ВАКЦИНЫ ПРОТИВ СВИНОГО ЦИРКОВИРУСА 3 ТИПА (PCV3), ИХ ПРОИЗВОДСТВО И ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2024 года по МПК C07K14/05 A61K39/12 

Родственные заявки и включение посредством ссылки

По настоящей заявке испрашивается приоритет для предварительной заявки на патент США 62/829400, поданной 4 апреля 2019, содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки во всей полноте. Также сделана ссылка на WO 2006/072065 и патенты США №№ 6,103,526; 9,610,345; 9,669,087 и 10,450,351; описания которых включены в настоящий документ посредством ссылки во всей полноте.

Вышеупомянутые заявки и все документы, процитированные в них или во время их делопроизводства («процитированные документы»), и все документы, процитированные или упомянутые в процитированных приложениях, и все документы, процитированные или упомянутые в данном документе («процитированные здесь документы»), и все документы, процитированные или упомянутые в цитируемых здесь документах, вместе с любыми инструкциями производителя, описаниями, техническими характеристиками и описаниями продуктов для любых продуктов, упомянутых здесь или в любом документе, включенном в настоящий документ посредством ссылки, тем самым включены в настоящую заявку посредством ссылки и могут использоваться в практике изобретения. Более конкретно, все документы, на которые есть ссылки, включены посредством ссылки в той же степени, как если бы каждый отдельный документ был специально и индивидуально указан как включенный посредством ссылки.

Заявление относительно списка последовательностей

Список последовательностей, связанный с настоящим приложением, обеспечивается в текстовом формате вместо бумажной копии и, таким образом, включен в описание посредством ссылки. Имя текстового файла, содержащего список последовательностей, - BI 19-AH009_ST25 (sequence listing).txt. Текстовый файл имеет размер 188 КБ; создан 6 апреля 2020, и он подается в электронном виде через EFS-Web одновременно с подачей описания.

Область техники, к которой относится изобретение

В настоящей заявке раскрывается рекомбинантный бакуловирусный вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий ORF2 свиного цирковируса 3 типа (PCV3). В настоящем документе также раскрыты композиции и вакцины, произведенные из ORF2, полученной из бакуловируса, PCV3 и ORF2 BaculoG/PCV3. Также раскрыт рекомбинантный бакуловирусный вектор, содержащий мутантный полинуклеотид, кодирующий ORF2 свиного цирковируса 3 типа (PCV3). Также раскрыты композиции и вакцины, полученные из мутантной ORF2 PCV3 бакуловирусного происхождения, и ORF2 BaculoG/PCV3.

Предшествующий уровень техники

Цирковирус свиней 3 типа (PCV3) представляет собой вирус без оболочки с икосаэдрической одноцепочечной ДНК (оцДНК), принадлежащий к роду Circovirus в семействе Circoviridae. Геном кодирует две основные открытые рамки считывания (ORF), где ORF1 кодирует связанный с репликацией белок (rep), а ORF2 кодирует белок вирусного капсида (cap), который определяет антигенные характеристики вируса. PCV3 генетически отличается от цирковируса свиней 2 типа (PCV2); в частности, между двумя вирусами существует только 48% идентичности аминокислот в гене rep и 26% идентичности аминокислот в гене cap.

О PCV3 впервые сообщили в 2016 в США Palinski, Rachel, et al. «A Novel Porcine Circovirus Distantly Related to Known Circoviruses Is Associated with Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome and Reproductive Failure». Journal of Virology, vol. 91, no.1, 26 Oct. 2016. С тех пор вирус был обнаружен во всем мире, включая Германию, Японию, Корею, Россию, Китай, Таиланд, Италию, Испанию, Данию, Южную Корею, Польшу, Бразилию, Колумбию, Индию, Сербию и Швецию. Хотя на сегодняшний день тестирование ограничено, обнаружение PCV3 в ретроспективных образцах указывает на то, что вирус, вероятно, циркулировал в популяциях свиней во всем мире за десятилетия до первоначальных отчетов 2017 года. Предполагается, что по мере расширения тестирования PCV3 будет обнаруживаться в большем количестве стран и в более старых образцах.

Кроме того, в китайской патентной заявке CN109207441A, озаглавленной «Cap-белок 3 типа рекомбинантного, экспрессируемого бакуловирусом цирковируса свиней, и его способ конструирования и праймер», испрашивается приоритет для заявки CN201810912587.1A, поданной 12 августа 2018 г. В заявке описывается конструкция бакуловируса для экспрессии ORF2 PCV3 для производства белков Cap 3 типа цирковируса свиней.

Заявка CN109207441A, озаглавленная «Cap-белок 3 типа рекомбинантного бакуловируса, экспрессирующего цирковирус свиней, и его способ конструирования и праймер», заявляет о приоритете заявки CN201810912587.1A, поданной 12 августа 2018 г. В заявке описано введение экспрессируемой бакуловирусом ORF2 PCV3, у мышей, и предоставлены данные ИФА о сероконверсии.

Заявка CN109207522A, озаглавленная «Рекомбинантный бакуловирус, экспрессирующий усеченный Сар белок цирковируса свиней 3 типа, способ его конструирования и праймер», заявляет о приоритете CN201810912585.2A, поданной 12 августа 2018 г. Заявка описывает применение усеченного бакуловирусного CAP/ORF2 у мышей, и предоставляет данные ИФА по сероконверсии.

Кроме того, патент США 10450351 (т.е. с серийным номером заявки 15/768356), озаглавленный «Иммуногенные композиции цирковируса свиней 3 типа и способы их изготовления и использования» был впервые опубликован как US 2018/0305410 A1 25 октября 2018 г. В нем испрашивается приоритет для предварительной заявки на патент 62/242 866, поданной 16 октября 2015 г. (изобретатель Ben Hause, передавший права на патент Исследовательскому фонду Канзасского университета). См. также Palinski, Rachel, et al. Journal of Virology, vol. 91, no. 1, 26 Oct. 2016, doi:10.1128/jvi.01879-16. Published online October 26, 2016. Документ относится к PCV3 из тканей, «собранных у четырех свиноматок с фермы с хронической плохой репродуктивной способностью, которые умерли с острыми клиническими симптомами, соответствующими PDNS (синдрому дерматита и нефропатии поросят)». Хотя в заявке на патент не указано, где находилась ферма, в ней описано, что данные иммуногистохимии (IHC) и количественной ПЦР (кПЦР) дали отрицательный результат на PCV2, вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV) и вирус гриппа A (IAV) у свиноматок и мумифицированных, мертворожденных и/или слабых плодов. В этой заявке на патент описывается выделение вируса, но не культуры размножающихся клеток.

Примеры в патенте '351 описывают детекцию кПЦР гена капсида PCV3, выделение вируса, клонирование капсидного белка PCV3, разработку моноклонального антитела против капсида PCV3, детекцию PCV3 и разработку рекомбинантного ИФА для капсида PCV3. Однако никаких исследований или данных по вакцинам не описано.

Недавно была опубликована статья, описывающая интраназальную инокуляцию 4- и 8-недельных поросят, свободных от специфических патогенов, инфекционным клоном ДНК PCV3 для оценки патогенеза PCV3. Однако не обсуждались вакцины для предотвращения заражения PCV3. Jiang, Haijun, et al. «Induction of Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome in Piglets by Infection with Porcine Circovirus Type 3». Journal of Virology, vol. 93, no. 4, 28 Nov. 2018, doi:10.1128/jvi.02045-18.

Цитирование или идентификация любого документа в этой заявке не является признанием того, что такой документ может быть использован в качестве известного уровня техники для настоящего изобретения.

Изложение сущности изобретения

Раскрыты антигенные белки ORF2 PCV3 и их варианты, которые можно использовать для вакцинации или лечения животных, в частности свиней.

Как правило, свиньей является молодая свинья.

В некоторых аспектах настоящего изобретения животное представляет собой поросенка. Как правило, поросенок имеет возраст не старше 15 недель, или не старше 6 недель, или не старше 3 недель, или не старше 2 недель, или не старше 1 недели.

В некоторых аспектах настоящего изобретения свинья представляет собой свиноматку или свинью до первого опороса.

В некоторых аспектах настоящего изобретения свинья представляет собой свиноматку или свинью до первого опороса (т.е. свиноматку, которая не опоросилась) в возрасте менее 1 года, обычно более 4 месяцев и менее 1 года, обычно в возрасте более 5 месяцев и до 1 года, обычно от 6 месяцев до 1 года, обычно от 4 до 8 месяцев, обычно от 5 до 8 месяцев, обычно от 5 до 7 месяцев, обычно от 5 до 6 месяцев.

В некоторых аспектах настоящего изобретения свинья представляет собой беременную свиноматку в возрасте менее 1 года, обычно в возрасте более 4 месяцев и менее 1 года, обычно в возрасте более 5 месяцев и менее 1 года, обычно в возрасте от 6 месяцев до 1 года.

В некоторых аспектах настоящего изобретения свинья представляет собой свинью до осеменения в возрасте менее 1 года, обычно более 4 месяцев и менее 1 года, обычно более 5 месяцев и менее 1 года, обычно от 6 месяцев до 1 года, обычно от 4 до 8 месяцев, обычно от 5 до 8 месяцев, обычно от 5 до 7 месяцев, обычно от 5 до 6 месяцев.

Раскрыта разработка бакуловирусной ORF2 PCV3, экспрессированной из «BaculoG/PCV3 ORF2», композиций и трех вакцин: живой вакцины BaculoG/PCV3 ORF2, P9 с адъювантом 50% ISA 207VG; живой вакцины BaculoG/PCV3 ORF2, P9 с адъювантом 20% карбополом, и контрольной живой вакцины BaculoG/без вставки, P4, с адъювантом 20% карбополом. Были предоставлены данные, показывающие эффективность вакцин для предотвращения заболевания PCV3.

Также раскрыта разработка ORF2 PCV3 бакуловирусного происхождения, полученной из убитого вируса.

Также раскрыта разработка ORF2 PCV3 бакуловирусного происхождения, полученной из мутантного убитого вируса.

Таким образом, в первом аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей белок ORF2 PCV3, предпочтительно антигенный белок ORF2 PCV3 (антиген ORF2 PCV3). Указанная композиция в дальнейшем также называется «композицией по настоящему изобретению». Также было понятно, что термин «композиция по настоящему изобретению», как описано в настоящей заявке, эквивалентен термину «раскрытая композиция».

Предпочтительно композиция по настоящему изобретению дополнительно включает ветеринарно приемлемый носитель, выбранный из группы, состоящей из растворителя, дисперсионной среды, покрытия, стабилизатора, разбавителя, консерванта, противомикробного агента, противогрибкового агента, изотонического агента, агента, замедляющего адсорбцию, адъюванта, надосадочной жидкости клеточной культуры, стабилизирующего агента, вирусного вектора, вектора экспрессии, иммуномодулирующего агента и/или любой их комбинации.

Настоящее изобретение также относится к белку ORF2 цирковируса свиней 3 типа (PCV3), и ветеринарно приемлемому носителю, включающему растворитель, дисперсионную среду, покрытие, стабилизирующий агент, разбавитель, консервант, противомикробный агент, противогрибковый агент, изотонический агент, агент, замедляющий адсорбцию, адъювант, надосадочную жидкость клеточной культуры, стабилизирующий агент, вирусный вектор, вектор экспрессии, иммуномодулирующий агент и/или любую их комбинацию.

В одном варианте осуществления ветеринарно приемлемый носитель включает адъювант, иммуномодулирующий агент, надосадочную жидкость клеточной культуры, вирусный вектор или вектор экспрессии, или любую их комбинацию. В другом варианте осуществления ветеринарно приемлемый носитель включает адъювант.

ORF2 PCV3 может принадлежать к группе a1, b1 или b2 (с использованием обозначения подтипа Fux et al., “Full genome characterization of porcine circovirus type 3 isolates reveals the existence of two distinct groups of virus strains,” Virology Journal (2018) 15:25, DOI 10.1186/s12985-018-0929-3 (включено в настоящий документ посредством ссылки); см., например, таблицу 4). Таким образом, PCV3, как упомянуто в настоящей заявке, представляет собой любую филогенетическую ветвь PCV3 или комбинацию клад, или предпочтительно выбран из группы, состоящей из PCV3a и PCV3b, и наиболее предпочтительно выбран из группы, состоящей из PCV3a1, PCV3b1, PCV3b2 и PCV3c. Таким образом, композиция по настоящему изобретению предпочтительно содержит белок ORF2 PCV3, выбранный из группы, состоящей из белка ORF2 PCV3a и белка ORF2 PCV3b, или наиболее предпочтительно содержит белок ORF2 PCV3, любой филогенетической клады PCV3 или комбинации клад, или выбранный из группы, состоящей из белка ORF2 PCV3a1, белка ORF2 PCV3b1 и белка ORF2 PCV3b2. В другом варианте осуществления белок ORF2 PCV3 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, кодируемой полинуклеотидной последовательностью, имеющей по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности последовательности или гомологии последовательности с SEQ ID NO: 1. Предпочтительно белок ORF2 PCV3 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 4. В соответствии с особо предпочтительным аспектом белком ORF2 PCV3 является рекомбинантный белок или наиболее предпочтительно рекомбинантный белок, экспрессируемый бакуловирусом. Таким образом, композиция предпочтительно содержит рекомбинантный белок ORF2 PCV3 или наиболее предпочтительно содержит белок ORF2 PCV3, экспрессируемый бакуловирусом.

В другом варианте осуществления белок ORF2 PCV3 представляет собой рекомбинантный белок ORF2 PCV3, полученный в результате его экспрессии вектором экспрессии, содержащим полинуклеотидную последовательность, кодирующую белок ORF2 PCV3. Предпочтительно вектор экспрессии представляет собой бакуловирус.

В еще одном варианте осуществления композиция дополнительно содержит белок ORF2 PCV2, который может быть результатом экспрессии вектором экспрессии, содержащим полинуклеотидную последовательность, кодирующую белок ORF2 PCV2. Предпочтительно вектор экспрессии представляет собой бакуловирус.

Кроме того, композиция может дополнительно содержать по меньшей мере один дополнительный антиген дополнительного патогена свиней. Дополнительный антиген или антигены патогенов свиней включают антиген PRRSV, бактериновый антиген Mycoplasma hyopneumoniae, антиген надосадочной жидкости Mycoplasma hyopneumoniae, антиген вируса болезни Ауески или псевдобешенства, антиген IAV, антиген вируса чумы свиней (классической или африканской, или их комбинации), антиген Actinobacillus pleuropneumoniae, антиген Escherichia coli, антиген парвовируса свиней (PPV), антиген Pasteurella multocida, антиген Erysipelothrix rhusiopathiae или антиген Mycoplasma hyorhinis.

В другом варианте осуществления белок ORF2 PCV3 присутствует в количестве от 0,2 до примерно 400 мкг/мл, или от 2 до примерно 400 мкг/мл, или от 4 до примерно 400 мкг/мл, или от 8 до примерно 400 мкг/мл, или примерно от 0,3 до 200 мкг/мл, или от 2 до примерно 200 мкг/мл, или от 4 до примерно 200 мкг/мл, или от 8 до примерно 200 мкг/мл, или от 0,35 до примерно 100 мкг/мл, или 2 до примерно 100 мкг/мл, или от 4 до примерно 100 мкг/мл, или от 8 до примерно 100 мкг/мл, или примерно от 0,4 до 50 мкг/мл, или от 2 до примерно 50 мкг/мл, или от 4 до примерно 50 мкг/мл, или от 8 до примерно 50 мкг/мл, или примерно от 0,45 до 30 мкг/мл, или примерно от 0,6 до 15 мкг/мл, или примерно от 0,75 до 8 мкг/мл, или примерно от 1,0 до примерно 6 мкг/мл, или примерно от 1,3 до 3,0 мкг/мл, или примерно от 1,4 до 2,5 мкг/мл, или примерно от 1,5 до 2,0 мкг/мл, или примерно 1,6 мкг/мл. В конкретном варианте осуществления композиция может содержать белок ORF2 PCV3 в количестве в диапазоне примерно от 1,5 до 2,0 мкг/мл композиции. Например, в одном из вариантов осуществления доза композиции в 1 мл может включать около 1,6 мкг белка ORF2 PCV3.

В другом варианте осуществления белок ORF2 PCV3 или общие белки ORF2 PCV2 и PCV3 присутствуют в количестве примерно от 0,2 до 400 мкг/дозу, или от 2 до примерно 400 мкг/дозу, или от 4 до примерно 400 мкг/дозу, или от 8 до примерно 400 мкг/дозу, или примерно от 0,3 до 200 мкг/дозу, или от 2 до примерно 200 мкг/дозу, или от 4 до примерно 200 мкг/дозу, или от 8 до примерно 200 мкг/дозу, или примерно от 0,35 до 100 мкг/дозу, или от 2 до примерно 100 мкг/дозу, или от 4 до примерно 100 мкг/дозу, или от 8 до примерно 100 мкг/дозу, или примерно от 0,4 до 50 мкг/дозу, или от 2 до примерно 50 мкг/дозу, или от 4 до примерно 50 мкг/дозу, или от 8 до примерно 50 мкг/дозу, или примерно от 0,45 до 30 мкг/дозу, или примерно от 0,6 до 15 мкг/дозу, или примерно от 0,75 до 8 мкг/дозу, или примерно от 1,0 до 6 мкг/дозу, или примерно от 1,3 до 3,0 мкг/дозу, или примерно от 1,4 до 2,5 мкг/дозу, или примерно от 1,5 до 2,0 мкг/дозу, или примерно 1,6 мкг/дозу. В конкретном варианте осуществления композиция может содержать общий белок ORF2 PCV3 и PCV2 в количестве в диапазоне примерно от 1,5 до 2,0 мкг/мл композиции. Например, в одном варианте осуществления доза композиции в 1 мл может включать примерно 1,6 мкг объединенного белка ORF2 PCV3 и PCV2.

В другом варианте осуществления адъювант включает гидроксид алюминия; фосфат алюминия; сапонин; Quil A; QS-21; GPI-0100; эмульсию типа вода-в-масле; эмульсию масло-в-воде; эмульсию вода-в-масле-в-воде; эмульсию на основе легкого жидкого парафинового масла или адъюванта типа Европейской Фармакопеи, изопреноидное масло; сквалан; сквалановое масло, полученное в результате олигомеризации алкенов, изобутена или децена; сложный эфир (эфиры) кислоты (кислот) или спирта (спиртов), содержащий линейную алкильную группу; растительное масло (масла); этилолеат; ди-(каприлат/капрат) пропиленгликоля; глицерил три- (каприлат/капрат); диолеат пропиленгликоля; сложный эфир (эфиры) разветвленной жирной кислоты (кислот) или спирта (спиртов); сложный эфир (эфиры) изостеариновой кислоты; неионное поверхностно-активное вещество (вещества); сложный эфир (эфиры) сорбитана, или маннида, или гликоля, или полиглицерина, или пропиленгликоля, или олеиновой, или изостеариновой кислоты, или рицинолевой кислоты, или гидроксистеариновой кислоты, при необходимости этоксилированный, ангидроманнитол олеат; блок-сополимеры полиоксипропилена и полиоксиэтилена, продукт Плюроник, карбопол; Карбопол 974P; Карбопол 934P; Карбопол 971P; полимер акриловой или метакриловой кислоты; сополимер малеинового ангидрида и алкенильного производного; сшитый полимер акриловой или метакриловой кислоты; полимер акриловой или метакриловой кислоты, сшитый с полиалкениловым эфиром сахара или полиспирта; карбомер; акриловый полимер, поперечно сшитый полигидроксилированным соединением, имеющий по меньшей мере 3 и не более 8 гидроксильных групп с атомами водорода по меньшей мере трех гидроксилов, при необходимости замещенным ненасыщенными алифатическими радикалами, имеющими по меньшей мере 2 атома углерода, с указанными радикалами, содержащими от 2 до 4 атома углерода, такими как винилы, аллилы и другие этиленненасыщенные группы, а ненасыщенные радикалы сами могут содержать другие заместители, такие как метил; адъювантную систему RIBI; Блок-сополимер; SAF-M; монофосфориллипид А; авридиновый липидно-аминовый адъювант; термолабильный энтеротоксин из E. coli (рекомбинантный или другой); токсин холеры; IMS 1314 или мурамилдипептид.

В еще одном варианте осуществления может применяться примерно от 50 мкг до 2000 мкг адъюванта, или адъювант присутствует в количестве примерно 250 мкг/мл в дозе композиции, или адъювант присутствует в количестве примерно от 100 мкг до 10 мг на дозу, или адъювант присутствует в количестве примерно от 500 мкг до 5 мг на дозу; адъювант присутствует в количестве примерно от 750 мкг до 2,5 мг на дозу, или адъювант присутствует в количестве примерно 1 мг на дозу. В конкретном варианте осуществления композиция может включать адъювант в диапазоне примерно от 750 мкг до 2,5 мг на дозу композиции. Например, в одном из вариантов осуществления доза композиции может включать примерно 1 мг адъюванта.

В одном варианте осуществления иммуномодулирующий агент включает интерлейкин (интерлейкины), интерферон (интерфероныы) или другой цитокин (цитокины).

Дозировка антибиотика (антибиотиков) может составлять примерно от 1 мкг/мл до 60 мкг/мл антибиотика (антибиотиков) или менее примерно 30 мкг/мл антибиотика (антибиотиков). Например, вариант осуществления композиции может включать менее примерно 30 мкг/мл антибиотика (антибиотиков).

В одном из вариантов осуществления антибиотик (антибиотики) включает гентамицин.

Композиция по настоящему описанию может содержать (i) белок ORF2 PCV3, (ii) по меньшей мере часть бакуловируса, экспрессирующего указанный белок ORF2 PCV3, (iii) часть культуры из клеток, которые были инфицированы или трансфицированы рекомбинантным бакуловирусом, экспрессирующим указанный белок ORF2 PCV3, (iv) инактивирующий агент, или инактивирующий агент, содержащий бинарный этиленимин (BEI), (v) тиосульфат натрия, или тиосульфат натрия в количествах, эквивалентных инактивирующему агенту или BEI; (vi) адъювант, или адъювант, содержащий Карбопол или Карбопол 971, и (vii) фосфатную соль в физиологически приемлемой концентрации. В одном варианте осуществления примерно 90% компонентов (i) - (iii) могут иметь размер менее 1 мкм, а pH указанной композиции доводят до примерно 6,5-7,5. В другом варианте осуществления BEI получен из культуры клеток, обработанной примерно от 2 до 8 или примерно 5 мМ BEI для инактивации бакуловируса. В другом варианте осуществления композиция содержит примерно от 2 до 8 или примерно 5 мМ BEI. Композиция может содержать примерно 1 мг Карбопола или Карбопола 971. Например, вариант осуществления композиции может включать культуру клеток, обработанную BEI с концентрацией примерно 5 мМ для инактивации бакуловируса. В некоторых вариантах осуществления доза композиции может включать остаточный BEI и/или примерно 1 мг Карбопола, Карбопола 971 или их комбинации.

Любая композиция по изобретению может быть составлена и/или упакована для применения разовой дозы или однократной вакцинации, а также для режима множественных доз. Предполагается, что однократное введение позволяет преодолеть присутствие материнских антител.

В одном варианте осуществления композиция может представлять собой PCV3 и PPV (предпочтительно упакованные в VLP) и/или PRRSV, предпочтительно для использования у свиноматок/свиней племенного возраста. В таком варианте осуществления предусмотрена одна или несколько доз для введения.

Согласно другому аспекту композиция по настоящему изобретению представляет собой иммуногенную композицию.

Изобретение также относится к композиции по настоящему изобретению для использования в качестве лекарственного средства.

Кроме того, композиция по настоящему изобретению предназначена для использования в качестве вакцины.

Согласно особо предпочтительному аспекту, композиция по настоящему изобретению предназначена для использования в способе индукции иммунного ответа или иммунологического ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа против (i) PCV3 и/или (ii) PCV2 и PCV3, и/или (iii) PCV3 и других патогенов свиней, и/или (iv) PCV3, PCV2 и других патогенов свиней.

Согласно другому предпочтительному аспекту композиция по настоящему изобретению предназначена для использования в способе уменьшения или предотвращения клинических признаков или заболевания, вызванного инфекцией PCV3 у животного, или для использования в способе лечения или профилактики инфицирования PCV3 у животного, причем указанным животным предпочтительно является свинья.

Кроме того, композиция по настоящему изобретению предназначена для использования в способе индукции иммунного ответа против PCV3 у свиньи, в частности, предпочтительно у беременной свиноматки.

В соответствии с еще одним аспектом, композиция по настоящему изобретению предназначена для использования в способе уменьшения или предотвращения клинических признаков или заболевания, вызванного инфекцией PCV3 у поросенка, при этом поросенок должен находиться на вскармливании свиноматкой, которой вводили композицию.

Таким образом, настоящее изобретение дополнительно обеспечивает композицию по настоящему изобретению для использования в способе уменьшения или предотвращения клинических признаков или заболевания, вызванного инфекцией PCV3 у поросенка, при этом поросенок должен находиться на вскармливании свиноматкой, которой вводили композицию по настоящему изобретению, и при этом предпочтительно указанная свиноматка, которой вводили композицию, является свиноматкой, которой вводили иммуногенную композицию, когда указанная свиноматка была беременна, в частности указанным поросенком, или является свиньей до осеменения.

Предпочтительно композицию по настоящему изобретению для использования в любом из вышеупомянутых способов вводят внутримышечно или интрадермально, в частности указанной свиноматке.

Настоящее изобретение также включает способ индукции иммунного ответа или иммунологического ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа против (i) PCV3 и/или (ii) PCV2 и PCV3, и/или (iii) PCV3 и другого патогена свиней, и/или (iv) PCV3, PCV2 и другого патогена свиней, включающий введение животному любой из описанных в настоящей заявке композиций. Животное может быть свиньей. Предпочтительно свинья может быть свиньей до первого опороса, поросенком или свиноматкой. Свинья до первого опороса или поросенок могут быть не старше 15 недель или не старше 6 недель, или не старше 3 недель, или не старше 2 недель, или не старше 1 недели. Применение может быть осуществлено в течение по меньшей мере 1, 2 или 3 недель от контакта с вирулентным цирковирусом свиней. Применение может быть осуществлено в течение по меньшей мере 1, 2 или 3 недель после контакта с вирулентным цирковирусом свиней. Для некоторых аспектов применение может включать однократное введение или введение путем однократного введения, или однократное введение одной дозы белка по настоящему изобретению или композиции по настоящему изобретению; а не режим многократной вакцинации или многодозовый режим. Для некоторых аспектов применение может включать режим многократной вакцинации или применения многократных доз белка по настоящему изобретению или композиции по настоящему изобретению.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ иммунизации субъекта, включающий введение субъекту композиции по настоящему изобретению.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ иммунизации свиней против клинического заболевания, вызванного по меньшей мере одним патогеном у указанного животного, где указанный способ включает стадию введения животному композиции по настоящему изобретению, при этом указанная иммуногенная композиция не вызывает клинических признаков инфекции, но способна вызывать иммунный ответ, который иммунизирует животное против патогенных форм указанного по меньшей мере одного патогена, и при этом указанный по меньшей мере один патоген предпочтительно представляет собой PCV3.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ индукции выработки антител, специфичных к PCV3, у свиноматки, где указанный способ включает введение композиции по настоящему изобретению. Свиноматка может быть беременной свиноматкой. В качестве альтернативы свиноматка может быть свиньей до первого опороса (т.е. свиноматкой, которая не опоросилась), предпочтительно свиноматкой перед осеменением.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ уменьшения или предотвращения клинических признаков или клинических симптомов, вызванных инфекцией PCV3 у поросят, при этом указанный способ включает:

- введение композиции по настоящему изобретению свиноматке, и

- обеспечение кормления указанного поросенка указанной свиноматкой,

и при этом указанная свиноматка предпочтительно является беременной свиноматкой, в частности указанным поросенком.

Предпочтительно, последние вышеупомянутые способы включают стадии:

- введение композиции по настоящему изобретению свиноматке, беременной указанным поросенком,

- обеспечение рождения указанной свиноматкой указанного поросенка, и

- обеспечение кормления указанного поросенка указанной свиноматкой.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ уменьшения клинических признаков и/или клинических симптомов, вызванных инфицированием вирусом эпидемической диареи свиней (PEDV) у поросят, при этом поросенка должна кормить свиноматка, которой была введена композиция по настоящему изобретению.

Предпочтительно в любом из вышеупомянутых способов, где это применимо, композицию по настоящему изобретению вводят внутримышечно или интрадермально, в частности указанной свиноматке.

Согласно другому предпочтительному аспекту иммуногенную композицию по настоящему изобретению вводят дважды, в частности внутримышечно или интрадермально, указанной свиноматке.

В другом предпочтительном аспекте клинические признаки, упомянутые в настоящей заявке, выбраны из группы, состоящей из снижения среднесуточного привеса и смертности.

В другом предпочтительном аспекте клинические признаки, как указано в настоящей заявке, выбраны из группы, состоящей из выталкивания мумифицированных, мертворожденных и/или слабых плодов.

В еще одном предпочтительном аспекте клинические симптомы, как упомянуто в настоящей заявке, выбраны из группы, состоящей из макроскопических повреждений, гистологических нарушений, репликации PCV3 в ткани и виремии PCV3.

В еще одном предпочтительном аспекте клинические симптомы, как упомянуто в настоящей заявке, выбраны из группы, состоящей из развития или производства мумифицированного, мертворожденного и/или слабого плода.

Настоящее изобретение также охватывает использование любой из раскрытых здесь композиций в любом из раскрытых здесь способов, или использование белка ORF2 PCV3, отдельно или в комбинации, из любой из описанных здесь композиций для применения при приготовлении композиции для индукции иммунологического или иммунного ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа против (i) PCV3 и/или (ii) PCV2 и PCV3, и/или (III) PCV3 и другого патогена свиней, и/или (iv) PCV3, PCV2 и другого патогена свиней, или для использования в способе индукции иммунологического или иммунного ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа против (i) PCV3 и/или (ii) PCV2 и PCV3, и/или (iii) PCV3 и другого патогена свиней, и/или (iv) PCV3, PCV2 и другого патогена свиней.

В одном варианте осуществления композиция может представлять собой PCV3 и PPV (предпочтительно упакованные в VLP) и/или PRRSV, предпочтительно для использования у свиноматок/свиней до первого опороса. В таком варианте осуществления предусмотрена одна или несколько доз для введения. Этот конкретный вариант осуществления включает использование белка ORF2 PCV3 в сочетании с белком PPV, и при необходимости белком PRRSV для использования в приготовлении композиции для индукции иммунологического или иммунного ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа PCV3 и PPV, и при необходимости PSSRV, или для использования в способе индукции иммунологического или иммунного ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа против PCV3 и PPV, и при необходимости PSSRV.

В этом варианте осуществления композиция может содержать (i) белок ORF2 цирковируса свиней 3 типа (PCV3), белок парвовируса (PPV), и при необходимости белок PRRSV (вируса респираторного и репродуктивного синдрома свиней), и (ii) ветеринарно приемлемый носитель, выбранный из группы, состоящей из растворителя, дисперсионной среды, покрытия, стабилизатора, разбавителя, консерванта, противомикробного агента, противогрибкового агента, изотонического агента, агента, замедляющего адсорбцию, адъюванта, надосадочной жидкости клеточной культуры, стабилизирующего агента, вирусного вектора, вектора экспрессии, иммуномодулирующего агента и/или любой их комбинации. Ветеринарно-приемлемый носитель может включать адъювант, иммуномодулирующий агент, надосадочную жидкость клеточной культуры, вирусный вектор или вектор экспрессии, или любую их комбинацию. Ветеринарно-приемлемый носитель может включать адъювант. Композиция может быть использована в способе индукции иммунного ответа или иммунологического ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа против PCV3, PPV и/или PRRSV. В одном варианте осуществления композиция может быть использована в способе индукции иммунного ответа против PCV3 у свиньи, в частности, предпочтительно у беременной свиноматки. В другом варианте осуществления композиция может быть использована в способе уменьшения или предотвращения клинических признаков или заболевания, вызванного инфекцией PCV3, у поросят, где поросенок должен получать вскармливание свиноматкой, которой была введена композиция. Композицию может вводить внутримышечно или интрадермально. Вариант осуществления также относится к способу индукции иммунного ответа или иммунологического ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа против PCV3, PPV и/или PRRSV, который может включать введение животному любой из вышеуказанных композиций. Вариант осуществления также относится к способу иммунизации свиней против клинического заболевания, вызванного по меньшей мере одним патогеном у указанного животного, где указанный способ включает стадию введения животному любой из вышеуказанных композиций, при этом указанная иммуногенная композиция не вызывает клинических признаков инфекции, но способна вызывать иммунный ответ, который иммунизирует животное против патогенных форм указанного по меньшей мере одного патогена.

PPV представляет собой автономный реплицирующийся вирус подсемейства Parvovirinae из рода Protoparvovirus в семействе Parvoviridae, содержащий одноцепочечную молекулу ДНК длиной около 5100 нуклеотидов (Cotmore et al., 2014: Arch Virol.: 159(5): 1239-1247; Molitor et al., 1984: Virology: 137(2):241-54). В вирионы упакована только минусовая цепь ДНК. Геном вируса кодирует три капсидных белка (VP1, VP2, VP3) и один неструктурный белок (NS1). Капсид парвовируса имеет диаметр около 22-25 нанометров и состоит из субъединиц VP1 и VP2. Эти белки происходят из подвергнутых альтернативному сплайсингу версий одной и той же молекулы РНК и, таким образом, перекрываются в последовательности. Кроме того, парвовирус свиней проявляет высокий уровень сходства последовательностей с вирусом панлейкопении кошек, парвовирусами собак и парвовирусом грызунов (Ranz et al., 1989: J. gen. Virol: 70: 2541-2553).

Белок PPV может происходить из инактивированной или убитой целой клетки или из субъединицы PPV. Предпочтительно белок PPV представляет собой рекомбинантный белок PPV.

В Европейском патенте ЕР 0551449А1 раскрыт способ получения субъединичной вакцины VP2 против парвовируса свиней. Cadar D et al. (Infection, Genetics and Evolution 2012, 12: 1163-1171) описывают филогению и эволюционную генетику парвовируса свиней у диких кабанов. Streck A. F et al. (Journal of General Virology 2011, 92: 2628-2636) описывают высокую скорость вирусной эволюции капсидного белка парвовируса свиней. WO 88/02026 относится к вакцинам на основе пустых вирусных капсидов. Martinez C et al. (Vaccine 1992, 10 (10): 684-690) раскрывает получение пустых капсидов свиного парвовируса с высокой иммуногенной активностью. Xu F et al. (Applied and Environmental Microbiology 2007, 73 (21): 7041-7047) описывают индукцию иммунных ответов у мышей после внутрижелудочного введения Lactobacillus casei, продуцирующих белок VP2 парвовируса свиньи. Патент США № 10485866 раскрывает иммуногенные композиции, содержащие вирусный белок 2 PPV (VP2), преимущественно мутантный PPV VP2, содержащий одну или несколько мутаций.

Термин «свиной парвовирус» или «PPV» хорошо известен специалисту в данной области техники. Однако «свиной парвовирус» представляет собой автономный реплицирующийся вирус из рода Рarvovirus в семействе Parvoviridae, содержащий одноцепочечную молекулу ДНК. Геном вируса кодирует три капсидных белка (VP1, VP2, VP3) и один неструктурный белок (NS1). Заболевание, вызываемое PPV у свиней, часто называют SMEDI (сокращение от мертворождения, мумификации, гибели эмбриона и бесплодия). Термин «свиной парвовирус» охватывает все возможные штаммы, генотипы, фенотипы и серотипы парвовируса свиней. Термин «вирусный белок 2» или «VP2» относится к капсидному белку VP2 парвовируса свиньи. Термин «вирусный белок 2» или «VP2» хорошо известен специалисту в данной области техники.

Репродуктивно-респираторный синдром свиней (PRRS) рассматривается многими как наиболее серьезное заболевание, поражающее в настоящее время свиноводство во всем мире. Вирус PRRS (PRRSV) представляет собой оболочечный одноцепочечный РНК-вирус, относящийся к семейству Arteriviridae. Антигенные характеристики различных изолятов вируса PRRS сильно различаются, а эффективные меры по предотвращению инфекций ограничены. Существуют три основные группы вакцин против PRRS, аттенуированный модифицированный живой вирус (MLV), вакцины с убитым вирусом или рекомбинантные вакцины. Белки вирусной оболочки вируса PRRSV обычно подразделяются на основные и минорные белки в зависимости от количества белков в вирионе. Основными белками оболочки вируса являются gp5 (ORF 5) и M (ORF 6), которые образуют димер. Минорные белки оболочки - это gp2 (ORF2), gp3 (ORF3), gp4 (ORF4) и E (ORF2b) и, вероятно, недавно идентифицированный вирусный белок gp5a (ORF 5a). Активный антигенный компонент может включать ORF4, ORF5, ORF6 или ORF7 вируса PRRSV.

Рекомбинантный антиген PRRSV может быть экспрессирован в векторной вакцине PRRSV или композиции, которая включает один или несколько сконструированных рекомбинантных аденовирусных векторов, которые несут и экспрессируют определенные антигены PRRSV, и при необходимости фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, адъювант, наполнитель или растворитель. Предпочтительно вектор представляет собой аденовирусный вектор, хотя также рассматриваются другие векторы, такие как бакуловирус.

PRRSV может быть любым штаммом, поскольку описанные в настоящей заявке новые композиции и способы по изобретению универсально применимы ко всем известным и еще не обнаруженным штаммам PRRSV. Вирус PRRSV существует в виде двух генотипов, называемых типами «US» и «EU», которые имеют примерно 50% гомологию последовательностей (Dea S. et al. (2000). Arch Virol 145: 659-88). Эти два генотипа также можно различить по их иммунологическим свойствам. Большая часть информации о секвенировании различных изолятов основана на структурных белках, а именно на белке оболочки GP5, который составляет только около 4% вирусного генома, тогда как о неструктурных белках (nsp) известно очень мало. Выделение вируса PRRSV и производство вакцин описано в ряде публикаций (WO 92/21375, WO 93/06211, WO93/ 03760, WO 93/07898, WO 96/36356, EP 0676467, EP 0732340, EP 0835930, US 10039821). Антиген PRRSV включает минорные белки PRRS (например, gp2, gp3, gp4, gp5a, gp5 или E) в любой комбинации, и при необходимости включает дополнительные основные белки PRRS (например, gp5 или M). Например, антигены PRRSV могут отображаться на поверхности вирусоподобных частиц (VLP). В других вариантах осуществления растворимые версии антигенов можно вводить животному-хозяину, при этом происходит олигомеризация (включая тримеризацию) белков друг с другом или дополнительно с компонентами VSV-G или других вирусных белков, или любая олигомеризация (включая мотивы тримеризации) (например, мотивы из бактериального GCN4 и т.п.). Более того, предполагается, что TM/CT-домены поверхностных гликопротеинов вируса типа I выполняют ту же функцию, что и соответствующие домены из VSV-G, и, следовательно, взаимозаменяемы с ними.

В некоторых вариантах осуществления один или несколько векторов содержат либо нуклеотидную последовательность, кодирующую антиген E PRRSV, полипептид, эктодомен или его вариант; либо нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный антиген gp2, gp3, gp4, gp5a, gp5 или M, полипептид, эктодомен или его вариант PRRSV, при этом существующая последовательность клеточной локализации gp2, gp3, gp4, gp5a, gp5 или M была заменена детерминантной последовательностью экспрессии на клеточной поверхности из гетерологичного гена. В некоторых вариантах осуществления один или несколько векторов содержат смесь двух векторов: первый вектор, экспрессирующий минорные белки PRRSV с перенацеливанием, и второй вектор, экспрессирующий основные белки PRRSV с перенацеливанием.

В предпочтительном варианте осуществления иммуногенную композицию, содержащую PCV3, PPV и/или PRRSV, вводят нуждающемуся субъекту в двух дозах. Однако иммуногенная композиция, содержащая PCV3, PPV и/или PRRSV, может быть введена в двух или более дозах, причем первую дозу вводят до введения второй (бустерной) дозы. Предпочтительно вторую дозу вводят по меньшей мере через 15 дней после первой дозы. Более предпочтительно вторую дозу вводят между 15 и 40 днями после первой дозы. Еще более предпочтительно вторую дозу вводят по меньшей мере через 17 дней после первой дозы. Еще более предпочтительно вторую доза вводят между 17 и 30 днями после первой дозы. Еще более предпочтительно вторую дозу вводят по меньшей мере через 19 дней после первой дозы. Еще более предпочтительно вторую дозу вводят между 19 и 25 днями после первой дозы. Наиболее предпочтительно вторую дозу вводят по меньшей мере через 21 день после первой дозы. Еще более предпочтительно вторую дозу вводят примерно через 21 день после первой дозы или через 21 день после первой дозы. В предпочтительном аспекте схемы двукратного введения как первую, так и вторую дозу иммуногенной композиции, содержащей PCV3, PPV и/или PRRSV, вводят в одинаковом количестве. Предпочтительно каждая доза находится в предпочтительных количествах, указанных выше, при этом доза 1 мл или 2 мл для первой и второй доз является наиболее предпочтительной. В дополнение к первому и второму режимам дозирования альтернативный вариант осуществления включает дополнительные последующие дозы. Например, в этих аспектах может быть введена третья, четвертая или пятая доза. Предпочтительно последующую третью, четвертую и пятую дозы вводят в том же количестве, что и первую дозу, при этом временные рамки между дозами соответствуют времени между первой и второй дозами, упомянутыми выше.

Объем дозы для каждого субъекта зависит от способа вакцинации и возраста субъекта. Предпочтительно общий объем составляет примерно от 0,2 мл до 5 мл, более предпочтительно примерно от 0,5 мл до 3,0 мл, еще более предпочтительно примерно от 1,0 мл до 2,5 мл, еще более предпочтительно примерно от 1,0 мл до 2,0 мл. Наиболее предпочтительный объем составляет 1 мл; 1,5 мл; 2 мл или 2,5 мл на дозу.

Иммуногенную композицию, содержащую PCV3, PPV и/или PRRSV, предпочтительно вводят местно или системно. Подходящие способы введения, обычно используемые, представляют собой пероральное или парентеральное введение, такое как интраназальное, внутривенное, интрадермальное, трансдермальное, внутримышечное, интраперитонеальное, подкожное, а также ингаляционное введение. Однако, в зависимости от природы и механизма действия соединения, иммуногенная композиция также может быть введена другими путями. Например, такие другие пути включают внутрикожный, внутривенный, внутрисосудистый, внутриартериальный, интраперитонеальный, интратекальный, интратрахеальный, внутрикожный, интракардиальный, интралобальный, интралобарный, интрамедуллярный, внутрилегочный, интраректальный и интравагинальный. Однако более предпочтительно иммуногенную композицию, содержащую PCV3, PPV и/или PRRSV, вводят подкожно или внутримышечно. Наиболее предпочтительно иммуногенную композицию, содержащую PCV3, PPV и/или PRRSV, вводят внутримышечно.

В одном аспекте указанную иммуногенную композицию, содержащую PCV3, PPV и/или PRRSV, вводят внутримышечно.

В одном аспекте указанную иммуногенную композицию, содержащую PCV3, PPV и/или PRRSV, вводят свиньям до первого опороса и/или свиноматкам.

Предпочтительно, иммуногенную композицию, содержащую PCV3, PPV и/или PRRSV, вводят свиньям до первого опороса и/или свиноматкам в возрасте по меньшей мере 3 месяцев, более предпочтительно в возрасте по меньшей мере 4 месяцев, наиболее предпочтительно по меньшей мере в возрасте 5 месяцев.

В одном аспекте иммуногенную композицию вводят свиньям до первого опороса и/или свиноматкам в возрасте по меньшей мере 3 месяцев.

В одном аспекте указанную иммуногенную композицию, содержащую PCV3, PPV и/или PRRSV, вводят свиньям до первого опороса и/или свиноматкам до беременности.

В режиме двухфазной вакцинации вторую дозу указанной иммуногенной композиции, содержащей PCV3, PPV и/или PRRSV, предпочтительно вводят свиньям до первого опороса и/или свиноматкам за 2, 3, 4 или 5 недель до спаривания/осеменения, наиболее предпочтительно примерно за 3 недели до спаривания/осеменения. Предпочтительно первую дозу указанной иммуногенной композиции вводят свиньям до первого опороса и/или свиноматкам за 2, 3, 4, 5 или 6 недель до введения второй дозы, наиболее предпочтительно примерно за 3 недели до введения второй дозы. Однако после применения режима двухфазной вакцинации предпочтительно, чтобы свиней до первого опороса и/или свиноматок ревакцинировали каждые 3, 4, 5, 6, 7 или 8 месяцев, наиболее предпочтительно примерно каждые 6 месяцев.

В одном из аспектов настоящего изобретения указанную иммуногенную композицию вводят свиньям до первого опороса и/или свиноматкам во время беременности и лактации.

В одном из аспектов настоящего изобретения иммуногенная композиция безопасна для свиней до первого опороса и/или свиноматок во время беременности и лактации.

Кроме того, утверждается, что вакцина способна защитить племенных свиней до первого опороса и свиноматок при заражении PCV3 в течение всей беременности, или двух триместров, или по меньшей мере одного триместра в течение 114 дней беременности.

Также утверждается, что вакцина способна значительно снизить количество мумифицированных, мертворожденных и слабых плодов у вакцинированных свиней до первого опороса и свиноматок, вакцинированных при заражении PCV3 в течение всей беременности, или двух, или по меньшей мере одного триместра в течение 114 дней беременности.

В одном из аспектов настоящего изобретения иммуногенная композиция безопасна для свиней до первого опороса и/или свиноматок с 30 дней беременности, предпочтительно с 40 дней беременности.

Предпочтительно, иммуногенная композиция, содержащая PCV3, PPV и/или PRRSV, содержит от 0,1 мкг до 150 мкг, предпочтительно от 0,25 мкг до 75 мкг, более предпочтительно от 0,5 мкг до 37,5 мкг, еще более предпочтительно от 0,5 мкг до 15 мкг, наиболее предпочтительно от 0,5 до 6 мкг антигена PCV3, PPV и/или PRRS. Иммуногенная композиция, содержащая PCV3, PPV и/или PRRSV, может находиться в количествах примерно 0,25 мкг; 0,5 мкг; 0,75 мкг; 1 мкг; 1,25 мкг; 1,5 мкг; 1,75 мкг; 2 мкг; 2,25 мкг; 2,5 мкг; 2,75 мкг; 3 мкг; 3,5 мкг; 4 мкг; 4,5 мкг; 5 мкг; 5,5 мкг; 6 мкг; 6,5 мкг; 7 мкг; 7,5 мкг; 8 мкг; 8,5 мкг; 9 мкг; 9,5 мкг; 10 мкг; 10,5 мкг; 11 мкг; 11,5 мкг; 12 мкг; 12,5 мкг; 13 мкг; 13,5 мкг; 14 мкг; 14,5 мкг или 15 мкг.

В одном аспекте настоящего изобретения иммуногенная композиция содержит от 0,1 до 150 мкг антигена VP2 PPV, предпочтительно от 0,5 до 30 мкг иммуногенной композиции, содержащей антигены PCV3, PPV и/или PRRS.

В одном аспекте иммуногенная композиция защищает от гомологичного и/или гетерологичного заражения.

Белок ORF2 PCV3 может продуцироваться системой экспрессии бакуловируса в культивируемых клетках насекомых. Способ может включать инактивацию бакуловируса. Инактивацию проводят способами, известными в данной области техники. Например, при химической инактивации подходящий образец вируса или образец сыворотки, содержащий вирус, обрабатывают в течение достаточного периода времени достаточным количеством или концентрацией инактивирующего агента при достаточно высокой (или низкой, в зависимости от инактивирующего агента) температуре или pH для инактивации вируса. Инактивацию путем нагревания проводят при температуре и в течение периода времени, достаточных для инактивации вируса. Инактивацию облучением проводят с использованием длины волны света или другого источника энергии в течение периода времени, достаточного для инактивации вируса. Вирус считается инактивированным, если он не может заразить восприимчивую к инфекции клетку. Инактивация может включать тепловую обработку или использование агента, инактивирующего вирус. Инактивирующий агент может включать азиридиновое соединение, такое как BEI.

Настоящее изобретение также включает рекомбинантный вектор, содержащий полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную последовательность, кодирующую белок ORF2 PCV3. ORF2 PCV3 может быть из группы a1, b1 или b2 (с использованием обозначения подтипа Fux et al., «Full genome characterization of porcine circovirus type 3 isolates reveals the existence of two distinct groups of virus strains», Virology Journal (2018) 15:25, DOI 10.1186/s12985-018-0929-3 (включен в настоящий документ посредством ссылки); см., например, таблицу 4). В другом варианте осуществления белок ORF2 PCV3 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, кодируемой полинуклеотидной последовательностью, имеющей по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности последовательности или гомологии последовательности с SEQ ID NO: 4. Рекомбинантный вектор может быть бакуловирусом. В другом варианте осуществления рекомбинантный вектор может иметь по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности последовательности или гомологии последовательности с SEQ ID NO: 2.

Следует отметить, что в настоящем изобретении, и в частности, в формуле изобретения и/или параграфах такие термины, как «содержит», «содержащийся», «содержащий» и т.п., могут иметь значение, приписываемое им в Патентном законодательстве США; например, они могут означать «включает», «включенный», «включающий» и тому подобное, и что такие термины, как «состоящий по существу из» и «состоит по существу из», имеют значение, приписываемое им в Патентном законодательстве США, например, они допускают элементы, не перечисленные явно, но исключающие элементы, которые встречаются в предыдущем уровне техники или которые влияют на основную или новую характеристику изобретения.

Свинья, молодая свинья или поросенок, которым вводят вакцину, могут иметь антитела против PCV, такие как PCV2 и/или PCV3, например, материнские антитела.

Эти и другие варианты осуществления раскрыты или очевидны из следующего подробного описания и охватываются им.

Следует отметить, что в настоящем изобретении, и в частности, в формуле изобретения и/или параграфах такие термины, как «содержать», «содержит», «содержащий» и т.п., могут иметь значение, приписываемое им в патентном законодательстве США; например, они могут означать «включает», «включенный», «включающий» и тому подобное, и что такие термины, как «состоящий по существу из» и «состоит по существу из», имеют значение, приписываемое им в патентном законодательстве США, например, они допускают элементы, не перечисленные явно, но исключающие элементы, которые встречаются в предыдущем уровне техники или которые влияют на основную или новую характеристику изобретения.

Эти и другие варианты осуществления раскрыты или очевидны из следующего подробного описания и охватываются им.

Краткое описание чертежей

Файл патента или заявки содержит по меньшей мере один чертеж, выполненный в цвете. Копии данного патента или публикации заявки на патент с цветными чертежами будут предоставлены Ведомством по запросу и при уплате необходимой пошлины.

Следующее подробное описание, данное в качестве примера, но не предназначенное для ограничения изобретения только конкретными описанными вариантами осуществления, может быть лучше всего понято в сочетании с прилагаемыми чертежами.

На фигуре 1 показана нуклеотидная последовательность ORF2 PCV3 в рекомбинантном бакуловирусе BaculoG/PCV3 ORF2, SEQ ID NO: 1.

На фигуре 2 показана фигура 2 из WO 2020/206452, содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки. фиг.2 из WO 2020/206452 представляет последовательность рекомбинантного бакуловируса BaculoG/PCV3 ORF2, SEQ ID NO: 2.

На фигуре 3 показана карта рекомбинантного бакуловируса, содержащего ген ORF2 PCV3 под контролем полиэдринового промотора бакуловируса (BaculoG/PCV3 ORF2 Клон 4B4-2E12 Pre-MSV p8).

На фигуре 4 показано медианное значение log10 геномных копий ДНК PCV3/мл в сыворотке крови в день исследования; Группы 1-5.

На фигуре 5 показано медианное значение log10 геномных копий ДНК PCV3/мл по группе в день исследования в образцах фекалий; группы 1-5.

На фигуре 6 показано медианное значение log10 геномных копий ДНК PCV3/мл по группе в день исследования в образцах из носа; группы 1-5.

На фигуре 7 показаны скорректированные по исходному уровню средние ректальные температуры (°F) для группы по способу наименьших квадратов по дням исследования.

На фигуре 8 показаны скорректированные по исходному уровню, средние по группам данные по способу наименьших квадратов для суточного веса (кг) по дням; группы 1-5.

На фигуре 9 показана средняя температура тела (°F) в группе по дням.

На фигуре 10 показана информация о последовательности PCV3 в ПЦР-позитивном гомогенате ткани, использованном для зараженного материала (SEQ ID NO: 3-5).

На фигуре 11 показано среднее значение ПЦР для Групп 1-5 от семи до сорока девяти дней.

На фигуре 12 показано медианное значение ПЦР для Групп 7-9 от семи до сорока девяти дней.

На фигуре 13 показано медианные значения ПЦР для фекалий для групп 1-5 от семи до сорока девяти дней.

На фигуре 14 показаны медианные значения ПЦР для назальных мазков для групп 1-5 от семи до сорока девяти дней

На фигуре 15 показано среднее арифметическое значение ректальной температуры для групп 1-6 с четырнадцати до сорока девяти дней оценки.

На фигуре 16 показаны средние значения температуры по способу наименьших квадратов по группам и дням для групп 1-5.

На фигуре 17 показана линейная диаграмма, показывающая средние ректальные температуры животных (скорректированную на основе наименьших квадратов) по группам и дням для групп 1-5.

На фигуре 18 показаны среднеарифметические значения массы тела для групп 1-6 от четырнадцати до сорока девяти дней.

На фигуре 19 показан линейный график, показывающий средние значения массы тела (по способу наименьших квадратов) по группам и дням для групп 1-5.

На фигуре 20 показан линейный график, изображающий данные для средних значений по способу наименьших квадратов для массы тела (с поправкой на исходный уровень) по группам и дням.

На фигуре 21 показан график истории производства пре-MSV+1.

На фигуре 22A показано количество клеток, а на фигуре 22B показана жизнеспособность и размер клеток во время инфицирования ORF2 BaculoG/PCV3.

На фигуре 23 показан анализ собранных жидкостей ORF2 BaculoG/PCV3.

На фигуре 24 показаны изображения инактивации через 72 часа.

На фигуре 25 показано сравнение способом вестерн-блоттинга условий инактивации антигена ORF2 BaculoG/PCV3 - после инактивации.

На фигуре 26 показан флуоресцентный дот-блоттинг ORF2 PCV3.

На фигуре 27 показан график наблюдаемой виремии в выборке популяции свиней после заражения на основе log10 геномных копий/мл. Все контрольные свиньи были виремическими, как определено с помощью ПЦР в каждой точке отбора проб во время фазы заражения, и вирусная нагрузка в каждой точке отбора проб во время фазы заражения была значительно снижена вакцинацией (P≤0,0050).

На фигуре 28 показан график измеренных средних ректальных температур (°F) до заражения (D12, D13, D14) и после заражения (D14.5-D20).

На фигуре 29 показан график наблюдаемой виремии у свиней до первого опороса, зараженных на Д83 (40 дней беременности). Цифры указывают количество геномных копий/мл. Ось Y отображается в линейном масштабе для точного представления нулевых значений. Стрелки указывают введение первичной вакцины, ревакцинации и контрольного заражения.

На фигуре 30 показана гистограмма, демонстрирующая процент пораженных поросят на основе наблюдаемого числа подвергшихся аутолизу, разрушенных, мумифицированных поросят, рожденных от свиноматок на опоросе в каждой опытной группе.

На фигуре 31 показано выравнивание аминокислотной последовательности капсида PCV3 с капсидом свиного PCV2 и капсидом вируса болезни клюва и пера (BFDV).

На фигуре 33 показана структура мутанта ORF2 PCV3 в петле FG, имеющего мутации в лизинах и гистидинах.

На фигуре 33 показана структура мутанта ORF2 PCV3, в котором нативный стоп-кодон для капсидного белка PCV3 был мутирован, а С-конец был удлинен до следующего стоп-кодона.

На фигуре 34 показаны нуклеотидные и аминокислотные последовательности мутанта ORF2 PCV3 в петле FG, имеющего мутации в лизинах и гистидинах, и мутанта ORF2 PCV3, в котором нативный стоп-кодон для капсидного белка PCV3 был мутирован, а С-конец был удлинен до следующий стоп-кодон (SEQ ID NO: 6-9).

На фигуре 35 показана аминокислотная последовательность мутанта ORF2 PCV3 «FG-PC» (SEQ ID NO: 10).

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к вакцине против PCV3.

Предполагается любая последовательность PCV3. См., например, Phan, Tung Gia, et al. «Detection of a Novel Circovirus PCV3 in Pigs with Cardiac and Multi-Systemic Inflammation». Virology Journal, vol. 13, no. 1, 2016, p. 184, doi:10.1186/s12985-016-0642-z. Published November 11, 2016, и Fux et al., «Full genome characterization of porcine circovirus type 3 isolates reveals the existence of two distinct groups of virus strains», Virology Journal (2018) 15:25, DOI 10.1186/s12985-018-0929-3, описание которых включено в качестве ссылки.

Последовательности генома PCV3 ORF2 и PCV3 были получены из KT869077 (GenBank). Был использован полный геном PCV3 в плазмиде, описанный в примерах. ORF2 и весь геном были синтезированы в Genscript.

Две дополнительные конструкции, рециркуляризованные геном PCV3, полученные двумя разными способами, были использованы в культуре клеток для сохранения вируса.

Следующие последовательности представлены в списке последовательностей:

SEQ ID NO: Тип Описание 1 ДНК Полинуклеотид, кодирующий ORF2 PCV3 в бакуловирусном векторе 2 ДНК Полинуклеотид, кодирующий ORF2 PCV3 в бакуловирусном векторе 3 Белок ORF1 PCV3, выделенный из ткани 4 Белок ORF2 PCV3, выделенный из ткани 5 ДНК Полинуклеотид, кодирующий ORF2 PCV3, выделенный из ткани 6 ДНК Полинуклеотид, кодирующий мутированную ORF2 PCV3 «FG» 7 ДНК Полинуклеотид, кодирующий мутированную ORF2 PCV3 «PC» 8 Белок Мутантный белок PCV3 ORF2 «FG» 9 Белок Мутантный белок PCV3 ORF2 «PC» 10 Белок Мутантный белок PCV3 ORF2 «FG-PC»

ORF2 PCV3 «FG» представляет собой антигенный белок согласно настоящему изобретению, который включает аминокислотные замены в петле FG природного белка ORF2 PCV3.

PCV3 ORF2 «PC» представляет собой антигенный белок согласно настоящему изобретению, который включает удлинение из аминокислот на С-конце природного белка ORF2 PCV3.

В предпочтительном аспекте полипептид по настоящему изобретению представляет собой рекомбинантный белок ORF2 PCV3, такой как рекомбинантный белок ORF2 PCV3, экспрессируемый бакуловирусом. Используемый здесь термин «рекомбинантный белок ORF2 PCV3», в частности, относится к молекуле белка, которая экспрессируется из молекулы рекомбинантной ДНК, такой как полипептид, который продуцируется способами рекомбинантной ДНК. пример таких способов включает случай, когда ДНК, кодирующую экспрессируемый белок, вставляют в подходящий вектор экспрессии, предпочтительно бакуловирусный вектор экспрессии, который, в свою очередь, используют для трансфекции, или, в случае бакуловирусного вектора экспрессии, для инфицирования клетки-хозяина, с целью производства белка или полипептида, кодируемого ДНК. Термин «рекомбинантный белок ORF2 PCV3», используемый в настоящей заявке, таким образом, в частности, относится к молекуле белка, которая экспрессируется из молекулы рекомбинантной ДНК.

Согласно конкретному примеру, рекомбинантный белок ORF2 PCV3 получают способом со следующими стадиями: ген ORF2 PCV3 клонируют в бакуловирусный вектор переноса; вектор переноса используют для получения рекомбинантного бакуловируса, содержащего указанный ген, путем гомологичной рекомбинации в клетках насекомых, и белок ORF2 PCV3 затем экспрессируется в клетках насекомых во время инфицирования рекомбинантным бакуловирусом.

Также понятно, что термин «рекомбинантный белок PCV3, состоящий из последовательности», в частности, также относится к любой котрансляционной и/или посттрансляционной модификации или модификациям последовательности, на которую воздействует клетка, в которой экспрессируется полипептид. Таким образом, термин «рекомбинантный белок ORF2 PCV3, состоящий из последовательности», как описано в настоящей заявке, также относится к последовательности, имеющей одну или несколько модификаций, произведенных клеткой, в которой экспрессируется полипептид, в частности, модификаций аминокислотных остатков, произведенных в биосинтезе белка и/или процессинге белка, предпочтительно выбранных из группы, состоящей из гликозилирования, фосфорилирования и ацетилирования.

Предпочтительно, рекомбинантный белок ORF2 PCV3 согласно настоящему описанию продуцируется или может быть получен бакуловирусной системой экспрессии, в частности, в культивируемых клетках насекомых.

В еще одном предпочтительном аспекте полипептид по настоящему изобретению представляет собой белок ORF2 PCV3, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 92%, более предпочтительно по меньшей мере 94%, еще более предпочтительно по меньшей мере 96%, еще более предпочтительно по меньшей мере 98%, или, в частности, 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4.

«Идентичность последовательности», как известно в данной области техники, относится к взаимосвязи между двумя или более полипептидными последовательностями, или двумя или более полинуклеотидными последовательностями, а именно эталонной последовательностью и данной последовательностью, которую нужно сравнить с эталонной последовательностью. Идентичность последовательностей определяют путем сравнения данной последовательности с эталонной последовательностью после того, как последовательности были оптимально выровнены для получения наивысшей степени сходства последовательностей, что определяется соответствием между строками таких последовательностей. После такого выравнивания идентичность последовательностей устанавливают на основе положения за положением, например, последовательности являются «идентичными» в конкретном положении, если в этом положении нуклеотиды или аминокислотные остатки идентичны. Общее количество таких идентичностей положений затем делят на общее количество нуклеотидов или остатков в эталонной последовательности, чтобы получить процент идентичности последовательности. Идентичность последовательности можно легко вычислить известными способами, включая, помимо прочего, способы, описанные в Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991), и Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988), руководства которых включены в настоящую заявку посредством ссылки. Предпочтительные способы определения идентичности последовательностей предназначены для обеспечения максимального совпадения между тестируемыми последовательностями. Способы определения идентичности последовательностей кодифицированы в общедоступных компьютерных программах, которые определяют идентичность последовательностей между данными последовательностями. примеры таких программ включают, без ограничения, пакет программ GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12 (1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN и FASTA (Altschul, SF et al., J. Molec. Biol., 215: 403-410 (1990). Программа BLASTX общедоступна в NCBI и других источниках (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, SF et al., J. Molec. Biol., 215: 403-410 (1990), руководства которых включены в настоящую заявку посредством ссылки). Эти программы оптимально выравнивают последовательности, используя размеры гэпов по умолчанию, чтобы получить наивысший уровень идентичности последовательности между данной и эталонной последовательностями. В качестве иллюстрации под полинуклеотидом с нуклеотидной последовательностью, имеющей по меньшей мере, например, 85%, предпочтительно 90%, еще более предпочтительно 95% «идентичности последовательности» с эталонной нуклеотидной последовательностью, подразумевается, что нуклеотидная последовательность данного полинуклеотида идентична эталонной последовательности, за исключением того, что данная полинуклеотидная последовательность может включать до 15, предпочтительно до 10, еще более предпочтительно до 5 точечных мутаций на каждые 100 нуклеотидов эталонной нуклеотидной последовательности. Другими словами, в полинуклеотиде, содержащем нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, предпочтительно 90%, еще более предпочтительно 95% идентичности относительно эталонной нуклеотидной последовательности, до 15%, предпочтительно 10%, еще более предпочтительно 5% нуклеотидов в эталонной последовательности может быть удалено или заменено другим нуклеотидом, или количество нуклеотидов до 15%, предпочтительно 10%, еще более предпочтительно 5% от общего количества нуклеотидов в эталонной последовательности может быть вставлено в эталонную последовательность. Эти мутации эталонной последовательности могут происходить в 5'- или 3'-концевых положениях эталонной нуклеотидной последовательности или в любом месте между этими концевыми положениями, перемежаясь либо индивидуально среди нуклеотидов в эталонной последовательности, либо в одной или нескольких смежных группах в эталонной последовательности. Аналогично, для полипептида, содержащего данную аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере, например, 85%, предпочтительно 90%, еще более предпочтительно 95% идентичности последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью, подразумевается, что данная аминокислотная последовательность полипептида идентична эталонной последовательности, за исключением того, что данная полипептидная последовательность может включать до 15, предпочтительно до 10, еще более предпочтительно до 5 аминокислотных изменений на каждые 100 аминокислот эталонной аминокислотной последовательности. Другими словами, для получения данной полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 85%, предпочтительно 90%, еще более предпочтительно 95% идентичности последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью, до 15%, предпочтительно до 10%, еще более предпочтительно до 5% аминокислотных остатков в эталонной последовательности может быть удалено или заменено другой аминокислотой, или количество аминокислот до 15%, предпочтительно до 10%, еще более предпочтительно до 5% от общего количества аминокислотных остатков в эталонной последовательности может быть вставлено в эталонную последовательность. Эти изменения эталонной последовательности могут происходить в амино- или карбокси-концевых положениях эталонной аминокислотной последовательности или в любом месте между этими концевыми положениями, с вкраплениями либо индивидуально среди остатков в эталонной последовательности, либо в одной или нескольких смежных группах в эталонной последовательности. Предпочтительно, чтобы неидентичные положения остатков различались консервативными аминокислотными заменами. Однако консервативные замены не учитываются при определении идентичности последовательностей.

«Гомология последовательностей» в контексте настоящего описания относится к способу определения родства двух последовательностей. Для определения гомологии последовательностей оптимально выравнивают две или более последовательностей и при необходимости вводят гэпы. Однако, в отличие от «идентичности последовательностей», консервативные аминокислотные замены учитываются как совпадение при определении гомологии последовательностей. Другими словами, для получения полипептида или полинуклеотида, имеющего 95% гомологии последовательности с эталонной последовательностью, 85%, предпочтительно 90%, еще более предпочтительно 95% аминокислотных остатков или нуклеотидов в эталонной последовательности должно соответствовать или содержать консервативную замену другой аминокислотой или нуклеотидом, или рядом аминокислот или нуклеотидов до 15%, предпочтительно до 10%, еще более предпочтительно до 5% от общего числа аминокислотных остатков или нуклеотидов, не включая консервативные замены, в эталонной последовательности могут быть вставлены в эталонную последовательность. Предпочтительно гомологичная последовательность включает по меньшей мере участок из 50, еще более предпочтительно 100, еще более предпочтительно 250, еще более предпочтительно 500 нуклеотидов.

«Консервативная замена» относится к замене аминокислотного остатка или нуклеотида другим аминокислотным остатком или нуклеотидом, имеющим аналогичные характеристики или свойства, включая размер, гидрофобность и т.д., так что общая функциональность существенно не изменяется.

Настоящее изобретение также охватывает мутации белков PCV3, такие как мутации капсидного белка PCV3, но не ограничиваясь ими. Несмотря на расхождение аминокислотных последовательностей капсида между PCV2 и вирусом болезни клюва и пера (BFDV), кристаллические структуры очень похожи, несмотря на расхождение их последовательностей. Предпочтительно мутации PCV3 предназначены для стабилизации вирусоподобных частиц (VLP). Капсидный белок PCV3 должен самособираться в VLP, однако уровень экспрессии белка PCV3 значительно ниже по сравнению с капсидным белком PCV2. В частности, только около 20% белка собирается в VLP, тогда как оставшиеся 80% белка объединяются в нерастворимую фракцию.

В некоторых вариантах осуществления вариантный белок по настоящему изобретению способен давать более высокий выход VLP, чем белок, кодируемый SEQ ID No. 1. Понятно, что более высокий выход, в частности, например, относится к более высокому молярному выходу. Альтернативно экспрессируемый вариантный белок по настоящему изобретению способен к более масштабной сборке VLP CAP (белок капсида (ORF2)), чем белок, кодируемый SEQ ID No. 1. примеры более высоких выходов включают по меньшей мере на 5% увеличенный выход или по меньшей мере на 10% увеличенный выход, или по меньшей мере на 15% увеличенный выход, или по меньшей мере на 20% увеличенный выход, или по меньшей мере на 25% увеличенный выход, или по меньшей мере на 30% увеличенный выход, или по меньшей мере на 35% увеличенный выход, или по меньшей мере на 40% увеличенный выход, или по меньшей мере на 50% увеличенный выход. Таким образом, например, если без модификации белка ORF2 PCV3 путем бакуловирусной экспрессии существует 20% растворимого белка PCV3 (VLP) и 80% нерастворимого белка PCV3, например, по данным вестерн-блоттинга, а при модификации, вместо этого имеется 25%, или 30%, или 35%, или 40%, или 45%, или 50%, или 55%, или 60% или более растворимого белка PCV3 (VLP) (при этом произошло увеличение на 5%, или 10%, или на 15%, или на 20%, или на 25%, или на 30%, или на 35%, или на 40%, или на 45% и т.д. растворимого белка PCV3 (VLP)), то это обеспечивает более высокий выход. Предпочтительно, от модификации белка ORF2 PCV3 выход VLP (растворимые белки PCV3) составляет по меньшей мере 50% от белков PCV3, экспрессируемых рекомбинантной бакуловирусной системой.

Анализы и методики, подходящие для использования в настоящем изобретении, включают те, которые использовались для отслеживания или количественной оценки сборки и разборки белка капсида цирковируса свиней (ORF2) в вирусоподобные частицы (VLP), и они включают иммуноферментный анализ (ИФА), ДСН/ПАГЭ, при необходимости с окрашиванием серебром или красителем кумасси, вестерн-блоттинг или иммуноблоттинг, эксклюзионную хроматографию (SEC), динамическое рассеяние света (DLS) или многоугловое рассеяние света (MALS), трансмиссионную электронную микроскопию (ТЭМ), аналитическое ультра-центрифугирование и флуоресцентный спектроскопический анализ (ФСА), при необходимости в сочетании с высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ). Дополнительные подходящие методики могут также включать тесты на замедление образования комплексов белок-нуклеиновая кислота в агарозном геле, тесты иммуннодиффузии, например, одномерную радиальную иммунодиффузию (ОРИД), анализ траекторий движения наночастиц (NTA), метаболическое мечение и хемилюминесцентные анализы на основе ферментов. Каждый из этих анализов хорошо известен в данной области техники и описан, например, в Fang, Mingli et al. «Detection of the Assembly and Disassembly of PCV2b Virus-Like Particles Using Fluorescence Spectroscopy Analysis» Intervirology vol. 58, 2015, pp. 318-323; Thompson, Christine et al. «Analytical technologies for influenza virus-like particle candidate vaccines: challenges and emerging approaches» Virology Journal vol 10, 2013, p. 141; Steppert, Petra et al. «Quantification and characterization of virus-like particles by size-exclusion chromatography and nanoparticle tracking analysis» Journal of Chromatography A vol. 1487, 2017, pp. 89-99; Yadav, Shalini et al. «A facile quantitative assay for viral particle genesis reveals cooperativity in virion assembly and saturation of an antiviral protein» Virology, vol 429, No. 2, 2012, pp. 155-162, и Zeltins, Andris «Construction and Characterization of Virus-Like Particles: A Review» Molecular Biotechnology vol. 53, 2013, pp. 92-107, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки во всей полноте.

В одном аспекте вариантный белок по настоящему изобретению способен давать более высокий выход VLP, чем белок, кодируемый SEQ ID No. 1, при определении с помощью вестерн-блоттинга. Другими словами, вариантный белок по настоящему изобретению способен к большей сборке CAP VLP, чем белок, кодируемый SEQ ID No. 1, при определении с помощью вестерн-блоттинга.

В различных вариантах осуществления, обсуждаемых в настоящей заявке, существует мутация или мутации капсидного белка ORF2 PCV3, например, для увеличения выхода VLP. Например, в различных вариантах осуществления в петле FG может быть одна, две, три или четыре мутации. В качестве примеров и обсуждений здесь представлены варианты осуществления, которые могут включать SKKK петли FG белка ORF2 PCV3, замененный на QPFS (например, мотив белка ORF2 PCV2). Выполняя замену (замены), специалист в данной области техники может применить изобретение путем замены только S на Q, или только замены первого K на P, или только замены второго K на F, или только замены третьего K на S, или любых комбинаций из этих замен, например, S на Q и первый K на P или S на Q и второй K на F или S на Q и третий K на S, или S на Q и первый K на P и второй K на F, или S на Q и первый K на P и третий K на S и т.д. Аналогичным образом, в этих вариантах осуществления, в дополнение или в качестве альтернативы замене (заменам) или мутации (мутациям) в петле FG, специалист в данной области техники может осуществить изобретение путем добавления аминокислот к С-концу белка ORF2 PCV3. Без удлинения или добавления на С-конце белок ORF2 PCV3 может быть в трехмерной структуре скрытым, а не экспонированным, как С-конец других цирковирусных ORF2 или капсидных белков. В вариантах осуществления, где имеется удлинение или добавление С-конца белка ORF2 PCV3, может быть выгодным удлинение или добавление к С-концу белка ORF2 PCV3 с мотивом из другого цирковируса, такого как, например, PCV2. Таким образом, например, специалист в данной области техники может удлинить или добавить к C-концу белка ORF2 PCV3 аминокислоты, обнаруженные на C-конце белка ORF2 PCV2 или капсидного белка, такие как аминокислоты 215-234 или 215-233 белка ORF2 PCV2 или капсидного белка. Специалист в данной области техники может удлинить или добавить к белку ORF2 PCV3 или капсидному белку эпитоп (эпитопы) белка ORF2 PCV2 или капсидного белка. В этой связи следует упомянуть Trible et al., “Antibody Recognition of Porcine Circovirus Type 2 Capsid Protein Epitopes after Vaccination, Infection and Disease, Clinical and Vaccine Immunology 18(5): 749-757 (2011) doi:10.1128/CVI.00418-10 (включен в настоящий документ посредством ссылки). Сообщается, что в PCV2 иммунореактивные области белка ORF2 (капсида) находятся между остатками 47 и 85, 165 и 200 и 200 и 233. Реагирующие на антитела области белка ORF2 (капсида) PCV2 находятся между аминокислотами 23 и 43, 71 и 85, 117 и 131, а также 171 и 202. Область белка ORF2 (капсида) PCV2, состоящая из аминокислот с 117 по 131, считается доминирующей областью распознавания антителами, а аминокислоты 156–162, 175–192, 195–202 и 228–223 считаются связанными с распознаванием антителами. Другой эпитоп белка ORF2 (капсида) PCV2 представляет собой 169-STIDYFQPNNKR, например, аминокислоты 169-180 (где аминокислотные остатки Y-173, F-174, Q-175 и K-179 могут способствовать распознаванию антителами). Другими эпитопами белка ORF2 (капсида) PCV2 могут быть аминокислоты 43-233, 43-135, 43-160, 91-160, 43-180, 160-233, 135-233 и 91-233, а также аминокислоты 169-188. Любой из них или любая комбинация этих эпитопов ORF2 PCV2 может быть удлинением С-конца или добавлением к белку ORF2 (капсиду) PCV3. В этом отношении упоминается, что удлинение С-конца ORF2 PCV3 может составлять до примерно 200 аминокислот, или примерно до 190 аминокислот, или примерно до 185 аминокислот, или примерно до 180 аминокислот, или примерно до 175 аминокислот, или примерно до 170 аминокислот, или примерно до 165 аминокислот, или примерно до 160 аминокислот, или примерно до 155 аминокислот, или примерно до 150 аминокислот, или примерно до 145 аминокислот, или примерно до 140 аминокислот, или примерно до 135 аминокислот, или примерно до 130 аминокислот, или примерно до 125 аминокислот, или примерно до 120 аминокислот, или примерно до 115 аминокислот или примерно до 110 аминокислот, или примерно до 105 аминокислот, или примерно до 100 аминокислот, примерно до 90 аминокислот, или примерно до 80 аминокислот, или примерно до 70 аминокислот, или примерно до 60 аминокислот, или примерно до 50 аминокислот, или примерно до 40 аминокислот, или примерно до 30 аминокислот в длину; например, от 1-50 аминокислот, или 10-50 аминокислот, или 10-40 аминокислот, или от 20 до 40 аминокислот, или примерно 30 аминокислот в длину.

В вариантах осуществления, где композиция содержит белок ORF2 (капсид) PCV3 по изобретению, например, такой белок, который был мутирован, например, где мутация включает добавление или удлинение С-конца, например, где добавление или удлинение С-конца включает эпитоп (эпитопы) белка ORF2 (капсида) PCV2, и композиция также включает белок ORF2 (капсид) PCV2 (например, для однократного введения против PCV2 и PCV3 или по показаниям, ими обусловленными, или для лечения симптомов или состояния, например, каждый может быть получен бакуловирусной экспрессией, например, отдельно или с одним или несколькими антигенами патогена свиней, такими как антиген (антигены) или патоген (патогены) свиньи, раскрытые в данном изобретении), причем может быть предпочтительно, чтобы эпитоп (эпитопы) белка ORF2 (капсида) PCV2 были из филогенетической ветви, которая является такой же или отличной от филогенетической ветви белка ORF2 (капсида) PCV2, включенного в композицию. Например, если компонент белка ORF2 (капсида) PCV2 происходит из штаммов PCV2a (на котором основан Ingelvac CircoFlex), может быть предпочтительно, чтобы добавление или удлинение капсидного белка ORF2 PCV3 (C-конец) происходило из другой филогенетической ветви, например, из генотипа PCV2b, PCV2c или PCVd-mPCV2b. В связи с генотипами, штаммами или филогенетической ветвью PCV2 следует упомянуть Franzo et al., «Revisiting the taxonomical classification of Porcine Circovirus type w (PCV2): still a real challenge», Virol J 12: 131 (2015) doi: 10.1186/s12985-015-0361-x (включено в настоящую заявку посредством ссылки). Может быть предпочтительно, чтобы добавление или удлинение С-конца капсидного белка ORF2 PCV3 было той же филогенетической ветви, штамма или генотипа, что и компонент капсидного белка ORF2 PCV2 композиции, или другой филогенетической ветви, штамма или генотипа, но представляло эпитоп капсидного белка ORF2 PCV2, который обеспечивает иммунологический ответ против одной или нескольких филогенетических ветвей, штаммов или генотипов PCV2. В связи с вышеизложенным, и в более общем плане, в связи с мутантными капсидными белками ORF2 PCV3 по настоящему изобретению, обсуждаемыми повсеместно в данном описании, изобретение охватывает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие такие мутантные капсидные белки ORF2 PCV3, векторы, такие как бакуловирусные векторы (см. ЕР 2460821 A2, включенный в настоящее описание посредством ссылки, вместе с документами, цитируемыми в нем, в части способов и материалов для экспрессии капсидного белка ORF2 PCV2 с помощью бакуловирусной системы экспрессии, который можно использовать для осуществления настоящего изобретения для экспрессии капсидного белка ORF2 PCV3, включая такие мутантные белки, как описаны в настоящей заявке, а также капсидный белок ORF2 PCV2, если необходимо включить его в композицию по настоящему изобретению), содержащие такие молекулы нуклеиновых кислот, и способы получения или экспрессии таких мутантных капсидных белков ORF2 PCV3 по настоящему изобретению, например, с помощью инфицирования или трансфекции соответствующих клеток вектором (например, если вектор является бакуловирусом, соответствующая клетка может быть клеткой насекомого, или клеткой Sf, или клеткой Sf+; см. EP 2 460 821 A2, включенный в настоящее описание посредством ссылки, вместе с документами, цитируемыми в нем). Предпочтительно извлекать или выделять белок после экспрессии или продукции, например, путем отделения твердых веществ и сохранения жидкой части или надосадочной жидкости, которая содержит растворимый белок (например, VLP). Композиции, обсуждаемые в этом абзаце, а также во всем этом описании, могут содержать мутантный капсидный белок ORF2 PCV3 (и при необходимости дополнительно капсидный белок ORF2 PCV2 и/или один или несколько дополнительных антигенов патогена свиней) в количествах, обсуждаемых в данном описании, и могут вводиться в режиме (режимах), как обсуждается в данном описании, например, в виде единственной или однократной дозы, и могут вводиться таким образом свиньям или поросятам, как обсуждается в настоящем описании.

В контексте изобретения белок по настоящему изобретению в качестве антигена в композиции, такой как иммунологическая композиция, предотвращает или лечит связанное с инфекцией PCV3 заболевание или состояние у субъекта, например, путем индукции, стимуляции или усиления иммунного ответа против PCV3.

Предыдущие исследования показали, что экспрессия полноразмерного гена кэпа PCV3 и NLS-доменов, присутствующих в N-концевом мотиве, богатом аргинином (ARM), может вызывать неправильное сворачивание белка и индуцировать образование кольцевых вирусных комплексов размером 10-12 нм (Sarker et al. Nat Commun. 2016 Oct 4; 7():13014). Wang et al. (AMB Expr 10, 3 (2020) https://doi.org/10.1186/s13568-019-0940-0) сообщил о способности VLP PCV3 к самосборке, при этом он был успешно экспрессирован в E. coli и применен при разработке ИФА для тестирования специфических антител в клинической сыворотке свиней. В частности, для достижения высокого уровня экспрессии рекомбинантного Cap PCV3 в E. coli, ген полного Cap дикого типа (wt-eCap) был амплифицирован из клинических образцов, и три оптимизированных целых фрагмента Cap (opti-eCap) и один оптимизированный фрагмент гена Cap с удаленным сигналом ядерной локализации (NLS) (opti-dCap), кодирующие ту же аминокислотную последовательность, что и wt-eCap, были синтезированы с учетом предпочтительных кодонов E. coli. В отличие от настоящего изобретения, если не принимать во внимание NLS капсида PCV3, указанные области не разрабатывались с прицелом на сборку и/или стабильность VLP. Кроме того, удаление NLS не обязательно приводит к улучшению сборки VLP. Однако варианты осуществления изобретения могут включать удаление или изменение капсидного белка NLS ORF2 PCV3, например, в дополнение к одной или нескольким мутациям петли FG и/или удлинению (удлинениям) С-конца, обсуждаемым в настоящей заявке.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение охватывает мутантные области, кодирующие положительно заряженные аминокислоты в белках PCV, таких как капсидный белок PCV3, но не ограничиваясь им. В частности, капсид PCV3 содержит большое количество положительного заряда в петле FG, которая находится на границе раздела 5 складки капсида PCV3. Большое количество положительного заряда в этой области может привести к появлению сил отталкивания в отсутствии нуклеиновой кислоты, как и следовало ожидать от VLP. В одном варианте осуществления изобретения положительно заряженные аминокислоты мутируют на нейтральные и/или отрицательно заряженные аминокислоты. В предпочтительном варианте осуществления лизины и гистидин в этой петле мутированы на аминокислоты из капсида PCV2 (SEQ ID NO: 6).

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к сконструированному белку ORF2 PCV3, содержащему уменьшенные количества положительно заряженных аминокислот по сравнению с нети-мышинышининженерным белком ORF2 PCV3. Несконструированный белок может быть белком ORF2 PCV3 дикого типа или природным белком, или может быть белком ORF2, уже модифицированным для другой цели, для которой необходимо улучшить активность образования капсида, например, улучшить самосборку в присутствии или при отсутствии упаковываемого полинуклеотида.

