Способ полевого биотестирования поверхностных вод на загрязненность нефтью и нефтепродуктами Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/02 C02F3/34 C12N1/16 

Изобретение относится к биотехнологиям, в частности к области использования биологических объектов для контроля загрязнения поверхностных вод.

Известен «Биологический способ определения степени общей токсичности и основных токсикантов водной среды (варианты)» (RU 2110067 C1, G01N 33/18, A01K 61/00, 27.04.1998), при котором в качестве тест-организмов для оценки токсичности вод, загрязненных различными веществами в широком диапазоне превышения ПДКт, однократно используют особей лабораторной культуры тест-организмов, выращенной путем близкородственного скрещивания гидробионтов при постоянном режиме содержания, на искусственных чистых эталонной воде и кормах. Определяют и сравнивают между собой возникающие в наборе растворов модельных токсикантов искусственной чистой эталонной воде и тестируемой водной среде спектры поведенческих реакций тест-организмов, их локомоторную активность. Во втором варианте способа дополнительно определяют процент тест-организмов, способных найти корм в заданный интервал времени. По результатам сравнений устанавливают основные токсиканты и их концентрации в тестируемой среде, а степень ее токсичности определяют путем сравнения определенных концентраций токсикантов с действующими на тестируемую среду нормативами по ПДКт.

Недостатком указанного способа является сложность процедуры получения тест-организмов и множество показателей, необходимых к анализу и оценке.

Известен «Способ биотестирования воды и почвы на загрязнение поллютантами» (RU 2135994 C1, G01N 33/18, 25.06.1997), при котором оценку проводят по количеству погибших клеток листецов ряски после окрашивания красителем. На основе результатов составляют бонитировочную шкалу загрязнений.

Недостатком указанного способа является сложность процедуры получения показателей и их оценки.

Известен «Способ биотестирования природных, сточных вод и водных растворов» (RU 2222003 С2, G01N 21/64, 11.12.2001), при котором производят измерение интенсивности замедленной флуоресценции тест-организма в индукционных максимумах после включения возбуждающего света высокой, а потом низкой интенсивности, в качестве показателя фитотоксичности используют отношение измеренных величин, пронормированных к аналогичным величинам, измеренным на контрольных образцах, не содержащих токсичных веществ. Перед измерением замедленной флуоресценции контрольные и опытные пробы тест-организма в течение 2 ч облучают светом интенсивностью 60 Вт/м². Техническим результатом данного способа является повышение чувствительности и расширение круга выявляемых токсических соединений при биотестировании воды.

Недостатком указанного способа является трудоемкость пробоподготовки, низкая экспрессность, сложная процедура оценки показателей.

Известен «Способ биотестирования проб воды и водных вытяжек» (RU 2245367 С2, C12Q 1/02, G01N 33/1, C12Q 1/02, C12R 1/90, 17.07.2002), при котором дафний погружают сначала в тестируемый раствор или воду для культивирования, а затем переносят в погруженную в воду для культивирования светонепроницаемую камеру с выходным отверстием, измеряют время выхода дафний из камеры тестирования на свет и по разнице времени выхода дафний оценивают токсичность тестируемого раствора. Способ позволяет быстро проводить контроль токсичности проб воды и водных вытяжек в лабораторных и полевых условиях.

Недостатком указанного способа является трудоемкость процедур получения показаетелей и их оценки.

Известен «Способ экологической оценки острой токсичности воды» (RU 2279072 С2, G01N 33/18, C02F 3/32, 09.08.2004), при котором неоднократно в течение весенне-летнего и осенне-зимнего сезонов проводят кратковременное биотестирование воды с внесенным поллютантом на Daphniamagna Straus одновременно на отстоянной водопроводной воде и природной воде, которую отбирают из одной и той же точки водоема. После каждого эксперимента определяют наличие острого токсического действия воды по ее действию на выживаемость тест-объекта в течение 96 часов без кормления. Тестируемые среды считают не оказывающими острого токсического действия, если выживаемость дафний отличается от контрольных показателей не более чем на 50% в течение всего периода исследований. Изобретение позволяет повысить точность экотоксикологической оценки потенциальной опасности поллютантов, попадающих в водные объекты.

