonostachys candelabrum F-1466, обладающий антибактериальной активностью в отношении возбудителя туляремии Francisella tularensis 15/10, депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур (ГКПМ - Оболенск), регистрационный номер F-1466.