В одном из вариантов осуществления одна или несколько положительно заряженных аминокислот являются замещенными, например, одно или несколько из лизина, аргинина или гистидина, или их комбинации. В одном варианте осуществления заменены две или более положительно заряженных аминокислот. В одном варианте осуществления заменены три или более положительно заряженных аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления заряд, связанный с областью белка ORF2, такой как петля FG, но не ограничиваясь этим, становится более отрицательным путем замены одной или нескольких отрицательно заряженных аминокислот. В некоторых вариантах осуществления положительно заряженные аминокислоты заменены аминокислотами, которые заряжены менее положительно, и/или положительно заряженные аминокислоты заменены аминокислотами, заряженными более отрицательно. То есть заряд области ORF2 может быть получен путем изменения за счет удаления положительного заряда, добавления отрицательного заряда, или того и другого.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение включает добавление дополнительных аминокислот к белкам PCV, таким как капсидный белок PCV3, но не ограничиваясь этим. Короткая длина гидрофобного С-конца капсида PCV3 может привести к тому, что С-конец будет скрыт в капсиде, и может привести к нестабильности VLP в отсутствии нуклеиновой кислоты. В противоположность этому, C-конец капсидных белков PCV2 и BFDV выступает из капсида. В одном варианте осуществления С-конец капсида PCV3 удлиняют примерно на 1-50 аминокислот, примерно на 10-40 аминокислот или примерно на 20-30 аминокислот. В другом варианте осуществления C-конец капсида PCV3 удлиняют примерно на 20, примерно на 21, примерно на 22, примерно на 23, примерно на 24, примерно на 25, примерно на 26, примерно на 27, примерно на 28, примерно на 29, примерно на 30, примерно на 31, примерно на 32, примерно на 33, примерно на 34, примерно на 35, примерно на 36, примерно на 37, примерно на 38, примерно на 39 или примерно на 40 аминокислот. В предпочтительном варианте осуществления C-конец капсидного белка PCV3 удлиняют путем мутации стоп-кодона. В особо предпочтительном варианте осуществления природный стоп-кодон для капсидного белка PCV3 мутирован, и С-конец удлинен до следующего стоп-кодона в последовательности вируса (SEQ ID NO: 7). В другом варианте осуществления C-конец капсида PCV может быть удлинен и/или заменен на C-конец других цирковирусов свиней. C-конец капсидного белка PCV3 может быть увеличен по длине примерно от 50 до 200 аминокислот, примерно от 60 до 190 аминокислот, примерно от 70 до 180 аминокислот, примерно от 80 до 170 аминокислот, примерно от 90 до 160 аминокислот, или примерно от 100 до 150 аминокислот.

В некоторых вариантах осуществления C-концевое удлинение включает добавление аминокислот на C-конце капсида PCV3, например, путем мутации стоп-кодона. Стоп-кодон можно мутировать путем делеции, замены или вставки. В некоторых вариантах осуществления C-концевое удлинение включает вставку аминокислот рядом с C-концом, включая вставку аминокислот с одним остатком от C-конца, или двумя остатками от C-конца, или тремя остатками, или четырьмя остатками, или пятью остатками, или шестью, или семью, или восемью, или более остатками перед С-концом, но не ограничиваясь этим. В одном варианте остатки могут представлять собой любой набор отрицательно заряженных аминокислот.

Следует понимать, что белки по изобретению могут отличаться от точных последовательностей, проиллюстрированных и описанных в настоящей заявке. Таким образом, изобретение предусматривает делеции, добавления и замены в показанных последовательностях до той степени, при которой эти последовательности все еще функционируют в соответствии со способами изобретения. В связи с этим особо предпочтительные замены обычно носят консервативный характер, т.е. такие замены, которые происходят в пределах семейства аминокислот. Например, аминокислоты обычно делятся на четыре семейства: (1) кислые - аспартат и глутамат; (2) основные - лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные - аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан, и (4) незаряженные полярные - глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда классифицируют как ароматические аминокислоты. Обоснованно предсказуемо, что выделенная или неприродная замена лейцина изолейцином или валином, или, наоборот, аспартата глутаматом, или, наоборот, треонина серином, или, наоборот, или аналогичная консервативная замена аминокислоты структурно родственной аминокислотой не будет иметь большого влияния на биологическую активность. Следовательно, белки, имеющие практически такую же аминокислотную последовательность, что и проиллюстрированные и описанные последовательности, но имеющие минорные аминокислотные замены, которые существенно не влияют на иммуногенность белка, входят в объем данного изобретения.

Данное изобретение также включает нуклеотидные последовательности, кодирующие функционально и/или антигенно эквивалентные варианты и производные антигенов по изобретению и их функционально эквивалентные фрагменты. Эти функционально эквивалентные варианты, производные и фрагменты проявляют способность сохранять антигенную активность. Например, изменения в последовательности ДНК, которые не изменяют кодируемую аминокислотную последовательность, а также те, которые приводят к консервативным заменам аминокислотных остатков, одной или нескольким делециям или добавлениям аминокислот и замене аминокислотных остатков на аминокислотные аналоги, являются такими, которые не оказывают существенного влияния на свойства кодируемого полипептида. Консервативные аминокислотные замены - глицин/аланин; валин/изолейцин/ лейцин; аспарагин/глутамин; аспарагиновая кислота/глутаминовая кислота; серин/ треонин/метионин; лизин/аргинин, и фенилаланин/тирозин/триптофан. В одном варианте осуществления варианты содержат по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96 %, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% гомологии или идентичности с представляющим интерес антигеном, эпитопом, иммуногеном, пептидом или полипептидом.

В некоторых вариантах осуществления замена вводит консервативное изменение, которое заменяет аминокислоту другой аминокислотой с аналогичной химической структурой, аналогичными химическими свойствами или аналогичным объемом боковой цепи. Введенные аминокислоты могут иметь полярность, гидрофильность или гидрофобность, сходную с аминокислотами, которые они заменяют. Консервативные замены аминокислот хорошо известны в данной области техники. Если аминокислоты имеют сходную полярность, это также можно определить по шкале гидрофобности для боковых цепей аминокислот.

Консервативные аминокислотные изменения также могут быть определены посредством ссылки на семейство оценочных матриц Point Accepted Mutation (PAM) или BLOcks Substitution Matrix (BLOSUM) для сохранения аминокислотной последовательности. Таким образом, консервативные аминокислотные изменения могут быть членами группы эквивалентности, представляющей собой набор аминокислот, имеющих взаимно положительные оценки в представлении сходства оценочной матрицы, выбранной для использования при выравнивании эталонных и мутантных полипептидных цепей.

Следует понимать, что неполярные аминокислоты включают аминокислоты с алифатическими боковыми цепями и аминокислоты с ароматическими боковыми цепями. Аминокислота пролин классифицируется как неполярная, но она также обладает свойством жесткости и может вызывать изменения во вторичной структуре. Например, пролины часто находятся на концах спиралей. Кроме того, в зависимости от конкретного контекста боковой цепи данного аминокислотного остатка, например, аминокислоты тирозина, обычно классифицируемого как неполярный из-за его ароматического кольца, может иметь функциональные эффекты, аналогичные полярным аминокислотным остаткам, таким как треонин через его гидроксильную группу. Таким образом, для целей изобретения тирозин можно рассматривать как неполярную, так и полярную аминокислоту. Кроме того, аминокислоты, которые описываются как полярные или гидрофильные, могут быть незаряженными или заряженными, а также могут быть основными или кислотными. Хорошо известно, что аминокислота гистидин имеет значение pKa около 7, так что при нейтральном pH в зависимости от белковой среды он может быть протонирован или не протонирован на своей боковой цепи и, таким образом, может нести или не нести заряд. Таким образом, для целей изобретения гистидин можно рассматривать как полярно заряженный или полярный незаряженный аминокислотный остаток.

Обсуждаемые здесь мутации обычно вводят в белок с использованием способов, известных в данной области техники, таких как сайт-направленный мутагенез белка, ПЦР и способы перетасовки генов, или с использованием множественных мутагенных олигонуклеотидов в циклах сайт-направленного мутагенеза. Таким образом, мутации могут вводиться направленным или случайным образом. Таким образом, способ мутагенеза дает один или несколько полинуклеотидов, кодирующих один или несколько различных мутантов.

Разработка рекомбинантного бакуловируса, содержащего ген ORF2 свиного цирковируса 3, под контролем бакуловирусного полиэдринового промотора (BaculoG/PCV3 ORF2 Clone 4B4-2E12 Pre-MSV p8; лот № 3624-039) описана в примере 1. В некоторых вариантах осуществления использование такого рекомбинантного бакуловируса, описанного в примере 1, в вакцине может включать убитые и/или инактивированные версии рекомбинантного вируса. Альтернативно, в некоторых вакцинах рекомбинантный вирус, например, подобный тому, который показан в примере 1, может использоваться как живой модифицированный вирус.

На фиг.1B представлена последовательность ORF2 рекомбинантного бакуловируса BaculoG/PCV3, SEQ ID NO: 2. Аннотации для основных последовательностей взяты из записи Genbank NC_001623. Специалист в данной области техники поймет, что от конструкции к конструкции следует ожидать незначительные мутации в основной цепи, учитывая сложность последовательности ДНК. Карта конструкции показана на фиг.2. Вектор экспрессии бакуловируса, BaculoG/PCV3 ORF2, может быть использован для разработки вакцин против PCV3 и/или контролей. Предпочтительные адъюванты для данной вакцины и/или контроля могут различаться в зависимости от типа используемого вектора экспрессии, например, для живой, живой модифицированной, инактивированной или убитой вакцины. Эффективность адъюванта может варьировать в зависимости от статуса используемого вектора (например, вируса). Количество адъюванта, используемого в вакцине, может быть заранее определено, например, заранее определенный процент может быть выбран так, чтобы он находился в заданном диапазоне (например, массовый процент и/или объемный процент в вакцине) для данного адъюванта и/или комбинации адъювантов. В некоторых случаях, например, при использовании живых вакцин можно использовать несколько адъювантов. Например, в некоторых вариантах осуществления может использоваться комбинация адъювантов, таких как карбопол и Montanide ISA 207VG. Альтернативно, вакцина, которая включает живой вектор экспрессии, такой как BaculoG/PCV3 ORF2, может быть дополнена адъювантом ISA 207VG и/или карбополом. Например, адъювант может присутствовать в вакцине в заранее определенной концентрации. Например, вакцина может содержать ISA 207VG в концентрации 50% от массы вакцины. Альтернативно, другая вакцина, включающая живую ORF2 BaculoG/PCV3, может включать адъювант, такой как карбопол, в количестве 20% от объема вакцины.

Вакцины, которые включают убитые векторы экспрессии, такие как вирусы, могут включать карбопол в качестве адъюванта. Например, вакцина, которая включает убитый ORF2 BaculoG/PCV3, может в некоторых вариантах осуществления включать карбопол в качестве эффективного адъюванта. Например, такая вакцина может включать заранее определенное количество адъюванта, например, заранее определенный массовый или объемный процент вакцины. В частности, вакцина, которая включает убитый ORF2 BaculoG/PCV3, может включать карбопол в количестве 20% от объема вакцины. В качестве альтернативы вакцина может включать убитый ORF2 BaculoG/PCV3 и адъювант в количестве примерно 50% от массы раствора вакцины. Например, вакцина, которая включает убитый BaculoG/PCV3 ORF2, может включать ISA 207VG в качестве адъюванта в предварительно определенном массовом проценте вакцины, таком как пятьдесят процентов.

Например, бакуловирусный вектор экспрессии BaculoG/PCV3 ORF2 был использован для разработки двух вакцин против PCV3 и контроля, как описано в настоящей заявке.

Разработка BaculoG/PCV3 ORF2, P9; живой вакцины с адъювантом 50% ISA 207VG (способы, использованные для разработки вакцины, раскрыты в примере 3).

Разработка BaculoG/PCV3 ORF2, P9; живой вакцины с адъювантом 20% карбополом (способы, использованные для разработки вакцины, раскрыты в примере 4).

Разработка контроля - BaculoG/без вставки, P4; живой вакцины с адъювантом 20% карбополом (способы, использованные для разработки вакцины, раскрыты в примере 5).

Разработка BaculoG/PCV3 ORF2, P9; убитой вакцины с адъювантом 50% ISA 207VG (способы, использованные для разработки вакцины, раскрыты в примере 3).

Разработка BaculoG/PCV3 ORF2, P9; убитой вакцины с адъювантом 20% карбополом (способы, использованные для разработки вакцины, раскрыты в примере 4).

Разработка контроля - BaculoG/без вставки, P4; убитой вакцины с адъювантом 20% карбополом (способы, использованные для разработки вакцины, раскрыты в примере 5).

Эффективность вакцин можно тестировать с использованием целого вируса PCV3 и ткани, положительной по результатам ПЦР (небольшое количество). Гомогенаты из тканей могут быть получены и секвенированы. Гомогенаты и/или целый вирус можно использовать для заражения вакцинированных животных.

Например, для того, чтобы проверить эффективность вакцин, были предоставлены целый вирус PCV3 и ПЦР-положительная ткань (небольшое количество). Были получены и секвенированы гомогенаты из тканей. Гомогенаты и целый вирус использовали для заражения вакцинированных животных.

Вакцина с субъединицей рекомбинантного белка ORF2 PCV3 и/или иммуногенная композиция из настоящего изобретения может быть получена с использованием способа из WO 2006/072065, пример 1, модифицированного для экспрессии белка ORF2 PCV3 (а не белка ORF2 PCV2).

Кодирующая последовательность ORF2 PCV3 может быть амплифицирована с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) из геномной ДНК PCV3 и/или синтетической ORF2 PCV3. Сайты рестрикции можно использовать для вставки необходимой кодирующей последовательности в вектор переноса. Например, в некоторых вариантах осуществления амплифицированная кодирующая последовательность ORF2 PCV3 может включать консенсусную последовательность Козака (см., например, Kozak M (October 1987) Nucleic Acids Res. 15 (20): 8125-8148) сразу за 5' стартового кодона вместе с фланкирующими сайтами рестрикционных ферментов.

В некоторых вариантах осуществления амплифицированная кодирующая последовательность ORF2 PCV3 может быть субклонирована в бакуловирусный вектор переноса с использованием фланкирующих сайтов рестрикции для создания необходимого вектора переноса. Например, амплифицированная кодирующая последовательность ORF2 PCV3 может быть субклонирована в бакуловирусный вектор переноса с использованием фланкирующих сайтов рестрикции для создания векторов переноса, таких как ORF2 pVL1392-PCV3 или ORF2 pVL1393-PCV3. Могут использоваться другие векторы переноса, широко известные в данной области техники. Рекомбинантный бакуловирус может быть получен путем котрансфекции клеток насекомых вектором переноса и ДНК бакуловируса. Используемая ДНК бакуловируса может включать линеаризованную и/или кольцевую ДНК бакуловируса. Например, в одном из вариантов осуществления рекомбинантный бакуловирус может быть получен путем котрансфекции клеток насекомых Sf9 (Spodoptera frugiperda) вектором переноса (например, таким как pVL1392-PCV3 ORF2 и/или pVL1393-PCV3) и линеаризованной ДНК бакуловируса BaculoGoldTM. Линеаризованная ДНК бакуловируса может происходить из вируса ядерного полиэдроза Autographa californica (AcNPV) и может содержать летальную делецию в локусе полиэдрина, поэтому сохранение жизнеспособного бакуловируса может быть произведено при котрансфекции вектором переноса, таким как pVL1392-PCV3. ORF2 и/или pVL1393-PCV3 ORF2. Полученный рекомбинантный бакуловирус может включать кодирующую последовательность ORF2 PCV3 под контролем полиэдринового промотора бакуловируса. Рекомбинантный бакуловирус можно амплифицировать в клетках насекомых Sf9 и затем очистить путем клонирования с лимитирующими разведениями на клетках насекомых Sf9. В некоторых вариантах осуществления может использоваться полноразмерная кольцевая ДНК бакуловируса, такая как Bac-to-Bac. Например, Bac-to-Bac может использовать опосредованную транспозоном рекомбинацию для вставки интересующего гена в полиэдриновый локус. Также можно использовать другие способы, известные в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления способ может быть выбран с учетом потенциальной воспроизводимости способа во время коммерциализации. Например, могут быть выбраны бакуловирусы, которые придают вакцине повышенную стабильность.

В некоторых вариантах осуществления после посева во флаконы с культурой основных клеток флаконы можно инкубировать при заданной температуре и в течение определенного периода времени. Например, культуру можно инкубировать при 27°C в течение четырех часов. Затем в каждую колбу можно засеять рекомбинантный бакуловирус, содержащий ген ORF2 PCV3. Например, плазмида pVL1392, содержащая ген ORF2 PCV3, может быть котрансфицирована ДНК бакуловируса BaculoGold® (BD Biosciences Pharmingen) в клетках насекомых Sf+ (Protein Sciences, Мериден, Коннектикут) для получения рекомбинантного бакуловируса, содержащего ген ORF2 PCV3. Рекомбинантный бакуловирус, содержащий ген ORF2 PCV3, может быть очищен от бляшек, и исходный вакцинный вирус (MSV) может быть размножен на линии клеток SF+, разделен на аликвоты и хранится при -70°C. MSV может быть положительно идентифицирован как бакуловирус ORF2 PCV3 с помощью ПЦР-ПДРФ с использованием праймеров, специфичных для бакуловируса. Клетки насекомых, инфицированные бакуловирусом ORF2 PCV3 для генерации MSV или рабочего вируса для посева, могут экспрессировать антиген ORF2 PCV3, выявляемый поликлональной сывороткой или моноклональными антителами в непрямом флуоресцентном анализе антител. Кроме того, идентичность бакуловируса ORF2 PCV3 может быть подтверждена N-концевым аминокислотным секвенированием. Бакуловирус MSV ORF2 PCV3 также тестируют на чистоту в соответствии с 9 C.F.R., Разделы 113.27(c), 113.28 и 113.55. Каждый рекомбинантный бакуловирус, засеянный во флаконы с перемешиванием, может иметь различную множественность инфицирования (MOI).

После посева бакуловируса флаконы можно инкубировать при 27±2°C в течение 7 дней, а также в течение этого времени можно перемешивать со скоростью 100 об./мин. Во флаконах можно использовать вентилируемые колпачки для обеспечения потока воздуха. Образцы из каждого флакона можно брать каждые 24 часа в течение следующих 7 дней. После экстракции каждый образец можно центрифугировать, отделить осадок и надосадочную жидкость, а затем подвергнуть микрофильтрации через мембрану с размером пор 0,45-1,0 мкм.

Количество ORF3 в полученных образцах затем может быть определено количественно с помощью ИФА. Анализ ИФА можно проводить с антителом против PCV3, разведенным до 1:6000 в 0,05 М карбонатном буфере (pH 9,6). Затем 100 мкл антитела можно поместить в лунки планшета для микротитрования, закрыть и инкубировать в течение ночи при 37°С. Затем планшет трижды промывают промывочным раствором, который содержит 0,5 мл Твин 20 (Sigma, Сент-Луис, Миссури), 100 мл 10 D-PBS (Gibco Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) и 899,5 мл дистиллированной воды. Затем в каждую лунку добавляют 250 мкл блокирующего раствора (5 г обезжиренного сухого молока (Nestle, Глендейл, Калифорния) в 10 мл D-PBS QS на 100 мл с дистиллированной водой). Следующим шагом является промывание тестового планшета и добавление предварительно разведенного антигена. Предварительно разведенный антиген получают путем добавления 200 мкл раствора разбавителя (0,5 мл Твин 20 в 999,5 мл фосфатно-солевой буфер Дульбекко (D-PBS)) в каждую лунку на планшете для разведения. Затем образец разбавляют в соотношении 1:240 и 1:480, и затем 100 мкл каждого из этих разбавленных образцов добавляют в одну из верхних лунок на планшете для разведения (т.е. в одну верхнюю лунку помещают 100 мкл разведения 1:240, а в другую лунку 100 мкл разведения 1:480). Затем можно выполнить последовательные разведения для оставшейся части планшета, удалив 100 мкл из каждой последующей лунки и перенеся их в следующую лунку на планшете. В каждой лунке осуществляют перемешивание перед следующим переносом. Промывание тестового планшета включает трехкратное промывание планшета промывочным буфером. Затем планшет герметично закрывают и инкубируют в течение часа при 37°C, а затем еще трижды промывают промывочным буфером. Используемое антитело для обнаружения представляет собой антитело к ORF2 PCV. Его разбавляют до 1–300 в растворе разбавителя, и затем в лунки добавляют 100 мкл разведенного проявляющего антитела. Затем планшет герметично закрывают и инкубируют в течение часа при 37°C перед трехкратным промыванием промывочным буфером. Затем готовят разбавитель для конъюгата, добавляя нормальную кроличью сыворотку (Jackson Immunoresearch, Вест-Гроув, Пенсильвания) к раствору разбавителя до концентрации 1%.

Конъюгат антитных способовмышиного козьего антитела (H+1) и пероксидазы хрена (Jackson Immunoresearch) разводят в разбавителе для конъюгата до 1:10 000. Затем в каждую лунку добавляют 100 мкл разведенного конъюгата антител. Затем планшет герметично закрывают и инкубируют в течение 45 минут при 37°C перед трехкратным промыванием промывочным буфером. В каждую лунку добавляют 100 мкл субстрата (TMB Peroxidase Substrate, Kirkgaard and Perry Laboratories (KPL), Гейтерсберг, Мэриленд), смешанного с равным объемом пероксидазного субстрата B (KPL). Планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут. Затем во все лунки добавляют 100 мкл раствора 1 н HCl, чтобы остановить реакцию. Затем планшет пропускают через считывающее устройство для ИФА.

Предпочтительные клетки насекомых можно культивировать и продуцировать белок ORF2 PCV3 в бессывороточных условиях, например, бессывороточные клетки насекомых согласно US 6 103 526 (линия клеток expresSF+).

Предусмотрены адъюванты, надосадочные жидкости клеточных культур, консерванты, стабилизирующие агенты, вирусные векторы, иммуномодулирующие агенты и дозировки, раскрытые в патентах США № 9610345 и 9669087, оба включены в настоящее описание посредством ссылки.

Используемая в настоящей заявке иммуногенная композиция эффективна для индукции иммунного ответа против PCV3 и предотвращения, снижения и/или уменьшения тяжести клинических симптомов, связанных с инфекцией PCV3. Композиция обычно содержит по меньшей мере один антиген PCV3.

PCV3 у молодых свиней может проявлять широкий спектр симптомов, и во многих случаях отдельные животные проявляют лишь небольшую часть потенциальных симптомов. Симптомы, связанные с присутствием PCV3, включают виремию, выделение вируса, например, присутствие вирусных нуклеиновых кислот в выделениях из организма, таких как молозиво, молоко, фекалии, слюна и мазки из глаз. Например, Jiang et al., «Induction of porcine dermatitis and nephropathy syndrome in piglets by infection with porcine circovirus type 3», J. Virol. doi:10.1128/JVI.02045-18, описание которого включено в качестве ссылки, относится к инокуляции поросят PCV3 и наблюдению за результирующими клиническими признаками. Настоящее изобретение относится к лечению и/или уменьшению симптомов дерматита свиней и синдрома нефропатии (PDNS)-подобного заболевания свиней, лимфоцитарной дисплазии и некроза у свиней, вызванных PCV3, путем введения композиции по изобретению.

Простое присутствие антител, особенно у молодых свиней или поросят, например, свиней или поросят в возрасте менее 15 недель, например, в возрасте менее 10 недель, например, в возрасте менее 6 недель, например, менее 3, 2 или 1 недели или при рождении, может не указывать на контакт с PCV3 и/или заболевание. Молодые свиньи или поросята, которые подверглись воздействию и/или имеют антитела против PCV3, все еще могут получить пользу от композиций согласно настоящему описанию, например, за счет уменьшения, предотвращения или снижения тяжести симптомов.

Таким образом, композиции согласно настоящему описанию могут быть использованы в способах индукции иммунного ответа, который может быть защитным иммунным ответом, а также в способах уменьшения или предотвращения, или снижения тяжести симптомов, а также в дозировках, составах и тому подобном для уменьшения, предотвращения или снижения тяжести симптомов, как и для способов вызова иммунного ответа. Таким образом, в настоящей заявке, где описаны способы индукции иммунного ответа, эти способы можно применять на практике для уменьшения, предотвращения или снижения тяжести симптомов, и описанные здесь композиции, которые полезны для индукции иммунного ответа, также применимы и для композиций, предназначенных для уменьшения, предотвращения или снижения тяжести симптомов (а также в качестве композиций для индукции иммунного ответа).

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящей заявке, имеют те же значения, которые обычно понимаются рядовым специалистом в области техники, к которой принадлежит это изобретение. Используемый здесь термин «иммуногенная композиция» относится к любой фармацевтической композиции, содержащей антиген PCV3, и эта композиция может быть использована для предотвращения или лечения заболевания или состояния, связанного с инфекцией PCV3, у субъекта. Предпочтительная иммуногенная композиция может индуцировать, стимулировать или усиливать иммунный ответ против PCV3. Таким образом, термин охватывает как субъединичные иммуногенные композиции, как описано ниже, так и композиции, содержащие полностью убитый или ослабленный и/или инактивированный PCV3.

Термин «субъединичная иммуногенная композиция» в контексте настоящего описания относится к композиции, содержащей по меньшей мере один иммуногенный полипептид или антиген, но не все антигены, происходящие от антигена из PCV3 или гомологичные ему. Такая композиция практически не содержит интактного PCV3. Таким образом, «субъединичную иммуногенную композицию» получают из по меньшей мере частично очищенных или фракционированных (предпочтительно в значительной степени очищенных) иммуногенных полипептидов из PCV3 или их рекомбинантных аналогов. Субъединичная иммуногенная композиция может содержать субъединичный антиген или представляющие интерес антигены, по существу свободные от других антигенов или полипептидов из PCV3, или во фракционированной форме. Предпочтительная иммуногенная субъединичная композиция включает белок ORF2 PCV3, как описано ниже.

«Иммунологический или иммунный ответ» на композицию или вакцину представляет собой развитие у хозяина клеточного и/или опосредованного антителами иммунного ответа на интересующую композицию или вакцину. Обычно «иммунный ответ» включает один или несколько из следующих эффектов: выработка или активация антител, В-клеток, хелперных Т-клеток, супрессорных Т-клеток и/или цитотоксических Т-клеток и/или γδ T клеток, специально направленных на антиген или антигены, включенные в интересующую композицию или вакцину, но не ограничивается этим. Предпочтительно, чтобы хозяин проявлял либо терапевтический, либо защитный иммунологический ответ, так что устойчивость к новой инфекции будет увеличиваться, и/или будет уменьшаться клиническая тяжесть заболевания. Такая защита будет продемонстрирована либо уменьшением количества или тяжести, либо отсутствием одного или нескольких симптомов, связанных с инфекциями PCV3, как описано выше.

Термины «иммуногенный» белок или полипептид, или «антиген» в контексте настоящего описания относятся к аминокислотной последовательности, которая вызывает иммунологический ответ, как описано выше. «Иммуногенный» белок или полипептид, как здесь используется, включает полноразмерную последовательность любых белков PCV3, их аналогов или их иммуногенных фрагментов. Термин «иммуногенный фрагмент» относится к фрагменту белка, который включает один или несколько эпитопов и, таким образом, вызывает иммунологический ответ, описанный выше. Такие фрагменты можно идентифицировать с использованием любого количества способов картирования эпитопов, хорошо известных в данной области техники. См., например, «Epitope Mapping Protocols» in «Methods in Molecular Biology», Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, N.J. Например, линейные эпитопы могут быть определены путем одновременного синтеза большого количества пептидов на твердых носителях, где пептиды соответствуют частям белковой молекулы, и взаимодействия пептидов с антителами, пока пептиды все еще прикреплены к подложкам. Такие способы известны в данной области техники и описаны, например, в патентах США 4,708,871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715, все они включены в настоящую заявку посредством ссылки. Точно так же конформационные эпитопы легко идентифицируются путем определения пространственной конформации аминокислот, например, с помощью рентгеновской кристаллографии и 2-мерного ядерного магнитного резонанса. См., например, Epitope Mapping Protocols, выше.

Синтетические антигены также включены в определение, например, полиэпитопы, фланкирующие эпитопы и другие рекомбинантные или синтетические антигены. См., например, Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781; Bergmann et al. (1996), J. Immunol. 157:3242-3249; Suhrbier, A. (1997), Immunol. and Cell Biol. 75:402-408; Gardner et al., (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, Jun. 28-Jul. 3, 1998.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения обеспечивается иммуногенная композиция, которая индуцирует иммунный ответ и, более предпочтительно, обеспечивает защитный иммунитет против клинических признаков инфекции PCV3. Композиция наиболее предпочтительно содержит полипептид или его фрагмент, экспрессируемый ORF2 PCV3, в качестве антигенного компонента композиции. ДНК и белок ORF2 PCV3, используемые в настоящей заявке для приготовления композиций и в рамках процессов, представленных в настоящей заявке, представляют собой высоко консервативный домен в изолятах PCV3, и, таким образом, любая ORF2 PCV3 будет эффективна в качестве источника ДНК и/или полипептида ORF2 PCV3, как используется здесь. Предпочтительный белок ORF2 PCV3 транслируется с нуклеотидной последовательности SEQ ID NO. 1. В настоящей заявке представлен предпочтительный полипептид ORF2 PCV3, но специалистам в данной области техники понятно, что эта последовательность может варьироваться в пределах 6-10% по гомологии последовательностей и при этом сохранять антигенные характеристики, которые делают ее полезной в иммуногенных композициях. Более того, антигенная характеристика модифицированного антигена все еще сохраняется, когда модифицированный антиген дает по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 100% защитного иммунитета по сравнению с белком ORF2 PCV3, кодируемым полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1. «Иммуногенная композиция» в контексте настоящего описания означает белок ORF2 PCV3, который вызывает «иммунологический ответ» у хозяина клеточного и/или опосредованного антителами иммунного ответа на белок ORF2 PCV3. Предпочтительно эта иммуногенная композиция способна вызывать или усиливать иммунный ответ против PCV3, тем самым обеспечивая защитный иммунитет против инфекции PCV3 и снижая частоту, тяжесть или предотвращая один или несколько, а предпочтительно все связанные с этим клинические признаки.

В некоторых формах иммуногенные части белка ORF2 PCV3 используются в качестве антигенного компонента в композиции. Используемый здесь термин «иммуногенная часть» относится к усеченным и/или замещенным формам или фрагментам белка ORF2 PCV3 и/или полинуклеотида, соответственно. Предпочтительно такие усеченные и/или замещенные формы или фрагменты будут содержать по меньшей мере 6 смежных аминокислот из полноразмерного полипептида ORF2. Более предпочтительно, усеченные или замещенные формы или фрагменты будут содержать по меньшей мере 10, более предпочтительно по меньшей мере 15 и еще более предпочтительно по меньшей мере 19 смежных аминокислот из полноразмерного полипептида ORF2. Кроме того, понятно, что такие последовательности могут быть частью более крупных фрагментов или усеченных форм.

Другой предпочтительный полипептид ORF2 PCV3, представленный в настоящей заявке, кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1. Однако специалистам в данной области техники понятно, что эта последовательность может варьироваться в пределах 6-20% по гомологии последовательностей и при этом сохранять антигенные характеристики, которые делают её полезной в иммуногенных композициях. В некоторых формах в качестве антигенного компонента в композиции используют усеченную или замещенную форму или фрагмент этого полипептида PVC3 ORF2. Предпочтительно такие усеченные или замещенные формы или фрагменты будут содержать по меньшей мере 18 смежных нуклеотидов из полноразмерной нуклеотидной последовательности ORF2. Более предпочтительно, усеченные или замещенные формы или фрагменты будут иметь по меньшей мере 30, более предпочтительно по меньшей мере 45 и еще более предпочтительно по меньшей мере 57 смежных нуклеотидов полноразмерной нуклеотидной последовательности ORF2, например SEQ ID NO: 1.

«Идентичность последовательности», как известно в данной области техники, относится к взаимосвязи между двумя или более полипептидными последовательностями, или двумя или более полинуклеотидными последовательностями, а именно, эталонной последовательностью и данной последовательностью, которую нужно сравнить с эталонной последовательностью. Идентичность последовательностей определяют путем сравнения данной последовательности с эталонной последовательностью после того, как последовательности были оптимально выровнены для получения наивысшей степени сходства последовательностей, что определяется соответствием между нитями таких последовательностей. После такого выравнивания идентичность последовательностей подтверждают на основе положения за положением, например, последовательности «идентичны» в конкретном положении, если в этом положении нуклеотиды или аминокислотные остатки идентичны. Общее количество таких идентичностей положений затем делят на общее количество нуклеотидов или остатков в эталонной последовательности, чтобы получить процент идентичности последовательности. Идентичность последовательности можно легко вычислить известными способами, включая, помимо прочего, способы, описанные в Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991); and Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988), руководства которых включены в настоящую заявку посредством ссылки. Предпочтительными способами определения идентичности последовательностей являются такие, которые разработаны таким образом, чтобы обеспечить совпадение между тестируемыми последовательностями в наиболее длинном участке. Способы определения идентичности последовательностей кодифицированы в общедоступных компьютерных программах, которые определяют идентичность последовательностей между данными последовательностями. Примеры таких программ включают, помимо прочего, пакет программ GCG Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN and FAS TA (Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990). Программа BLASTX общедоступна в NCBI и других источниках (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, SF et al., J. Molec. Biol., 215: 403-410 (1990), руководства которых включены в настоящее описание посредством ссылки). Эти программы оптимально выравнивают последовательности, используя веса гэпов по умолчанию для получения наивысшего уровня идентичности последовательностей между данной и эталонной последовательностями. В качестве иллюстрации для полинуклеотида, имеющего нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере, например, 85%, предпочтительно 90%, еще более предпочтительно 95% «идентичности последовательности» по отношению к эталонной нуклеотидной последовательности, предполагается, что нуклеотидная последовательность данного полинуклеотида идентична эталонной последовательности, за исключением того, что указанная полинуклеотидная последовательность может включать до 15, предпочтительно до 10, еще более предпочтительно до 5 точечных мутаций на каждые 100 нуклеотидов эталонной нуклеотидной последовательности. Другими словами, в полинуклеотиде, имеющем нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, предпочтительно 90%, еще более предпочтительно 95% идентичности относительно эталонной нуклеотидной последовательности, до 15%, предпочтительно 10%, еще более предпочтительно 5% нуклеотидов в эталонной последовательности может быть удалено или заменено другим нуклеотидом, или количество нуклеотидов до 15%, предпочтительно до 10%, еще более предпочтительно до 5% от общего количества нуклеотидов в эталонной последовательности может быть вставлено в эталонную последовательность. Эти мутации эталонной последовательности могут происходить в 5’- или 3’-концевых положениях эталонной нуклеотидной последовательности или в любом месте между этими концевыми положениями, либо располагаясь по отдельности среди нуклеотидов в эталонной последовательности, либо смежно в одной или нескольких группах в эталонной последовательности. Аналогично, для полипептида, содержащего данную аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере, например, 85%, предпочтительно 90%, еще более предпочтительно 95% идентичности последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью, подразумевается, что данная аминокислотная последовательность полипептида идентична эталонной последовательности, за исключением того, что данная полипептидная последовательность может включать до 15, предпочтительно до 10, еще более предпочтительно до 5 аминокислотных изменений на каждые 100 аминокислот эталонной аминокислотной последовательности. Другими словами, для получения данной полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 85%, предпочтительно 90%, еще более предпочтительно 95% идентичности последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью, до 15%, предпочтительно до 10%, еще более предпочтительно до 5% аминокислотных остатков в эталонной последовательности могут быть удалены или заменены другой аминокислотой, или количество аминокислот до 15%, предпочтительно до 10%, еще более предпочтительно до 5% от общего количества аминокислотных остатков в эталонной последовательности может быть вставлено в эталонную последовательность. Эти изменения эталонной последовательности могут происходить в амино- или карбокси-концевых положениях эталонной аминокислотной последовательности или в любом месте между этими концевыми положениями, либо по отдельности среди остатков в эталонной последовательности, либо вместе в одной или нескольких группах в эталонной последовательности. Предпочтительно, чтобы неидентичные положения остатков различались консервативными аминокислотными заменами. Однако консервативные замены не учитываются при определении идентичности последовательностей.

«Гомология последовательностей» в контексте настоящего описания относится к способу определения родства двух последовательностей. Для определения гомологии последовательностей оптимально выравнивают две или более последовательностей и при необходимости вводят гэпы. Однако, в отличие от «идентичности последовательностей», консервативные аминокислотные замены учитываются как совпадение при определении гомологии последовательностей. Другими словами, для получения полипептида или полинуклеотида, имеющего 95% гомологию последовательности с эталонной последовательностью, 85%, предпочтительно 90%, еще более предпочтительно 95% аминокислотных остатков или нуклеотидов в эталонной последовательности должны соответствовать друг другу или содержать консервативную замену на другую аминокислоту или нуклеотид, или по сравнению с эталонной последовательностью могут быть вставлены аминокислоты или нуклеотиды в количестве до 15%, предпочтительно до 10%, еще более предпочтительно до 5% от общего количества аминокислотных остатков или нуклеотидов, не включая консервативные замены. Предпочтительно гомологичная последовательность включает по меньшей мере удлинение из 50, еще более предпочтительно по меньшей мере 100, еще более предпочтительно по меньшей мере 250 и еще более предпочтительно по меньшей мере 500 нуклеотидов.

«Консервативная замена» относится к замене аминокислотного остатка или нуклеотида другим аминокислотным остатком или нуклеотидом, имеющим аналогичные характеристики или свойства, включая размер, гидрофобность и т.д., так что общая функциональность существенно не изменяется.

«Выделенный» означает преобразованный «руками человека» из своего естественного состояния, то есть, если термин относится к природному элементу, то этот элемент был изменен или удален из своей первоначальной среды, или и то, и другое. Например, полинуклеотид или полипептид, естественно присутствующий в живом организме, не «выделен», но тот же полинуклеотид или полипептид, выделенный из сосуществующих материалов в его естественном состоянии, является «выделенным», как используется здесь этот термин.

Таким образом, иммуногенная композиция, используемая в настоящей заявке, также относится к композиции, которая содержит белок ORF2 PCV3, где указанный белок ORF2 PCV3 представляет собой любой из белков, описанных выше.

Согласно дополнительному аспекту, белок ORF2 PCV3 обеспечивается в иммунологической композиции на уровне включения антигена, эффективном для индукции необходимого иммунного ответа, а именно снижения частоты, уменьшения тяжести или предотвращения одного или нескольких клинических признаков, связанных с инфекцией PCV3. Предпочтительно уровень включения белка ORF2 PCV3 составляет по меньшей мере 0,2 мкг антигена/мл конечной иммуногенной композиции (мкг/мл), более предпочтительно примерно от 0,2 до 400 мкг/мл, еще более предпочтительно примерно от 0,3 до 200 мкг/мл, еще более предпочтительно примерно от 0,35 до 100 мкг/мл, еще более предпочтительно примерно от 0,4 до 50 мкг/мл, еще более предпочтительно примерно от 0,45 до 30 мкг/мл, еще более предпочтительно примерно от 0,6 до 15 мкг/мл, еще более предпочтительно примерно от 0,75 до 8 мкг/мл, еще более предпочтительно примерно от 1,0 до 6 мкг/мл, еще более предпочтительно примерно от 1,3 до 3,0 мкг/мл, еще более предпочтительно примерно от 1,4 до 2,5 мкг/мл, еще более предпочтительно примерно от 1,5 до 2,0 мкг/мл, и наиболее предпочтительно примерно 1,6 мкг/мл.

Согласно дополнительному аспекту, уровень включения антигена ORF2 составляет по меньшей мере 0,2 мкг белка ORF2 PCV3, как описано выше, на дозу конечной антигенной композиции (мкг/дозу), более предпочтительно примерно от 0,2 до 400 мкг/дозу, еще более предпочтительно примерно от 0,3 до 200 мкг/дозу, еще более предпочтительно примерно от 0,35 до 100 мкг/дозу, еще более предпочтительно примерно от 0,4 до 50 мкг/дозу, еще более предпочтительно примерно от 0,45 до 30 мкг/дозу, еще более предпочтительно примерно от 0,6 до 15 мкг/дозу, еще более предпочтительно примерно от 0,75 до 8 мкг/дозу, еще более предпочтительно примерно от 1,0 до 6 мкг/дозу, еще более предпочтительно примерно от 1,3 до 3,0 мкг/дозу, еще более предпочтительно примерно от 1,4 до 2,5 мкг/дозу, еще более предпочтительно примерно от 1,5 до 2,0 мкг/дозу и наиболее предпочтительно примерно 1,6 мкг/дозу. В одном из вариантов осуществления антиген ORF2 (например, белок ORF2 PCV3) может присутствовать в дозе конечной композиции в диапазоне примерно от 1,3 до 3 мкг. Например, конечная антигенная композиция может включать примерно 1,6 мкг белка ORF2 PCV3 в дозе 1 мл.

Полипептид ORF2 PCV3, используемый в иммуногенной композиции в соответствии с настоящим изобретением, может быть получен любым способом, включая выделение и очистку ORF2 PCV3, стандартный синтез белка и рекомбинантную способологию. Предпочтительные способы получения полипептида ORF2 PCV3 представлены в заявке на патент США сер. № 11/034,797, идеи и содержание которого включены в настоящую заявку посредством ссылки. Вкратце, чувствительные клетки инфицируют рекомбинантным вирусным вектором, содержащим кодирующие последовательности ДНК ORF2 PCV3, полипептид ORF2 PCV3 экспрессируется рекомбинантным вирусом, а экспрессированный полипептид ORF2 PCV3 выделяют из надосадочной жидкости фильтрацией и инактивируют любым традиционным способом, предпочтительно с использованием бинарного этиленимина, который затем нейтрализуют, чтобы остановить процесс инактивации.

Используемая в настоящей заявке иммуногенная композиция также обозначается как композиция, которая включает (i) любой из белков ORF2 PCV3, описанных выше, предпочтительно в концентрациях, описанных выше, и (ii) по меньшей мере часть вирусного вектора, экспрессирующего указанный белок ORF2 PCV3, предпочтительно рекомбинантного бакуловируса. Кроме того, иммуногенная композиция может содержать (i) любой из белков ORF2 PCV3, описанных выше, предпочтительно в концентрациях, описанных выше, (ii) по меньшей мере часть вирусного вектора, экспрессирующего указанный белок ORF2 PCV3, предпочтительно рекомбинантного бакуловируса, и (iii) часть надосадочной жидкости клеточной культуры.

Используемая в настоящей заявке иммуногенная композиция также относится к композиции, которая включает (i) любой из белков ORF2 PCV3, описанных выше, предпочтительно в концентрациях, описанных выше, (ii) по меньшей мере часть вирусного вектора, экспрессирующего указанный белок ORF2 PCV3, предпочтительно рекомбинантного бакуловируса и (iii) часть культуры клеток; при этом около 90% компонентов могут иметь размер менее 1 мкм.

Используемая в настоящей заявке иммуногенная композиция также относится к композиции, которая включает (i) любой из белков ORF2 PCV3, описанных выше, предпочтительно в концентрациях, описанных выше, (ii) по меньшей мере часть вирусного вектора, экспрессирующего указанный белок ORF2 PCV3, (iii) часть культуры клеток, и (iv) инактивирующий агент для инактивации рекомбинантного вирусного вектора, предпочтительно BEI, где около 90% компонентов (i) – (iii) могут иметь размер менее 1 мкм. Предпочтительно BEI присутствует в концентрациях, эффективных для инактивации бакуловируса. Эффективные концентрации описаны выше.

Используемая здесь иммуногенная композиция также относится к композиции, которая включает (i) любой из белков ORF2 PCV3, описанных выше, предпочтительно в концентрациях, описанных выше, (ii) по меньшей мере часть вирусного вектора, экспрессирующего указанный белок ORF2 PCV3, (iii) часть клеточной культуры, (iv) инактивирующий агент для инактивации рекомбинантного вирусного вектора, предпочтительно BEI, и (v) нейтрализующий агент для остановки инактивации, опосредованной инактивирующим агентом, где около 90% компонентов (i) – (iii) может иметь размер менее 1 мкм. Предпочтительно, если инактивирующим агентом является BEI, указанная композиция содержит тиосульфат натрия в количествах, эквивалентных BEI.

Полипептид включается в композицию, которую можно вводить животному, чувствительному к инфекции PCV3. В предпочтительных формах композиция может также включать дополнительные компоненты, известные специалистам в данной области техники (см. также Remington's Pharmaceutical Sciences. (1990). 18th ed. Mack Publ., Easton). Кроме того, композиция может включать один или несколько ветеринарно- приемлемых носителей. Используемый здесь термин «ветеринарно приемлемый носитель» включает любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, адъюванты, стабилизирующие агенты, разбавители, консерванты, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические агенты, агенты, замедляющие адсорбцию, и тому подобное. В предпочтительном варианте осуществления иммуногенная композиция содержит белок ORF2 PCV3, как предусмотрено здесь, предпочтительно в концентрациях, описанных выше, который смешан с адъювантом, предпочтительно карбополом, и физиологическим раствором.

Специалисты в данной области техники поймут, что используемая здесь композиция может включать известные физиологически приемлемые стерильные растворы для инъекций. Для приготовления готового к применению раствора для парентеральной инъекции или инфузии водные изотонические растворы, такие как, например, физиологический раствор или соответствующие растворы белков плазмы легко доступны. Кроме того, иммуногенные и вакцинные композиции по настоящему изобретению могут включать разбавители, изотонические агенты, стабилизаторы или адъюванты. Разбавители могут включать воду, физиологический раствор, декстрозу, этанол, глицерин и т.п. Изотонические агенты могут включать, среди прочего, хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. Стабилизаторы включают, среди прочего, альбумин и щелочные соли этилендиаминтетрауксусной кислоты.

«Адъюванты» в контексте настоящего описания могут включать гидроксид алюминия и фосфат алюминия, сапонины, например, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Кембридж, Массачусетс), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Бирмингем, Алабама), эмульсию вода-в-масле, эмульсию масло-в-воде, эмульсию вода-в-масле-в-воде. Эмульсия может быть основана, в частности, на легком жидком парафиновом масле (типа Европейской Фармакопеи), изопреноидном масле, таком как сквалан или сквалановое масло, полученное в результате теолигомеризации алкенов, в частности изобутена или децена; сложных эфирах кислот или спиртов, содержащих линейную алкильную группу, в частности растительных маслах, этилолеате, ди-(каприлате/капрате) пропиленгликоля, три-(каприлате/капрате) глицерина или диолеате пропиленгликоля; сложных эфирах разветвленных жирных кислот или спиртов, в частности сложных эфирах изостеариновой кислоты. Масло используют в сочетании с эмульгаторами для образования эмульсии. Эмульгаторы предпочтительно представляют собой неионные поверхностно-активные вещества, в частности сложные эфиры сорбитана, маннида (например, ангидроманнитололеат), гликоля, полиглицерина, пропиленгликоля и олеиновой, изостеариновой, рицинолевой или гидроксистеариновой кислоты, которые при необходимости являются этоксилированными, и блок-сополимеры полиоксипропилена-полиоксиэтилена, в частности продукты Плюроник, особенно L121. См. Hunter et al., Theory and Practical Application of Aduvants (Ed Stewart-Tull, D. E. S.). John Wiley and Sons, NY, стр. 51-94 (1995) и Todd et al., Vaccine 15: 564-570 (1997).

Например, можно использовать эмульсию SPT, описанную на странице 147 книги “Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach» edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995, и эмульсию MF59, описанную на странице 183 этой же книги.

Еще одним примером адъюванта является соединение, выбранное из полимеров акриловой или метакриловой кислоты и сополимеров малеинового ангидрида и алкенильного производного. Предпочтительными адъювантными соединениями являются полимеры акриловой или метакриловой кислоты, которые являются сшитыми, особенно с полиалкениловыми эфирами сахаров или многоатомных спиртов. Эти соединения известны под термином «Карбомер» (Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996). Специалисты в данной области техники могут также сослаться на патент США No. US 2909462, в котором описаны такие акриловые полимеры, поперечно сшитые полигидроксилированным соединением, имеющий по меньшей мере 3 гидроксильные группы, предпочтительно не более 8, причем атомы водорода по меньшей мере трех гидроксилов заменены ненасыщенными алифатическими радикалами, имеющими по меньшей мере 2 атома углерода. Предпочтительными радикалами являются радикалы, содержащие от 2 до 4 атомов углерода, например, винилы, аллилы и другие этиленненасыщенные группы. Сами ненасыщенные радикалы могут содержать другие заместители, такие как метил. Продукция, продаваемая под названием Карбопол; (BF Goodrich, Огайо, США), является особо пригодной. Они поперечно сшиты аллил-сахарозой или аллил-пентаэритритом. Среди них можно отметить Карбопол 974P, 934P и 971P. Наиболее предпочтительным является использование Карбопола, в частности использование Карбопола 971P, предпочтительно в количествах примерно от 500 мкг до 5 мг на дозу, еще более предпочтительно в количестве примерно от 750 мкг до 2,5 мг на дозу, и наиболее предпочтительно в количество примерно 1 мг на дозу. В частности, доза конечной композиции может включать Карбопол или Карбопол 971 в диапазоне примерно от 750 мкг до 2,5 мг карбопола. Например, в некоторых вариантах осуществления доза конечной композиции может включать примерно 1 мг Карбопола 971.

Дополнительные подходящие адъюванты включают систему адъювантов RIBI (Ribi Inc.), блок-сополимер (CytRx, Атланта, Джорджия), SAF-M (Chiron, Эмеривилл, Калифорния), монофосфориллипид A, адъювант авридин-липид-амин, термолабильный энтеротоксин из E.coli (рекомбинантный или другой), токсин холеры, IMS 1314 или мурамилдипептид среди многих других, но не ограничиваются ими.

Предпочтительно адъювант добавляют в количестве примерно от 100 мкг до 10 мг на дозу. Еще более предпочтительно адъювант добавляют в количестве примерно от 100 мкг до 10 мг на дозу. Еще более предпочтительно адъювант добавляют в количестве примерно от 500 мкг до 5 мг на дозу. Еще более предпочтительно адъювант добавляют в количестве примерно от 750 мкг до 2,5 мг на дозу. Наиболее предпочтительно адъювант добавляют в количестве примерно 1 мг на дозу.

Кроме того, композиция может включать один или несколько фармацевтически приемлемых носителей. Используемый здесь термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, стабилизирующие агенты, разбавители, консерванты, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические агенты, агенты, замедляющие адсорбцию, и тому подобное. Наиболее предпочтительно, композиция, представленная в настоящей заявке, содержит белок ORF2 PCV3, выделенный из надосадочной жидкости клеток, культивируемых in vitro, при этом указанные клетки были инфицированы рекомбинантным вирусным вектором, содержащим ДНК ORF2 PCV3 и экспрессирующим белок ORF2 PCV3, и при этом указанную клеточную культуру обрабатывали примерно от 2 п до 8 мМ BEI, предпочтительно примерно 5 мМ BEI для инактивации вирусного вектора, и эквивалентной концентрацией нейтрализующего агента, предпочтительно раствора тиосульфата натрия в конечной концентрации примерно от 2 до 8 мМ, предпочтительно примерно 5 мМ.

Настоящее изобретение также относится к иммуногенной композиции, которая включает (i) любой из белков ORF2 PCV3, описанных выше, предпочтительно в концентрациях, описанных выше, (ii) по меньшей мере часть вирусного вектора, экспрессирующего указанный белок ORF2 PCV3, (iii) часть культуры клеток, (iv) инактивирующий агент для инактивации рекомбинантного вирусного вектора, предпочтительно BEI, и (v) нейтрализующий агент, чтобы остановить инактивацию, опосредованную инактивирующим агентом, предпочтительно тиосульфат натрия в количествах, эквивалентных BEI, и (vi) подходящий адъювант, предпочтительно Карбопол 971 в количествах, описанных выше; при этом около 90% компонентов (i) – (iii) имеют размер менее 1 мкм. Согласно дополнительному аспекту эта иммуногенная композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемую соль, предпочтительно фосфатную соль в физиологически приемлемых концентрациях. Предпочтительно pH указанной иммуногенной композиции доводят до физиологического значения pH, то есть примерно от 6,5 до 7,5.

В одном из вариантов осуществления иммуногенная композиция может относиться к композиции, которая включает в дозе 1 мл (i) по меньшей мере некоторое количество белка ORF2 PCV3, (ii) бакуловирус, экспрессирующий указанный белок ORF2 PCV3, (iii) культуру клеток, (iv) инактивирующий агент ( например, BEI) с концентрацией в диапазоне примерно от 2 до 8 мМ, (v) нейтрализующий агент (например, тиосульфат натрия) в количествах, эквивалентных инактивирующему агенту, и (vi) заданное количество адъюванта (например, Карбопола 971), и (vii) фосфатную соль в физиологически приемлемой концентрации. В некоторых вариантах осуществления компоненты могут быть выбраны так, что 90% комбинации компонентов, которая включает (i) белок ORF2 PCV3, (ii) бакуловирус, экспрессирующий белок, и (iii) культуру клеток, имела размер менее 1 мкм. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления один или несколько компонентов иммуногенной композиции могут быть выбраны таким образом, чтобы иммуногенная композиция имела pH в диапазоне примерно от 6,5 до 7,5. Выбор компонентов и/или определения в отношении количеств и/или концентраций могут зависеть от различных факторов, которые влияют на стабильность иммуногенной композиции, простоту производства, доступность материалов, возраст, рост и/или состояние животных, подлежащих лечению, и/или требуемые результаты.

Например, иммуногенная композиция в контексте настоящего описания также относится к композиции, которая содержит на один мл (i) по меньшей мере 1,6 мкг белка ORF2 PCV3, описанного выше, (ii) по меньшей мере часть бакуловируса, экспрессирующего указанный белок ORF2 PCV3, (iii) часть культуры клеток, (iv) примерно от 2 до 8 мМ BEI, (v) тиосульфат натрия в количествах, эквивалентных по BEI, и (vi) примерно 1 мг Карбопола 971, и (vii) фосфатную соль в физиологически приемлемой концентрации, где примерно 90% компонентов (i) – (iii) могут иметь размер менее 1 мкм, а pH указанной иммуногенной композиции доводят примерно до 6,5-7,5.

Иммуногенные композиции могут дополнительно включать один или несколько других иммуномодулирующих агентов, таких как, например, интерлейкины, интерфероны или другие цитокины (такие, как ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-7, ИФН-альфа, ИФН-бета, ИФН-гамма и др., но не ограничиваясь ими). Иммуногенные композиции также могут включать гентамицин и мертиолят. Хотя количества и концентрации адъювантов и добавок, используемых в контексте настоящего изобретения, могут быть легко определены специалистом в данной области техники, настоящее изобретение рассматривает композиции, содержащие примерно от 50 мкг до 2000 мкг адъюванта. В некоторых вариантах осуществления может быть предпочтительным использовать адъюванты в количестве примерно 250 мкг адъюванта на одну миллилитровую дозу вакцинной композиции. В некоторых вариантах осуществления иммуногенная композиция может включать антибиотики в концентрации в диапазоне примерно от 1 мкг/мл до 60 мкг/мл. Например, иммуногенная композиция может включать менее примерно 30 мкг/мл антибиотиков.

Используемая в настоящей заявке иммуногенная композиция также относится к композиции, которая включает (i) любой из белков ORF2 PCV3, описанных выше, предпочтительно в концентрациях, описанных выше, (ii) по меньшей мере часть вирусного вектора, экспрессирующего указанный белок ORF2 PCV3, (iii) часть клеточной культуры, (iv) инактивирующий агент для инактивации рекомбинантного вирусного вектора, предпочтительно BEI, и (v) нейтрализующий агент, чтобы остановить инактивацию, опосредованную инактивирующим агентом, предпочтительно тиосульфат натрия в количествах, эквивалентных BEI; (vi) подходящий адъювант, предпочтительно Карбопол 971 в количествах, описанных выше; (vii) фармацевтически приемлемую концентрацию солевого буфера, предпочтительно фосфатной соли, и (viii) антимикробно-активный агент; при этом около 90% компонентов (i) – (iii) имеют размер менее 1 мкм.

Композицию согласно изобретению можно применять интрадермально, интратрахеально или интравагинально. Композицию предпочтительно можно применять внутримышечно или интраназально, наиболее предпочтительно внутримышечно. В организме животного может оказаться полезным применение фармацевтических композиций, как описано выше, посредством внутривенной или прямой инъекции в ткани-мишени. Для системного применения предпочтительны внутривенный, внутрисосудистый, внутримышечный, интраназальный, внутриартериальный, интраперитонеальный, пероральный, орогастральный или интратекальный пути введения. Более местное нанесение может осуществляться подкожно, интрадермально, интрадермально, интракардиально, интралобально, интрамедуллярно, внутрилегочно или непосредственно в обрабатываемой ткани или рядом с ней (соединительной, костной, мышечной, нервной, эпителиальной ткани). В зависимости от необходимой продолжительности и эффективности лечения композиции согласно настоящему описанию можно вводить один или несколько раз, а также с перерывами, например, ежедневно в течение нескольких дней, недель или месяцев и в различных дозировках. Предусмотрены как разовая доза, так и множественные дозы. Также рассматриваются комбинированные вакцины с другими антигенами патогенов свиней. Предпочтительные комбинированные композиции содержат белок ORF2 PCV3 и PPV, антиген PRRSV, антиген M. hyopneumoniae (надосадочную жидкость или бактерин) или антиген PRRSV и антиген M. hyopneumoniae (надосадочную жидкость или бактерин), или любую комбинацию вышеперечисленного с белком ORF2 PCV2.

В некоторых вариантах осуществления может быть разработан режим дозирования для доставки эффективных количеств ORF2 PCV3 для индукции необходимого эффекта, такого как иммунный ответ у животного и/или их потомства. Определения в отношении режимов дозирования могут быть связаны с необходимыми результатами, компонентами, выбранными для использования в иммуногенной композиции, путем введения, таким как парентеральное и/или подкожное введение, количеством или введенными дозами, например, однократным введением или множественными дозами, и/или конкретными свойствами животного или популяции животных, подлежащих лечению, например, возрастом, размером и/или состоянием животных. Состояние животных может относиться, например, к состоянию здоровья, состоянию беременности, размеру и т.д. Таким образом, свиноматкам и поросятам могут потребоваться разные эффективные дозы.

Как указано выше, способы лечения могут отличаться в зависимости от необходимого результата. Например, свиноматку можно лечить для ингибирования и/или предотвращения состояний, связанных с цирковирусом свиньи, или свиноматку можно лечить для ингибирования и/или предотвращения негативных эффектов инфекции цирковирусом свиньи у ее поросят.

Режим дозирования может включать одну или несколько доз иммуногенной композиции, которая включает заранее определенное количество белка ORF2 PCV3. Например, режим дозирования может включать дозы в диапазоне примерно от 2 мкг до 400 мкг белка ORF2 PCV3. В одном из вариантов осуществления режим дозирования конкретной иммуногенной композиции может включать более примерно двух микрограммов белка ORF2 PCV3. В некоторых случаях каждая доза конкретной иммуногенной композиции во многих случаях включает белок ORF2 PCV3 в количестве, превышающем примерно 4 мкг. Некоторые варианты осуществления режима дозирования для иммуногенной композиции могут включать иммуногенные композиции в дозах по меньшей мере примерно 8 мкг белка ORF2 PCV3. Например, некоторые режимы дозирования иммуногенной композиции, раскрытые в настоящей заявке, могут быть структурированы таким образом, чтобы по меньшей мере одна доза включала более чем примерно 16 мкг необходимого белка ORF2 PCV3.

В одном из вариантов осуществления режим дозирования может быть выбран на основе необходимой экспрессии конкретного белка ORF2 PCV3 в организме животного. Например, учитывая иммуногенную композицию, которая включает соответствующий вектор и/или систему экспрессии для свиней, может быть необходимо, чтобы вектор, доставленный в иммуногенной композиции, был способен доставлять белок ORF2 PCV3 в количестве, которое находится в диапазоне примерно от 2 мкг до 400 мкг in vivo. В одном варианте осуществления схема дозирования конкретной иммуногенной композиции построена так, чтобы доставить животному количество белка ORF2 PCV3, превышающее примерно 2 мкг. В некоторых случаях схема дозирования конкретной иммуногенной композиции построена так, чтобы доставить животному количество белка ORF2 PCV3, превышающее примерно 4 мкг. Некоторые варианты режима дозирования иммуногенной композиции структурированы так, чтобы доставлять животному количество белка ORF2 PCV3, превышающее примерно 8 мкг. Например, некоторые режимы дозирования иммуногенной композиции, раскрытые в настоящей заявке, могут быть структурированы таким образом, чтобы животному можно было доставить более чем примерно 16 мкг необходимого белка ORF2 PCV3.

Режимы дозирования могут также включать руководство по поводу путей и/или времени введения. Например, может быть необходимо доставить дозу иммуногенной композиции поросенку в определенном возрасте, в частности, в возрасте около 1, 2 или 3 недель в зависимости от иммуногенных композиций и необходимых результатов. В некоторых случаях поросятам можно вводить иммуногенные композиции в возрасте примерно от 7 дней до 28 дней. В варианте схемы дозирования свиньям можно вводить иммуногенную композицию в возрасте примерно от 14 дней до 26 дней. Например, окно введения для поросят может быть выбрано в диапазоне примерно от 16 дней до 26 дней. Некоторые варианты схемы дозирования могут включать введение иммуногенной композиции поросенку в возрасте примерно от 18 дней до 24 дней.

Иммуногенная композиция может включать рекомбинантный белок ORF2 PCV3. В частности, иммуногенная композиция может включать рекомбинантный белок ORF2 PCV3, экспрессированный из бакуловирусов.

Кроме того, в некоторых случаях иммуногенная композиция, которая включает рекомбинантный белок ORF2 PCV3, может быть введена в комбинации с одной или несколькими дозами дополнительных антигенов, например, антигенов из ORF2 PCV2, PPV, PRRSV и/или M. hyopneumoniae («М. Нуо»). Антиген вируса РРСС может быть аттенуированной живой вакциной. Антиген М.Нуо может быть бактерином, надосадочной жидкостью или комбинацией бактерина и надосадочной жидкости.

Несколько доз иммуногенных композиций можно вводить в режиме дозирования. Например, режим дозирования может быть составлен из дозы иммуногенной композиции, которая включает рекомбинантный белок ORF2 PCV3, и дозы иммуногенной композиции, которая включает рекомбинантный белок ORF2 PCV2. В одном случае дозы могут включать приблизительно эквивалентные количества рекомбинантного белка ORF2 PCV3 и белка ORF2 PCV2. Вариант схемы дозирования может включать дозы иммуногенных композиций, которые включают рекомбинантный белок ORF2 PCV3 и рекомбинантный ORF2 PCV2, оба из которых могут быть экспрессированы с использованием бакуловирусных систем экспрессии.

Вариант осуществления иммуногенной композиции рекомбинантной ORF2 PCV3 может включать дополнительные антигены, например, антигены, такие как рекомбинантные белки из ORF2 PCV3, а также аттенуированный живой PRRSV и/или бактерин, надосадочная жидкость или комбинация бактерина и надосадочной жидкости M. Hyo. Некоторые варианты осуществления иммуногенной композиции могут включать рекомбинантные белки, экспрессируемые бакуловирусом из ORF2 PCV3 и ORF2 PCV2, а также антигены PRRSV (например, аттенуированную живую вакцину) и/или M. Hyo (например, бактерин и/или надосадочную жидкость). Кроме того, в некоторых случаях иммуногенная композиция может включать белок ORF2 PCV3 в комбинации с белком ORF2 PCV2, аттенуированный живой вирус PRRSV и/или бактерин M. Hyo и/или надосадочную жидкость.

Иммуногенные композиции могут включать рекомбинантный белок ORF2 PCV3 и рекомбинантный белок ORF2 PCV2. В одном случае дозы могут включать приблизительно эквивалентные количества рекомбинантного белка ORF2 PCV3 и белка ORF2 PCV2. Вариант схемы дозирования может включать дозы иммуногенных композиций, которые включают рекомбинантный белок ORF2 PCV3 и рекомбинантный ORF2 PCV2, оба из которых могут быть экспрессированы с использованием систем экспрессии бакуловирусов.

Некоторые варианты осуществления иммуногенной композиции могут включать рекомбинантные белки, экспрессируемые бакуловирусом из ORF2 PCV3, а также антигены PRRSV и/или M. Hyo. Кроме того, рекомбинантные белки из ORF2 PCV3 и ORF2 PCV2 могут быть объединены с антигенами PRRSV и/или M. Hyo с образованием иммуногенной композиции. Как описано выше, дополнительные антигены могут включать аттенуированный живой вирус PRRSV, и/или бактерин M Hyo, и/или надосадочную жидкость.

Например, иммуногенная композиция может содержать рекомбинантный белок ORF2 PCV3 и рекомбинантный белок ORF2 PCV2. В некоторых случаях иммуногенная композиция включает приблизительно эквивалентные количества рекомбинантного белка ORF2 PCV3 и белка ORF2 PCV2. Некоторые варианты осуществления иммуногенной композиции могут включать комбинацию рекомбинантных белков, экспрессируемых бакуловирусом, из ORF2 PCV3 и ORF2 PCV2, а также PRRSV и/или M. Hyo.

Режимы дозирования могут быть использованы для улучшения экономики свиноводства. Например, иммуногенные композиции, такие как вакцины, можно вводить свиноматкам и/или поросятам для защиты свиноматок, поросят, или тех и других.

В частности, вакцинация свиноматок перед беременностью может снизить количество мумифицированных, мертворожденных и/или слабых поросят при опоросе, если свиноматки заражены PCV3. Обычно считается, что PCV3 является репродуктивным заболеванием. Кроме того, использование вакцины на основе экспрессии инактивированным бакуловирусом ORF2 PCV3 может снижать и/или ингибировать репликацию вируса у свиноматок. Это снижение репликации может снизить количество мумий при опоросе у вакцинированных свиноматок примерно на 4%. Такое сокращение может иметь значительные экономические последствия для производителей свиней.

Кроме того, утверждается, что вакцина способна защитить племенных свинок и свиноматок при заражении PCV3 на протяжении всей беременности, или двух триместров, или по меньшей мере одного триместра в течение 114 дней беременности.

Также утверждается, что вакцина способна значительно снизить количество мумий, мертворожденных и ослабленных плодов у вакцинированных свинок и свиноматок, вакцинированных при заражении PCV3, в течение всей беременности, или двух триместров, или по меньшей мере одного триместра в течение 114 дней беременности.

Схема дозирования может включать вакцинацию молодых свиноматок (т.е. в 5-месячном возрасте или младше) по меньшей мере одной дозой иммуногенной композиции, как описано в настоящей заявке, перед осеменением. Доза иммуногенной композиции, описанная в настоящей заявке, может вводиться внутримышечно в виде дозы один (1) мл до осеменения. В некоторых вариантах осуществления свиноматкам можно вводить одну или несколько доз вакцины. Например, может быть введена первая вакцина, за которой следует ревакцинация через 21 день и до осеменения. В некоторых вариантах осуществления свиноматки могут быть осеменены в период от 14 дней до 21 дня после ревакцинации. Эти временные рамки могут позволить свиноматкам выработать иммунный ответ. Использование такого режима дозирования может уменьшить и/или подавить количество мумий при опоросе.

Кроме того, использование режима дозирования, который включает введение дозы 1 мл иммуногенной композиции, которая включает антиген PCV3 (т.е. рекомбинантную ORF2 PCV3), позволяет снижать, уменьшать и/или ингибировать лимфоаденопатию, лимфоидное истощение и/или многоядерные/гигантские гистиоциты у свиней, инфицированных PCV3.

В некоторых вариантах осуществления режим дозирования для вакцинации поросят в возрасте примерно 3 недель с использованием вакцины ORF2 PCV3, экспрессированной бакуловирусом, позволяет снизить вирусную нагрузку, если поросята впоследствии заражаются PCV3. Например, количество реплицирующегося вируса в тканях вакцинированных поросят может быть снижено по сравнению с невакцинированными поросятами. Кроме того, вакцинация поросят вакциной ORF2 PCV3 позволяет снизить смертность, клинические признаки, макроскопические поражения и/или гистологические нарушения у вакцинированных поросят по сравнению с невакцинированными поросятами, которые впоследствии подвергаются воздействию PCV3.

Термин «иммуностимулятор» в контексте настоящего описания означает любой агент или композицию, которые могут запускать иммунный ответ сразу, предпочтительно без инициирования или усиления специфического иммунного ответа, например, иммунного ответа против конкретного патогена. Кроме того, рекомендуется вводить иммуностимулятор в подходящей дозе. Предпочтительно иммуностимулятор представляет собой гемоцианин лимфы улитки (KLH) и/или неполный адъювант Фрейнда (IFA). В данном контексте иммуностимулятор играет роль не адъюванта, а усилителя заражения. Предпочтительно KLH эмульгируют в IFA, содержащем 1 мг KLH/мл, который можно вводить внутримышечно за два дня до и через два дня после контрольного заражения.

В соответствии с дополнительным соображением, обеспечивается антигенный белок цирковируса свиней 3 типа (PCV3), где указанный белок является функциональным антигенным вариантом белка ORF2 PCV3, и указанный белок, в частности, также называется «белком, рассматриваемым дополнительно» в дальнейшем.

Предпочтительно, белок, рассматриваемый дополнительно, представляет собой функциональный антигенный вариант белка ORF2 PCV3, кодируемого SEQ ID № 1.

В одном предпочтительном аспекте белок, рассматриваемый дополнительно, включает замены и/или удлинения ORF2 PCV3.

В другом предпочтительном аспекте белок, рассматриваемый дополнительно, представляет собой функциональный антигенный вариант белка, кодируемого SEQ ID №1, и/или функциональный антигенный вариант способен давать более высокий выход вирусоподобных частиц (VLP), чем белок, кодируемый SEQ ID № 1.

Предпочтительно, указанный функциональный антигенный вариант способен давать более высокий выход VLP, чем белок, кодируемый SEQ ID № 1, при определении с помощью вестерн-блоттинга.

Согласно одному предпочтительному аспекту указанный функциональный антигенный вариант имеет меньше положительно заряженных аминокислотных остатков, чем белок, кодируемый SEQ ID No. 1.

Согласно другому предпочтительному аспекту указанный функциональный антигенный вариант имеет одну или несколько замен в петле FG белка, кодируемого SEQ ID No. 1, и при этом предпочтительно эти замены включают замены одного или нескольких остатков S и/или K и/или остатка H мотива SKKKH петли FG белка, кодируемого SEQ ID No. 1.

Согласно еще одному предпочтительному аспекту, указанный функциональный антигенный вариант имеет одну или несколько замен в петле FG белка, кодируемого SEQ ID No. 1, где эти замены включают замены одного или нескольких остатков S и/или остатков K мотива SKKKH петли FG белка, кодируемого SEQ ID No. 1.

Согласно еще одному предпочтительному аспекту указанный функциональный антигенный вариант имеет одну или несколько замен в петле FG белка, кодируемого SEQ ID No. 1, где эти замены включают замены остатка S или остатка H и всех из остатков K мотива SKKKH петли FG белка, кодируемого SEQ ID No. 1.

В еще одном предпочтительном аспекте указанный функциональный антигенный вариант имеет одну или несколько замен в петле FG белка, кодируемого SEQ ID No. 1, где эти замены включают замену по меньшей мере S и/или H и любого K мотива SKKKH петли FG белка, кодируемого SEQ ID №1 с Q, P, F или S.

В еще одном предпочтительном аспекте указанный функциональный антигенный вариант имеет одну или несколько замен в петле FG белка, кодируемого SEQ ID No. 1, где эти замены включают замену мотива SKKK в мотиве SKKKH петли FG белка, кодируемого SEQ ID No. 1, на QPFS, или замену мотива KKKH в мотиве SKKKH петли FG белка, кодируемого SEQ ID No. 1, на QPFS.

В еще одном дополнительном предпочтительном аспекте указанный функциональный антигенный вариант кодируется полностью или частично SEQ ID № 1, 2, 5, 6 или 7.

В еще одном предпочтительном аспекте указанный функциональный антигенный вариант кодируется полностью или частично SEQ ID No. 1, 2, 5, 6 или 7.

Согласно особо предпочтительному аспекту, указанный функциональный антигенный вариант имеет С-концевую часть, которая выходит за пределы концевой последовательности SVL белка, кодируемого SEQ ID No. 1, предпочтительно, где указанное удлинение является всей последовательностью или включает последовательность из цирковируса, и предпочтительно где по меньшей мере часть указанного удлинения заменяет концевую последовательность SVL белка, кодируемого SEQ ID No. 1

Согласно другому предпочтительному аспекту указанный функциональный антигенный вариант имеет С-концевую часть, которая выходит за пределы концевой последовательности SVL белка, кодируемого SEQ ID No. 1, и где указанное удлинение составляет от 1 до 100 аминокислот.

Согласно дополнительному предпочтительному аспекту указанный функциональный антигенный вариант имеет С-концевую часть, которая выходит за пределы концевой последовательности SVL белка, кодируемого SEQ ID No. 1, и где указанное удлинение составляет от 1 до 50 аминокислот.

Согласно еще одному предпочтительному аспекту, указанный функциональный антигенный вариант имеет С-концевую часть, которая выходит за пределы концевой последовательности SVL белка, кодируемого SEQ ID No. 1, и где указанное удлинение составляет от 1 до 30 аминокислот.

В одном особо предпочтительном аспекте указанный функциональный антигенный вариант имеет С-концевую часть, которая выходит за пределы концевой последовательности SVL белка, кодируемого SEQ ID No. 1.

Предпочтительно указанное удлинение составляет от 1 до 30 аминокислот и/или указанное удлинение включает всю последовательность VKININLTPPVATSRVPSRALPLRFGCGHR.

В другом предпочтительном аспекте указанный функциональный антигенный вариант кодируется полностью или частично SEQ ID No. 1, 2, 5, 6 или 7.

В предпочтительном аспекте указанный вариантный белок содержит или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей идентичность последовательностей и/или гомологию последовательностей по меньшей мере примерно 80%, или по меньшей мере примерно 85%, или по меньшей мере примерно 86%, или по меньшей мере примерно 87%, или по меньшей мере примерно 88%, или по меньшей мере примерно 89%, например, в диапазоне примерно от 83% до 89%, например 84%, или 85%, или 86%, или 87%, или 88%, или 89% идентичности последовательности и/или гомологии последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 3, 4, 8, 9 или 10, и/или где белок представляет собой рекомбинантный белок, и где указанный белок имеет одну или несколько замен в петле FG.

В предпочтительном аспекте указанный вариантный белок содержит или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей идентичность последовательностей и/или гомологию последовательностей по меньшей мере примерно 80%, или по меньшей мере примерно 85%, или по меньшей мере примерно 86%, или по меньшей мере примерно 87%, или по меньшей мере примерно 88%, или по меньшей мере примерно 89%, например, в диапазоне примерно от 83% до 89%, например 84%, или 85%, или 86%, или 87%, или 88%, или 89% идентичности последовательности и/или гомологии последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 3, 4, 8, 9 или 10, и/или где белок является рекомбинантным белком, и где указанный белок имеет С-концевую часть, которая выходит за пределы концевой последовательности SVL белка, кодируемого SEQ ID No. 1.

В предпочтительном аспекте указанный вариантный белок содержит петлю FG, имеющую одну или несколько замен в петле FG, и дополнительно содержит С-концевую часть, которая выходит за пределы концевой последовательности SVL белка, кодируемого SEQ ID No. 1, где последовательность вариантного белка включает или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей идентичность последовательности и/или гомологию последовательности по меньшей мере примерно 80%, или по меньшей мере примерно 85%, или по меньшей мере примерно 86%, или по меньшей мере примерно 87%, или по меньшей мере примерно 88%, или по меньшей мере примерно 89%, например, в диапазоне примерно от 83% до 89%, например, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% или 89% идентичности последовательности и/или гомологии последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 3, 4, 8, 9 или 10, и/или где белок представляет собой рекомбинантный белок.

В другом предпочтительном аспекте белок, рассматриваемый дополнительно, представляет собой рекомбинантный белок, полученный методами рекомбинантной ДНК.

В еще одном предпочтительном аспекте белок, рассматриваемый дополнительно, представляет собой белок, экспрессируемый бакуловирусом.

Предпочтительно указанный PCV3 представляет собой любую филогенетическую ветвь PCV3 или комбинацию филогенетических ветвей.

Предпочтительно указанный PCV3 выбран из группы, состоящей из PCV3a и PCV3b.

В частности, указанный PCV3 предпочтительно выбран из группы, состоящей из PCV3a1, PCV3b1 и PCV3b2.

PCV3 также может быть выбран из PCV3c (BMC Vet Res. 2019 Jul 15; 15 (1): 244. Doi: 10.1186 / s12917-019-1977-7).

Более конкретно, указанная ORF2 PCV3 предпочтительно принадлежит к группе a1, b1 или b2 (с использованием обозначения подтипа Fux et al., «Full genome characterization of porcine circovirus type 3 isolates reveals the existence of two distinct groups of virus strains», Virology Journal (2018) 15:25, DOI 10.1186/s12985-018-0929-3 (включено в настоящий документ посредством ссылки); см., например, таблицу 4).

В предпочтительном аспекте указанный белок ORF2 PCV3 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, кодируемой полинуклеотидной последовательностью, имеющей по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1 или гомологии последовательности с SEQ ID NO: 1.

В другом предпочтительном аспекте указанный вариантный белок содержит или состоит из аминокислотной последовательности, кодируемой полинуклеотидной последовательностью, имеющей по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1 или гомологии последовательности с SEQ ID NO: 6.

В еще одном предпочтительном аспекте указанный вариантный белок содержит или состоит из аминокислотной последовательности, кодируемой полинуклеотидной последовательностью, имеющей по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1 или гомологии последовательности с SEQ ID NO: 7.

В еще одном предпочтительном аспекте указанный белок ORF2 PCV3 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 3, 4, 8, 9 или 10, и/или где белок представляет собой рекомбинантный белок.

В еще одном предпочтительном аспекте указанный вариантный белок содержит или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 3, 4, 8, 9 или 10, и/или где белок представляет собой рекомбинантный белок.

В еще одном предпочтительном аспекте указанный вариантный белок содержит или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 3, 4, 8, 9 или 10, и/или где белок представляет собой рекомбинантный белок, и где указанный белок имеет одну или несколько замен в петле FG.

В предпочтительном аспекте указанный вариантный белок содержит или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 3, 4, 8, 9 или 10, и/или где белок представляет собой рекомбинантный белок.

В другом предпочтительном аспекте указанный вариантный белок содержит или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 3, 4, 8, 9 или 10, и/или где белок представляет собой рекомбинантный белок, и где указанный белок имеет С-концевую часть, которая выходит за пределы концевой последовательности SVL белка, кодируемого SEQ ID No. 1.

Согласно предпочтительному аспекту, указанный белок представляет собой рекомбинантный белок в результате его экспрессии вектором экспрессии, содержащим полинуклеотидную последовательность, кодирующую белок.

Согласно предпочтительному аспекту указанный белок представляет собой рекомбинантный белок, полученный в результате его экспрессии бакуловирусным вектором экспрессии, содержащим полинуклеотидную последовательность, кодирующую белок.

В другом предпочтительном аспекте предоставлена нуклеотидная последовательность, которая кодирует белок, рассматриваемый дополнительно, и где указанный нуклеотид также именуется «нуклеотидной последовательностью, рассматриваемой дополнительно» в дальнейшем.

В дополнительном предпочтительном аспекте предоставлен вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, рассматриваемую дополнительно, и где указанный вектор также называется в дальнейшем «вектором, рассматриваемым дополнительно».

Также обеспечивается рекомбинантный вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, рассматриваемую дополнительно.

Кроме того, обеспечивается хозяин экспрессии, которого трансформируют или трансфицируют нуклеотидной последовательностью, рассматриваемой дополнительно, и при этом указанный хозяин экспрессии также именуется здесь и далее «хозяином экспрессии, рассматриваемым дополнительно».

Также обеспечивается хозяин бакуловирусной экспрессии, который трансформирован или трансфицирован нуклеотидной последовательностью, рассматриваемой дополнительно, и где указанный хозяин бакуловирусной экспрессии также называется «хозяином бакуловирусной экспрессии, рассматриваемым дополнительно».

Кроме того, обеспечивается способ получения белка, рассматриваемого дополнительно, включающий экспрессию нуклеотидной последовательности, рассматриваемой дополнительно.

Также обеспечивается способ получения белка, рассматриваемого дополнительно, при этом способ включает экспрессию вектора, рассматриваемого дополнительно.

Кроме того, обеспечивается способ получения белка, рассматриваемого дополнительно, при этом способ включает экспрессию рекомбинантного вектора, рассматриваемого дополнительно.

Также обеспечивается способ получения белка, рассматриваемого дополнительно, включающий культивирование хозяина экспрессии, рассматриваемого дополнительно, чтобы вызвать экспрессию белка.

Кроме того, обеспечивается способ получения белка, рассматриваемого дополнительно, включающий трансфекцию хозяина экспрессии нуклеотидной последовательностью, рассматриваемой дополнительно, или вектором, рассматриваемым дополнительно, и культивирование хозяина экспрессии, чтобы вызвать экспрессия белка.

Также обеспечивается способ получения белка, рассматриваемого дополнительно, включающий культивирование хозяина для бакуловирусной экспрессии, рассматриваемого дополнительно, чтобы вызвать экспрессию белка.

Также обеспечивается способ получения белка, рассматриваемого дополнительно, включающий трансфекцию хозяина для бакуловирусной экспрессии нуклеотидной последовательностью, рассматриваемой дополнительно, или вектором, рассматриваемым дополнительно, и культивирование хозяина для бакуловирусной экспрессии, чтобы вызвать экспрессию белка.

Предпочтительно, в любом из вышеупомянутых способов получения белка, рассматриваемого дополнительно, инактивирующий агент используют, когда достигнуты достаточные уровни экспрессированного белка, и где инактивирующим агентом предпочтительно является бинарный этиленимин (BEI), когда используют достаточный уровень. экспрессированного белка.

Предпочтительно, любой из вышеуказанных способов получения белка, рассматриваемого дополнительно, включает трансфекцию хозяина для бакуловирусной экспрессии нуклеотидной последовательностью вектора и культивирование хозяина для бакуловирусной экспрессии в среде, чтобы вызвать экспрессию белка, где среда после экспрессии белка включает (i) указанный белок, (ii) по меньшей мере часть бакуловируса, экспрессирующего указанный белок, (iii) часть культуры клеток, которые были инфицированы или трансфицированы рекомбинантным бакуловирусом, который экспрессировал указанный белок.

Предпочтительно, любой из вышеуказанных способов получения белка, рассматриваемого дополнительно, включает трансфекцию хозяина для бакуловирусной экспрессии нуклеотидной последовательностью вектора и культивирование хозяина для бакуловирусной экспрессии в среде, чтобы вызвать экспрессию белка, где среда после экспрессии белка включает (i) указанный белок, (ii) по меньшей мере часть бакуловируса, экспрессирующую указанный белок, (iii) часть культуры клеток, которые были инфицированы или трансфицированы рекомбинантным бакуловирусом, который экспрессировал указанный белок, и где около 90% компонентов (i) - (iii) имеют размер менее 1 мкм.

Предпочтительно, любой из вышеуказанных способов получения белка, рассматриваемого дополнительно, включает трансфекцию хозяина для бакуловирусной экспрессии нуклеотидной последовательностью вектора и культивирование хозяина для бакуловирусной экспрессии в среде, чтобы вызвать экспрессию белка, где среда после экспрессии белка включает (i) указанный белок, (ii) по меньшей мере часть бакуловируса, экспрессирующую указанный белок, (iii) часть культуры клеток, которые были инфицированы или трансфицированы рекомбинантным бакуловирусом, который экспрессировал указанный белок, и где примерно 90% компонентов (i) - (iii) имеют размер менее 1 мкм, а pH указанной композиции доводят примерно до 6,5-7,5.