Недостатком указанного способа является длительность его подготовительных и аналитических процедур.

Известен "Способ биотестирования воды на загрязнение тяжелыми металлами» (RU 2315006 C1, C02F 3/32, G01N 33/18, 04.04.2006), при котором для биотестирования культивируют растения ряски малой Lemna minor L. при постоянном световом и температурном режиме и составе ростовой минеральной среды. Период биотестирования составляет 7 суток. Степень токсичности оценивают через среднюю суточную долю прироста ряски малой и вычисляют по формуле: D=(В-А)/A⋅t, где А - исходное число листецов ряски в пробе; В - конечное числолистецов; t - время роста в сутках. Количество листецов в пробах подсчитывают на 2-е, 5-е и 7-е сутки теста. Наличие загрязнителей определяют по комплексу морфологических изменений ряски. В качестве них используют специфическое изменение окраски молодых и зрелых растений с характерной локализацией на листецах, сохранение групп листецов ряски либо их распад, частичный или полный, сохранение либо отпадение корешков. Способ позволяет повысить информативность системы биотестирования воды.

Недостатком указанного способа является необходимость культивирования тест-организмов, длительный период биотестирования и направленность на выявление исключительно тяжелых металлов.

Известен «Способ комплексного биотестирования воды, почвы, биологически активных веществ в фитотестах», RU 2322669 С2, G01N 33/18, G01N 33/24, G01N 33/15, 15.03.2006), при котором производится комплексная оценка цитогенетических, структурно-метаболических и морфофизиологических нарушений, наблюдаемых в фитотестах. Цитогенетические и структурно-метаболические нарушения выявляют у луковиц Allium сера, при этом показателями цитогенетических нарушений служат увеличение частоты аберрантных клеток и изменение митотического индекса, показателями структурно-метаболических нарушений - увеличение клеток с тремя и более ядрышками в ядре и изменение длительности мацерации корешков луковиц. Морфофизиологические нарушения выявляют у Phaseolus vulgaris, при этом показателями морфофизиологических нарушений служат снижение всхожести семян, увеличение частоты морфозов и изменение зеленой массы растений. Способ позволяет объективно прогнозировать эффекты последействия фактора на популяционном уровне.

Недостатком указанного способа является сложность проведения оценки показателей, его низкая экспрессность и невозможность применения в полевых условиях.

Известен «Способ биотестирования токсичности воды на низших ракообразных животных» (RU 2377560 C1, G01N 33/18, 27.12.2009), при котором осуществляют определение показателя смертности рачков в пробах тестируемой воды в отсутствие добавленного корма, находящихся в емкостях, установленных в климатостате с длительностью эксперимента 48 часов, при этом емкости с водой и тест-организмами при проведении биотестирования устанавливают в наклонном положении в кассету, которую вращают со скоростью 5-10 оборотов в минуту. Изобретение позволяет повысить чувствительность и снизить трудоемкость процесса биотестирования воды на низших ракообразных животных.

Недостатком указанного способа является низкая экспрессность и невозможность применения в полевых условиях.

Известен «Способ биотестирования проб воды и устройство для его осуществления» (RU 2409813 С2, G01N 33/18, 07.06.2008), при котором две группы дафний параллельно выдерживают в тестируемой и контрольной пробах воды, а затем дафний по одной переносят в измерительное устройство, представляющее собой плоский стеклянный сосуд, имеющий разметку дна, заполненный нейтральной водной средой. Сравнивают число пересечений линий разметки дафниями, прошедшими выдержку в тестируемой пробе воды с аналогичным числом пересечений дафниями, прошедшими выдержку в отстоянной водопроводной воде. Способ и устройство позволяют оперативно и с высокой чувствительностью проводить биотестирование проб воды в лабораторных и полевых условиях.