Предпочтительно, любой из вышеупомянутых способов получения белка, рассматриваемого дополнительно, включает продукцию белка бакуловирусной системой экспрессии в культивируемых клетках насекомых.

Предпочтительно, любой из вышеуказанных способов получения белка, рассматриваемого дополнительно, включает продукцию белка бакуловирусной системой экспрессии в культивируемых клетках насекомых, и где способ включает стадию инактивации бакуловируса.

Предпочтительно, любой из вышеуказанных способов получения белка, рассматриваемого дополнительно, включает продукцию белка бакуловирусной системой экспрессии в культивируемых клетках насекомых, и где способ включает стадию инактивации бакуловируса, и где стадия инактивации включает тепловую обработку или использование агента, инактивирующего вирус.

Предпочтительно, любой из вышеуказанных способов получения белка, рассматриваемого дополнительно, включает продукцию белка бакуловирусной системой экспрессии в культивируемых клетках насекомых, и где способ включает стадию инактивации бакуловируса, и где стадия инактивации включает тепловую обработку или использование агента, инактивирующего вирус, и где агент, инактивирующий вирус, включает азиридиновое соединение.

Предпочтительно, любой из вышеупомянутых способов получения белка, рассматриваемого дополнительно, включает продукцию белка бакуловирусной системой экспрессии в культивируемых клетках насекомых, и где способ включает стадию инактивации бакуловируса, и где стадия инактивации включает тепловую обработку или использование агента, инактивирующего вирус, и где агент, инактивирующий вирус, включает азиридиновое соединение, где азиридиновое соединение включает BEI.

Кроме того, обеспечивается белок, который может быть получен любым из вышеупомянутых способов получения белка, рассматриваемых дополнительно.

Также обеспечивается композиция, содержащая белок, получаемый любым из вышеуказанных способов получения белка, рассматриваемых дополнительно, и при этом композиция предпочтительно включает носитель, разбавитель или наполнитель. Кроме того, обеспечивается композиция, которую можно получить любым из вышеуказанных способов получения белка, рассматриваемых дополнительно, и где композиция предпочтительно включает носитель, разбавитель или наполнитель.

В частности, любая из упомянутых композиций также именуется в дальнейшем «композицией, рассматриваемой дополнительно».

В композиции, рассматриваемой дополнительно, белок предпочтительно присутствует в количестве от 0,2 до примерно 400 мкг/мл, или от 2 до примерно 400 мкг/мл, или от 4 до примерно 400 мкг/мл, или от 8 до примерно 400 мкг/мл, или примерно от 0,3 до 200 мкг/мл, или от 2 до примерно 200 мкг/мл, или от 4 до примерно 200 мкг/мл, или от 8 до примерно 200 мкг/мл, или примерно от 0,35 до 100 мкг/мл, или от 2 до примерно 100 мкг/мл, или от 4 до примерно 100 мкг/мл, или от 8 до примерно 100 мкг/мл, или примерно от 0,4 до 50 мкг/мл, или примерно от 0,45 до 30 мкг/мл, или примерно от 0,6 до 15 мкг/мл, или примерно от 0,75 до 8 мкг/мл, или примерно от 1,0 до 6 мкг/мл, или примерно от 1,3 до 3,0 мкг/мл, или примерно от 1,4 до 2,5 мкг/мл, или примерно от 1,5 до 2,0 мкг/мл или примерно 1,6 мкг/мл.

Предпочтительно композиция, рассматриваемая дополнительно, включает любой один или несколько из растворителя, дисперсионной среды, покрытия, стабилизирующего агента, разбавителя, консерванта, противомикробного агента, противогрибкового агента, изотонического агента, агента, замедляющего адсорбцию, адъюванта, надосадочной жидкости клеточной культуры, стабилизирующего агента, вирусного вектора, вектора экспрессии и/или иммуномодулирующего агента.

Предпочтительно обеспечивается композиция, рассматриваемая дополнительно, в которой носитель, разбавитель или наполнительно представляет собой любой один или несколько из адъюванта, иммуномодулирующего агента, надосадочной жидкости клеточной культуры, вирусного вектора или вектора экспрессии, или любой их комбинации.

Предпочтительно обеспечивается композиция, рассматриваемая дополнительно, в которой носитель, разбавитель или наполнитель включает адъювант.

Предпочтительно обеспечивается композиция, рассматриваемая дополнительно, в которой носитель, разбавитель или наполнитель включает адъювант, где адъювант включает один или несколько из полимеров акриловой или метакриловой кислоты; сополимера малеинового ангидрида и алкенильного производного; сшитого полимера акриловой или метакриловой кислоты; полимера акриловой или метакриловой кислоты, сшитого с полиалкениловым эфиром сахара или полиспирта; карбомера; акрилового полимера, поперечно сшитого полигидроксилированным соединением, имеющий по меньшей мере 3 и не более 8 гидроксильных групп с атомами водорода по меньшей мере трех гидроксилов, при необходимости или замещенным ненасыщенными алифатическими радикалами, имеющими по меньшей мере 2 атома углерода, с указанными радикалами, содержащими от 2 до 4 атома углерода, такими как винилы, аллилы и другие этиленненасыщенные группы, и ненасыщенные радикалы сами могут содержать другие заместители, такие как метил; Карбопола; Карбопола 974P; Карбопола 934P; Карбопола 971P; гидроксида алюминия; фосфата алюминия; сапонина; Quil A; QS-21; GPI-0100; эмульсии типа вода в масле; эмульсии масло-в-воде; эмульсии вода-в-масле-в-воде; эмульсии на основе легкого жидкого парафинового масла или адъюванта типа Европейской Фармакопеи, изопреноидного масла; сквалана; скваланового масла, полученного в результате олигомеризации алкенов, изобутена или децена; (а) сложного эфира (эфиров) кислоты (кислот) или спирта (спиртов), содержащего линейную алкильную группу; растительного масла (масел); этилолеата; ди-(каприлат/капрат) пропиленгликоля; глицерилтри-(каприлата/капрата); диолеата пропиленгликоля; сложного эфира (эфиров) разветвленной жирной кислоты (кислот) или спирта (спиртов); сложного эфира (эфиров) изостеариновой кислоты; неионного поверхностно-активного вещества (веществ); сложного эфира (эфиров) сорбитана, или маннида, или гликоля, или полиглицерина, или пропиленгликоля, или олеиновой, или изостеариновой кислоты, или рицинолевой кислоты, или гидроксистеариновой кислоты, при необходимости этоксилированной, ангидроманнитололеата; блок-сополимеров полиоксипропилена и полиоксиэтилена, продукта Плюроник, адъювантной системы RIBI; блок-сополимера; SAF-M; монофосфориллипида А; авридинового липидно-аминового адъюванта; термолабильного энтеротоксина из E. coli (рекомбинантного или другого); токсина холеры; IMS 1314 или мурамилдипептида.

Предпочтительно обеспечивается композиция, рассматриваемая дополнительно, в которой носитель, разбавитель или наполнитель включает адъювант, где адъювант включает Карбопол или Карбопол 971.

Предпочтительно обеспечивается композиция, рассматриваемая дополнительно, в которой носитель, разбавитель или наполнитель включает адъювант, где адъювант присутствует в количестве примерно от 50 мкг до 2000 мкг от композиции, или где адъювант присутствует в дозе композиции примерно 250 мкг/мл, или адъювант присутствует в количестве примерно от 100 мкг до 10 мг от композиции, или где адъювант присутствует в количестве примерно от 500 мкг до 5 мг от композиции; адъювант присутствует в количестве примерно от 750 мкг до 2,5 мг от композиции, или адъювант присутствует в количестве примерно 1 мг от композиции.

Предпочтительно обеспечивается композиция, рассматриваемая дополнительно, содержащая иммуномодулирующий агент.

Предпочтительно обеспечивается композиция, рассматриваемая дополнительно, содержащая иммуномодулирующий агент, и при этом иммуномодулирующий агент представляет собой один или несколько из интерлейкина (интерлейкинов), интерферона (интерферонов) или другого цитокина (цитокинов).

Предпочтительно обеспечивается композиция, рассматриваемая дополнительно, содержащая антибиотик (антибиотики).

Предпочтительно обеспечивается композиция, рассматриваемая дополнительно, содержащая антибиотик (антибиотики), где антибиотик (антибиотики) включает гентамицин.

Предпочтительно обеспечивается композиция, рассматриваемая дополнительно, содержащая антибиотик (антибиотики), и где композиция содержит примерно от 1 мкг/мл до 60 мкг/мл антибиотика (антибиотиков).

Предпочтительно обеспечивается композиция, рассматриваемая дополнительно, содержащая антибиотик (антибиотики), и где композиция содержит примерно от 1 мкг/мл до менее примерно 30 мкг/мл антибиотика (антибиотиков).

Предпочтительно обеспечивается композиция, рассматриваемая дополнительно, содержащая дополнительный антиген.

Предпочтительно обеспечивается композиция, рассматриваемая дополнительно, содержащая дополнительный антиген, где указанный дополнительный антиген не является антигеном ORF2 PCV3.

Предпочтительно обеспечивается композиция, рассматриваемая дополнительно, содержащая дополнительный антиген, где указанный дополнительный антиген не является антигеном PCV3.

Предпочтительно обеспечивается композиция, рассматриваемая дополнительно, содержащая дополнительный антиген из дополнительного патогена свиней.

Предпочтительно обеспечивается композиция, рассматриваемая дополнительно, которая дополнительно содержит антиген дополнительного патогена свиней, при этом указанный патоген представляет собой один или несколько антигенов PCV2, PRRSV (вируса респираторного и репродуктивного синдрома свиней), антиген бактерина Mycoplasma hyopneumoniae, антиген надосадочной жидкости Mycoplasma hyopneumoniae, антиген болезни Ауески или псевдобешенства, антиген свиного гриппа, антиген свиной чумы (классической или африканской, или их комбинацию), антиген Actinobacillus pleuropneumoniae, антиген Escherichia coli, антиген свиного парвовируса (PPV) или антиген Pasteurella multocida.

Предпочтительно обеспечивается композиция, рассматриваемая дополнительно, которая дополнительно содержит антиген дополнительного патогена свиней, при этом указанная композиция дополнительно содержит один или несколько из антигена PCV2, антигена PRRSV и антигена PPV.

Предпочтительно представлена композиция, рассматриваемая дополнительно, дополнительно содержащая антиген PCV2.

Предпочтительно обеспечивается композиция, рассматриваемая дополнительно, дополнительно содержащая антиген PCV2, где антиген PCV2 представляет собой белок ORF2 PCV2.

Предпочтительно обеспечивается композиция, рассматриваемая дополнительно, которая дополнительно содержит антиген PCV2, где антиген PCV2 представляет собой рекомбинантный белок ORF2 PCV2.

Предпочтительно обеспечивается композиция, рассматриваемая дополнительно, которая дополнительно содержит антиген PCV2, где антиген PCV2 представляет собой белок ORF2 PCV2, экспрессируемый рекомбинантным бакуловирусом.

Предпочтительно обеспечивается композиция, рассматриваемая дополнительно, находящаяся в лекарственной форме.

Предпочтительно обеспечивается композиция, рассматриваемая дополнительно, которая составлена и/или упакована для введения однократной дозы или однократного введения.

Предпочтительно обеспечивается композиция, рассматриваемая дополнительно, которая составлена и/или упакована для режима множественных доз.

Предпочтительно обеспечивается композиция, рассматриваемая дополнительно, которая составлена и/или упакована для двухдозового режима.

Предпочтительно обеспечивается композиция, рассматриваемая дополнительно, которая находится в лекарственной форме, и при этом указанная лекарственная форма доставляется из контейнера, содержащего большее количество указанной композиции, и при этом лекарственная форма указанной композиции может быть доставлена из указанного контейнера.

Предпочтительно обеспечивается композиция, рассматриваемая дополнительно, которая находится в лекарственной форме, и при этом указанная лекарственная форма доставляется из контейнера, содержащего большее количество указанной композиции, и при этом лекарственная форма указанной композиции может быть доставлена из указанного контейнера, и при этом указанный контейнер содержит по меньшей мере 10 доз указанной композиции.

Предпочтительно обеспечивается композиция, рассматриваемая дополнительно, которая находится в лекарственной форме, и при этом указанная лекарственная форма доставляется из контейнера, содержащего большее количество указанной композиции, и при этом лекарственная форма указанной композиции может быть доставлена из указанного контейнера, и при этом указанный контейнер содержит по меньшей мере 50 доз указанной композиции.

Предпочтительно, обеспечивается композиция, рассматриваемая дополнительно, которая находится в лекарственной форме, и при этом указанная лекарственная форма доставляется из контейнера, содержащего большее количество указанной композиции, и при этом лекарственная форма указанной композиции может быть доставлена из указанного контейнера, и при этом указанный контейнер содержит по меньшей мере 100 доз указанной композиции.

Предпочтительно обеспечивается композиция, рассматриваемая дополнительно, которая находится в лекарственной форме, и при этом указанная лекарственная форма доставляется из контейнера, содержащего большее количество указанной композиции, и при этом лекарственная форма указанной композиции может быть доставлена из указанного контейнера, и при этом указанный контейнер содержит по меньшей мере 200 доз указанной композиции.

Предпочтительно обеспечивается композиция, рассматриваемая дополнительно, которая находится в лекарственной форме, и при этом указанная лекарственная форма доставляется из контейнера, содержащего большее количество указанной композиции, и при этом лекарственная форма указанной композиции может быть доставлена из указанного контейнера, и при этом указанный контейнер содержит по меньшей мере 250 доз указанной композиции.

Предпочтительно обеспечивается композиция, рассматриваемая дополнительно, которая содержит антиген PCV2, где антиген PCV2 представляет собой белок ORF2 PCV2, экспрессируемый рекомбинантным бакуловирусом, и где либо белок, либо объединенное общее количество белка ORF PCV3 и белка ORF PCV2 присутствует в количестве примерно от 0,2 до 400 мкг/дозу, или от 2 до примерно 400 мкг/дозу, или от 4 до примерно 400 мкг/дозу. или от 8 до примерно 400 мкг/дозу, или примерно от 0,3 до 200 мкг/дозу, или от 2 до примерно 200 мкг/дозу, или от 4 до примерно 200 мкг/дозу, или от 8 до примерно 200 мкг/дозу, или примерно от 0,35 до 100 мкг/дозу, или от 2 до примерно 100 мкг/дозу, или от 4 до примерно 100 мкг/дозу, или от 8 до примерно 100 мкг/дозу, или примерно от 0,4 до 50 мкг/дозу, или примерно от 0,45 до 30 мкг/дозу, или примерно от 0,6 до 15 мкг/дозу, или примерно от 0,75 до 8 мкг/дозу, или примерно от 1,0 до 6 мкг/дозу, или примерно от 1,3 до 3,0 мкг/дозу, или примерно от 1,4 до 2,5 мкг/дозу, или примерно от 1,5 до 2,0 мкг/дозу, или примерно 1,6 мкг/дозу.

Предпочтительно обеспечивается композиция, рассматриваемая дополнительно, которая содержит соль.

Предпочтительно обеспечивается композиция, рассматриваемая дополнительно, которая содержит инактивированный вирусный вектор и/или надосадочную жидкость клеточной культуры.

Предпочтительно обеспечивается композиция, рассматриваемая дополнительно, которая содержит инактивированный вирусный вектор и надосадочную жидкость клеточной культуры.

Предпочтительно обеспечивается композиция, рассматриваемая дополнительно, которая включает (i) белок, (ii) по меньшей мере часть бакуловируса, экспрессирующего указанный белок, (iii) часть культуры клеток, которые были инфицированы или трансфицированы рекомбинантным бакуловирусом, экспрессирующим указанный белок, (iv) инактивирующий агент, или инактивирующий агент, включающий бинарный этиленимин (BEI), (v) тиосульфат натрия, или тиосульфат натрия в количествах, эквивалентных инактивирующему агенту или BEI; (vi) адъювант, или адъювант, содержащий Карбопол или Карбопол 971, и (vii) фосфатную соль в физиологически приемлемой концентрации.

Предпочтительно обеспечивается композиция, рассматриваемая дополнительно, которая включает (i) белок, (ii) по меньшей мере часть бакуловируса, экспрессирующего указанный белок, (iii) часть культуры клеток, которые были инфицированы или трансфицированы рекомбинантным бакуловирусом, экспрессирующим указанный белок, (iv) инактивирующий агент, или инактивирующий агент, включающий бинарный этиленимин (BEI), (v) тиосульфат натрия, или тиосульфат натрия в количествах, эквивалентных инактивирующему агенту или BEI; (vi) адъювант, или адъювант, содержащий Карбопол или Карбопол 971, и (vii) фосфатную соль в физиологически приемлемой концентрации, и где BEI получен из культуры клеток, обработанной примерно от 2 до 8 или примерно 5 мМ BEI для инактивации бакуловируса, и/или композиция содержит примерно от 2 до 8 или примерно 5 мМ BEI, и/или композиция содержит примерно 1 мг Карбопола или Карбопола 971.

Предпочтительно обеспечивается композиция, рассматриваемая дополнительно, которая представляет собой иммуногенную композицию, содержащую белок, рассматриваемый дополнительно, и носитель, разбавитель или наполнитель.

Предпочтительно обеспечивается композиция, рассматриваемая дополнительно, которая представляет собой иммуногенную композицию, содержащую белок, рассматриваемый дополнительно, и носитель, разбавитель или наполнитель, и дополнительный антиген, как указано выше.

Также обеспечивается способ создания композиции, рассматриваемой дополнительно, где белок, рассматриваемый дополнительно, смешивают с носителем, разбавителем или наполнителем.

Кроме того, обеспечивается способ создания композиции, рассматриваемой дополнительно, где белок, рассматриваемый дополнительно, смешивают с носителем, разбавителем или наполнителем, и дополнительным антигеном.

Кроме того, для использования в качестве лекарственного средства обеспечивается белок, рассматриваемый дополнительно.

Также белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования в качестве вакцины.

Также белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования в способе индукции иммунного ответа или иммунологического ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа против PCV3 у животного.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования в способе индукции иммунного ответа или иммунологического ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа против PCV3 у свиней.

Также белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования в способе индукции иммунного ответа или иммунологического ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа против PCV3 у молодых свиней.

Также белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования в способе индукции иммунного ответа или иммунологического ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа против PCV3 у поросят.

Также белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования в способе индукции иммунного ответа или иммунологического ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа против PCV3 у поросят; при этом поросят должны вскармливать свиноматки, которым вводили белок, рассматриваемый дополнительно, или композицию, рассматриваемую дополнительно.

Также белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования в способе индукции иммунного ответа или иммунологического ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа против PCV3 у свиноматок.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования в способе индукции иммунного ответа или иммунологического ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа против PCV3 у беременных свиноматок, свиней до первого опороса или подсвинков для осеменения.

Также белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования с целью индукции иммунного ответа против PCV3 у животных.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования с целью индукции иммунного ответа против PCV3 у свиней.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования с целью индукции иммунного ответа против PCV3 у молодых свиней.

Также белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования с целью индукции иммунного ответа против PCV3 у поросят.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования с целью индукции иммунного ответа против PCV3 у поросят; при этом поросята должны получать кормление от свиноматок, которым вводили белок, рассматриваемый дополнительно, или композицию, рассматриваемую дополнительно.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования с целью индукции иммунного ответа против PCV3 у свиноматок.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования с целью индукции иммунного ответа против PCV3 у беременных свиноматок, свиней до первого опороса или подсвинков до осеменения.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования в способе уменьшения или предотвращения клинических признаков или клинических симптомов, или заболевания, вызванного инфекцией PCV3 у животного, или для использования в способе лечения или профилактики инфекции PCV3 у животного.

Также белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования в способе уменьшения или предотвращения клинических признаков или клинических симптомов, или заболевания, вызванного инфекцией PCV3 у животного, или для использования в способе лечения или профилактики инфекции PCV3 у животного, где указанное животное является свиньей.

Также белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования в способе уменьшения или предотвращения клинических признаков, или клинических симптомов или заболевания, вызванного инфекцией PCV3 у животного, или для использования в способе лечения или профилактики инфекции PCV3 у животного, где указанное животное является молодой свиньей.

Также белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования в способе уменьшения или предотвращения клинических признаков, или клинических симптомов или заболевания, вызванного инфекцией PCV3 у животного, или для использования в способе лечения или предотвращения инфекции PCV3 у животного, где указанное животное является поросенком.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования в способе уменьшения или предотвращения клинических признаков, или клинических симптомов или заболевания, вызванного инфекцией PCV3 у животного, или для использования в способе лечения или профилактики инфекции PCV3 у животного, где указанное животное представляет собой поросенка, и при этом поросенок должен вскармливаться свиноматкой, которой был введен белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования в способе уменьшения или предотвращения клинических признаков или заболевания, вызванного инфекцией PCV3 у животного, или для использования в способе лечения или предотвращения инфекции PCV3 у животного, где указанное животное является свиноматкой.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования в способе уменьшения или предотвращения клинических признаков, или клинических симптомов или заболевания, вызванного инфекцией PCV3 у животного, или для использования в способе лечения или профилактики инфекции PCV3 у животного, где указанное животное представляет собой беременную свиноматку, свинью до первого опороса или подсвинка до осеменения.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования при иммунизации животного против PCV3.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования при иммунизации животного против PCV3, где указанное животное является свиньей.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования при иммунизации животного против PCV3, где указанное животное является молодой свиньей.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования при иммунизации животного против PCV3, где указанное животное представляет собой поросенка.

Также белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования при иммунизации животного против PCV3, где указанное животное представляет собой поросенка, и при этом поросенок должен вскармливаться свиноматкой, которой был введен белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования при иммунизации животного против PCV3, где указанное животное является свиноматкой.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования при иммунизации животного против PCV3, где указанное животное представляет собой беременную свиноматку, свинью до первого опороса или подсвинка до осеменения.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования в способе снижения, или элиминации, или нейтрализации экспрессии вируса PCV3 у животного.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования в способе снижения, или элиминации, или нейтрализации экспрессии вируса PCV3 у животного, где указанное животное является свиньей.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования в способе снижения, или элиминации, или нейтрализации экспрессии вируса PCV3 у животного, где указанное животное является молодой свиньей.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования в способе снижения, элиминации или нейтрализации экспрессии вируса PCV3 у животного, где указанное животное представляет собой поросенка.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования в способе снижения, элиминации или нейтрализации экспрессии вируса PCV3 у животного, где указанное животное представляет собой поросенка, и при этом поросенок должен вскармливаться свиноматкой, которой был введен белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования в способе снижения, или элиминации, или нейтрализации экспрессии вируса PCV3 у животного, где указанное животное является свиноматкой.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования в способе снижения, или элиминации, или нейтрализации экспрессии вируса PCV3 у животного, где указанное животное представляет собой беременную свиноматку, свинью до первого опороса или подсвинка до осеменения.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования с целью индукции выработки антител, специфичных к PCV3, у животного.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования с целью индукции выработки антител, специфичных к PCV3, у животного, где указанное животное является свиньей.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования с целью индукции выработки антител, специфичных к PCV3, у животного, где указанное животное представляет собой молодую свинью.

Также белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования с целью индукции выработки антител, специфичных к PCV3, у животного, где указанное животное представляет собой поросенка.

Также белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования с целью индукции выработки антител, специфичных к PCV3, у животного, где указанное животное представляет собой поросенка, и при этом поросенок должен вскармливаться свиноматкой, которой был введен белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования с целью индукции выработки антител, специфичных к PCV3, у животного, где указанное животное является свиноматкой.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования с целью индукции выработки антител, специфичных к PCV3, у животного, где указанное животное представляет собой беременную свиноматку, свинью до первого опороса или подсвинка до осеменения.

Предпочтительно указанный белок, рассматриваемый дополнительно, или композицию, рассматриваемую дополнительно, вводят указанному животному внутримышечно или интрадермально.

Предпочтительно, указанный белок, рассматриваемый дополнительно, или композицию, рассматриваемую дополнительно, вводят указанному животному в сочетании с другим антигеном, предпочтительно, когда другой патоген является антигеном патогена свиней.

Предпочтительно, указанный белок, рассматриваемый дополнительно, или композицию, рассматриваемую дополнительно, вводят указанному животному вместе с другим антигеном, где указанный другой антиген не является антигеном ORF2 PCV3, предпочтительно, когда другой патоген является антигеном патогена свиней.

Предпочтительно, указанный белок, рассматриваемый дополнительно, или композицию, рассматриваемую дополнительно, вводят указанному животному вместе с другим антигеном, где указанный другой антиген не является антигеном PCV3, предпочтительно, когда другой патоген является антигеном патогена свиньи.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для любого из вышеуказанных применений, где указанное животное представляет собой свиноматку, беременную поросенком.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для любого из вышеупомянутых применений, где указанное животное представляет собой свиноматку, беременную поросенком, и при этом поросенок должен вскармливаться свиноматкой, которой вводили белок, рассматриваемый дополнительно, или композицию, рассматриваемую дополнительно.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для любого из вышеупомянутых применений, где указанное животное является свиноматкой, и при этом указанный белок, рассматриваемый дополнительно, или указанную композицию, рассматриваемую дополнительно, вводят дважды указанной свиноматке.

Предпочтительно указанным животным является свиноматка, и при этом указанный белок, рассматриваемый дополнительно, или указанную композицию, рассматриваемую дополнительно, вводят указанной свиноматке только дважды.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для любого из вышеупомянутых применений, где указанное животное является поросенком, и где белок, рассматриваемый в дальнейшем, или композицию, рассматриваемую дополнительно, вводят указанному поросенку один раз.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для любого из вышеуказанных применений, в которых указанное животное является поросенком, и при этом белок, рассматриваемый дополнительно, или композицию, рассматриваемую дополнительно, вводят указанному поросенку только один раз.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для любого из вышеупомянутых применений, в которых указанное животное является свиноматкой, и где белок, рассматриваемый дополнительно, или композицию, рассматриваемую дополнительно, вводят дважды указанной свиноматке, и где указанное применение не включает введение какого-либо другого антигена PCV3 указанному животному до или во время введения указанного белка, рассматриваемого дополнительно, или композиции, рассматриваемой дополнительно.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для любого из вышеуказанных применений, где указанное животное является свиноматкой, и при этом белок, рассматриваемый дополнительно, или композицию, рассматриваемую дополнительно, вводят дважды указанной свиноматке, и где указанное применение не включает введение какого-либо другого антигена PCV3 указанному животному до или во время введения указанного белка, рассматриваемого дополнительно, или композиции, рассматриваемой дополнительно.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для любого из вышеуказанных применений, где указанное животное является свиноматкой, и при этом белок, рассматриваемый дополнительно, или композицию, рассматриваемую дополнительно, вводят указанной свиноматке только дважды, и где указанное применение не включает введение какого-либо другого антигена PCV3 указанному животному до или во время введения указанного белка, рассматриваемого дополнительно, или композиции, рассматриваемой дополнительно.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для любого из вышеупомянутых применений, где указанное животное является поросенком, и где белок, рассматриваемый дополнительно, или композицию, рассматриваемую дополнительно, вводят один раз указанному поросенку, и где указанное применение не включает введение какого-либо другого антигена PCV3 указанному животному до или во время введения указанного белка, рассматриваемого дополнительно, или композиции, рассматриваемой дополнительно.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для любого из вышеуказанных применений, где указанное животное является поросенком, и где белок, рассматриваемый дополнительно, или композицию, рассматриваемую дополнительно, вводят один раз указанному поросенку, и где указанное применение не включает введение какого-либо другого антигена PCV3 указанному животному до или во время введения указанного белка, рассматриваемого дополнительно, или композиции, рассматриваемой дополнительно.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для любого из вышеуказанных применений, где указанное животное является поросенком, и где белок, рассматриваемый дополнительно, или композицию, рассматриваемую дополнительно, вводят только один раз указанному поросенку, и где указанное применение не включает введение какого-либо другого антигена PCV3 указанному животному до или во время введения указанного белка, рассматриваемого дополнительно, или композиции, рассматриваемой дополнительно.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для любого из вышеупомянутых применений, где введение животному при применении состоит из однодозовой, однократной вакцинации или единственного введения одной дозы указанного белка, рассматриваемого дополнительно, или композиции, рассматриваемой дополнительно.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для любого из вышеупомянутых применений, где введение животному при применении состоит из режима многократной вакцинациии или режима нескольких доз указанного белка, рассматриваемого дополнительно, или композиции, рассматриваемой дополнительно.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для любого из вышеупомянутых применений, где введение животному при применении состоит из двукратной вакцинации, или двукратного применения дозы указанного белка, рассматриваемого дополнительно, или композиции, рассматриваемой дополнительно.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для любого из вышеуказанных применений, при котором введение животному осуществляют в течение по меньшей мере 1, 2 или 3 недель контакта с вирулентным цирковирусом свиней.

Кроме того, обеспечивается белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, где животным является поросенок не старше 15-недельного возраста, или не старше 6-недельного возраста, или не старше 3-х недельного возраста, или не старше 2-х недельного возраста, или не старше 1-недельного возраста.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для любого из вышеупомянутых применений, где указанный белок, рассматриваемый дополнительно, предназначен для любого из вышеупомянутых применений.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для любого из вышеупомянутых применений, где указанный белок, рассматриваемый дополнительно, предназначен для использования в двух или более случаях, упомянутых выше.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для любого из вышеуказанных применений, при этом указанная композиция, рассматриваемая дополнительно, предназначена для любого из вышеуказанных применений.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для любого из вышеуказанных применений, в которых животному вводят второй антиген перед введением белка, рассматриваемого дополнительно, или композиции, рассматриваемой дополнительно.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для любого из вышеупомянутых применений, где второй антиген вводят животному одновременно с введением белка, рассматриваемого дополнительно, или композиции, рассматриваемой дополнительно.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для любого из вышеуказанных применений, где второй антиген вводят животному в то же время и в той же композиции, что и при введении белка, рассматриваемого дополнительно, или композиции, рассматриваемой дополнительно.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для любого из вышеупомянутых применений, где второй антиген вводят животному в то же время и в другой композиции, чем при введении белка, рассматриваемого дополнительно, или композиции, рассматриваемой дополнительно.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для любого из вышеупомянутых применений, где второй антиген вводят животному после введения белка, рассматриваемого дополнительно, или композиции, рассматриваемой дополнительно.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования при вакцинации свиньи для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у свиньи, где белок находится в иммуногенной композиции, которую вводят свинье в одной дозе.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования при вакцинации молодой свиньи для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи, где белок находится в иммуногенной композиции, которую вводят свинье только в одной дозе.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования при вакцинации молодой свиньи для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у свиньи, где белок находится в иммуногенной композиции, которую вводят этой молодой свинье в двух дозах.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования при вакцинации молодой свиньи для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи, где белок находится в иммуногенной композиции, которую вводят этой молодой свинье только в двух дозах.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования в качестве единственного антигена PCV3 для вакцинации молодой свиньи, чтобы уменьшить тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у молодой свиньи, где белок находится в иммуногенной композиции, которую вводят этой молодой свинье в одной дозе.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования в качестве единственного антигена PCV3 для вакцинации молодой свиньи, чтобы уменьшить тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у молодой свиньи, где белок находится в иммуногенной композиции, которую вводят этой молодой свинье только в одной дозе.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования в качестве единственного антигена PCV3 для вакцинации молодой свиньи, чтобы уменьшить тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у молодой свиньи, где белок находится в иммуногенной композиции, которую вводят этой молодой свинье в двух дозах.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для использования в качестве единственного антигена PCV3 для вакцинации молодой свиньи, чтобы уменьшить тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у молодой свиньи, где белок находится в иммуногенной композиции, которую вводят этой молодой свинье только в двух дозах.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у молодой свиньи;

где одну дозу иммуногенной композиции вводят этой молодой свинье способом вакцинации для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у молодой свиньи;

где введение одной дозы иммуногенной композиции молодой свинье в способе вакцинации уменьшает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где белок, рассматриваемый дополнительно, представляет собой антигенный компонент в одной дозе иммуногенной композиции в способе вакцинации, который уменьшает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

предпочтительно белок присутствует в количестве по меньшей мере 2 мкг в одной дозе иммуногенной композиции;

где белок является антигенным компонентом в способе вакцинации, который снижает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи.

В настоящей заявке также представлена иммуногенная композиция, рассматриваемая дополнительно, для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где только одну дозу иммуногенной композиции вводят этой молодой свинье способом вакцинации для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где введение одной дозы иммуногенной композиции молодой свинье в способе вакцинации снижает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где белок, рассматриваемый дополнительно, представляет собой антигенный компонент в одной дозе иммуногенной композиции в способе вакцинации, который уменьшает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

предпочтительно, где белок присутствует в количестве по меньшей мере 2 мкг в одной дозе иммуногенной композиции;

где белок является антигенным компонентом в способе вакцинации, который снижает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи.

Кроме того, белок, рассматриваемый дополнительно, или композиция, рассматриваемая дополнительно, обеспечивается для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где две дозы иммуногенной композиции вводят этой молодой свинье способом вакцинации для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где введение двух доз иммуногенной композиции молодой свинье в способе вакцинации снижает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где белок, рассматриваемый дополнительно, представляет собой антигенный компонент в двух дозах иммуногенной композиции в способе вакцинации, который уменьшает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

предпочтительно, белок присутствует в количестве по меньшей мере 2 мкг в одной дозе иммуногенной композиции;

где белок является антигенным компонентом в способе вакцинации, который снижает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи.

Также обеспечивается иммуногенная композиция, рассматриваемая дополнительно, для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у молодой свиньи;

где только две дозы иммуногенной композиции вводят этой молодой свинье способом вакцинации для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где введение двух доз иммуногенной композиции молодой свинье в способе вакцинации снижает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где белок, рассматриваемый дополнительно, представляет собой антигенный компонент в двух дозах иммуногенной композиции в способе вакцинации, который уменьшает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

предпочтительно белок присутствует в количестве по меньшей мере 2 мкг в одной дозе иммуногенной композиции;

где белок является антигенным компонентом в способе вакцинации, который снижает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи.

Предпочтительно, в любом из вышеупомянутых применений указанные клинические признаки или симптомы выбраны из группы, состоящей из снижения среднесуточного привеса и смертности.

Предпочтительно, в любом из вышеупомянутых применений указанные клинические признаки или симптомы выбираются из группы, состоящей из макроскопических повреждений, гистологических нарушений, репликации PCV3 в ткани и виремии PCV3.

Предпочтительно, в любом из вышеупомянутых применений указанные клинические признаки или симптомы выбраны из группы, состоящей из развития или продукции мумифицированного, мертворожденного и/или слабого плода.

Предпочтительно при любом из вышеупомянутых применений указанные клинические признаки или симптомы представляют собой или включают выталкивание мумифицированного, мертворожденного и/или слабого плода.

Настоящее изобретение теперь будет описано посредством следующих наборов пунктов. Для простоты ссылки эти наборы пунктов были помечены как набор пунктов A, набор пунктов B и т.д. Раскрытие в каждом наборе пунктов в равной степени применимо к настоящему изобретению. Аналогичным образом раскрытие информации в каждом наборе пунктов в равной степени применимо ко всем остальным пунктам:

НАБОР ПУНКТОВ A:

Набор пунктов A - Настоящее изобретение теперь будет описано посредством следующего набора пронумерованных пунктов (набор пунктов A). Раскрытие в этом наборе пунктов в равной степени применимо к настоящему изобретению. Подобным образом раскрытие в этом наборе пунктов в равной степени применимо к каждому из других наборов пунктов.

1. Композиция, содержащая:

белок ORF2 цирковируса свиней 3 типа (PCV3), и

ветеринарно приемлемый носитель, включающий растворитель, дисперсионную среду, покрытие, стабилизирующий агент, разбавитель, консервант, противомикробный агент, противогрибковый агент, изотонический агент, агент, замедляющий адсорбцию, адъювант, надосадочную жидкость клеточной культуры, стабилизирующий агент, вирусный вектор или вектор экспрессии, и иммуномодулирующий агент, или любую их комбинацию.

2. Композиция по п.1, где ветеринарно приемлемый носитель включает адъювант, иммуномодулирующий агент, надосадочную жидкость клеточной культуры, вирусный вектор или вектор экспрессии, или любую их комбинацию.

3. Композиция по п.1, где ветеринарно приемлемый носитель включает адъювант.

4. Композиция по любому из пп.1-3, где ORF2 PCV3 относится к группе a1, b1 или b2 (с использованием обозначения подтипа Fux et al., «Full genome characterization of porcine circovirus type 3 isolates reveals the existence of two distinct groups of virus strains», Virology Journal (2018) 15:25, DOI 10.1186/s12985-018-0929-3 (включено в настоящий документ посредством ссылки); см., например, таблицу 4).

5. Композиция по любому из пп.1-3, где белок ORF2 PCV3 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, кодируемой полинуклеотидной последовательностью, имеющей по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1 или гомологии последовательности с SEQ ID NO: 1.

6. Композиция по любому из пп.1-5, где белок ORF2 PCV3 представляет собой рекомбинантный белок ORF2 PCV3 в результате его экспрессии вектором экспрессии, содержащим полинуклеотидную последовательность, кодирующую белок ORF2 PCV3.

7. Композиция по п.6, где вектор экспрессии представляет собой бакуловирус.

8. Композиция по любому из пп.1-7, дополнительно содержащая белок ORF2 PCV2.

9. Композиция по п.8, где белок ORF2 PCV2 получен при экспрессии вектором экспрессии, содержащим полинуклеотидную последовательность, кодирующую белок ORF2 PCV2.

10. Композиция по п.9, где вектор экспрессии представляет собой бакуловирус.

11. Композиция по любому из пп.1-10, дополнительно содержащая дополнительный антиген дополнительного патогена свиней.

12. Композиция по п.11, где дополнительный антиген дополнительного патогена свиней включает антиген PRRSV (вируса респираторного и репродуктивного синдрома свиней), бактериновый антиген Mycoplasma hyopneumoniae, антиген надосадочной жидкости Mycoplasma hyopneumoniae, антиген болезни Ауески или псевдобешенства, антиген свиного гриппа, антиген чумы свиней (классической или африканской, или их комбинации), антиген Actinobacillus pleuropneumoniae, антиген Escherichia coli, или антиген Pasteurella multocida.

13. Композиция по любому из пп.1-12, где белок ORF2 PCV3 присутствует в количестве от 0,2 до примерно 400 мкг/мл, или примерно от 0,3 до 200 мкг/мл, или примерно от 0,35 до 100 мкг/мл, или примерно от 0,4 до 50 мкг/мл, или примерно от 0,45 до 30 мкг/мл, или примерно от 0,6 до 15 мкг/мл, или примерно от 0,75 до 8 мкг/мл, или примерно от 1,0 до 6 мкг/мл, или примерно от 1,3 до 3,0 мкг/мл, или примерно от 1,4 до 2,5 мкг/мл, или примерно от 1,5 до 2,0 мкг/мл, или примерно 1,6 мкг/мл.

14. Композиция по любому из пп.1-12, где белок ORF2 PCV3 или общие белки ORF2 PCV2 и PCV3 присутствуют в количестве примерно от 0,2 до 400 мкг/дозу, или примерно от 0,3 до 200 мкг/дозу, или примерно от 0,35 до 100 мкг/дозу, или примерно от 0,4 до 50 мкг/дозу, или примерно от 0,45 до 30 мкг/дозу, или примерно от 0,6 до 15 мкг/дозу, или примерно от 0,75 до 8 мкг/дозу, или примерно от 1,0 до 6 мкг/дозу, или примерно от 1,3 до 3,0 мкг/дозу, или примерно от 1,4 до 2,5 мкг/дозу, или примерно от 1,5 до 2,0 мкг/дозу, или примерно 1,6 мкг/дозу.

15. Композиция по любому из пп.1-14, где адъювант включает гидроксид алюминия; фосфат алюминия; сапонин; Quil A; QS-21; GPI-0100; эмульсию вода-в- масле; эмульсию масло-в-воде; эмульсию вода-в-масле-в-воде; эмульсию на основе легкого жидкого парафинового масла или адъюванта типа Европейской Фармакопеи, изопреноидное масло; сквалан; сквалановое масло, полученное в результате олигомеризации алкенов, изобутена или децена; сложный эфир (эфиры) кислоты (кислот) или спирта (спиртов), содержащих линейную алкильную группу; растительное масло (масла); этилолеат; ди-(каприлат/капрат) пропиленгликоля; глицерилтри-(каприлат/ капрат); диолеат пропиленгликоля; сложный эфир (эфиры) разветвленной жирной кислоты (кислот) или спирта (спиртов); сложный эфир (эфиры) изостеариновой кислоты; неионное поверхностно-активное вещество (вещества); сложный эфир (эфиры) сорбитана, или маннида, или гликоля, или полиглицерина, или пропиленгликоля, или олеиновой кислоты, или изостеариновой кислоты, или рицинолевой кислоты, или гидроксистеариновой кислоты, при необходимости этоксилированный, ангидроманнитололеат; блок-сополимеры полиоксипропилена и полиоксиэтилена, продукт Плюроник, Карбопол; Карбопол 974P; Карбопол 934P; Карбопол 971P; полимер акриловой или метакриловой кислоты; сополимер малеинового ангидрида и алкенильного производного; сшитый полимер акриловой или метакриловой кислоты; полимер акриловой или метакриловой кислоты, сшитый с полиалкениловым эфиром сахара или полиспирта; карбомер; акриловый полимер, поперечно сшитый полигидроксилированным соединением, имеющий по меньшей мере 3 и не более 8 гидроксильных групп с атомами водорода по меньшей мере трех гидроксилов, при необходимости замещенными или замещенным ненасыщенными алифатическими радикалами, имеющими по меньшей мере 2 атома углерода, с указанными радикалами, содержащими от 2 до 4 атома углерода, такими как винилы, аллилы и другие этиленненасыщенные группы, и ненасыщенные радикалы сами могут содержать другие заместители, такие как метил; адъювантную систему RIBI; блок-сополимер; SAF-M; монофосфориллипид А; авридиновый липидно-аминовый адъювант; термолабильный энтеротоксин из E. coli (рекомбинантный или другой); токсин холеры; IMS 1314 или мурамилдипептид.

16. Композиция по любому из пп.1-15, содержащая примерно от 50 мкг до 2000 мкг адъюванта, или где адъювант присутствует в количестве примерно 250 мкг/мл в дозе композиции, или адъювант присутствует в количестве примерно от 100 мкг до 10 мг на дозу, или где адъювант присутствует в количестве примерно от 500 мкг до 5 мг на дозу; адъювант присутствует в количестве примерно от 750 мкг до 2,5 мг на дозу, или адъювант присутствует в количестве примерно 1 мг на дозу.

17. Композиция по любому из пп.1-16, где иммуномодулирующий агент включает интерлейкин (интерлейкины), интерферон (интерфероны) или другой цитокин (цитокины), или гемоцианин лимфы улитки (KLH), или KLH, эмульгированный с неполным адъювантом Фрейнда (KLH/ICFA).

18. Композиция по любому из пп.1-17, содержащая примерно от 1 мкг/мл до 60 мкг/мл антибиотика (антибиотиков) или менее примерно 30 мкг/мл антибиотика (антибиотиков).

19. Композиция по любому из пп.1-18, где антибиотик (антибиотики) включает гентамицин.

20. Композиция по любому из пп.1-19, содержащая (i) белок ORF2 PCV3, (ii) по меньшей мере часть бакуловируса, экспрессирующего указанный белок ORF2 PCV3, (iii) часть культуры клеток, которые были инфицированы или трансфицированы рекомбинантным бакуловирусом, который экспрессировал указанный белок ORF2 PCV3, (iv) инактивирующий агент, или инактивирующий агент, содержащий бинарный этиленимин (BEI), (v) тиосульфат натрия, или тиосульфат натрия в количествах, эквивалентных инактивирующему агенту или BEI; (vi) адъювант, или адъювант, содержащий Карбопол или Карбопол 971, и (vii) фосфатную соль в физиологически приемлемой концентрации.

21. Композиция по п.20, где примерно 90% компонентов (i) - (iii) имеют размер менее 1 мкм, а pH указанной композиции доведен примерно до 6,5-7,5.

22. Композиция по п.20 или 21, где BEI получен из культуры клеток, обработанной примерно от 2 до 8 или примерно 5 мМ BEI для инактивации бакуловируса, и/или композиция содержит примерно от 2 до 8 или примерно 5 мМ BEI, и/или композиция содержит примерно 1 мг Карбопола или Карбопола 971.

23. Композиция по любому из пп.1-22, составленная и/или упакованная для введения единичной дозы или однократной иммунизации, а не для режима множественных доз.

24. Способ индукции иммунного ответа или иммунологического ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа против (i) PCV3 и/или (ii) PCV2 и PCV3, и/или (iii) PCV3 и другого патогена свиней, и/или (iv) PCV3, PCV2 и другого патогена свиней, включающий введение животному композиции, определенной в любом из пунктов 1-23.

25. Способ по п.25, где животное представляет собой свинью.

26. Способ по п.25, где свинья представляет собой молодую свинью, или поросенка.

27. Способ по п.26, где молодая свинья или поросенок имеют возраст не старше 15 недель, или не старше 6 недель, или не старше 3 недель, или не старше 2 недель, или не старше 1 недели.

28. Способ по п.26, где введение осуществляют в течение по меньшей мере 1, 2 или 3 недель после контакта с вирулентным цирковирусом свиней.

29. Способ по любому из пп.24-28, где введение включает единственную, введение путем однократного введения, или однократное введение одной дозы; а не режим многократной вакцинации или многократного введения.

30. Использование композиции по любому из пп.1-23 в способе любого из пунктов 24-29, или применение белка ORF2 PCV3, одного или в комбинации, в любой из композиций по пп.1-23, для использования при приготовлении композиции с целью индукции иммунологического или иммунного ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа против (i) PCV3 и/или (ii) PCV2 и PCV3, и/или (iii) PCV3 и другого патогена свиней, и/или (iv) PCV3, PCV2 и другого патогена свиней, или для использования в способе индукции иммунологического или иммунного ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа против (i) PCV3 и/или (ii) PCV2 и PCV3, и/или (iii) PCV3 и другого патогена свиней, и/или (iv) PCV3, PCV2 и другого патогена свиней.

31. Способ получения композиции по любому из пп.1-23, включающий продукцию белка ORF2 PCV3 с помощью системы экспрессии бакуловируса в культивируемых клетках насекомых.

32. Способ по п.31, включающий инактивацию бакуловируса.

33. Способ по п.32, в котором инактивация включает тепловую обработку или использование агента, инактивирующего вирус.

34. Способ по п.25, где агент, инактивирующий вирус, включает азиридиновое соединение.

35. Способ по п. 26, где азиридиновое соединение включает BEI.

36. Рекомбинантный вектор, содержащий полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную последовательность, кодирующую белок ORF2 PCV3.

37. Рекомбинантный вектор по п. 36, где ORF2 PCV3 относится к группе a1, b1 или b2 (с использованием обозначения подтипа Fux et al., «Full genome characterization of porcine circovirus type 3 isolates reveals the existence of two distinct groups of virus strains», Virology Journal (2018) 15:25, DOI 10.1186/s12985-018-0929-3 (включено в настоящий документ посредством ссылки); см., например, таблицу 4).

38. Рекомбинантный вектор по п.36, где белок ORF2 PCV3 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, кодируемой полинуклеотидной последовательностью, имеющей по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности последовательности или гомологии последовательности с SEQ ID NO: 1.

39. Рекомбинантный вектор по любому из пп.36-38, представляющий собой бакуловирус.

40. Рекомбинантный вектор по п.39, включающий по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности последовательности или гомологии последовательности с SEQ ID NO: 2.

НАБОР ПУНКТОВ B:

Набор пунктов B - Настоящее изобретение теперь будет описано посредством следующего набора пронумерованных пунктов (Набор пунктов B). Раскрытие в этом наборе пунктов в равной степени применимо к настоящему изобретению. Подобным образом раскрытие в этом наборе пунктов в равной степени применимо к каждому из других наборов пунктов.

1. Композиция, содержащая белок ORF2 цирковируса свиней 3 типа (PCV3), предпочтительно антигенный белок ORF2 PCV3 (антиген ORF2 PCV3).

2. Композиция по п.1, дополнительно содержащая ветеринарно приемлемый носитель, выбранный из группы, состоящей из растворителя, дисперсионной среды, покрытия, стабилизирующего агента, разбавителя, консерванта, противомикробного агента, противогрибкового агента, изотонического агента, агента, замедляющего адсорбцию, адъюванта, надосадочной жидкости клеточной культуры, стабилизирующего агента, вирусного вектора, вектора экспрессии, иммуномодулирующего агента и/или любой их комбинации.

3. Композиция, в частности композиция по пп.1 или 2, содержащая: белок ORF2 цирковируса свиней 3 типа (PCV3), и ветеринарно приемлемый носитель, содержащий растворитель, дисперсионную среду, покрытие, стабилизирующий агент, разбавитель, консервант, противомикробный агент, противогрибковый агент, изотонический агент, агент, замедляющий адсорбцию, адъювант, надосадочную жидкость клеточной культуры, стабилизирующий агент, вирусный или экспрессирующий вектор, иммуномодулирующий агент и/или любую их комбинацию.

4. Композиция по любому из пп.1-3, где ветеринарно приемлемый носитель включает адъювант, иммуномодулирующий агент, надосадочную жидкость клеточной культуры, вирусный вектор или вектор экспрессии, или любую их комбинацию.

5. Композиция по любому из пп.1-4, где ветеринарно приемлемый носитель включает адъювант.

6. Композиция по любому из пп.1-5, где PCV3 выбран из группы, состоящей из PCV3a и PCV3b.

7. Композиция по любому из пп.1-6, где PCV3 представляет собой любую филогенетическую ветвь PCV3 или выбран из группы, состоящей из PCV3a1, PCV3b1, PCV3b2 и PCV3c.

8. Композиция по любому из пп.1-7, где ORF2 PCV3 относится к группе a1, b1 или b2.

9. Композиция по любому из пп.1-8, где белок ORF2 CV3 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, кодируемой полинуклеотидной последовательностью, имеющей по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1 или гомологии последовательности с SEQ ID NO: 1.

10. Композиция по любому из пп.1-9, где белок ORF2 PCV3 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 90% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 4.

11. Композиция по любому из пп.1-10, где белок ORF2 PCV3 представляет собой рекомбинантный белок ORF2 PCV3.

12. Композиция по любому из пп.1-11, где белок ORF2 PCV3 представляет собой рекомбинантный белок ORF2 PCV3 в результате его экспрессии вектором экспрессии, содержащим полинуклеотидную последовательность, кодирующую белок ORF2 PCV3.

13. Композиция по п.12, где вектор экспрессии представляет собой бакуловирус.

14. Композиция по любому из пп.1-13, где белок ORF2 PCV3 представляет собой ORF2 PCV3, экспрессируемый рекомбинантным бакуловирусом.

15. Композиция по любому из пп.1-14, дополнительно включающая белок ORF2 PCV2, предпочтительно антигенный белок ORF2 PCV2 (антиген ORF2 PCV2).

16. Композиция по п.15, где белок ORF2 PCV2 получен при экспрессии вектором экспрессии, содержащим полинуклеотидную последовательность, кодирующую белок ORF2 PCV2.

17. Композиция по п.16, где вектор экспрессии представляет собой бакуловирус.

18. Композиция по любому из пп.1-17, дополнительно включающая дополнительный антиген дополнительного патогена свиней.

19. Композиция по п.18, где дополнительный антиген дополнительного патогена свиней включает антиген PRRSV (вируса респираторного и репродуктивного синдрома свиней), бактериновый антиген Mycoplasma hyopneumoniae, антиген надосадочной жидкости Mycoplasma hyopneumoniae, антиген болезни Ауески или псевдобешенства, антиген свиного гриппа, антиген чумы свиней (классической или африканской, или их комбинации), антиген Actinobacillus pleuropneumoniae, антиген Escherichia coli, антиген парвовируса свиней (PPV) или антиген Pasteurella multocida, или их комбинацию.

20. Композиция по любому из пп.1-19, где белок ORF2 PCV3 присутствует в количестве от 0,2 до примерно 400 мкг/мл, или примерно от 0,3 до 200 мкг/мл, или примерно от 0,35 до 100 мкг/мл. или примерно от 0,4 до 50 мкг/мл, или примерно от 0,45 до 30 мкг/мл, или примерно от 0,6 до 15 мкг/мл, или примерно от 0,75 до 8 мкг/мл, или примерно от 1,0 до 6 мкг/мл, или примерно от 1,3 до 3,0 мкг/мл, или примерно от 1,4 до 2,5 мкг/мл, или примерно от 1,5 до 2,0 мкг/мл, или примерно 1,6 мкг/мл.

21. Композиция по любому из п.п 1-20, где белок ORF2 PCV3 или общие белки ORF2 PCV2 и PCV3 присутствуют в количестве примерно от 0,2 до 400 мкг/дозу, или примерно от 0,3 до 200 мкг/дозу, или примерно от 0,35 до 100 мкг/дозу, или примерно от 0,4 до 50 мкг/дозу, или примерно от 0,45 до 30 мкг/дозу, или примерно от 0,6 до 15 мкг/дозу, или примерно от 0,75 до 8 мкг/дозу, или примерно от 1,0 до 6 мкг/дозу, или примерно от 1,3 до 3,0 мкг/дозу, или примерно от 1,4 до 2,5 мкг/дозу, или примерно от 1,5 до 2,0 мкг/дозу, или примерно 1,6 мкг/дозу.

22. Композиция по любому из пп.2-21, где адъювант включает полимер акриловой или метакриловой кислоты; сополимер малеинового ангидрида и алкенильного производного; сшитый полимер акриловой или метакриловой кислоты; полимер акриловой или метакриловой кислоты, сшитый с полиалкениловым эфиром сахара или полиспирта; карбомер; акриловый полимер, поперечно сшитый полигидроксилированным соединением, имеющий по меньшей мере 3 и не более 8 гидроксильных групп с атомами водорода по меньшей мере трех гидроксилов, при необходимости замещенными или замещенным ненасыщенными алифатическими радикалами, имеющими по меньшей мере 2 атома углерода, с указанными радикалами, содержащими от 2 до 4 атома углерода, такими как винилы, аллилы и другие этиленненасыщенные группы, и ненасыщенные радикалы сами могут содержать другие заместители, такие как метил; Карбопол; Карбопол 974P; Карбопол 934P; Карбопол 971P; гидроксид алюминия; фосфат алюминия; сапонин; Quil A; QS-21; GPI-0100; эмульсию вода-в-масле; эмульсию масло-в-воде; эмульсию вода-в-масле-в-воде; эмульсию на основе легкого жидкого парафинового масла или адъюванта типа Европейской Фармакопеи, изопреноидное масло; сквалан; сквалановое масло, полученное в результате олигомеризации алкенов, изобутена или децена; сложный эфир (эфиры) кислоты (кислот) или спирта (спиртов), содержащий линейную алкильную группу; растительное масло (масла); этилолеат; ди-(каприлат/ капрат) пропиленгликоля; глицерилтри-(каприлат/капрат); диолеат пропиленгликоля; сложный эфир (эфиры) разветвленной жирной кислоты (кислот) или спирта (спиртов); сложный эфир (эфиры) изостеариновой кислоты; неионное поверхностно-активное вещество (вещества); сложный эфир (эфиры) сорбитана, или маннида, или гликоля, или полиглицерина, или пропиленгликоля, или олеиновой, или изостеариновой кислоты, или рицинолевой кислоты, или гидроксистеариновой кислоты, при необходимости этоксилированный, ангидроманнитол олеат; блок-сополимеры полиоксипропилена и полиоксиэтилена, продукт Плюроник, адъювантную систему RIBI; блок-сополимер; SAF-M; монофосфориллипид А; авридиновый липидно-аминовый адъювант; термолабильный энтеротоксин из E. coli (рекомбинантный или другой); токсин холеры; IMS 1314 или мурамилдипептид.

23. Композиция по любому из пп.2-22, содержащая примерно от 50 мкг до 2000 мкг адъюванта, или где адъювант присутствует в количестве примерно 250 мкг/мл на дозу композиции, или адъювант присутствует в количестве примерно от 100 мкг до 10 мг на дозу, или где адъювант присутствует в количестве примерно от 500 мкг до 5 мг на дозу; адъювант присутствует в количестве примерно от 750 мкг до 2,5 мг на дозу, или адъювант присутствует в количестве примерно 1 мг на дозу.

24. Композиция по любому из пп.2-23, где иммуномодулирующий агент включает интерлейкин (интерлейкины), интерферон (интерфероны) или другой цитокин (цитокины).

25. Композиция по любому из пп.1-24, содержащая примерно от 1 мкг/мл до 60 мкг/мл антибиотика (антибиотиков) или менее примерно 30 мкг/мл антибиотика (антибиотиков).

26. Композиция по любому из пп.1-25, где антибиотик (антибиотики) включает гентамицин.

27. Композиция по любому из пп.1-26, включающая (i) белок ORF2 PCV3, (ii) по меньшей мере часть бакуловируса, экспрессирующего указанный белок ORF2 PCV3, (iii) часть культуры клеток, которые были инфицированы или трансфицированы рекомбинантным бакуловирусом, который экспрессировал указанный белок ORF2 PCV3, (iv) инактивирующий агент, или инактивирующий агент, содержащий бинарный этиленимин (BEI), (v) тиосульфат натрия, или тиосульфат натрия в количествах, эквивалентных инактивирующему агенту или BEI; (vi) адъювант, или адъювант, содержащий Карбопол или Карбопол 971, и (vii) фосфатную соль в физиологически приемлемой концентрации.

28. Композиция по п.27, где примерно 90% компонентов (i) - (iii) имеют размер менее 1 мкм, а pH указанной композиции доводят примерно до 6,5-7,5.

29. Композиция по пп.27 или 28, где BEI получен из культуры клеток, обработанной примерно от 2 до 8 или примерно 5 мМ BEI для инактивации бакуловируса, и/или композиция содержит примерно от 2 до 8 или примерно 5 мМ BEI, и/или композиция содержит примерно 1 мг Карбопола или Карбопола 971.

30. Композиция по любому из пп.1-29, где указанная композиция составлена и/или упакована для однократного введения или однократного введения композиции, а не для режима множественных доз, или где указанная композиция составлена и/или упакована для многодозового режима введения композиции.

31. Композиция по любому из пп.1-30, являющаяся иммуногенной композицией.

32. Композиция по любому из пп.1-31 для использования в качестве лекарственного средства.

33. Композиция по любому из пп.1-31 для использования в качестве вакцины.

34. Композиция по любому из пп.1-31 для использования в способе индукции иммунного ответа или иммунологического ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа против (i) PCV3 и/или (ii) PCV 2 и PCV3, и/или (iii) PCV3 и другого патогена свиней, и/или (iv) PCV3, PCV2 и другого патогена свиней.

35. Композиция по любому из пп.1-31 для использования в способе уменьшения или предотвращения клинических признаков или заболевания, вызванного инфекцией PCV3 у животного, или для использования в способе лечения или профилактики инфекции PCV3 у животного, причем указанное животное предпочтительно представляет собой свинью.

36. Композиция по любому из пп.1-31 для применения в способе индукции иммунного ответа против PCV3 у этой молодой свиньи, в частности, предпочтительно у беременной свиноматки.

37. Композиция по любому из пп.1-31 для использования в способе уменьшения или предотвращения клинических признаков или заболевания, вызванного инфекцией PCV3 у поросят, при этом поросенок должен вскармливаться свиноматкой, которой вводили композицию.

38. Композиция для применения по п.37, где указанная свиноматка, которой вводили композицию, представляет собой свиноматку, которой вводили иммуногенную композицию, когда указанная свиноматка была беременна, в частности, указанным поросенком, или в период до осеменения.

39. Композиция для применения по любому из пп.32-38, где указанная композиция предназначена для введения внутримышечно или интрадермально.

40. Композиция для применения по любому из пп.36-39, предназначенная для введения указанной свиноматке внутримышечно или интрадермально.

41. Способ индукции иммунного ответа или иммунологического ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа против (i) PCV3 и/или (ii) PCV2 и PCV3, и/или (iii) PCV3 и другого патогена свиней, и/или (iv) PCV3, PCV2 и другого патогена свиней, включающий введение животному композиции, указанной в любом из пп.1-31.

42. Способ по п. 41, в котором животное представляет собой свинью.

43. Способ по п. 42, где свинья представляет собой молодую свинью, или поросенка.

44. Способ по пп.42 или 43, где свинья является свиноматкой.

45. Способ иммунизации субъекта, включающий введение субъекту композиции по любому из пп.1-31.

46. Способ иммунизации свиней против клинического заболевания, вызванного по меньшей мере одним патогеном у указанного животного, включающий стадию введения животному композиции по любому из пп.1-31, при этом указанная иммуногенная композиция не вызывает клинических признаков инфекции, но способна вызывать иммунный ответ, который иммунизирует животное против патогенных форм указанного по меньшей мере одного патогена.

47. Способ по п.46, где указанным по меньшей мере одним патогеном является PCV3.

48. Способ индукции выработки антител, специфичных к PCV3, у свиноматки, включающий введение указанной свиноматке композиции по любому из пп.1-31.

49. Способ уменьшения или предотвращения клинических признаков или клинических симптомов, вызванных инфекцией PCV3 у поросят, при этом указанный способ включает введение композиции по любому из пп.1-31 свиноматке и предоставление указанному поросенку возможности вскармливания указанной свиноматкой.

50. Способ по п.49, в котором указанная свиноматка является беременной свиноматкой, в частности, указанным поросенком, или подсвинком до осеменения.

51. Способ по пп. 49 или 50, включающий этапы введения композиции по любому из пп.1-31 свиноматке, беременной указанным поросенком, обеспечения рождения указанной свиноматкой указанного поросенка и обеспечения вскармливания указанного поросенка указанной свиноматкой.

52. Способ уменьшения клинических признаков и/или клинических симптомов, вызванных инфицированием PEDV у поросят, при котором поросенок должен вскармливаться свиноматкой, которой была введена композиция по любому из пп.1-31.

53. Способ по любому из пп.45-52, где указанную иммуногенную композицию, или указанную вакцину или фармацевтическую композицию вводят внутримышечно или интрадермально указанной свиноматке.

54. Способ по любому из пп.45-53, где указанную иммуногенную композицию, или указанную вакцину или фармацевтическую композицию вводят дважды указанной свиноматке.

55. Способ по любому из пп.45-54, где указанную иммуногенную композицию, или указанную вакцину или фармацевтическую композицию вводят дважды мукозально, предпочтительно дважды интраназально, указанной свиноматке.

56. Композиция для применения по любому из пп.32-40 или способ по любому из пп.41-55, где указанные клинические признаки выбраны из группы, состоящей из снижения среднесуточного привеса и смертности.

57. Композиция для применения по любому из пп.32-40 или способ по любому из пп.41-55, где клинические признаки выбраны из группы, состоящей из выталкивания мумифицированного, мертворожденного и/или слабого плода.

58. Композиция для применения по любому из пп.32-40 или способ по любому из пп.41-55, где клинические симптомы выбраны из группы, состоящей из макроскопических повреждений, гистологических нарушений, репликации PCV3 в ткани и виремии PCV3.

59. Композиция для применения по любому из пп.32-40 или способ по любому из пп.41-55, где клинические симптомы выбраны из группы, состоящей из развития или продукции мумифицированного, мертворожденного и/или слабого плода.

60. Композиция для применения по любому из пп.32-40 или способ по любому из пп.41-55, где свинья или поросенок имеют возраст не старше 15 недель, или не старше 6 недель, или не старше 3 недель, или не старше 2 недель, или не старше 1 недели.

61. Способ по п.60, где введение осуществляют в течение по меньшей мере 1, 2 или 3 недель воздействия вирулентного цирковируса свиней.

62. Композиция для применения по любому из пп.32-41 или способ по любому из пп.42-55, где введение включает единственное однократное введение, или однократное введение композиции в единчственной, одной дозе; а не режим многократного введения или многократного дозирования, или где введение состоит из однодозового, однократного введения, или однократного введения одной дозы; а не режима многократного введения или многократного дозирования, или где введение включает режим многократного введения или введения множества доз композиции, или где введение включает схему двукратного введения или введения двух доз композиции, или где введение состоит из режима двукратного введения или введения двух доз композиции.

63. Применение композиции по любому из пп.1-31 в способе по любому из пп.42-55, или применение белка ORF2 PCV3, отдельно или в комбинации, из любой из композиций по п.п 1-31, для использования при приготовлении композиции для индукции иммунологического или иммунного ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа против (i) PCV3 и/или (ii) PCV2 и PCV3, и/или (iii) PCV3 и другого патогена свиней, и/или (iv) PCV3, PCV2 и другого патогена свиней, или для использования в способе индукции иммунологического или иммунного ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа против (i) PCV3 и/или (ii) PCV2 и PCV3, и/или (iii) PCV3 и другого патогена свиней, и/или (iv) PCV3, PCV2 и другого патогена свиней.

64. Способ получения композиции по любому из пп.1-31, включающий получение белка ORF2 PCV3 с помощью бакуловирусной системы экспрессии в культивируемых клетках насекомых.

65. Способ по п.64, включающий инактивацию бакуловируса.

66. Способ по п.65, где инактивация включает тепловую обработку или использование агента, инактивирующего вирус.

67. Способ по п.66, где агент, инактивирующий вирус, включает азиридиновое соединение.

68. Способ по п.67, где азиридиновое соединение включает BEI.

69. Рекомбинантный вектор, содержащий полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную последовательность, кодирующую белок ORF2 PCV3.

70. Рекомбинантный вектор по п.69, где ORF2 PCV3 относится к группе a1, b1 или b2.

71. Композиция, содержащая (i) белок ORF2 цирковируса свиней 3 типа (PCV3), белок парвовируса (PPV) и, при необходимости, белок PRRSV (вируса респираторного и репродуктивного синдрома свиней), и (ii) ветеринарно приемлемый носитель, выбранный из группы, состоящей из растворителя, дисперсионной среды, покрытия, стабилизатора, разбавителя, консерванта, противомикробного агента, противогрибкового агента, изотонического агента, агента, замедляющего адсорбцию, адъюванта, надосадочной жидкости клеточной культуры, стабилизирующего агента, вирусного вектора, вектора экспрессии, иммуномодулирующего агента и/или любой их комбинации.

72. Композиция по п.71, где ветеринарно приемлемый носитель включает адъювант, иммуномодулирующий агент, надосадочную жидкость клеточной культуры, вирусный вектор или вектор экспрессии, или любую их комбинацию.

73. Композиция по пп.71 или 72, где белок PPV представляет собой капсидный белок PPV VP2.

74. Композиция по любому из пп.71-73, где белок PRRSV представляет собой ORF4, ORF5, ORF6 или ORF7 вируса PRRS.

75. Композиция по пп.73 или 74, где белок PPV и/или белок PRRSV экспрессируются в векторе.

76. Композиция по любому из пп.71-75, представляющая собой иммуногенную композицию, вводимую в двух дозах свинье.

77. Композиция по п.76, где свинья является свиньей до первого опороса или свиноматкой.

78. Композиция по пп.76 или 77, где введение осуществляют до спаривания/осеменения, до беременности, во время беременности или во время лактации.

79. Композиция по любому из пп.76-78, где иммуногенная композиция содержит от 0,1 мкг до 150 мкг, предпочтительно от 0,25 мкг до 75 мкг, более предпочтительно от 0,5 мкг до 37,5 мкг, еще более предпочтительно от 0,5 мкг до 15 мкг, наиболее предпочтительно от 0,5 мкг до 6 мкг антигена PCV3, PPV и/или PRRSV.

80. Композиция по любому из пп.76-79, где иммуногенную композицию вводят внутримышечно.

81. Способ индукции иммунного ответа или иммунологического ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа против цирковируса свиней 3 типа (PCV3), включающий парентеральное или подкожное применение у свиней однократной вакцинации, однократного введения или однократной дозы (i) по меньшей мере от 2 мкг до примерно 400 мкг рекомбинантного белка ORF2 PCV3, экспрессируемого бакуловирусной системой, и (ii) ветеринарно приемлемого носителя, содержащего растворитель, дисперсионную среду, покрытие, стабилизирующий агент, разбавитель, консервант, противомикробный агент, противогрибковый агент, изотонический агент, агент, замедляющий адсорбцию, адъювант, надосадочную жидкость клеточной культуры, стабилизирующий агент, вирусный вектор или вектор экспрессии, иммуномодулирующий агент и/или любую их комбинацию.

82. Способ по п.81, в котором свинья представляет собой поросенка, молодую свинью, или свиноматку, или подсвинка до осеменения.

83. Способ по п.81 или п.82, где свинья имеет возраст примерно 1 неделю, или 2 недели, или 3 недели, или 7-28, или 7-22, или 14-22, или 16-22, или 21±5 дней.

84. Способ по любому из пп.81-83, где ветеринарно приемлемый носитель включает адъювант, иммуномодулирующий агент, надосадочную жидкость клеточной культуры, вирусный вектор или вектор экспрессии, или любую их комбинацию.

85. Способ по любому из пп.81-84, где ORF2 PCV3 представляет собой любую филогенетическую ветвь PCV3, или из группы PCV3a, PCV3a1, PCV3b, PCV3b1 или PCV3b.

86. Способ по любому из пп.81-85, где белок ORF2 PCV3 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, кодируемой полинуклеотидной последовательностью, имеющей по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности последовательности с SEQ ID NO : 1 или гомологии последовательности с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7.

87. Способ по любому из пп.81-86, где однократная вакцинация, однократное введение или однократная доза дополнительно включает белок ORF2 PCV2 или дополнительный антиген дополнительного патогена свиней.

88. Способ по п.87, где дополнительный антиген дополнительного патогена свиней включает антиген PRRSV (вируса респираторного и репродуктивного синдрома свиней), бактериновый антиген Mycoplasma hyopneumoniae, антиген надосадочной жидкости Mycoplasma hyopneumoniae, антиген болезни Ауески или псевдобешенства, антиген свиного гриппа, антиген чумы свиней (классической или африканской, или их комбинации), антиген Actinobacillus pleuropneumoniae, антиген Escherichia coli, антиген парвовируса свиней (PPV) или антиген Pasteurella multocida, или их комбинацию.

89. Способ по любому из пп.81-88, где адъювант включает полимер акриловой или метакриловой кислоты; сополимер малеинового ангидрида и алкенильного производного; сшитый полимер акриловой или метакриловой кислоты; полимер акриловой или метакриловой кислоты, сшитый с полиалкениловым эфиром сахара или полиспирта; карбомер; акриловый полимер, поперечно сшитый полигидроксилированным соединением, имеющий по меньшей мере 3 и не более 8 гидроксильных групп с атомами водорода по меньшей мере трех гидроксилов, при необходимости замещенными, или замещенным ненасыщенными алифатическими радикалами, имеющими по меньшей мере 2 атома углерода, с указанными радикалами, содержащими от 2 до 4 атомов углерода, такими как винилы, аллилы и другие этиленненасыщенные группы, и ненасыщенные радикалы сами могут содержать другие заместители, такие как метил; Карбопол; Карбопол 974P; Карбопол 934P; Карбопол 971P; гидроксид алюминия; фосфат алюминия; сапонин; Quil A; QS-21; GPI-0100; эмульсию вода-в-масле; эмульсию масло-в-воде; эмульсию вода-в-масле-в-воде; эмульсию на основе легкого жидкого парафинового масла или адъюванта типа Европейской Фармакопеи, изопреноидное масло; сквалан; сквалановое масло, полученное в результате олигомеризации алкенов, изобутена или децена; сложный эфир (эфиры) кислоты (кислот) или спирта (спиртов), содержащий линейную алкильную группу; растительное масло (масла); этилолеат; ди-(каприлат/капрат) пропиленгликоля; глицерилтри-(каприлат/капрат); диолеат пропиленгликоля; сложный эфир (эфиры) разветвленной жирной кислоты (кислот) или спирта (спиртов); сложный эфир (эфиры) изостеариновой кислоты; неионное поверхностно-активное вещество (вещества); сложный эфир (эфиры) сорбитана, или маннида, или гликоля, или полиглицерина, или пропиленгликоля, или олеиновой, или изостеариновой кислоты, или рицинолевой кислоты, или гидроксистеариновой кислоты, при необходимости этоксилированный, ангидроманнитололеат; блок-сополимеры полиоксипропилена и полиоксиэтилена, продукт Плюроник, адъювантную систему RIBI; Блок-сополимер; SAF-M; монофосфориллипид А; авридиновый липидно-аминовый адъювант; термолабильный энтеротоксин из E. coli (рекомбинантный или другой); токсин холеры; IMS 1314 или мурамилдипептид.

90. Способ по любому из пп.81-89, где белок ORF2 PCV3 присутствует в количестве от 0,2 до примерно 400 мкг/мл, или примерно от 0,3 до 200 мкг/мл, или примерно от 0,35 до 100 мкг/мл. мл, или примерно от 0,4 до 50 мкг/мл, или примерно от 0,45 до 30 мкг/мл, или примерно от 0,6 до 15 мкг/мл, или примерно от 0,75 до 8 мкг/мл, или примерно от 1,0 до 6 мкг/мл, или примерно от 1,3 до 3,0 мкг/мл, или примерно от 1,4 до 2,5 мкг/мл, или примерно от 1,5 до 2,0 мкг/мл, или примерно 1,6 мкг/мл.

91. Способ по п.87, где белок ORF2 PCV3 или общие белки ORF2 PCV2 и PCV3 присутствуют в количестве примерно от 0,2 до 400 мкг/дозу, или примерно от 0,3 до 200 мкг/дозу, или примерно от 0,35 до 100 мкг/дозу, или примерно от 0,4 до 50 мкг/дозу, или примерно от 0,45 до 30 мкг/дозу, или примерно от 0,6 до 15 мкг/дозу, или примерно от 0,75 до 8 мкг/дозу, или примерно от 1,0 до 6 мкг/дозу, или примерно от 1,3 до 3,0 мкг/дозу, или примерно от 1,4 до 2,5 мкг/дозу, или примерно от 1,5 до 2,0 мкг/дозу, или примерно 1,6 мкг/дозу.

92. Способ по любому из пп.81-91, включающий примерно от 50 мкг до 2000 мкг адъюванта, или где адъювант присутствует в количестве примерно 250 мкг/мл на дозу композиции, или адъювант присутствует в количестве примерно от 100 мкг до 10 мг на дозу, или где адъювант присутствует в количестве примерно от 500 мкг до 5 мг на дозу; адъювант присутствует в количестве примерно от 750 мкг до 2,5 мг на дозу, или адъювант присутствует в количестве примерно 1 мг на дозу.

93. Способ по любому из пп.82-92, где иммуномодулирующий агент включает интерлейкин, интерферон или другой цитокин.

94. Способ по любому из пп.81-93, где однократная вакцинация, однократное введение или однократная доза дополнительно включает примерно от 1 мкг/мл до 60 мкг/мл антибиотика (антибиотиков) или менее примерно 30 мкг/мл антибиотика.

95. Способ по п.84, где антибиотик включает гентамицин.

96. Способ по любому из пп.81-95, где однократная вакцинация, однократное введение или однократная доза включает (i) белок ORF2 PCV3, (ii) по меньшей мере часть бакуловируса, экспрессирующего указанный белок ORF2 PCV3, (iii) часть культуры клеток, которые были инфицированы или трансфицированы рекомбинантным бакуловирусом, который экспрессировал указанный белок ORF2 PCV3, (iv) инактивирующий агент, или инактивирующий агент, содержащий бинарный этиленимин (BEI), (v) тиосульфат натрия, или тиосульфат натрия в количествах, эквивалентных инактивирующему агенту или BEI; (vi) адъювант, или адъювант, содержащий Карбопол или Карбопол 971, и (vii) фосфатную соль в физиологически приемлемой концентрации.

97. Способ по п.96, где примерно 90% компонентов (i) - (iii) имеют размер менее 1 мкм, а pH указанной композиции доводят примерно до 6,5-7,5.

98. Способ по пп.96 или 97, где BEI получен из культуры клеток, обработанной примерно от 2 до 8 или примерно 5 мМ BEI для инактивации бакуловируса, и/или композиция содержит примерно от 2 до 8 или примерно 5 мМ BEI, и/или композиция содержит около 1 мг Карбопола или Карбопола 971.

99. Способ по любому из пп.81-98, дополнительно включающий уменьшение или предотвращение клинических признаков или заболевания, вызванного инфекцией PCV3 или вирусом эпидемической диареи свиней (PEDV), у беременной свиноматки или поросенка.

100. Способ по п.99, где уменьшение или предотвращение клинических признаков или заболевания у поросенка включает кормление поросенка свиноматкой, получавшей введение путем однократного введения, однократное введение или однократную дозу.

101. Способ по п.99, где уменьшение или предотвращение клинических признаков или заболевания у поросенка включает введение путем однократного введения, однократного введения или однократной дозы у беременной свиноматки.

102. Способ по п.101, дополнительно включающий кормление поросенка свиноматкой после рождения поросенка свиноматкой.

103. Способ по любому из пп.99–102, где клиническим признаком является снижение среднесуточного привеса, смертность, развитие, продукция или выталкивание мумифицированного, мертворожденного и/или слабого плода, макроскопическое поражение, гистологическое нарушение, репликация PCV3 в ткани или виремия PCV3.

104. Способ по любому из пп.81-103, где парентеральное или подкожное введение является внутримышечным или интрадермальным.

105. Неприродный белок ORF2 PCV3, содержащий сконструированную петлю FG, где петля FG содержит три или менее положительно заряженных аминокислот.

106. Белок ORF2 PCV3 по п.105, где петля FG содержит две положительно заряженные аминокислоты.

107. Белок ORF2 PCV3 по п.105, где петля FG содержит одну положительно заряженную аминокислоту.

108. Белок ORF2 PCV3 по п.105, где в петле FG отсутствуют положительно заряженные аминокислоты.

109. Белок ORF2 PCV3 по п.105, где в петле FG отсутствуют остатки аргинина и лизина.

110. Белок ORF2 PCV3 по п.105, где в петле FG отсутствуют остатки аргинина, лизина и гистидина.

111. Белок ORF2 PCV3 по п.105, где петля FG содержит QPFSYH, LSRGF или MASGF.

112. Неприродный белок ORF2 PCV3, содержащий сконструированное С-концевое удлинение.

113. Белок ORF2 PCV3 по п.112, где С-концевое удлинение включает примерно от 1 до 10, примерно от 5 до 20 или примерно от 10 до 30 аминокислот.

114. Белок ORF2 PCV3 по п.112, в котором С-концевое удлинение включает примерно от 1 до 10, или примерно от 5 до 20, или примерно от 10 до 30 аминокислот, примерно от 50 до 200 аминокислот, примерно от 60 до 190 аминокислот, примерно от 70 до 180 аминокислот, примерно от 80 до 170 аминокислот, примерно от 90 до 160 аминокислот, или примерно от 100 до 150 аминокислот.

115. Белок ORF2 PCV3 по п.112, где С-концевое удлинение содержит С-концевые аминокислоты из другого капсидного белка.

116. Белок ORF2 PCV3 по п.115, где C-концевое удлинение включает C-концевые аминокислоты из капсида PCV2, такого как капсид BFDV или капсид CaCV.

117. Белок ORF2 PCV3 по п.112, где С-концевое удлинение включает EFNLKDPPLN, PK или QFAPNNPSTEFDYETGRQL.

118. Способ получения самособирающегося капсидного белка ORF2 PCV3, который включает замену одной или нескольких аминокислот из аргинина, лизина или гистидина в петле FG на незаряженные положительно аминокислоты.

119. Способ усиления самосборки капсидного белка ORF2 PCV3, который включает добавление или вставку аминокислотных остатков на С-конце белка.

120. Способ по п.118, который включает добавление или вставку от 1 до 10, или примерно от 5 до 20, или примерно от 10 до 30 аминокислот, примерно от 50 до 200 аминокислот, примерно от 60 до 190 аминокислот, примерно от 70 до 180 аминокислот, примерно от 80 до 170 аминокислот, примерно от 90 до 160 аминокислот, или примерно от 100 до 150 аминокислот.

121. Способ по п.119, который включает добавление или вставку аминокислот из другого капсидного белка.

122. Способ по п.121, где добавленные или вставленные аминокислоты взяты из капсида PCV2, такого как капсид BFDV или капсид CaCV.

123. Способ по п.121, где добавленные или вставленные аминокислоты включают EFNLKDPPLN, PK или QFAPNNPSTEFDYETGRQL.

124. Композиция, содержащая белок PCV по любому из пп.105–117 или белок, полученный способом по любому из пп.118–123, в количестве, вызывающем иммунный ответ или защитный иммунный ответ против PCV3 и/или его клинических симптомов, при однократном введении, и ветеринарно приемлемый носитель, включающий растворитель, дисперсионную среду, покрытие, стабилизирующий агент, разбавитель, консервант, противомикробный агент, противогрибковый агент, изотонический агент, агент, замедляющий адсорбцию, адъювант, надосадочную жидкость клеточной культуры, стабилизирующий агент, вирусный вектор или вектор экспрессии, иммуномодулирующий агент и/или любую их комбинацию.

125. Композиция по п.124, где белок ORF2 PCV3 кодируется SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7.

126. Композиция по пп.124 или 125, где ветеринарно приемлемый носитель включает адъювант, иммуномодулирующий агент, надосадочную жидкость клеточной культуры, вирусный вектор или вектор экспрессии, или любую их комбинацию.

127. Композиция по любому из пп.124-126, дополнительно включающая белок ORF2 PCV2, предпочтительно антигенный белок ORF2 PCV2 (антиген ORF2 PCV2) или дополнительный антиген дополнительного патогена свиней.

128. Композиция по п.127, где дополнительный антиген дополнительного патогена свиней включает антиген PRRSV (вируса респираторного и репродуктивного синдрома свиней), бактериновый антиген Mycoplasma hyopneumoniae, антиген надосадочной жидкости Mycoplasma hyopneumoniae, антиген болезни Ауески или псевдобешенства, антиген свиного гриппа, антиген чумы свиней (классической или африканской, или их комбинации), антиген Actinobacillus pleuropneumoniae, антиген Escherichia coli, антиген парвовируса свиней (PPV), или антиген Pasteurella multocida, или их комбинацию.

129. Композиция по любому из пп.124-128, где адъювант включает полимер акриловой или метакриловой кислоты; сополимер малеинового ангидрида и алкенильного производного; сшитый полимер акриловой или метакриловой кислоты; полимер акриловой или метакриловой кислоты, сшитый с полиалкениловым эфиром сахара или полиспирта; карбомер; акриловый полимер, поперечно сшитый полигидроксилированным соединением, имеющий по меньшей мере 3 и не более 8 гидроксильных групп с атомами водорода по меньшей мере трех гидроксилов, при необходимости замещенными, или замещенным ненасыщенными алифатическими радикалами, имеющими по меньшей мере 2 атома углерода, с указанными радикалами, содержащими от 2 до 4 атома углерода, такие как винилы, аллилы и другие этиленненасыщенные группы, и ненасыщенные радикалы сами могут содержать другие заместители, такие как метил; Карбопол; Карбопол 974P; Карбопол 934P; Карбопол 971P; гидроксид алюминия; фосфат алюминия; сапонин; Quil A; QS-21; GPI -0100; эмульсию вода-в-масле; эмульсию масло-в-воде; эмульсию вода-в-масле-в-воде; эмульсию на основе легкого жидкого парафинового масла или адъюванта типа Европейской Фармакопеи, изопреноидное масло; сквалан; сквалановое масло, полученное в результате олигомеризации алкенов, изобутена или децена; сложный эфир (эфиры) кислоты (кислот) или спирта (спиртов), содержащий линейную алкильную группу; растительное масло (масла); этилолеат; ди-(каприлат/капрат) пропиленгликоля; глицерилтри-(каприлат/капрат); диолеат пропиленгликоля; сложный эфир (эфиры) разветвленной жирной кислоты (кислот) или спирта (спиртов); сложный эфир (эфиры) изостеариновой кислоты; неионное поверхностно-активное вещество (вещества); сложный эфир (эфиры) сорбитана, или маннида, или гликоля, или полиглицерина, или пропиленгликоля, или олеиновой, или изостеариновой кислоты, или рицинолевой кислоты, или гидроксистеариновой кислоты, при необходимости этоксилированный, ангидроманнитололеат; блок-сополимеры полиоксипропилена и полиоксиэтилена, продукт Плюроник, адъювантную систему RIBI; Блок-сополимер; SAF-M; монофосфориллипид А; авридиновый липидно-аминовый адъювант; термолабильный энтеротоксин из E. coli (рекомбинантный или другой); токсин холеры; IMS 1314 или мурамилдипептид.

130. Композиция по любому из пп.124-129, где белок ORF2 PCV3 присутствует в количестве от 0,2 до примерно 400 мкг/мл, или примерно от 0,3 до 200 мкг/мл, или примерно от 0,35 до 100 мкг/мл, или примерно от 0,4 до 50 мкг/мл, или примерно от 0,45 до 30 мкг/мл, или примерно от 0,6 до 15 мкг/мл, или примерно от 0,75 до 8 мкг/мл, или примерно от 1,0 до 6 мкг/мл, или примерно от 1,3 до 3,0 мкг/мл, или примерно от 1,4 до 2,5 мкг/мл, или примерно от 1,5 до 2,0 мкг/мл, или примерно 1,6 мкг/мл.

131. Композиция по любому из пп.124-130, где белок ORF2 PCV3 или общие белки ORF2 PCV2 и PCV3 присутствуют в количестве примерно от 0,2 до 400 мкг/дозу или примерно от 0,3 до 200 мкг/дозу, или примерно от 0,35 до 100 мкг/дозу, или примерно от 0,4 до 50 мкг/дозу, или примерно от 0,45 до 30 мкг/дозу, или примерно от 0,6 до 15 мкг/дозу, или примерно от 0,75 до 8 мкг/дозу, или примерно от 1,0 до 6 мкг/дозу, или примерно от 1,3 до 3,0 мкг/дозу, или примерно от 1,4 до 2,5 мкг/дозу, или примерно от 1,5 мкг/дозу до 2,0 мкг/дозу, или примерно 1,6 мкг/дозу.

132. Композиция по любому из пп.124-131, содержащая примерно от 50 мкг до 2000 мкг адъюванта, или где адъювант присутствует в количестве примерно 250 мкг/мл на дозу композиции, или адъювант присутствует в количестве примерно от 100 мкг до 10 мг на дозу, или где адъювант присутствует в количестве примерно от 500 мкг до 5 мг на дозу; адъювант присутствует в количестве примерно от 750 мкг до 2,5 мг на дозу, или адъювант присутствует в количестве примерно 1 мг на дозу.

133. Композиция по любому из пп.125-132, где иммуномодулирующий агент включает интерлейкин, интерферон или другой цитокин.

134. Вектор, содержащий и экспрессирующий белок PCV по любому из пп.105–117 или белок, полученный способом по любому из пп.118–123.

135. Вектор по п.134, где белок PCV экспрессируется с помощью SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7.

136. Вектор по пп.134 или 135, представляющий собой бакуловирус.

137. Способ получения композиции по любому из пп.125-133, включающий получение белка ORF2 PCV3 с помощью бакуловирусной системы экспрессии в культивируемых клетках насекомых.

138. Способ по п.137, дополнительно включающий инактивацию бакуловируса.

139. Способ по п.138, где инактивация включает тепловую обработку или использование агента, инактивирующего вирус.

140. Способ по п.139, где агент, инактивирующий вирус, включает азиридиновое соединение.

141. Способ по п.140, где азиридиновое соединение включает BEI.

НАБОР ПУНКТОВ C:

Набор пунктов C - Настоящее изобретение теперь будет описано посредством следующего набора пронумерованных пунктов (набор пунктов C). Раскрытие в этом наборе пунктов в равной степени применимо к настоящему изобретению. Подобным образом раскрытие в этом наборе пунктов в равной степени применимо к каждому из других наборов пунктов.

1. Антигенный белок цирковируса свиней 3 типа (PCV3), где указанный белок представляет собой белок ORF2 PCV3 или его функциональный антигенный вариант.

2. Белок по п.1, где указанный белок ORF2 PCV3 представляет собой белок, кодируемый SEQ ID No. 1.

3. Белок по пп.1 или 2, представляющий собой функциональный антигенный вариант ORF2 PCV3.

4. Белок по любому из предыдущих пунктов, представляющий собой функциональный антигенный вариант белка, кодируемого SEQ ID No. 1.

5. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант способен давать более высокий выход вирусоподобных частиц (VLP), чем белок, кодируемый SEQ ID No. 1.

6. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант способен давать более высокий выход VLP, чем белок, кодируемый SEQ ID No. 1, как можно определить с помощью вестерн-блоттинга.

7. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант имеет меньше положительно заряженных аминокислотных остатков, чем белок, кодируемый SEQ ID No. 1.

8. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант имеет одну или несколько замен в петле FG белка, кодируемого SEQ ID No. 1.

9. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант имеет одну или несколько замен в петле FG белка, кодируемого SEQ ID No.1, где эти замены включают замены одного или нескольких из остатка S и/или остатков K и/или остатка H мотива SKKKH петли FG белка, кодируемого SEQ ID No. 1.

10. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант имеет одну или несколько замен в петле FG белка, кодируемого SEQ ID No.1, где эти замены включают замены одного или нескольких из остатка S и/или остатков K мотива SKKKH петли FG белка, кодируемого SEQ ID No.1.

11. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант имеет одну или несколько замен в петле FG белка, кодируемого SEQ ID No. 1, где эти замены включают замены остатка S или остатка H и всех остатков K мотива SKKKH петли FG белка, кодируемого SEQ ID No. 1.

12. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант имеет одну или несколько замен в петле FG белка, кодируемого SEQ ID No.1, где эти замены включают замену по меньшей мере S и/или H и любого K мотива SKKKH петли FG белка, кодируемого SEQ ID No.1, на Q, P, F или S.

13. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант имеет одну или несколько замен в петле FG белка, кодируемого SEQ ID No.1, где эти замены включают замену мотива SKKK в мотиве SKKKH петли FG белка, кодируемого SEQ ID No.1, на QPFS, или замену мотива KKKH в мотиве SKKKH петли FG белка, кодируемого SEQ ID No.1, на QPFS.

14. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант кодируется полностью или частично SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6 или 7.

15. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант кодируется полностью или частично SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6 или 7.

16. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант имеет С-концевую часть, выходящую за пределы концевой последовательности SVL белка, кодируемого SEQ ID No.1, предпочтительно, где указанное удлинение является полным или включает последовательность из вируса Сircoviridae, и предпочтительно в котором по меньшей мере часть указанного удлинения заменяет концевую последовательность SVL белка, кодируемого SEQ ID No.1.

17. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант имеет С-концевую часть, которая выходит за пределы концевой последовательности SVL белка, кодируемого SEQ ID No.1, и где указанное удлинение составляет от 1 до 100 аминокислот.

18. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант имеет С-концевую часть, которая выходит за пределы концевой последовательности SVL белка, кодируемого SEQ ID No.1, и где указанное удлинение составляет от 1 до 50 аминокислот.

19. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант имеет С-концевую часть, которая выходит за пределы концевой последовательности SVL белка, кодируемого SEQ ID No.1, и где указанное удлинение составляет от 1 до 30 аминокислот.

20. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант имеет С-концевую часть, которая выходит за пределы концевой последовательности SVL белка, кодируемого SEQ ID No.1, где указанное удлинение составляет от 1 до 30 аминокислот, и где указанное удлинение включает всю часть последовательности VKININLTPPVATSRVPSRALPLRFGCGHR.

21. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант имеет С-концевую часть, которая выходит за пределы концевой последовательности SVL белка, кодируемого SEQ ID No.1, где указанное удлинение составляет от 1 до 30 аминокислот, и где указанное удлинение включает всю последовательность VKININLTPPVATSRVPSRALPLRFGCGHR.

22. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант кодируется полностью или частично SEQ ID No. 1, 2, 5, 6 или 7.

23. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант кодируется полностью или частично SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6 или 7.

24. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный белок представляет собой рекомбинантный белок, полученный способами рекомбинантной ДНК.

25. Белок по любому из предыдущих пунктов, представляющий собой белок, экспрессируемый бакуловирусом.

26. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный PCV3 выбран из группы, состоящей из PCV3a и PCV3b.

27. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный PCV3 представляет собой любую филогенетическую ветвь PCV3, или выбран из группы, состоящей из PCV3a1, PCV3b1, PCV3b2 и PCV3c.

28. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанная ORF2 PCV3 принадлежит к группе a1, b1 или b2 (с использованием обозначения подтипа Fux et al., «Full genome characterization of porcine circovirus type 3 isolates reveals the existence of two distinct groups of virus strains», Virology Journal (2018) 15:25, DOI 10.1186/s12985-018-0929-3 (включено в настоящий документ посредством ссылки); см., например, таблицу 4).

29. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный белок ORF2 PCV3 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, кодируемой полинуклеотидной последовательностью, имеющей по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1 или гомологии последовательности с SEQ ID NO: 1.

30. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный вариантный белок содержит или состоит из аминокислотной последовательности, кодируемой полинуклеотидной последовательностью, имеющей по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности последовательности с SEQ ID NO:1 или гомологии последовательности с SEQ ID NO: 6.

31. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный вариантный белок содержит или состоит из аминокислотной последовательности, кодируемой полинуклеотидной последовательностью, имеющей по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности последовательности с SEQ ID NO:1 или гомологии последовательности с SEQ ID NO:7.

32. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный белок ORF2 PCV3 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 3, 4, 8, 9 или 10, и/или где белок представляет собой рекомбинантный белок.

33. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный вариантный белок содержит или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 3, 4, 8, 9 или 10, и/или где белок представляет собой рекомбинантный белок, или белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный вариантный белок содержит или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 3, 4, 8, 9 или 10, и/или где белок представляет собой рекомбинантный белок, и где указанный белок имеет одну или несколько замен в петле FG.

34. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный вариантный белок содержит или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 3, 4 , 8, 9 или 10, и/или где белок представляет собой рекомбинантный белок, или белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный вариантный белок содержит или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 3, 4, 8, 9 или 10, и/или где белок представляет собой рекомбинантный белок, и где указанный белок имеет С-концевую часть, которая выходит за пределы концевой последовательности SVL белка, кодируемого SEQ ID No.1.

35. Белок по любому из предыдущих пунктов, представляющий собой рекомбинантный белок в результате его экспрессии вектором экспрессии, содержащим полинуклеотидную последовательность, кодирующую белок.

36. Белок по любому из предыдущих пунктов, представляющий собой рекомбинантный белок, полученный в результате его экспрессии бакуловирусным вектором экспрессии, содержащим полинуклеотидную последовательность, кодирующую белок.

37. Нуклеотидная последовательность, кодирующая белок по любому из предыдущих пунктов.

38. Вектор, содержащий нуклеотидную последовательность по любому из предыдущих пунктов.

39. Рекомбинантный вектор, содержащий нуклеотидную последовательность по любому из предыдущих пунктов.

40. Хозяин экспрессии, трансформированный или трансфицированный нуклеотидной последовательностью по любому из предыдущих пунктов.

41. Хозяин бакуловирусной экспрессии, трансформированный или трансфицированный нуклеотидной последовательностью по любому из предыдущих пунктов.

42. Способ получения белка по любому из предыдущих пунктов, включающий экспрессию нуклеотидной последовательности по любому из предыдущих пунктов.

43. Способ получения белка по любому из предыдущих пунктов, включающий экспрессию вектора по любому из предыдущих пунктов.

44. Способ получения белка по любому из предыдущих пунктов, включающий экспрессию рекомбинантного вектора по любому из предыдущих пунктов.

45. Способ получения белка по любому из предыдущих пунктов, включающий культивирование хозяина экспрессии по любому из предыдущих пунктов, чтобы вызвать экспрессию белка.

46. Способ получения белка по любому из предыдущих пунктов, включающий трансфекцию экспрессии нуклеотидной последовательностью вектора по любому из предыдущих пунктов и культивирование хозяина экспрессии, чтобы вызвать экспрессию белка.

47. Способ получения белка по любому из предыдущих пунктов, включающий культивирование хозяина для бакуловирусной экспрессии по любому из предыдущих пунктов, чтобы вызвать экспрессию белка.

48. Способ получения белка по любому из предыдущих пунктов, включающий трансфекцию хозяина для бакуловирусной экспрессии нуклеотидной последовательностью вектора по любому из предыдущих пунктов и культивирование хозяина для бакуловирусной экспрессии, чтобы вызвать экспрессию белка.

49. Способ по любому из предыдущих пунктов, где инактивирующий агент используют, когда достигнуты достаточные уровни экспрессированного белка.

50. Способ по любому из предыдущих пунктов, где инактивирующий агент, содержащий бинарный этиленимин (BEI), используют, когда достигнуты достаточные уровни экспрессированного белка.

51. Способ получения белка по любому из предыдущих пунктов, включающий трансфекцию хозяина для бакуловирусной экспрессии нуклеотидной последовательностью вектора по любому из предыдущих пунктов и культивирование хозяина для бакуловирусной экспрессии в среде, чтобы вызвать экспрессию белок, где среда после экспрессии белка включает (i) указанный белок, (ii) по меньшей мере часть бакуловируса, экспрессирующую указанный белок, (iii) часть культуры клеток, которые были инфицированы или трансфицированы рекомбинантным бакуловирусом, который экспрессировал указанный белок.

52. Способ получения белка по любому из предыдущих пунктов, включающий трансфекцию хозяина для бакуловирусной экспрессии нуклеотидной последовательностью вектора по любому из предыдущих пунктов и культивирование хозяина для бакуловирусной экспрессии в среде, чтобы вызвать экспрессию белок, где среда после экспрессии белка включает (i) указанный белок, (ii) по меньшей мере часть бакуловируса, экспрессирующую указанный белок, (iii) часть культуры клеток, которые были инфицированы или трансфицированы рекомбинантным бакуловирусом, который экспрессировал указанный белок, и где около 90% компонентов (i) - (iii) имеют размер менее 1 мкм.

53. Способ получения белка по любому из предыдущих пунктов, включающий трансфекцию хозяина для бакуловирусной экспрессии нуклеотидной последовательностью вектора по любому из предыдущих пунктов и культивирование хозяина для бакуловирусной экспрессии в среде, чтобы вызвать экспрессию белка, где среда после экспрессии белка включает (i) указанный белок, (ii) по меньшей мере часть бакуловируса, экспрессирующую указанный белок, (iii) часть культуры клеток, которые были инфицированы или трансфицированы рекомбинантным бакуловирусом, который экспрессировал указанный белок, и где примерно 90% компонентов (i) - (iii) имеют размер менее 1 мкм, а pH указанной композиции доводят до примерно 6,5-7,5.

54. Способ получения белка по любому из предыдущих пунктов, включающий получение белка бакуловирусной системой экспрессии в культивируемых клетках насекомых.

55. Способ получения белка по любому из предыдущих пунктов, включающий получение белка бакуловирусной системой экспрессии в культивируемых клетках насекомых, и где способ включает стадию инактивации бакуловируса.

56. Способ получения белка по любому из предыдущих пунктов, включающий получение белка бакуловирусной системой экспрессии в культивируемых клетках насекомых, и где способ включает стадию инактивации бакуловируса, и где стадия инактивации включает тепловую обработку или использование агента, инактивирующего вирус.

57. Способ получения белка по любому из предыдущих пунктов, включающий получение белка бакуловирусной системой экспрессии в культивируемых клетках насекомых, и где способ включает стадию инактивации бакуловируса, и где стадия инактивации включает тепловую обработку или использование агента, инактивирующего вирус, и где агент, инактивирующий вирус, включает азиридиновое соединение.

58. Способ получения белка по любому из предыдущих пунктов, включающий получение белка бакуловирусной системой экспрессии в культивируемых клетках насекомых, и где способ включает стадию инактивации бакуловируса, и где стадия инактивации включает тепловую обработку или использование агента, инактивирующего вирус, и где агент, инактивирующий вирус, включает азиридиновое соединение, где азиридиновое соединение включает BEI.

59. Белок, получаемый способом по любому из предыдущих пунктов.

60. Композиция, содержащая белок, получаемый способом по любому из предыдущих пунктов.

61. Композиция, которую можно получить способом по любому из предыдущих пунктов.

62. Композиция, содержащая белок по любому из предыдущих пунктов и носитель, разбавитель или наполнитель.

63. Композиция, содержащая белок по любому из предыдущих пунктов и ветеринарно приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель.

64. Композиция по любому из предыдущих пунктов, в которой белок присутствует в количестве от 0,2 до примерно 400 мкг/мл, или от 2 до примерно 400 мкг/мл, или от 4 до примерно 400 мкг/мл, или от 8 до примерно 400 мкг/мл, или от 8 до примерно 400 мкг/мл, или примерно от 0,3 до 200 мкг/мл, или от 2 примерно до 200 мкг/мл, или от 4 до примерно до 200 мкг/мл, или от 8 до примерно 200 мкг/мл, или примерно от 0,35 до 100 мкг/мл, или от 2 до примерно 100 мкг/мл, или от 4 до примерно 100 мкг/мл, или от 8 до примерно 100 мкг/мл, или примерно от 4 до 50 мкг/мл, или примерно от 0,45 до 30 мкг/мл, или примерно от 0,6 до 15 мкг/мл, или примерно от 0,75 до 8 мкг/мл, или примерно от 1,0 до 6 мкг/мл, или примерно от 1,3 до 3,0 мкг/мл, или примерно от 1,4 до 2,5 мкг/мл, или примерно от 1,5 до 2,0 мкг/мл, или примерно 1,6 мкг/мл.

65. Композиция, включающая белок по любому из предыдущих пунктов, содержащая одно или несколько из растворителя, дисперсионной среды, покрытия, стабилизирующего агента, разбавителя, консерванта, противомикробного агента, противогрибкового агента, изотонического агента, агента, замедляющего адсорбцию, адъюванта, надосадочной жидкости клеточной культуры, стабилизирующего агента, вирусного вектора, вектора экспрессии и/или иммуномодулирующего агента.

66. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где носитель, разбавитель или наполнитель представляет собой любой одно или несколько из адъюванта, иммуномодулирующего агента, надосадочной жидкости клеточной культуры, вирусного вектора или вектора экспрессии, или любой их комбинации.

67. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где носитель, разбавитель или наполнитель включает адъювант.

68. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где носитель, разбавитель или наполнитель включает адъювант, где адъювант включает один или несколько из полимера акриловой или метакриловой кислоты; сополимера малеинового ангидрида и алкенильного производного; сшитого полимера акриловой или метакриловой кислоты; полимера акриловой или метакриловой кислоты, сшитого с полиалкениловым эфиром сахара или полиспирта; карбомера; акрилового полимера, поперечно сшитого полигидроксилированным соединением, имеющий по меньшей мере 3 и не более 8 гидроксильных групп с атомами водорода по меньшей мере трех гидроксилов, при необходимости замещенными или замещенным ненасыщенными алифатическими радикалами, имеющими по меньшей мере 2 атома углерода, с указанными радикалами, содержащими от 2 до 4 атома углерода, такими как винилы, аллилы и другие этиленненасыщенные группы, и ненасыщенные радикалы сами могут содержать другие заместители, такие как метил; Карбопола; Карбопола 974P; Карбопола 934P; Карбопола 971P; гидроксида алюминия; фосфата алюминия; сапонина; Quil A; QS-21; GPI-0100; эмульсии вода-в-масле; эмульсии масло-в-воде; эмульсии вода-в-масле-в-воде; эмульсии на основе легкого жидкого парафинового масла или адъюванта типа Европейской Фармакопеи, изопреноидного масла; сквалана; скваланового масла, полученного в результате олигомеризации алкенов, изобутена или децена; сложного эфира (эфиров) кислоты (кислот) или спирта (спиртов), содержащего линейную алкильную группу; растительного масла (масел); этилолеата; ди-(каприлата/капрата) пропиленгликоля; глицерилтри-(каприлата/капрата); диолеата пропиленгликоля; сложного эфира (эфиров) разветвленной жирной кислоты (кислот) или спирта (спиртов); сложного эфира (эфиров) изостеариновой кислоты; неионного поверхностно-активного вещества (веществ); сложного эфира (эфиров) сорбитана, или маннида, или гликоля, или полиглицерина, или пропиленгликоля, или олеиновой, или изостеариновой кислоты, или рицинолевой кислоты, или гидроксистеариновой кислоты, при необходимости этоксилированного, ангидроманнитололеата; блок-сополимеров полиоксипропилена и полиоксиэтилена, продукта Плюроник, адъювантной системы RIBI; блок-сополимера; SAF-M; монофосфориллипида А; авридинового липидно-аминового адъюванта; термолабильного энтеротоксина из E. coli (рекомбинантного или другого); токсина холеры; IMS 1314 или мурамилдипептида.

69. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где носитель, разбавитель или наполнитель включает адъювант, где адъювант включает Карбопол или Карбопол 971.

70. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где носитель, разбавитель или наполнитель включает адъювант, где адъювант присутствует в количестве примерно от 50 мкг до 2000 от композиции, или где адъювант присутствует в дозе композиции примерно 250 мкг/мл, или адъювант присутствует в количестве примерно от 100 мкг до 10 мг от композиции, или где адъювант присутствует в количестве примерно от 500 мкг до 5 мг от композиции; адъювант присутствует в количестве примерно от 750 мкг до 2,5 мг от композиции, или адъювант присутствует в количестве примерно 1 мг от композиции.

71. Композиция по любому из предыдущих пунктов, содержащая иммуномодулирующий агент.

72. Композиция по любому из предыдущих пунктов, содержащая иммуномодулирующий агент, и где иммуномодулирующий агент представляет собой один или несколько из интерлейкина (интерлейкинов), интерферона (интерферонов) или другого цитокина (цитокинов).

73. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где композиция содержит антибиотик (антибиотики).

74. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где содержащая антибиотик (антибиотики), где антибиотик (антибиотики) включает гентамицин.

75. Композиция по любому из предыдущих пунктов, содержащая антибиотик (антибиотики), и где композиция содержит примерно от 1 мкг/мл до 60 мкг/мл антибиотика (антибиотиков).

76. Композиция по любому из предыдущих пунктов, содержащая антибиотик (антибиотики), и где композиция содержит примерно от 1 мкг/мл до менее примерно 30 мкг/мл антибиотика (антибиотиков).

77. Композиция по любому из предыдущих пунктов, содержащая дополнительный антиген.

78. Композиция по любому из предыдущих пунктов, содержащая дополнительный антиген, где указанный дополнительный антиген не является антигеном ORF2 PCV3.

79. Композиция по любому из предыдущих пунктов, содержащая дополнительный антиген, где указанный дополнительный антиген не является антигеном PCV3.

80. Композиция по любому из предыдущих пунктов, содержащая дополнительный антиген дополнительного патогена свиней.

81. Композиция по любому из предыдущих пунктов, дополнительно содержащая антиген дополнительного патогена свиней, при этом указанный патоген представляет собой любой один или несколько из антигенов PCV2, PRRSV (вируса респираторного и репродуктивного синдрома свиней), бактеринового антигена Mycoplasma hyopneumoniae, антигена надосадочной жидкости Mycoplasma hyopneumoniae, антигена болезни Ауески или псевдобешенства, антигена свиного гриппа, антигена чумы свиней (классической или африканской, или их комбинации), антигена Actinobacillus pleuropneumoniae, антигена Escherichia coli, антигена парвовируса свиней (PPV) или антигена Pasteurella multocida.

82. Композиция по любому из предыдущих пунктов, дополнительно содержащая антиген дополнительного патогена свиней, причем указанная композиция дополнительно содержит один или несколько из антигена PCV2, антигена PRRSV и антигена PPV.

83. Композиция по любому из предыдущих пунктов, дополнительно содержащая антиген PCV2.

84. Композиция по любому из предыдущих пунктов, дополнительно содержащая антиген PCV2, где антиген PCV2 представляет собой белок ORF2 PCV2.

85. Композиция по любому из предыдущих пунктов, дополнительно содержащая антиген PCV2, где антиген PCV2 представляет собой рекомбинантный белок ORF2 PCV2.

86. Композиция по любому из предыдущих пунктов, дополнительно содержащая антиген PCV2, где антиген PCV2 представляет собой белок ORF2 PCV2, экспрессируемый рекомбинантным бакуловирусом.

87. Композиция по любому из предыдущих пунктов, находящаяся в лекарственной форме.

88. Композиция по любому из предыдущих пунктов, составленная и/или упакованная для введения разовой дозы или однократной вакцинации.

89. Композиция по любому из предыдущих пунктов, составленная и/или упакованная для режима приема нескольких доз.

90. Композиция по любому из предыдущих пунктов, составленная и/или упакованная для режима приема двух доз.

91. Композиция по любому из предыдущих пунктов, находящаяся в лекарственной форме, и при этом указанная лекарственная форма доставляется из контейнера, содержащего большее количество указанной композиции, и при этом лекарственная форма указанной композиции может быть доставлена из указанного контейнера.

92. Композиция по любому из предыдущих пунктов, находящаяся в лекарственной форме, и при этом указанная лекарственная форма доставляется из контейнера, содержащего большее количество указанной композиции, и при этом лекарственная форма указанной композиции может быть доставлена из указанного контейнера, и при этом указанный контейнер содержит по меньшей мере 10 доз указанной композиции.

93. Композиция по любому из предыдущих пунктов, находящаяся в лекарственной форме, и при этом указанная лекарственная форма доставляется из контейнера, содержащего большее количество указанной композиции, и при этом лекарственная форма указанной композиции может быть доставлена из указанного контейнера, и при этом указанный контейнер содержит по меньшей мере 50 доз указанной композиции.

94. Композиция по любому из предыдущих пунктов, находящаяся в лекарственной форме, и при этом указанная лекарственная форма доставляется из контейнера, содержащего большее количество указанной композиции, и при этом лекарственная форма указанной композиции может быть доставлена из указанного контейнера, и при этом указанный контейнер содержит по меньшей мере 100 доз указанной композиции.

95. Композиция по любому из предыдущих пунктов, находящаяся в лекарственной форме, и при этом указанная лекарственная форма доставляется из контейнера, содержащего большее количество указанной композиции, и при этом лекарственная форма указанной композиции может быть доставлена из указанного контейнера, и при этом указанный контейнер содержит по меньшей мере 200 доз указанной композиции.

96. Композиция по любому из предыдущих пунктов, находящаяся в лекарственной форме, и где указанная лекарственная форма доставляется из контейнера, содержащего большое количество указанной композиции, и при этом лекарственная форма указанной композиции может быть доставлена из указанного контейнера, и при этом указанный контейнер содержит по меньшей мере 250 доз указанной композиции.

97. Композиция по любому из предыдущих пунктов, содержащая антиген PCV2, где антиген PCV2 представляет собой рекомбинантный бакуловирус, экспрессирующий белок ORF2 PCV2, и где либо белок, либо комбинированное общее количество белка ORF2 PCV3 и белка ORF PCV2 присутствуют в количестве примерно от 0,2 до 400 мкг/дозу, или от 2 до примерно 400 мкг/дозу, или от 4 до примерно 400 мкг/дозу. или от 8 до примерно 400 мкг/дозу, или примерно от 0,3 до 200 мкг/дозу, или от 2 до примерно 200 мкг/дозу, или от 4 до примерно 200 мкг/дозу, или от 8 до примерно 200 мкг/дозу, или примерно 0,35 до 100 мкг/дозу, или от 2 до примерно 100 мкг/дозу, или от 4 до примерно 100 мкг/дозу, или от 8 до примерно 100 мкг/дозу, или примерно от 0,4 до 50 мкг/дозу, или примерно от 0,45 до 30 мкг/дозу, или примерно от 0,6 до 15 мкг/дозу, или примерно от 0,75 до 8 мкг/дозу, или примерно от 1,0 до 6 мкг/дозу, или примерно от 1,3 до 3,0 мкг/дозу, или примерно от 1,4 до 2,5 мкг/дозу, или примерно от 1,5 до 2,0 мкг/дозу, или примерно 1,6 мкг/дозу.

98. Композиция по любому из предыдущих пунктов, содержащая соль.

99. Композиция по любому из предыдущих пунктов, содержащая инактивированный вирусный вектор и/или надосадочную жидкость клеточной культуры.

100. Композиция по любому из предыдущих пунктов, содержащая инактивированный вирусный вектор и надосадочную жидкость клеточной культуры.

101. Композиция по любому из предыдущих пунктов, содержащая (i) белок, (ii) по меньшей мере часть бакуловируса, экспрессирующего указанный белок, (iii) часть культуры клеток, которые были инфицированы или трансфицированы рекомбинантным бакуловирусом, который экспрессировал указанный белок, (iv) инактивирующий агент, или инактивирующий агент, содержащий бинарный этиленимин (BEI), (v) тиосульфат натрия, или тиосульфат натрия в количествах, эквивалентных инактивирующему агенту или BEI; (vi) адъювант, или адъювант, содержащий Карбопол или Карбопол 971, и (vii) фосфатную соль в физиологически приемлемой концентрации.

102. Композиция по любому из предыдущих пунктов, содержащая (i) белок, (ii) по меньшей мере часть бакуловируса, экспрессирующего указанный белок, (iii) часть культуры клеток, которые были инфицированы или трансфицированы рекомбинантным бакуловирусом, который экспрессировал указанный белок, (iv) инактивирующий агент, или инактивирующий агент, содержащий бинарный этиленимин (BEI), (v) тиосульфат натрия, или тиосульфат натрия в количествах, эквивалентных инактивирующему агенту или BEI; (vi) адъювант, или адъювант, содержащий Карбопол или Карбопол 971, и (vii) фосфатную соль в физиологически приемлемой концентрации, и где BEI получен из культуры клеток, обработанной примерно от 2 до 8 или примерно 5 мМ BEI для инактивации бакуловируса, и/или композиция содержит примерно от 2 до 8 или примерно 5 мМ BEI, и/или композиция содержит примерно 1 мг Карбопола или Карбопола 971.

103. Композиция по любому из предыдущих пунктов, представляющая собой иммуногенную композицию, содержащую белок по любому из предыдущих пунктов и носитель, разбавитель или наполнитель.

104. Композиция по любому из предыдущих пунктов, представляющая собой иммуногенную композицию, содержащую белок по любому из предыдущих пунктов и носитель, разбавитель или наполнитель, и дополнительный антиген по любому из предыдущих пунктов.

105. Способ получения композиции по любому из предыдущих пунктов, где белок по любому из предыдущих пунктов смешивают с носителем, разбавителем или наполнителем.

106. Способ получения композиции по любому из предыдущих пунктов, где белок по любому из предыдущих пунктов смешивают с носителем, разбавителем или наполнителем, и дополнительным антигеном.

107. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для использования в качестве лекарственного средства.

108. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для использования в качестве вакцины.

109. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для использования в способе индукции иммунного ответа или иммунологического ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа против PCV3 у животного.

110. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для использования в способе индукции иммунного ответа или иммунологического ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа против PCV3 у свиней.

111. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов. пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для использования в способе индукции иммунного ответа или иммунологического ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа против PCV3 у молодых свиней.

112. Белок по любому из предыдущих пунктов или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для использования в способе индукции иммунного ответа или иммунологического ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа против PCV3 у поросят.

113. Белок по любому из предыдущих пунктов или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для использования в способе индукции иммунного ответа или иммунологического ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа против PCV3 у поросят; при этом поросята должны получать вскармливание от свиноматок, которым вводили белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидную последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяина экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композицию по любому из предыдущих пунктов.

114. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для использования в способе индукции иммунного ответа или иммунологического ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа против PCV3 у свиноматок.

115. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для использования в способе индукции иммунного ответа или иммунологического ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа против PCV3 у беременных свиноматок, свиней до первого опороса, или подсвинков до осеменения.

116. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов. пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения с целью индукции иммунного ответа против PCV3 у животных.

117. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения с целью индукции иммунного ответа против PCV3 у свиней.

118. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения с целью индукции иммунного ответа против PCV3 у молодых свиней.

119. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения с целью индукции иммунного ответа против PCV3 у поросят.

120. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения с целью индукции иммунного ответа против PCV3 у поросят; при этом поросята должны получать вскармливание свиноматками, которым вводили белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидную последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяина экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композицию по любому из предыдущих пунктов.

121. Белок по любому из предыдущих пунктов или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения с целью индукции иммунного ответа против PCV3 у свиноматок.

122. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения с целью индукции иммунного ответа против PCV3 у беременных свиноматок, свиней до первого опороса или подсвинков до осеменения.

123. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения в способе уменьшения или предотвращения клинических признаков, или клинических симптомов или заболевания, вызванного инфекцией PCV3 у животного, или для применения в способе лечения или профилактики инфекции PCV3 у животного.

124. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения в способе уменьшения или предотвращения клинических признаков, или клинических симптомов или заболевания, вызванного инфекцией PCV3 у животного, или для применения в способе лечения или профилактики инфекции PCV3 у животного, где указанное животное является свиньей.

125. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения в способе уменьшения или предотвращения клинических признаков, или клинических симптомов или заболевания, вызванного инфекцией PCV3 у животного, или для применения в способе лечения или профилактики инфекции PCV3 у животного, где указанное животное представляет собой молодую свинью.

126. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения в способе уменьшения или предотвращения клинических признаков или клинических симптомов, или заболевания, вызванного инфекцией PCV3 у животного, или для применения в способе лечения или профилактики инфекции PCV3 у животного, где указанное животное представляет собой поросенка.

127. Белок по любому из предыдущих пунктов или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов. пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения в способе уменьшения или предотвращения клинических признаков или клинических симптомов, или заболевания, вызванного инфекцией PCV3 у животного, или для применения в способе лечения или профилактики инфекции PCV3 у животного, где указанное животное представляет собой поросенка, и при этом поросенок должен получать вскармливание свиноматкой, которой вводили белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидную последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяина экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композицию по любому из предыдущих пунктов.

128. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения в способе уменьшения или предотвращения клинических признаков или заболевания, вызванного инфекцией PCV3 у животного, или для применения в способе лечения или профилактики инфекции PCV3 у животного, где указанное животное является свиноматкой.

129. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов. пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения в способе уменьшения или предотвращения клинических признаков или клинических симптомов, или заболевания, вызванного инфекцией PCV3 у животного, или для применения в способе лечения или профилактики инфекции PCV3 у животного, где указанное животное представляет собой беременную свиноматку, свинью до первого опороса или подсвинка до осеменения.

130. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения при иммунизации животного против PCV3.

131. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения при иммунизации животного против PCV3, где указанное животное является свиньей.

132. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения при иммунизации животного против PCV3, где указанное животное представляет собой молодую свинью.

133. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения при иммунизации животного против PCV3, где указанное животное представляет собой поросенка.

134. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения при иммунизации животного против PCV3, где указанное животное представляет собой поросенка, и при этом поросенок должен получать вскармливание свиноматкой, которой вводили белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидную последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяина экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композицию по любому из предыдущих пунктов.

135. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения при иммунизации животного против PCV3, где указанное животное является свиноматкой.

136. Белок по любому из предыдущих пунктов или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения при иммунизации животного против PCV3, где указанное животное представляет собой беременную свиноматку, свинью до первого опороса или подсвинка до осеменения.

137. Белок по любому из предыдущих пунктов или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения в способе уменьшения, элиминации или нейтрализации экспрессии вируса PCV3 у животного.

138. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения в способе уменьшения, элиминации или нейтрализации экспрессии вируса PCV3 у животного, где указанное животное является свиньей.

139. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения в способе уменьшения, элиминации или нейтрализации экспрессии вируса PCV3 у животного, где указанное животное представляет собой молодую свинью.

140. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения в способе уменьшения, элиминации или прекращения экспрессии вируса PCV3 у животного, где указанное животное представляет собой поросенка.

141. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения в способе уменьшения, элиминации или нейтрализации экспрессии вируса PCV3 у животного, где указанное животное представляет собой поросенка, и при этом поросенок должен получать вскармливание свиноматкой, которой вводили белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидную последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяина экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композицию по любому из предыдущих пунктов.

141. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения в способе уменьшения, элиминации или нейтрализации экспрессии вируса PCV3 у животного, где указанное животное является свиноматкой.

142. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения в способе уменьшения, элиминации или нейтрализации экспрессии вируса PCV3 у животного, где указанное животное представляет собой беременную свиноматку, свинью до первого опороса или подсвинка до осеменения.

143. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения с целью индукции выработки антител, специфичных к PCV3, у животного.

144. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения с целью индукции выработки антител, специфичных к PCV3, у животного, где указанное животное является свиньей.

145. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения с целью индукции выработки антител, специфичных к PCV3, у животного, где указанное животное представляет собой молодую свинью.

146. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения с целью индукции выработки антител, специфичных к PCV3, у животного, где указанное животное представляет собой поросенка.

147. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения с целью индукции выработки антител, специфичных к PCV3, у животного, где указанное животное представляет собой поросенка, и при этом поросенок должен получать вскармливание свиноматкой, которой вводили белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидную последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяина экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композицию по любому из предыдущих пунктов.

148. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения с целью индукции выработки антител, специфичных к PCV3, у животного, где указанное животное является свиноматкой.

149. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения с целью индукции выработки антител, специфичных к PCV3, у животного, где указанное животное представляет собой беременную свиноматку, свинью до первого опороса или подсвинка до осеменения.

150. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где указанный белок по любому из предыдущих пунктов или нуклеотидную последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяина экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композицию по любому из предыдущих пунктов вводят указанному животному внутримышечно или интрадермально.

151. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где указанный белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидную последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяина экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композицию по любому из предыдущих пунктов вводят указанному животному вместе с другим антигеном, предпочтительно при этом другой патоген является антигеном патогена свиней.

152. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где указанный белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидную последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяина экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композицию по любому из предыдущих пунктов вводят указанному животному вместе с другим антигеном, где указанный другой антиген не является антигеном ORF2 PCV3, предпочтительно, где другой патоген является антигеном патогена свиней.

153. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где указанный белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидную последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяина экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композицию по любому из предыдущих пунктов вводят указанному животному вместе с другим антигеном, где указанный другой антиген не является антигеном PCV3, предпочтительно, где другой патоген является антигеном патогена свиньи.

154. Белок по любому из предыдущих пунктов или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где указанное животное представляет собой свиноматку, беременную поросенком.

155. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где указанное животное представляет собой свиноматку, беременную поросенком, и при этом поросенок должен получать вскармливание свиноматкой, которой вводили белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидную последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяина экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композицию по любому из предыдущих пунктов.

156. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где указанное животное является свиноматкой, и где указанный белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидную последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяина экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов вводят дважды указанной свиноматке.

157. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где указанное животное является свиноматкой, и где указанный белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидную последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяина экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композицию по любому из предыдущих пунктов вводят только дважды указанной свиноматке.

158. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где указанное животное представляет собой поросенка, и где белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидную последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяина экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композицию по любому из предыдущих пунктов вводят один раз указанному поросенку.

159. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где указанное животное представляет собой поросенка, и где белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидную последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяина экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композицию по любому из предыдущих пунктов вводят только один раз указанному поросенку.

160. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где указанное животное является свиноматкой, и где белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидную последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяина экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композицию по любому из предыдущих пунктов дважды вводят указанной свиноматке, и где указанное применение не включает введение любого другого антигена PCV3 указанному животному до или во время введения указанного белка по любому из предыдущих пунктов или нуклеотидной последовательности по любому из предыдущих пунктов, или вектора экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяина экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиции по любому из предыдущих пунктов.

161. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где указанное животное является свиноматкой, и где белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидную последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяина экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композицию по любому из предыдущих пунктов дважды вводят указанной свиноматке, и где указанное применение не включает введение любого другого антигена PCV3 указанному животному до или во время введения указанного белка по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидной последовательности по любому из предыдущих пунктов или вектора экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяина экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиции по любому из предыдущих пунктов.

162. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где указанное животное является свиноматкой, и где белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидную последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяина экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композицию по любому из предыдущих пунктов вводят только дважды указанной свиноматке, и где указанное применение не включает введение любого другого антигена PCV3 указанному животному до или во время введения указанного белка по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидной последовательности по любому из предыдущих пунктов, или вектора экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяина экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиции по любому из предыдущих пунктов.

163. Белок по любому из предыдущих пунктов или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где указанное животное представляет собой поросенка, и где белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидную последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяина экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композицию по любому из предыдущих пунктов вводят один раз указанному поросенку, и где указанное применение не включает введение любого другого антигена PCV3 указанному животному до или во время введения указанного белка по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидной последовательности по любому из предыдущих пунктов, или вектора экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяина экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиции по любому из предыдущих пунктов.

164. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где указанное животное представляет собой поросенка, и где белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидную последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяина экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композицию по любому из предыдущих пунктов вводят один раз указанному поросенку, и где указанное применение не включает введение любого другого антигена PCV3 указанному животному до или во время введения указанного белка по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидной последовательности по любому из предыдущих пунктов, или вектора экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяина экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиции по любому из предыдущих пунктов.

165. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где указанное животное представляет собой поросенка, и где белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидную последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяина экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композицию по любому из предыдущих пунктов вводят только один раз указанному поросенку, и где указанное применение не включает введение любого другого антигена PCV3 указанному животному до или во время введения указанного белка по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидной последовательности по любому из предыдущих пунктов, или вектора экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяина экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиции по любому из предыдущих пунктов.

166. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где введение животному при применении состоит из однодозовой, однократной вакцинации или однократного введения одной дозы указанного белка по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидной последовательности по любому из предыдущих пунктов, или вектора экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяина экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиции по любому из предыдущих пунктов.

167. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где введение животному при применении состоит из режима многократной вакцинации или режима введения нескольких доз указанного белка по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидной последовательности по любому из предыдущих пунктов, или вектора экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяина экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиции по любому из предыдущих пунктов.

168. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где введение животному при применении состоит из двукратного введения, или двукратного введения дозы указанного белка по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидной последовательности по любому из предыдущих пунктов, или вектора экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяина экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиции по любому из предыдущих пунктов.

169. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где введение животному осуществляют в течение по меньшей мере 1, 2 или 3 недель воздействия вирулентного цирковируса свиней.

170. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где животным является поросенок в возрасте не старше 15 недель, или не старше 6 недель, или не старше 3 недель, или не старше 2 недель, или не старше 1 недели.

171. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где указанный белок по любому из предыдущих пунктов или указанная композиция по любому из предыдущих пунктов предназначена для применения по любому из предыдущих пунктов.

172. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где указанный белок по любому из предыдущих пунктов предназначен для применения по любому из предыдущих пунктов.

173. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где указанная композиция по любому из предыдущих пунктов предназначена для применения по любому из предыдущих пунктов.

174. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где второй антиген вводят животному перед введением белка по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидной последовательности по любому из предыдущих пунктов, или вектора экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяина экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиции по любому из предыдущих пунктов.

175. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где второй антиген вводят животному одновременно с введением белка по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидной последовательности по любому из предыдущих пунктов, или вектора экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяина экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиции по любому из предыдущих пунктов.

176. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где второй антиген вводят животному в то же время и в той же композиции, что и при введении белка по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидной последовательности по любому из предыдущих пунктов, или вектора экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяина экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиции по любому из предыдущих пунктов.

177. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где второй антиген вводят животному в то же время и в другой композиции, при введении белка по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидной последовательности по любому из предыдущих пунктов, или вектора экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяина экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиции по любому из предыдущих пунктов.

178. Белок по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидная последовательность по любому из предыдущих пунктов, или вектор экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяин экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где второй антиген вводят животному после введения белка по любому из предыдущих пунктов, или нуклеотидной последовательности по любому из предыдущих пунктов, или вектора экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или хозяина экспрессии по любому из предыдущих пунктов, или композиции по любому из предыдущих пунктов.

179. Белок по любому из предыдущих пунктов в качестве единственного антигена PCV3 для применения при вакцинации свиней для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у свиней, при этом белок находится в иммуногенной композиции, которую вводят этой молодой свинье в одной дозе.

180. Белок по любому из предыдущих пунктов в качестве единственного антигена PCV3 для применения при вакцинации молодой свиньи для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи, при этом белок находится в иммуногенной композиции, которую вводят этой молодой свинье только в одной дозе.

181. Белок по любому из предыдущих пунктов в качестве единственного антигена PCV3 для применения при вакцинации молодой свиньи для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи, где белок находится в иммуногенной композиции, которую вводят этой молодой свинье в двух дозах.

182. Белок по любому из предыдущих пунктов в качестве единственного антигена PCV3 для применения при вакцинации молодой свиньи для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи, при этом белок находится в иммуногенной композиции, которую вводят этой молодой свинье только в двух дозах.

183. Белок по любому из предыдущих пунктов для применения в качестве единственного антигена PCV3 для вакцинации молодой свиньи для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи, при этом белок находится в иммуногенной композиции. которую вводят этой молодой свинье в одной дозе.

184. Белок по любому из предыдущих пунктов для применения в качестве единственного антигена PCV3 для вакцинации молодой свиньи для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи, при этом белок находится в иммуногенной композиции. которую вводят этой молодой свинье только в одной дозе.

185. Белок по любому из предыдущих пунктов для применения в качестве единственного антигена PCV3 для вакцинации молодой свиньи с целью уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи, при этом белок находится в иммуногенной композиции. которую вводят этой молодой свинье в двух дозах.

186. Белок по любому из предыдущих пунктов для применения в качестве единственного антигена PCV3 для вакцинации молодой свиньи для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи, при этом белок находится в иммуногенной композиции. которую вводят этой молодой свинье только в двух дозах.

187. Иммуногенная композиция по любому из предыдущих пунктов для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где одну дозу иммуногенной композиции вводят этой молодой свинье в способе вакцинации для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где введение одной дозы иммуногенной композиции молодой свинье в способе вакцинации снижает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где белок по любому из предыдущих пунктов представляет собой антигенный компонент в одной дозе иммуногенной композиции в способе вакцинации, который уменьшает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

предпочтительно белок присутствует в количестве по меньшей мере 2 мкг в одной дозе иммуногенной композиции;

где белок представляет собой антигенный компонент в способе вакцинации, который уменьшает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи.

188. Иммуногенная композиция по любому из предыдущих пунктов для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где только одну дозу иммуногенной композиции вводят этой молодой свинье в способе вакцинации для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где введение одной дозы иммуногенной композиции молодой свинье в способе вакцинации снижает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где белок по любому из предыдущих пунктов представляет собой антигенный компонент в одной дозе иммуногенной композиции в способе вакцинации, который уменьшает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

предпочтительно белок присутствует в количестве по меньшей мере 2 мкг в одной дозе иммуногенной композиции;

где белок представляет собой антигенный компонент в способе вакцинации, который снижает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи.

189. Иммуногенная композиция по любому из предыдущих пунктов для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где две дозы иммуногенной композиции вводят этой молодой свинье в способе вакцинации для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где введение двух доз иммуногенной композиции молодой свинье в способе вакцинации снижает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где белок по любому из предыдущих пунктов представляет собой антигенный компонент в двух дозах иммуногенной композиции в способе вакцинации, который уменьшает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

предпочтительно белок присутствует в количестве по меньшей мере 2 мкг в одной дозе иммуногенной композиции;

где белок представляет собой антигенный компонент в способе вакцинации, который уменьшает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи.

190. Иммуногенная композиция по любому из предыдущих пунктов для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где только две дозы иммуногенной композиции вводят этой молодой свинье в способе вакцинации для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где введение двух доз иммуногенной композиции молодой свинье в способе вакцинации снижает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где белок по любому из предыдущих пунктов представляет собой антигенный компонент в двух дозах иммуногенной композиции в способе вакцинации, который снижает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

предпочтительно белок присутствует в количестве по меньшей мере 2 мкг в одной дозе иммуногенной композиции;

где белок представляет собой антигенный компонент в способе вакцинации, который снижает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи.

191. Применение по любому из предыдущих пунктов, где указанные клинические признаки или симптомы выбраны из группы, состоящей из снижения среднесуточного привеса и смертности.

192. Применение по любому из предыдущих пунктов, где указанные клинические признаки или симптомы выбраны из группы, состоящей из макроскопических повреждений, гистологических нарушений, репликации PCV3 в ткани и виремии PCV3.

193. Применение по любому из предыдущих пунктов, где указанные клинические признаки или симптомы выбраны из группы, состоящей из развития или продукции мумифицированного плода.

194. Применение по любому из предыдущих пунктов, где указанные клинические признаки или симптомы представляют собой или включают выталкивание мумифицированного, мертворожденного и/или слабого плода.

НАБОР ПУНКТОВ D:

Набор пунктов D - Настоящее изобретение теперь будет описано посредством следующего набора пронумерованных пунктов (Набора пунктов D). Раскрытие в этом наборе пунктов в равной степени применимо к настоящему изобретению. Подобным образом раскрытие в этом наборе пунктов в равной степени применимо к каждому из других наборов пунктов.

1. Антигенный белок цирковируса свиней 3 типа (PCV3), являющийся функциональным антигенным вариантом белка ORF2 PCV3.

2. Белок по п.1, где указанный белок ORF2 PCV3 представляет собой белок, кодируемый SEQ ID No. 1.

3. Белок по пп.1 или 2, содержащий замены и/или удлинения ORF2 PCV3.

4. Белок по любому из предыдущих пунктов, представляющий собой функциональный антигенный вариант белка, кодируемого SEQ ID No.1.

5. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант способен давать более высокий выход вирусоподобных частиц (VLP), чем белок, кодируемый SEQ ID No.1.

6. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант способен давать более высокий выход VLP, чем белок, кодируемый SEQ ID No.1, как можно определить с помощью вестерн-блоттинга.

7. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант имеет меньше положительно заряженных аминокислотных остатков, чем белок, кодируемый SEQ ID No.1.

8. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант имеет одну или несколько замен в петле FG белка, кодируемого SEQ ID No.1.

9. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант имеет одну или несколько замен в петле FG белка, кодируемого SEQ ID No.1, где эти замены включают замены одного или нескольких остатков S, и/или остатков K и/или остатка H мотива SKKKH петли FG белка, кодируемого SEQ ID No. 1.

10. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант имеет одну или несколько замен в петле FG белка, кодируемого SEQ ID No. 1, где эти замены включают замены одного или нескольких из остатка S, и/или остатков K мотива SKKKH петли FG белка, кодируемого SEQ ID No.1.

11. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант имеет одну или несколько замен в петле FG белка, кодируемого SEQ ID No.1, где эти замены включают замены остатка S или остатка H и всех остатков K мотива SKKKH петли FG белка, кодируемого SEQ ID No.1.

12. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант имеет одну или несколько замен в петле FG белка, кодируемого SEQ ID No.1, где эти замены включают замену по меньшей мере S и/или H и любого K из мотива SKKKH петли FG белка, кодируемого SEQ ID No.1, на Q, P, F или S.

13. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант имеет одну или несколько замен в петле FG белка, кодируемого SEQ ID No.1, где эти замены включают замену мотива SKKK в мотиве SKKKH петли FG белка, кодируемого SEQ ID No.1, на QPFS, или замену мотива KKKH в мотиве SKKKH петли FG белка, кодируемого SEQ ID No.1, на QPFS.

14. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант кодируется полностью или частично SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6 или 7.

15. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант кодируется полностью или частично SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6 или 7.

16. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант имеет С-концевую часть, которая выходит за пределы концевой последовательности SVL белка, кодируемого SEQ ID No.1, предпочтительно, где указанное удлинение является полным или включает последовательность от цирковируса, и предпочтительно где по меньшей мере часть указанного удлинения заменяет концевую последовательность SVL белка, кодируемого SEQ ID No.1.

17. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант имеет С-концевую часть, которая выходит за пределы концевой последовательности SVL белка, кодируемого SEQ ID No.1, и где указанное удлинение составляет от 1 до 100 аминокислот.

18. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант имеет С-концевую часть, которая выходит за пределы концевой последовательности SVL белка, кодируемого SEQ ID No. 1, и где указанное удлинение составляет от 1 до 50 аминокислот.

19. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант имеет С-концевую часть, которая выходит за пределы концевой последовательности SVL белка, кодируемого SEQ ID No.1, и где указанное удлинение составляет от 1 до 30 аминокислот.

20. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант имеет С-концевую часть, которая выходит за пределы концевой последовательности SVL белка, кодируемого SEQ ID No.1, где указанное удлинение составляет от 1 до 30 аминокислот, и где указанное удлинение включает всю часть последовательности VKININLTPPVATSRVPSRALPLRFGCGHR.

21. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант имеет С-концевую часть, которая выходит за пределы концевой последовательности SVL белка, кодируемого SEQ ID No.1, где указанное удлинение составляет от 1 до 30 аминокислот, и где указанное удлинение включает всю последовательность VKININLTPPVATSRVPSRALPLRFGCGHR.

22. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант кодируется полностью или частично SEQ ID NО: 1, 2, 5, 6 или 7.

23. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант кодируется полностью или частично SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6 или 7.

24. Белок по любому из предыдущих пунктов, представляющий собой рекомбинантный белок, полученный методами рекомбинантной ДНК.

25. Белок по любому из предыдущих пунктов, представляющий собой белок, экспрессируемый бакуловирусом.

26. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный PCV3 выбран из группы, состоящей из PCV3a и PCV3b.

27. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный PCV3 представляет собой любую филогенетическую ветвь PCV3 или выбран из группы, состоящей из PCV3a1, PCV3b1, PCV3b2 и PCV3c.

28. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанная ORF2 PCV3 принадлежит к группе a1, b1 или b2 (с использованием обозначения подтипа Fux et al., «Full genome characterization of porcine circovirus type 3 isolates reveals the existence of two distinct groups of virus strains», Virology Journal (2018) 15:25, DOI 10.118/s12985-018-0929-3 (включено в настоящий документ посредством ссылки); см., например, таблицу 4).

29. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный белок ORF2 PCV3 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, кодируемой полинуклеотидной последовательностью, имеющей по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1 или гомологии последовательности с SEQ ID NO: 1.

30. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный вариантный белок содержит или состоит из аминокислотной последовательности, кодируемой полинуклеотидной последовательностью, имеющей по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности последовательности с SEQ ID NO:1 или гомологии последовательности с SEQ ID NO:6.

31. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный вариантный белок содержит или состоит из аминокислотной последовательности, кодируемой полинуклеотидной последовательностью, имеющей по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности последовательности с SEQ ID NO:1 или гомологии последовательности с SEQ ID NO:7.

32. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный белок ORF2 PCV3 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 3, 4, 8, 9 или 10, и/или где белок представляет собой рекомбинантный белок.

33. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный вариантный белок содержит или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 3, 4, 8, 9 или 10, и/или где белок представляет собой рекомбинантный белок, или белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный вариантный белок содержит или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 3, 4, 8, 9 или 10, и/или где белок является рекомбинантным белком, и где указанный белок имеет одну или несколько замен в петле FG.

34. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный вариантный белок содержит или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 3, 4 , 8, 9 или 10, и/или где белок представляет собой рекомбинантный белок, или белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный вариантный белок содержит или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 3, 4, 8, 9 или 10, и/или где белок представляет собой рекомбинантный белок, и где указанный белок имеет С-концевую часть, которая выходит за пределы концевой последовательности SVL белка, кодируемого SEQ ID No. 1.

35. Белок по любому из предыдущих пунктов, представляющий собой рекомбинантный белок в результате его экспрессии вектором экспрессии, содержащим полинуклеотидную последовательность, кодирующую белок.

36. Белок по любому из предыдущих пунктов, представляющий собой рекомбинантный белок, полученный в результате его экспрессии бакуловирусным вектором экспрессии, содержащим полинуклеотидную последовательность, кодирующую белок.

37. Нуклеотидная последовательность, кодирующая белок по любому из предыдущих пунктов.

38. Вектор, содержащий нуклеотидную последовательность по любому из предыдущих пунктов.

39. Рекомбинантный вектор, содержащий нуклеотидную последовательность по любому из предыдущих пунктов.

40. Хозяин экспрессии, трансформированный или трансфицированный нуклеотидной последовательностью по любому из предыдущих пунктов.

41. Хозяин бакуловирусной экспрессии, трансформированный или трансфицированный нуклеотидной последовательностью по любому из предыдущих пунктов.

42. Способ получения белка по любому из предыдущих пунктов, включающий экспрессию нуклеотидной последовательности по любому из предыдущих пунктов.

43. Способ получения белка по любому из предыдущих пунктов, включающий экспрессию вектора по любому из предыдущих пунктов.

44. Способ получения белка по любому из предыдущих пунктов, включающий экспрессию рекомбинантного вектора по любому из предыдущих пунктов.

45. Способ получения белка по любому из предыдущих пунктов, включающий культивирование хозяина экспрессии по любому из предыдущих пунктов, чтобы вызвать экспрессию белка.

46. Способ получения белка по любому из предыдущих пунктов, включающий трансфекцию хозяина для экспрессии нуклеотидной последовательностью вектора по любому из предыдущих пунктов и культивирование хозяина для экспрессии, чтобы вызвать экспрессию белка.

47. Способ получения белка по любому из предыдущих пунктов, включающий культивирование хозяина для бакуловирусной экспрессии по любому из предыдущих пунктов, чтобы вызвать экспрессию белка.

48. Способ получения белка по любому из предыдущих пунктов, включающий трансфекцию хозяина для бакуловирусной экспрессии нуклеотидной последовательностью вектора по любому из предыдущих пунктов и культивирование хозяина для бакуловирусной экспрессии для того, чтобы вызвать экспрессию белка.

49. Способ по любому из предыдущих пунктов, где инактивирующий агент используют, когда достигнуты достаточные уровни экспрессии белка.

50. Способ по любому из предыдущих пунктов, где инактивирующий агент, включающий бинарный этиленимин (BEI), используют, когда достигнуты достаточные уровни экспрессированного белка.

51. Способ получения белка по любому из предыдущих пунктов, включающий трансфекцию хозяина для бакуловирусной экспрессии нуклеотидной последовательностью вектора по любому из предыдущих пунктов и культивирование хозяина для бакуловирусной экспрессии в среде, чтобы вызвать экспрессию белка, где среда после экспрессии белка включает (i) указанный белок, (ii) по меньшей мере часть бакуловируса, экспрессирующую указанный белок, (iii) часть культуры клеток, которые были инфицированы или трансфицированы рекомбинантным бакуловирусом, который экспрессировал указанный белок.

52. Способ получения белка по любому из предыдущих пунктов, включающий трансфекцию хозяина для бакуловирусной экспрессии нуклеотидной последовательностью вектора по любому из предыдущих пунктов и культивирование хозяина для бакуловирусной экспрессии в среде, чтобы вызвать экспрессию белка, где среда после экспрессии белка включает (i) указанный белок, (ii) по меньшей мере часть бакуловируса, экспрессирующего указанный белок, (iii) часть культуры клеток, которые были инфицированы или трансфицированы рекомбинантным бакуловирусом, который экспрессировал указанный белок, и где примерно 90% компонентов (i) - (iii) имеют размер менее 1 мкм.

53. Способ получения белка по любому из предыдущих пунктов, включающий трансфекцию хозяина для бакуловирусной экспрессии нуклеотидной последовательностью вектора по любому из предыдущих пунктов и культивирование хозяина для бакуловирусной экспрессии в среде, чтобы вызвать экспрессию белка, где среда после экспрессии белка включает (i) указанный белок, (ii) по меньшей мере часть бакуловируса, экспрессирующего указанный белок, (iii) часть культуры клеток, которые были инфицированы или трансфицированы рекомбинантным бакуловирусом, который экспрессировал указанный белок, и где примерно 90% компонентов (i) - (iii) имеют размер менее 1 мкм, а pH указанной композиции доводят до примерно 6,5-7,5.

54. Способ получения белка по любому из предыдущих пунктов, включающий получение белка бакуловирусной системой экспрессии в культивируемых клетках насекомых.

55. Способ получения белка по любому из предыдущих пунктов, включающий получение белка бакуловирусной системой экспрессии в культивируемых клетках насекомых, и где способ включает стадию инактивации бакуловируса.

56. Способ получения белка по любому из предыдущих пунктов, включающий получение белка бакуловирусной системой экспрессии в культивируемых клетках насекомых, и где способ включает стадию инактивации бакуловируса, и где стадия инактивации включает тепловую обработку или использование агента, инактивирующего вирус.

57. Способ получения белка по любому из предыдущих пунктов, включающий получение белка бакуловирусной системой экспрессии в культивируемых клетках насекомых, и где способ включает стадию инактивации бакуловируса, и где стадия инактивации включает тепловую обработку или использование агента, инактивирующего вирус, и где агент, инактивирующий вирус, включает азиридиновое соединение.

58. Способ получения белка по любому из предыдущих пунктов, включающий получение белка бакуловирусной системой экспрессии в культивируемых клетках насекомых, и где способ включает стадию инактивации бакуловируса, и где стадия инактивации включает тепловую обработку или использование агента, инактивирующего вирус, и где агент, инактивирующий вирус, включает азиридиновое соединение, где азиридиновое соединение включает BEI.

59. Белок, получаемый способом по любому из предыдущих пунктов.

60. Композиция, содержащая белок, получаемый способом по любому из предыдущих пунктов.

61. Композиция, которую можно получить способом по любому из предыдущих пунктов.

62. Композиция, содержащая белок по любому из предыдущих пунктов и носитель, разбавитель или наполнитель.

63. Композиция, содержащая белок по любому из предыдущих пунктов и ветеринарно приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель.

64. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где белок присутствует в количестве от 0,2 до примерно 400 мкг/мл, или от 2 до примерно 400 мкг/мл, или от 4 до примерно 400 мкг/мл, или от 8 до примерно 400 мкг/мл, или от 8 до примерно 400 мкг/мл, или примерно от 0,3 до 200 мкг/мл, или от 2 примерно до 200 мкг/мл, или от 4 примерно до 200 мкг/мл, или от 8 примерно до 200 мкг/мл, или примерно от 0,35 до 100 мкг/мл, или от 2 до примерно 100 мкг/мл, или от 4 до примерно 100 мкг/мл, или от 8 до примерно 100 мкг/мл, или примерно от 0,4 до 50 мкг/мл, или примерно от 0,45 до 30 мкг/мл, или примерно от 0,6 до 15 мкг/мл, или примерно от 0,75 до 8 мкг/мл, или примерно от 1,0 до 6 мкг/мл, или примерно от 1,3 до 3,0 мкг/мл, или примерно от 1,4 до 2,5 мкг/мл, или примерно от 1,5 до 2,0 мкг/мл, или примерно 1,6 мкг/мл.

65. Композиция, содержащая белок по любому из предыдущих пунктов, включающая одно или несколько из растворителя, дисперсионной среды, покрытия, стабилизирующего агента, разбавителя, консерванта, противомикробного агента, противогрибкового агента, изотонического агента, агента, замедляющего адсорбцию, адъюванта, надосадочной жидкости клеточной культуры, стабилизирующего агента, вирусного вектора, вектора экспрессии и/или иммуномодулирующего агента.

66. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где носитель, разбавитель или наполнитель представляет собой любой один или несколько из адъюванта, иммуномодулирующего агента, надосадочной жидкости клеточной культуры, вирусного вектора или вектора экспрессии, или любой их комбинации.

67. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где носитель, разбавитель или наполнитель включает адъювант.

68. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где носитель, разбавитель или наполнитель включает адъювант, где адъювант включает один или несколько из полимера акриловой или метакриловой кислоты; сополимера малеинового ангидрида и алкенильного производного; сшитого полимера акриловой или метакриловой кислоты; полимера акриловой или метакриловой кислоты, сшитого с полиалкениловым эфиром сахара или полиспирта; карбомера; акрилового полимера, поперечно сшитого полигидроксилированным соединением, имеющий по меньшей мере 3 и не более 8 гидроксильных групп с атомами водорода по меньшей мере трех гидроксилов, при необходимости замещенными или замещенным ненасыщенными алифатическими радикалами, имеющими по меньшей мере 2 атома углерода, с указанными радикалами, содержащими от 2 до 4 атома углерода, такими как винилы, аллилы и другие этиленненасыщенные группы, и ненасыщенные радикалы сами могут содержать другие заместители, такие как метил; Карбопола; Карбопола 974P; Карбопола 934P; Карбопола 971P; гидроксида алюминия; фосфата алюминия; сапонина; Quil A; QS-21; GPI-0100; эмульсии вода-в-масле; эмульсии масло-в-воде; эмульсии вода-в-масле-в-воде; эмульсии на основе легкого жидкого парафинового масла или адъюванта типа Европейской Фармакопеи, изопреноидного масла; сквалана; скваланового масла, полученного в результате олигомеризации алкенов, изобутена или децена; сложного эфира (эфиров) кислоты (кислот) или спирта (спиртов), содержащего линейную алкильную группу; растительного масла (масел); этилолеата; ди-(каприлата/капрата) пропиленгликоля; глицерилтри-(каприлата/капрата); диолеата пропиленгликоля; сложного эфира (эфиров) разветвленной жирной кислоты (кислот) или спирта (спиртов); сложного эфира (эфиров) изостеариновой кислоты; неионного поверхностно-активного вещества (веществ); сложного эфира (эфиров) сорбитана, или маннида, или гликоля, или полиглицерина, или пропиленгликоля, или олеиновой, или изостеариновой кислоты, или рицинолевой кислоты, или гидроксистеариновой кислоты, при необходимости этоксилированного, ангидроманнитололеата; блок-сополимеров полиоксипропилена и полиоксиэтилена, продукта Плюроник, адъювантной системы RIBI; блок-сополимера; SAF-M; монофосфориллипида А; авридинового липидно-аминового адъюванта; термолабильного энтеротоксина из E. coli (рекомбинантного или другого); токсина холеры; IMS 1314 или мурамилдипептида.

69. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где носитель, разбавитель или наполнитель включает адъювант, где адъювант включает Карбопол или Карбопол 971.

70. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где носитель, разбавитель или наполнитель включает адъювант, где адъювант присутствует в количестве примерно от 50 мкг до 2000 от композиции, или где адъювант присутствует в количество примерно 250 мкг/мл дозы композиции, или адъювант присутствует в количестве примерно от 100 мкг до 10 мг композиции, или где адъювант присутствует в количестве примерно от 500 мкг до 5 мг от композиции; адъювант присутствует в количестве примерно от 750 мкг до 2,5 мг от композиции, или адъювант присутствует в количестве примерно 1 мг от композиции.

71. Композиция по любому из предыдущих пунктов, содержащая иммуномодулирующий агент.

72. Композиция по любому из предыдущих пунктов, содержащая иммуномодулирующий агент, и где иммуномодулирующий агент представляет собой один или несколько из интерлейкина (интерлейкинов), интерферона (интерферонов) или другого цитокина (цитокинов).

73. Композиция по любому из предыдущих пунктов, содержащая антибиотик (антибиотики).

74. Композиция по любому из предыдущих пунктов, содержащая антибиотик (антибиотики), где антибиотик (антибиотики) включает гентамицин.

75. Композиция по любому из предыдущих пунктов, содержащая антибиотик (антибиотики), и содержащая примерно от 1 мкг/мл до 60 мкг/мл антибиотика (антибиотиков).

76. Композиция по любому из предыдущих пунктов, содержащая антибиотик (антибиотики), и содержащая примерно от 1 мкг/мл до менее примерно 30 мкг/мл антибиотика (антибиотиков).

77. Композиция по любому из предыдущих пунктов, содержащая дополнительный антиген.

78. Композиция по любому из предыдущих пунктов, содержащая дополнительный антиген, где указанный дополнительный антиген не является антигеном ORF2 PCV3.

79. Композиция по любому из предыдущих пунктов, содержащая дополнительный антиген, где указанный дополнительный антиген не является антигеном PCV3.

80. Композиция по любому из предыдущих пунктов, содержащая дополнительный антиген дополнительного патогена свиней.

81. Композиция по любому из предыдущих пунктов, дополнительно содержащая антиген дополнительного патогена свиней, где указанный патоген представляет собой любой один или несколько из антигенов PCV2, PRRSV (вируса респираторного и репродуктивного синдрома свиней), бактеринового антигена Mycoplasma hyopneumoniae, антигена надосадочной жидкости Mycoplasma hyopneumoniae, антигена болезни Ауески или псевдобешенства, антигена свиного гриппа, антигена свиной чумы (классической или африканской, или их комбинации), антигена Actinobacillus pleuropneumoniae, антигена Escherichia coli, антигена парвовируса свиней (PPV) или антигена Pasteurella multos.

82. Композиция по любому из предыдущих пунктов, дополнительно содержащая антиген дополнительного патогена свиней, причем указанная композиция дополнительно содержит один или несколько из антигена PCV2, антигена PRRSV и антигена PPV.

83. Композиция по любому из предыдущих пунктов, дополнительно содержащая антиген PCV2.

84. Композиция по любому из предыдущих пунктов, дополнительно содержащая антиген PCV2, где антиген PCV2 представляет собой белок ORF2 PCV2.

85. Композиция по любому из предыдущих пунктов, дополнительно содержащая антиген PCV2, где антиген PCV2 представляет собой рекомбинантный белок ORF2 PCV2.

86. Композиция по любому из предыдущих пунктов, дополнительно содержащая антиген PCV2, где антиген PCV2 представляет собой экспрессируемый бакуловирусом рекомбинантный белок ORF2 PCV2.

87. Композиция по любому из предыдущих пунктов, находящаяся в лекарственной форме.

88. Композиция по любому из предыдущих пунктов, составленная и/или упакованная для введения разовой дозы или однократной вакцинации.

89. Композиция по любому из предыдущих пунктов, составленная и/или упакованная для режима приема нескольких доз.

90. Композиция по любому из предыдущих пунктов, составленная и/или упакованная для режима приема двух доз.

91. Композиция по любому из предыдущих пунктов, находящаяся в лекарственной форме, и при этом указанная лекарственная форма доставляется из контейнера, содержащего большее количество указанной композиции, и при этом лекарственная форма указанной композиции может быть доставлена из указанного контейнера.

92. Композиция по любому из предыдущих пунктов, находящаяся в лекарственной форме, и при этом указанная лекарственная форма доставляется из контейнера, содержащего большее количество указанной композиции, и при этом лекарственная форма указанной композиции может быть доставлена из указанного контейнера, и при этом указанный контейнер содержит по меньшей мере 10 доз указанной композиции.

93. Композиция по любому из предыдущих пунктов, находящаяся в лекарственной форме, и при этом указанная лекарственная форма доставляется из контейнера, содержащего большее количество указанной композиции, и при этом лекарственная форма указанной композиции может быть доставлена из указанного контейнера, и при этом указанный контейнер содержит по меньшей мере 50 доз указанной композиции.

94. Композиция по любому из предыдущих пунктов, находящаяся в лекарственной форме, и при этом указанная лекарственная форма доставляется из контейнера, содержащего большее количество указанной композиции, и при этом лекарственная форма указанной композиции может быть доставлена из указанного контейнера, и при этом указанный контейнер содержит по меньшей мере 100 доз указанной композиции.

95. Композиция по любому из предыдущих пунктов, находящаяся в лекарственной форме, и при этом указанная лекарственная форма доставляется из контейнера, содержащего большее количество указанной композиции, и при этом лекарственная форма указанной композиции может быть доставлена из указанного контейнера, и при этом указанный контейнер содержит по меньшей мере 200 доз указанной композиции.

96. Композиция по любому из предыдущих пунктов, находящаяся в лекарственной форме, и при этом указанная лекарственная форма доставляется из контейнера, содержащего большее количество указанной композиции, и при этом лекарственная форма указанной композиции может быть доставлена из указанного контейнера, и при этом указанный контейнер содержит по меньшей мере 250 доз указанной композиции.

97. Композиция по любому из предыдущих пунктов, содержащая антиген PCV2, где антиген PCV2 представляет собой экспрессируемый бакуловирусом рекомбинантный белок ORF2 PCV2, и где либо белок, либо комбинированные общие белки ORF2 PCV3 и ORF PCV2 присутствуют в количестве примерно от 0,2 до 400 мкг/дозу, или от 2 до примерно 400 мкг/дозу, или от 4 до примерно 400 мкг/дозу. или от 8 до примерно 400 мкг/дозу, или примерно от 0,3 до примерно 200 мкг/дозу, или от 2 до примерно 200 мкг/дозу, или от 4 до примерно 200 мкг/дозу, или от 8 до примерно 200 мкг/дозу, или примерно от 0,35 до 100 мкг/дозу, или от 2 до примерно 100 мкг/дозу, или от 4 до примерно 100 мкг/дозу, или от 8 до примерно 100 мкг/дозу, или примерно от 0,4 до 50 мкг/дозу, или примерно от 0,45 до 30 мкг/дозу, или примерно от 0,6 до 15 мкг/дозу, или примерно от 0,75 до 8 мкг/дозу, или примерно от 1,0 до 6 мкг/дозу, или примерно от 1,3 до 3,0 мкг/дозу, или примерно от 1,4 до 2,5 мкг/дозу, или от 1,5 до примерно 2,0 мкг/дозу или примерно 1,6 мкг/дозу.

98. Композиция по любому из предыдущих пунктов, содержащая соль.

99. Композиция по любому из предыдущих пунктов, содержащая инактивированный вирусный вектор и/или надосадочную жидкость клеточной культуры.

100. Композиция по любому из предыдущих пунктов, содержащая инактивированный вирусный вектор и надосадочную жидкость клеточной культуры.

101. Композиция по любому из предыдущих пунктов, содержащая (i) белок, (ii) по меньшей мере часть бакуловируса, экспрессирующего указанный белок, (iii) часть культуры клеток, которые были инфицированы или трансфицированы рекомбинантным бакуловирусом, который экспрессировал указанный белок, (iv) инактивирующий агент, или инактивирующий агент, содержащий бинарный этиленимин (BEI), (v) тиосульфат натрия, или тиосульфат натрия в количествах, эквивалентных инактивирующему агенту или BEI; (vi) адъювант, или адъювант, включающий Карбопол или Карбопол 971, и (vii) фосфатную соль в физиологически приемлемой концентрации.

102. Композиция по любому из предыдущих пунктов, содержащая (i) белок, (ii) по меньшей мере часть бакуловируса, экспрессирующего указанный белок, (iii) часть культуры клеток, которые были инфицированы или трансфицированы рекомбинантным бакуловирусом, который экспрессировал указанный белок, (iv) инактивирующий агент, или инактивирующий агент, содержащий бинарный этиленимин (BEI), (v) тиосульфат натрия, или тиосульфат натрия в количествах, эквивалентных инактивирующему агенту или BEI; (vi) адъювант, или адъювант, содержащий Карбопол или Карбопол 971, и (vii) фосфатную соль в физиологически приемлемой концентрации, и где BEI получен из культуры клеток, обработанной примерно от 2 до 8 или примерно 5 мМ BEI для инактивации бакуловируса, и/или композиция содержит примерно от 2 до 8 или примерно 5 мМ BEI, и/или композиция содержит примерно 1 мг Карбопола или Карбопола 971.

103. Композиция по любому из предыдущих пунктов, представляющая собой иммуногенную композицию, содержащую белок по любому из предыдущих пунктов и носитель, разбавитель или наполнитель.

104. Композиция по любому из предыдущих пунктов, представляющая собой иммуногенную композицию, содержащую белок по любому из предыдущих пунктов и носитель, разбавитель или наполнитель, и дополнительный антиген по любому из предыдущих пунктов.

105. Способ получения композиции по любому из предыдущих пунктов, где белок по любому из предыдущих пунктов смешивают с носителем, разбавителем или наполнителем.

106. Способ получения композиции по любому из предыдущих пунктов, где белок по любому из предыдущих пунктов смешивают с носителем, разбавителем или наполнителем, и дополнительным антигеном.

107. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения в качестве лекарственного средства.

108. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения в качестве вакцины.

109. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения в способе индукции иммунного ответа или иммунологического ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа против PCV3 у животного.

110. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения в способе индукции иммунного ответа или иммунологического ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа против PCV3 у свиней.

111. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения в способе индукции иммунного ответа или иммунологического ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа против PCV3 у молодых свиней.

112. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения в способе индукции иммунного ответа или иммунологического ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа против PCV3 у поросят.

113. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения в способе индукции иммунного ответа или иммунологического ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа против PCV3 у поросят; при этом поросята должны получать вскармливание свиноматками, которым вводили белок по любому из предыдущих пунктов или композицию по любому из предыдущих пунктов.

114. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения в способе индукции иммунного ответа или иммунологического ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа против PCV3 у свиноматок.

115. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения в способе индукции иммунного ответа или иммунологического ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа против PCV3 у беременных свиноматок, свиней до первого опороса или подсвинков до осеменения.

116. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения с целью индукции иммунного ответа против PCV3 у животных.

117. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения с целью индукции иммунного ответа против PCV3 у свиней.

118. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения с целью индукции иммунного ответа против PCV3 у молодых свиней.

119. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения с целью индукции иммунного ответа против PCV3 у поросят.

120. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения с целью индукции иммунного ответа против PCV3 у поросят; при этом поросята должны получать вскармливание свиноматками, которым вводили белок по любому из предыдущих пунктов или композицию по любому из предыдущих пунктов.

121. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения с целью индукции иммунного ответа против PCV3 у свиноматок.

122. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения с целью индукции иммунного ответа против PCV3 у беременных свиноматок, свиней до первого опороса или подсвинков до осеменения.

123. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения в способе уменьшения или предотвращения клинических признаков или клинических симптомов, или заболевания, вызванного инфекцией PCV3 у животного, или для применения в способе лечения или профилактики инфекции PCV3 у животного.

124. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения в способе уменьшения или предотвращения клинических признаков или клинических симптомов, или заболевания, вызванного инфекцией PCV3 у животного, или для применения в способе лечения или профилактики инфекции PCV3 у животного, где указанное животное представляет собой свинью.

125. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения в способе уменьшения или предотвращения клинических признаков или клинических симптомов, или заболевания, вызванного инфекцией PCV3 у животного, или для применения в способе лечения или профилактики инфекции PCV3 у животного, где указанное животное представляет собой молодую свинью.

126. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения в способе уменьшения или предотвращения клинических признаков или клинических симптомов, или заболевания, вызванного инфекцией PCV3 у животного, или для применения в способе лечения или профилактики инфекции PCV3 у животного, где указанное животное представляет собой поросенка.

127. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения в способе уменьшения или предотвращения клинических признаков или клинических симптомов, или заболевания, вызванного инфекцией PCV3 у животного, или для применения в способе лечения или профилактики инфекции PCV3 у животного, где указанное животное представляет собой поросенка, и при этом поросенок должен получать вскармливание свиноматкой, которой был введен белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов.

128. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения в способе уменьшения или предотвращения клинических признаков или заболевания, вызванного инфекцией PCV3 у животного, или для применения в способе лечения или профилактики инфекции PCV3 у животного, где указанное животное является свиноматкой.

129. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения в способе уменьшения или предотвращения клинических признаков или клинических симптомов, или заболевания, вызванного инфекцией PCV3 у животного, или для применения в способе лечения или профилактики инфекции PCV3 у животного, где указанное животное представляет собой беременную свиноматку, свинью до первого опороса или подсвинка до осеменения.

130. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения при иммунизации животного против PCV3.

131. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения при иммунизации животного против PCV3, где указанное животное представляет собой свинью.

132. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения при иммунизации животного против PCV3, где указанное животное представляет собой молодую свинью.

133. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения при иммунизации животного против PCV3, где указанное животное представляет собой поросенка.

134. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения при иммунизации животного против PCV3, где указанное животное представляет собой поросенка, и при этом поросенок должен получать вскармливание свиноматкой, которой был введен белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов.

135. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения при иммунизации животного против PCV3, где указанное животное является свиноматкой.

136. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения при иммунизации животного против PCV3, где указанное животное представляет собой беременную свиноматку, свинью до первого опороса или подсвинка до осеменения.

137. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения в способе снижения, элиминации или нейтрализации экспрессии вируса PCV3 у животного.

138. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения в способе снижения, элиминации или нейтрализации экспрессии вируса PCV3 у животного, где указанное животное представляет собой свинью.

139. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения в способе снижения, элиминации или нейтрализации экспрессии вируса PCV3 у животного, где указанное животное представляет собой молодую свинью.

140. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения в способе снижения, элиминации или нейтрализации экспрессии вируса PCV3 у животного, где указанное животное представляет собой поросенка.

141. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения в способе снижения, элиминации или нейтрализации экспрессии вируса PCV3 у животного, где указанное животное представляет собой поросенка, и при этом поросенок должен получать вскармливание свиноматкой, которой был введен белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов.

141. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения в способе снижения, элиминации или нейтрализации экспрессии вируса PCV3 у животного, где указанное животное является свиноматкой.

142. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения в способе снижения, элиминации или нейтрализации экспрессии вируса PCV3 у животного, где указанное животное представляет собой беременную свиноматку, свинью до первого опороса или подсвинка до осеменения.

143. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения с целью индукции выработки антител, специфичных к PCV3, у животного.

144. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения с целью индукции выработки антител, специфичных к PCV3, у животного, где указанное животное представляет собой свинью.

145. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения с целью индукции выработки антител, специфичных к PCV3, у животного, где указанное животное представляет собой молодую свинью.

146. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения с целью индукции выработки антител, специфичных к PCV3, у животного, где указанное животное представляет собой поросенка.

147. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения с целью индукции выработки антител, специфичных к PCV3, у животного, где указанное животное представляет собой поросенка, и при этом поросенок должен получать вскармливание свиноматкой, которой был введен белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов.

148. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения с целью индукции выработки антител, специфичных к PCV3, у животного, где указанное животное представляет собой свиноматку.

149. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения с целью индукции выработки антител, специфичных к PCV3, у животного, где указанное животное представляет собой беременную свиноматку, свинью до первого опороса или подсвинка до осеменения.

150. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где указанный белок по любому из предыдущих пунктов или композицию по любому из предыдущих пунктов вводят указанному животному внутримышечно или интрадермально.

151. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где указанный белок по любому из предыдущих пунктов или композицию по любой из предыдущих пунктов вводят указанному животному в комбинации с другим антигеном, предпочтительно, когда другой патоген является антигеном патогена свиней.

152. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где указанный белок по любому из предыдущих пунктов или композицию по любой из предыдущих пунктов вводят указанному животному вместе с другим антигеном, где указанный другой антиген не является антигеном ORF2 PCV3, предпочтительно, когда другой патоген является антигеном патогена свиней.

153. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где указанный белок по любому из предыдущих пунктов или композицию по любой из предыдущих пунктов вводят указанному животному вместе с другим антигеном, где указанный другой антиген не является антигеном PCV3, предпочтительно, где другой патоген является антигеном патогена свиньи.

154. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где указанное животное представляет собой свиноматку, беременную поросенком.

155. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где указанное животное представляет собой свиноматку, беременную поросенком, и при этом поросенок должен получать вскармливание свиноматкой, которой был введен белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов.

156. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где указанное животное является свиноматкой, и где указанный белок по любому из предыдущих пунктов или композицию по любому из предыдущих пунктов вводят дважды указанной свиноматке.

157. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанное животное является свиноматкой, и где указанный белок по любому из предыдущих пунктов или композицию по любому из предыдущих пунктов вводят указанной свиноматке только дважды.

158. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где указанное животное является поросенком, и где белок по любому из предыдущих пунктов или композицию по любому из предыдущих пунктов вводят один раз указанному поросенку.

159. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где указанное животное является поросенком, и где белок по любому из предыдущих пунктов или композицию по любому из предыдущих пунктов вводят указанному поросенку только один раз.

160. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где указанное животное является свиноматкой, и где белок по любому из предыдущих пунктов или композицию по любому из предыдущих пунктов вводят дважды указанной свиноматке, и где указанное применение не включает введение любого другого антигена PCV3 указанному животному до или во время введения указанного белка по любому из предыдущих пунктов или композиции по любому из предыдущих пунктов.

161. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где указанное животное является свиноматкой, и где белок по любому из предыдущих пунктов или композицию по любому из предыдущих пунктов вводят дважды указанной свиноматке, и где указанное применение не включает введение любого другого антигена PCV3 указанному животному до или во время введения указанного белка по любому из предыдущих пунктов или композиции по любому из предыдущих пунктов.

162. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где указанное животное является свиноматкой, и где белок по любому из предыдущих пунктов или композицию по любому из предыдущих пунктов вводят указанной свиноматке только дважды, и где указанное применение не включает введение любого другого антигена PCV3 указанному животному до или во время введения указанного белка по любому из предыдущих пунктов или композиции по любому из предыдущих пунктов.

163. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где указанное животное является поросенком, и где белок по любому из предыдущих пунктов или композицию по любому из предыдущих пунктов вводят один раз указанному поросенку, и где указанное применение не включает введение любого другого антигена PCV3 указанному животному до или во время введения указанного белка по любому из предыдущих пунктов или композиции по любому из предыдущих пунктов.

164. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где указанное животное представляет собой поросенка, и где белок по любому из предыдущих пунктов или композицию по любому из предыдущих пунктов вводят один раз указанному поросенку, и где указанное применение не включает введение любого другого антигена PCV3 указанному животному до или во время введения указанного белка по любому из предыдущих пунктов или композиции по любому из предыдущих пунктов.

165. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где указанное животное представляет собой поросенка, и где белок по любому из предыдущих пунктов или композицию по любому из предыдущих пунктов вводят указанному поросенку только один раз, и где указанное применение не включает введение любого другого антигена PCV3 указанному животному до или во время введения указанного белка по любому из предыдущих пунктов или композиции по любому из предыдущих пунктов.

166. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где введение животному при использовании состоит из однодозовой, однократной вакцинации или однократного введения одной дозы указанного белка по любому из предыдущих пунктов или композиции по любому из предыдущих пунктов.

167. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где введение животному при использовании состоит из многократной вакцинации или режима многократного введения указанного белка по любому из предыдущих пунктов или композиции по любому из предыдущих пунктов.

168. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где введение животному при использовании состоит из двукратной вакцинации, или двукратного введения дозы указанного белка по любому из предыдущих пунктов или композиции по любому из предыдущих пунктов.

169. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где введение животному осуществляют в течение по меньшей мере 1, 2 или 3 недель воздействия вирулентного цирковируса свиней.

170. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов, где животным является поросенок в возрасте не старше 15 недель, или не старше 6 недель, или не старше 3 недель, или не старше 2 недель, или не старше 1 недели.

171. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где указанный белок по любому из предыдущих пунктов предназначен для применения по любому из предыдущих пунктов.

172. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где указанный белок по любому из предыдущих пунктов предназначен для двух или более использований из предыдущих пунктов.

173. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где указанная композиция по любому из предыдущих пунктов предназначена для применения по любому из предыдущих пунктов.

174. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где второй антиген вводят животному перед введением белка по любому из предыдущих пунктов или композиции по любому из предыдущих пунктов.

175. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где второй антиген вводят животному одновременно с введением белка по любому из предыдущих пунктов или композиции по любому из предыдущих пунктов.

176. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где второй антиген вводят животному одновременно и в той же композиции, что и при введении белка по любому из предыдущих пунктов, или композиции по любому из предыдущих пунктов.

177. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где второй антиген вводят животному одновременно и в другой композиции, чем при введении белка по любому из предыдущих пунктов или композиции по любому из предыдущих пунктов.

178. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения по любому из предыдущих пунктов, где второй антиген вводят животному после введения белка по любому из предыдущих пунктов или композиции по любому из предыдущих пунктов.

179. Белок по любому из предыдущих пунктов в качестве единственного антигена PCV3 для применения при вакцинации молодой свиньи с целью уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи, при этом белок находится в иммуногенной композиции, которую вводят этой молодой свинье в одной дозе.

180. Белок по любому из предыдущих пунктов в качестве единственного антигена PCV3 для применения при вакцинации молодой свиньи с целью уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи, при этом белок является иммуногенной композицией, которую вводят этой молодой свинье только в одной дозе.

181. Белок по любому из предыдущих пунктов в качестве единственного антигена PCV3 для применения при вакцинации молодой свиньи с целью уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи, где белок находится в иммуногенной композиции, которую вводят этой молодой свинье в двух дозах.

182. Белок по любому из предыдущих пунктов в качестве единственного антигена PCV3 для применения при вакцинации молодой свиньи с целью уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи, при этом белок находится в иммуногенной композиции, которую вводят этой молодой свинье только в двух дозах.

183. Белок по любому из предыдущих пунктов для применения в качестве единственного антигена PCV3 для вакцинации молодой свиньи с целью уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи, при этом белок находится в иммуногенной композиции, которую вводят этой молодой свинье в одной дозе.

184. Белок по любому из предыдущих пунктов для применения в качестве единственного антигена PCV3 для вакцинации молодой свиньи с целью уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи, при этом белок находится в иммуногенной композиции, которую вводят этой молодой свинье только в одной дозе.

185. Белок по любому из предыдущих пунктов для применения в качестве единственного антигена PCV3 для вакцинации молодой свиньи с целью уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи, при этом белок находится в иммуногенной композиции, которую вводят этой молодой свинье в двух дозах.

186. Белок по любому из предыдущих пунктов для применения в качестве единственного антигена PCV3 для вакцинации молодой свиньи с целью уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи, при этом белок находится в иммуногенной композиции, которую вводят этой молодой свинье только в двух дозах.

187. Иммуногенная композиция по любому из предыдущих пунктов для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где одну дозу иммуногенной композиции вводят этой молодой свинье в способе вакцинации для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где введение одной дозы иммуногенной композиции молодой свинье в способе вакцинации снижает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где белок по любому из предыдущих пунктов представляет собой антигенный компонент в одной дозе иммуногенной композиции в способе вакцинации, который уменьшает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

предпочтительно белок присутствует в количестве по меньшей мере 2 мкг в одной дозе иммуногенной композиции;

где белок представляет собой антигенный компонент в способе вакцинации, который снижает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи.

188. Иммуногенная композиция по любому из предыдущих пунктов для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где только одну дозу иммуногенной композиции вводят этой молодой свинье в способе вакцинации для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где введение одной дозы иммуногенной композиции молодой свинье в способе вакцинации снижает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где белок по любому из предыдущих пунктов представляет собой антигенный компонент в одной дозе иммуногенной композиции в способе вакцинации, который уменьшает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

предпочтительно белок присутствует в количестве по меньшей мере 2 мкг в одной дозе иммуногенной композиции;

где белок представляет собой антигенный компонент в способе вакцинации, который снижает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи.

189. Иммуногенная композиция по любому из предыдущих пунктов для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где две дозы иммуногенной композиции вводят этой молодой свинье в способе вакцинации для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где введение двух доз иммуногенной композиции молодой свинье в способе вакцинации снижает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где белок по любому из предыдущих пунктов представляет собой антигенный компонент в двух дозах иммуногенной композиции в способе вакцинации, который снижает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

предпочтительно белок присутствует в количестве по меньшей мере 2 мкг в одной дозе иммуногенной композиции;

где белок представляет собой антигенный компонент в способе вакцинации, который снижает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи.

190. Иммуногенная композиция по любому из предыдущих пунктов для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где только две дозы иммуногенной композиции вводят этой молодой свинье способом вакцинации для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где введение двух доз иммуногенной композиции молодой свинье в способе вакцинации снижает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где белок по любому из предыдущих пунктов представляет собой антигенный компонент в двух дозах иммуногенной композиции в способе вакцинации, который уменьшает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

предпочтительно белок присутствует в количестве по меньшей мере 2 мкг в одной дозе иммуногенной композиции;

где белок представляет собой антигенный компонент в способе вакцинации, который снижает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи.

191. Применение по любому из предыдущих пунктов, где указанные клинические признаки или симптомы выбраны из группы, состоящей из снижения среднесуточного привеса и смертности.

192. Применение по любому из предыдущих пунктов, где указанные клинические признаки или симптомы выбраны из группы, состоящей из макроскопических повреждений, гистологических нарушений, репликации PCV3 в ткани и виремии PCV3.

193. Применение по любому из предыдущих пунктов, где указанные клинические признаки или симптомы выбраны из группы, состоящей из развития или рождения мумифицированного, мертворожденного и/или слабого плода.

194. Применение по любому из предыдущих пунктов, где указанные клинические признаки или симптомы представляют собой или включают выталкивание мумифицированного, мертворожденного и/или слабого плода.

Набор пунктов E - Настоящее изобретение теперь будет описано посредством следующего набора пронумерованных пунктов (Набора пунктов E). Раскрытие в этом наборе пунктов в равной степени применимо к настоящему изобретению. Подобным образом раскрытие в этом наборе пунктов в равной степени применимо к каждому из других наборов пунктов.

1. Антигенный белок цирковируса свиней 3 типа (PCV3), являющийся функциональным антигенным вариантом белка ORF2 PCV3.

2. Белок по п.1, где указанный белок ORF2 PCV3 представляет собой белок, кодируемый SEQ ID No.1.

3. Белок по пп.1 или 2, который содержит замены и/или удлинения ORF2 PCV3.

4. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант способен давать более высокий выход вирусоподобных частиц (VLP), чем белок, кодируемый SEQ ID No.1.

5. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант имеет одну или несколько замен в петле FG белка, кодируемого SEQ ID No.1.

6. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант имеет одну или несколько замен в петле FG белка, кодируемого SEQ ID No.1, где эти замены включают замены одного или нескольких из остатка S, и/или остатков K и/или остатка H мотива SKKKH петли FG белка, кодируемого SEQ ID No.1.

7. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант имеет С-концевую часть, которая выходит за пределы концевой последовательности SVL белка, кодируемого SEQ ID No.1.

8. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант имеет С-концевую часть, которая выходит за пределы концевой последовательности SVL белка, кодируемого SEQ ID No.1, где указанное удлинение составляет от 1 до 30 аминокислот, и где указанное удлинение включает всю часть последовательности VKININLTPPVATSRVPSRALPLRFGCGHR.

9. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный антигенный вариант кодируется полностью или частично SEQ ID No. 1, 2, 5, 6 или 7.

10. Белок по любому из предыдущих пунктов, где указанный функциональный вариант белка антигена содержит или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 3 , 4, 8, 9 или 10.

11. Нуклеотидная последовательность, кодирующая белок по любому из предыдущих пунктов.

12. Хозяин бакуловирусной экспрессии, трансформированный или трансфицированный нуклеотидной последовательностью по п.11.

13. Способ получения белка по любому из пп.1-10, включающий культивирование хозяина для бакуловирусной экспрессии по п.12, чтобы вызвать экспрессию белка.

14. Композиция, содержащая белок по любому из пп.1-10 и носитель, разбавитель или наполнитель.

15. Композиция по п.14, содержащая иммуномодулирующий агент.

16. Белок по любому из пп.1-10 или композиция по любому из пп.14-15 для применения в качестве вакцины.

17. Белок по любому из пп.1-10 или композиция по любому из пп.14-15 для применения в способе индукции иммунного ответа или иммунологического ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа против PCV3 у свиней.

18. Белок по любому из пп.1-10 или композиция по любому из пп.14-15 для применения в способе лечения или профилактики инфекции PCV3 у животного, где указанное животное является свиньей.

19. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения при иммунизации животного против PCV3, где указанное животное является свиньей.

20. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения в способе снижения, элиминации или нейтрализации экспрессии вируса PCV3 у животного, где указанное животное является свиньей.

21. Белок по любому из предыдущих пунктов или композиция по любому из предыдущих пунктов для применения с целью индукции выработки антител, специфичных к PCV3, у животного.

22. Белок по любому из пп.1-10 или композиция по любому из пп.14-15 для применения в способе уменьшения или предотвращения клинических признаков, или клинических симптомов или заболевания, вызванного инфекцией PCV3 у животного, где указанное животное является свиньей.

23. Белок или композиция для применения по п.22, где указанные клинические признаки или симптомы выбраны из группы, состоящей из снижения среднесуточного привеса, смертности, макроскопических повреждений, гистологических нарушений, репликации PCV3 в ткани, виремии PCV3, развития или рождения мумифицированного, мертворожденного и/или слабого плода, выталкивания мумифицированного, мертворожденного и/или слабого плода.

24. Белок или композиция для применения по любому из пп.16-23, где введение животному при применении состоит из единственного, однократного введения или единственного, однократного введения одной дозы указанного белка или указанной композиции.

25. Белок или композиция для применения по любому из пп.16-23, где введение животному при применении состоит из двукратного введения, или двудозового введения указанного белка или указанной композиции по любому из предыдущих пунктов.

26. Белок или композиция для применения по любому из пп.16-25, где указанный белок или указанную композицию вводят указанному животному внутримышечно или интрадермально.

27. Антигенный белок цирковируса свиней 3 типа (PCV3) для применения в качестве единственного антигена PCV3 для применения при вакцинации свиньи и/или для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой свиньи, где белок находится в иммуногенной композиции, которую вводят свиньям только в одной дозе, где указанный антигенный белок представляет собой белок ORF2 PCV3 или его функциональный антигенный вариант, предпочтительно, где указанный функциональный антигенный вариант его представляет собой белок по любому из пп.1-10; предпочтительно, где указанная свинья является поросенком, предпочтительно, где указанный поросенок имеет возраст не старше 15 недель.

28. Антигенный белок цирковируса свиней 3 типа (PCV3) для применения в качестве единственного антигена PCV3 для применения при вакцинации свиньи и/или для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой свиньи, при этом белок находится в иммуногенной композиции, которую вводят свиньям только в двух дозах, где указанный антигенный белок представляет собой белок ORF2 PCV3 или его функциональный антигенный вариант, предпочтительно, где указанный функциональный антигенный вариант представляет собой белок по любому из пп.1-10; предпочтительно, где указанная свинья представляет собой свиноматку или подсвинка до осеменения.

29. Иммуногенная композиция для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у молодой свиньи;

где только одну дозу иммуногенной композиции вводят этой молодой свинье способом вакцинации для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где введение одной дозы иммуногенной композиции молодой свинье в способе вакцинации снижает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где белок представляет собой антигенный компонент в одной дозе иммуногенной композиции в способе вакцинации, который уменьшает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где белок представляет собой антигенный компонент в способе вакцинации, который уменьшает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где указанный белок представляет собой антигенный белок цирковируса свиней 3 типа (PCV3);

где указанный антигенный белок представляет собой белок ORF2 PCV3 или его функциональный антигенный вариант;

предпочтительно, где его функциональный антигенный вариант представляет собой белок по любому из пп.1-10.

30. Иммуногенная композиция для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у молодой свиньи;

где только одну дозу иммуногенной композиции вводят этой молодой свинье способом вакцинации для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где введение одной дозы иммуногенной композиции молодой свинье в способе вакцинации снижает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где белок представляет собой антигенный компонент в одной дозе иммуногенной композиции в способе вакцинации, который уменьшает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где белок представляет собой антигенный компонент в способе вакцинации, который уменьшает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

при этом молодая свинья является поросенком, предпочтительно, где указанный поросенок имеет возраст не старше 15 недель;

где указанный белок представляет собой антигенный белок цирковируса свиней 3 типа (PCV3);

где указанный антигенный белок представляет собой белок ORF2 PCV3 или его функциональный антигенный вариант;

предпочтительно, где его функциональный антигенный вариант представляет собой белок по любому из пп.1-10.

31. Иммуногенная композиция для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у молодой свиньи;

где только две дозы иммуногенной композиции вводят этой молодой свинье способом вакцинации для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где введение двух доз иммуногенной композиции молодой свинье в способе вакцинации уменьшает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где белок представляет собой антигенный компонент в двух дозах иммуногенной композиции в способе вакцинации, который снижает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где белок представляет собой антигенный компонент в способе вакцинации, который уменьшает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где указанный белок представляет собой антигенный белок цирковируса свиней 3 типа (PCV3);

где указанный антигенный белок представляет собой белок ORF2 PCV3 или его функциональный антигенный вариант;

предпочтительно, где его функциональный антигенный вариант представляет собой белок по любому из пп.1-10.

32. Иммуногенная композиция для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, вызванных инфекцией PCV3 у молодой свиньи;

где только две дозы иммуногенной композиции вводят этой молодой свинье способом вакцинации для уменьшения тяжести клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где введение двух доз иммуногенной композиции молодой свинье в способе вакцинации уменьшает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где белок представляет собой антигенный компонент в двух дозах иммуногенной композиции в способе вакцинации, который уменьшает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где белок представляет собой антигенный компонент в способе вакцинации, который уменьшает тяжесть клинических признаков или клинических симптомов, возникающих в результате инфекции PCV3 у этой молодой свиньи;

где свинья представляет собой свиноматку или подсвинка до осеменения;

где указанный белок представляет собой антигенный белок цирковируса свиней 3 типа (PCV3);

где указанный антигенный белок представляет собой белок ORF2 PCV3 или его функциональный антигенный вариант;

предпочтительно, где его функциональный антигенный вариант представляет собой белок по любому из пп.1-10.

33. Иммуногенная композиция для применения по любому из пп.29-32, где указанные клинические признаки или симптомы выбраны из группы, состоящей из снижения среднесуточного привеса, смертности, макроскопических повреждений, гистологических нарушений, репликации PCV3 в ткани, виремии PCV3, развития или рождения мумифицированного, мертворожденного и/или слабого плода, выталкивания мумифицированного, мертворожденного и/или слабого плода.

34. Иммуногенная композиция для применения по любому из пп.29-33, где указанный белок или указанную композицию вводят указанному животному внутримышечно или интрадермально.

При практическом применении любого из вариантов осуществления изобретения, белков PCV3 по изобретению, обсуждаемых по всему описанию, изобретение охватывает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие белки PCV3 по изобретению, векторы, такие как бакуловирусные векторы (см. EP 2 460 821 А2, включенный сюда посредством ссылки, вместе с документами, цитируемыми в нем в отношении способов и материалов для экспрессии капсидного белка ORF2 PCV2 с помощью системы экспрессии на основе бакуловируса, можно использовать в практике настоящего изобретения для экспрессии капсидного белка ORF2 PCV3, включая такой белок ORF2 дикого типа PCV3 или мутантный капсидный белок, как описано в настоящей заявке, а также один или несколько белков одного или нескольких патогенов свиней, если необходимо, для включения их в композицию по настоящему изобретению), содержащие такие молекулы нуклеиновой кислоты, и способы для продукции или экспрессии таких мутантных белков PCV3 по изобретению, такие как инфицирование или трансфекция соответствующих клеток вектором (например, если вектор представляет собой бакуловирус, соответствующей клеткой может быть клетка насекомого, или Sf-клетка, или Sf+-клетка; см. EP 2460821 A2, включенный в настоящий документ посредством ссылки, вместе с документами, указанными в нем). Предпочтительно извлекать или изолировать белок после экспрессии или продукции, например, путем отделения твердых веществ и сохранения жидкой части или надосадочной жидкости, которая содержит растворимый белок (например, VLP), и фильтрации надосадочной жидкости. Надосадочную жидкость, содержащую растворимый белок (например, VLP), инактивируют, предпочтительно с помощью BEI, такого как примерно от 2 до 8 или примерно 5 мМ BEI, для инактивации бакуловируса. К композиции также добавляют адъювант, предпочтительно примерно 1 мг или примерно 20 об.% Карбопола или Карбопола 971. Дозировку примерно 2, 4, 8 или 16 мкг композиции в составе примерно 1 мл или примерно 2 мл в однократной или многократной дозе вводят этой молодой свинье или поросенку в возрасте не старше 15 недель, или не старше 6 недель, или не старше 3 недель, или не старше 2 недель, или не старше 1 недели.

Настоящее изобретение будет дополнительно проиллюстрировано в следующих примерах, которые даны только для целей иллюстрации и не предназначены для ограничения раскрытия каким-либо образом. Способы молекулярного клонирования (такие, как конструирование вставок ДНК, плазмид и рекомбинантных вирусных или растительных векторов, но не ограничиваясь этим) выполняли с использованием стандартных способов молекулярной биологии, описанных J. Sambrook et. al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989), и в патенте США № 8,865,183, описание которого включено посредством ссылки.

Хотя настоящее изобретение и его преимущества были подробно описаны, следует понимать, что в нем могут быть выполнены различные изменения, замены и варианты, не выходящие за рамки сущности и объема изобретения, как определено в прилагаемой формуле изобретения.

Настоящее изобретение будет дополнительно проиллюстрировано в следующих примерах, которые приведены только для целей иллюстрации и никоим образом не предназначены для ограничения изобретения.

Примеры

В представленных здесь примерах первичные данные были включены в дополнение к сводным таблицам, которые анализируют эти первичные данные. Как и в случае любых полевых испытаний, результаты не совсем одинаковы для каждого животного, и, кроме того, может быть один или несколько аномальных результатов. Однако следует понимать, что сводные таблицы представляют собой анализ первичных данных. Результаты анализа показывают эффективность настоящего изобретения.

Пример 1

Идентификация и клонирование ORF2 PCV3, а также получение и очистка ORF2 BaculoG/PCV3

Кодирующая последовательность ORF2 PCV3 (SEQ ID NO:1) была клонирована с помощью ПЦР из синтетического гена, содержащего последовательность ORF2 KT869077 (см. Fan et al., “Complete Genome Sequence of a Novel Porcine Circovirus Type 3 Strain, PCV3/CN/Hubei-618/2016, Isolated from China», Genome Announc 2017 Apr 5(15) e00100-17, Apr 13. doi: 10.1128/genomeA.00100-17, включенный в настоящее описание посредством ссылки) и встроена в плазмиду для переноса бакуловирусом pVL1393 (Invitrogen) с использованием сайтов рестрикции 5' BamHI и 3' NotI. Рестрикционный фрагмент BamHI/NotI также содержал консенсусную последовательность Козака (GCCACC) непосредственно между сайтом 5’ BamHI и стартовым кодоном ORF2 PCV3. Рекомбинантный бакуловирус, содержащий кодирующую последовательность ORF2 PCV3 под контролем полиэдринового промотора, был получен путем котрансфекции клеток насекомых Sf9 (Spodoptera frugiperda) линеаризованной ДНК бакуловируса и переноса плазмиды pVL1393-PCV3 ORF2. Полученный рекомбинантный бакуловирус, BaculoG/PCV3 ORF2, был амплифицирован в клетках насекомых Sf9 и затем очищен путем клонирования с лимитирующими разведениями. При этом делается отсылка на применение способа из EP 2460821 A2, включенного в настоящую заявку посредством ссылки, вместе с документами, цитируемыми в нем, с кодирующей последовательностью для белка ORF2 PCV3, как описано в настоящей заявке (включая то, что вышеупомянутые способы используются для получения любого мутанта, варианта или модифицированного белка ORF2 PCV3, особенно SEQ ID NO: 3, 4, 8, 9 или 10).

Кодирующую последовательность ORF2 PCV3 (SEQ ID NO:1) клонировали с помощью ПЦР из синтетического гена, содержащего последовательность ORF2 KT869077, и встраивали в бакуловирусную плазмиду для переноса VL1393, используя сайты рестрикции 5’ BamHI и 3’ NotI. Рестрикционный фрагмент BamHI/NotI также содержал консенсусную последовательность Козака (GCCACC) непосредственно между сайтом 5’ BamHI и стартовым кодоном ORF2 PCV3. Рекомбинантный бакуловирус, содержащий кодирующую последовательность ORF2 PCV3 под контролем полиэдринового промотора, был получен путем совместной трансфекции клеток насекомых Sf9 (Spodoptera frugiperda) линеаризованной ДНК бакуловируса и переноса плазмиды pVL1393-PCV3 ORF2. Полученный рекомбинантный бакуловирус, BaculoG/PCV3 ORF2, был амплифицирован в клетках насекомых Sf9 и впоследствии очищен путем клонирования с лимитирующими разведениями.

Примеры 1А, 1В, 1С

Идентификация и клонирование ORF2 PCV3 и его мутантов или вариантов (мутации петли FG, мутации петли FG и удлинение или добавление к C-концу), получение и очистка ORF2 BaculoG/PCV3 и их мутантов или вариантов (мутации петли FG, мутации петли FG и удлинение или добавление к С-концу), и его применение

Пример 1A: Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок ORF2 PCV3 SEQ ID NO: 4, была клонирована в вектор, бакуловирусный вектор (см. пример 1, см. также EP 2460821 A2, включенный в настоящую заявку посредством ссылки вместе с документами, цитируемыми в нем, в отношении способов и материалов для экспрессии капсидного белка ORF2 PCV2 с помощью системы экспрессии на основе бакуловируса) (при необходимости включения в композицию по изобретению один или несколько белков одного или нескольких патогенов свиней также могут быть экспрессированы с использованием векторной системы, такой как бакуловирусная система, или может быть включен инактивированный патоген, такой как инактивированный вирус, например PRRSV или бактерин, или надосадочная жидкость бактериальной культуры). Клетки инфицировали или трансфицировали вектором, бакуловирусным вектором (см. пример 1, пример 2, см. EP 2460821 A2, включенный в настоящую заявку посредством ссылки вместе с документами, цитируемыми в нем; клетки SF+ (Spodoptera frugiperda), инфицировали или трансфицировали с примерной MOI (множественностью заражения), равной 0,076, рекомбинантным бакуловирусом, содержащим кодирующую ORF2 гена 2 цирковируса 3 свиньи под контролем полиэдринового промотора бакуловируса).

После экспрессии или продукции белка его собирали или выделяли, например, разделяя твердые вещества и сохраняя жидкую часть или надосадочную жидкость, содержащую растворимый белок (например, VLP), и фильтруя надосадочную жидкость. Надосадочную жидкость, содержащую растворимый белок (например, VLP), инактивируют, предпочтительно с помощью BEI, такого как примерно от 2 до 8 или примерно 5 мМ BEI, для инактивации бакуловируса. Для приготовления композиции также добавляют адъювант, предпочтительно примерно 1 мг или примерно 20 об.% Карбопола или Карбопола 971. (См., например, пример 2; колбу инкубируют при 28°C ± 2°C при постоянном перемешивании примерно при 100 об./мин в течение семи дней. Клетки и среду в асептических условиях переносят в 2 центрифужных флакона по 1 л, и клетки осаждают при 15000 g в течение 20 минут при 4°C. Полученную надосадочную жидкость фильтруют через фильтр с размером пор 0,2 мкм и хранят при 4°C, инактивированный антиген ORF2 бакуловируса PCV3, 800 мл; адъювант Карбопол 971P (0,5% исходный раствор), 200 мл; всего 1000 мл или 1 л).

Однократную дозу (т.е. введение с помощью однократного введения или одного введения) композиции, содержащей 2 мкг, 4 мкг, 8 мкг или 16 мкг антигена ORF2 PCV3 в общем объеме 1 мл или примерно 2 мл, вводят группам свиней (например, 6 свиней в группе). Группа молодых свиней или поросят возрастом не старше 15 недель. Группа молодых свиней или поросят возрастом не старше 6 недель. Группа молодых свиней или поросят возрастом не старше 3 недель. Группа молодых свиней или поросят возрастом не старше 2 недель. Группа молодых свиней или поросят возрастом не старше 1 недели. Группа молодых свиней в качестве свиноматок, до осеменения. Применение, например, по времени, однократной дозы является одним из нижеупомянутых введений схемы многократной дозы, обсуждаемой непосредственно ниже. При однократном введении каждая из групп молодых свиней демонстрирует иммунитет, например, защитный иммунитет, против PCV3 и/или клинических признаков или симптомов, и/или снижение, или уменьшение, или предотвращение PCV3 или заболеваемости и/или клинических признаков или симптомов инфекции.

Режим множественного дозирования, то есть двукратного введения или введения двух единичных введений (например, первичная и вторичная иммунизация) с интервалом не менее недели композиции, содержащей 2 мкг, 4 мкг, 8 мкг или 16 мкг антигена ORF2 PCV3 в общем объеме 1 мл или примерно 2 мл применяют у групп свиней (например, 6 свиней на группу). Группа молодых свиней или поросят не старше 15-недельного возраста (первое введение в возрасте 2 или 3 недели и второе введение в возрасте 3 или 4 недели). Группа молодых свиней или поросят не старше 6-недельного возраста (первое введение в возрасте 2 или 3 недели и второе введение в возрасте 3, 4 или 5 недель). Группа молодых свиней или поросят в возрасте не старше 3 недель (первое введение в возрасте от 7 до 14 дней, второе введение в возрасте от 14 до 21 дня). Группа молодых свиней или поросят в возрасте не старше 2 недель (первое введение в возрасте 1 недели и второе введение в возрасте 2 недель). Группа молодых свиней или поросят в возрасте не старше 1 недели (введение в 3, 4 и 7 дни). Группа молодых свиней, представляющих собой свиноматок перед осеменением (первое введение между 4 и 6 неделями до осеменения и второе введение между 2 и 4 неделями до осеменения). При многократном введении каждая из групп молодых свиней демонстрирует иммунитет, например, защитный иммунитет, против PCV3 и/или его клинических признаков или симптомов, и/или снижение, или ослабление, или предотвращение инфекции PCV3, или частоты и/или клинических признаков или симптомов инфекции.

Пример 1B: Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок ORF2 PCV3 с SEQ ID NO: 8 (4 мутации в петле FG; петля FG белка ORF2 PCV3 заменена на петлю PCV2 (SKKK → QPFS), была клонирована в вектор, бакуловирусный вектор (см. пример 1, см. также ЕР 2460821 А2, включенный здесь посредством ссылки, вместе с документами, цитируемыми в нем в отношении способов и материалов для экспрессии мутантного капсидного белка ORF2 PCV2 через бакуловирусную систему экспрессии) (при необходимости для включения их в композицию по изобретению, один или несколько белков одного или нескольких патогенов свиней также могут быть экспрессированы с использованием векторной системы, такой как бакуловирусная система, или могут быть инактивированным патогеном, таким как инактивированный вирус, например PRRSV или бактерин, или надосадочная жидкость бактериальной культуры). Клетки инфицированы или трансфицированы вектором, бакуловирусным вектором (см. пример 1, пример 2, см. EP 2460821 A2, включенный в настоящий документ посредством ссылки вместе с документами, цитируемыми в нем; SF+ (Spodoptera frugiperda) клетки инфицированы или трансфицированы с приблизительной MOI, равной 0,076, рекомбинантным бакуловирусом, содержащим кодирующий мутантный ген ORF2 свиного цирковируса 3 под контролем бакуловирусного полиэдринового промотора).

После экспрессии или продукции мутантного белка мутантный белок извлекают или выделяют, например, разделяя твердые вещества и сохраняя жидкую часть или надосадочную жидкость, которая содержит растворимый мутантный белок (например, VLP), и фильтруя надосадочную жидкость. Надосадочную жидкость, содержащую растворимый мутантный белок (например, VLP), инактивируют, предпочтительно с помощью BEI, такого как примерно от 2 до 8 или примерно 5 мМ BEI, для инактивации бакуловируса. Для приготовления композиции также добавляют адъювант, предпочтительно примерно 1 мг или примерно 20 об.% Карбопола или Карбопола 971. (См., например, пример 2, колбу инкубируют при 28°C±2°C при постоянном перемешивании примерно при 100 об./мин в течение семи дней. Клетки и среду в асептических условиях переносят в 2 центрифужных флакона по 1 л, и клетки осаждают при 15000 g в течение 20 минут при 4°C. Полученную надосадочную жидкость фильтруют 0,2 мкм и хранят при 4°C, инактивированный бакуловирус, мутантный антиген ORF2 PCV3, 800 мл; Карбопол 971P (0,5% исходный раствор) адъювант, 200 мл; всего 1000 мл или 1 л). Количество VLP (растворимый мутантный белок ORF2 PCV3), полученное с мутантом, превышает количество VLP, полученного из нативной последовательности SEQ ID NO: 4.

Единичную дозу (т.е. при однократной вакцинации или однократном введении) композиции, содержащей 2 мкг, 4 мкг, 8 мкг или 16 мкг мутантного антигена ORF2 PCV3 в общем объеме 1 мл или около 2 мл, вводят группам свиней (например, 6 свиней на группу). Группа молодых свиней или поросят в возрасте не старше 15 недель. Группа молодых свиней или поросят в возрасте не старше 6 недель. Группа молодых свиней или поросят в возрасте не старше 3 недель. Группа молодых свиней или поросят в возрасте не старше 2 недель. Группа молодых свиней или поросят в возрасте не старше 1 недели. Группа молодых свиней, представляющих собой свиноматок, до осеменения. Введение, например, по времени, однократной дозы является одним из нижеупомянутых введений схемы многократной дозы, обсуждаемой непосредственно ниже. При однократном введении каждая из групп молодых свиней демонстрирует иммунитет, например, защитный иммунитет, против PCV3 и/или его клинических признаков или симптомов, и/или снижение, или уменьшение, или предотвращение инфекции PCV3 или ее частоты, и/или клинических признаков или симптомов.

Режим множественного дозирования, то есть двукратной вакцинации или два однократных введения (например, первичная и вторичная иммунизация) с интервалом не менее недели композиции, содержащей 2 мкг, 4 мкг, 8 мкг или 16 мкг мутантного антигена ORF2 PCV3 в общем объеме 1 мл или около 2 мл применяют к группам молодых свиней (например, 6 свиней в группе). Группа молодых свиней или поросят в возрасте не старше 15-недель (первое введение в возрасте 2 или 3 недель и второе введение в возрасте 3 или 4 недель). Группа молодых свиней или поросят в возрасте не старше 6-недель (первое введение в возрасте 2 или 3 недель и второе введение в возрасте 3, 4 или 5 недель). Группа молодых свиней или поросят в возрасте не старше 3 недель (первое введение в возрасте от 7 до 14 дней, второе введение в возрасте от 14 до 21 дня). Группа молодых свиней или поросят возрастом не старше 2 недель (первое введение в возрасте 1 недели и второе введение в возрасте 2 недель). Группа молодых свиней или поросят в возрасте не старше 1 недели (введение в 3, 4 и 7 дни). Группа молодых свиней, представляющих собой свиноматок до осеменения (первое введение между 4 и 6 неделями до осеменения и второе введение между 2 и 4 неделями до осеменения). При многократном введении каждая из групп молодых свиней демонстрирует иммунитет, например, защитный иммунитет, против PCV3 и/или его клинических признаков или симптомов, и/или снижение, или ослабление, или предотвращение инфекции PCV3 или ее частоты и/или ее клинических признаков или симптомов.

Пример 1C: Каждая из молекул нуклеиновой кислоты, кодирующие (а) мутантный белок ORF2 PCV3, имеющий 4 мутации в FG-петле; петля FG белка ORF2 PCV3 заменена петлей PCV2 (SKKK → QPFS) и удлинением С-конца на 30 аминокислот путем удаления стоп-кодона в природной кодирующей последовательности С-конца ORF2 PCV3 с тем, условием, что при удалении стоп-кодона, т.е. после «SVL» на С-конце природного белка ORF2 PCV3, добавляют: VKININLTPPVATSRVPSRALPLRFGCGHR, см. SEQ ID NO: 8 и 9, и (b) мутантный белок ORF2 PCV3, имеющий С-концевое удлинение на 30 аминокислот за счет удаления стоп-кодона в кодирующей последовательности С-конца природной ORF2 PCV3 с тем условием, что при удалении стоп-кодона, то есть после «SVL» на С-конце природного белка ORF2 PCV3, добавляют: VKININLTPPVATSRVPSRALPLRFGCGHR, см. SEQ ID NO: 9, была клонирована в вектор, бакуловирусный вектор (см. пример 1, см. также EP 2460821 A2, включенный в настоящую заявку посредством ссылки вместе с документами, цитируемыми в нем в отношении способов и материалов для экспрессии мутантных капсидных белков ORF2 PCV2 посредством бакуловирусной системы экспрессии) (при необходимости для их включения в композицию по изобретению, один или несколько белков одного или нескольких патогенов свиней также могут быть экспрессированы с использованием векторной системы, такой как бакуловирусная система, или может быть инактивированный патоген, такой как инактивированный вирус, например PRRSV или бактерин, или надосадочная жидкость бактериальной культуры). Клетки инфицируют или трансфицируют векторами, кодирующими (а) или (b), бакуловирусными векторами, кодирующими (а) или (b) (см. пример 1, пример 2, см. ЕР 2460821 А2, включенный в настоящую заявку посредством ссылки вместе с документами, цитируемые в нем; клетки SF+ (Spodoptera frugiperda) инфицируют или трансфицируют с приблизительной MOI 0,076 рекомбинантным бакуловирусом, содержащим кодирующий мутантный ген 2 ORF2 свиного цирковируса 3 под контролем бакуловирусного полиэдринового промотора).

После экспрессии или продукции мутантных белков (а) или (b), каждый из мутантных белков извлекают или выделяют, например, путем разделения твердых веществ и выделения жидкой части или надосадочной жидкости, содержащей растворимый мутантный белок (например, VLP), и фильтрации надосадочной жидкости. Надосадочную жидкость, содержащую растворимый мутантный белок (например, VLP), инактивируют, предпочтительно с помощью BEI, такого как примерно от 2 до 8 или примерно 5 мМ BEI, для инактивации бакуловируса. Для приготовления композиции также добавляют адъювант, предпочтительно примерно 1 мг или примерно 20 об.% Карбопола или Карбопола 971. (См., например, пример 2; колбу инкубируют при 28°C±2°C при постоянном перемешивании примерно при 100 об./мин в течение семи дней. Клетки и среду в асептических условиях переносят в 2 центрифужных флакона по 1 л, и клетки осаждают при 15000 g в течение 20 минут при 4°C. Полученную надосадочную жидкость фильтруют через фильтр с размером пор 0,2 мкм и хранят при 4°C, инактивированный бакуловирусный мутантный антиген ORF2 PCV3, 800 мл; Карбопол 971P (0,5% исходный раствор) адъювант, 200 мл; всего 1000 мл или 1 л). Количество VLP (растворимых мутантных белков ORF2 PCV3), полученных с каждым мутантом, больше, чем количество VLP, полученных из нативной последовательности SEQ ID NO:4. Количество VLP (растворимый мутантный белок ORF2 PCV3), полученных из мутанта, имеющего как мутацию FG петли, так и удлинение, (мутант (b)) может быть больше, чем количество VLP, полученных только из мутанта или варианта только по FG петле или только по удлинению.

Единичную дозу (т.е. введение путем однократного введения или однократное введение) композиции, содержащей 2 мкг, 4 мкг, 8 мкг или 16 мкг мутантного антигена ORF2 PCV3 (а) или (b) в общем объеме 1 мл или примерно 2 мл, вводят группам свиней (например, по 6 молодых свиней в группе). Группа молодых свиней или поросят в возрасте не старше 15 недель. Группа молодых свиней или поросят в возрасте не старше 6 недель. Группа молодых свиней или поросят в возрасте не старше 3 недель. Группа молодых свиней или поросят в возрасте не старше 2 недель. Группа молодых свиней или поросят в возрасте не старше 1 недели. Группа молодых свиней, представляющих собой свиноматок до осеменения. Введение, например, по времени, однократной дозы является одним из нижеперечисленных введений из режима многократного дозирования, обсуждаемого непосредственно ниже. При однократном введении каждой из доз (а) или (b) каждая из групп молодых свиней демонстрирует иммунитет, например, защитный иммунитет против PCV3 и/или его клинических признаков или симптомов, и/или снижение, или ослабление, или предотвращение инфекции PCV3, или ее частоты и/или ее клинических признаков или симптомов.

Режим множественного дозирования композиции, содержащей 2 мкг, 4 мкг, 8 мкг или 16 мкг мутантного антигена ORF2 PCV3 (а) или (b) в общем объеме 1 мл или примерно 2 мл то есть, двукратного введения или двух однократных введений (например, первичной иммунизации и вторичной иммунизации одним и тем же мутантом, т.е. первичную и вторичную иммунизацию осуществляют либо обоими (а), либо обоими (b), и первичную и вторичную иммунизацию осуществляют в той же дозировке), при котором между введениями имеется перерыв в одну неделю, применяют к группам молодых свиней (например, по 6 молодых свиней в группе). Группа молодых свиней или поросят в возрасте не старше 15 недель (первое введение в возрасте 2 или 3 недель и второе введение в возрасте 3 или 4 недель). Группа молодых свиней или поросят в возрасте не старше 6 недель (первое введение в возрасте 2 или 3 недель и второе введение в возрасте 3, 4 или 5 недель). Группа молодых свиней или поросят в возрасте не старше 3 недель (первое введение в возрасте от 7 до 14 дней, второе введение в возрасте от 14 до 21 дня). Группа молодых свиней или поросят в возрасте не старше 2 недель (первое введение в возрасте 1 недели и второе введение в возрасте 2 недель). Группа молодых свиней или поросят в возрасте не старше 1 недели (введение в 3, 4 и 7 дни). Группа молодых свиней, представляющих собой свиноматок перед осеменением (первое введение между 4 и 6 неделями до осеменения и второе введение между 2 и 4 неделями до осеменения). В результате многократного введения или (а), или (b) каждая из групп свиней демонстрирует иммунитет, например, защитный иммунитет, против PCV3 и/или его клинических признаки или симптомов, и/или снижение, или уменьшение, или предотвращение инфекции PCV3, или ее частоты и/или ее клинических признаков или симптомов.

Пример 2

Производство антигена ORF2 BaculoG/PCV3 для исследования

Партию антигена объемом 1 л получали во вращающейся колбе объемом 3 л путем инфицирования клеток SF+ (Spodoptera frugiperda) с приблизительной MOI, равной 0,076, рекомбинантным бакуловирусом, содержащим ген 2 ORF2 цирковируса свиней 3 под контролем бакуловирусного полиэдринового промотора (BaculoG/PCV3 ORF2 Клон 4B4-2E12 Pre-MSV p8). Колбу инкубировали при 28°C±2°C при постоянном перемешивании приблизительно при 100 об./мин в течение семи дней. Клетки и среду в асептических условиях переносили в центрифужные флаконы 2 x 1 л, и клетки осаждали при 15000 g в течение 20 минут при 4°C. Полученную надосадочную жидкость фильтровали через фильтр с размером пор 0,2 мкм и хранили при 4°C.

Таблица 1. Состав инактивированной бакуловирусной вакцины PCV3 ORF2

Компонент Назначение Объем Инактивированный бакуловирусный PCV3 ORF2 Антиген 800 мл Карбопол 971P (0,5% базовый раствор) Адъювант 200 мл

Пример 3

Оценка эффективности прототипов вакцин против цирковируса свиней 3 типа (PCV3) у молодых свиней, лишенных молозива, рожденных кесаревым сечением

Задачи примера заключаются в следующем: оценить эффективность прототипа вакцины против PCV3 умолодых свиней, рожденных путем кесарева сечения, лишенных молозива (CDCD), разработать модель заражения для PCV3 у молодых свиней CDCD, включая определение переменных первичного и вторичного исхода, подтвердить инфекционность инфекционных молекулярных клонов.

Это исследование было разработано для оценки использования целого вируса и ПЦР-положительного гомогената ткани (оба предоставлены Ветеринарной диагностической лабораторией Университета штата Айова (ISU VDL)) в качестве потенциальных контрольных материалов для будущих исследований. Кроме того, сохранение инфекционного клона PCV3 у свиней дало бы дополнительную возможность для будущих исследований модели заражения и поэтому было включено в план исследования. Поскольку прототипы вакцин были доступны, они были включены для более точной оценки модели заражения.

Таблица 2. Дизайн исследования

№ Помещение* Вакцинация (Д0; возраст 3 недели) Заражение (Д21; возраст 6 недель) Аутопсия (Д49; возраст 10 недель) Аутопсия (Д63; возраст 12 недель) 8 А BaculoG/PCV3 - ISA Целый вирус + гемоцианин лимфы улитки (KLH) Все оставшиеся животные умерщвлены; сбор тканей Не применяется 8 BaculoG/PCV3 - Карбопол 8 Плацебо 12 В BaculoG/PCV3 - Карбопол ПЦР + гомогенат тканей + KLH 8 животных умерщвлены; сбор тканей 4 животных умерщвлены; сбор тканей 12 Плацебо 6 С Нет Плацебо – контроль заражения (среда для целого вируса) 3 животных умерщвлены; сбор тканей 3 животных умерщвлены; сбор тканей № Помещение Заражение (в Д14; в 5 недель) Аутопсия 2 D Инфекционный клон – BIAH рециркуляризованный геном Все животные умерщвлены на Д28 или Д42. 2 Инфекционный клон – ISU рециркуляризованный геном 2 Инфекционный клон – ISU димеризованный геном в плазмиде

Всего было использовано 54 молодые свиньи. Животные были произвольно распределены на пять экспериментальных групп (n = 8-12/ группу) и одну группу строгого контроля (n = 6). Животные были размещены в трех помещениях. В 7-дневном возрасте свиней вакцинировали PCV2. В Д0 в возрасте трех недель свиней вакцинировали либо векторной конструкцией, экспрессирующей ORF2 PCV3, с адъювантом ISA 207VG, либо векторной конструкцией, экспрессирующей ORF2 PCV3, с адъювантом карбополом, либо плацебо (подобранный контроль для векторной конструкции). Свиньи были перемещены примерно в пятинедельном возрасте. На 21 день в возрасте шести недель свиней заражали либо целым вирусом, либо гомогенатом ткани. В дополнение к контрольному материалу вводили иммуностимулятор (IFA/KLH). В данном контексте иммуностимулятор играет роль не адъюванта, а усилителя заражения. В течение всего исследования периодически анализировали ректальную температуру, массу тела, собирали сыворотку, целую кровь, назальные мазки и фекальные мазки. Образцы тестировали совместно. Животных умерщвляли на Д49 или Д63, как описано в таблице 2. Собирали и оценивали множество свежих и фиксированных тканей.

Для исследования инфекционных конструкций клонов использовали всего 6 молодых свиней. Животные были произвольно распределены на три группы (n = 2 на группу) и размещены в одной комнате. В Д14, когда животным было приблизительно 5 недель, им прививали один из трех инфекционных клонов. Инокуляцию производили внутрипеченочно (под контролем УЗИ). Кроме того, животных 9-й группы прививали внутримышечно. Регистрировали ректальную температуру, массу тела, собирали образцы сыворотки, назальных и фекальных мазков периодически на протяжении всего исследования. Образцы тестировали с помощью кПЦР, чтобы определить, способны ли клоны реплицироваться. Животных умерщвляли на Д49. Множество свежих и фиксированных тканей были собрано только у животных, которые были виремическими, и было передано для оценки.

Расписание исследования показано в таблице 3.

Таблица 3

День исследования Мероприятие при исследовании

Д-22 Сбор пуповинной крови

Д-14 Вакцинация животных от PCV2 в 7-дневном возрасте

Д0 Вакцинация животных 1-6 групп (3-недельный возраст)

Сбор крови (Примечание: не собирали фекальные мазки, назальные мазки, не регистрировали температуру или вес)

Д12 Перевозка животных

Д14 Заражение животных в группах 7-9 (5-недельный возраст)

Д19 Введение KLH/ICFA животным в группах 1-6

Д21 Заражение животных в группах 1-5 (возраст 6 недель)

Д23 Введение KLH/ICFA животным в группах 1-6

Д49 Вскрытие отобранных животных в группах 4-6; все животные группы 1-3, 7-9

Д63 Вскрытие оставшихся животных в группах 4-6

Д21 - Д12 Наблюдения за общим состоянием здоровья всех животных

Д13 - Д63 Клинические наблюдения за всеми имеющимися животными

Д13, 15, 16, 19, 21, 23, 28 Ректальная температура из групп 7-9

Сбор крови, фекальные мазки, назальные мазки у животных групп 7-9

Д13, 21, 22, 23, 26, 28, 35, 42, 49 Ректальная температура из групп 1-5

Сбор крови, фекальные мазки, назальные мазки у животных 1-5 групп

Д13, 15, 16, 19, 21, 22, 23, 26, 28, 35,

42, 49 Ректальная температура из группы 6

Сбор крови, фекальные мазки, назальные мазки у животных группы 6

Д13, 21, 28, 35, 42, 49 Масса тела (все животные)

Экспериментальную вакцину (BaculoG/PCV ORF2) сравнивали с плацебо-сопоставимым контролем. Схема лечения представлена в таблице 4.

Таблица 4

Группа Лечение 1 BaculoG/PCV ORF2, Р9; живая, с добавлением адъювантов 50% ISA
207VG; L#3624-171 2 и 4 BaculoG/PCV ORF2, Р9; живая, с добавлением адъювантов 20% карбопола; L#3624-172А 3 и 5 BaculoG/контроль без вставки, Р4; живая, с добавлением адъювантов 20% карбопола; L#3624-172В 6 Без лечения 7 Инфекционный клон – BIAH рециркуляризованный геном; серия №3718-050 8 Инфекционный клон – ISU димеризованный геном в плазмиде 9 Инфекционный клон – ISU сохраненный вирус

Вакцины вводили на Д0 внутримышечно в правую сторону шеи (2 мл), на середине расстояния между основанием уха и плечевым суставом, с использованием стерильных игл и шприцев подходящего размера. Коммерческую вакцину против PCV2 (Circoflex, серия № 3091134A) вводили всем животным в соответствии с инструкциями производителя.

Заражение целым вирусом: материал для заражения хранили при температуре -70°C±10°C до использования. Непосредственно перед заражением материал размораживали при 37°C и использовали в неразбавленном виде. Общая дозировка составляла 2 мл (1 мл интраназально/1 мл внутримышечно). На 21 день каждая свинья получала 1 мл вирусного материала интраназально и 1 мл внутримышечно. Внутримышечное введение материала для заражения осуществляли путем инъекции вирусного материала в левую сторону шеи, на середине расстояния между основанием уха и плечевым суставом, с использованием стерильных игл и шприцев подходящего размера. Введение материала для заражения интраназально осуществляли, прикрепляя распылитель на кончике носа к люэровскому шприцу объемом 5 см³. Продолжительность заражения составила 28 дней. Обычное культивирование материала проводили на чашках с кровяным агаром при 37°C в анаэробных и аэробных условиях в течение 48 часов. Роста не наблюдалось, и тест был признан удовлетворительным. Материал был протестирован способом ПЦР на наличие микоплазмы; никаких загрязнений выявлено не было. Результат кПЦР PCV3: 6,6 log10 геномных копий/мл (Cq = 23,58). Глубокое секвенирование образцов (MiSeq_127) было завершено с использованием обработки как ДНК, так и РНК. Секвенирование не привело к восстановлению PCV3.

Заражение гомогенатом ткани, положительным по ПЦР PCV3. Материал для заражения хранили при -70°C±10°C до использования. Непосредственно перед заражением материал размораживали при 37°C и использовали в неразбавленном виде. Общая дозировка составляла 2 мл (1 мл интраназально/1 мл внутримышечно). На 21 день каждая свинья получала 1 мл вирусного материала интраназально и 1 мл внутримышечно. Внутримышечное введение материала для заражения осуществляли путем инъекции вирусного материала в левую сторону шеи, на середине расстояния между основанием уха и плечевым суставом, с использованием стерильных игл и шприцев подходящего размера. Введение материала для заражения интраназально осуществляли, прикрепляя распылитель на кончике носа к люэровскому шприцу объемом 5 см³. Продолжительность заражения составила 28 дней. Обычное культивирование материала проводили на чашках с кровяным агаром при 37°C в анаэробных и аэробных условиях в течение 48 часов. Роста не наблюдалось, и тест был признан удовлетворительным. Материал был протестирован способом ПЦР на наличие микоплазмы; никаких загрязнений выявлено не было. Результат кПЦР PCV3: 9,1 log10 геномных копий/мл (Cq = 14,82). Глубокое секвенирование образцов (MiSeq_127) было завершено с использованием обработки как ДНК, так и РНК. Секвенирование привело к восстановлению полного генома PCV3 (99% нуклеотидов к PCV3 GB MG564174.1).

В таблице 5 описан иммуностимулятор, вводимый животным.

Таблица 5

Непатентованное название Гемоцианин лимфы улитки, эмульгированный в неполном адъюванте Фрейнда (KLH/ICFA) Состав (на дозу) BIVI-R&D приготовленный KLH/ICFA для содержания эквивалента 1 мг KLH с добавлением адъюванта 1 мл ICFA Производитель BI AH USA – Ames, IA Номер серии 3519-049 Срок годности Н/П Хранение Хранили при 2-8°С перед использованием Форма выпуска 52 мл – в 60 мл пластиковых флаконах Анализ KLH/ICFA испытывали на стерильность Применяемая доза 2,0 мл в правую мышцу бедра на Д19 и 2,0 мл в левую мышцу бедра на Д23. Применение осуществляло лицо, применяющее препарат, не отвечавшее за сбор данных в этом исследовании. Применение KLH задокументировано в записях о применении продукта.

На D14 молодой свиньи в группах 7 и 8 были инфицированы посредством инъекции под ультразвуковым контролем только в печень - лимфатические узлы не инокулировали. Для заражения 1 мл материала набирали в туберкулиновый шприц и присоединяли к стерильной игле 22 g x 1,5 дюйма. Иглу вводили в три разных участка печени. В каждое место вводили примерно 300 мкл. Свиньям в группе 9 вводили инокулят, как описано выше. Кроме того, им внутримышечно вводили 3 мл материала; 1,5 мл материала в мышцы шеи справа и 1,5 мл материала в мышцы шеи слева. После заражения свиньям вводили 0,5 мл Baytril в мышцы шеи справа. Группе 7 (молодые свиньи 1 и 2) вводили материал с рециркуляризованным геномом. Группе 8 (молодые свиньи 3 и 4) вводили димеризованную плазмиду. Группе 9 (молодые свиньи 5 и 6) вводили материал культуры трансфицированных клеток. В Таблице 6 показаны критерии включения/исключения, использованные в исследовании.

Таблица 6

Характеристики Требования Вид и порода Свиньи, CDCD Возраст Молодым свиньям исполнился 21 день на Д0. Диапазон массы тела Никакого конкретного диапазона массы тела не требуется Источник и собственник Источник: Struve Labs International; 1603 Enterprise St., Мэннинг, штат Айова, 51455
Владелец: Boehringer Ingelheim Animal Health USA, Inc. Количество 60 Идентификация Ушная бирка (с уникальным номером) Физиологический статус Все молодой свиньи были вакцинированы против PCV2 перед отправкой в AMVC. Все поросята были здоровыми на момент вакцинации, что было определено лицом, проводящим исследования. Серологический статус Не указан Дополнительные требования к включению Образцы сыворотки, собранные на Д0 и Д13, были протестированы на присутствие ДНК PCV3 и PCV2 с помощью кПЦР. Ни в один момент времени ДНК PCV3 или PCV2 обнаружена не была. Исключение Было получено всего 60 животных, после транспортировки не было смертных случаев. Все животные были включены в исследование. Удаление после включения После включения в исследование животных не удаляли.

Молодая свинья была экспериментальной единицей. Рандомизацию молодых свиней для загона и лечения проводил статистик или назначенное лицо. До начала исследования имеющиеся данные о свиньях, информацию о подстилке и условиях содержания использовали для случайного назначения лечения в помете. Всего в группы 1-6 было включено четыре помета от 12 до 14 свиней. Всего в группы 7-9 было включено два помета с тремя молодыми свиньями. Персонал, занимающийся сбором данных или выполнением лабораторных анализов, не имел представления о распределении свиней по группам на протяжении всего исследования. Лечение проводил человек, не участвовавший в сборе данных. Было одобрено использование животных в этом исследовании. В соответствии с принятыми правилами животноводства были предоставлены адекватная подстилка и место для кормления. За молодыми свиньями ежедневно наблюдали, чтобы обеспечить доступ к достаточному количеству корма и воды и определить общее состояние здоровья животных. По прибытии на объект животные находились под ветеринарным наблюдением до конца исследования. На протяжении всего исследования животных никак не лечили. На протяжении всего исследования свиней кормили следующими лечебными кормами: UltraCare 100 Medicated (серия № 7Nov03); UltraCare 240 Medicated (серия № 8Jun25); UltraCare 500 Medicated (серия № 8Aug30), или Lean Metrics CEPS Medicated (серия № 08Nov14). После завершения исследования животных утилизировали, за исключением животного № 13, которое было кремировано на Д46.

У всех свиней ежедневно контролировали общее состояние здоровья с Д1 по Д12. Никаких отклонений не отмечено. Начиная с D13 и продолжая до конца исследования, всех свиней ежедневно наблюдали на наличие клинических признаков, как описано в таблице 7.

Таблица 7

Оценка Респираторные признаки Неврологические признаки Состояние тела Диарея 0 Норма Норма Норма Норма 1 Умеренная = умеренное учащение дыхания. Угнетение функции = от сниженной активности до вялости, требуется физическая стимуляция, чтобы вызвать передвижение. Умеренная = подавленный аппетит, но все еще есть, немного худощавый по сравнению с другими животными в загоне. Умеренная = слегка жидкий стул, наблюдаемый у этой молодой свиньи 2 Средняя = заметное увеличение частоты дыхания Атаксия = неспособность координировать мышечную активность, спастические движения головы, конечностей и/или туловища Средняя = не ест, ребра и позвоночник явно выражены Средняя = наблюдается жидкий стул; явное окрашивание перианальной области 3 Тяжелая = хрипы Тремор = непроизвольные повторяющиеся движения мышц Тяжелая = истощение Тяжелая = наблюдается очень водянистый стул 4 Лежачее положение = лежит, не способен подняться при воздействии физического раздражителя 5 Судороги = двустороннее тоническое или клоническое сокращение мышц, приводящее к частичной или полной потере сознания

В дни сбора данных о температуре тела температуру каждого животного регистрировали с помощью микрочипа (Destron Fearing LifeChip® с технологией Bio-Thermo Technology) и термометра Allflex (номер модели RS420-45, серийный номер C088 26001). Данные были записаны в °F. Для статистического анализа данные были скорректированы до исходного уровня. Пирексия определялась как температура выше 104°F. В дни анализа массы тела регистрировали массу тела в килограммах по калиброванной шкале.

В дни сбора крови венозную целую кровь собирали через переднюю полую вену от каждой молодой свиньи с использованием стерильной иглы Vaccutainer® подходящего размера, держателя иглы Vaccutainer® и пробирок с сепаратором сыворотки (SST). Кровь доставляли вручную, а сыворотку декантировали в два криогенных флакона с завинчивающейся крышкой и одну пробирку Falcon на 5 мл, на которой были указаны номер исследования, день исследования и идентификатор животного. Образцы сыворотки в криогенных флаконах хранили при -70°C±10°C и отслеживали с помощью электронной системы управления Freezerworks. Сыворотка была проверена способом кПЦР на наличие PCV3. Пробирки Falcon объемом 5 мл были перенесены для анализа ИФА.

У свиней собирали образцы мазков. Отдельный стерильный тампон (Fisher, кат. № 23-400-111 или аналогичный) использовали для получения пробы фекалий из прямой кишки животного или пробы из носа из одной ноздри. После отбора пробы каждый тампон помещали в пробирку, содержащую 1,0 мл минимальной эссенциальной среды (кат. номер SAFC 62892-1000M3056). Были подготовлены пробирки со средой, которые перед использованием хранили при 4°C. После использования пробирки были помечены как минимум идентификатором животного, номером исследования и датой. Пробирки хранили при -70°C±10°C и доставляли в день сбора, и обрабатывали стандартными способами. Обработанные материалы хранили во флаконах, на которых был указан по меньшей мере номер исследования, день исследования и идентификатор животного. Образцы хранили при -70°C±10°C и отслеживали с помощью электронной системы управления Freezerworks. Образцы были протестированы способом кПЦР.

Животных в группах 7-9 вскрывали на Д49. Животных в группах 1-6 умерщвляли либо в Д49, либо в Д63. Во время аутопсии макроскопические поражения регистрировали в протоколе вскрытия трупа. Исследователь или назначенное лицо собирали фиксированные формалином образцы ткани головного мозга (1/2 органа), мозжечка (1/2 органа), ствола мозга (1/2 органа), легкого (1 участок добавочной доли или области с поражением), сердца (2 среза), почки (1 срез), печени (1 срез), селезенки (1 срез), миндалины (1/2 органа), тонкой кишки (3 среза), толстой кишки (2 среза) и лимфоузлов (поверхностных паховых, трахеобронхиальных, подвздошных, брыжеечных, желудочно-печеночных и подвздошно-слепокишечных). Все фиксированные ткани помещали в один контейнер, содержащий 10% забуференный раствор формалина, таким образом, чтобы соотношение фиксированных тканей к формалину составляло 1:10. Для каждой молодой свиньи двойные образцы срезов, перечисленных выше, собирали в следующие упаковочные завязываемые мешки; 1 - головной мозг, мозжечок, ствол мозга; 2 - легкое, сердце, почка, печень, селезенка; 3 - лимфатические узлы и миндалины; 4 - тонкая кишка и толстая кишка. Пакеты со свежими тканями и сосуды с фиксированными тканями были помечены как минимум номером исследования, днем исследования и идентификатором животного. Все свежие ткани переносили на Д49 или Д63. Обращаем внимание, что ткани не собирали у животных 1 и 2 (группа 7); 4 (группа 8), или 5 и 6 (группа 9), поскольку виремия не была обнаружена с помощью количественной ПЦР.

Терминальные образцы крови собирали у следующих животных на Д63: 57 и 55 (группа 6); 53, 50, 46 и 44 (группа 5); 41, 37, 35 и 33 (группа 4). Перед забором крови свиней подвергали глубокой анестезии. Кровь собирали в пробирки SST и доставляли в день забора. Сыворотку отделяли от сгустка центрифугированием и декантировали в центрифужные пробирки объемом 50 мл, на которых были указаны номер исследования, день исследования и идентификатор животного. Образцы сыворотки отслеживали с помощью электронной системы управления FreezerWorks. Переносили половину сыворотки, собранной у каждого животного.

Статистический анализ данных проводили с использованием SAS версии 9.2 или более поздней версии (SAS, Кэри, Северная Каролина/ США, SAS Institute, Inc.). Перечни данных и сводные статистические данные по группам лечения были сгенерированы для всех переменных, если это необходимо. Данные по виремии из групп 1-5 были разделены по бинарному результату (присутствует/отсутствует) для каждого животного, и построены медианные значения ПЦР по группам и дням. Долю пораженных животных анализировали с помощью точного критерия Фишера между группами лечения; значения p менее 0,01 считали достоверными. Данные для фекальных и назальных мазков из групп 1-5 были дихотомизированы для получения двоичного результата (присутствует/отсутствует) для каждого животного, и были нанесены медианные значения ПЦР по группам и дням. Долю пораженных животных анализировали с помощью точного критерия Фишера между группами лечения; значения p менее 0,01 считались значимыми. Долю пораженных животных для групп 4 и 5 по дням анализировали с помощью теста Уилкоксона. Ректальную температуру и массу тела анализировали с использованием смешанной модели с корректировкой по базовой линии. Сообщаются средние значения наименьших квадратов по группам и дням. Были проанализированы сравнения групп по дням; значения p менее 0,01 считали достоверными.

В протокол внесены три поправки. Во-первых, из-за небольшого размера свиней был изменен протокол инокуляции инфекционного клонового материала. Во-вторых, для свиней в группах 7, 8, 9 были добавлены дополнительные даты отбора на основании результатов ПЦР. Добавлены даты: Д36, Д42 и Д49. Кроме того, аутопсия была проведена на Д49, а не на Д42. В-третьих, исследователь рекомендовал не собирать данные о массе тела и температуре на Д0, а кровь не собирать на Д7 из-за дополнительного стресса, который это может вызвать у животного.

Виремия не была обнаружена ни у одного из шести животных строгого контроля на протяжении всего исследования (группа 6). Распределение частот виремии по группам представлено в таблице 8 ниже. Групповое медианное значение log10 геномных копий ДНК PCV3/мл в день для групп 1-5 представлено на фигуре 4.

У невакцинированных свиней воздействие материала для заражения целым вирусом (WV) приводило к виремии у 100% животных (группа 3). Виремия у этих животных впервые наблюдалась между Д28 и Д42 и присутствовала у всех животных во время завершения теста (D49). Напротив, виремия была предотвращена у 94% (15/16) вакцинированных животных, подвергшихся заражению целым вирусом (p <0,001). Одно вакцинированное животное, у которого наблюдалась виремия (# 14), находилось в группе 1 и имело обнаруживаемую виремию только на Д49.

У невакцинированных свиней воздействие материала для заражения гомогенатом ткани (TH) приводило к виремии у 100% животных (группа 5). Виремия у этих животных впервые наблюдалась на 22-й день (у всех животных) и присутствовала у всех животных на момент выхода из испытания (Д49). У четырех животных (№ 53, 50, 46 и 44), которых содержали еще на две недели, обнаруживались уровни виремии во время аутопсии на Д63. Напротив, виремия была предотвращена у 42% (5/12) вакцинированных животных, подвергшихся заражению тканевым гомогенатом (p = 0,0373). Из семи вакцинированных животных, которые стали виремическими, только одно животное (№40) имело виремию с Д22 по Д49. Виремия отмечена между Д35 и Д49 у оставшихся шести вакцинированных животных. В Таблице 8 показана частота обнаружения ДНК PCV3 в сыворотке по группам лечения.

Таблица 8

Группа Лечение Выявленная виремия %
позитивных Нет Да Всего 1 BaculoPCV3/ISA - WV 7 1 8 12,5% 2 BaculoPCV3/Карбопол - WV 8 0 8 0,0% 3 Плацебо/Карбопол - WV 0 8 8 100,0% 4 BaculoPCV3/Карбопол – ТН 5 7 12 58,3% 5 Плацебо/Карбопол – ТН 0 12 12 100,0% 6 Строгий контроль 6 0 6 0,0%

Поскольку только два животных в группе были включены в часть исследования, посвященную инфекционным клонам, исходные данные по животным и дням представлены в таблице 9. ДНК PCV3 была обнаружена у обоих животных в группах 7 и 8, но только у одного животного из группы 9. Только у одного животного (№3; группа 8) развилась виремия в течение последующих недель. Интересно, что виремия не началась до Д28.

Таблица 9. Log10 геномных копий ДНК PCV3/мл по животным и дням

Никаких клинических признаков не наблюдалось ни у одного животного после вакцинации до Д12 (день транспортировки). На протяжении всего исследования только у двух животных (№13, группа 1; №59, группа 6) наблюдались постоянные отклонения от нормы. У трех дополнительных животных наблюдались спорадические аномалии.

Животное № 13 (группа 1), как наблюдали, имело ярко выраженные ребра и позвоночник, и оно не ело (оценка состояния тела 2) вскоре после прибытия на 13 и 14 день. На 23 день животное теряло координацию после кровотечения. На Д28 у животного была отмечена хромота левой задней ноги. Животное нашли мертвым на Д46. Макроскопическое исследование на момент смерти выявило фибринозный плеврит с мультифокальными участками ателектаза в краниальных вентральных долях легких и фибринозный перикардит. Судя по макроскопическим повреждениям, смерть была обусловлена системной бактериальной инфекцией. Смерть, вероятно, не была связана с вакцинацией или заражением, поскольку ДНК PCV3 не была обнаружена в сыворотке этого животного ни на одном этапе исследования.

У животного № 59 (группа 6) наблюдалась хромота на правую заднюю ногу с Д32-43, и было отмечено, что у него не сгибались задние конечности с D44 по 49. Поскольку это животное входило в группу строгого контроля, клинические признаки не были связаны с вакцинацией или заражением. У трех дополнительных животных наблюдались спорадические клинические признаки. Было обнаружено, что животное №14 (группа 1) имело ярко выраженные ребра и позвоночник и не ело (оценка состояния тела 2) вскоре после прибытия в AMVC на Д13. Кроме того, у животного была взлохмаченная шерсть на 16 и 17 день. Поскольку клинические признаки начинались до заражения и не проявлялись до 13 дней после вакцинации, предполагается, что эти признаки связаны с перемещением животного CDCD в молодом возрасте, а не с вакцинацией или заражением. У животного № 11 (группа 1) наблюдалось угнетение функции/летаргия (неврологическая оценка 1) на Д19. Поскольку у этого животного не было доказательств виремии на протяжении всего исследования, маловероятно, что клинические признаки были связаны с заражением. Наблюдалось, что животное № 5 (группа 9) было немного худее по сравнению с остальными животными в группе, с умеренным снижением аппетита (оценка состояния тела 1) на Д19. Поскольку на 15-й день у этого животного была обнаружена преходящая виремия, клинические признаки могли быть связаны с инфекцией. Однако клинические признаки не соответствовали предыдущей публикации [25] и были временными.

Выделение вируса с фекалиями не было обнаружено ни у одного из шести животных строгого контроля на протяжении всего исследования (группа 6). Распределение частоты выделения вируса с фекалиями по группам представлено в таблице 10. Медиана группового log10 геномных копий ДНК PCV3/мл в образцах фекалий по дням для групп 1-5 представлена на фигуре 5.

Таблица 10. Частота обнаружения ДНК PCV3 по группам в образцах фекалий

Группа Лечение Выявленная ДНК вируса в фекалиях %
позитивных Нет Да Всего 1 BaculoPCV3/ISA - WV 7 1 8 12,5% 2 BaculoPCV3/Карбопол - WV 5 3 8 37,5% 3 Плацебо/Карбопол - WV 1 7 8 57,5% 4 BaculoPCV3/Карбопол – ТН 1 11 12 91,7% 5 Плацебо/Карбопол – ТН 0 12 12 100,0% 6 Строгий контроль 6 0 6 0,0%

У невакцинированных молодых свиней воздействие материала на основе целого вирусного приводило к выделению вируса в фекалиях у 88% животных (группы 3). Вирус в фекалиях у этих животных впервые наблюдали между Д35 и Д49. Напротив, выделение вируса в фекалии было предотвращено у 75% (12/16) вакцинированных животных, подвергшихся заражению целым вирусом (p = 0,0101 (группа 1 против 3); p = 0,1189 (группа 2 против 3)). В целом выделение вируса в фекалиях у вакцинированных животных было спорадическим и не соответствовало истинной инфекции.

У невакцинированных свиней заражение материалом из гомогената тканей приводило к выделению вируса в фекалиях у 100% животных (группа 5). Выделение вируса в фекалиях у этих животных было двухфазным, и у нескольких животных обнаруживались количества PCV3 в фекалиях на Д22 и снова на Д35-49. Выделение вируса в фекалиях наблюдалось у 92% вакцинированных животных. Однако, в отличие от невакцинированных животных, выделение вируса в фекалиях было наиболее распространено на Д22 и Д23 без второго пика.

ДНК PCV3 не была обнаружена ни в одном из образцов фекалий, взятых у животных в группах 7-9.

Назальное выделение вируса не было обнаружено ни у одного из животных строгого контроля на протяжении всего исследования (группа 6), за исключением животного № 59. Поскольку ДНК PCV3 была обнаружена только на Д15, а все другие образцы (сыворотка, фекалии) были отрицательными, это, вероятно, ложноположительный результат. Медиана группового log10 геномных копий ДНК PCV3/мл в образцах фекалий по дням для групп 1-5 представлена на фигуре 6. (* Считается, что обнаружение вируса в мазках из носа у животного № 59 является ложноположительным).

У невакцинированных свиней воздействие материала для заражения вирусом приводило к выделению вируса в назальном мазке у 88% животных (группа 3). Назальные выделения вируса у этих животных впервые наблюдались между Д35 и Д49. Напротив, выделение вируса из носа было предотвращено у 94% (15/16) вакцинированных животных, подвергшихся заражению целым вирусом (p = 0,0014 (группа 1 против 3); p = 0,0101 (группа 2 против 3)). Одно вакцинированное животное (№19, группа 2) с положительными результатами имело PCV2 только на Д49.

У невакцинированных свиней воздействие материала для заражения гомогенатом тканей приводило к выделению вируса из носа у 100% животных (группа 5). Выделение вируса из носа у этих животных было двухфазным, и у нескольких животных были выявляемые количества PCV3 в ноздрях на Д22 и снова на Д35-49. Назальные выделения вируса наблюдались у 100% вакцинированных животных. Однако, в отличие от невакцинированных животных, выделение вируса из носа присутствовало у большинства животных на Д22 и 23 без второго пика. Спорадическое выделение вируса наблюдалось только у двух животных после D28.

Только два животных на группу были включены в часть исследования, посвященную инфекционным клонам, необработанные данные по животным и дням представлены в таблице 11. ДНК PCV3 была обнаружена у 5/6 животных на следующий день после инокуляции (D15) и у всех животных независимо от инокулята между Д16-21. Только у одного животного (№4; группа 8) обнаруживалась ДНК PCV3 в мазках из носа после Д21.

Таблица 11. Log10 геномных копий ДНК PCV3/мл в мазках из носа по животным и дням для групп 7-9

Скорректированная по базовой линии средняя ректальная температура (°F) для группы способом наименьших квадратов по дню исследования представлена на фигуре 7. Данные для группы 6 не включены в фигуру, поскольку анализ был основан на модели, и животные в группе 6 содержались в отдельном помещении. Исходные данные и описательную статистику по группам и дням можно найти в статистическом отчете, связанном с этим исследованием. Никаких различий между группами 1-3 не наблюдалось независимо от вакцинационного статуса. Вакцинированные животные, зараженные тканевым гомогенатом (группа 4), имели значительно более низкие температуры по сравнению с невакцинированными зараженными животными (группа 5) во время периода заражения (p = 0,0021).

Ни одно животное не считалось пирексическим (имевшим температуру выше 104°F) на протяжении всего исследования.

Скорректированные по базовому уровню средние значения групповых наименьших квадратов (кг) представлены для групп 1-5 на фигуре 7. Исходные данные и описательную статистику для всех групп можно найти в статистическом отчете, связанном с этим исследованием. Никаких различий между группами не наблюдалось, независимо от материала для заражения или статуса вакцинации (p> 0,1).

Первой целью этого исследования была разработка модели заражения для PCV3 у свиней CDCD и определение первичных и вторичных переменных результата. Оценивали два материала для заражения, гомогенат ткани и целый вирус. Поскольку 100% животных, подвергшихся воздействию гомогената ткани, становились виремическими в течение 24 часов после заражения и имели обнаруживаемое выделение из носа и фекалий, материал считался высоко заразным. Развитие виремии PCV3 и выделение фекальным и назальным путями не требовало совместной инфекции, поскольку другие патогены, включая PRRSV, PCV2 и PPV, не были обнаружены обычным культивированием, глубоким секвенированием и специфическими ПЦР-анализами, проводившимися на исходных тканях.

Цельновирусный материал вызвал виремию у 100% животных и выделение вируса из носа и фекалий у 88% животных, и поэтому считается заразным. Однако виремия произошла через 14 дней после заражения; значительно медленнее по сравнению с гомогенатом ткани. Гипотеза состоит в том, что задержка связана с вирусной нагрузкой исследуемого материала. В частности, значения Cq гомогената ткани и целого вируса составляли 14,82 и 23,58, соответственно, что позволяет предположить, что гомогенат ткани содержал большее количество ДНК PCV3 по сравнению с целым вирусом.

Поскольку исходные сообщения о случаях PCV3 в полевых условиях включали репродуктивную недостаточность и PDNS у свиноматок [3], была выдвинута гипотеза, что инфицирование свиней CDCD может приводить к PDNS. Однако не было никаких внешних доказательств PDNS (или другого клинического заболевания) или гипертермии после воздействия любого из контрольных материалов. Поскольку гомогенат ткани содержал большое количество вируса, а начало виремии было в пределах 24 часов, маловероятно, что инфицирование свиней CDCD только PCV3 приведет к PDNS. Следовательно, исходя из имеющихся в настоящее время данных, виремия представляется наиболее подходящим первичным параметром для применения в будущих исследованиях с использованием модели свиней CDCD. Кроме того, фекальные и назальные выделения были уменьшены, и их можно было использовать в качестве второстепенных параметров. Биологически значимых различий в температуре и массе тела не наблюдалось; эти параметры вряд ли пригодятся для будущих исследований. Поскольку другие параметры (серология, гистопатология) не оценивались во время создания отчета, они могут предоставить дополнительные параметры.

Первая цель исследования заключалась в первоначальной оценке прототипа вакцины с использованием двух разных адъювантов. В этом исследовании представлены предварительные данные о том, что одна внутримышечная доза антигена ORF2 PCV3, экспрессируемого бакуловирусом, вводимая трехнедельным свиньям, предотвращала виремию, присутствие вируса в назальном отделяемом и фекалиях после заражения целым вирусом. У животных групп 1 и 2 не было обнаружено выделения или виремии, поэтому нельзя сделать однозначный вывод о предпочтении одного адъюванта другому. Данные из групп 3 и 4 предполагают, что эффективность вакцины снижается, когда материал для заражения содержит большее количество ДНК PCV3. Следовательно, установление дозы заражения, которая приводит к инфекции, но не подавляет вакцинацию, может быть полезно для будущих исследований эффективности.

Чтобы оценить эффективность вакцинации против PCV3 на модели единственной ко-инфекции, свиней CDCD вакцинировали против PCV2 в возрасте семи дней. Основываясь на различиях в аминокислотной структуре капсида (26% идентичности аминокислот в гене cap между двумя вирусами [2]), было выдвинуто предположение, что перекрестной защиты не будет. Основываясь на результатах этого исследования, вакцинация против PCV2, по-видимому, не предотвращала виремию PCV3, поэтому маловероятно, что вакцинация против PCV2 играла какую-либо роль в отсутствии клинических проявлений заболевания.

Вторая цель этого исследования заключалась в подтверждении инфекционности инфекционных молекулярных клонов, созданных внешним сотрудником, и внутреннего молекулярного клона, созданного группой по разработке вакцины. Интересно, что внутрипеченочная инокуляция свиней CDCD инфекционными материалами клонов приводила к обнаруживаемому присутствию вируса в назальных мазках в течение семи дней после заражения. Предполагается, что временная виремия привела к распространению вируса на носовой эпителий, где произошла репликация. Для подтверждения этой гипотезы потребуются дальнейшие исследования и оценка ткани носа с помощью антиген-специфического реагента. Неизвестно, почему виремия снова была обнаружена у животного №3 в дни 28-49. Возможно, если бы использовалось большее количество животных, обнаружение виремии произошло бы у большего процента животных. Хотя развитие виремии в течение нескольких недель предполагает, что животное № 3 действительно инфицировано, инфекция носила субклинический характер. Этот результат не согласуется с недавней публикацией [25], в которой инфицирование обычных четырехнедельных свиней инфекционным клоном PCV3 приводило к PDNS.

Одна внутримышечная доза антигена ORF2 PCV3, экспрессируемого бакуловирусом, вводимая трехнедельным свиньям, предотвращала виремию, присутствие вируса в назальном и фекальном мазке после заражения материалом гомогената тканей, который считался инфекционным. В научных исследованиях или в обоснованных ожиданиях исследований эффективности виремия может использоваться в качестве основного параметра для оценки вакцинации. Для будущих основных исследований, связанных с полностью лицензированным продуктом, потребуется другой первичный параметр (обнаружение антигена PCV3 в тканях или клиническое заболевание). Инокуляция свиней CDCD инфекционным материалом клона приводила к виремии у одного животного и присутствию вируса в назальном мазке у нескольких животных. Однако никаких клинических признаков не наблюдалось.

Пример 4

Вакцина, введенная группе 1

Вакцина, обозначенная как «вакцина против цирковируса свиней, тип 3, модифицированный живой бакуловирусный вектор», была получена с помощью следующей процедуры. Партия антигена объемом 1 л была получена в вращающейся колбе объемом 3 л путем инфицирования клеток SF+ (Spodoptera frugiperda) с приблизительной MOI, равной 0,076, рекомбинантным бакуловирусом, содержащим ген ORF2 свиного цирковируса 3 типа под контролем бакуловирусного полиэдринового промотора. Колбу инкубировали при 28°C±2°C при постоянном перемешивании приблизительно при 100 об./мин в течение семи дней. Клетки и среду в асептических условиях переносили в центрифужные флаконы 2 x 1 л и клетки осаждали при 15000 g в течение 20 минут при 4°C. Полученную надосадочную жидкость фильтровали через фильтр с размером пор 0,2 мкм и хранили при 4°C. В состав материала входило 50% ISA207 VG, как показано в таблице 12. Вакцина удовлетворительно прошла тестирование стерильности после розлива в конечные контейнеры. Анализ безопасность на мышах перед применением материала у свиней не проводили.

Таблица 12. Состав вакцины - адъювант ISA207 VG

Компонент Назначение № серии Масса Концентрация BaculoG/PCV3 ORF2 Антиген 3624-144 101,07 г 50% ISA2017 VG Адъювант 15060911879 101,07 г 50%

Пример 5

Вакцина для групп 2 и 4

Вакцина, вводимая группам 2 и 4: Способы получения - Вакцина, обозначенная как «Цирковирусная вакцина свиней, тип 3, модифицированный живой бакуловирусный вектор», была получена способом, описанным выше для группы 1. Надосадочная жидкость была объединена с 20% Карбопола, как показано в таблице 13. Вакцина удовлетворительно прошла тестирование на стерильность после розлива в окончательные контейнеры. Анализ безопасность на мышах перед применением материала у свиней не проводили.

Таблица 13. Состав вакцины - адъювант Карбопол

Компонент Назначение № серии Объем BaculoG/PCV3 ORF2 Антиген 3624-144 80 мл Карбопол Адъювант А80371 20 мл

Пример 6

Вакцина для групп 3 и 5

Вакцина, обозначенная как «Модифицированный живой бакуловирусный вектор», представляет собой соответствующее плацебо продукта. Его готовили по следующей методике. Партию антигена 0,5 л получали в вращающейся колбе объемом 1 л путем инфицирования клеток SF+ (Spodoptera frugiperda) с приблизительной MOI, равной 0,1, рекомбинантным бакуловирусом, не содержащим вставки. Колбу инкубировали при 28°C±2°C при постоянном перемешивании приблизительно при 100 об./мин в течение четырех дней. Клетки и среду в асептических условиях переносили в центрифужный флакон на 1 л, и клетки осаждали при 10 000 g в течение 20 минут при 4°C. Полученную надосадочную жидкость фильтровали через фильтр с размером пор 0,2 мкм и хранили при 4°C. В состав материала входило 20% Карбопола, как показано в таблице 14. Вакцина удовлетворительно прошла тестирование стерильности после розлива в окончательные контейнеры. Анализ безопасность на мышах перед применением материала у свиней не проводили.

Таблица 14. Состав плацебо - адъювант Карбопол

Компонент Назначение № серии Объем BaculoG/контроль без вставки Антиген 3624-153 60 мл Карбопол Адъювант А80371 15 мл

На фигуре 10 показана информация о последовательности в PCV3 ПЦР-позитивном гомогенате ткани, использованном для инфекционного материала.

Плазмида инфекционного клона pCR-BluntII-TOPO-PCV3 была создана из gBlock генома PCV3 на 2000 пар оснований (KT869077), полученного от Integrated DNA Technologies (IDT). GBlock встраивали в вектор pCR-BluntII-TOPO и трансформировали в E.coli Stbl2. Плазмиду инфекционного клона амплифицировали и очищали из 1 л размноженной E.coli Stbl2 с использованием набора для очистки Qiagen CompactPrep Maxi-DNA Purification, следуя процедуре, рекомендованной производителем. Клон pCR-BluntII-TOPO-PCV3 3624-046.06, серия № 3718-038 разводили в стерильном ФСБ, pH 7,4 от Life Technologies Gibco, кат. № 10010-023, серия № 1967438 до конечной концентрации 400 мкг/мл плазмиды в общем объеме 4 мл. Разбавленную плазмиду переносили аликвотами в стерильный флакон с вакциной и хранили при -20°C.