Недостатком указанного способа является необходимость проведения оператором рутинных процедур в рамках тестирования.

Известен «Экспресс-способ биотестирования природных, сточных вод и водных растворов» (RU 2413771 С2, C12Q 1/00, 10.04.2009), который включает приготовление рабочей и контрольной биолюминесцентных проб на основе ферментов и измерение кинетики биолюминесценции. Причем при приготовлении контрольной пробы используют биолюминесцентный биомодуль, включающий совместно иммобилизованные ферменты и субстраты биферментной системы светящихся бактерий с добавлением дистиллированной воды или фосфатного буфера. При приготовлении рабочей пробы используют биолюминесцентный биомодуль, включающий совместно иммобилизованные ферменты и субстраты биферментной системы светящихся бактерий с добавлением анализируемого образца воды. Далее обе пробы выдерживают в течение 30-300 секунд, запускают реакцию биолюминесценции в обеих пробах раствором ФМН, причем соотношение объемов раствора ФМН в концентрации 5×10^-4 M и контрольного или анализируемого раствора составляет 1:10-1:50, и регистрируют интенсивность свечения биолюминесценции обеих проб. При этом критерием токсичности воды является снижение на 20% и более или увеличение на 20% и более величины максимальной интенсивности свечения биолюминесценции, измеряемой в рабочей пробе по сравнению с этими параметрами в контрольной пробе. Изобретение позволяет повысить чувствительность экспресс-способа биотестирования природных, сточных вод и водных растворов.

Недостатком указанного способа является необходимость приготовления проб тест-организмов и использования при этом специального оборудования, а также применения дополнительных реактивов.

Известен «Способ биотестирования токсичности водной среды» (RU 2462707 CI, G01N 33/18, A01K 61/00, 14.041.2011), при котором в качестве тест-объекта используют коловратку, вид которой экологически соответствует минеральному составу исследуемой водной среды. Помещают маточную культуру коловратки в пробы с исследуемой (опыт) и чистой (контроль) водой, где выдерживают в течение 2,5-3,0 часа. Исследуемую воду относят к токсичной при наличии в ней абортированных яиц коловратки. Для определения степени токсичности исследуемой водной среды осуществляют серию разведений исследуемой пробы водой, взятой из фонового чистого участка водного объекта, выдерживают в разведенных пробах в течение 2,5-3,0 часа маточную культуру коловраток, фиксируют разведение, снимающее токсическое действие на абортирование яиц, и степень токсичности исследуемой водной среды оценивают по степени разведения пробы чистой водой до снятия абортирования, причем при разведении пробы до 1:1 исследуемую воду относят к нетоксичной; до 1:25 - к слаботоксичной; до 1:50 - к умеренно токсичной; до 1:100 - к остро токсичной; до 1:500 более - к весьма токсичной. Значительно повышается экспрессность, достоверность способа. Кроме того, возможна оценка степени токсичности исследуемой водной среды.

Недостатком указанного способа является его низкая экспрессность и необходимость подбора тест-организма к минеральному составу исследуемой водной среды.

Известен «Способ биотестирования токсичности вод и водных растворов» (RU 2482474 С2, G01N 33/00, 21.01.2011), который подразумевает облучение исследуемого образца растительного объекта прерывистым светом высокой интенсивности 100-250 Вт/м от синих светоизлучающих диодов с возбуждением свечения этого образца и регистрацией после свечения в красной спектральной области фотоприемником между световыми импульсами, пропускаемыми через красный светофильтр, причем за счет сокращения длительности световых периодов возбуждения свечения при одновременном увеличении темновых интервалов между ними создают условия низкого светового облучения, а за счет увеличения соотношения длительности световых периодов к темновым создают условия высокого светового облучения, измеряют интенсивность замедленной флуоресценции исследуемого образца в режиме высокого светового облучения в начале каждой кривой затухания, интенсивность в режиме низкого светового облучения измеряют в конце каждой кривой затухания, а о токсичности судят по их отношению. Достигается повышение точности и чувствительности определения.