Пример 7

Разработка модели заражения PCV3

Все таблицы 17, 21, 26, 31, 32-41, 42-51, 52, 54-63, 64-71, 72, 75, 76-84, 85-94, 95, 97-106, 107-117, и 118, упомянутые в примере 7, являются такими же, как таблицы 17, 21, 26, 31, 32-41, 42-51, 52, 54-63, 64-71, 72, 75, 76-84, 85-94, 95, 97-106, 107-117 и 118, приведенные в WO 2020/206452, содержание которой включено в настоящую заявку посредством ссылки.

PCV3 является новым заболеванием в мировой популяции свиней, и из-за его потенциальной корреляции с клиническим заболеванием он вызвал интерес к разработке вакцин против PCV3. Для оценки прототипов вакцин была необходима разработка модели заражения.

Как показано в следующих таблицах и фигурах, пример 7 отражает исследования, проведенные для разработки модели заражения PCV3 у молодых свиней. В частности, использовали молодых свиней, полученных после кесарева сечения, лишенных молозива («CDCD»).

Исследования были разработаны для оценки использования целого вируса и ПЦР-положительного гомогената ткани в качестве потенциальных контрольных материалов для будущих исследований. Кроме того, сохранность инфекционного клона PCV3 у свиней предоставило дополнительную возможность для будущих исследований модели заражения и поэтому было включено в план исследования.

Любые прототипы вакцин, доступные в ходе экспериментов, были включены для более точной оценки модели заражения.

PCV3 был выделен из клинического материала. Выделение вируса подтверждали с помощью кПЦР в режиме реального времени, трансмиссионной электронной микроскопии и иммунофлуоресцентного анализа с использованием подходящих антител. Было показано, что выделенный вирусный сбор не содержит других вирусов, включая PCV1, PCV2, PRRSV, SIV, коронавирусы свиней. Полученный вирус представлял собой чистую культуру. Чистота была подтверждена с помощью секвенирования следующего поколения.

Полный геном PCV3 клонировали в подходящий плазмидный вектор путем полного синтетического синтеза всего PCV3.

Геномная последовательность была подтверждена, и геном вырезали путем ферментативного расщепления плазмиды. Затем геном повторно сшивали для создания замкнутого ковалентного кольцевого генома PCV3.

Циркуляризованный геном PCV3 трансфицировали в подходящие клеточные линии для сохранения инфекционного вируса. Сохраненный вирус и/или циркуляризованный геном инокулировали молодой свинье. Циркуляризованный геном был введен в печень и паховый лимфатический узел под контролем ультразвука.

Во второй итерации были созданы плазмиды, которые содержали две копии генома PCV3. Достаточные количества очищенной плазмиды, содержащей димерный PCV3, были приготовлены для применения в разработке модели заражения и исследованиях патогенности/вирулентности.

Был получен клинический материал, включая ткани и жидкости, содержащие PCV3 с высоким титром, как определено с помощью кПЦР. Было показано, что клинический материал не содержит других вирусов свиней, включая PCV1, PCV2, PRRSV, SIV и/или коронавирусы свиней.

Клинический материал использовали для разработки модели заражения PCV3 и для исследований патогенности/вирулентности. Были проведены исследования на животных для оценки патогенности и распространения вируса с использованием различных путей инокуляции. В частности, дополнительно к другим исследуемым путям материал вируса PCV3 и/или гомогенат ткани с высоким титром инокулировали в один рог матки свиноматок на 40-й день беременности. Оценивали распространение PCV3 на плод в зараженном роге и неинокулированном роге матки. Оценивали развитие мумий в результате заражения PCV3.

Модель заражения использовали для формирования основы для оценки потенциальных вакцин.

Образцы из исследований PCV3 были протестированы, включая предварительную скрининговую ПЦР и серологию, ПЦР для модели заражения и инфекционных клонов, серологию для исследований вакцин.

Предел обнаружения, чувствительность и специфичность анализов не определяли.

Вакцины-кандидаты оценивали в различных комбинациях адъювантов. Вакцины-кандидаты включали, например, бакуловирус, экспрессирующий ORF2 PCV3, и геном PCV3, экспрессированный в плазмиде (вакцину на основе нуклеиновой кислоты). Серологический анализ был проведен для исследования вакцины.

В таблице 15 относится к дозировке продукта и условиям содержания животных. В частности, в таблице 15 показаны животные, оцененные по группам. В частности, были определены помет, конкретное животное, были ли они вакцинированы, помещение, в которой находились животные, и чан, у которого они находились.

Следующие данные относятся к данным о виремии у животных и их анализу.

Как показано в таблице 16, значения виремии, измеренные с использованием кПЦР в сыворотке и показанные в логарифмических единицах геномных копий/мл, представлены по группам животных в выбранные дни исследования.

Таблица 16

Таблица 16, продолжение

Таблица 16, продолжение

На фигуре 11 показано среднее значение ПЦР для групп 1-5 от семи до сорока девяти дней.

На фигуре 12 показано медианное значение ПЦР для групп 7-9 от семи до сорока девяти дней.

В таблице 18 представлены результаты анализа виремии для групп 1-5.

Таблица 18

Виремия (кПЦР сыворотки, log геномных копий/мл), результаты виремии по группам.

Сравнение значений Р для данных из таблицы 18 показано в таблице 19.

Таблица 19

Виремия (кПЦР сыворотки, log геномных копий/мл), сравнение значений Р по группам.

Сравнение по группам Значение Р 1 против 3 0,0014 2 против 3 0,0002 4 против 5 0,0373

Следующие данные относятся к данным выделения вируса в фекалиях при измерении с использованием кПЦР фекалий (т.е. логарифм копий гена/мл) у субъектов-животных, и к их анализу.

Как показано в таблице 20, значения выделения вируса в фекалиях при измерении с помощью кПЦР фекалий, показанные в логарифмических геномных копиях/ мл, представлены по группам для животных в выбранные дни исследования.

Таблица 20

Таблица 20 (продолжение)

Таблица 20 (продолжение)

На фигуре 13 показаны медианные значения ПЦР для выделения вируса с фекалиями для групп 1-5 от семи до сорока девяти дней.

В таблице 22 представлены результаты определения выделения вируса с фекалиями для групп 1-5.

Таблица 22

Сравнение значений P для данных из таблицы 22 (определения выделения вируса в фекалиях) показано в таблице 23.

Таблица 23

Сравнение по группам Значение Р 1 против 3 0,0101 2 против 3 0,1189 4 против 5 1,0000

Прямое сравнение значений P (т.е. критерия Уилкоксона) для групп 4 и 5 показано в таблице 24.

Таблица 24

День Значение Р 22 0,239 23 0,131 26 1,000 28 1,000 35 0,014 42 0,005 49 0,261

Следующие ниже данные относятся к данным по выделению вируса в назальном мазке при измерении с использованием кПЦР назального мазка (т.е. логарифм геномных копий/мл) у животных, и к их анализу.

Как показано в таблице 25, количество выделенного вируса в назальном мазке при измерении с помощью кПЦР назального мазка и показанные в логарифмах геномных копий/мл, представлены по группам для животных в выбранные дни исследования.

Таблица 25

Таблица 25 (продолжение)

Таблица 25 (продолжение)

На фигуре 14 показаны медианные значения ПЦР для выделения вируса из носа для групп 1-5 от семи до сорока девяти дней.

В таблице 27 представлены результаты определения выделения вируса из носа для групп 1-5.

Таблица 27

Сравнение значений P для данных таблицы 27 (определение выделения вируса из носа) показано в таблице 28.

Таблица 28

Сравнение групп Значение Р 1 против 3 0,0014 2 против 3 0,0101 4 против 5 1,0000

Прямое сравнение значений P (т.е. тест Уилкоксона) для групп 4 и 5 показано в таблице 29.

Таблица 29

День Значение Р 22 0,812 23 0,760 26 1,000 28 1,000 35 0,014 42 0,003 49 0,217

Следующие данные относятся к показаниям ректальной температуры (ºF), измеренным у животных, и к их анализу.

Как показано в таблице 30, значения ректальной температуры, измеренные в градусах Фаренгейта, изображены по группам для животных в течение ряда дней исследования.

Таблица 30

Таблица 30 (продолжение)

Таблица 30 (продолжение)

На фигуре 15 показано среднее арифметическое значение ректальной температуры для групп 1-6 с четырнадцати до сорока девяти дней оценки.

На фигуре 16 представлены средние значения температуры, полученные способом наименьших квадратов по группам и дням для групп 1-5.

В таблице 53 показывает сравнение значений P для данных, относящихся к ректальной температуре.

Таблица 53. Ректальная температура (F). Значения Р при сравнении групп

На фигуре 17 представлена линейная диаграмма, показывающая средние ректальные температуры животных (скорректированные по базовой линии на основе наименьших квадратов) по группам и дням для групп 1-5.

В таблице 73 показано сравнение значений P для различных групп (1-5).

Таблица 73. Ректальная температура (F) (с поправкой на базовую линию). Значения Р при сравнении групп

Следующие данные относятся к значениям массы тела (кг), измеренным у животных, и их анализу.

Как показано в таблице 74, значения массы тела, измеренные в килограммах, изображены по группам для животных в выбранный день исследования.

На фигуре 19 представлен линейный график, показывающий средние значения массы тела (по способу наименьших квадратов) по группам и дням для групп 1-5.

В таблице 96 представлено сравнение в группах P-значений для массы тела.

Таблица 96. Масса тела (кг). Сравнение значений Р в группах

Сравнение
групп День Оценка Значение
Р 1 против 2 13 -0,49 0,1409 21 -0,71 0,1971 28 -0,91 0,2752 35 -1,03 0,3117 42 -1,29 0,2718 49 -1,48 0,2998 1 против 3 13 -0,70 0,0353- 21 -0,99 0,0747 28 -1,21 0,1478 35 -1,06 0,2944 42 -1,51 0,1972 49 -2,47 0,0853 4 против 5 13 0,16 0,5802 21 0,33 0,3429 28
— 0,54 0,3284 35 0,42 0,4901 42 0,62 0,4249 49 0,47 0,5637

На фиг.20 представлен линейный график, изображающий данные для средних значений наименьших квадратов для массы тела (с поправкой на исходный уровень) по группам и дням.

В таблице 119 представлена таблица P-значений для сравнения различных групп (1-5) по массе тела, корректированной по базовому уровню.

Таблица 119. Масса тела (кг) (скорректированной по базовой линии), значения Р для сравнения групп

Сравнение групп День Оценка Значение Р 1 против 2 28 0,04 0,8895 35 -0,07 0,8912 42 -0,34 0,6344 49 -0,49 0,5923 1 против 3 28 0,10 0,7072 35 0,25 0,6418 42 -0,20 0,7836 49 -1,11 0,2258 4 против5 28 0,05 0,7993 35 -0,07 0,8086 42 0,13 0,7314 49 -0,02 0,9671

Пример 8

Биопроцесс PCV3

Заражение осуществляли с помощью бакуловирусного посевного материала BaculoG/PCV3 ORF2 Pre-MSV. Целевая MOI составляла 0,1, а окончательная расчетная MOI - 0,1.

Параметры заражения показаны в таблице 120.

Таблица 120

Параметр Подробная информация Размер/конфигурация сосуда • Сосуд Sartorius Biostat B на 10 л со стеклянной рубашкой
• Кольцевой разбрызгиватель
• Крыльчатка с наклонными лопастями 2 х 45° и отрицательным наклоном, установленная на расстоянии примерно от одного до семи дюймов от нижней части вала мешалки. Рабочий объем 8 л Среда Ex-Cell 420, бессывороточная среда Клетки и целевые CPD SF+ клетки @ 1х10⁶ клеток/мл Температура 27°С Контроль газа / растворенного кислорода Барботаж O₂ при 0,3 л/мин с регулятором рабочего цикла DO Контроль рН Только монитор Перемешивание 100 об./мин

Жидкости биореактора собирали в асептических условиях в биотейнер на 10 л, разливали в 8 центрифужных флаконов емкостью по 1 л и центрифугировали при 10000 g в течение 20 минут при 4°C. Осветленные жидкости собирали в асептических условиях в биотейнер на 10 л и фильтровали через фильтр 0,8/0,2 мм в новый биотейнер на 10 л, а окончательный отфильтрованный собранный продукт хранили при 4°C.

Десять различных условий инактивации были исследованы при 5 мМ концентрации бинарного этиленимина (BEI) при 37°C в течение 72 часов, как показано в таблице 121. Были взяты образцы для мониторинга pH (таблица 122) и растворимости ORF2 PCV3.

Таблица 121

Контроль Контроль+
ВДИ 150 мМ
NaCl 350 мМ
NaCl 550 мМ
NaCl 50 мМ
MgCl₂ 100 мМ
MgCl₂ 200 мМ
MgCl₂ pH
7.0 pH
7.5 Бакуловирусный
сбор (мл) 220 220 220 220 220 220 220 220 220 220 2M MgCl₂ (мл) 0 0 0 0 0 6.3 12.5 25 0 0 5M Na Cl (мл) 0 0 7.5 17.5 27.5 0 0 0 0 0 1M Трис HCl,
pH 7.5 0 0 0 0 0 0 0 0 11.3 25 ВДИ (мл) 0 30 22.5 12.5 2.5 23.7 17.5 5 18.7 5 Общий объем (мл) 220 250 250 250 250 250 250 250 250 250

На фиг.24 показаны изображения инактивации в момент времени 72 часа.

Таблица 122

На фиг.25 показано сравнение условий инактивации антигена ORF2 BaculoG/PCV3 с помощью вестерн-блоттинга – после инактивации.

На фиг.26 показан флуоресцентный дот-блот PCV3 ORF2.

По данным этого исследования, низкий уровень ORF2 PCV3, продуцируемый в биореакторе, который аналогичен испытаниям в мешалках, и кинетика заражения свидетельствует о незначительном недостатке инокулята. После инактивации наблюдалась минимальная потеря ORF2 PCV3 из биореактора, поскольку каждое из условий оказывало минимальное влияние на растворимую ORF2, хотя MgCl₂ в концентрации 200 мМ мог иметь большее влияние на наблюдаемую потерю ORF2 PCV. Потери ORF2 PCV3 в жидкостях для сбора при хранении при 4°C в течение 9 дней не наблюдалось.

Пример 9

Вакцинация молодых свиней, рожденных путем кесарева сечения, лишенных молозива, инактивированной вакциной ORF2 PCV3, экспрессируемой бакуловирусом

В этом исследовании оценивали экспериментальную вакцину PCV3 ORF2, экспрессируемую инактивированным бакуловирусом, при введении 3-недельным молодым свиньям. Рандомизированное слепое исследование с вакцинацией/заражением было проведено с использованием 50 молодых свиней, полученных путем кесарева сечения, лишенных молозива («CDCD»), возрастом 22 дня на Д0. Молодые свиньи были снабжены подстилкой и произвольно распределены по экспериментальным группам, причем однопометники содержались в одном загоне. В Д0 поросятам внутримышечно вводили контрольный продукт или плацебо, соответствующее продукту, или экспериментальную вакцину. Поросят наблюдали ежедневно на предмет общего состояния здоровья и собирали кровь для оценки сероконверсии. Всех молодых свиней заражали через 14 дней после вакцинации гомогенатом ткани (который дал положительный результат на PCV3 при ПЦР), и вскрывали через четыре недели. Клинические наблюдения проводили ежедневно после заражения до завершения исследования (Д42), а кровь собирали еженедельно для оценки виремии (PCV3 с помощью ПЦР). При аутопсии внутренние органы оценивали на предмет макроскопических повреждений, а ткани собирали для гистопатологической оценки. Гистологические препараты окрашивали, исследовали с помощью RNAScope и оценивали.

На протяжении всего исследования весь персонал, участвовавший в сборе данных или выполнении лабораторных анализов, не знал, какое лечение будет назначено свиньям. Лечение проводил исследователь, который не участвовал в сборе данных.

Использование 20 животных в контрольной группе и группе вакцины, соответственно, согласуется с предыдущими исследованиями по лицензированию вакцинации против цирковируса свиней. Были включены дополнительные животные для учета естественной убыли молодых свиней CDCD перед контрольным заражением.

Свиней снабжали подстилкой и случайным образом распределяли для лечения, принимая отдельного поросенка за экспериментальную единицу.

Все рандомизации проводили с использованием SAS версии 9.4. Использовали пометы от шести (7 помётов) или восьми (1 помёт) молодых свиней. Для произвольного распределения в экспериментальную группу случайную вариацию генерировали для каждой молодой свиньи с использованием функции RANUNI в SAS. Затем идентификаторы молодых свиней были отсортированы по помету и различным значениям. В каждом помете трем (или четырем для помета с 8 молодыми свиньями) животным с наименьшими значениями вариабельности были присвоены Т01, а остальным - Т02. Во время фазы вакцинации молодых свиней в максимально возможной степени содержали по пометам, по три или четыре молодой свиньи на брудер, с использованием брудеров в трех помещениях. Во время фазы заражения, за исключением помета из 8 молодых свиней, молодых свиней содержали по пометам, по одному помету на загон, в одном из двух помещений. Помет с 8 однопометниками размещали в двух загонах по 6 и 2 однопометника, соответственно. Для контрольного содержания загоны были рандомизированы по местам и станкам в пределах помещения путем генерации случайных значений для каждого помета, сортировки по разным значениям и согласования отсортированного порядка с комбинациями мест-станков.

Фаза вакцинации. Двадцать пять молодых свиней, рожденных посредством кесарева сечения, лишенных молозива (CDCD), в возрасте приблизительно 3 недель вакцинировали либо вакциной ORF2 PCV3, экспрессированной с помощью бакуловируса, либо контрольной вакциной, подобранной в качестве плацебо. Было установлено, что титр вируса составлял 6,76 x 10⁶ TCID₅₀/мл. Инактивированный антиген готовили с 20% карбополом и разливали в окончательные контейнеры. Плацебо, используемое в качестве отрицательного контроля, получали таким же образом с инактивированным антигеном из бакуловируса отрицательного контроля. Вакцину или плацебо вводили внутримышечно каждому животному. Пуповинную кровь собирали у всех молодых свиней при родах (кесарево сечение; день -22). Сыворотку отделяли и тестировали на ДНК PCV3 и ДНК PCV2 с помощью ПЦР. Все образцы были отрицательными как по PCV3, так и по PCV2. На D-2 у всех молодых свиней брали кровь для сбора сыворотки, а затем вакцинировали PCV2 Ingelvac CircoFLEX®. Все образцы сыворотки были отрицательными при ПЦР как на PCV3, так и на PCV2, и серонегативными на M. hyopneumoniae и вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней.

Фаза заражения: всех животных заражали гомогенатом ткани, положительным по PCV3 (1 мл интраназально и 1 мл внутримышечно) через 14 дней после вакцинации. Гемоцианин лимфы улитки (KLH), эмульгированный в неполном адъюванте Фрейнда (ICFA), содержащем 1 мг KLH/мл, вводили внутримышечно за два дня до и через два дня после заражения (таблица 123). Гомогенат ткани, использованный для заражения, был проверен на наличие посторонних агентов с помощью количественной ПЦР и глубокого секвенирования. На 42-й день животных умерщвляли. При вскрытии собирали ряд тканей. К ним относятся мозг, сердце, почки, легкие, селезенка, толстая кишка, миндалины, трахеобронхиальный лимфатический узел (TBLN), мезентериальный лимфатический узел (MLN) и внешний подвздошный лимфатический узел (ILN).

Таблица 123. Дизайн исследования

Группа N Вакцинация KLH/ICFA Заражение KLH/ICFA Аутопсия Плацебо 25 Д0, 2 мл в/м (в шею справа) Д12, 2 мл в/м Д14, 1 мл и/н, 1 мл в/м Д16, 2 мл в/м Д42 Вакцина 25

В таблице 124 описан гомогенат ткани, используемый для заражения животных PCV3.

Таблица 124

Описание Гомогенат ткани, зараженной PCV3; серия № 3743-105, Ct = 9,5 Получение Замороженную ткань измельчали с использованием стерильной ступки и пестика, суспендировали в MEM и центрифугировали при 1000 g в течение 15 минут. Надосадочную жидкость фильтровали через фильтр 0,2 мкм и хранили при -70°C±10°C до использования. За день до заражения материал размораживали при 37°C, разливали в стерильные флаконы для вакцины и закрывали крышками. Дозировка и процедура заражения 1 мл интраназально, прикрепив кончик назального распылителя к люэровскому шприцу объемом 5 см³ и введя полную дозу 1 мл в одну ноздрю. 1 мл внутримышечно в шею слева на середине расстояния между основанием уха и плечевым суставом, используя стерильные шприцы подходящего размера и стерильные иглы. Тестирование Рутинное культивирование материала проводили на чашках с кровяным агаром при 37°C анаэробно и аэробно в течение 48 часов; роста не наблюдалось, и тест был признан удовлетворительным. Материал был протестирован способом ПЦР на наличие микоплазмы и PCV2; никаких загрязнений выявлено не было. Результат кПЦР PCV3 составил 9,1 log10 геномных копий/мл (Cq = 14,82). Глубокое секвенирование образцов (MiSeq_127 09Oct18) было завершено с использованием обработки как ДНК, так и РНК; секвенирование привело к извлечению полного генома PCV3 (99% нуклеотидов к PCV3 GB MG564174.1).

В таблице 125 предоставляет информацию о свиньях, использованных в исследовании.

Таблица 125

Характеристики Требования Вид и порода Свинья, коммерческая смешанная порода Возраст и пол Свиньи были 22-дневного возраста в D0 (рождены путем кесарева сечения), как самки, так и самцы. Диапазон массы тела Типичная масса тела свиней CDCD этого возраста Источник и собственность Свиньи CDCD были получены и выращены в Struve Labs International; 1603 Enterprise St., Мэннинг, Айова 51455 Количество 50 (семь пометов по 6 молодых свиней, один помет 8 молодых свиней) Идентификация Ушная бирка (с уникальным номером) Подготовительная обработка Образец венозной крови был взят у всех молодых свиней при рождении (пуповинная кровь на кесаревом сечении; D-22). Сыворотку ставили на лед или немедленно замораживали и тестировали на ДНК PCV3 и ДНК PCV2 с помощью ПЦР в ISU-VDL, чтобы установить серологический статус для всех поросят. Все образцы были отрицательными как по PCV3, так и по PCV2.
На D-2 у всех свиней брали кровь для сбора сыворотки, а затем вакцинировали PCV2 Ingelvac CircoFLEX®. Сыворотку немедленно ставили на лед или замораживали в BI AH USA-Ames и тестировали на ДНК PCV3 и ДНК PCV2 с помощью ПЦР в ISU-VDL. Все образцы были отрицательными при ПЦР как на PCV3, так на PCV2. Хранившиеся образцы сыворотки Д-2 (за исключением молодой свиньи № 18 и № 45 из-за отсутствия сыворотки) были представлены в ISU-VDL для подтверждения серонегативного статуса M. hyopneumoniae (отношение S/P <0,3) и вируса PRRSV (отношение S/P <0,4). Все образцы были отрицательными. Ветеринарная помощь и лечение Молодые свиньи получали лечебный кормовой рацион. На Д8 молодые свиньи получили дозу препарата Excede®, указанную на этикетке, перед отправкой в VRI. Из-за подозрения на бактериальный сепсис все оставшиеся молодые свиньи получали Байтрил (серия № AHO2X32, годен до Ноября 2021) в день 30 в левую сторону шею согласно указаниям на этикетке.

Все 50 молодых свиней соответствовали требованиям, изложенным выше, и исследователь провел оценку здоровья на Д-2, чтобы убедиться, что в исследование были включены только здоровые животные.

После начала исследования молодых свиней исключали только в случае травмы, болезни или смерти, которые могут повлиять на результат исследования. Две молодые свиньи были изъяты во время фазы вакцинации, и пять молодых свиней были изъяты во время фазы заражения.

Свинья № 5 (вакцинированная группа) наблюдалась в связи с отсутствием аппетита и снижением активности на Д6; свинья была умерщвлена и исключена из исследования на Д6. Вскрытие показало желтушную кожу, подкожную фасцию и фибрин на печени и селезенке с пятнистой поверхностью печени, и коллапс левой апикальной доли легкого. Тушу утилизировали способом компостирования.

Свинью № 4 (вакцинированная группа) усыпили и изъяли из исследования перед заражением на D14 из-за плохого состояния тела и хромоты на обеих задних ногах. При вскрытии макроскопических повреждений не наблюдалось. Тушу утилизировали путем сжигания.

Виремия: Виремию определяли как положительный результат на PCV3 с помощью ПЦР (пороговое значение цикла (Ct) <37, геномная эквивалентность 4,697 log для этого исследования). Виремию после заражения вакцинированных и контрольных животных оценивали с помощью количественной ПЦР. Все контрольные молодые свиньи были виремическими в каждой точке отбора проб во время фазы заражения (таблица 126). Три вакцинированных молодые свиньи имели положительные результаты на Д7 со значениями Ct от 35,6 до 36,7 (при ≥37 - пороговое значение для отрицательного результата), что, скорее всего, указывало на ложноположительный результат, учитывая, что все вакцинированные молодые свиньи были отрицательными на Д12 перед заражением. После заражения у двух вакцинированных молодых свиней не отмечалось виремии. В то время как до 91% вакцинированных молодых свиней действительно становились виремическими, нагрузка вируса (геномные копии) в крови была значительно снижена примерно на log у вакцинированных в каждый момент времени после заражения (P≤0,0050) по сравнению с контрольной группой (фиг.27).

Таблица 126. Частота и процент молодых свиней с виремией PCV3 в зависимости от лечения и дня

Наблюдения за общим состоянием здоровья: За всеми молодыми свиньями ежедневно наблюдали для оценки общего состояния здоровья с Д2 до Д14 с дополнительным наблюдением между 2 и 4 часами после вакцинации. Никаких клинических признаков не наблюдалось после вакцинации до Дня 6, когда у этой молодой свиньи № 5 (вакцинированная группа) наблюдалась потеря аппетита и снижение активности до изъятия из исследования по гуманным соображениям. На Д8 у молодых свиней № 12 (вакцинированная группа), № 15 (группа плацебо), № 36 (вакцинированная группа) и № 38 (группа плацебо) наблюдались грыжи. На Д9 молодая свинья №4 (вакцинированная группа) была обнаружена застрявшей между кормушкой и стенкой перед транспортировкой в VRI; в VRI у этой молодой свиньи была обнаружена хромота с опухшей правой задней ногой, которая прогрессировала до двусторонней хромоты на задние ноги на Д11, прежде чем она была изъята из исследования перед заражением на Д14.

Смертность после заражения: Молодых свиней, которые умерли или были усыплены после заражения перед тестированием на Д42, вскрывали. Две контрольные молодые свиньи (группа плацебо) и три вакцинированные молодые свиньи (вакцинированная группа) погибли или были умерщвлены во время фазы заражения. Молодая свинья № 7 (вакцинированная группа) была найдена мертвой на 26-й день. При аутопсии были выявлены закупорка менингеальных сосудов и увеличение ILN. Молодая свинья №2 (вакцинированная группа) была найдена мертвой на 30-й день. При аутопсии наблюдались хронически активный фиброзный и фибринозный перикардит и краниальная вентральная пневмония. Молодая свинья №19 (вакцинированная группа) была найдена мертвой на 31 день. У этой свиньи наблюдался маленький размер, при вскрытии не обнаруживались макроскопические повреждения, что свидетельствует о неспособности развиваться. Молодая свинья № 49 (группа плацебо) была найдена мертвой на 35 день, без предшествующих клинических признаков и с макроскопическими поражениями в виде легочного застойного явления в почках со скудным количеством белого экссудата. Молодая свинья № 15 (группа плацебо) была умерщвлена по гуманным соображениям на Д40. Эта свинья находилась в коме. Вскрытие показало умеренную гидроцефалию и диффузную гиперемию менингеальных сосудов. Ранее у этой молодой свиньи была атаксия в течение 7 дней и снижение активности в течение четырех предыдущих дней. Кроме того, у этой молодой свиньи наблюдались тяжелые респираторные симптомы (шумное дыхание) на Д35 и ухудшение состояния тела в течение 10 дней до эвтаназии.

Через 2-4 часа после заражения, а затем ежедневно во время фазы заражения, всех молодых свиней исследовали один раз в день на предмет клинических признаков, связанных с PCV3, как описано в таблице 127.

Таблица 127

Показа-тель по шкале Неврологические признаки Состояние тела Диарея Респираторные признаки Дерматит 0
Нет Норма Норма Норма Норма Норма 1
Умерен-ный Угнетение функции = от снижения активности до летаргии, требуется физическая стимуляция, чтобы заставить двигаться Снижен аппетит, но еще ест, слегка худее, по сравнению с находящимися рядом животными Наблюдается слегка размягченный стул Умеренное повышение частоты дыхания Красно-фиолетовые пятна на коже, особенно заметные на задних ногах 2
Средний Атаксия = неспособность координировать мышечную активность, спастические движения головы, конечностей и/или торса Не ест, явно выдаются ребра и позвоночник Наблюдается водянистый стул, явное покраснение перианальной области Заметное повышение частоты дыхания Слегка выступающие над кожей красно-фиолетовые пятна на коже, на задних ногах, промежности или животе 3
Тяжелый Тремор = непроизвольные повторные движения мышц Истощение Наблюдается очень водянистый стул Шумное дыхание Красно-фиолетовые пятна покрывают большую часть тела 4
Тяжелый Лежачий = лежит, не может встать при воздействии физического стимула 5
Тяжелый Судороги = билатеральные тонические или клонические сокращения мышц, приводящие к частичной или полной потере сознания

Клинические признаки наблюдались между Д21 и Д40, в большинстве случаев это небольшое снижение функции (неврологической) и умеренное увеличение частоты дыхания (таблица 128). Во время фазы заражения не отмечено диареи и дерматита.

Таблица 128

Масса тела: Всех молодых свиней взвешивали перед вакцинацией, перед заражением, через одну неделю после заражения и перед вскрытием трупа. Значения массы тела, рассчитанные по способу наименьших квадратов, у вакцинированной группы были численно (незначительно) больше в каждый момент времени (таблица 129).

Таблица 129

Группа Д2 Д12 Д21 Д42 Контроль 4,04 кг 7,13 кг 13,20 кг 39,11 кг Вакцина 4,06 кг 7,40 кг 13,78 кг 40,70 кг

Температура тела: Температуру тела измеряли самокалибрующимся ректальным термометром и с помощью внутрикожных микрочипов. Температуру измеряли три раза перед контрольным заражением, для установления исходного уровня, затем через 2-4 часа после контрольного заражения, и один раз в день до 20-го дня. Средние температуры для опытных групп были в пределах 1°F в каждый из дней сбора (фиг. 28).

Общая оценка поражений: После заражения у всех молодых свиней проводили аутопсию в случае смерти или во время запланированного теста на изъятие (Д42). Исследователь провел патологоанатомическое исследование всех основных систем органов. Были добавлены конкретные патологические описания лимфатических узлов (трахеобронхиальных, наружных паховых, брыжеечных), почек, сердца и легких (таблица 130).

Таблица 130

Показа-тель Лимфоузлы Легкие Дерматит Почки Сердце 0
Нет Норма Норма Норма Норма Норма 1
Умерен-ный Увеличены, но менее чем в 2 раза по сравнению с нормой Интерстициальная пневмония Красно-фиолетовые пятна на коже, наиболее заметные на задних ногах Увеличены Увеличено 2
Средний Увеличены в 2-5 раз по сравнению с нормой Мультифокальные области консолидации Слегка выступающие над кожей красно-фиолетовые пятна, на задних ногах и промежности, или на животе Мультифокальные белые или красные точечные поражения с увеличением или без него Присутствуют мультифокальные бледные (некротические) или красные (геморрагические) области 3
Тяжелый Увеличены более чем в 5 раз по сравнению с нормой Диффузная консолидация с интерстициальной пневмонией Красно-фиолетовые пятна, покрывающие большую часть тела

При вскрытии наблюдали очень мало повреждений. Никаких повреждений сердца, почек или кожи (дерматит) не наблюдалось. Мультифокальная гиперемия легких наблюдалась у трех вакцинированных молодых свиней, одна из которых умерла. Комментарии подтвердили, что поражения минимальны (1%). Остальные поражения представляли увеличенные лимфатические узлы у 10/25 контрольных молодых свиней и 14/23 вакцинированных молодых свиней.

Сбор ткани и гистологическая оценка: При вскрытии трупа исследователь забирал образцы мозга (мозжечок), сердца (пораженный участок, в противном случае - поперечный разрез правого и левого желудочков), почки (поперечный разрез), легкого (пораженный участок, в противном случае - добавочную долю), селезенки (поперечный разрез), толстой кишки, тонкой кишки, миндалин, трахеобронхиального лимфатического узла (TBLN), брыжеечного лимфатического узла (MLN) и пахового лимфатического узла (ILN). Все ткани молодых свиней сохраняли в контейнерах, заполненных достаточным количеством 10% забуференного раствора формалина. Через 24 часа в 10% забуференном растворе формалина ткани переносили в 70% этанол и отправляли для подготовки гистологических препаратов в ISU VDL. Образцы тканей обрабатывали для стандартного окрашивания гематоксилином и эозином (H&E). На каждом срезе H&E оценивали наличие поражений или их отсутствие. Если были отмечены отклонения, предоставляли краткое описание морфологического диагноза вместе с оценкой степени тяжести в соответствии с таблицей 131.

Таблица 131

Ткань Тяжесть поражения Нет (0) Умеренная (1) Средняя (2) Лимфатические узлы Норма – нет значительных гистологических нарушений Лимфаденит, грануломатоз, диффузный, хронический с ≤5 многоядерных гигантских клеток и внутриочаговых липидных вакуолей Менингоэнцефалит, лимфоплазмоцитарный, мультифокальный, подострый, средний периваскулит с >6 лимфоплазмоцитарных очагов и/или периваскулярных агрегатов Мозг и мозжечок Норма - без существенных гистологических нарушений Менингоэнцефалит, лимфоплазмоцитарный, мультифокальный, подострый, минимальный периваскулит с ≤5 лимфоплазмоцитарных очагов и/или периваскулярных агрегатов Лимфаденит, грануломатоз, диффузный, хронический, тяжелый с >6 многоядерных гигантских клеток. Миндалины Норма - без существенных гистологических нарушений Тонзиллит, грануломатоз, диффузный, хронический, средний с ≤5 многоядерных гигантских клеток. Лимфаденит, грануломатоз, диффузный, хронический, тяжелый с >6 многоядерных гигантских клеток Сердце Норма - без существенных гистологических нарушений Миокардит, лимфоплазмоцитарный, мультифокальный, подострый, минимальный периваскулит с ≤5 лимфоплазмоцитарных очагов и/или периваскулярных агрегатов Миокардит, лимфоплазмоцитарный, мультифокальный, подострый, средний периваскулит с >6 лимфоплазмоцитарных очагов и/или периваскулярных агрегатов Кожа Норма - без существенных гистологических нарушений Интерстициальная пневмония, лимфоплазмоцитарный, мультифокальный, подострый, минимальный периваскулит с ≤5 лимфоплазмоцитарных очагов и/или периваскулярных агрегатов Интерстициальная пневмония, лимфоплазмоцитарный, мультифокальный, подострый, средний периваскулит с >6 лимфоплазмоцитарных очагов и/или периваскулярных агрегатов Печень Норма - без существенных гистологических нарушений Гепатит, лимфоплазмоцитарный, мультифокальный, подострый, минимальный периваскулит с ≤5 лимфоплазмоцитарных очагов и/или периваскулярных агрегатов Гепатит, лимфоплазмоцитарный, мультифокальный, подострый, средний периваскулит с >6 лимфоплазмоцитарных очагов и/или периваскулярных агрегатов Селезенка Норма - без существенных гистологических нарушений Спленит, лимфоплазмоцитарный, мультифокальный, подострый, минимальный периваскулит с ≤5 лимфоплазмоцитарных очагов и/или периваскулярных агрегатов Спленит, лимфоплазмоцитарный, мультифокальный, подострый, средний периваскулит с >6 лимфоплазмоцитарных очагов и/или периваскулярных агрегатов Почки Норма - без существенных гистологических нарушений Интерстициальный нефрит, лимфоплазмоцитарный, мультифокальный, подострый, минимальный периваскулит с ≤5 лимфоплазмоцитарных очагов и/или периваскулярных агрегатов Интерстициальный нефрит, лимфоплазмоцитарный, мультифокальный, подострый, средний периваскулит с >6 лимфоплазмоцитарных очагов и/или периваскулярных агрегатов Тонкая кишка Норма - без существенных гистологических нарушений Интерстициальный серозит, лимфоплазмоцитарный, мультифокальный, подострый, минимальный периваскулит с ≤5 лимфоплазмоцитарных очагов и/или периваскулярных агрегатов Интерстициальный серозит, лимфоплазмоцитарный, мультифокальный, подострый, средний периваскулит с >6 лимфоплазмоцитарных очагов и/или периваскулярных агрегатов Толстая кишка Норма - без существенных гистологических нарушений Интерстициальный серозит, лимфоплазмоцитарный, мультифокальный, подострый, минимальный периваскулит с ≤5 лимфоплазмоцитарных очагов и/или периваскулярных агрегатов Интерстициальный серозит, лимфоплазмоцитарный, мультифокальный, подострый, средний периваскулит с >6 лимфоплазмоцитарных очагов и/или периваскулярных агрегатов

Не наблюдали гистологических повреждений миндалин, TBLN, MLN или селезенки у какой-либо молодой свиньи. Большинство молодых свиней имели по меньшей мере легкие гистологические поражения ILN (таблица 132).

В целом, гистологические поражения головного мозга (таблица 133), почек (таблица 134), сердца (таблица 135) и легких (таблица 136) обычно были легкими, и только 2/25 контрольных молодых свиней имели гистологические поражения кишечника, одна -тонкой кишки (таблица 137) и одна - толстой кишки (таблица 138). Две молодые свиньи с гистологическими поражениями головного мозга были обнаружены мертвыми во время исследования с макроскопическими поражениями в виде менингита (№15 [группа плацебо] - гнойный и лимфоцитарный менингит и № 7 [вакцинированная группа] - бактериальный хронический активный менингит). Четыре молодые свиньи в группе плацебо и две молодые свиньи в вакцинированной группе имели поражения в двух тканях. В целом 92% контрольных молодых свиней имели гистологические нарушения, и 87% вакцинированных молодых свиней имели гистологические нарушения (таблица 139).

Таблица 132. Частота и тяжесть гистологических поражений паховых лимфатических узлов

Группа Норма Умеренные Средние Тяжелые Контроль 4/25 (16%) 12/25 (48%) 8/25 (32%) 1/25 (4%) Вакцина 5/23 (22%) 13/23 (57%) 4/23 (17%) 1/23 (4%)

Таблица 133. Частота и тяжесть гистологических поражений головного мозга

Группа Норма Умеренные Контроль 24/25 (96%) 1/25 (4%) Вакцина 22/23 (96%) 1/23 (4%)

Таблица 134. Частота и тяжесть гистологических поражений почек

Группа Норма Умеренные Средние Контроль 22/25 (88%) 3/25 (12%) Вакцина 19/23 (83%) 3/23 (13%) 1/23 (13%)

Таблица 135. Частота и тяжесть гистологических поражений сердца

Группа Норма Умеренные Контроль 20/25 (80%) 5/25 (20%) Вакцина 20/23 (87%) 3/23 (13%)

Таблица 136. Частота и тяжесть гистологических поражений легких

Группа Норма Умеренные Контроль 24/25 (96%) 1/25 (4%) Вакцина 21/23 (91%) 2/23 (9%)

Таблица 137. Частота и тяжесть гистологических поражений толстой кишки

Группа Норма Умеренные Контроль 24/25 (96%) 1/25 (4%) Вакцина 23/23 (100%) 0/23 (0%)

Таблица 138. Частота и тяжесть гистологических поражений тонкой кишки

Группа Норма Умеренные Контроль 24/25 (96%) 1/25 (4%) Вакцина 21/21 (100%) 0/21 (0%)

Таблица 139. Частота гистологических поражений по группам

Группа Если имеется Контроль 23/25 (92%) Вакцина 20/23 (87%)

Репликацию вируса в тканях вакцинированных и получавших плацебо животных после заражения оценивали с помощью RNAScope. RNAscope позволяет осуществлять специфическую маркировку и визуализацию вирусной мРНК. RNAscope обнаруживает реплицирующийся вирус в ткани, в отличие от иммуногистохимии или ПЦР, которые идентифицируют генетический материал вируса независимо от того, жив ли вирус или мертв. Ткани фиксировали и повышали проницаемость, чтобы обеспечить доступ к зонам-мишеням для вирусной репликации внутри клеток. Затем гибридизовали пару олигонуклеотидных зондов, специфичных к РНК PCV3, так, чтобы они располагались в непосредственной близости друг от друга на РНК-мишени PCV3. Детекция мРНК означает, что вирус PCV3 реплицируется, а не просто обнаруживает генетический материал PCV3. За этим последовала гибридизация молекулы амплификации сигнала (SAM), которая распознает пару специфических олигонуклеотидных зондов. В неспецифических реакциях два зонда не должны располагаться рядом друг с другом, предотвращая их гибридизацию с SAM. Сами SAM конъюгированы с ферментом. Как и в анализах гибридизации in situ, сигналы выявляют с использованием хромогенного субстрата с последующим исследованием слайдов под микроскопом в светлом поле. Слайды для РНК-анализа PCV3 окрашивали, считывали и оценивали в соответствии с таблицей 140.

Таблица 140. Шкала оценки RNAScope

Оценка Описание 0 = норма Ноль клеток с окрашиванием PCV3 1 = умеренная <10% клеток с окрашиванием PCV3 2 = средняя окрашивание 10-50% клеток с PCV3 3 = тяжелая > 50% клеток с окрашиванием PCV3

Никаких доказательств репликации PCV3 не наблюдалось ни в каких срезах головного мозга/мозжечка какой-либо молодой свиньи. Почти все контрольные молодые свиньи имели по меньшей мере умеренное окрашивание PCV3 RNAScope в почках (таблица 141), сердце (таблица 142), толстой кишке (таблица 143) и тонкой кишке (таблица 144), в то время как только одна вакцинированная свинья имела слабое окрашивание в каждой из четырех тканей, и три других молодых свиньи имели слабое окрашивание в почках.

Все контрольные молодые свиньи имели окрашивание селезенки от умеренного до среднего (таблица 145) и от умеренного до сильного окрашивания ILN (таблица 146) и легких (таблица 147). Напротив, у шести вакцинированных молодых свиней не было окрашивания при RNAscope ни в одной ткани (в том числе у трех молодых свиней, умерших в фазе заражения). При максимальном окрашивании у молодых свиней с помощью RNAscope 48% контрольных животных имели показатели тяжелой степени, а остальные 52% - средней тяжести, по сравнению с только 9% вакцинированных молодых свиней, имеющей показатели тяжелой степени, и 17% - средней тяжести. Все контрольные молодые свиньи имели по меньшей мере одну ткань с реплицирующимся вирусом PCV3, в то время как 71% вакцинированных молодых свиней имели по меньшей мере одну ткань с реплицирующимся вирусом PCV3 (таблица 148). Существенным результатом исследования является разница между контролем и вакциной при оценке тканей с помощью RNAScope (таблица 149). RNAscope обнаруживает реплицирующийся вирус в ткани, в отличие от иммуногистохимии или ПЦР, которые идентифицируют генетический материал вируса, является ли он живым или мертвым. Поразительно, что все контрольные молодые свиньи имели окрашивание селезенки от умеренного до среднего, а ILN и легких - от умеренного до сильного. Напротив, у шести вакцинированных молодых свиней не было окрашивания с помощью RNAscope ни в одной ткани. Все ткани вакцинированных животных продемонстрировали значительную профилактику инфекции.

Таблица 141. Частота показателей, полученных посредством RNAscope, в почках

Группа Норма Умеренные Контроль 2/25 (8%) 23/25 (92%) Вакцина 19/23 (83%) 4/23 (17%)

Таблица 142. Частота показателей, полученных посредством RNAscope, в сердце

Группа Норма Умеренные Средние Контроль 4/25 (16%) 20/25 (80%) 1/25 (4%) Вакцина 22/23 (96%) 1/23 (4%)

Таблица 143. Частота показателей, полученных посредством RNAscope, в толстой кишке

Группа Норма Умеренные Контроль 4/25 (16%) 21/25 (84%) Вакцина 22/23 (96%) 1/23 (4%)

Таблица 144. Частота показателей, полученных посредством RNAscope, в тонкой кишке

Группа Норма Умеренные Контроль 9/25 (36%) 23/25 (92%) Вакцина 20/21 (83%) 1/21 (17%)

Таблица 145. Частота показателей, полученных посредством RNAscope, в селезенке

Группа Норма Умеренные Средние Тяжелые Контроль 13/25 (52%) 12/25 (48%) Вакцина 9/23 (39%) 13/23 (57%) 1/23 (4%)

Таблица 146. Частота показателей, полученных посредством RNAscope, в паховых лимфоузлах

Группа Норма Умеренные Средние Тяжелые Контроль 2/24 (8%) 16/24 (67%) 6/24 (25%) Вакцина 9/23 (39%) 8/23 (35%) 6/23 (26%)

Таблица 147. Частота показателей, полученных посредством RNAscope, в легких

Группа Норма Умеренные Средние Тяжелые Контроль 4/25 (16%) 11/25 (44%) 10/25 (40%) Вакцина 13/23 (57%) 5/23 (22%) 3/23 (13%) 2/23 (9%)

Таблица 148. Частота показателей по шкале RNAscope

Группа Если имеется Контроль 25/25 (100%) Вакцина 17/23 (71%)

Таблица 149. Статистические сравнения результатов анализа ткани посредством RNAscope

Исследование было признано достоверным на основании того, что контрольные молодые свиньи оставались серонегативными по PCV3 в течение периода вакцинации. Клиническое заболевание проявлялось клиническими признаками снижения функции (неврологической) и увеличением частоты дыхания между 7 и 26 днями после заражения, показателями смертности, привеса, виремии, крупных повреждений, микроскопическими признаками [00653] Статистический анализ данных проводили с использованием SAS версии 9.4 (SAS, Кэри, Северная Каролина / США, SAS Institute, Inc.). Перечни данных и сводные статистические данные по группам лечения были сгенерированы для всех переменных, если это необходимо.

Для аутопсии, гистопатологии, клинических наблюдений, гипертермии и RNAscope PCV3 способы анализа данных варьировали в зависимости от распределения данных для оцениваемой переменной. Как правило, данные анализировали с использованием способов, описанных ниже для доли профилактики (PF) и точного критерия Фишера, и/или доли смягчения (MF). Для некоторых переменных почти все из всех ответов относились к одной категории, поэтому анализ не проводили. Смертность анализировали аналогично, за исключением того, что анализ MF не проводили. Для клинических наблюдений с целью выявления пораженных животных использовали определение случая в течение двух или более дней с отклонениями от нормы клинических наблюдений. Кроме того, с использованием способа MF оценивали количество и продолжительность патологических клинических наблюдений. Что касается гипертермии, животные со значениями температуры на 1 градус или выше исходного уровня были идентифицированы как гиперчувствительные в течение отдельного дня.

Данные, проанализированные с использованием способов PF и точного анализа Фишера, если они еще не были дихотомическими, были разделены для получения бинарного результата (например, нормальный/ненормальный) для каждого животного. Бинарные данные были обобщены по группам с помощью частотного распределения. Кроме того, для бинарных данных был оценен относительный риск (RR) и рассчитан 95% доверительный интервал (CI) с использованием критерия Кохрана - Мантеля - Хэнзеля в процедуре SAS PROC FREQ. Затем RR и связанный CI были переведены в шкалу PF (1 - RR) для представления. Для анализа PROC FREQ использовали стратификацию по помету. Статистическая значимость была достигнута, если 95% доверительный интервал для RR не включал 0. В способе MF использовали стратифицированный подход начальной загрузки с использованием интервала максимальной плотности для построения 95% доверительного интервала для MF на основе распределения начальной загрузки. Стратификацию производили по помету. Статистическая значимость была достигнута, если в доверительном интервале не было 0.

Данные виремии анализировали с использованием обобщенного теста Фридмана (блокирование по помету) для сравнения групповых распределений виремии (количественное) в каждый момент времени после заражения. P-значения меньше 0,05 считаются статистически значимыми.

Вес до вакцинации (день -2) анализировали с использованием линейной смешанной модели по группе (фиксированный эффект), по помету (случайный эффект) и по остатку. Были оценены средние значения наименьших квадратов, и групповые сравнения были оценены с помощью P-значений. При необходимости были построены 95% доверительные интервалы. Массы тела фазы испытания (дни 12, 21, 42) были проанализированы с использованием линейной смешанной модели по группе, дню и взаимосвязи группа/день (фиксированные эффекты), помещению для испытания и станку в помещении для испытания (случайные эффекты) и неструктурированной ковариацией, представляющей собой повторяющиеся измерения на уровне каждого из животных. Были оценены средние значения наименьших квадратов, и сравнения групп были оценены с помощью P-значений по дням исследования. Среднесуточный привес устанавливали и оценивали с использованием линейного контраста условий фиксированного эффекта. При необходимости были построены 95% доверительные интервалы. P-значения меньше 0,05 считаются статистически значимыми.

Экспериментальная вакцина с инактивированным бакуловирусом, экспрессирующим ORF2 PCV3, значительно предотвращала репликацию вируса, выявленную в ILN, селезенке и легких и значительно уменьшала количество реплицирующегося вируса PCV3, обнаруживаемого во всех тканях. Вакцина также численно снизила смертность, клинические признаки, макроскопические поражения и гистологические нарушения в дополнение к численному увеличению массы тела после фазы заражения. Эти данные демонстрируют клинически значимое заболевание, сопоставляя клиническую картину с доказательствами репликации вируса PCV3 в тканях при оценке с помощью RNAscope.

Две контрольные молодые свиньи погибли во время фазы заражения; при аутопсии ни одной из молодых свиней предварительный диагноз не был установлен. Ткани ILN, селезенки и легких обеих молодых свиней имели средние или высокие показатели присутствия PCV3, а почки, сердце, толстый и тонкий кишечник имели показатель PCV3 RNAscope, равный 1. Напротив, три вакцинированных молодой свиньи, умершие после заражения, имели предварительный диагноз бактериальной септицемии или неспособности развиваться, что часто встречается у молодых свиней CDCD. Этот диагноз подтверждается результатами RNAscope, которые были отрицательными для всех тканей, поэтому вакцинированные молодые свиньи, умершие после заражения, не считаются умершими из-за PCV3.

При оценке клинических признаков 14/25 (56%) контрольных молодых свиней прошли клиническое наблюдение после заражения по сравнению с 11/23 (48%) вакцинированными молодыми свиньями. Ограниченное количество клинических признаков соответствует ожиданиям от лабораторной оценки цирковируса. Клинические наблюдения во время этого исследования аналогичны тем, что исторически наблюдались при лабораторной модели заражения PCV2.

Та же самая тенденция наблюдалась с массой тела; по способу наименьших квадратов средняя масса тела вакцинированных была на 0,92 кг больше, чем в контрольной группе, вне теста, что указывает на лучшее общее состояние здоровья (гидратация и аппетит). В то время как до 91% вакцинированных молодых свиней действительно становились виремическими, нагрузка вируса (геномных копий) в крови значительно снижалась примерно на log у вакцинированных в каждый момент времени после заражения (P≤0,0050; фиг.28) по сравнению с контролем. Немногочисленные поражения были обнаружены во время общей оценки вне теста и во время гистологического исследования. Большинство макроскопических поражений представляли собой увеличенные лимфатические узлы (10/25 контрольных молодых свиней и 14/23 вакцинированных молодых свиней), а большинство микроскопических поражений представляли собой умеренные поражения ILN.

RNAScope обнаруживает реплицирующийся вирус в ткани в отличие от иммуногистохимии или ПЦР, которые идентифицируют генетический материал вируса, независимо от того, реплицируется он или мертв. Поразительно, что все контрольные молодые свиньи имели окрашивание селезенки от умеренного до среднего, а ILN и легкого - от умеренного до сильного. Напротив, у шести вакцинированных молодых свиней не было окрашивания RNAScope ни в одной ткани. Все ткани вакцинированных животных продемонстрировали значительную профилактику инфекции (как путем анализа предотвращенной доли, так и анализа гипотез), а ILN, селезенка и легкое также продемонстрировали снижение степени тяжести за счет доли с ослабленными симптомами.

Серологические результаты были отрицательными для всех образцов во все дни. Это может быть связано с коротким интервалом между вакцинацией и контрольным заражением.

Экспериментальная вакцина с инактивированным бакуловирусом, экспрессирующим ORF2 PCV3, значительно предотвращала репликацию вируса, выявляемую в ILN, селезенке и легких, и значительно уменьшала количество реплицирующегося вируса PCV3, обнаруживаемого во всех тканях. Вакцина также численно снизила смертность, клинические признаки, макроскопические поражения и гистологические нарушения в дополнение к численному увеличению массы тела после фазы заражения. Эти данные демонстрируют клинически значимое заболевание, сопоставляя клиническую картину с оценкой и показателем RNAscope. В целом экспериментальная вакцина из убитого бакуловируса, экспрессирующего ORF2 PCV3, оказалась эффективной против PCV3.

Пример 10

Репродуктивное исследование PCV3 у свиноматок после опороса

Фаза вакцинации: в этом исследовании использовали 46 молодых свиней до осеменения (возраст ≥5 месяцев). Все самки были проверены на отсутствие вируса до вакцинации способом кПЦР на следующие агенты: PCV3, PCV2, атипичный пестивирус молодых свиней (APPV), вирус трансмиссивного гастроэнтерита (TGEV), вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV) и парвовирус молодых свиней (PPV). Было также показано, что животные являются серонегативными в отношении гриппа A и M. hyopneumoniae.

Свиньи были разделены на три группы лечения для этого исследования: 1 = отсутствие воздействия и отсутствие заражения PCV3 (NTX), получение плацебо с заражением PCV3, и вакцинация вакциной PCV3 ORF2 с заражением PCV3. Молодых свиней до осеменения вакцинировали на Д0 и Д21 в зависимости от их экспериментальных групп (2 мл внутримышечно в правую сторону шеи). Свиньям в экспериментальной группе NTX вводили вакцину плацебо и содержали отдельно от свинок других экспериментальных групп. Синхронизацию эструса осуществляли введением MATRI™ (альтреногеста) с кормом с 17 по 30 день. На 30 день P.G.600® (сывороточный гонадотропин [PMSG] и хорионический гонадотропин) вводили всем свиньям. Животных оценивали на эструс, и они были осеменены между 35-42 днями. У тридцати шести свиноматок была подтверждена беременность на D77 (D35 беременности), и их использовали в этом исследовании (таблица 150).

Таблица 150. Группы лечения и дизайн исследования

Группа лечения Лечение n Заражение Опорос Аутопсия NTX Плацебо 2 Нет Д147-Д159
данные помета и аутопсии/сбор ткани/крови Д168-Д180 (21 день после опороса)
данные помета и аутопсии/сбор ткани/крови Плацебо 12 Д83 (примерно 40 дней гестации), гомогенат ткани с PCV3, по 2 мл в/м и и/н Вакцина Вакцина 19

Фаза заражения: всех животных в группах, получавших плацебо и вакцину, заражали гомогенатом ткани, положительным по PCV3, на сроке 40 дней беременности. Гомогенат ткани PCV3 вводили по 2 мл внутримышечно и интраназально каждому животному. Гемоцианин лимфы улитки (KLH), эмульгированный в неполном адъюванте Фрейнда (ICFA), содержащем 1 мг KLH/мл, вводили за два дня до и через два дня после заражения. Гомогенат ткани, использованный для заражения, был проверен на наличие посторонних агентов с помощью количественной ПЦР и глубокого секвенирования.

Виремия: у свиноматок брали сыворотку на протяжении всего исследования и оценивали на виремию с помощью кПЦР (см. таблицу 151 и фиг.28). Цифры, выделенные жирным шрифтом в верхнем ряду таблицы 151, указывают соответствующий день исследования. Номера в таблице 151, выделенные жирным шрифтом, соответствуют измеренному количеству геномных копий PCV3/мл.

Три молодые свиньи в вакцинированной группе показали виремию на D110. Отсутствие виремии на D103 и D117 может указывать на то, что это показание было либо ложноположительным, либо было эффектом вакцины в отношении подавления репликации вируса. Аналогичным образом, одна из двух свиноматок NTX, не подвергавшихся заражению, показала виремию на D110. Животных NTX содержали отдельно, и отсутствие виремии на D103 и D117 может указывать на то, что эти показания могут быть ложноположительными. Все свиноматки, получавшие плацебо, показали виремию после заражения и продолжали иметь виремию до дня опороса. В целом, данные о виремии у свиноматок показывают, что вакцина способна подавить репликацию вируса у свиноматок.

Клинические признаки: Все молодые свиньи до осеменения были переведены на опорос. Во время опороса поросят определяли как здоровых, мумифицированных, слабых, мертворожденных и подвергшихся аутолизу. Также регистрировали любую смертность от раздавливания в первые три дня после опороса. Процент мумифицированных показан на фиг.30. По одной свиноматке в группах вакцины и плацебо не опоросились.

Согласно фигуре 30, наблюдается явное сокращение количества мумий в группе вакцины по сравнению с группой плацебо. У одной из двух свиноматок в группе NTX был один мумифицированный плод, и у обеих свиноматок был один мертворожденный поросенок.

PCV3 общепризнан репродуктивным заболеванием. В репродуктивном исследовании свиноматок вакцинировали, проводили вторичную иммунизацию и осеменяли, чтобы оценить эффект заражения PCV3. Экспериментальная вакцина с экспрессией инактивированным бакуловирусом ORF2 PCV3, по-видимому, почти полностью исключает репликацию вируса у свиноматок. Более того, при опоросе у вакцинированных свиноматок количество мумий сократилось до менее чем 4%. Это сокращение может иметь значительные экономические последствия для производителей свиней.

Пример 11

Получение мутанта ORF2 PCV3 в петле FG для усиления сборки вирусоподобных частиц

Ряд последовательностей капсида цирковируса выравнивали с капсидом цирковируса молодых свиней 3 типа (PCV3) и двумя последовательностями, по которым были доступны структурные данные: капсидом цирковируса молодых свиней типа 2 (PCV2) и капсидом вируса болезни клюва и пера (BFDV). Оценка выравниваний со структурными данными показала, что, несмотря на расхождение аминокислотных последовательностей капсида между PCV2 и BFDV, расшифрованные структуры были очень похожи. Это позволяет предположить, что структуры капсидов цирковирусов могут быть подобными, несмотря на расхождение их последовательностей (Фиг.31 и 32).

Кроме того, капсид PCV3 был единственной выровненной последовательностью цирковируса, которая содержала большие количества положительного заряда в петле FG, которая находится на поверхности 5-го порядка образования капсида PCV3. Большое количество положительного заряда в этой области может привести к силам отталкивания в отсутствии нуклеиновой кислоты, как и следовало ожидать от вирусоподобных частиц (VLP). Таким образом, лизины и гистидин в этой петле были заменены на аминокислоты из капсида PCV2 (Фиг.32). Эта последовательность была названа PCV3 ORF2 FG (SEQ ID NO: 6).

Последовательность была синтезирована в Genscript и клонирована для рекомбинантных бакуловирусов для оценки экспрессии ORF2 PCV3 и сборки в VLP.

Пример 12

Получение мутанта ORF2 PCV3 в нативном стоп-кодоне и удлинение С-конца для усиленной сборки VLP

Оценка выравниваний со структурными данными, описанными в примере 13, дополнительно показала, что капсид PCV3 имеет самую короткую С-концевую последовательность из всех выровненных последовательностей капсида цирковируса. С-конец капсидных белков PCV2 и BFDV выступает из капсида. Короткая гидрофобная природа С-конца капсида PCV3 может привести к тому, что С-конец будет скрыт в капсиде, и может привести к нестабильности VLP в отсутствии нуклеиновой кислоты. Таким образом, нативный стоп-кодон для капсидного белка PCV3 был подвергнут мутации, и С-конец был удлинен до следующего стоп-кодона в вирусной последовательности (фиг. 33). Эта последовательность была названа PCV3 ORF2 PC (SEQ ID NO: 7).

Последовательность синтезировали в Genscript и клонировали для рекомбинантных бакуловирусов для оценки экспрессии ORF2 PCV3 и сборки в VLP.

Пример 13

Данные о заражении для мутантных кандидатов ORF2 PCV3 у молодых свиней CDCD

Фаза вакцинации. Двадцать пять молодых свиней, рожденных кесаревым сечением, лишенных молозива (CDCD), в возрасте приблизительно 3 недель вакцинируют либо вакциной ORF2 бакуловируса PCV3 с повышенной экспрессией, либо контрольной вакциной, подобранной в качестве плацебо. Пуповинную кровь собирают у всех молодых свиней при родах (кесарево сечение; Д-22). Сыворотку отделяют и тестируют на ДНК PCV3 и ДНК PCV2 с помощью ПЦР. На D-2 у всех молодых свиней берут кровь для сбора сыворотки, а затем вакцинируют PCV2 Ingelvac CircoFLEX®.

Фаза заражения: всех животных заражают гомогенатом ткани, положительным по PCV3, через 14 дней после вакцинации. Гемоцианин лимфы улитки (KLH), эмульгированный в неполном адъюванте Фрейнда (ICFA), содержащем 1 мг KLH/1 мл, вводят за два дня до и через два дня после заражения (таблица 152). Гомогенат ткани, используемый для заражения, проверяют на посторонние агенты с помощью КПЦР и глубокого секвенирования. Животных умерщвляют на 42-й день. При аутопсии собирают ряд тканей, включая мозг, сердце, почки, легкие, селезенку, толстую кишку, миндалины, трахеобронхиальный лимфатический узел (TBLN), мезентериальный лимфатический узел (MLN) и внешний подвздошный лимфатический узел (ILN).

Таблица 152. Дизайн исследования

Группа N Вакцинация KLH/ICFA Заражение KLH/ICFA Аутопсия Плацебо 25 Д0, 2 мл в/м (в шею справа) Д12, 2 мл в/м Д14, 1 мл и/н, 1 мл в/м Д16, 2 мл в/м Д42 Вакцина 25

Лабораторная фаза

Виремия: Виремию после заражения вакцинированных и контрольных животных оценивают с помощью количественной ПЦР. После заражения все контрольные молодые свиньи являются виремическими. Нагрузка по виремии (количество геномных копий/мл) полностью исключена у вакцинированных.

Клинические признаки: Репликацию вируса в тканях вакцинированных и получавших плацебо животных после заражения оценивают с помощью RNAScope. RNAScope - это недавно разработанная технология, которая позволяет специально маркировать и визуализировать вирусную мРНК. RNAScope обнаруживает реплицирующийся вирус в ткани, в отличие от иммуногистохимии или ПЦР, которые идентифицируют генетический материал вируса, независимо от того, живой он или мертвый. Ткани фиксируют и пермеабилизуют, чтобы обеспечить доступ к зонам-мишеням для вирусной репликации внутри клеток. Затем гибридизуют пару олигонуклеотидных зондов, специфичных к РНК PCV3, так, чтобы они располагались в непосредственной близости друг от друга на РНК-мишени PCV3. (Детекция матричной РНК означает репликацию вируса PCV3, а не только обнаружение генетического материала PCV3). За этим следует гибридизация молекулы амплификации сигнала (SAM), которая распознает пару специфических олигонуклеотидных зондов. В неспецифических реакциях два зонда не располагаются рядом друг с другом, предотвращая их гибридизацию с SAM. Сами SAM конъюгированы с ферментом. Как и в анализах гибридизации in situ, сигналы обнаруживают с использованием хромогенного субстрата с последующим исследованием слайдов под микроскопом в светлом поле. Слайды для анализа PCV3 RNAscope окрашивают, окрашенные слайды считывают и оценивают (таблица 153).

Таблица 153. Шкала оценки RNAScope

Оценка Описание 0 = норма Ноль клеток с окрашиванием PCV3 1 = умеренная <10% клеток с окрашиванием PCV3 2 = средняя окрашивание 10-50% клеток с PCV3 3 = тяжелая > 50% клеток с окрашиванием PCV3

Никаких доказательств репликации PCV3 не наблюдается ни в каких участках головного мозга/мозжечка какой-либо молодой свиньи. Почти у всех контрольных молодых свиней отмечается по меньшей мере слабое окрашивание RNAscope PCV3 в почках, сердце, толстой и тонкой кишке. За исключением одной молодой свиньи, ни у одной из других вакцинированных молодых свиней не обнаруживается окрашивания исследуемых тканей.

Экспериментальная инактивированная бакуловирусная вакцина с повышенной экспрессией ORF2 PCV3 значительно предотвращает репликацию вируса в ILN, селезенке и легких, и значительно снижает количество выявленного реплицирующегося вируса PCV3 во всех тканях. Вакцина также численно снижает смертность, клинические признаки, макроскопические поражения и гистологические нарушения в дополнение к численному повышению массы тела после фазы заражения. В целом показано, что экспериментальный бакуловирус с повышенной экспрессией ORF2 PCV3 эффективен против PCV3.

Пример 14

Данные о тестировании мутантных кандидатов ORF2 PCV3 на репродуктивной модели

Фаза вакцинации: в этом исследовании использовали 46 молодых свиней до размножения (возраст ≥5 месяцев). Все самки проходили скрининг в Ветеринарно-диагностической лаборатории Университета штата Айова (ISU-VDL) на предмет отсутствия виремии до вакцинации способом кПЦР на следующие агенты: PCV3, PCV2, атипичный пестивирус молодых свиней (APPV), вирус трансмиссивного гастроэнтерита (TGEV), вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV) и парвовирус молодых свиней (PPV). Также было показано, что животные являются серонегативными в отношении гриппа A и M. hyopneumoniae, что подтверждается ISU-VDL.

Молодых свиней до осеменения вакцинировали на Д0 и Д21 в зависимости от их экспериментальных групп. Свиньям NTX вводили вакцину плацебо. Синхронизацию эструса осуществляли введением MATRI™ (альтреногеста) с кормом с 17 по 30 день. На 30 день всем свиньям давали P.G.600. Животных оценивали на эструс и осеменяли между 35-42 днями. У 36 свиноматок была подтверждена беременность на Д77 (Д35 беременности), и они были использованы этом исследовании (таблица 154).

Таблица 154. Дизайн исследования с указанием групп лечения

Группа лечения Лечение n Заражение Опорос Аутопсия NTX Плацебо 5 Нет Д147-Д159
Данные помета и аутопсии/сбор ткани/крови Д168-Д180 (21 день после опороса)
Данные помета и аутопсии/сбор ткани/крови Плацебо 15 Д83 (примерно 40 дней гестации), гомогенат ткани с PCV3, по 2 мл в/м и и/н Вакцина Вакцина 16

Фаза заражения: всех животных заражали гомогенатом ткани, положительным по PCV3, через 40 дней беременности. Гемоцианин лимфы улитки (KLH), эмульгированный в неполном адъюванте Фрейнда (ICFA), содержащем 1 мг KLH/1 мл, вводили за два дня до и через два дня после контрольного заражения. Гомогенат ткани, использованный для заражения, был проверен на наличие посторонних агентов с помощью количественной ПЦР и глубокого секвенирования.

Лабораторная фаза

Виремия: у свиноматок брали сыворотку на протяжении всего исследования и оценивали на виремию с помощью количественной ПЦР.

Ни у одной из вакцинированных молодых свиней не обнаружено виремии ни в одном из образцов, взятых после заражения. У всех молодых свиней из групп NTX и плацебо виремия начиналась через неделю после заражения и продолжалась в течение 3-5 недель после заражения. В целом, данные о виремии у свиноматок показывают, что вакцина способна подавить репликацию вируса у свиноматок.

Клинические признаки: Все свинки были отправлены на опорос. При опоросе поросят определяли как здоровых, мумифицированных, слабых, мертворожденных и подвергшихся аутолизу. Также регистрировали любую смертность от раздавливания в первые три дня после опороса.

Наблюдается явное и значительное снижение общего количества мумий в группе вакцины по сравнению с группой плацебо. Аналогичное снижение количества мертворожденных и слабых молодых свиней наблюдается в группе вакцинированных по сравнению с группой плацебо и NTX. Кроме того, данные RNAScope по тканям указывают на значительное сокращение до полного прекращения репликации вируса в тканях вакцинированных свиноматок и молодых свиней по сравнению с тканями из групп NTX и плацебо.

PCV3 общепризнан репродуктивным заболеванием. На репродуктивной модели свиноматок вакцинируют, проводят повторную иммунизацию и осеменяют для оценки эффекта заражения PCV3. Вакцинированные животные (свиноматки и поросята) также демонстрируют снижение или устранение репликации вируса в исследуемых тканях. Экспериментальная вакцина с повышенной экспрессией инактивированным бакуловирусом ORF2 PCV3, по-видимому, почти полностью исключает репликацию вируса у свиноматок. Более того, при опоросе у вакцинированных свиноматок наблюдалось значительное сокращение количества мумий. Это сокращение может иметь значительные экономические последствия для производителей свиней.

PCV3 в комбинации с PPV

Здесь следует упомянуть WO2018/083156, раскрытие которой включено посредством ссылки.

Целью этого исследования является оценка появления иммунитета от раскрытой здесь вакцины против PCV3 (исследуемый вакцинный продукт 1 (далее именуемый «IVP1»)) при использовании в комбинации с субъединичной вакциной против парвовируса свиней, как описано в примерах, в частности полученных в соответствии с примерами 1 и 2 из WO2018/083156 (далее обозначаются как «IVP2»), и где эта смесь IVP1 и IVP2 также именуется «IVP2/IVP1» здесь и в дальнейшем.

Это исследование включает 60 молодых свиней, полученных путем кесарева сечения, лишенных молозива (CDCD), серонегативных по PCV3 и PPV, из которых 30 были вакцинированы смесью IVP2/IVP1, а 30 (контрольная группа) получали стерильный разбавитель (вода для инъекций) в возрасте 3 недель (т.е. в день исследования 0 (D0)) с последующим заражением PCV3 на D14.

Вакцинация IVP2/IVP1 приводит к значительному увеличению числа молодых свиней, серопозитивных по PCV3, виремии и данным RNAscope. К Д42 все молодой свиньи группы IVP2/IVP1 являются серопозитивными по PVC3, в то время как в контрольной группе значительно меньше молодых свиней являются позитивными.

После оценки параметров первичного результата вакцинация IVP2/IVP1 значительно снижает и/или устраняет виремию у вакцинированных. Кроме того, общий уровень гистологических нарушений, определяемый при окрашивании H&E, является более выраженным в контрольной группе, причем значительно больше молодых свиней имеют показатели средней и высокой тяжести по меньшей мере в одной категории оценки поражения, тогда как значительно меньшее количество вакцинированных молодых свиней имеют средний балл поражения, ни один из которых не был высоким. Что еще более важно, на гистологическом уровне, определяемом окрашиванием вирус-специфическим RNAScope, вакцина способна предотвращать или уменьшать репликацию вируса в тканях, включая, помимо прочего, сердце, почки, легкие, кишечник и нервную ткань.

В заключение, IVP1, используемый в сочетании с IVP2, обеспечивает эффективную активную иммунизацию 3-недельных молодых свиней CDCD при заражении вирулентным PCV3 на 14 день после вакцинации.

Пример 16

PCV3 в комбинации с PPV и PRRSV

Здесь следует упомянуть WO2018/083156 и WO2012/110489, раскрытие которых включено посредством ссылки.

Целью этого исследования с вакцинацией и заражением является предоставление данных о связанном использовании раскрытой здесь вакцины PCV3 и описанной выше (в примере 15, со ссылкой на WO2018/083156) парвовирусной субъединичной вакцины IVP2 (IVP1/IVP2, как описано выше) с вакциной MLV PRRS (указанная MLV PRRS депонирована в Европейской коллекции клеточных культур (ECACC) под номером доступа ECACC 1 1012502), описанной в примерах WO2012/110489 (названной «IVP3», и далее эта смесь обозначается как «IVP1/IVP2/IVP3» у 5-6-месячных молодых свиней.

Двадцать семь молодых свиней до осеменения получали из стада, ранее показавшего отрицательные результаты по PCV3, без предыдущего заболевания или вакцинации против PCV3. Молодых свиней произвольно распределяли на 3 экспериментальных группы, из которых n = 9 получали вакцинацию в Д0 и вторичную иммунизацию вакциной в Д21: T1 - отрицательный контроль, T2 - IVP1/IVP2/IVP3, Т3 – не получавшие лечения контрольные молодые свиньи (NTX), каждую группу размещали отдельно.

Молодых свиней вакцинировали, осеменяли и определяли беременность. примерно на 40-й день беременности (dG) всех молодых свиней инокулировали контрольным штаммом PCV3 (как описано в настоящей заявке). У молодых свиней брали кровь еженедельно, за исключением периодов синхронизации и осеменения (Д35 - Д70), и анализировали сыворотку.

Свиньям давали опороситься, и пометы исследовали на наличие мумий, мертворожденных и слабых поросят. В целом у вакцинированных молодых свиней и свиноматок не наблюдалось, или наблюдалось значительно меньшее количество мумий, мертворожденных и слабых пометов по сравнению с контролем или группами NTX.

При обследовании на виремию, в отличие от контрольных групп, у молодых свиней Т2 обнаруживается полное прекращение виремии после заражения. В заключение следует отметить, что комбинированная вакцина IVP1/IVP2/IVP3 эффективна для предотвращения виремии и инфекции PCV3 у плодов на 40dG.

При гистологическом анализе молодой свиньи Т2 способны предотвращать репликацию вируса в ключевых тканях после заражения. У контрольных молодых свиней/ свиноматок и в пометах наблюдается значительная репликация вируса и, следовательно, клиническое проявление PCV3. Это обнаруживается при окрашивании H&E и анализа вируса посредством RNAScope, которые обнаруживают репликацию вирусной мРНК в клетках и тканях. В заключение, комбинированная вакцина IVP1/IVP2/IVP3 эффективна для предотвращения клинических признаков заражения PCV3 молодых свиней, свиноматок и плодов на 40dG.

После подробного описания предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения следует понимать, что изобретение, определенное в приведенных выше параграфах, не должно ограничиваться конкретными деталями, изложенными в приведенном выше описании, так как многие очевидные его вариации возможны без выхода за рамки сущности или объема настоящего изобретения.

Также в данном описании раскрыты следующие пункты:

1. Композиция, содержащая белок ORF2 цирковируса молодых свиней 3 типа (PCV3).

2. Композиция по п.1, дополнительно содержащая ветеринарно приемлемый носитель, выбранный из группы, состоящей из растворителя, дисперсионной среды, покрытия, стабилизирующего агента, разбавителя, консерванта, противомикробного агента, противогрибкового агента, изотонического агента, агента, замедляющего адсорбцию, адъюванта, надосадочной жидкости клеточной культуры, стабилизирующего агента, вирусного вектора, вектора экспрессии и иммуномодулирующего агента, или любой их комбинации.

3. Композиция, в частности композиция по пп.1 или 2, содержащая: белок ORF2 цирковируса молодых свиней 3 типа (PCV3), и ветеринарно приемлемый носитель, включающий растворитель, дисперсионную среду, покрытие, стабилизирующий агент, разбавитель, консервант, противомикробный агент, противогрибковый агент, изотонический агент, агент, замедляющий адсорбцию, адъювант, надосадочную жидкость клеточной культуры, стабилизирующий агент, вирусный вектор или вектор экспрессии, и иммуномодулирующий агент или любую их комбинацию.

4. Композиция по любому из пп.1-3, где ветеринарно приемлемый носитель включает адъювант, иммуномодулирующий агент, надосадочную жидкость клеточной культуры, вирусный вектор или вектор экспрессии, или любую их комбинацию.

5. Композиция по любому из пп.1-4, где ветеринарно приемлемый носитель включает адъювант.

6. Композиция по любому из пп.1-5, где PCV3 выбран из любой филогенетической ветви PCV3 или комбинации филогенетических ветвей, или группы, состоящей из PCV3a и PCV3b.

7. Композиция по любому из пп.1-6, где PCV3 представляет собой любую филогенетическую ветвь PCV3, или выбран из группы, состоящей из PCV3a1, PCV3b1, PCV3b2 и PCV3c.

8. Композиция по любому из пп.1-7, где ORF2 PCV3 относится к группе a1, b1 или b2.

9. Композиция по любому из пп.1-8, где белок ORF2 PCV3 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, кодируемой полинуклеотидной последовательностью, имеющей по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1 или гомологии последовательности с SEQ ID NO: 1.

10. Композиция по любому из пп.1-9, где белок ORF2 PCV3 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 90% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 4.

11. Композиция по любому из пп.1-10, где белок ORF2 PCV3 представляет собой рекомбинантный белок ORF2 PCV3.

12. Композиция по любому из пп.1-11, где белок ORF2 PCV3 представляет собой рекомбинантный белок ORF2 PCV3 в результате его экспрессии вектором экспрессии, содержащий полинуклеотидную последовательность, кодирующую белок ORF2 PCV3.

13. Композиция по п.12, где вектор экспрессии представляет собой бакуловирус.

14. Композиция по любому из пп.1-13, где белок ORF2 PCV3 представляет собой экспрессируемый бакуловирусом рекомбинантный ORF2 PCV3.

15. Композиция по любому из пп.1-14, дополнительно содержащая белок ORF2 PCV2, предпочтительно антигенный белок ORF2 PCV2 (антиген ORF2 PCV2).

16. Композиция по п.15, где белок ORF2 PCV2 получен при экспрессии вектором экспрессии, содержащим полинуклеотидную последовательность, кодирующую белок ORF2 PCV2.

17. Композиция по п.16, где вектор экспрессии представляет собой бакуловирус.

18. Композиция по любому из пп.1-17, дополнительно содержащая дополнительный антиген дополнительного патогена свиней.

19. Композиция по п.18, в которой дополнительный антиген дополнительного патогена свиней включает антиген PRRSV (вируса респираторного и репродуктивного синдрома свиней), бактериновый антиген Mycoplasma hyopneumoniae, антиген надосадочной жидкости Mycoplasma hyopneumoniae, антиген болезни Ауески или псевдобешенства, антиген свиного гриппа, антиген чумы молодых свиней (классической или африканской, или их комбинации), антиген Actinobacillus pleuropneumoniae, антиген Escherichia coli, антиген парвовируса свиней (PPV) или антиген Pasteurella multocida, или их комбинацию.

20. Композиция по любому из пп.1-19, где белок ORF2 PCV3 присутствует в количестве от 0,2 до примерно 400 мкг/мл, или примерно от 0,3 до 200 мкг/мл, или примерно от 0,35 до 100 мкг/мл, или примерно от 0,4 до 50 мкг/мл, или примерно от 0,45 до 30 мкг/мл, или примерно от 0,6 до 15 мкг/мл, или примерно от 0,75 до 8 мкг/мл, или примерно от 1,0 до 6 мкг/мл, или примерно от 1,3 до 3,0 мкг/мл, или примерно от 1,4 до 2,5 мкг/мл, или примерно от 1,5 до 2,0 мкг/мл, или примерно 1,6 мкг/мл.

21. Композиция по любому из пп.1-20, где белок ORF2 PCV3 или общие белки ORF2 PCV2 и PCV3 присутствуют в количестве примерно от 0,2 до 400 мкг/дозу, или примерно от 0,3 до 200 мкг/дозу, или примерно от 0,35 до 100 мкг/дозу, или примерно от 0,4 до 50 мкг/дозу, или примерно от 0,45 до 30 мкг/дозу, или примерно от 0,6 до 15 мкг/дозу, или примерно от 0,75 до 8 мкг/дозу, или примерно от 1,0 до 6 мкг/дозу, или примерно от 1,3 до 3,0 мкг/дозу, или примерно от 1,4 до 2,5 мкг/дозу, или примерно от 1,5 до 2,0 мкг/дозу, или примерно 1,6 мкг/дозу.

22. Композиция по любому из пп.2-21, где адъювант включает полимер акриловой или метакриловой кислоты; сополимер малеинового ангидрида и алкенильного производного; сшитый полимер акриловой или метакриловой кислоты; полимер акриловой или метакриловой кислоты, сшитый с полиалкениловым эфиром сахара или полиспирта; карбомер; акриловый полимер, поперечно сшитый с полигидроксилированным соединением, имеющий по меньшей мере 3 и не более 8 гидроксильных групп с атомами водорода по меньшей мере трех гидроксилов, при необходимости замещенными или замещенным ненасыщенными алифатическими радикалами, имеющими по меньшей мере 2 атома углерода, с указанными радикалами, содержащими от 2 до 4 атома углерода, такими как винилы, аллилы и другие этиленненасыщенные группы, а ненасыщенные радикалы сами могут содержать другие заместители, такие как метил; карбопол; Карбопол 974P; Карбопол 934P; Карбопол 971P; гидроксид алюминия; фосфат алюминия; сапонин; Quil A; QS-21; GPI-0100; эмульсию вода-в-масле; эмульсию масло-в-воде; эмульсию вода-в-масле-в-воде; эмульсию на основе легкого жидкого парафинового масла или адъюванта типа Европейской Фармакопеи, изопреноидное масло; сквалан; сквалановое масло, полученное в результате олигомеризации алкенов, или изобутена или децена; сложный эфир (эфиры) кислоты (кислот) или спирта (спиртов), содержащий линейную алкильную группу; растительное масло (масла); этилолеат; ди-(каприлат/капрат) пропиленгликоля; глицерилтри-(каприлат/ капрат); диолеат пропиленгликоля; сложный эфир (эфиры) разветвленной жирной кислоты (кислот) или спирта (спиртов); сложный эфир (эфиры) изостеариновой кислоты; неионное поверхностно-активное вещество (вещества); сложный эфир (эфиры) сорбитана, или маннида, или гликоля, или полиглицерина, или пропиленгликоля, или олеиновой, или изостеариновой кислоты, или рицинолевой кислоты, или гидроксистеариновой кислоты, при необходимости этоксилированный, ангидроманнитол олеат; блок-сополимеры полиоксипропилена и полиоксиэтилена, продукт Плюроник, адъювантную систему RIBI; Блок-сополимер; SAF-М; монофосфориллипид А; авридиновый липидно-аминовый адъювант; термолабильный энтеротоксин из E. coli (рекомбинантный или другой); токсин холеры; IMS 1314 или мурамилдипептид.

23. Композиция по любому из пп.2-22, содержащая примерно от 50 мкг до 2000 мкг адъюванта, или где адъювант присутствует в количестве примерно 250 мкг/мл в дозе композиции, или адъювант присутствует в количестве примерно от 100 мкг до 10 мг на дозу, или где адъювант присутствует в количестве примерно от 500 мкг до 5 мг на дозу; адъювант присутствует в количестве примерно от 750 мкг до 2,5 мг на дозу, или адъювант присутствует в количестве примерно 1 мг на дозу.

24. Композиция по любому из пп.2-23, где иммуномодулирующий агент включает интерлейкин (интерлейкины), интерферон (интерфероны) или другой цитокин (цитокины).

25. Композиция по любому из пп.1-24, содержащая примерно от 1 мкг/мл до 60 мкг/мл антибиотика (антибиотиков) или менее примерно 30 мкг/мл антибиотика (антибиотиков).

26. Композиция по любому из пп.1-25, где антибиотик (антибиотики) включает гентамицин.