Недостатком указанного способа является использование сложного оптического оборудования для получения искомых показателей.

Известен «Способ биотестирования по проращиванию семян» (RU 2492473 С2, G01N 33/18, 08.06.2011), при котором проводят равномерную укладку семян редиса красного круглого с белым кончиком на фильтровальную бумагу в чашке Петри. В чашку наливают по 5 мл исследуемой пробы воды, при этом уровень жидкости в чашке должен быть ниже поверхности семян. При этом фильтровальная бумага принимается круглой формы по диаметру чашки Петри с меткой на краю, на нее укладывается шаблон с отверстиями для разметки мест посадки семян, причем одно из отверстий ориентируется относительно метки фильтровальной бумаги. Далее размеченную фильтровальную бумагу помещают в чашку Петри с ориентацией ее метки в северном направлении по компасу, затем на чашке Петри по размеченным местам посадки на фильтровальную бумагу укладываются семена. Наливают исследуемую воду, после проращивания семян до взятия проростков с чашки Петри для измерения длины корня у каждого проростка измеряют по компасу угол направления его корня как показатель азимута корня. У непроросших семян азимут корня принимают за отсутствие количественного значения и в журнале измерений ставят прочерк. В дальнейшем у всех проростков в чашке Петри измеряют длину корня, причем эту длину у непроросших семян принимают равной нулю.

Недостатком указанного способа является его низкая экспрессность и сложность получения искомых показателей.

Известен «Способ биотестирования по длине корней тестового растения загрязненной нефтью воды» (RU 2499256 С2, G01N 33/18, 07.12.2011), при котором выбирают тест-растение, проводят равномерную укладку семян тест-растения на фильтровальную бумагу в контрольной и испытуемой чашке Петри диаметром 10 см. Далее в каждую контрольную и испытуемую чашку Петри наливают по 5,0 мл воды при 4-8-кратной повторности полива, при этом уровень жидкости в чашках должен быть ниже поверхности семян. При этом в контрольной чашке Петри принимается проба воды с нулевой концентрацией нефти, а в испытуемых чашках до полива подготавливают водные эмульсии испытуемой нефти с разными концентрациями. Приготовленными водными эмульсиями с заданной концентрацией нефти поливают семена тест-растения в чашках Петри в течение 72 часов, причем концентрацию нефти в разных водных эмульсиях увеличивают до тех пор, пока в момент измерений длины корня всхожесть семян редиса красного круглого не будет ниже 50%. Изобретение обеспечивает оценку опасных уровней загрязнения водных объектов нефтью, за счет повышения точности показателей влияния нефти различной объемной концентрации в водном растворе на рост корней растения на конкретной территории.

Недостатком указанного способа является его низкая экспрессность и сложность получения искомых показателей.

Известен «Способ определения токсичности водной среды» (RU 2522542 C1, G01N 33/18, 14.05.2013), который подразумевает помещение суспензии клеток губки в исследуемый раствор, выдерживание в течение суток с последующим подсчетом пузыревидных клеток под микроскопом. О токсичности судят по достоверному увеличению пузыревидных клеток в исследуемом растворе по сравнению с контролем. Технический эффект -значительное повышение чувствительности способа при минимальных сроках проведения эксперимента.

Недостатком указанного способа является его низкая экспрессность и сложность получения искомых показателей.