27. Композиция по любому из пп.1-26, содержащая (i) белок ORF2 PCV3, (ii) по меньшей мере часть бакуловируса, экспрессирующего указанный белок ORF2 PCV3, (iii) часть культуры клеток, которые были инфицированы или трансфицированы рекомбинантным бакуловирусом, экспрессирующим указанный белок ORF2 PCV3, (iv) инактивирующий агент, или инактивирующий агент, содержащий бинарный этиленимин (BEI), (v) тиосульфат натрия, или тиосульфат натрия в количествах, эквивалентных инактивирующему агенту или BEI; (vi) адъювант, или адъювант, включающий Карбопол, или Карбопол 971, и (vii) фосфатную соль в физиологически приемлемой концентрации.

28. Композиция по п.27, где примерно 90% компонентов (i) - (iii) имеют размер менее 1 мкм, а pH указанной композиции доводят до примерно 6,5-7,5.

29. Композиция по пп.27 или 28, где BEI получен из культуры клеток, обработанной примерно от 2 до 8 или примерно 5 мМ BEI для инактивации бакуловируса, и/или композиция содержит примерно от 2 до 8 или примерно 5 мМ BEI, и/или композиция содержит примерно 1 мг Карбопола или Карбопола 971.

30. Композиция по любому из пп.1-29, где указанная композиция составлена и/или упакована для однократного применения одной дозы или однократной иммунизации композицией, а не для режима множественных доз, или где указанная композиция составлена и/или упакована для режима приема нескольких доз композиции, или где указанная композиция составлена и/или упакована для двукратного введения дозы или двукратной иммунизации композицией.

31. Композиция по любому из пп.1-30, которая является иммуногенной композицией.

32. Композиция по любому из пп.1-31 для применения в качестве лекарственного средства.

33. Композиция по любому из пп.1-31 для применения в качестве вакцины.

34. Композиция по любому из пп.1-31 для применения в способе индукции иммунного ответа или иммунологического ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа против (i) PCV3 и/или (ii) PCV2 и PCV3, и/или (iii) PCV3 и другого патогена свиней, и/или (iv) PCV3, PCV2 и другого патогена свиней.

35. Композиция по любому из пп.1-31 для применения в способе уменьшения или предотвращения клинических признаков или заболевания, вызванного инфекцией PCV3 у животного, или для применения в способе лечения или профилактики инфекции PCV3 у животного, причем указанное животное предпочтительно представляет собой молодую свинью.

36. Композиция по любому из пп.1-31 для применения в способе индукции иммунного ответа против PCV3 у этой молодой свиньи, в частности, предпочтительно у беременной свиноматки.

37. Композиция по любому из пп.1-31 для применения в способе уменьшения или предотвращения клинических признаков или заболевания, вызванного инфекцией PCV3 у поросят, при этом поросенок должен получать вскармливание свиноматкой, у которой применяли композицию.

38. Композиция для применения по п.37, где указанная свиноматка, у которой применяли композицию, представляет собой свиноматку, которой вводили иммуногенную композицию, когда указанная свиноматка была беременна, в частности, указанным поросенком, или подсвинка до осеменения.

39. Композиция для применения по любому из пп.32-38, предназначенная для введения внутримышечно или интрадермально.

40. Композиция для применения по любому из пп.36-39, предназначенная для введения указанной свиноматке внутримышечно или интрадермально.

41. Способ индукции иммунного ответа или иммунологического ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа против (i) PCV3, и/или (ii) PCV2 и PCV3, и/или (iii) PCV3 и другого патогена свиней, и/или (iv) PCV3, PCV2 и другого патогена свиней, включающий введение животному композиции, указанной в любом из пп.1-31.

42. Способ по п. 41, где животное представляет собой свинью.

43. Способ по п. 42, где свинья представляет собой молодую свинью, или поросенка.

44. Способ по п. 42 или 43, где свинья представляет собой свиноматку.

45. Способ иммунизации субъекта, включающий введение субъекту композиции по любому из пп.1-31.

46. Способ иммунизации молодых свиней против клинического заболевания, вызванного по меньшей мере одним патогеном у указанного животного, включающий стадию введения животному композиции по любому из пп.1-31, при этом указанная иммуногенная композиция не вызывает клинических признаков инфекции, но способна вызывать иммунный ответ, который иммунизирует животное против патогенных форм указанного по меньшей мере одного патогена.

47. Способ по п.46, где указанным по меньшей мере одним патогеном является PCV3.

48. Способ индукции выработки антител, специфичных для PCV3 у свиноматки, включающий введение указанной свиноматке композиции по любому из пп.1-31.

49. Способ уменьшения или предотвращения клинических признаков или клинических симптомов, вызванных инфекцией PCV3 у поросят, включающий введение композиции по любому из пп.1 по 31 свиноматке и обеспечение кормления указанной свиноматкой указанного поросенка.

50. Способ по п.49, где указанная свиноматка является беременной свиноматкой, в частности, указанным поросенком, или является подсвинком до осеменения.

51. Способ по пп.49 или 50, включающий этапы введения композиции по любому из пп.1-31 свиноматке, беременной указанным поросенком, рождения указанной свиноматкой указанного поросенка и вскармливания указанного поросенка указанной свиноматкой.

52. Способ уменьшения клинических признаков и/или клинических симптомов, вызванных инфицированием PEDV у поросят, при котором поросенок должен получать вскармливание свиноматкой, которой вводили композицию по любому из пп.1-31.

53. Способ по любому из пп.45-52, где указанную иммуногенную композицию, или указанную вакцину или фармацевтическую композицию вводят внутримышечно или интрадермально указанной свиноматке.

54. Способ по любому из пп.45-53, где указанную иммуногенную композицию, или указанную вакцину или фармацевтическую композицию вводят дважды указанной свиноматке.

55. Способ по любому из пп.45-54, где указанную иммуногенную композицию, или указанную вакцину или фармацевтическую композицию вводят дважды через слизистую оболочку, предпочтительно дважды интраназально, указанной свиноматке.

56. Композиция для применения по любому из пп.32-40 или способ по любому из пп.41-55, где указанные клинические признаки выбраны из группы, состоящей из снижения среднесуточного привеса и смертности.

57. Композиция для применения по любому из пп.32-40 или способ по любому из пп.41-55, где клинические признаки выбраны из группы, состоящей из выталкивания мумифицированного, мертворожденного и/или слабого плода.

58. Композиция для применения по любому из пп.32-40 или способ по любому из пп.41-55, где клинические симптомы выбраны из группы, состоящей из макроскопических повреждений, гистологических нарушений, репликации PCV3 в ткани и виремии PCV3.

59. Композиция для применения по любому из пп.32-40 или способ по любому из пп.41-55, где клинические симптомы выбраны из группы, состоящей из развития или производства мумифицированного, мертворожденного и/или слабого плода.

60. Композиция для применения по любому из пп.32-40 или способ по любому из пп.41-55, где свинья или поросенок имеет возраст не старше 15 недель, или не старше 6 недель, или не старше 3 недель, или не старше 2 недель, или не старше 1 недели.

61. Способ по п. 60, где введение осуществляют в течение по меньшей мере 1, 2 или 3 недель после контакта с вирулентным цирковирусом молодых свиней.

62. Композиция для применения по любому из пп.32-41 или способ по любому из пп.42-55, где введение включает введение путем однократного введения одной дозой или однократное применение одной дозы композиции; а не режим многократной вакцинации или многократного введения, или где введение состоит из однократной вакцинации одной дозой или однократного введения одной дозы; а не из режима многократной вакцинации или многократного введения дозы, или где введение включает режим многократной вакцинации или многократного введения дозы композиции, или где введение включает режим двукратной вакцинации или двукратного введения дозы композиции, или где введение состоит из режима двукратной вакцинации или режима введения двух доз композиции.

63. Использование композиции по любому из пп.1-31 в способе по любому из пп. 42-55, или использование белка ORF2 PCV3, отдельно или в комбинации, с любой из композиций по пп.1-31, для применения при приготовлении композиции для индукции иммунологического или иммунного ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа против (i) PCV3, и/или (ii) PCV2 и PCV3, и/или (iii) PCV3 и другого патогена свиней, и/или (iv) PCV3, PCV2 и другого патогена свиней, или для применения в способе индукции иммунологического или иммунного ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа против (i) PCV3, и/или (ii) PCV2 и PCV3, и/или (iii) PCV3 и другого патогена свиней, и/или (iv) PCV3, PCV2 и другого патогена свиней.

64. Способ приготовления композиции по любому из пп.1-31, включающий получение белка ORF2 PCV3 с помощью бакуловирусной системы экспрессии в культивируемых клетках насекомых.

65. Способ по п.64, включающий инактивацию бакуловируса.

66. Способ по п.65, где инактивация включает тепловую обработку или использование агента, инактивирующего вирус.

67. Способ по п.66, где агент, инактивирующий вирус, включает азиридиновое соединение.

68. Способ по п.67, где азиридиновое соединение включает BEI.

69. Рекомбинантный вектор, содержащий полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную последовательность, кодирующую белок ORF2 PCV3.

70. Рекомбинантный вектор по п.69, где ORF2 PCV3 относится к группе a1, b1 или b2.

71. Композиция, содержащая (i) белок ORF2 цирковируса молодых свиней 3 типа (PCV3), белок парвовируса (PPV), и при необходимости белок PRRSV (вируса респираторного и репродуктивного синдрома свиней), и (ii) ветеринарно приемлемый носитель, выбранный из группы, состоящей из растворителя, дисперсионной среды, покрытия, стабилизатора, разбавителя, консерванта, противомикробного агента, противогрибкового агента, изотонического агента, агента, замедляющего адсорбцию, адъюванта, надосадочной жидкости клеточной культуры, стабилизирующего агента, вирусного вектора, вектора экспрессии и иммуномодулирующего средства, или любой их комбинации.

72. Композиция по п.71, где ветеринарно приемлемый носитель включает адъювант, иммуномодулирующий агент, надосадочную жидкость клеточной культуры, вирусный вектор или вектор экспрессии, или любую их комбинацию.

73. Композиция по пп.71 или 72, где белок PPV представляет собой капсидный белок PPV VP2.

74. Композиция по любому из пп.71-73, где белок PRRSV представляет собой ORF4, ORF5, ORF6 или ORF7 вируса PRRS.

75. Композиция по пп.73 или 74, где белок PPV и/или белок PRRSV экспрессируется в векторе.

76. Композиция по любому из пп.71-75, представляющая собой иммуногенную композицию, вводимую в двух дозах свинье.

77. Композиция по п.76, где свинья является молодой свиньей до первого опороса или свиноматкой.

78. Композиция по пп.76 или 77, где введение осуществляют до спаривания/ осеменения, до беременности, во время беременности или во время лактации.

79. Композиция по любому из пп.76-78, где иммуногенная композиция содержит от 0,1 мкг до 150 мкг, предпочтительно от 0,25 мкг до 75 мкг, более предпочтительно от 0,5 мкг до 37,5 мкг, еще более предпочтительно от 0,5 мкг до 15 мкг, наиболее предпочтительно от 0,5 мкг до 6 мкг антигена PCV3, PPV и/или PRRSV.

80. Композиция по любому из пп.76-79, где иммуногенную композицию вводят внутримышечно.

81. Способ индукции иммунного ответа или иммунологического ответа, или защитного иммунного или иммунологического ответа против цирковируса свиней 3 (PCV3), включающий парентеральное или подкожное применение у свиней однократной вакцинации, однократного введения или однократной дозы (i) по меньшей мере от 2 мкг до примерно 400 мкг рекомбинантного белка ORF2 PCV3, экспрессируемого бакуловирусной системой, и (ii) ветеринарно приемлемого носителя, содержащего растворитель, дисперсионную среду, покрытие, стабилизирующий агент, разбавитель, консервант, противомикробный агент, противогрибковый агент, изотонический агент, агент, замедляющий адсорбцию, адъювант, надосадочную жидкость клеточной культуры, стабилизирующий агент, вирусный вектор или вектор экспрессии, и иммуномодулирующий агент, или любую их комбинацию.

82. Способ по п.81, где свинья представляет собой поросенка, молодую свинью, или свиноматку, или подсвинка до осеменения.

83. Способ по пп.81 или п. 82, где свинья имеет возраст примерно 1 неделю, или 2 недели, или 3 недели, или 7-28, или 7-22, или 14-22, или 16-22, или 21±5 дней.

84. Способ по любому из пп.81-83, где ветеринарно приемлемый носитель включает адъювант, иммуномодулирующий агент, надосадочную жидкость клеточной культуры, вирусный вектор или вектор экспрессии, или любую их комбинацию.

85. Способ по любому из пп.81-84, где ORF2 PCV3 происходит из любой филогенетической ветви PCV3 или комбинации филогенетических ветвей, или группы PCV3a, PCV3a1, PCV3b, PCV3b1 или PCV3b.

86. Способ по любому из пп.81-85, где белок ORF2 PCV3 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, кодируемой полинуклеотидной последовательностью, имеющей по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1 или гомологии последовательности с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7.

87. Способ по любому из пп.81-86, где однократная вакцинация, однократное введение или однократная доза дополнительно включает белок ORF2 PCV2 или дополнительный антиген дополнительного патогена свиней.

88. Способ по п.87, где дополнительный антиген дополнительного патогена свиней включает антиген PRRSV (вируса респираторного и репродуктивного синдрома свиней), бактериновый антиген Mycoplasma hyopneumoniae, антиген надосадочной жидкости Mycoplasma hyopneumoniae, антиген болезни Ауески или псевдобешенства, антиген свиного гриппа, антиген чумы свиней (классической или африканской, или их комбинации), антиген Actinobacillus pleuropneumoniae, антиген Escherichia coli, антиген парвовируса свиней (PPV) или антиген Pasteurella multocida, или их комбинацию.

89. Способ по любому из пп.81-88, где адъювант включает полимер акриловой или метакриловой кислоты; сополимер малеинового ангидрида и алкенильного производного; сшитый полимер акриловой или метакриловой кислоты; полимер акриловой или метакриловой кислоты, сшитый с полиалкениловым эфиром сахара или полиспирта; карбомер; акриловый полимер, поперечно сшитый полигидроксилированным соединением, имеющий по меньшей мере 3 и не более 8 гидроксильных групп с атомами водорода по меньшей мере трех гидроксилов, при необходимости замещенными или замещенными ненасыщенными алифатическими радикалами, имеющими по меньшей мере 2 атома углерода, с указанными радикалами, содержащими от 2 до 4 атома углерода, такими как винилы, аллилы и другие этиленненасыщенные группы, и ненасыщенные радикалы сами могут содержать другие заместители, такие как метил; карбопол; Карбопол 974P; Карбопол 934P; Карбопол 971P; гидроксид алюминия; фосфат алюминия; сапонин; Quil A; QS-21; GPI-0100; эмульсию вода-в-масле; эмульсию масло-в-воде; эмульсию вода-в-масле-в-воде; эмульсию на основе легкого жидкого парафинового масла или адъюванта типа Европейской Фармакопеи, изопреноидное масло; сквалан; сквалановое масло, полученное в результате олигомеризации алкенов, изобутена или децена; сложный эфир (эфиры) кислоты (кислот) или спирта (спиртов), содержащий линейную алкильную группу; растительное масло (масла); этилолеат; ди-(каприлат/капрат) пропиленгликоля; глицерилтри-(каприлат/капрат); диолеат пропиленгликоля; сложный эфир (эфиры) разветвленной жирной кислоты (кислот) или спирта (спиртов); сложный эфир (эфиры) изостеариновой кислоты; неионное поверхностно-активное вещество (вещества); сложный эфир (эфиры) сорбитана, или маннида, или гликоля, или полиглицерина, или пропиленгликоля, или олеиновой, или изостеариновой кислоты, или рицинолевой кислоты, или гидроксистеариновой кислоты, при необходимости этоксилированный, ангидроманнитол олеат; блок-сополимеры полиоксипропилена и полиоксиэтилена, продукт Плюроник, адъювантную систему RIBI; Блок-сополимер; SAF-M; монофосфориллипид А; авридиновый липидно-аминовый адъювант; термолабильный энтеротоксин из E. coli (рекомбинантный или другой); токсин холеры; IMS 1314 или мурамилдипептид.

90. Способ по любому из пп.81-89, где белок ORF2 PCV3 присутствует в количестве от 0,2 до примерно 400 мкг/мл, или примерно от 0,3 до 200 мкг/мл, или примерно от 0,35 до 100 мкг/мл, или примерно от 0,4 до 50 мкг/мл, или примерно от 0,45 до 30 мкг/мл, или примерно от 0,6 до 15 мкг/мл, или примерно от 0,75 до 8 мкг/мл, или примерно от 1,0 до 6 мкг/мл, или примерно от 1,3 до 3,0 мкг/мл, или примерно от 1,4 до 2,5 мкг/мл, или примерно от 1,5 до 2,0 мкг/мл, или примерно 1,6 мкг/мл.

91. Способ по п.87, где белок ORF2 PCV3 или общие белки ORF2 PCV2 и PCV3 присутствуют в количестве примерно от 0,2 до 400 мкг/дозу, или примерно от 0,3 до 200 мкг/дозу, или примерно от 0,35 до 100 мкг/дозу, или примерно от 0,4 до 50 мкг/дозу, или примерно от 0,45 до 30 мкг/дозу, или примерно от 0,6 до 15 мкг/дозу, или примерно от 0,75 до 8 мкг/дозу, или примерно от 1,0 до 6 мкг/дозу, или примерно от 1,3 до 3,0 мкг/дозу, или примерно от 1,4 до 2,5 мкг/дозу, или примерно от 1,5 до 2,0 мкг/дозу, или примерно 1,6 мкг/дозу.

92. Способ по любому из пп.81-91, включающий примерно от 50 мкг до примерно 2000 мкг адъюванта, или где адъювант присутствует в количестве примерно 250 мкг/мл в дозе композиции, или адъювант присутствует в количестве примерно от 100 мкг до 10 мг на дозу, или где адъювант присутствует в количестве примерно от 500 мкг до 5 мг на дозу; адъювант присутствует в количестве примерно от 750 мкг до 2,5 мг на дозу, или адъювант присутствует в количестве примерно 1 мг на дозу.

93. Способ по любому из пп.82-92, где иммуномодулирующий агент включает интерлейкин, интерферон или другой цитокин.

94. Способ по любому из пп.81-93, где однократная вакцинация, однократное введение или однократная доза дополнительно включает примерно от 1 мкг/мл до 60 мкг/мл антибиотика (антибиотиков) или менее примерно 30 мкг/мл антибиотика.

95. Способ по п. 84, где антибиотик включает гентамицин.

96. Способ по любому из пп.81-95, где однократная вакцинация, однократное введение или однократная доза включает (i) белок ORF2 PCV3, (ii) по меньшей мере часть бакуловируса, экспрессирующего указанный белок ORF2 PCV3, (iii) часть культуры клеток, которые были инфицированы или трансфицированы рекомбинантным бакуловирусом, экспрессирующим указанный белок ORF2 PCV3, (iv) инактивирующий агент, или инактивирующий агент, содержащий бинарный этиленимин (BEI), (v) тиосульфат натрия, или тиосульфат натрия в эквивалентных количествах для инактивирующего агента или BEI; (vi) адъювант, или адъювант, содержащий Карбопол или Карбопол 971, и (vii) фосфатную соль в физиологически приемлемой концентрации.

97. Способ по п.96, где примерно 90% компонентов (i) - (iii) имеют размер менее 1 мкм, а pH указанной композиции доводят до примерно 6,5-7,5.

98. Способ по пп.96 или 97, где BEI получен из культуры клеток, обработанной примерно от 2 до 8 или примерно 5 мМ BEI для инактивации бакуловируса, и/или композиция содержит примерно от 2 до 8 или около 5 мМ BEI и/или композиция содержит примерно 1 мг Карбопола или Карбопола 971.

99. Способ по любому из пп.81-98, дополнительно включающий уменьшение или предотвращение клинических признаков или заболевания, вызванного инфекцией PCV3 или вирусом эпидемической диареи молодых свиней (PEDV), у беременной свиноматки или поросенка.

100. Способ по п.99, где уменьшение или предотвращение клинических признаков или заболевания у молодых свиней включает кормление поросенка свиноматкой, у которой применяли введение путем однократного введения, однократное введение или однократную дозу.

101. Способ по п.99, где уменьшение или предотвращение клинических признаков или заболевания у молодых свиней в ключает введение путем однократного введения, однократное введение или однократную дозу у беременной свиноматки.

102. Способ по п.101, дополнительно включающий вскармливание поросенка свиноматкой после того, как свиноматка родила поросенка.

103. Способ по любому из пп.99–102, где клиническим признаком является снижение среднесуточного привеса, смертность, развитие, производство или выталкивание мумифицированного, мертворожденного и/или слабого плода, макроскопическое поражение, гистологическое нарушение, репликация PCV3 в ткани или виремия PCV3.

104. Способ по любому из пп.81-103, где парентеральное или подкожное введение является внутримышечным или интрадермальным.

105. Неприродный белок ORF2 PCV3, включающий сконструированную петлю FG, где петля FG содержит три или менее положительно заряженных аминокислоты.

106. Белок ORF2 PCV3 по п.105, где петля FG содержит две положительно заряженные аминокислоты.

107. Белок ORF2 PCV3 по п.105, где петля FG содержит одну положительно заряженную аминокислоту.

108. Белок ORF2 PCV3 по п.105, где в петле FG отсутствуют положительно заряженные аминокислоты.

109. Белок ORF2 PCV3 по п.105, где в петле FG отсутствуют остатки аргинина и лизина.

110. Белок ORF2 PCV3 по п.105, где в петле FG отсутствуют остатки аргинина, лизина и гистидина.

111. Белок ORF2 PCV3 по п.105, где петля FG содержит QPFSYH, LSRGF или MASGF.

112. Неприродный белок ORF2 PCV3, содержащий сконструированное С-концевое удлинение.

113. Белок ORF2 PCV3 по п.112, где С-концевое удлинение включает примерно от 1 до 10, примерно от 5 до 20 или примерно от 10 до 30 аминокислот.

114. Белок ORF2 PCV3 по п.112, где С-концевое удлинение включает примерно от 1 до 10, или примерно от 5 до 20, или примерно от 10 до 30 аминокислот, примерно от 50 до 200 аминокислот, примерно от 60 до 190 аминокислот, примерно от 70 до 180 аминокислот, примерно от 80 до 170 аминокислот, примерно от 90 до 160 аминокислот или примерно от 100 до 150 аминокислот.

115. Белок ORF2 PCV3 по п.112, где С-концевое удлинение содержит С-концевые аминокислоты из другого капсидного белка.

116. Белок ORF2 PCV3 по п.115, где C-концевое удлинение включает C-концевые аминокислоты из капсида PCV2, в виде капсида BFDV или капсида CaCV.

117. Белок ORF2 PCV3 по п.112, где С-концевое удлинение включает EFNLKDPPLN, PK или QFAPNNPSTEFDYETGRQL.

118. Способ получения самособирающегося капсидного белка ORF2 PCV3, который включает замену одной или нескольких аминокислот аргинина, лизина или гистидина в петле FG на незаряженные положительно аминокислоты.

119. Способ усиления самосборки капсидного белка ORF2 PCV3, который включает добавление или вставку аминокислотных остатков на С-конце белка.

120. Способ по п.118, включающий добавление или вставку от 1 до 10, или примерно от 5 до 20, или примерно от 10 до 30 аминокислот, примерно от 50 до 200 аминокислот, примерно от 60 до 190 аминокислот, примерно от 70 до 180 аминокислот, примерно от 80 до 170 аминокислот, примерно от 90 до 160 аминокислот или примерно от 100 до 150 аминокислот.

121. Способ по п.119, включающий добавление или вставку аминокислот из другого капсидного белка.

122. Способ по п.121, где добавленные или вставленные аминокислоты происходят из капсида PCV2, в виде капсида BFDV или капсида CaCV.

123. Способ по п.121, где добавленные или вставленные аминокислоты включают EFNLKDPPLN, PK или QFAPNNPSTEFDYETGRQL.

124. Композиция, содержащая белок PCV по любому из пп.105–117 или белок, полученный способом по любому из пп.118–123, в количестве, необходимом для индукции иммунного ответа или защитного иммунного ответа против PCV3 и/или его клинических симптомов, при однократном введении, и ветеринарно приемлемый носитель, включающий растворитель, дисперсионную среду, покрытие, стабилизирующий агент, разбавитель, консервант, противомикробный агент, противогрибковый агент, изотонический агент, агент, замедляющий адсорбцию, адъювант, надосадочную жидкость клеточной культуры, стабилизирующий агент, вирусный вектор или вектор экспрессии, и иммуномодулирующий агент, или любую их комбинацию.

125. Композиция по п.124, где белок ORF2 PCV3 кодируется SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:7.

126. Композиция по пп.124 или 125, где ветеринарно приемлемый носитель включает адъювант, иммуномодулирующий агент, надосадочную жидкость клеточной культуры, вирусный вектор или вектор экспрессии или любую их комбинацию.

127. Композиция по любому из пп.124-126, дополнительно включающая белок ORF2 PCV2, предпочтительно антигенный белок ORF2 PCV2, или дополнительный антиген дополнительного патогена свиней.

128. Композиция по п. 127, где дополнительный антиген дополнительного патогена свиней включает антиген PRRSV (вируса респираторного и репродуктивного синдрома свиней), бактериновый антиген Mycoplasma hyopneumoniae, антиген надосадочной жидкости Mycoplasma hyopneumoniae, антиген болезни Ауески или псевдобешенства, антиген свиного гриппа, антиген чумы молодых свиней (классической или африканской, или их комбинации), антиген Actinobacillus pleuropneumoniae, антиген Escherichia coli, антиген парвовируса свиней (PPV) или антиген Pasteurella multocida, или их комбинацию.

129. Композиция по любому из пп.124-128, где адъювант включает полимер акриловой или метакриловой кислоты; сополимер малеинового ангидрида и алкенильного производного; сшитый полимер акриловой или метакриловой кислоты; полимер акриловой или метакриловой кислоты, сшитый с полиалкениловым эфиром сахара или полиспирта; карбомер; акриловый полимер, поперечно сшитый полигидроксилированным соединением, имеющий по меньшей мере 3 и не более 8 гидроксильных групп с атомами водорода по меньшей мере трех гидроксилов, при необходимости замещенными или замещенным ненасыщенными алифатическими радикалами, имеющими по меньшей мере 2 атома углерода, с указанными радикалами, содержащими от 2 до 4 атома углерода, такими как винилы, аллилы и другие этиленненасыщенные группы, и ненасыщенные радикалы сами могут содержать другие заместители, такие как метил; карбопол; Карбопол 974P; Карбопол 934P; Карбопол 971P; гидроксид алюминия; фосфат алюминия; сапонин; Quil A; QS-21; GPI-0100; эмульсию вода-в-масле; эмульсию масло-в-воде; эмульсию вода-в-масле-в-воде; эмульсию на основе легкого жидкого парафинового масла или адъюванта типа Европейской Фармакопеи, изопреноидное масло; сквалан; сквалановое масло, полученное в результате олигомеризации алкенов, изобутена или децена; сложный эфир (эфиры) кислоты (кислот) или спирта (спиртов), содержащий линейную алкильную группу; растительное масло (масла); этилолеат; ди-(каприлат/капрат) пропиленгликоля; глицерилтри-(каприлат/капрат); диолеат пропиленгликоля; сложный эфир (эфиры) разветвленной жирной кислоты (кислот) или спирта (спиртов); сложный эфир (эфиры) изостеариновой кислоты; неионное поверхностно-активное вещество (вещества); сложный эфир (эфиры) сорбитана, или маннида, или гликоля, или полиглицерина, или пропиленгликоля, или олеиновой, или изостеариновой кислоты, или рицинолевой кислоты, или гидроксистеариновой кислоты, при необходимости этоксилированный, ангидроманнитол олеат; блок-сополимеры полиоксипропилена и полиоксиэтилена, продукт Плюроник, адъювантную систему RIBI; Блок-сополимер; SAF-M; монофосфориллипид А; авридиновый липидно-аминовый адъювант; термолабильный энтеротоксин из E. coli (рекомбинантный или другой); токсин холеры; IMS 1314 или мурамилдипептид.

130. Композиция по любому из пп.124-129, где белок ORF2 PCV3 присутствует в количестве от 0,2 до примерно 400 мкг/мл, или примерно от 0,3 до 200 мкг/мл, или примерно от 0,35 до 100 мкг/мл, или примерно от 0,4 до 50 мкг/мл, или примерно от 0,45 до 30 мкг/мл, или примерно от 0,6 до 15 мкг/мл, или примерно от 0,75 до 8 мкг/мл, или примерно от 1,0 до 6 мкг/мл, или примерно от 1,3 до 3,0 мкг/мл, или примерно от 1,4 до 2,5 мкг/мл, или примерно от 1,5 до 2,0 мкг/мл, или примерно 1,6 мкг/мл.

131. Композиция по любому из пп.124-130, где белок ORF2 PCV3 или общие белки ORF2 PCV2 и PCV3 присутствуют в количестве примерно от 0,2 до 400 мкг/дозу, или примерно от 0,3 до 200 мкг/дозу, или примерно от 0,35 до 100 мкг/дозу, или примерно от 0,4 до 50 мкг/дозу, или примерно от 0,45 до 30 мкг/дозу, или примерно от 0,6 до 15 мкг/дозу, или примерно от 0,75 до 8 мкг/дозу, или примерно от 1,0 до 6 мкг/дозу, или примерно от 1,3 до 3,0 мкг/дозу, или примерно от 1,4 до 2,5 мкг/дозу, или примерно от 1,5 до 2,0 мкг/дозу, или примерно 1,6 мкг/дозу.

132. Композиция по любому из пп.124-131, содержащая примерно от 50 мкг до 2000 мкг адъюванта, или где адъювант присутствует в количестве примерно 250 мкг/мл в дозе композиции, или адъювант присутствует в количестве примерно от 100 мкг до 10 мг на дозу, или где адъювант присутствует в количестве примерно от 500 мкг до 5 мг на дозу; адъювант присутствует в количестве примерно от 750 мкг до 2,5 мг на дозу, или адъювант присутствует в количестве примерно 1 мг на дозу.

133. Композиция по любому из пп.125-132, где иммуномодулирующий агент включает интерлейкин, интерферон или другой цитокин.

134. Вектор, содержащий и экспрессирующий белок PCV по любому из пп.105–117 или белок, продуцируемый способом по любому из пп.118–123.

135. Вектор по п.134, где белок PCV экспрессируется SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7.

136. Вектор по пп.134 или 135, представляющий собой бакуловирус.

137. Способ получения композиции по любому из пп.125-133, включающий получение белка ORF2 PCV3 с помощью бакуловирусной системы экспрессии в культивируемых клетках насекомых.

138. Способ по п.137, дополнительно включающий инактивацию бакуловируса.

139. Способ по п.138, где инактивация включает тепловую обработку или использование агента, инактивирующего вирус.

140. Способ по п.139, где агент, инактивирующий вирус, включает азиридиновое соединение.

141. Способ по п. 140, где азиридиновое соединение включает BEI.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110>БЕРИНГЕР ИНГЕЛЬХАЙМ ЭНИМАЛ ХЕЛТ ЮЭсЭй ИНК.