Известен «Штамм Vibrio Aquamarinus, способ определения токсичности проб сего помощью и тест-культура для определения токсичности проб» (RU 2534819 С2, C12N 1/20, C12R 1/63, C12Q 1/02, 13.11.2012), в котором заявлены штамм бактерий Vibrio Aquamarinus, способ определения токсичности проб с его помощью и применение штамма в качестве тест-культуры для определения химической токсичности проб. Измеряют люминесценцию штамма Vibrio Aquamarinus ВКПМВ-11245 в присутствии по меньшей мере одного химического токсиканта пробы, в качестве которого могут быть использованы ZnSO4 или CuSO4, или K2Cr2O7 или нефть, или дизельное топливо, или льяльная вода, или фенол, или тяжелый металл. Измеряют люминесценцию указанного штамма при отсутствии химического токсиканта и сравнивают измеренные уровни люминесценции. При этом изменение люминесценции свидетельствует о токсичности исследуемой пробы. Изобретение позволяет повысить достоверность определения наличия токсических веществ в окружающей среде.

Недостатком указанного способа является использование сложного оборудования для получения искомых показателей.

Известен «Способ определения влияния токсичности сточных вод на водные соленые среды» (RU 541457 CI, G01N 33/18, C02F 3/00, 09.06.2004), при котором осуществляют определение показателей роста культуры морской одноклеточной водоросли в тестируемой воде и включает культивирование культуры морской одноклеточной водоросли, процедуру биотестирования, состоящую из отбора проб воды, внесения в контроль и в тестируемую среду инокулята культивируемой водоросли, подсчета численности клеток водоросли. В качестве тест-объектов используют культуры одноклеточных морских микроводорослей Platymonasviridis Rouch и Dunaliella salina Teod, на которых проводят долгосрочный (15-суточный) эксперимент. Микроводоросль Platymonas viridis Rouch используют для оценки влияния токсичности стоков на морскую среду.

Недостатком указанного способа является его низкая экспрессность и необходимость культивирования тест-объектов.

Известен «Способ биотестирования воды, почвы, биологически активных веществ» (RU 2319959 С2, G01N 33/18, G01N 33/24, C12Q 1/02, C12R 1/865, 15.03.2006), при котором осуществляется регистрация изменчивости характера колониеобразования двух штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisae различной плоидности под влиянием среды. Используются гаплоидные и диплоидные штаммы. Фиксируют токсическое действие по летальному показателю, мутагенность по возрастанию количества мутантных форм колоний, определяют индукцию наследуемой клеточной летальности и прогнозируют отдаленную патологию по количеству морфозов и изменению размеров колоний. Клетки культур, находящихся в конце логарифмической фазы роста, обрабатываются раствором исследуемого вещества 30-180 мин. Затем проводят посев на полную твердую среду и инкубируют при 30°С. Учет результатов на 4-5-е сутки. Способ повышает объективность токсикогенетической оценки за счет использования чувствительных гаплоидных штаммов, специфичных реакций гаплоидов и диплоидов при воздействии слабых доз мутагенов.

Недостатком указанного способа является низкая экспрессность, необходимость использования двух штаммов дрожжей и их подбора в определенной фазе роста, сложность получения и многочисленность искомых показателей загрязненности воды.

Общим недостатком методов-аналогов анализа является низкая способность к полевым условиям реализации, вследствие их сложности и многостадийности, либо высокая трудоемкость при адаптации как методов, так и применяемой аппаратуры.

В качестве прототипа выбран «Способ оценки общей токсичности воды» RU 2541457 C1, G01N 33/18, C02F 3/00, 22.02.2000), при котором осуществляют регистрацию изменения рН при помещении сухих дрожжей Saccharomyces cerevisae в пробу воды. В основу предложенного способа положено обнаруженное авторами явление, заключающееся в кратковременном защелачивании среды при переходе сухих дрожжей в активную фазу развития. Экспериментально показано, что наличие в среде токсикантов приводит к тому, что явление защелачивания отсутствует. Защелачивание пробы указывает на отсутствие в ней токсикантов. Способ повышает экспрессивность оценки и снижение затрат на его применение.

Недостатком, как приведенных аналогов, так и прототипа является невозможность получения количественной оценки загрязненности и использование сложного лабораторного оборудования.

Основными задачами, на решение которых направлено заявляемое изобретение являются: повышение экспрессности и простоты применения способа биотестирования вод на загрязненность, достижение возможности получения количественных оценок и использования в полевых условиях, снижения затрат на его применение.

Для достижения указанного результата в предлагаемом способе учитывают изменения количества выделяемого углекислого газа в процессе нормальной и угнетенной формы метаболизма тест-объекта, в качестве которого используются дрожжи Saccharomy cescerevisiae, регистрируемое пенным расходомером.

Предлагаемый способ иллюстрирован схемой установки, представленной на фиг. 1, а также графиком изменения скорости выделения углекислого газа при добавлении в культуральную жидкость нефти (фиг. 2).

Оборудование для биотестирования на загрязненность включает две аналогичные установки, в состав каждой из которых входит колба коническая с крышкой и резиновой трубкой для ввода проб, мыльница и пенный расходомер.

Способ реализуется следующим образом.

Перед началом тестирования приготавливается питательная среда, которой служит раствор следующего состава: (4±0,02) г сахара на 25 мл дистиллированной воды приведенной в температурное равновесие с атмосферой.

Мыльницы, подсоединенные к пенным расходомерам, заполняются мыльным раствором (соотношение моющего средства и воды -1:5).

В каждую из двух колб вносится питательная среда для дрожжей. После этого производится засев навески дрожжей в питательную среду. Полученная смесь перемешивается стеклянной палочкой 25-30 сек. Сразу после этого колбы через шлиф с патрубком подсоединяется к пенным расходомерам.

Фиксируется время начала процесса брожения, отмечается время для выполнения первого и последующих замеров.

В колбы с помощью шприца с иглой через резиновую трубку в крышке вводятся пробы воды, в одну - отобранная с места предполагаемого загрязнения, в другую - контрольная проба.

Замеряется время прохождения мыльным кольцом, получаемым от сдавливания мыльницы, 1 см³ объема расходомера каждые 5 минут. Таким образом, определяется скорость выделения углекислого газа.

По снижению скорости выделения углекислого газа в установке с пробой, отобранной с места предполагаемого загрязнения, делают вывод о токсичности пробы. Представленный способ позволяет получать количественные оценки загрязненности по величине снижения скорости выделения углекислого газа.

Краткое описание чертежей

На фигуре 1 изображена схема установки, реализующей заявленный способ биотестирования вод. Цифрами обозначены:

1 - колба коническая;

2 - резиновая трубка для ввода проб;

3 - мыльница;

4 - пенный расходомер.

На фигуре 2 изображен график изменения скорости выделения углекислого газа при добавлении в культуральную жидкость нефти. По оси абсцисс отложена длительность процесса брожения, по оси ординат - скорость выделения углекислого газа. Кривые отображают изменение скорости выделения углекислого газа для контрольного образца (маркер «ромб») и загрязненного нефтью образца (маркер «крест»).

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ полевого биотестирования вод на загрязненность нефтью и нефтепродуктами с использованием дрожжей Saccharomyces cerevisiae в качестве тест-объекта, включающий количественную оценку загрязненности по величине снижения скорости выделения углекислого газа дрожжами Saccharomyces cerevisiae, регистрируемой пенным расходомером в установке с пробой, отобранной с места предполагаемого загрязнения, в сравнении со скоростью выделения углекислого газа дрожжами в установке с контрольной пробой без загрязнения. Изобретение обеспечивает расширение арсенала способов количественной оценки загрязненности поверхностных вод нефтепродуктами. 2 ил.

Способ полевого биотестирования вод на загрязненность нефтью и нефтепродуктами с использованием дрожжей Saccharomyces cerevisiae в качестве тест-объекта, отличающийся тем, что осуществляют количественную оценку загрязненности по величине снижения скорости выделения углекислого газа дрожжами Saccharomyces cerevisiae, регистрируемой пенным расходомером в установке с пробой, отобранной с места предполагаемого загрязнения, в сравнении со скоростью выделения углекислого газа дрожжами в установке с контрольной пробой без загрязнения.