<120>ВАКЦИНЫ ПРОТИВ СВИНОГО ЦИРКОВИРУСА 3 ТИПА (PCV3),ИХ ПРОИЗВОДСТВО

И ПРИМЕНЕНИЕ

<130>BI 19-AH009

<160>10

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>645

<212>DNA

<213>Porcine circovirus

<400>1

atgagacaca gagctatatt cagaagaaga ccccgcccaa ggagacgacg acgccacaga 60

aggcgctatg ccagaagacg actattcatt aggaggccca cagctggcac atactacaca

120

aagaaatact ccacaatgaa cgtcatatcc gttggaaccc ctcagaataa caagccctgg

180

cacgccaacc acttcattac ccgcctaaac gaatgggaaa ctgcaattac ctttgaatat

240

tataagatac taaaaatgaa agttacactc agccctgtaa tttctccggc tcagcaaaca

300

aaaactatgt tcgggcacac agccatagat ctagacggcg cctggaccac aaacacttgg

360

ctccaagacg acccttatgc ggaaagttcc actcgtaaag ttatgacttc taaaaaaaaa

420

cacagccgtt acttcacccc caaaccactt ctggcgggaa ctaccagcgc tcacccagga

480

caaagcctct tctttttctc cagacccacc ccatggctca acacatatga ccccaccgtt

540

caatggggag cactgctttg gagcatttat gtcccggaaa aaactggaat gacagacttc

600

tacggcacca aagaagtttg gattcgttac aagtccgttc tctga 645

<210>2

<211>134448

<212>DNA

<213>Porcine circovirus

<400>2

gaattctacc cgtaaagcga gtttagtttt gaaaaacaaa tgacatcatt tgtataatga 60

catcatcccc tgattgtgtt ttacaagtag aattctatcc gtaaagcgag ttcagttttg

120

aaaacaaatg agtcatacct aaacacgtta ataatcttct gatatcagct tatgactcaa

180

gttatgagcc gtgtgcaaaa catgagataa gtttatgaca tcatccactg atcgtgcgtt

240

acaagtagaa ttctactcgt aaagccagtt cggttatgag ccgtgtgcaa aacatgacat

300

cagcttatga ctcatacttg attgtgtttt acgcgtagaa ttctactcgt aaagcgagtt

360

cggttatgag ccgtgtgcaa aacatgacat cagcttatga gtcataatta atcgtgcgtt

420

acaagtagaa ttctactcgt aaagcgagtt gaaggatcat atttagttgc gtttatgaga

480

taagattgaa agcacgtgta aaatgtttcc cgcgcgttgg cacaactatt tacaatgcgg

540

ccaagttata aaagattcta atctgatatg ttttaaaaca cctttgcggc ccgagttgtt

600

tgcgtacgtg actagcgaag aagatgtgtg gaccgcagaa cagatagtaa aacaaaaccc

660

tagtattgga gcaataatcg atttaaccaa cacgtctaaa tattatgatg gtgtgcattt

720

tttgcgggcg ggcctgttat acaaaaaaat tcaagtacct ggccagactt tgccgcctga

780

aagcatagtt caagaattta ttgacacggt aaaagaattt acagaaaagt gtcccggcat

840

gttggtgggc gtgcactgca cacacggtat taatcgcacc ggttacatgg tgtgcagata

900

tttaatgcac accctgggta ttgcgccgca ggaagccata gatagattcg aaaaagccag

960

aggtcacaaa attgaaagac aaaattacgt tcaagattta ttaatttaat taatattatt

1020

tgcattcttt aacaaatact ttatcctatt ttcaaattgt tgcgcttctt ccagcgaacc

1080

aaaactatgc ttcgcttgct ccgtttagct tgtagccgat cagtggcgtt gttccaatcg

1140

acggtaggat taggccggat attctccacc acaatgttgg caacgttgat gttacgttta

1200

tgcttttggt tttccacgta cgtcttttgg ccggtaatag ccgtaaacgt agtgccgtcg

1260

cgcgtcacgc acaacaccgg atgtttgcgc ttgtccgcgg ggtattgaac cgcgcgatcc

1320

gacaaatcca ccactttggc aactaaatcg gtgacctgcg cgtctttttt ctgcattatt

1380

tcgtctttct tttgcatggt ttcctggaag ccggtgtaca tgcggtttag atcagtcatg

1440

acgcgcgtga cctgcaaatc tttggcctcg atctgcttgt ccttgatggc aacgatgcgt

1500

tcaataaact cttgtttttt aacaagttcc tcggtttttt gcgccaccac cgcttgcagc

1560

gcgtttgtgt gctcggtgaa tgtcgcaatc agcttagtca ccaactgttt gctctcctcc

1620

tcccgttgtt tgatcgcggg atcgtacttg ccggtgcaga gcacttgagg aattacttct

1680

tctaaaagcc attcttgtaa ttctatggcg taaggcaatt tggacttcat aatcagctga

1740

atcacgccgg atttagtaat gagcactgta tgcggctgca aatacagcgg gtcgcccctt

1800

ttcacgacgc tgttagaggt agggccccca ttttggatgg tctgctcaaa taacgatttg

1860

tatttattgt ctacatgaac acgtatagct ttatcacaaa ctgtatattt taaactgtta

1920

gcgacgtcct tggccacgaa ccggacctgt tggtcgcgct ctagcacgta ccgcaggttg

1980

aacgtatctt ctccaaattt aaattctcca attttaacgc gagccatttt gatacacgtg

2040

tgtcgatttt gcaacaacta ttgtttttta acgcaaacta aacttattgt ggtaagcaat

2100

aattaaatat gggggaacat gcgccgctac aacactcgtc gttatgaacg cagacggcgc

2160

cggtctcggc gcaagcggct aaaacgtgtt gcgcgttcaa cgcggcaaac atcgcaaaag

2220

ccaatagtac agttttgatt tgcatattaa cggcgatttt ttaaattatc ttatttaata

2280

aatagttatg acgcctacaa ctccccgccc gcgttgactc gctgcacctc gagcagttcg

2340

ttgacgcctt cctccgtgtg gccgaacacg tcgagcgggt ggtcgatgac cagcggcgtg

2400

ccgcacgcga cgcacaagta tctgtacacc gaatgatcgt cgggcgaagg cacgtcggcc

2460

tccaagtggc aatattggca aattcgaaaa tatatacagt tgggttgttt gcgcatatct

2520

atcgtggcgt tgggcatgta cgtccgaacg ttgatttgca tgcaagccga aattaaatca

2580

ttgcgattag tgcgattaaa acgttgtaca tcctcgcttt taatcatgcc gtcgattaaa

2640

tcgcgcaatc gagtcaagtg atcaaagtgt ggaataatgt tttctttgta ttcccgagtc

2700

aagcgcagcg cgtattttaa caaactagcc atcttgtaag ttagtttcat ttaatgcaac

2760

tttatccaat aatatattat gtatcgcacg tcaagaatta acaatgcgcc cgttgtcgca

2820

tctcaacacg actatgatag agatcaaata aagcgcgaat taaatagctt gcgacgcaac

2880

gtgcacgatc tgtgcacgcg ttccggcacg agctttgatt gtaataagtt tttacgaagc

2940

gatgacatga cccccgtagt gacaacgatc acgcccaaaa gaactgccga ctacaaaatt

3000

accgagtatg tcggtgacgt taaaactatt aagccatcca atcgaccgtt agtcgaatca

3060

ggaccgctgg tgcgagaagc cgcgaagtat ggcgaatgca tcgtataacg tgtggagtcc

3120

gctcattaga gcgtcatgtt tagacaagaa agctacatat ttaattgatc ccgatgattt

3180

tattgataaa ttgaccctaa ctccatacac ggtattctac aatggcgggg ttttggtcaa

3240

aatttccgga ctgcgattgt acatgctgtt aacggctccg cccactatta atgaaattaa

3300

aaattccaat tttaaaaaac gcagcaagag aaacatttgt atgaaagaat gcgtagaagg

3360

aaagaaaaat gtcgtcgaca tgctgaacaa caagattaat atgcctccgt gtataaaaaa

3420

aatattgaac gatttgaaag aaaacaatgt accgcgcggc ggtatgtaca ggaagaggtt

3480

tatactaaac tgttacattg caaacgtggt ttcgtgtgcc aagtgtgaaa accgatgttt

3540

aatcaaggct ctgacgcatt tctacaacca cgactccaag tgtgtgggtg aagtcatgca

3600

tcttttaatc aaatcccaag atgtgtataa accaccaaac tgccaaaaaa tgaaaactgt

3660

cgacaagctc tgtccgtttg ctggcaactg caagggtctc aatcctattt gtaattattg

3720

aataataaaa caattataaa tgtcaaattt gttttttatt aacgatacaa accaaacgca

3780

acaagaacat ttgtagtatt atctataatt gaaaacgcgt agttataatc gctgaggtaa

3840

tatttaaaat cattttcaaa tgattcacag ttaatttgcg acaatataat tttattttca

3900

cataaactag acgccttgtc gtcttcttct tcgtattcct tctctttttc atttttctcc

3960

tcataaaaat taacatagtt attatcgtat ccatatatgt atctatcgta tagagtaaat

4020

tttttgttgt cataaatata tatgtctttt ttaatggggt gtatagtacc gctgcgcata

4080

gtttttctgt aatttacaac agtgctattt tctggtagtt cttcggagtg tgttgcttta

4140

attattaaat ttatataatc aatgaatttg ggatcgtcgg ttttgtacaa tatgttgccg

4200

gcatagtacg cagcttcttc tagttcaatt acaccatttt ttagcagcac cggattaaca

4260

taactttcca aaatgttgta cgaaccgtta aacaaaaaca gttcacctcc cttttctata

4320

ctattgtctg cgagcagttg tttgttgtta aaaataacag ccattgtaat gagacgcaca

4380

aactaatatc acaaactgga aatgtctatc aatatatagt tgctgatatc atggagataa

4440

ttaaaatgat aaccatctcg caaataaata agtattttac tgttttcgta acagttttgt

4500

aataaaaaaa cctataaata ttccggatta ttcataccgt cccaccatcg ggcgcggatc

4560

cgccaccatg agacacagag ctatattcag aagaagaccc cgcccaagga gacgacgacg

4620

ccacagaagg cgctatgcca gaagacgact attcattagg aggcccacag ctggcacata

4680

ctacacaaag aaatactcca caatgaacgt catatccgtt ggaacccctc agaataacaa

4740

gccctggcac gccaaccact tcattacccg cctaaacgaa tgggaaactg caattacctt

4800

tgaatattat aagatactaa aaatgaaagt tacactcagc cctgtaattt ctccggctca

4860

gcaaacaaaa actatgttcg ggcacacagc catagatcta gacggcgcct ggaccacaaa

4920

cacttggctc caagacgacc cttatgcgga aagttccact cgtaaagtta tgacttctaa

4980

aaaaaaacac agccgttact tcacccccaa accacttctg gcgggaacta ccagcgctca

5040

cccaggacaa agcctcttct ttttctccag acccacccca tggctcaaca catatgaccc

5100

caccgttcaa tggggagcac tgctttggag catttatgtc ccggaaaaaa ctggaatgac

5160

agacttctac ggcaccaaag aagtttggat tcgttacaag tccgttctct gagcggccgc

5220

tgcagatctg atcctttcct gggacccggc aagaaccaaa aactcactct cttcaaggaa

5280

atccgtaatg ttaaacccga cacgatgaag cttgtcgttg gatggaaagg aaaagagttc

5340

tacagggaaa cttggacccg cttcatggaa gacagcttcc ccattgttaa cgaccaagaa

5400

gtgatggatg ttttccttgt tgtcaacatg cgtcccacta gacccaaccg ttgttacaaa

5460

ttcctggccc aacacgctct gcgttgcgac cccgactatg tacctcatga cgtgattagg

5520

atcgtcgagc cttcatgggt gggcagcaac aacgagtacc gcatcagcct ggctaagaag

5580

ggcggcggct gcccaataat gaaccttcac tctgagtaca ccaactcgtt cgaacagttc

5640

atcgatcgtg tcatctggga gaacttctac aagcccatcg tttacatcgg taccgactct

5700

gctgaagagg aggaaattct ccttgaagtt tccctggtgt tcaaagtaaa ggagtttgca

5760

ccagacgcac ctctgttcac tggtccggcg tattaaaaca cgatacattg ttattagtac

5820

atttattaag cgctagattc tgtgcgttgt tgatttacag acaattgttg tacgtatttt

5880

aataattcat taaatttata atctttaggg tggtatgtta gagcgaaaat caaatgattt

5940

tcagcgtctt tatatctgaa tttaaatatt aaatcctcaa tagatttgta aaataggttt

6000

cgattagttt caaacaaggg ttgtttttcc gaaccgatgg ctggactatc taatggattt

6060

tcgctcaacg ccacaaaact tgccaaatct tgtagcagca atctagcttt gtcgatattc

6120

gtttgtgttt tgttttgtaa taaaggttcg acgtcgttca aaatattatg cgcttttgta

6180

tttctttcat cactgtcgtt agtgtacaat tgactcgacg taaacacgtt aaataaagct

6240

tggacatatt taacatcggg cgtgttagct ttattaggcc gattatcgtc gtcgtcccaa

6300

ccctcgtcgt tagaagttgc ttccgaagac gattttgcca tagccacacg acgcctatta

6360

attgtgtcgg ctaacacgtc cgcgatcaaa tttgtagttg agctttttgg aattatttct

6420

gattgcgggc gtttttgggc gggtttcaat ctaactgtgc ccgattttaa ttcagacaac

6480

acgttagaaa gcgatggtgc aggcggtggt aacatttcag acggcaaatc tactaatggc

6540

ggcggtggtg gagctgatga taaatctacc atcggtggag gcgcaggcgg ggctggcggc

6600

ggaggcggag gcggaggtgg tggcggtgat gcagacggcg gtttaggctc aaatgtctct

6660

ttaggcaaca cagtcggcac ctcaactatt gtactggttt cgggcgccgt ttttggtttg

6720

accggtctga gacgagtgcg atttttttcg tttctaatag cttccaacaa ttgttgtctg

6780

tcgtctaaag gtgcagcggg ttgaggttcc gtcggcattg gtggagcggg cggcaattca

6840

gacatcgatg gtggtggtgg tggtggaggc gctggaatgt taggcacggg agaaggtggt

6900

ggcggcggtg ccgccggtat aatttgttct ggtttagttt gttcgcgcac gattgtgggc

6960

accggcgcag gcgccgctgg ctgcacaacg gaaggtcgtc tgcttcgagg cagcgcttgg

7020

ggtggtggca attcaatatt ataattggaa tacaaatcgt aaaaatctgc tataagcatt

7080

gtaatttcgc tatcgtttac cgtgccgata tttaacaacc gctcaatgta agcaattgta

7140

ttgtaaagag attgtctcaa gctcggatcc cgcacgccga taacaagcct tttcattttt

7200

actacagcat tgtagtggcg agacacttcg ctgtcgtcga cgtacatgta tgctttgttg

7260

tcaaaaacgt cgttggcaag ctttaaaata tttaaaagaa catctctgtt cagcaccact

7320

gtgttgtcgt aaatgttgtt tttgataatt tgcgcttccg cagtatcgac acgttcaaaa

7380

aattgatgcg catcaatttt gttgttccta ttattgaata aataagattg tacagattca

7440

tatctacgat tcgtcatggc caccacaaat gctacgctgc aaacgctggt acaattttac

7500

gaaaactgca aaaacgtcaa aactcggtat aaaataatca acgggcgctt tggcaaaata

7560

tctattttat cgcacaagcc cactagcaaa ttgtatttgc agaaaacaat ttcggcgcac

7620

aattttaacg ctgacgaaat aaaagttcac cagttaatga gcgaccaccc aaattttata

7680

aaaatctatt ttaatcacgg ttccatcaac aaccaagtga tcgtgatgga ctacattgac

7740

tgtcccgatt tatttgaaac actacaaatt aaaggcgagc tttcgtacca acttgttagc

7800

aatattatta gacagctgtg tgaagcgctc aacgatttgc acaagcacaa tttcatacac

7860

aacgacataa aactcgaaaa tgtcttatat ttcgaagcac ttgatcgcgt gtatgtttgc

7920

gattacggat tgtgcaaaca cgaaaactca cttagcgtgc acgacggcac gttggagtat

7980

tttagtccgg aaaaaattcg acaccacaac tatgcacgtt cgtttgactg gtacgccgtc

8040

ggcgtgttaa catacaagtt gctaaccggc ggccgacacc catttgaaaa aagcgaagac

8100

gaaatgttgg acttgaatag catgaagcgt cgtcagcaat acaatgacat tggcgtttta

8160

aaacacgttc gtaacgttaa cgctcgtgac tttgtgtact gcctaacaag atacaacata

8220

gattgtagac tcacaaatta caaacaaatt ataaaacatg agtttttgtc gtaaaaatgc

8280

cacttgtttt acgagtagaa ttctacgtgt aacacacgat ctaaaagatg atgtcatttt

8340

ttatcaatga ctcatttgtt ttaaaacaga cttgttttac gagtagaatt ctacgtgtaa

8400

agcatgatcg tgagtggtgt taataaaatc ataaaaatta ttgtaaatgt ttattattta

8460

aaaacgattc aaatatataa taaaaacaat ctacatctat ttcttcacaa tccataacac

8520

acaacaggtc catcaatgag tttttgtctt tatccgacat actatgtgca tgtaacaaat

8580

caaatacatc ttttaaattt ttatacacat ctttacattg tctaccaaaa tctttaataa

8640

ccctataaca aggaaaagac ttttcttctt gcgtggtttt gccgcgcaga tattgaaata

8700

aaatgtgcat gcacgacaac ttgtgtttac taaaatgctc cttgcctata ccgcaaaacc

8760

ggccatacat ttcggcgatt acacgcggac aattgtacga ttcgtctacg tgtaaacgat

8820

catcataatc actcttgcgc aaacgaataa attttttcac cgcttccgac aaacgaggca

8880

ccaattcggc gggcacgctt cgatacatta ttctgtgcac ataagttacc acacaaaatt

8940

tattgtacca ccatccgaca acgtcgttat tagggttgaa cacgttggcg atgcgcagca

9000

gtttcccgtt tctcatgaaa tattcaaagc ggcccaaaat aatttgcaag caatccaaca

9060

tgtcttgaga aatttctcgt tcaaaattgt tcaaagagaa tatctgccat ccgttttgaa

9120

cgcgcacgct gacgggaacc accgcatcga tttgctccaa cacttcacgg acgttatcgt

9180

cgatgcccat cgtttcgctg gtgctgaacc aatgggaaag gctcttgatg gaatcgcccg

9240

cgtctatcat cttgaccgct tcgtcaaagg tgcaactgcc gctcttcaaa cgccgcatag

9300

cggtcacgtc ccgctctatg cacgacatac cgtttacgta cgattctgat aggtattcct

9360

gaactatacg gtaatggtga tacgactcgc catacacgtc gtgcacctca ttgtatttag

9420

cataataatt gtaaattatt aactttgcag cgagagacat gttgtcagta aagcggtgct

9480

aggctcaata atactgatgt acaggcacgc gtgctattta tatataattt cgcaaggagg

9540

ggagctgtta tcggttgcta ttattaaaga atggccgtct gtttttatca caagcttggc

9600

agcctcaacc atgaagcgtc gtcattgtaa attaaattct ctgcctcaag aattatttga

9660

caagattgtc gagtatttat ctttatctga ttactgcaat ttggtgcttg tctgtaaaag

9720

accttctagt aaatataacg tgatatttga tagtactaat caccaacatt tgaaaggcgt

9780

gtacaaaaag acagacgtgc aaataacaag ctacaacgaa tacatcaact gtatttgcaa

9840

cgaactgaga caagacgaat tctatgccaa atcatcatgg attgcgagta tttgcggtca

9900

ccagagagcg acaattttta gtgtaacaaa taaacaagta gaaatgaaat atcatttgta

9960

taatatagca attgtggaaa gtgaagattg caacggattt tacccatttg agccaacgcg

10020

cgattgttta atatgcaaac aaaaaaacca atgtcctcgt aattcattta ttgtttcgtt

10080

gtgtaaatat ttagaaaaac aaaatgtaca atcaaacttt atatattatt tatacgaaat

10140

aaatacataa taataactat tatacatgtt tttattttac aatacttcct gtataacctc

10200

tctaactaca ttaggagtac aatccacgtc aattacacgt ttagctattt ttctaatttt

10260

gtaatgttta tcgtagagtt tttcgttaat acattgaata gccaacaagg gatttgggtg

10320

cacaccgtca tagagtactt ccatgtcgtc ttcaaagcgc atttttcgct tgcgaaaatg

10380

ccgctcttgg cccaaaacaa aagcgagttt gatgcggtcg tcgatgcgtt ccgaaaatac

10440

ggccaaatgc tggtgtttgg tgatgtcgcg cggaaacgtc accgtgccat ttttgctttc

10500

cgccacgacg gcggttttca atttttcggc cgactgcagc atgttaagtt tggcgtcgag

10560

ttcgtgcaaa cgcaattcaa actgctcaaa cctgttgccc acctcgttct tgaacgtctc

10620

gtgggtgacc ataaattttt cgctgtttgc attcagtttc tttacatgtt ttaaaacaga

10680

ttcaatcttg tcgcgcaaat catcacgctc gccttcagtt tgaatgtgca gcaacgcgtt

10740

gcttttgttg gcaaaattta accgcatcaa aatttccaac aacccgtgct tggtcgcgaa

10800

caatgcgccc aacgagttga gatcgcgttt ggatctctgt ttgtgaaaaa caatttcgtt

10860

taaatggtaa acttgatcgc cgtcccaatt gcaatcaagt atgtcgtcgt gcgcaatttc

10920

aagacctttg caaaaatcta tcacattgta gcattttgcg ttcgtgtcgc tgtgcacgta

10980

tctgtacttg aaactgtgcg tgttgcattt gaatgagtcc catttaacga tgtgcgacca

11040

ttgttgggcg tttatgtggt actttttgta gtcgtctgca ttgaaccgat cttcggcggc

11100

gatggcgtcg ttgtcgttgt caccggacca catccaccag ttccataacc aggatagcat

11160

tgctttagct tgtctagcaa ttcctttgtt atacaacgag aaaatttcgt tcccttataa

11220

ttatagctgt acggtgcgcg tatttgtttg ttaacgttac aaaaaatatc cctgtccacg

11280

tccggccaat actgcaacgt gagcgcgtcc aagtttgaat cttgcatatg cggaacgtac

11340

aaacgtacgg cctctctcac acaatgcgca aaactgcccg gctgaatgta atcactgtcc

11400

aactttgcag gtttctcgaa agccttgtac cgatgcacgc gaacattttg agcggacgtg

11460

attttaaact tgtcggtgaa ttttaaccac aaatgaaatc cacggttgcc ggtatacatg

11520

actcttgaca cgttctcttc cgtgtaaaac aacagaaacg ccgtggcgcc aatgtaaatt

11580

ttcagcatta aatcgtgttc gtcaacataa tttttgtaat cggcgtctac gacccattcc

11640

ctgccgccgc cgtcgtccaa cggtttgacg tgcacgtcgg acactttgtt ttgcacaata

11700

taactataca attgtgcgga ggtatcaaaa tatctgtcgg cgtgaatcca gcgcgcgttg

11760

accgtcatga acgcgtactt gcggctgtcg ttgtacgcaa tggcgtccca catcatgtcg

11820

acgcgcttct gcgtataatt gcacactaac atgttgccct ttgaacttga cctcgattgt

11880

gttaattttt ggctataaaa aggtcaccct ttaaaatttg ttacataatc aaattaccag

11940

tacagttatt cggtttgaag caaaatgact attctctgct ggcttgcact gctgtctacg

12000

cttactgctg taaatgcggc caatatattg gccgtgtttc ctacgccagc ttacagccac

12060

catatagtgt acaaagtgta tattgaagcc cttgccgaaa aatgtcacaa cgttacggtc

12120

gtcaagccca aactgtttgc gtattcaact aaaacttatt gcggtaatat cacggaaatt

12180

aatgccgaca tgtctgttga gcaatacaaa aaactagtgg cgaattcggc aatgtttaga

12240

aagcgcggag tggtgtccga tacagacacg gtaaccgccg ctaactacct aggcttgatt

12300

gaaatgttca aagaccagtt tgacaatatc aacgtgcgca atctcattgc caacaaccag

12360

acgtttgatt tagtcgtcgt ggaagcgttt gccgattatg cgttggtgtt tggtcacttg

12420

tacgatccgg cgcccgtaat tcaaatcgcg cctggctacg gtttggcgga aaactttgac

12480

acggtcggcg ccgtggcgcg gcaccccgtc caccatccta acatttggcg cagcaatttc

12540

gacgacacgg aggcaaacgt gatgacggaa atgcgtttgt ataaagaatt taaaattttg

12600

gccaacatgt ccaacgcgtt gctcaaacaa cagtttggac ccaacacacc gacaattgaa

12660

aaactacgca acaaggtgca attgcttttg ctaaacctgc atcccatatt tgacaacaac

12720

cgacccgtgc cgcccagcgt gcagtatctt ggcggaggaa tccatcttgt aaagagcgcg

12780

ccgttgacca aattaagtcc ggtcatcaac gcgcaaatga acaagtcaaa aagcggaacg

12840

atttacgtaa gttttgggtc gagcattgac accaaatcgt ttgcaaacga gtttctttac

12900

atgttaatca atacgttcaa aacgttggat aattacacca tattatggaa aattgacgac

12960

gaagtagtaa aaaacataac gttgcccgcc aacgtaatca cgcaaaattg gtttaatcaa

13020

cgcgccgtgc tgcgtcataa aaaaatggcg gcgtttatta cgcaaggcgg actacaatcg

13080

agcgacgagg ccttggaagc cgggataccc atggtgtgtc tgcccatgat gggcgaccag

13140

ttttaccatg cgcacaaatt acagcaactc ggcgtagccc gcgccttgga cactgttacc

13200

gtttccagcg atcaactact agtggcgata aacgacgtgt tgtttaacgc gcctacctac

13260

aaaaaacaca tggccgagtt atatgcgctc atcaatcatg ataaagcaac gtttccgcct

13320

ctagataaag ccatcaaatt cacagaacgc gtaattcgat atagacatga catcagtcgt

13380

caattgtatt cattaaaaac aacagctgcc aatgtaccgt attcaaatta ctacatgtat

13440

aaatctgtgt tttctattgt aatgaatcac ttaacacact tttaattacg tcaataaatg

13500

ttattcacca ttatttacct ggtttttttg agaggggctt tgtgcgactg cgcacttcca

13560

gcctttataa acgctcacca accaaagcag gtcattattg tgccaggacg ttcaaaggcg

13620

aaacatcgaa atggagtctg ttcaaacgcg cttatgtgcc agtagcaatc aatttgctcc

13680

gttcaaaaag cgccagcttg ccgtgccggt cggttctgtg aacagtttga cacacaccat

13740

cacctccacc accgtcacca gcgtgattcc aaaaaattat caagaaaaac gtcagaaaat

13800

atgccacata atatcttcgt tgcgtaacac gcacttgaat ttcaataaga tacagtctgt

13860

acataaaaag aaactgcggc atttgcaaaa tttgctaaga aaaaagaacg aaattattgc

13920

cgagttggtt agaaaacttg aaagtgcaca gaagaagaca acgcacagaa atattagtaa

13980

accagctcat tggaaatact ttggagtagt cagatgtgac aacacaattc gcacaattat

14040

tggcaacgaa aagtttgtaa ggagacgttt ggccgagctg tgcacattgt acaacgccga

14100

gtacgtgttt tgccaagcac gcgccgatgg agacaaagat cgacaggcac tagcgagtct

14160

gctgacggcg gcgtttggtt cgcgagtcat agtttatgaa aatagtcgcc ggttcgagtt

14220

tataaatccg gacgagattg ctagtggtaa acgtttaata attaaacatt tgcaagatga

14280

atctcaaagt gatattaacg cctattaatt tgaaaggtga ggaagagccc aattgcgttg

14340

agcgcattac cataatgcca tgtattttaa tagatactga gatctgttta aatgtcagat

14400

gccgttctcc ttttgccaaa ttcaaagtat tgattattgt agatggcttt gatagcgctt

14460

atattcaggc taccttttgt agcattagcg atagtgtaac aattgttaac aaatctaacg

14520

aaaagcatgt aacgtttgac gggtttgtaa ggccggacga tgaaggtaca acaatgcctt

14580

atgtcattgg accattatat tctgtcgacg ctgctgtcgc cgaccgtaaa gtgaaggacg

14640

tggtggattc aattcaaaac caacagacaa tgttaaaagt atttattaac gaggctaatg

14700

tgtataacaa atggaatatg cttaaaggtt taatttataa taataacaat gaatctgttt

14760

tagtaaaata atgtagtaaa atttataaag gtagataaaa attataatat taataaaaaa

14820

aataatgtta ctaaatgggt tcctgcgtta aattatttta cgggtagaca gctattaact

14880

attttattta tttttaaatt taaataaatg tattgttaga aaattgtgtt gttttattag

14940

tataacgaaa aaatacatga cataaaccgc ttccaatttt ggtcacacaa actcttgtgt

15000

ggatagttta cgtaatgagt taaataggcg ggcagttgtc cgctaaacgt gtcggtggtc

15060

aagtagatgt gcattaattt acgacaaccc aaagcggggc cgcttatgtc aagtattttt

15120

ttcacaaaat tggtaatggt ttcgttttgt tccttgtaca aacacatgtc ggtgtgatcg

15180

ttgacgcacg agttgtacga ttccgccggc aggttggcaa acaagcgctt gagatgcttg

15240

agtctgcgtt caattttata atcaaacttg ttggtgaaaa tgtctttcag caagcacatt

15300

aactggtcgt tcaaaacgcg ctgcaacgac gacaccaaca catgatattc gtttccaaaa

15360

agcgaaaaat ttttgatgca gcggtccgcg ttgaagggtc gtttcataat gcgcacgttg

15420

acaaaaaaca cgttgaaaga cagcggggct gtggttattt taacgccgtt gtcggtatac

15480

tcgtcgacgc cgtctgcgct tgttatgtca atttgtagcg caaatctaac caaatcaaac

15540

tcatcgttgt actgtgtctt tatgcatttt atatggcggt ttaagtgcaa gttgatttgg

15600

ccgtttaatc tataggctcc gttttgataa catttcagca ctaccaacgg atccgacatg

15660

taaacttgac gcgttagcac gtccaattca gcgtaatgtt ggtcgacgca tttttgtaaa

15720

ttagtttgca ggttgcaaaa catttttgcg caaaagccgt aatagtcaaa atctatgcat

15780

tttaatgcgc ttctgtcgtc gtcaatatgg catgtcacgg ctgcgcctcc agttaacacg

15840

aataaaccgc cgttttcgca aactacggct tcgaaacaat ctttgataaa tgccaacttt

15900

gctttagcca caattttatc gcgcaggcga tcttcaatat cctttgtcgt aatataaggt

15960

aggacgccaa gatttagttg attcaacaaa cgttccataa tgaatagcgg cgacgcaaca

16020

cgactacact gttcaaatgc gcacgcaaaa caaacccttg caactttatt tgccaatcgt

16080

aatcacagta gtttttacga gtacgccatc gcgtttgtaa gcacattgct ttttaaaaat

16140

aatttaaatt taatgaccgc gtgcaatttg atcaactcgt tgatcaactt tgaactcaac

16200

atgtttggta aaagtttatt gctaaatgga tttgttaatt tctgcattgc taacagcgac

16260

ggggttacga ttcaacataa aatgttaacc aacgtgttaa gttttttgtt ggaaaaatat

16320

tattaaaaat aaataaataa acttgttcag ttctaattat tgttttattt tttataaaat

16380

aatacaattt tatttataca ttaatacttt ggtatttatt aatacaatta tttacaatac

16440

tttatttaca ctataatact ttatttacat tagtactaaa ttaatactaa attacgctaa

16500

tactaaatta atactttata taatcaaaaa taatacttta tataatactt tctaatcatc

16560

ataaacgggt aatagttttt tctcttgaaa tttacgctgc aactcttcgc taaaacacat

16620

gggcggtgga gtgggagcgg gtggagtagg agtccttacg ggtttgatgg gcgacagttc

16680

tctggacttg cggaacagct tgggcgaaag cgtcggcgtg cgccgactaa tgatttcttc

16740

atccggcaac ggaggctcgc acattgtgca cgcgtccggt gaggtacaca aaactttctt

16800

gggcacgctg tacaccggct tgggcacgct atatgtgttg ccaaaataga actcgttgtg

16860

gttgccgaac ggagacgatg ggtgtgaaga cggcgatggc tgtgaagaca agtccgaagg

16920

cgcgataaaa gatgaaagtg tttctgaaac cgaagtggtg gtagaagtgg tagaaggcgg

16980

gtgcgttacg gcaaccacgc tgctgctatt tctgccttcg gagaccactt ccagcaatct

17040

agagttactc tctcgttctt cgcggcgata gtcaatgtcg caataatgtt cataagatgc

17100

cttttcggct tcggcgcgcc ttttcatgta tatgttgtga cgcatctcct ttaactgcac

17160

gtacaaattc cagcattgca cagccagtat cgtaagcacg cccattatga ttacgggata

17220

attttgatta aacacggtcg gctcgtgatc gcttacaatc gctcggcaca tgatgcattt

17280

tttgtaaatg ttcacataca cacagttttg gctcaaggtt tcggtatttg cgtagtcaat

17340

ttccagatac acgatagagt tccagcacat tgattccaaa tcgtagtgac gatataaaac

17400

atctagcgcc ggtagatgac catttttgaa cacgtagatt tgaaacgcgg caaacagcat

17460

ccaacacagc ccagtgatca cgtttaccat aatacacgtg atagcgacgt aaaagttttc

17520

tttcgcattg aaatttacat ttgtgtttga agagctgctg cgatttttcg tccacacgat

17580

aatcttccat ataaaataaa acatgtaaaa taatatccac atgccgaacg ccagcattat

17640

cggtatagat agattgataa ccgattgctt tccttcaatt tccagcaaaa acgcgtatct

17700

gctgtctatc actcccatta tagataacac aaacactatc agatatgcta ataataatga

17760

ggcattaagc ccgaattgta aaactgcagt gattttattt aacattttga atatttaatt

17820

caacaactaa gtaatggcaa tatgtatcga gtactgatcg tgtttttcct gttcgtgttt

17880

ctttatatag tgtaccagcc cttttatcag gcatacttgc atatcggaca tgcccaacaa

17940

gattacaatg acacgttgga cgataggatg gattacattg aatccgtaat gcgtagaagg

18000

cactacgtgc cgattgaagc gttgcccgca atcaggtttg atactaatct cggcacgttg

18060

gccggtgaca cgattaaatg catgtcggtg cctttgtttg ttagtgacat tgacctgccg

18120

atgtttgatt gtagtcagat atgcgataac ccgtctgcgg cgtatttctt tgtcaacgaa

18180

acggatgtgt ttgtggtcaa cggccacaga ctgacggtgg gcggatactg ctccactaat

18240

agtttgcccc gcaactgtaa tcgcgagacg agcgtcattt taatgagtct caatcagtgg

18300

acgtgcatag ccgaggaccc gcgttactat gcgggcacag ataacatgac gcaactcgca

18360

ggcagacaac actttgaccg cattatgccc ggacagagtg ataggaacgt cctgtttgac

18420

cgattactag gccgagaggt gaacgtgacc actaacacgt ttcgccgcag ctgggacgag

18480

ttgctggagg acggcactag gcggttcgaa atgcgctgca acgcccgaga taacaacaat

18540

aatctcatgt ttgttaatcc gcttaatccc ctcgagtgtc tcccgaacgt gtgcactaac

18600

gttagcaacg tgcacaccag tgttagaccc gtatttgaaa cgggagagtg tgactgcggc

18660

gacgaagcgg tcacgcgtgt tacgcacatt gtgccggggg acaggacctc tatgtgtgcc

18720

agcattatag atggcctgga taaaagtacg gcatcatata gatatcgcgt agagtgcgtt

18780

aatctgtaca cctctattct aaattattct aataacaaat tgttatgtcc cagtgacact

18840

tttgatagta acacggacgc agcttttgcc tttgaagtgc ccggctccta ccctttatcg

18900

cgcaacggca tcaacgagcc aacttatcgc ttttatcttg ataccagatc tcgagttaat

18960

tacaatgacg tcagagggca gttatcttaa ttgtgataac acaaacaata agtcatttaa

19020

atgttacgtc agtagttagt atataagccg tacatgttgg cttgcaaatt cagtcaatat

19080

caggctttta tcatggacgg tgtaaagctg ctagggacgt gcgcgctaat aattttgtta

19140

tcgacgacga gtacagttgt cgggcgtgac cgtatcacgt ttacgccgat agaagatagc

19200

gcaggcctca tgtttgaacg catgtacggc ttgcgacatc atacagacga cagatttgtg

19260

tttgtgaaaa aattcaattt tgtttcggtg ctgcaagagc tcaataatat caaatctaaa

19320

attgaattat atgaagcgca agtttcaact tgcacaaacg tcagacaaat aaaacagaac

19380

agatcgagta tcatcaaagc tcgcattgaa aatcagctgc agtttttgac gcaactaaac

19440

aaaaatctca tcacatactc tgtggaaagc agcattttaa gcaacgacgt gctggacaac

19500

atcgatctgg aatatgacga cagcggtgag tttgacgttt acgacgaata cgaacagcct

19560

tcgcattgga gcaacatgac tgtatccgac gcgcaagctt tgctccgaaa cccgcccaaa

19620

gacagagtaa tgtttttgga catggttacc accagcgacg tgagcagcaa atacgaagaa

19680

tacataaact gcattgtgag caaccgtacc gttgaaaacg agtgcatgtt tttagccaac

19740

atgatgaacg tgctcaacga caaattggac gacgcagcag ctttggccaa gatgctggag

19800

cgaatagtaa aacaaacgcg aaagaacaaa ctcaacatct ccaacacggt tatagacgac

19860

gacacgctgc taacggaaat gaaaaaatta acacaaactt tatacaacca aaaccgcgtg

19920

tgggtagtgg attttaacaa ggacatgaat agttatttcg atttgtcgca agcgtataaa

19980

ttgcatttat atgttgattt aaacacggtc attatgttta ttaccatgcc attgttaaaa

20040

tccaccgccg tttcgtttaa tttgtatcgc gtcatgacgg tgcctttttg caggggcaaa

20100

atgtgtctgc ttatcatttc gggcaatgaa tactttggga ttacagacag caaaaactat

20160

tatgtgcccg tatctgataa ctttagacaa gattgccaag agtttacggg ctacaatgag

20220

tttttgtgtc ccgaaactga gccgattgcc actatgaact cgaaagtgtg cgagattgaa

20280

atgtttatgg gtcgatatag cgacgacgtg gacaacatgt gcgacattag ggtggccaat

20340

tataatccca aaaaagctta cgtgaacact ttaatagact accgaaaatg gttgtacatt

20400

tttccaaaca cgaccgtgtc cgtccactat tattgtcacg acgcgcttgt agaagttgat

20460

acaaaagttt cgcccggcgt tggtgttatg ttttcgacta tggcgcaaac gtgttcgatt

20520

agaataacgt atgatgtgac cataactgta gattcgcgat tttatgtcag ccattcaact

20580

acatactggc ctaaaaagaa atttaatttt aacaactaca tcgaccaaat gttgcttgaa

20640

aaagcgacca ccagttttat accgactgtt gacaatttta cccggcccgt tttattgcaa

20700

cttcctcata aatttcacat taaagattac acatcgacgc cccatcattt tttccatcag

20760

tctaaaattt acaccaacag cgcggcgccc gacgaagact cgcaagacga cagtaatacc

20820

accgtggtaa ttatcgctat tgtcgctgca atgatcctat tctgtggatt attgttattt

20880

ttgttttgct gtataaaaaa acggtgtcat caatcaaata acgtggttgt gcaatacaaa

20940

aataacaatg aatttgtcac aatttgcaat aatttagaag acaatcgagc atacattaat

21000

ttacctaatg aatacgatag cgatgatatg ccaaaaccat tgtacccttt acttggcttt

21060

aatgatgatt tgttaaaaga tgataaacct gtgttgtacc ctatgattat agaaagaata

21120

aaataaaaca tgtataattg aaataaatat attatttaat aaaatgtttt ttatttatat

21180

actattttct attacatatt ccaatgcaca caaatgttta atggctatca gttttaattt

21240

tactaattcg tctaaacaaa aattattcac ttgctgtttt tcatccattt gacatatggc

21300

gtttataaat aattcgctgt gttttatgaa cgaatcgtaa accgctgcct gggccttcag

21360

cacggtcggc gcattgtatt tttgggtaaa gtacgcaata tttttagtca aacacagaga

21420

ttttaaatct ttttcattta tatccaagtc ggaacaatcg tatacaaaat ctagcttttc

21480

actttcgggc gcgcccagat actggtttac gagttcgagc tgctccactt ggcctttgat

21540

atcggccgct atgcacaaca ttttgtcgat tgcagtttca ttgtttttaa cataataatt

21600

tttaactttt ttattttgca atttaatcaa actatttaaa ttcgcttgac ctttcttaca

21660

aagcgcagtt aatatgcaag acattttgac ttataataaa aaacaaaact tttatatatt

21720

catttattgt tcaataataa caaatattcc aggcttaaaa gctaacgaat agggcttttc

21780

ggtaattttc ttattattca tgtccgtcat ctgcatctct ttgccgtact tgacgccgtc

21840

aatggtgccc atcatgtaca ttttaatctc ctccgaaggt ccgtctattt tgtccatttc

21900

gaacaatcta tcaaaatctt caacgctcat tctctgcata tcaagaggaa cgtttctgat

21960

ctttccggtg gcgtaaattg atccgttgtt gtcacggttg attatgtaaa accgacgaat

22020

caacatgtcg cgctcgctag ttttgttctt atccggcaaa tgaatgcaca cgtttggttc

22080

catcttcaaa ggaaaatcgc tttgcaagtg tttttgcaaa atgttgccaa atatattgtt

22140

gtgtttgtga atgtctccgt attgaatgct aaaaaactgg ccaaagttgc ttttggcacg

22200

ttttatggtt ccaaagtcgg aaaaccaaaa tccgcagggc ttgccctgca ctcttggacc

22260

gatggtgtac gtagtcttgc cgttggccgg ctccaacacc acgatatttt tatcgggctc

22320

gggatacaac ttgtcttccc attcgtgcaa actgttcaaa ttagacagtc gacaaaattc

22380

gtttttcaaa aatctgcctt cgaaacaact acaattcagt attgaaaagt tgcctcgttt

22440

cacattaatc gccatctgct cctgccacaa catcttcgtc aactcgtgtg gctccaattg

22500

aatggacgac ggcgtaaaat agcacattac gcccgtttcg tcgtgtttca cgttaaaagc

22560

gccgctgttg tacggcacca gctgctggtc ctcaccacct tccgatcttt cccgcttcgg

22620

ctggttgtcg tcgctgctcg aatatccatc gccaatcttg cgtttagttg ccatgctacc

22680

gacgtgcgct gtctgctgtg gttcaagtct aattgaagtg tttcacagaa tataagatat

22740

ataataaata tggacgactc tgttgccagc atgtgcgtag acaacgcgtt tgcgtacact

22800

actgacgatt tattgaaaaa tattcctttt agtcattcca aatgcgcccc tttcaagcta

22860

caaaattaca ccgttttgaa gcggttgagc aacgggttta tcgacaagta tgtggacgtg

22920

tgctctatca gcgagttgca aaagtttaat tttaagatag atcggctaac caactacata

22980

tcaaacattt tcgagtacga gtttgtagtt ttagaacacg atttgtccac agtgcacgtc

23040

attaacgccg aaacaaaaac caaactgggc catataaacg tgtcgctaaa ccaaaacgac

23100

gcaaacgtgc tcattttgac cgtaacttta acgagctaaa atgaacgagg acacgccccc

23160

gttttatttt atcagcgtgt gtgacaactt tcgcgacaac accgccgaac acgtattcga

23220

catgttaata gaaagacata gttcgtttga aaattatccc attgaaaaca cggcgtttat

23280

taacagcttg atcgttaacg ggtttaaata caatcaagtt gacgatcacg ttgtgtgcga

23340

gtattgcgaa gcagaaataa aaaattggtc cgaagacgag tgtattgaat atgcacacgt

23400

aaccttgtcg ccgtattgcg cgtatgctaa caagatcgcc gagcgtgaat cgtttggcga

23460

caacattacc atcaacgctg tactagtgaa agaaggcaaa cccaagtgtg tgtacagatg

23520

catgtccaat ttacagtcgc gtatggatac gtttgttaac ttttggcctg ccgcattgcg

23580

tgacatgatt acaaacattg cggaagcggg acttttttac acgggtcgcg gagacgaaac

23640

tgtgtgtttc ttttgcgact gttgcgtacg tgattggcat actaatgaag acacctggca

23700

gcgacacgcc gccgaaaacc cgcaatgtta ttttgtattg tcggtgaaag gtaaagaatt

23760

ttgtcaaaac tcaattactg tcactcacgt tgataaacgt gacgacgaca atttaaacga

23820

aaacgccgac gacattgagg aaaaatatga atgcaaagtc tgtctcgaac gccaacgcga

23880

cgccgtgctt atgccgtgtc ggcatttttg cgtttgcgtt cagtgttatt ttggattaga

23940

tcaaaagtgt ccgacgtgtc gtcaggacgt caccgatttt ataaaaatat ttgtggtgta

24000

ataaaatggt gttcaacgtg tactacaacg gctattatgt ggaaaaaaaa ttctccaagg

24060

agtttttaat tcatattgcg cctgatttga aaaacagcgt cgactggaac ggcagcacgc

24120

gcaaacagct gcgcgttcta gacaagcgcg cctacaggca ggtgttgcac tgcaacggca

24180

gatactactg gcccgatggc acaaagtttg tctctcatcc gtacaacaaa tctattcgca

24240

cgcacagcgc aacagtcaaa cggaccgaca gctcgcatcg attaaaaagc cacgtggtcg

24300

acaaacgacc gcgccgctct ttagattctc ctcgcttgga cggatatgtt ttggcatcgt

24360

cgcccatacc acacagcgac tggaatgaag aactaaagct gtacgcccag agccacggct

24420

acgacgacta cgacgacaat ttagaagatg gcgaaatcga cgaacgtgac tctttaaaaa

24480

gtttaaataa tcatctagac gacttgaatg tattagaaaa acaataaaac atgtattaaa

24540

aataataata ataaaactat attttgtaat atataatgta ttttatttaa aaattgtcta

24600

ttccgtagtt gagaaagttt tgtcttgact tcataactct cttctccata ttctgcagct

24660

cgtttacgtt ttttgtgacg cttttaattt tctcaaaatg ctggctgtca atagttattt

24720

tttgcttttg tctattaatt tcttccaatt gagattttaa atctcgctga gattgagatg

24780

cgttgtaatt ccttgagaac atcttgagaa aacatacaga tgaggtaaaa cagcatcttt

24840

tatccaaatt aggagttaat tattattcat ttgtatcgcg accatttgct cgtacacatc

24900

ttccataaaa tggttatttt tattgcgata agtgttggca ttgacatttt gcaaatgtcg

24960

taggttaaag gggcaaatgg gctgcgtggc cgataaaaga ttccagttca acaatccctc

25020

ttcgcccccg tttaacttga aaatggcgct acacgtttct acgctatcgt gttcctgttg

25080

agtggcgcac ggttcgacca gtatcatctt gtgatatgcg gttttgacat tcatgtgcaa

25140

cggaataact tgcgggtcat cgcattcgtc ggaattaagc tttaaatggc gtccgtatgc

25200

tttccaaagt ttttcgtcgt cgaaccgcgg cactgcttgc aagtcgacgc ggggaaacgg

25260

cgctctgtac aaaacgccta aattcaaaaa ctgattgcat tgttgcagct ctgtccaatc

25320

gacgcgattt ttgtaatttt gaaacagcat caggttgaac gccgcgctgg cgcgcacgtt

25380

tgtaatcact gtgtaattga tcagcttgtg ccaatactgg gcattgaaat tttcttcaaa

25440

ctcatttcta aactctggat gcgcaaacat gtgtctaatg tagtacgcgg gcggggcgtt

25500

gaacgcagtc catttgtcaa tacacttcca gtctgaatgt aacgtgttca ccaaaccggg

25560

atattcgtca aacacgagca tgtgatccga ccacggtatg ctgtgggcga tcaattttag

25620

ttcttgcacg cggccttcgc gtaagcaata caaaatgagc gcgtcgctga tcttgacaca

25680

gtcttgcatg tacgcggaca aattaacgtt ttccatacag ctcacattgt ttattagcgc

25740

cgtgttcaag tgtttgtatt tggacacata atcgtagttg atgtactgtt taatgggttc

25800

ttgaaaccat tcttttagta gtatgtgact ggccactatg cgtttccaat ttaatttgtg

25860

tgcgtatttt tgctgcaccg acaacgagag gttattgtaa tttttggata tttcttccat

25920

gtccaacaag tccccaaacg cgagtataaa atcttgcgtc aaaaattttt gctcagacac

25980

caacgaccag atcaaatgtg atttaaacct gttggcgatt gttatcgaca acggcgaaat

26040

tgaaataatt ttccaatcca acttgttgcg aaacacgtga ataaaatcga cgcgtccgta

26100

acattcgcgc gatatgcgct tccaaaacgt gtcatcttgc aaattaagca aatagacacg

26160

attgttggga gatttgacgg ccaattcaat tatttttata tattcttttt gctttaaagc

26220

gcgttgtagc acttgggttg gagccatgtc gactgaagct ccacgctgtt tgaagcaagg

26280

tgaccgtttt ggtcggcatg ttcaaacgtc gattacatgt ttgctttgca tcaaaatggc

26340

gtaattaatt aagaaacaac atgaaagcca tctgcatcat tagcggcgat gttcatggaa

26400

aaatttattt tcaacaagaa tcagcgaatc aaccgcttaa aattagcggc tatttgttaa

26460

atttgcctcg aggtttgcac ggctttcacg tgcacgaata tggcgacacg agcaacggtt

26520

gcacgtcggc cggtgagcac tttaatccca ccaatgagga ccacggcgct cccgatgctg

26580

aaattaggca tgttggcgac ttgggcaaca taaaatcggc tggctacaat tcactgaccg

26640

aagtaaacat gatggacaac gttatgtctc tatatggccc gcataatatt atcggaagaa

26700

gtttggtcgt gcacacggac aaagacgatt tgggccttac cgatcatccg ttgagcaaaa

26760

caaccggcaa ttctggcggc cgtttgggat gcggaataat tgccatatgt aaatgatgtc

26820

atcgttctaa ctcgctttac gagtagaatt ctacgtgtaa aacataatca agagatgatg

26880

tcatttgttt ttcaaaactg aactcaagaa atgatgtcat ttgtttttca aaactgaact

26940

ggctttacga gtagaattct acttgtaacg catgatcaag ggatgatgtc atttgttttt

27000

caaaaccgaa ctcgctttac gagtagaatt ctacttgtaa aacataatcg aaagatgatg

27060

tcatttgttt tttaaaattg aactggcttt acgagtagaa ttctacttgt aaaacacaat

27120

cgagagatga tgtcatattt tgcacacggc tctaattaaa ctcgctttac gagtaaaatt

27180

ctacttgtaa cgcatgatca agggatgatg tattggatga gtcatttgtt tttcaaaact

27240

aaactcgctt tacgagtaga attctacttg taacgcacga tcaagggatg atgtcattta

27300

tttgtgcaaa gctgatgtca tcttttgcac acgattataa acactaatca aataatgact

27360

catttgtttt caaaactgaa ctcgctttac gagtagaatt ctacttgtaa aacacaatca

27420

agggatgatg tcattataca atgatgtcat ttgtttttca aaactaaact cgctttacga

27480

gtagaattct acgtgtaaaa cacaatcaag ggatgatgtc atttactaaa ataaaataat

27540

tatttaaata aaaatgtttt tattgtaaaa tacacattga ttacacgtga catttacgat

27600

ggcgaacaat aatttcactt tttatattag gacacgacgt gtatatagga aagcttaagc

27660

gtttcaataa agccatggcg tacacgctaa gcttgcccag cttgcggctc tttgaaatct

27720

gtagttttcg gggagtaccg tcgttcttca gtgccacata cgtcaacttg cgatcgtaca

27780

ctttataata cgtgttgtag ttattttttt ccagaaattc cctcataaag caatccttgg

27840

ataaagtttt tgatccgtac agttggccac accggtccat gcacaggtac acacacgtga

27900

tggcgttttg aatgacgatg cgatttctgt caacggcaac gcgcttgaat atggtgtcga

27960

cgttgtccga ttcaatggtt ccgtaaacag ctccgtctgg atttactgcc aaaaactgcc

28020

ggttaataaa cagctggccg ggaatagacg tgcccgtgat gtgtgtcagc agagctgagc

28080

agtcagccat agaggctaga gctacaagtg ccagcaagcg atacatgatg aactttaatt

28140

ccccacagca aactggcgct tttatataaa aatttgggcc atttttggcg attagataat

28200

ttttgaagat tagataatat tgagattagt taataatttg tgtgattaga taacttttta

28260

gggtattgcg cattataaat caaggtcgag ttgtataaac tgctctggcg tgtaaaactg

28320

cagacttaag ttttttgcaa acactcggtc tgaatcgcta aaatctttct gaccggtggt

28380

tagattaatt cggccagccg cgtcgcccac ataaaaagat tgttccttgt caatatgcgt

28440

aaactgtttg gccatctcgc gccacattcc cgtgtcgggc tttcgatgct catccttgtt

28500

gggcgacaca taaaacgata tgggcacgcc agtagctttt ttaatattct ctaatttata

28560

taataaatcg ctcgctttga ttttgccgga acctaaatgg gcttggttcg taaaaacaac

28620

taaatcgtag cctaattcgt acaaacgctt tagcttgtgt gcgcacggaa ggagctgcca

28680

gtcgtctggg ttttttggaa atttggaccg tgtctttgag ctaattagcg tgccgtccaa

28740

atcaaaagcc gcaattttgg ttcttttagc gccgtcatga accgcgtacg catacaaatc

28800

gggctgctgt aacgtccaca tggtgaatgc atcttactca aagtccatca attcgtacgc

28860

gtttgtgtcc aggtcgggcg ttgaaaaatt gtagcttgcc attagatcgg atagcgattc

28920

aaattttgta agcgtttgta gcgcacgttt ggcatcttgt ttaaaattac acgacgacag

28980

acagtaaaaa tattcctcga taagcatgac tacacccata tcactgttta agtgctcgac

29040

gtagttgttg catgttatgt cgcgtgtgcc gcgatacgcg tgatttcggt gaaaatcaca

29100

ccacaaccag tcggcgtgcg tgtaacaaag tcgacagcga aacaatttat cgttttccaa

29160

aaaatttaaa tactcgacag ttttgcagct tagattccgc gtttgattca ccttaaaatc

29220

gtcgtcagcc tctataatct cgggcaacag cttgccttgt tgccccatcg tatcgatcac

29280

ctcccccaag tggcccggtg ttatattaag tcgtttaaaa tcatttattg cttcctgcac

29340

gtcggcctgg taatttttga ccacgggcgt ggaaatcaat tgccgttgaa gggaaataat

29400

tcgtggtgtg ggtatcggcc gcctgttgca caattccacc agcggtggag gcaagggcgc

29460

attcacagca accgttgtca tttataagta atagtgtaaa aatgcaaata ttcatcaaaa

29520

cattgacggg caaaaccatt accgccgaaa cggaacccgc agagacggtg gccgatctta

29580

agcaaaaaat tgccgataaa gaaggtgtgc ccgtagatca acaaagactt atctttgcgg

29640

gcaaacaact ggaagattcc aaaactatgg ccgattacaa tattcagaag gaatctactc

29700

ttcacatggt gttacgatta cgaggagggt attaataata acaataataa aaaccattaa

29760

atatacataa aagtttttta tttaatctga catatttgta tcttgtgtat tatcgctaac

29820

cattaaaagt gctggagcca cagtgttgcg gcgagtcttt atagaagatc gttgtttggc

29880

tggaactgag cttttccttt tcctgctgcc gctaatggga gtgggcacgt actctgtagt

29940

agacggtgca acgggcaact tgagcgctac cgtcttaaat ttggccatac ttttagtgat

30000

gaaatcgcgc gttaacactt cgtcgtaaat gttacttagc agaggcgcaa cattgtgatt

30060

aaatgtctcg tttaacaagc tgtaaaactc cgaataaagc ttatcgcgca tttcgcagct

30120

ctccttcaat tctgccaaat ttgcgttggt aagcaccaca gtctgtcttt ttttgctcgc

30180

tggaattgct gcgttctcgc ttgaagacga cgatgtcgat cggtcggcca tttttttgcc

30240

cagcttttca gtgtgatcaa aaatgaacac aaaatctgcc aattcgggct tgtttttcac

30300

caaatcccac atggccgggc tactaggcca ctcgggctgc ttgatcttag tgtaccaact

30360

gttaaacaaa atgtatttat tgttgttaat cactttcttc ttgcgtttgg acattttgcg

30420

ttcgtcttgc atgacaggca ccacgttaag gatatagtta atgttctttc tttccaagaa

30480

atttacaata acggccagct ggtccatgtt ggatttgttg taagagctcg attccagttt

30540

attcaacagc ttttcatttt tgcacacggc cgcagtctcc ggagattgtt gctccggcac

30600

gtttaccatg tttgcttctt gtaaaccttt gaaacaaccc gtttgtattc ttgatgatat

30660

atttttttaa tgcccaacaa cctggcaatt cgtttgtgat gaagacacac cttacgcttc

30720

gaacatttgt cggtgattac tgtgaaatgg cctaaattag ctcttatata ttcttttata

30780

cgctcaaacg acacgatgtc caacatgtgc gcgcagacgt tttctgtgtt catcgtgtgc

30840

ttgagcgtgt tgatggcttc cctgaacagc gcttgtattt cgctgcgagt caagcagtcc

30900

gaatcacacc cgcctaagtg cgtgcaattt ttggggggca tcgttgtcta tctttttcag

30960

agtggcgtag aaaaagtcct gcaattgcct attatcaaaa cgcgccttga cgctgcgcac

31020

aaaatcaaaa aattcaatgt aattgctgta atcgtacgtg atcagttgtt tgtcgttcat

31080

ataattaaag tatttgttga gcggcacgat ggccaggctg cgcgctattt cgcaattgaa

31140

gcgtcgcggt tttaacatta tacggtagtc attgccaaac gtgcccggca acaacttcac

31200

ggtgtacgtg ttgggtttgg cgttcacgtt aatcaagttg ccgcgcacga cgcctacgta

31260

tatcaaatac ttgtaggtga cgccgtcatc tttccattgt aacgtaaatg gcaacttgta

31320

gatgaacgcg ctgtcaaaaa accggccagt ttcttccaca aactcgcgca cggctgtctc

31380

gtaaactttt gcgtcgcaac aatcgcgatg acctcgtggt atggaaattt tttctaaaaa

31440

agtgtcgttc atgtcggcgg cgggcgcgtt cgcgctccgg tacgcgcgac gggcacacag

31500

caggacagcc ttgtccggct cgattatcat aaacaatcct gcagcgtttc gcattttaca

31560

tatttgacac ttaaaaaatt gcgcacacga gcaccatcgt ttgataccta attgcaacta

31620

tttacaattt atcagtttac gttgaacccg ttttaatttt ttagatccgt ccttgttcag

31680

ttgcaagttg actaaatgac aaaatttttc ggttctgcaa aaccgccctt gtctgttcca

31740

cccgttgtat ttgaaaaaac tttttttcac gcggcgacaa ctgcttgtat aatattgccc

31800

aatgtaaaca tgcaaaattt tgttactctc gtcaaaacag cggttggcgt tccattccat

31860

aattttttta ttatttatca acgatggcca ttgtaaattg tcgtcattta tacgcatcat

31920

atgatttaac aaaagctttt cgtatagcgg aacttcaatt cccttggaac atttttcaaa

31980

cgataattta atttgtttct cggttggcag catttcatgc ttgattaaca atcgcctgac

32040

ttttatagcc acgtttatgt ctttgcacag caaatgtggg ttgtcgacaa tgtaatagtg

32100

caaagcattt gttacggcaa atgcgtagtt tgatttgacg acgccctttt tcttgacggg

32160

cattgcggct tttaaaatta cttgcaagca ttgtacgaat acctctttgt gtttaaacaa

32220

taatatggac aaacatcggc gaaacaattt gtaataatta tgaaatccca aattgcaggt

32280

tttaaacttc tttgttactt gttttataat aaataaaatt tgctgaccca tgtctgcgcc

32340

cacaacttta attaaccatt tgtgcgcata ttgattgtct cgttgttccc aaccggaaaa

32400

ttgattgatc tcgagccacc ggcattggtc gtttgatacc gtcgttaacg ccgacgctcc

32460

tgcctgtttg attacgggtt ctaaaagacg aaacagcagc gtaaatttgt ttttgcgtcg

32520

gtagtatttt ggcaggcaat aatcaaaaaa atccgtaagc aattctctgc atctattaat

32580

attcgttgcg tacgaatcga gtttttcaaa aattactttg tttgtatgaa aataacgttt

32640

gggcttctca caataataat cttcgttgta gaacagaaac ggtttgcgag aattggcacg

32700

tttgtccatg attggctcag tgtaacgatt gattcaaatc aaaattgaca acacgtttgc

32760

cgtaatgtgc accggttcgc acacgtttgc cgcgtatgta atccatgttt atttcgctgt

32820

cgcaattgat tacacgattg tgttgggcgg cgcgttttat tgaatttagg cgacgcgtcg

32880

acaactccaa aggattgtaa agcgcagatt tttccagagt aaacgagttt aagtggccac

32940

cgttgaacca ttccagagcc acgattgtgt acagcaaaaa gaatatttct ttgtcgacgt

33000

tttcaaacgc aaacttgttt tttaggcaat agtagtaaaa ttttaacgaa ttgtataaat

33060

aaaacataaa attgccattt ttaaagtaaa attctacatc cgtgacgaac aaaaggttta

33120

ctattttgtt ctccaacaag tgtgccaatt ttcttaagta caccattgaa tttttgtcgt

33180

cgtccatctc gatcaacaac acgtacggcg ttttggaatt taaaattatt ctaaaatttt

33240

cctgttgcaa cgattccaca gcgtccgacc aatatgacgc tgccacctct agacagatgt

33300

atttcttgga aaacacgtgt cgtttgataa cctcgctgat ggacgtgatc gattgtaaat

33360

acttttcaaa cgtcgcgtct tcccaaccac gcaccgacac gggcgctgtc gtgtcgggct

33420

gatgtttgaa atccaaacca ctctgaatta acttggttgt gattcgtatg ctcaactgtt

33480

gacccaacgt gtagtgatct tcgtaggcgc gctcccacat cacgttacac acaaatttga

33540

cgagatcatc aacgtctttc tgttgcaaaa ttcgccgcaa acgcgccaca tcgcccttgt

33600

accaccgatc tcggcacaca agctgtagca tttttaaatc gtgatcgctc aagctattaa

33660

ttctggttag atttatatag tcgtcaatat cctcgggcgt ggtttgcgtc atgtctgtaa

33720

aacgtgcaaa atcaaacatt tttatgttgt agtcgaatct aacaaatcca tcggcgttca

33780

cttgcacttc gcgctttaca aaacgaggta gcgtgtaatc gaacccgttt aaatagattg

33840

cgtacaaaac cagcacttca tcttccagtt tgcacgcttg cggcaaaaat tgtgtggtgt

33900

gctccaaccg ggtgacaaac atgactatgg aaaataacgc ggaattcaac agacgactag

33960

agtacgtggg cacgatcgcc acaatgatga aacgaacatt gaacgtttta cgacagcagg

34020

gctattgcac gcaacaggat gcggattctt tgtgcgtgtc agacgacacg gcggcctggt

34080

tatgcggccg tttgccgacc tgcaattttg tatcgttccg cgtgcacatc gaccagtttg

34140

agcatccaaa tccggcgttg gaatatttta aatttgaaga aagtctggcg caacgccaac

34200

acgtgggccc gcgttacacg tacatgaatt acacgctttt taaaaacgtc gtggccctca

34260

aattggtcgt gtacacgcgc acgctacaag ctaacatgta cgcggacggg ttgccgtatt

34320

ttgtgcaaaa tttttcagaa acaagctaca aacatgttcg tgtgtatgtt agaaaacttg

34380

gtgcgataca agtagcgaca ttatcagttt acgaacaaat tattgaagat acaataaatg

34440

aactcgtcgt caatcacgtt gattagataa tgtccgtgtt aaatgtgata tcttagatta

34500

cgagcgcgca ataaccatag tttaatcgaa gagaatagcc gtcgccacaa tggataatta

34560

caaattgcaa ttgcaagaat tttttgacca agcgcccgac aacgacgatc ccaactttga

34620

acatcaaacg cccaatctat tggcgcatca gaaaaaaggc atacagtgga tgattaacag

34680

agaaaaaaac ggccggccca acggcggcgt gcttgccgac gacatgggac tcggcaaaac

34740

gctctctgtg ctaatgttaa tcgcaaaaaa caactctcta caattgaaaa ctctaatagt

34800

gtgtcctttg tctttaatca atcattgggt aaccgaaaac aagaagcata atttaaattt

34860

taacatttta aagtattaca aatctttgga tgccgacacg tttgagcatt accacattgt

34920

ggtgaccacg tacgacgttt tattggcaca tttcaaattg atcaaacaaa ataaacagtc

34980

aagtctgttt tcaacccgct ggcatcgagt tgttctagat gaagcgcata ttatcaaaaa

35040

ctgcaagacg ggcgtgcaca acgccgcgtg cgctttgacc gcaacaaacc gatggtgcat

35100

taccggcaca ccgatccaca acaagcattg ggacatgtac tcgatgatta attttttgca

35160

atgtcgtcct tttaacaatc caagagtgtg gaaaatgtta aataaaaaca acgactctac

35220

aaatcgcata aaaagtatta ttaaaaaaat tgttttaaaa cgcgacaaat ctgaaatttc

35280

ttctaacatt cctaaacaca cggttgagta tgtacatgtt aattttaatg aagaagaaaa

35340

aacgttgtac gataaattaa agtgtgaatc ggaagaggcg tatgtgaagg ctgtggcagc

35400

gcgtgaaaac gaaaacgcac taagccgatt gcagcaaatg cagcacgtgt tatggctaat

35460

actgaaattg aggcaaatct gctgccaccc gtatttggcc atgcacggta aaaatatttt

35520

ggaaacaaac gactgtttta aaatggatta tatgagcagc aagtgcaaac gagtgctcga

35580

cttggtagac gacattttga acacaagcaa cgacaagata atattggttt cgcaatgggt

35640

ggaatattta aaaatatttg aaaacttttt taaacaaaaa aacattgcta cgttaatgta

35700

cacgggccaa ttaaaagtgg aagacaggat tttggccgag acgacattca atgatgctgc

35760

caatactcaa catcgaattt tgctgctttc cattaagtgc ggcggcgtcg ggttaaactt

35820

aataggcgga aaccacattg taatgttgga gcctcattgg aacccgcaaa ttgaattgca

35880

ggcgcaagac cgaatcagtc gtatgggaca aacaaaaaac acgtacgtgt acaagatgct

35940

aaatgtggaa gacaacagca tcgaaaaata cattaaacaa cgccaagaca aaaagattgc

36000

gtttgtcaac acggtctttg aagagactct gctcaattac gaagacatta aaaaattttt

36060

caacttgtag ctggtaagtc gtcatgaaca cccgatatgc tacttgctat gtttgcgacg

36120

agttggtgta cttgtttaag aaaacgttta gtaacatgtc cccttcggcc gctgcgtttt

36180

accaacggcg catggccatt gttaaaaacg gtatcgtgct gtgcccacgt tgttcgtcgg

36240

aactaaaaat tggcaacggc gtttcgattc caatttaccc ccaccgcgct caacaacatg

36300

cacgacggtc gcgttaagac gcaagcgctt cgagttttgg cccgctcgct acctccgctg

36360

tacgactcga ccgtcgatcg acacggctgc aaggtgttca cggtgcggcg ctacaacaga

36420

cgcgtaatcg actttgcggg cattcgcaac aaaacgctgg aaatcattaa aacggataga

36480

aacttgccgc tcaacacaga atgcaatgtg aaagttgtcg acagtgcatg catgcgttgc

36540

agaaaaagtt tcgcagttta ccccgccgtt acctatctgc attgcggaca ttcgtgtctg

36600

tgcaccgact gcgacgaaac ggtaaacgtg gacaacacgt gtcctaaatg taaaagcggc

36660

attagatata aattaaaata caaaactttg taacatgttg ccctacgaaa tggtgattgc

36720

cgtgttggtt tacttgtcgc cggcgcagat tctaaattta aaccttcctt ttgcatacca

36780

aaaaagtgtg ctgtttgcca gcaactctgc aaaagttaac gaacgcatca ggcggcgagc

36840

gcgtgacgac aacgacgacg acccctattt ttactacaaa cagttcataa agattaattt

36900

tttaactaaa aaaataataa atgtttataa taaaactgaa aagtgtatta gagcgacgtt

36960

tgatggtcgg tatgtggtta cacgcgacgt tttaatgtgc tttgtaaaca agagttatat

37020

gaagcaattg ctgcgcgagg ttgacactcg cattacacta cagcaacttg ttaaaatgta

37080

tagtccagaa tttggttttt atgtaaatag caaaattatg tttgtgttaa ctgaatcggt

37140

gttggcgtct atttgtttaa aacactcgtt cggcaaatgc gagtggttgg acaaaaatat

37200

aaaaactgtg tgtttacaat taagaaaaat ttgtattaat aataagcaac attcgacatg

37260

tctatcgtat tgattattgt catagttgta atatttttaa tatgtttttt gtacctatca

37320

aatagcaata ataaaaatga tgccaataaa aacaatgctt ttattgatct caatcccttg

37380

ccgctcaatg ctacaaccgc tactactacc actgccgttg ctaccaccac taccaacaac

37440

aacaacagca tagtggcctt tcggcaaaac aacattcaag aactacaaaa ctttgaacga

37500

tggttcaaaa ataatctctc atattcgttt agccaaaaag ctgaaaaggt ggtaaatccc

37560

aatagaaatt ggaacgacaa cacggtattt gacaatttga gtccgtggac aagcgttccg

37620

gactttggta ccgtgtgcca cacgctcata gggtattgcg tacgctacaa caacaccagc

37680

gacacgttat accagaaccc tgaattggct tacaatctca ttaacgggct gcgcatcatt

37740

tgcagcaaac tgcccgatcc gccgccgcac caacaagcgc cctggggccc ggtcgccgat

37800

tggtaccatt tcacaatcac aatgcccgag gtgtttatga acattaccat tgtgctaaac

37860

gaaacgcagc attacgacga agctgcgtcc ctcacgcgtt actggctcgg cttgtatctg

37920

cccacggccg tcaactcgat gggctggcac cggacggcag gcaactcaat gcgcatgggt

37980

gtgccctaca cgtacagtca aatgttgcgc ggatattcat tggcgcaaat taggcaagag

38040

cagggaatac aagaaatcct aaacacgatc gcgtttccgt acgtgactca aggcaacggc

38100

ttgcacgtcg attcgatata catcgatcac attgacgtgc gcgcttacgg ctatttgata

38160

aattcatact ttacgtttgc ctattacacg tactattttg gagacgaggt aatcaacacg

38220

gtgggtttga cgagagccat cgaaaacgtg ggcagtcccg agggagttgt ggtgccaggc

38280

gtcatgtctc gaaacggcac gttgtactcc aacgtgatag gcaactttat tacgtatccg

38340

ttggccgtcc attcggccga ttactccaaa gtgttgacca aactttcaaa aacatattac

38400

ggttcggttg tgggcgtaac gaataggttg gcttactacg aatccgatcc cacaaacaac

38460

attcaagcgc ccctgtggac catggcgcgg cgcatttgga atcggcgcgg cagaattatc

38520

aactataatg ccaacacggt gtcgtttgag tcgggtatta ttttgcaaag tttgaacgga

38580

atcatgcgca tcccgtcggg caccacgtcc acgcagtcgt tcagaccgac cattggccaa

38640

acggctatag ccaaaaccga cacggccggc gccattttgg tgtacgccaa gtttgcggaa

38700

atgaacaatt tgcaatttaa atcgtgcacg ttgttctacg atcacggcat gttccagcta

38760

tattacaaca ttggcgtgga accaaactcg ctcaacaaca caaacgggcg ggtgattgtg

38820

ctaagcagag acacgtcggt caacaccaac gatttgtcat ttgaagcgca aagaattaac

38880

aacaacaact cgtcggaagg caccacgttc aacggtgtgg tctgtcatcg cgttcctatc

38940

acaaacatca acgtgccttc tctgaccgtt cgaagtccca attctagcgt cgaactagtc

39000

gagcagataa ttagttttca aacaatgtac acggccacgg cttcggcctg ttacaaatta

39060

aacgtcgaag gtcattcgga ttccctgaga gcttttagag ttaattccga cgaaaacatt

39120

tatgtaaacg tgggcaacgg cgttaaagcc ctgtttaatt atccctgggt aatggtcaaa

39180

gaaaataaca aagtgtcttt catgtcggct aacgaagaca ctactatacc atttagcgtt

39240

ataatgaatt ccttcacctc tatcggcgaa ccagctttgc aatactctcc atcaaattgc

39300

tttgtgtatg gaaacggttt caaattgaac aacagcacgt ttgatttaca atttattttt

39360

gaaattgtgt aattatattt agggagaatg tgatattcaa aagactgact gttaacacaa

39420

aagactgata ttgttgttgt tacaaaatag ataataaaac aaaaaataaa ttaaatatta

39480

tttatttatt aaactgttta attttaatgc taacgcgtac aaatcacgct gttccgacgt

39540

ggacatggaa ttgcgcagaa aagtcttgat agtgtcgatt tcttcgccgt catccacttc

39600

catatatttg atttcttcct cgatttgcat ttccaagttt gcgtattctt gcaaataata

39660

atctagtcgt tgggcgacct cgccaatttt aaataataca ttatccgaca ccaaatgcca

39720

gcgagtgact gtgcgctcca tcatcctggc actttttaat gtgaatatta aaaggttgtt

39780

gcatatatat cgttaaacgt ttatgtttac tttcacgtta gctcgtttca ttgatgtaaa

39840

catttagttt tataacagcg tcggtaattt tattttttaa agtaaacaga ccaaaatcaa

39900

aggtgtcttc gacaggtacg attattttcc cattgacact gttttcgtgc acagatataa

39960

ttttatcacc gtttattatt ttgcccaaac acacgtactc gtttcttctc aagccaacta

40020

tttctaaaca attcactttt ctattatcgt gtacgcaatt aaaagtaaac gaagcgctac

40080

aattgtcgta ttctattaca attctgcggc atttataaaa tttattaatg ttgacgcaaa

40140

ttccatgcag cgcatccatt tcgtactgca aatgcggcgc aattaaaaaa tttcctcgtc

40200

gttgttaaca atcttgggcg ctaaaaagca cgccaacacg cccacgtctt taatgcaata

40260

ttccaatttg aacggcagtt cctcggacat gtatattgtc acggtgggcg ccaaaggagc

40320

ggctttagca aaatgacaca agtaatcgcc cgcaaaagtg tgcgttacgg tttgctttgc

40380

tttgagaacg gaaaagtttt cgttgtccgc gctcatctgc acgtccgccg agccaatgtc

40440

gccatttgct ctaaactgca gacccttctt ggaacacgac acaataatat cgtggtcgaa

40500

ttgcgtcatg tctttgcaca cctgcgcaaa ctcgacgctc gacatgtgga cgacgcaatc

40560

gtaatcgcta tccggaattc ccaaatgttc cacgtcgatg cacatcaact tgagcgtgta

40620

cgtgcagatt ctattgtcgt tgttgaacac gaacgccatc acatcgccct gatcttccgc

40680

tttcatcagt acagagctgc gctcgttaac gcatttgaca attttactta aactgtttat

40740

ggacacgttg agcggcacgt tgcggtcaca tctatatttt ttgaaaccct cggcgtgtag

40800

ttgcaacgac acgagcgcga catgcgaggt gtccataacc tgcatgctta cgcctcgatt

40860

atcacaatca aaagtagcgt gcggcagcag atccttaaaa gtttccacca gcctcttcaa

40920

aactgcgccg gttttaaatt ccgcttcgaa catttttagc agtgattcta attgcagctg

40980

ctctttgata caactaattt tacgacgacg atgcgagctt ttattcaacc gagcgtgcat

41040

gtttgcaatc gtgcaagcgt tatcaatttt tcattatcgt attgttgcac atcaacaggc

41100

tggacaccac gttgaactcg ccgcagtttt gcggcaagtt ggacccgccg cgcatccaat

41160

gcaaactttc cgacattctg ttgcctacga acgattgatt ctttgtccat tgatcgaagc

41220

gagtgccttc gactttttcg tgtccagtgt ggcttgtttt aataaattct ttgaaaatat

41280

tgtcgggtgt attattaaat agcatgtatg gtatgttgaa gatgggataa cgcttggcgt

41340

gcgggtcgtc atgatttcca ccgcgcacca catatttgcg ctcaatttta tcaaaattgg

41400

actggcgaga caaaaacgag acgggcgaca ggcatatttg ggcgtgcgta ccatcttcgg

41460

ccatccactc ggtcaggtct tcgctgcggt taaacacacc tttctgaccg tgaatgccac

41520

atatttttat tccttccaaa tcgttggtgg acgtgactat gactatttta agcataacgt

41580

tgtcgccgtt aaccaccatg ctggcgtcga gtttttcaat tttttgattt ttaatttgtc

41640

taaagtaaac gtacactttg taaacgttaa aattgccgtt ggtgcacgtt tcaattttgt

41700

accgtcggcc gtcgtacacc caattaatct ttgcgttgct caccaacaca ccggccatgt

41760

acagcacaag tccgtcgtct agcgcaacgt aatttttgtc gctactattc gtaaacttta

41820

ctaaacacga ctgcttgggg ccgaccacaa gcttgccctt caatttgttc actttgttgt

41880

tgtataaaca aatgggcagc gcaatgtgcg gaatgtacgg atcttcggcg gtcatgagtt

41940

tattgtctcg caccaacgtc cacaatttaa acattttatt gttgagcaaa atggacttgt

42000

ttaccgccac agagtagcca tttggtaaac ccgatacgca attttcctct ttgtactcaa

42060

acacgggcat ggcattcttt agattggtta gggacacaat caatttgggt acgggcgtgg

42120

tatgaaataa atgtataaaa ttacgataat aatactgctc caacttggac atgagcgatt

42180

tgacgtcatc gttttctacg atcgtacact gaataatggg attatagtat atagaatgtt

42240

tatagtggta ttcgtagggt gtcaacaata cgttaatgtc ggcttcgttg ttcacccgca

42300

actttttttt gatgcatatc attccttcgt gatgattaac gtaaagtatt ctgtctgtaa

42360

tcttcaattc gatgggcgcc atgtttcttt tcatagtgta cacgataaac gacgtgtttg

42420

attttaaaca ttttaaattt gtgggtctat cattaaacgc gatcagcaac gagtcgtctt

42480

gaacgtcgtt gaggtcgtcc acgaacgcga ccagattgtg ttttagcaaa tattgaaatt

42540

tttgcgcaac catttcgtag tccacgttgg gcaaacatgc gttgcggcaa aggaaaaact

42600

ttttgcccgc cacggtcatt tcgccgtgaa aaaaactgcc aataaatttc acaaaatcct

42660

ttttttgctt caacattttc tggcgcatgc tgtcgttggt gattcgcgcc acctcgttgc

42720

cgacgcgata ttttaacacg ggcaacgaaa tttcaatatt gttattgctg ctgttgtcct

42780

gttgattggg aaagactttg cgttgcttgc taaaagtttt cgatacgcaa tatatgagac

42840

gcccgttgac tatacaatcg acaatctttt tcgactcttt gttgtacaag acgctttgaa

42900

ttttacgacg cttgttcgcc accgtgtacg cgtcgtcgtc ggccgtcttg tcgagaactc

42960

gttgatagtt ttgcaaaatt gtcgaagtta ataacagttc tatcaaatag gcgtgcttgt

43020

atacaatttt gttggccaaa ctgtctatag aatagtttat gtcgtgattc ataataattt

43080

ttatgtgttc cacgagttgt tgcttgtgaa gcgtgttgta ttcgaagaga aaatcgagcg

43140

gtttccattt gccgctgttg gccagatatg tttccagcac agaatttaaa tcttccgtca

43200

ctacgtaatc gctagcgtac acgtctcgag caaacaggac gtcgtcttgt ttgtcgtaaa

43260

ctagttggat tgcgcgattg atgtgcttct cttgatccac gttgccgtac aaaaacatgc

43320

gtttgcaatg tttggcgtat agcttgtcgt agaaattgtg caccaaaacg ttgttgttca

43380

tcattatgtt gggaaaactc aaaaatctgc cgtccagcat aaaagttccg ttaatattgt

43440

tgtttgcgtc gacatcgtcc gtttctctaa attgcttgtc taagcgcgtg ccgaatataa

43500

cgggcacaca tttatgcatt acgcaactga gctgttcatt aagagcgcaa cacaaataag

43560

acttgcgttc ttgaatagcg caaaaaagca tacgttcatt gctgtttgta gcgcaatcaa

43620

aagtatattt taatttgtat ttattttcaa ttctatcgta caactcgttg aaatcttgaa

43680

ccacgtccgt catcgtgaag cgattactgc gcactaatta tgtctaaacg tgttcgtgaa

43740

cggtcggttg tttcggatga aacggccaaa cgcattcgac aaaacgaaca ctgtcatgcc

43800

aaaaatgaat cttttttggg gttttgcaac ttggaagaaa ttgattatta tcaatgttta

43860

aaaatgcaat acgttccgga ccaaaagttt gacaacgatt ttattttaac agtgtacaga

43920

atggccaacg tggtgacgaa acaagttaga ccgtataaca gtatcgacga aaagcaccat

43980

tacaacacgg tgcgtaacgt gttgatttta ataaaaaatg cgcgtttagt gcttagtaat

44040

agtgtcaaaa agcaatacta tgacgatgtg ttaaaattga aaaaaaatac agacttggaa

44100

tcgtacgatc cattgattac ggtcttttta caaattggcg aatctgtaaa tgaagaaata

44160

caaaaactca gaaaagcttt ggtcaatttt tttactaata aacccgacaa gtcggatata

44220

aacaacccag atgtagtttc gtatcaattt atttttggca gagtacaaaa attgtataac

44280

agggcaatta aacaaaaaac taaaactata attgtaaaac gtcctacaac tatgaacaga

44340

attcaaatag attggaaaac tctttccgaa gacgaacaaa aaatgactag acaagaaatt

44400

gccgaaaaaa ttgtaaagcc ttgttttgag caatttggca ctatattaca catatacgta

44460

tgtcctttaa aacacaaccg aattattgtc gagtatgcaa actcagagtc ggtacaaaaa

44520

gccatgactg taaatgacga cactcgattt acagttacag agttttccgt ggttcagtac

44580

tacaacgtgg ccaaaacaga aatggtgaac cagcgaattg acataataag caaggacatt

44640

gaggatttaa gaaacgcttt aaaatcttac acataaatta aaatatcgaa caaaggaaaa

44700

aaacaattgt aacaaaaata atttacatta aaatttacaa gtttttttct agtgtcgtac

44760

ttttttacaa tgcgtctgtt gtccgtcgag cattgcaaac atattgtgga cggcgcaaaa

44820

tagcaaacaa aaggcacgtc cgcgctctcc cacgctattc taaaacgatg aatccatatt

44880

aatttttcat tgtcgccaaa cgtcgctccg ctggcctcct tccaataaca aatactcaga

44940

aacacaaaca tgtacaattg ctgtcgcggc gttaattgtc gctgtttttc caaatagtct

45000

attatgggaa acaaacactt gtcacaacac aaatactcgt taattgtcac aaccgacaag

45060

cacatttggc aaaatgcgtc gcaatttttg tacggacgag attctatgcg aagttcgttg

45120

tccatgacgt cttgggtcca ctttttcaac aagacacttt tatatttgtg atttgtacaa

45180

ctttggtacg tgttagagtg tttttgataa gctttgataa gtttaaaact gttggagtaa

45240

ggccacgtca ttatgttctg caccttttgt ttaaaagaca gaaattacta tatgttcaaa

45300

ctatttaaag attattggcc aacgtgcacg acagaatgcc agatatgtct tgagaaaatt

45360

gacgataacg ggggcatagt ggcaatgccc gacactggca tgttaaactt ggaaaagatg

45420

tttcacgaac aatgtattca gcgttggcgt cgcgaacata ctcgagatcc ctttaatcgt

45480

gttataaaat attattttaa ctttccccca aaaacactag aggagtgcaa cgtgatgctt

45540

cgagaaacta aagggtttat aggcgatcac gaaattgatc gcgtttacaa acgcgtttat

45600

caacgcgtta cacaggaaga cgccctggac attgaactcg attttaggca tttttttaaa

45660

atgcaatcat gacgaacgta tggttcgcga cggacgtcaa cctgatcaat tgtgtactga

45720

aagataattt atttttgata gataataatt acattatttt aaatgtgttc gaccaagaaa

45780

ccgatcaagt tagacctctg tgcctcggtg aaattaacgc ccttcaaacc gatgcggccg

45840

cccaagccga tgcaatgctg gatacatcct cgacgagcga attgcaaagt aacgcgtcca

45900

cgtaacaatt attcagatcc cgataacgaa aacgacatgt tgcacatgac cgtgttaaac

45960

agcgtgtttt tgaacgagca cgcgaaattg tattatcggc acttgttgcg caacgatcaa

46020

gccgaggcga gaaaaacaat tctcaacgcc gacagcgtgt acgagtgcat gttaattaga

46080

ccaattcgta cggaacattt tagaagcgtc gacgaggctg gcgaacacaa catgagcgtt

46140

ttaaagatca tcatcgatgc ggtcatcaag tacattggca aactggccga cgacgagtac

46200

attttgatag cggaccgcat gtatgtcgat ttaatctatt ccgaatttag ggccattatt

46260

ttgcctcaaa gcgcgtacat tatcaaagga gattacgcag aaagcgatag tgaaagcggg

46320

caaagtgtcg acgtttgtaa tgaactcgaa tatccttgga aattaattac ggcgaacaat

46380

tgtattgttt ctacggacga gtcacgtcag tcgcaataca tttatcgcac ttttcttttg

46440

tacaatacag tcttgaccgc aattcttaaa caaaacaatc cattcgacgt aattgccgaa

46500

aatacttcta tttcaattat agtcaggaat ttgggcagct gtccaaacaa taaagatcgg

46560

gtaaagtgct gcgatcttaa ttacggcggc gtcccgccgg gacatgtcat gtgcccgccg

46620

cgtgagatca ccaaaaaagt ttttcattac gcaaagtggg ttcgaaatcc caacaagtac

46680

aaacgataca gcgagttaat cgcgcgccaa tcagaaaccg gcggcggatc tgcgagttta

46740

cgcgaaaacg taaacaacca gctacacgct cgagatgtgt ctcaattaca tttattggat

46800

tgggaaaact ttatgggtga attcagcagt tattttggtc tgcacgcaca caacgtgtag

46860

catcgccagt atttaacagc tgacctattt gttaaacaag cattcttatc tcaataattg

46920

gtccgacgtg gtgacaattg tatccacaat catgaaaaaa gtagcgcttg gaaaaattat

46980

cgaaaacaca gtagaaagca aatataaaag caacagtgtg tcgtcgtcat tgtcaacggg

47040

cgccagtgca aaattgagtt taagcgaata ttacaaaact tttgaagcaa ataaagtggg

47100

ccagcacact acgtacgacg tggtcggcaa gcgagattac acgaaatttg acaaattggt

47160

gaaaaaatat tgacatgctg cgatcaatca tgcgacgttt caagagtaca aacaatctca

47220

gcaaaaaacc ctccgattat tatgtagtgt tatgtccaaa gtgttatttt gtgacgtcgg

47280

ccgaagtgag cgtggctgaa tacatagaaa tgcataaaaa ttttaacacg aaattcgccg

47340

atcggtgccc taacgatttt attgtgacca actctaaaag ttggaataat catgaaaatt

47400

gttctgccct attttaccct ctgtgttaat aaagtttgtt gtttgtattt tgtggtttta

47460

tttatttacg ctagatattg ggtttaaggt tcttagaaat agagttgtat tttccctacc

47520

aaaagggatt tgagcttcat ataaatacaa ttttcgctcg acaagcggtt tatttcactc

47580

ggaggtatta tatcaggcag tcgaacgtgc gcgatgaaac atcccgttta cgctagatat

47640

ttggagtttg atgatgtagt gttagatttg actagtttaa tatttttaga gtttgataac

47700

gctcaaaatg aagagtacat tatttttatg aatgtaaaaa aggcgtttta caaaaacttt

47760

cacattactt gtgatttgtc gcttgaaacg ctgaccgtgt tggtgtacga aaaagctcgc

47820

ctaattgtga aacaaatgga gtttgagcag ccgccaaact ttgttaattt tatcagtttc

47880

aacgcgaccg acaacgacaa ctccatgata atagacttgt gttccgacgc gcgcataatc

47940

gtggccaaga agctgacgcc cgacgaaacg tatcatcagc gcgtgtccgg atttttggat

48000

tttcaaaaac gtaactgcat acctcggccc ccaatcgagt cggacccaaa agtgcgagac

48060

gccttggatc gtgaactaga aataaaacta tacaagtaga aaaaaattaa tttattaata

48120

gttgtaataa ttatcttcgt cctcatcttc gctggtgtca taatgcggtg gtgtgtttgt

48180

gttttgtttt aatcgtttgc gcgtcgacac cacttcgccg ataggaaatt ttttggattt

48240

cgcattaaat gcccgcttag cgacgcgccg tttacgacta ctaaacatgt tgacgcgctc

48300

gtcgtcttca gtgtcataat ccgtgctagt gttttcgttg ttattttcta tgagacgatc

48360

gtttgattta gttttcgtag aattgtccgc gttatcgtcg ctttcgtcga tgtcgtccct

48420

aactatctcg taggcggctt tgcgcggaat ccaagaattt tgcaatgtat ctattttaac

48480

gtacttttct tcgagcgctt ttctagcttt atgcatagca atgtcttcgt cgccgccgtt

48540

cattttatga tactttgtaa acgtctcgac gaataacttt ttggcgcgag gaggcatttt

48600

ttcattgtat aacatatcgg gaatttgata cattgtaatt agaattaagc aagttcgtct

48660

tcggttgtac tgtattcggt ttctgtatct gtagtggaat cctctgtact agtagtagtg

48720

tcgctattgt tggcgtcagg ccttggctgc catttaccgt ctatcaacat gtattttttc

48780

ctaacagcac aacatgctag cttggtagct atctgtgtcg acttatattt ttgtaaacta

48840

cgatcgtaga atttttcaaa tatcctctta ccgttatagg gaaggttttg ataatattta

48900

ggcaacatat caataaaaga caatataaaa actttgtgtt tgtgttttat ttatcacata

48960

aaatggacgt ctggcaagaa tcacaaccaa tattagtgtt ttttttctta cattacgaga

49020

ttcaacttga tactaaaatt aattattaat taaattaaat taaattttga agcatttttt

49080

cgctatcgtt ttcagactca aaattatcga cgctatcgct atgaaaagcg taatatttgt

49140

tggctttgag atattctata ttttgctcat ttttaacaat aaacacgcga ctcttttcgt

49200

cgcgtctcac cataacaccg tttttacaaa tggaaatgta tttgtaaaac ggcaacagag

49260

cgtcgcgagt ttttttaagt aacagctttt gctccgctgt ggcggccaca aatattttta

49320

cgggcccgtc gtaattaatg tttaaattaa aatttttaag tcgacgctcg cgcgacttgg

49380

tttgccattc tttagcgcgc gtcgcgtcac acagcttggc cacaatgtgg tttttgtcaa

49440

acgaagattc tatgacgtgt ttaaagttta ggtcgagtaa agcgcaaatc ttttttaaat

49500

aatagtttct aattttttta ttattcagcc tgctgtcgtg aataccgtat atctcaacgc

49560

tgtctgtgag attgtcgtat tctagccttt ttagtttttc gctcatcgac ttgatattgt

49620

ccgacacatt ttcgtcgatt tgcgttttga tcaacgactt gagcagagac acgttaatca

49680

actgttcaaa ttgatccata ttaactatat caacccgatg cgtatatggt gcgtaaaata

49740

tattttttaa ccctcttata ctttgcactc tgcgttaata cgcgttcgtg tacagacgta

49800

atcatgtttt cttttttgga taaaactcct actgagtttg acctcatatt agaccctcac

49860

aagttgcaaa acgtggcatt ttttaccaat gaagaattta aagttatttt aaaaaatttc

49920

atcacagatt taaagaagaa ccaaaaatta aattatttca acagtttaat cgaccaatta

49980

atcaacgtgt acacagacgc gtcggtgaaa aacacgcagc ccgacgtgtt ggctaaaatt

50040

atcaaatcaa cttgtgttat agtcacagat ttgccgtcca acgtgtttct caaaaagttg

50100

aagaccaaca agtttacaga cactattaat tatttaattt tgccccactt tattttgtgg

50160

gatcacaatt ttgttatatt tttaaacaaa gctttcaatt ctaaacatga aaacaatctg

50220

gttgacattt cgggcgctct gcagaaaatc aaacttacac acggtgtcat caaagatcag

50280

ttgcagagca aaaacgggta cgcggtccaa tacttgtact cgacgtttct caacacggcc

50340

tcgttctacg ccaacgtgca atgtttaaat ggtgtcaacg aaattatgcc gccgcggagc

50400

agcgtaaagc gctattatgg acgtgatgtg gacaacgtgc gtgcatggac cacgcgtcat

50460

cccaacatta gccagctgag tacgcaagtc tcggacgtcc acattaacga gtcatctacc

50520

gactggaatg taaaagtggg tctgggaata tttcccggcg ctaacacaga ctgcgacggt

50580

gacaaaaaaa ttattacatt tttacccaaa cctaattccc taatcgactc ggaatgcctt

50640

ttgtacggcg accctcggtt taatttcatt tgctttgaca aaaaccgttt gtcgtttgtg

50700

tcacaacaaa tttattattt gtacaaaaat attgacgcaa tggaggcgtt gtttaaatct

50760

acaccattgg tttacgcgct gtggcaaaaa cataaacatg agcagtttgc acagaggcta

50820

gagatgttgt tgcgtgattt ttgcttaatt gccagttcaa acgctagtta tttacttttt

50880

aaacagctta cacagctcat agctaacgaa gaaatggtgt gcggagatga agaaatattc

50940

aatttaggcg gccaatttgt agacatgatt aaaagcggtg ctaaaggcag tcaaaatctg

51000

attaaaagca cgcaacaata ccgacagact ttaaatacag atattgaaac tgtgtcttca

51060

cgagccacca ccagtttaaa tagttacata tcttctcaca ataaggtaaa agtgtgtggc

51120

gccgacatat atcataacac ggttgtgtta cagagcgtgt ttattaaaaa taactatgtt

51180

tgttacaaaa acgacgaacg tacaatcatg aatatttgcg ctttgccctc tgagtttctg

51240

tttccagaac atttgctcga catgttcatt gaatgataat ataaatagag cgcatttgat

51300

tgcatgcaat cagtgtttta ttaattttag agcaacatgt acgataaatt tatgatctat

51360

cttcacttga atgggctgca cggagaagca aaatactaca aatatttaat gtctcaaatg

51420

gattttgaaa atcaagtagc cgatgaaatc aagcggtttt gtgaaactcg tctgaaaccg

51480

gcaatcagtt gcaacacttt aactgcggaa agtctcaata cgctcgtaga cagcgtagtc

51540

tgcaaaaatg gactgttaaa tccttacgcc aaagaagtac agtttgcttt gcaatatctt

51600

tttgacgatg acgaaatatc caaacgagat caagatggct ttaaactatt tttattacat

51660

aattatgaca ggtgtgaaaa tatggaagaa tattttttaa ttaacaattt tagcatagca

51720

gactacgaat ttgaagacat gtttgaaatt gttcgtattg attgtagaga tctgttatta

51780

cttcttgcta aatataatat gtaattaaaa ttttgtttgt tttattaaaa tcctggatta

51840

aaaaatgacg aataatttga tttgcgtgca cgccaacaag attcttcgtc attatgatca

51900

atgcgtgcat caagtttatg cttttgtaat tggcttctga ccactttagc catttgagcg

51960

tatctgcatt cgtcgtctag agtttcaaac accagatcgg cgcaattata aaatccttca

52020

cccacgggat ctatgcgctg ccaacgcaca tacattacaa attgatttga cctgtacggt

52080

attactacgg gtatagaata gactagactg ttgtcacata atgaatcgcc cggatttgga

52140

attaaatttg aatcgttacc acctatgtat tctaattcgt tccaagttat tggattgcga

52200

cgatcccagt ttgatttagt aataaacact tcaaaataac tgggctcgtg tatggctgtt

52260

ggacaaaaat gaacattcat ctgataaacc ggttgatagc gatttaaata tagcgtattt

52320

ggcctccagt tgttaaaagg ttcgtccatt ccgcttttat caccaaacac agaattgcga

52380

tcgtttgaac cggcaccgca aagtgtgtgc ggcacaaccc tttgttcgat taggtcaaaa

52440

tcgtcataat taggaccggc cacagccgcg tattccatat actgttgaaa catgtattgc

52500

gctgtggaag cggccgcccc ggattctaaa tcgagagctc gatatttata atagactgat

52560

ttgtaagcat tgcggcacgc ggcgtcggga atgttatcgc cattgtcggg ccaataaaag

52620

tttccatctt taaaacattt atattgacgg gccgtcggca cggacaaata gccgtgagag

52680

cgcactgccg gcgcgtgaat cgcagcaaac aatgcaatta ataatgcaat cattatgatt

52740

atacttatag aacactaatc ggaataataa ccgctgtcgt aatcttggtc aaaaacgtta

52800

tgttgaaaca taataacacc ttacagtaac atacaataaa acaacatagt atcgtatata

52860

attataaact ttattttttc attttataca aacaaaattt atacgtattg ttagcacatt

52920

gagtgtcatt ttcgctgtct gaactatcac aatcatcgtc atcatcatca tcattgtcat

52980

cgtcgtcgtc acgtttgcgt ttgacactgc attttttttg gttaattttc actaacactg

53040

gttcttttcg atcgtacaat tgattctgca tgtacttttg catgatcgcg gtaaaacact

53100

ttgcaatttt atccttttgt tcgtcgccaa atatttccag caactcgttc ataaatgtgc

53160

acaaaatgcc catgtgtttt atccagctga ttcgcatttt cactggatcg aacaaacgca

53220

aggggtacgc tttttctgtt accttgcctt cgatgtctat caaaaggtac gggatacgat

53280

ctccgttgcc gggcacaaaa tccgtgcctt tgttaaccaa aatttctcta caatgcctag

53340

ccaccgtaat cacgcgtctt ttgggtgacg gaccctcatt atcgtcagtt gatttgcgtt

53400

ttttgcccgg gttatcgtta taggtcatac taaagctgta gtcggtcaac gattttgatt

53460

tggcaaactc atcatagtat tcataaaaac tagtctgtaa actttgcaaa catttgtcca

53520

tgtccaaatg acgcaatatt tgttccactg ccgtcctaaa cgcgattctc ataaaaacgg

53580

gcatatcctt tttaactaac caacccttgt atacgatttt attctcactg ttgagatagc

53640

aatatttttt cttttttaat agtattaaaa ctttcattaa attttcaaat gccattttgt

53700

aaccgtccgt gaatgagtta ttaacgcgtg tctcaacatg tgtgcatatt tgttttaatg

53760

tgtcggtttc gttggatatt tcgttatagt taaatgtggg caaaacaaat gtagaatctg

53820

tgtcgccgta cacaacttta aaagtgatgc tgcccagatt gaatttttct aaaatctcag

53880

ggtcgttgct caaaccttca atcagagaaa tggccagccg caactgattg cgaccaactc

53940

tagtgatgta gtttgcaagc actttgtaaa aaatgccata ataaccgtat atgctattgg

54000

cggtgcgctt cacggaattt tgtttttgat cgtacagatc gtacaagaat gccgattcgc

54060

tttgattgtc gcgattcttt ttaaatttgc acctttcgct taacaatttt aatagcaatt

54120

taacaactat tgcacgcgaa ttgtggttca aatacacgtt gccgtcttcg cataaaatta

54180

aattggacaa acaagcacaa atggctatca ttatagtcaa gtacaaagaa ttaaaatcga

54240

gagaaaacgc gttcttgtaa atgcctgcac gaggttttaa cactttgccg cctttgtact

54300

tgaccgtttg attggcgggt cccaaattga tggcatcttt aggtatgttt tttagaggta

54360

tcaattttct tttgagatta gaaatacccg ctgcggcttt gtcggctttg aattggcccg

54420

atattattga cagatcgttt ttgttaaaaa aatacgggtc aggctcctct ttgccggtgc

54480

tctcgttaat gcgcgtgttt gtgatggctg cgtaaaagca cgccacgcta atcaaatgcg

54540

aaatattaca tatcacgtcg tctgtacaca aacgatgcaa tatacattgc gaatatacag

54600

aatcggccat tttcaatttg acaaacaatt ttatcggcaa catgcaatcc tgcacgttgt

54660

acttggcaat cacgtccagc cgtcgagtgt tgtacatctt gaccatttcg gtccaaggca

54720

aatcgatttt gttttcaccc aaatagtaac tactgattgt gttcaattga aagttttcaa

54780

ctttatgctg attagaatcg ctgctgaaaa atttatacaa atcaatgtga atgtaatagt

54840

taaaataata cgtgtccact ttgttgccca acttgtttat aaacagcttt gtcgtcggcg

54900

ccgcagccgg caaatcgtaa cgctttaata gcattttggt tttattcaat cgtccaagta

54960

tatagggcag atcaaatacg tctccgttaa aatccaaaat cacatcggga tttgtaattt

55020

ttatcatgtc aaaaaacgct gtaatcatgt cgatttcatt ttgaaacatg accacatacg

55080

tgtcatcgtc ataggtctct ggaatctggg tcggcagctt gtgatacata aaacaaaatt

55140

ttgcatactc gtcgtttttg tacaccacaa atcctataga cattatgcaa tcaaccgatg

55200

ctttcgacat gttgtggccg tccgaatgag tctcaatgtc atagcacgac aaaacgggca

55260

tgatgccgct ggttaaagtc atttcatcga ccaactcaaa gtcttcatta aaatgttgca

55320

aattaaacat gcgcgtcgtc gatccaccga catagttatt ttggcagcgt tgtgttttct

55380

tgaatcgcat ataggcgcct tccacaaacg gcgtttgcat gtgtacgcga ttaacgttgt

55440

gaagaaactt gtccaaacac gccgcgttgt ccgatggcgc tgctttgttt ctttcgtatt

55500

taatcacgtt tatcttgttc aaataatttc cttccacgcc cggcgccaca aacgtggtgt

55560

agctgatgca cttgttgcgg caagacggaa atatgtgctt gtcgtagcat tgtttgtaag

55620

aatacaaatt tagttttact ttaaagtaaa actgcagcac tcgttctttg atatttgtat

55680

tacaaaatgc aaacaagcaa ccttgttttt catcgtaatg caaacgaatg atacgaaacg

55740

tatcggctga agtaatattg aattctcctg gttttgcata ttctgcaaag cgcgttttga

55800

gttcattgta aggatatatt ttcattttta aatatgcagc gatggcccaa atatggaggc

55860

acagacgtca acacgcgcac tgtacacgat ttgttaaaca ccataaacac catgagtgct

55920

cgaatcaaaa ctctggagcg gtatgagcac gctttgcgag agattcacaa agtcgttgta

55980

attttgaaac cgtccgcgaa cacacatagc tttgaacccg acgctctgcc ggcgttgatt

56040

atgcaatttt tatcggattt cgccggccga gatatcaaca cgttgacgca caacatcaac

56100

tacaagtacg attacaatta tccgccggcg cccgtgcccg cgatgcaacc accgccaccg

56160

cctcctcaac cccccgcgcc acctcaacca ccgtattaca acaattatcc gtattatccg

56220

ccgtatccgt tttcgacacc gccgccaaca cagccgccag aatcgaacgt cgcgggcgtc

56280

ggcggctcgc aaagtttgaa tcaaatcacg ttgactaacg aggaggagtc tgaactggcg

56340

gctttattta aaaacatgca aacgaacatg acttgggaac ttgttcaaaa tttcgttgaa

56400

gtgttaatca ggatcgtacg cgtgcacgta gtaaacaacg tgaccatgat taacgttata

56460

tcgtctataa cttccgttcg aacattaatt gattacaatt ttacagaatt tattagatgc

56520

gtataccaaa aaacaaacat acgttttgca atagatcagt atctgtgcac taacatagtt

56580

acgtttatag atttttttac tagagtcttt tatttggtga tgcgaacaaa ttttcagttc

56640

accacttttg accaattgac ccaatactct aacgaacttt acacaagaat tcaaacgagc

56700

atacttcaaa gcgcggctcc tctttctcct ccgaccgtgg aaacggtcaa cagcgatatc

56760

gtcatttcaa atttgcaaga acaattaaaa agagaacgcg ctttgatgca acaaatcagc

56820

gagcaacata gaattgcaaa cgaaagagtg gaaactctgc aatcgcaata cgacgagttg

56880

gatttaaagt ataaagagat atttgaagac aaaagtgaat tcgcacaaca aaaaagtgaa

56940

aacgtgcgaa aaattaaaca attagagaga tccaacaaag aactcaacga caccgtacag

57000

aaattgagag atgaaaatgc cgaaagattg tctgaaatac aattgcaaaa aggcgatttg

57060

gacgaatata aaaacatgaa tcgccagttg aacgaggaca tttataaact caaaagaaga

57120

atagaatcga catttgataa agattacgtc gaaaccttga acgataaaat tgaatcgttg

57180

gaaaagcaat tggatgataa acaaaattta aaccgggaac taagaagcag catttcaaaa

57240

atagacgaaa ctacacagag gtacaaactt gacgccaaag atattatgga actcaaacag

57300

tcggtatcga ttaaagatca agaaattgcc atgaaaaacg ctcaatattt agaattgagt

57360

gctatatatc aacaaactgt aaatgaatta actgcaacta aaaatgaatt gtctcaagtc

57420

gcgacaacca atcaaagttt atttgcagaa aatgaagaat ctaaagtgct tttagaaggc

57480

acgttggcgt ttatagatag cttttatcaa ataattatgc agattgaaaa acctgattac

57540

gtgccgattt ctaaaccaca gcttacagca caagaaagta tatatcaaac ggattatatc

57600

aaagattggt tgcaaaaatt gaggtctaaa ctgtcaaacg ccgacgttgc caatttgcaa

57660

tcagtttccg aattgagtga tttaaaaagt caaataattt ctattgtacc acgaaatatt

57720

gtaaatcgaa ttttaaaaga aaattataaa gtaaaagtag aaaatgtcaa tgcagaatta

57780

ctggaaagtg ttgctgtcac aagtgctgta agcgctttag tacagcaata tgaacgatca

57840

gaaaagcaaa acgttaaact tagacaagaa ttcgaaataa aattaaacga tttacaaaga

57900

ttattggagc aaaatcagac tgattttgag tcaatatcag agtttatctc acgagatccg

57960

gctttcaaca gaaatttaaa tgacgagcga ttccaaaact tgaggcaaca atacgacgaa

58020

atgtctagta aatattcagc cttggaaacg actaaaatta aagagatgga gtctattgca

58080

gatcaggctg tcaaatctga aatgagtaaa ttaaacacac aactagatga attaaactct

58140

ttatttgtta aatataatcg taaagctcaa gacatatttg agtggaaaac tagcatgctt

58200

aaaaggtacg aaacgttggc gcgaacaaca gcggccagcg ttcaaccaaa cgtcgaatag

58260

aattacaaaa atttatattc attttcatct tcgtcatact tcaacagtcc caacacgttc

58320

atgttgtgat tctcgccgtt ttcgacagtt acgtaaatag ttactttgat taaattatct

58380

tccagcagca ttgagatttg attgaaatcc gcacatagct tttgtagcga atccgcttct

58440

ttttttttat ttgtgttgac gtagaaaaca gatttgttcc atttgcccaa gtcggaagag

58500

gtagaacagt catccgaatc ggcaatgttc aactcgtcgc ttttaaactg cacaataaac

58560

ttgttatcgc ccatgtcatt ttcttccaat tcgcttttta acacatttac attgtacgaa

58620

gcaacgtgtt tgttcgatcg actaatgttg atctttgcgt ttgtgcaatt ttgcaaattt

58680

gaatatgctt cgctttcttt agcctcgcac aattcgatgc gcgtagagtt gaccacgttc

58740

caattcatgt acacgtttga tccattaaaa atttgttgac actttatact gtaaatggta

58800

aagatttggt tttcattgtc ttttaaatat ttaaacacct cattgatgtc gtcagacccc

58860

tttatattgt tcttgaatag atttattagt gttttcgcat tgacagaaca ttccacttga

58920

accacgtcgg gatcgtcgtt gagatttttg tacacaacct caaaaacaac tttgtacaaa

58980

ccgctgttga ttttcttgta gataaatttg tactttacaa taatattgac gccatcttca

59040

ttttcaaaat gtttgttagt caaatagtcg ctcatggggg ttgcagtttc aatttccatt

59100

tcacattctt tgtattcgtt gatctgaatc atttgactaa actttgtttt cacataattt

59160

aaactaatgt catagcactt gccttcttcc atgtctttga aagattgcga atcgccgtag

59220

tattcttgaa ttttgttgtc ggacattatt cgaaaagtgt aatggtattc attatcgata

59280

ctcaacgtca ttttgctcat caatttacca ctaatccttt tgtaattttc tctaatcttc

59340

ttggggctac tggccatagc catgcgtttt ataagcggct caccgctact ttctccagac

59400

aaagatcttt tggtcgccat attgctgttg tcgatatgtg ggaatctatc cgatggcaaa

59460

tactgaatgg cgacgaaatc gaagtgtcgc cagagcaccg ttcgttagcg tggagggagt

59520

tgattataaa cgtggccagc aacacgccgc tcgacaacac gttcagaaca atgtttcaaa

59580

aagccgattt tgaaaatttc gactacaaca cgccgattgt gtacaattta aaaacaaaaa

59640

ctttaacaat gtacaacgag agaataagag cggctctgaa cagacccgtc cgatttaacg

59700

atcaaacggt caatgttaat attgcgtacg tatttttgtt ctttatttgt atagttttgc

59760

tgagcgtgtt ggccgtcttt ttcgacacaa acattgcgac cgacacgaag agtaaaaatg

59820

ttgcagcaaa aattaaataa actcaaagat ggtttgaaca cgttcagcag caagtcggtg

59880

gtttgcgctc gctcaaaatt atttgacaaa cgcccaacgc gcagacctag atgttggcga

59940

aaactatcag agatcgacaa aaagtttcac gtttgccgac acgttgacac gtttttggat

60000

ttgtgcggcg gaccgggcga gtttgccaac tataccatgt cgttgaaccc gctttgcaaa

60060

gcgtatggcg tcacgttgac aaacaactcg gtgtgcgtgt acaaaccgac agtgcgcaaa

60120

cgcaaaaatt tcacaaccat tacggggccc gacaagtcag gcgacgtgtt tgataaaaat

60180

gttgtatttg agattagcat caagtgtggc aacgcgtgcg atctggtgtt ggcagatggc

60240

tcggttgacg ttaatggacg cgaaaacgaa caagaacgtc tcaactttga tttgatcatg

60300

tgcgagacgc agctaatttt aatttgcctg cgtcccggcg gcaattgcgt tttaaaagtt

60360

ttcgacgcgt ttgaacacga aacgatccaa atgctaaaca agtttgttaa ccatttcgaa

60420

aaatgggttt tatacaaacc gccttcttct cggcctgcca attccgaacg ctatttaatt

60480

tgtttcaata aattagttag accgtattgt aacaattatg tcaacgagtt ggaaaaacag

60540

tttgaaaaat attatcgcat acaattaaaa aacttaaaca agttgataaa cttgttgaaa

60600

atataacgtg tgtataaaaa gccagcggct tcaaatcagg catcattcaa catggattcg

60660

ctagccaatt tgtgcttgaa aaccctgcct tacaagtttg agccgcctaa gtttttacga

60720

acaaaatatt gcgacgcatg tcgctacaga tttttaccaa aattttctga tgaaaaattt

60780

tgtggacaat gcatatgcaa catatgcaac aatccaaaaa atatagattg tccatcatca

60840

tatatatcga aaattaaacc gaagaaagaa aacaaagaaa tatatattac cagcaacaag

60900

tttaataaaa cgtgcaaaaa cgaatgtaat caacaatcaa accggagatg tttaatttcc

60960

tattttacaa atgaaagttg taaagagctc aattgttgtt ggtttaataa aaactgttac

61020

atgtgtttgg aatataaaaa gaatttatac aatgtaaatt tgtatacgat tgatggtcat

61080

tgtccttcgt ttaaagccgt ttgtttttca tgtataaaaa gaatcaaaac gtgccaagtt

61140

tgcaatcaac ctttattgaa aatgtacaaa gagaagcaag aagagcgttt gaagatgcag

61200

tcgctgtacg caacgttggc cgatgtagat ttaaaaatat tagacattta cgatgtcgac

61260

aattattcta gaaaaatgat attgtgtgct caatgtcata tatttgcacg ctgtttttgt

61320

accaatacca tgcaatgttt ttgtcctcga cagggttata agtgtgaatg tatatgccga

61380

cgatctaaat attttaaaaa taatgtattg tgtgttaaaa gtaaagcggc ttgttttaat

61440

aaaatgaaaa taaaacgtgt tccaaaatgg aagcatagtg tagattatac tttcaaaagt

61500

atatacaagt taataaatgt ttaattttaa ggatattgtt atggaataaa ctataaaatg

61560

aatttgatgc aatttaattt tttgatactt tccacagacg gtagattcag aacgatggca

61620

aacatgtcgc tagacaatga gtacaaactt gaattggcca aaacggggct gttttctcac

61680

aataacctga ttaaatgtat aggctgtcgc acgattttgg acaagattaa cgccaagcaa

61740

attaaacgac acacgtattc gaattattgc atatcgtcaa ccaacgcgtt gatgttcaat

61800

gaatcgatga gaaaaaaatc atttacgagt tttaaaagct ctcggcgtca gtttgcatca

61860

caatccgtgg tcgttgacat gttggctcgt cgcggcttct attattttgg caaagccggc

61920

catttgcgtt gttccggatg ccatatagtt tttaaatata aaagcgtaga cgacgcccaa

61980

cgccggcaca aacaaaattg caagtttctc aacgcaatag aagactattc cgtcaatgaa

62040

caatttggca aactcgatgt tgcggaaaaa gaaatactgg ctgccgattt gattcctccg

62100

cggctaagcg ttaaaccttc ggcgccgccc gccgaaccgc taactcaaca ggtctccgaa

62160

tgcaaagttt gttttgatag agaaaaatcg gtgtgtttca tgccgtgccg tcacctggct

62220

gtgtgcacgg aatgttcgcg tcggtgcaag cgttgttgtg tgtgcaacgc aaaaattatg

62280

cagcgcatcg aaacattacc tcagtaaaca ttgcaaacga ctacgacatt ctttaaaaat

62340

aagctatata taaatattgc attgtatgac aaaaaaatta ttaacctact gcaaagtaaa

62400

acttgtaaaa ggcttttcaa aaaaatttgc gagtttattt tgtcgctgcg tcgtgtcgca

62460

tctaagcgac gaagacgaca gcgacggtga tcgctattat cagtataata acaattgtaa

62520

tttcatatac ataaatattg taaaataaaa gacatattat tgtacataat gttttattgt

62580

aattaaatta atacaccaat ttaaacacat gttgatgttg ttgtgaataa tttttaaatt

62640

tttacttttt tcgtcaaaca ctatggcgtt gctttcgatt agttttttcg ttagcatttc

62700

atctaaaaaa tcaaactgtt tgcccggcgc gtttagggat tctatggtgt agtcgggcgt

62760

gtcgctgttt agatattggt ccacttcgcg cattatgtcc aagacgttgt tctgcaaatg

62820

aatgagcttt gtcaccacgt ccacggacgt gttcatgttt cttttttgaa aactaaattg

62880

caacaattgt acgtgtccac tatacaattc ggcttaatat actcgtcggc gcaatcgtat

62940

ttgcaatcca atttcgtgtt caacaaattg gtgatgatat ctttgaacgt gcacgttttc

63000

aatttgtcct tatcggccaa cgcaagtttc aattcgctct gtaaagtttc taaaattttg

63060

tctttattgt tgtcaaattc gtgcgtgttg cgttccaacc acaatttgaa cggctcgtcg

63120

acaaaaatgc tgcgcaacac ctcgtacaac tgtctgccta acgtgtacac ttgctcgtat

63180

tctttcatgc tgacctcttt gctaacgtac attactaaaa aatctacaag tattttcaaa

63240

catttgtaat aggcgacgta ttttgattta agttttaaac cgtccaccgt gtattcgtcc

63300

acgttcgcat cgaccacttt tcgattatta tcgccgcttg ttgccggcgc gtcggcctgt

63360

tcggttttaa ctatatccgg ttcaatattt aaagtttcaa aagatttaat ggcattcata

63420

aaatcatctt tttgctttgg cgtggtcaat ggtaaatcta tcgaggagtt gtcgtccgtg

63480

tgctcttcgg gcacgctgtt cagacgtaac gtaatctttt tgggatcgtc ttcatcgggt

63540

atcaaatcgg ctttaatttt attagaattg agcaacgaca tggtggtcgc ttgtaaattt

63600

aataaattaa ttaaagactg aaattgtata ttgcacaaat ttattttcat ttttattgat

63660

cttactatta atacgctggc agttggtatg cttcatccat ttttgtgact agaaaatttg

63720

ctaaaaaact gagctcgtcc tgtgttaaaa cgttgtcgtc cacgaatcta tgcaatgtaa

63780

atgttacact gacattgttt aacaatgcat gtattaaaaa atcaacctgt cgcctactga

63840

gtttattaga agagtcgacc gtttctacta gtttgtagat tttgttattt tcaatttcat

63900

tgtttaaaaa catgttaact actcgtttga gtttaagcga aaaatccttg tccggataga

63960

cttgttcgca cagccaattg ctaagagtgg ttttgaccac ggacaccttg gtggtgaacg

64020

tcgtcgattt gaccagttcg gtgaaaaagt ttttcattaa attggacatt ttaacaaaca

64080

cttatcaatc tattgagctg gtatttttgt ttagaatcgc atcaagcgct tgctcgatct

64140

ccaatttttt tcggacgctc ttagctttat gactcggtat gtcttctacg gtagactcgg

64200

tgttcttact tataatggcc gggctgacga taataaacac gagaaacaat atgagcagat

64260

acaaaaagat gctgttttcc tttttgtcat acactaggct aaatatggcc agtgcgccca

64320

acaacaaata taaattcatt tttattccct tactctattc gttgcgatag tacaacaacg

64380

attctcccga cgaaccggac gaattgcgat tatgctgcgc gtcgtcgtcg tcgttgttgt

64440

tctcctcttc gctgctcgtt tcgtctaaac ctatattgta tttgttcaag taatgtttgg

64500

tgcttgcgga ggattcgtgg ttcattaatt tggccacttt ttgtaaaggc acgccgctat

64560

tgtataggtt actgctcaaa taatgtctta tcatgttgct gcgcggccgt tccatctcga

64620

cgcccgactc ttcaaggagt cgcctgaaat ctttgaaggg cgtcgaggtg tttttagata

64680

tttgcaaaat ggtcgggttt cgtgaataaa tctcgcgtgc caattccaac ggtttcattt

64740

tgatgttgtt gagtgtgtta ttacgactgc gttttcgctt taaattaatc gtgtcgctgt

64800

gcagttttcc tcttttaatt agcacgttga gatcgtccac gctgagttgg cgcgcttcgt

64860

tgattcgcat acccgtccct aacatgatgc aaaacactat cgcgccccta attagaccgc

64920

ggtcgtgaac ataatcgctg ttgagcattt taattttatc attaataaaa tttaatatgg

64980

tatctattac gtttttaagc attaaattct tttccttttc cctgatattt ttgagctcct

65040

tgtcgcgcgg cagcataacc atgcggggaa ttttgtattc gggcaagttc atcatgttgg

65100

tgtaaaagtt tatagtcaac tgtagtgttt ctttggtgac cgagcgaagt tcgagcatgc

65160

gcctgcacag ttcttgggga tcaatgagaa gtgtttggtt ttctatcgag tcaaactcct

65220

tgtccaacga gtacgacatg tcttccaggt gaacatcgtc taccgagcag tacacaattt

65280

taatgaatcg agacttgtaa ctttttaaag tggtgggcgc aaacggtttg gggaacatgt

65340

acttgctcca cagactgttg tttttcacct cgtcgggcgt gcatcgttgc cgatcggtgg

65400

ccaaatcgaa cacggactcg aaccggggag cggattgaat ttttattttc caagaattaa

65460

aattgttttc gttgcgaaca ttaaaaccgt tcattgtggt taatcaaatt tattaaaaac

65520

aaaaggagaa tcggtgtcaa tactatccga atattgttgt tgttctctta atattacgaa

65580

ataatatatt acatacagca gtaagaataa agctataaaa gcgactacac taattaaaat

65640

tataattccc gccgacacgt tgctcgtcgt gttgtcatag cccaccatgt cgtttattgg

65700

cattttgtga acgggctcgc taaattgttg cggttcgctg gcagtatcgt cgttgagcgc

65760

caatttcaac gggatgtatt ccaccttttc gtggttgccc aaccgatagt agggcacgtc

65820

caaattcatg tttacaactt atttgctaac aggaatttat gcaacaaaag tggtttggct

65880

ttgatgagac gcaatttgaa atacttgctg catttacgct taagattgta ttccatgcgg

65940

gcggcggtct tgtagtcgta cgcgctcgcg ctgtgataca cgagccgtaa attggttgcg

66000

ttgcgcaaac acttggcgcc ttgtttgttc gaatgctgtt ttatgcgtct gttaagattg

66060

ctcgtgatgc ccgtgtacaa ttttccattg tcttgccgca gaatgtacac gcaccacacc

66120

ttgttggtgt acagagtcgt cgccatgatt atgcagtgcg ccctttcgtg ttcggccgag

66180

tggcgttagg cgcagccgcg gcaataatcg cgttggcgtc cttgttgtaa tttatttgtt

66240

gaaaaataaa acgtcttaga gtttcgtttt ggaacgccaa ttcggtcaag ctctcctggc

66300

aagcgctttt ggtcaaatga gcggccggcg aattgaccgc gttggcggcc gacgttaaga

66360

aggtggcgtt ctggaacatg ctgggctgct tgccggctcg cgtcgccagc tcggccatgt

66420

aattgaatat gttggcagac gcagatagcg gcgccaaaaa cgcaacgttc tcttttaaac

66480

tcatgactcg cgccctgttt ttttcgttca gcacgtagtg gtagtaatcg ccgccgccgg

66540

caaacagatc gtcaatcacg gcgttgatca gatcgttgat catgttgatg tgcggaaagc

66600

gacgcgactc gactgcgctc tgtatgtttg gcggcagagt ggcgtgcttg agcaacagag

66660

tcatgtaatt gttggccagc tgctgattga aaggtaacgg aatgggaatg ttgcacgtca

66720

ccgcttccgc caccatgtac tggacggcca gactgagttg tttggcggcc tcggccaaag

66780

cgtctttgcc caacatatca gcgccaccgt tgtaaaactt ttgcgcgtac gccggcagcg

66840

aatttagcac aaacgatggc tgaaatatat ttgaatcgct cgacagggac tcggccgcgt

66900

tgctctgtcc caactctttt tgcaaccgaa tcaggtggcg tatcatggtt tcctccgatt

66960

caaaccgctt taccacgttt acgctgattg ggttcgtgtc gatgcacatg tcacgaatag

67020

tgtttataaa aagaatcatg agaggactaa gttctgacat gtcattgcac ctgtaatatc

67080

taataatctt ttgaacaaaa tccacacatt tgttgtacca aatagattca ccggcgtcga

67140

gcgtcggttc tttgctcttg ttgtacggtg caatcgctac cgagtttgtg ctgttgctgc

67200

ggctcgtgta atccatcctg ttgtcgcgcg tggcgacggt cgtaggcacc gtcgccggcg

67260

gcacgtaccc gggcgcgttg taagtttgcg cgctggtgaa tatggccgtt gccggattag

67320

agggatacct cagcggcgga ggggtgttgt aataaaaatt gccacgttca tctgtcatac

67380

tttttatttg tactcttatg attacaaaac tcaatatacg gattacttat aatatagttg

67440

ttgtgacaaa aaagcgataa taaaattaac aaaattatca acaagttaat catggaaaat

67500

ttttcaacgt tgaataacaa caacaaaatg gcgcaggtca acagcaccgt ttgaaaactg

67560

acgcgccgac acaaaatgct ttcgcaattt ctaaaagcca cattaaacga attttcacct

67620

ttgatataat cacgcagttc ttttttacaa cattcgtcgc acaaaattaa cacctttata

67680

atgaggccgt cggtgtgtat cgtttgaaat gtccgcggtt gactgcctgg atgaaattca

67740

aacgagtacc cagtggacac gtgtatctgt gcaaaataat gggctaatat cgaggcgccc

67800

gtttttttaa cctttacttt tgatatttta ataacattaa tgttgttatt tgcgtaatca

67860

gagtttttat tgtggtgatc atcgtacaaa taatgaagca acagttcact atcgtattta

67920

atcttgttta gcgttgtcaa gtttttgttt cttaggcgtt ggagcgtctc cgtcgtcgat

67980

attttcttcg aaatcgagtc caacaacgtc ggcgtttcct tcttgctcat cgatagcggc

68040

ggcggaggcg gcctctccgt cgtcgtcatt ctcggtttct acagtgcgtt tgggcgacga

68100

cgtgtgtaca gcagcgtccg tcttactatt atcggaccgc caaatttttg tttgaaataa

68160

catttggccc ttgttcaact ttatttcggc gcagttaaac attattgcat taagatcata

68220

ttcgccgttt tgcaccaaat tgcacaaaac accatagttg ccgcacgaca ctgtagaata

68280

ggcgtttttg tacaacaatc tgagttgcgg cgagctagcc accttgataa tatgggcgcc

68340

aacgccccgt ttttttaagt aatattcgtc ttcaattata aaatctagta cgttttcatc

68400

ttcactgttg atttgggcgt tcacgatgat gtctggcgta atgttgctca tgcttgccat

68460

ttttcttata atagcgttta ctttaatgta tttggcaatt tattttgaat ttgacgaaac

68520

gactttcacc aagcggctcc aagtgatgac tgaatatgtg aagcgcacca acgcagacga

68580

acccacaccc gacgtaatag gctacgtgtc ggatattatg caaaacactt atattgtaac

68640

gtggttcaac accgtcgacc tttccaccta tcacgaaagc gtgcatgatg accggattga

68700

aatttttgat ttcttaaatc aaaaatttca acctgttgat cgaatcgtac acgatcgcgt

68760

tagagcaaat gatgaaaatc ccaacgagtt tattttgagc ggcgacaagg ccgacgtgac

68820

catgaaatgc cccgcatatt ttaactttga ttacgcacaa ctaaaatgtg ttcccgtgcc

68880

gccgtgcgac aacaagtctg ccggtcttta tcccatggac gagcgtttgc tggacacgtt

68940

ggtgttgaac caacacttgg acaaagatta ttctaccaac gcgcacttgt atcatcccac

69000

gttctatctt aggtgttttg caaacggagc gcacgcagtc gaagaatgtc cagataatta

69060

cacgtttgac gcggaaaccg gccagtgtaa agttaacgaa ttgtgtgaaa acaggccaga

69120

cggctatata ctatcatact ttccctccaa tttgctcgtc aaccagttta tgcagtgcgt

69180

aaatgggcgc cacgtggtgg gcgaatgccc cgcgaataaa atatttgatc gcaacttaat

69240

gtcgtgcgtg gaagcgcatc cgtgcgcgtt taacggcgcc ggacacacgt acataacggc

69300

cgatatcggc gacacgcaat atttcaaatg tttgaataat aacgagtcac aactgataac

69360

gtgcatcaac cggatcagaa actctgacaa ccagtacgag tgttccggcg actccagatg

69420

catagattta cccaacggta cgggccaaca tgtattcaaa cacgttgacg acgatatttc

69480

gtacaacagt ggccaattgg tgtgcgataa ttttgaagtt atttccgaca tcgaatgtga

69540

tcaatcaaac gtgtttgaaa acgcgttgtt tatggacaaa tttagattaa acatgcaatt

69600

cccaactgag gtgtttgacg gcaccgcgtg cgtgccagcc accgcggaca atgtcaactt

69660

tttacgttcc acgtttgcca ttgaaaatat tccaaaccat tatggcatcg acatgcaaac

69720

ctccatgttg ggcacgaccg aaatggttaa acagttggtt tccaaagatt tgtcgttaaa

69780

caacgacgcc atctttgctc aatggctttt gtatgcgaga gacaaagacg ccatcgggct

69840

taacccgttc accggcgagc ctatcgactg ttttggagac aacttgtacg atgtgtttga

69900

cgctagacgc gcaaacattt gtaacgattc gggaacgagc gttttaaaaa cgctcaattt

69960

tggcgatggc gagtttttaa acgtattgag cagcacgctg accggaaaag atgaggatta

70020

tcgccaattt tgtgctatat cctacgaaaa cggccaaaaa atcgtagaaa acgaacattt

70080

tcagcgacgt atattgacaa atatactaca gtcggacgtt tgtgccgacc tatatactac

70140

actttaccaa aaatatacta cactaaactc taaatatact acaactccac ttcaatataa

70200

ccacactctc gtaaaacggc ccaaaaatat cgaaatatat ggggcaaata cacgtttaaa

70260

aaacgctacg attccaaaaa acgctgcaac tattccgccc gtgtttaatc cctttgaaaa

70320

ccagccaaat aacaggcaaa acgattctat tctacccctg tttaaccctt ttcaaacgac

70380

cgacgccgta tggtacagcg aaccaggtgg cgacgacgac cattgggtag tggcgccgcc

70440

aaccgcacca cctccaccgc ccgagccaga accagagcca gaacccgagc cagaacccga

70500

gccagagtta ccgtcaccgc taatattaga caacaaagat ttattttatt catgccacta

70560

ctcggttccg tttttcaagc taaccagttg tcatgcggaa aatgacgtca ttattgatgc

70620

tttaaacgag ttacgcaaca acgttaaagt ggacgctgat tgcgaattgg ccaaagacct

70680

atcgcacgtt ttgaacgcgt acgcttatgt gggcaatggg attggttgta gatccgcgta

70740

cgacggagat gcgatagtgg taaaaaaaga agccgtgcct agtcacgtgt acgccaacct

70800

gaacacgcaa tccaacgacg gcgtcaaata caaccgttgg ttgcacgtca aaaacggcca

70860

atacatggcg tgtcccgaag aattgtacga taacaacgaa tttaaatgta acatagaatc

70920

ggataaatta tactatttgg ataatttaca agaagattcc attgtataaa cattttatgt

70980

cgaaaacaaa tgacatcatt ccggatcatg atttacgcgt agaattctac ttgtaaagca

71040

agttaaaata agccgtgtgc aaaaatgaca tcagacaaat gacatcatct acctatcatg

71100

atcatgttaa taatcatgtt ttaaaatgac atcagcttat gactaataat tgatcgtgcg

71160

ttacaagtag aattctactc gtaaagcgag tttagttttg aaaaacaaat gagtcatcat

71220

taaacatgtt aataatcgtg tataaaggat gacatcatcc actaatcgtg cgttacaagt

71280

agaattctac tcgtaaagcg agttcggttt tgaaaaacaa atgacatcat ttcttgattg

71340

tgttttacac gtagaattct actcgtaaag tatgttcagt ttaaaaaaca aatgacatca

71400

ttttacagat gacatcattt cttgattatg ttttacaagt agaattctac tcgtaaagca

71460

agtttagttt taaaaaacaa atgacatcat ctcttgatta tgttttacaa gtagaattct

71520

actcgtaaag cgagtttagt tttgaaaaac aaatgacatc atctcttgat tatgttttac

71580

aagtagaatt ctactcgtaa agcgagttta gttttcaaaa acaaatgaca tcatcccttg

71640

atcatgcgtt acaagtagaa ttctactcgt aaagcgagtt gaattttgat tacaaatatt

71700

ttgtttatga tagcaagtat aaataaccga acaaagttaa atttttttca tttacttgtc

71760

accatgtttc gaatataccc taataacaca actgtgcccg gttgtttagt gggtgacatt

71820

attcaagttc gttataaaga tgtatcacat attcgctttt tgtcagatta tttatctttg

71880

atgcctaacg ttgcgattgt aaacgaatat ggacctaaca accagttagt aataaaacgc

71940

aaaaacaaat cgctgaaaag cttgcaagat ttgtgtctgg acaaaatagc cgtttcgctc

72000

aagaaacctt ttcgtcagtt aaaatcgtta aatgctgttt gtttgatgcg agacattata

72060

ttttcgctgg gtttaccaat tatttttaat ccggctttgc tacaaagaaa agtgccgcag

72120

cgcagcgtgg gatatttcat gaattcaaaa ttggaaaggt ttgccaattg tgatcggggt

72180

catgtcgttg aagagaaaca attgcagagt aatttgtata tagattattt ttgtatgatt

72240

tgtggtttaa atgtttttaa aataaaagaa taacaattta cacattgttt tattacatgg

72300

ataatgttgt ttgtttgaca ttaaaggtta tcatggtgca atgattaata ataaaacaat

72360

attatgacat tattttcctg ttattttaca atataaaatc acaccaattg tgcaaagttt

72420

tattatttgt ttgtcgacgg tcgaggggtc agcggcgtgt gcaacaataa aaaacatgaa

72480

gctgttaaca attttgattt tattttattc attttttatg aatttgcaag cgctaccaga

72540

ttaccatcaa gcaaataggt gtgtgttgct gggaactcgc attggatgga acgatgacaa

72600

tagccaagat cccaacgtat attggaaatg gtgttaaata aaagtgaata tattttttat

72660

aaaatttttt atttaaaatt ccaagtaatc cctgcaaaca ttaaacactg taggtatttt

72720

taaatcttgc cacatgcgaa caacgcacgg cctgtcgtcg aacaccgcta ttacattata

72780

ttttcctctg atatagttgt taaacaattt taattttaat aaataatctt tacaagtatc

72840

gtctgaaggc ctcataaaca atttatatga tttaatatca aaatactttt caatccagtt

72900

tcgagtgggc tgttcacaaa ttacgcttct cccgctcata aacacgataa ttgcgtcgtg

72960

gcaatttgcc aaatacttaa cgcaagtaat aacgtctaag cgggcttcat cttgagcaac

73020

tctattatca aaatcataaa acgatctatt tgtgggcaaa gctactgtac cgtctaaatc

73080

acataataca gcgcggggaa atttgtcgcc gacaggaacg taatattcga aattatttac

73140

ctttagaaac tttttatatt gctttttaat agtttctgga tttaatggaa atttatcaga

73200

gcgtttataa ttgcgttcaa gagccgtttc caaagaaacg tccatcaaac gcgttaaaaa

73260

atggtaatta tgcgttgcgg ccattttttg ccacatgtcc accgattgag tgttcaaatt

73320

agtgtcgctg acaaccacgt tggcaccaca ttttgcggct tttaaaaact gttcaatgca

73380

cattttggta atttgttctt ctttagtttg tctacatttc cgcgattggt tatagaaagc

73440

gttcagtttt gtataatcgc cgtttaaaaa caacttaacg cgcacgtcgt ctctgttgat

73500

ttctgtatag ccttttaaac ttttggcata cgtgcttttg cccgaacccg aaatgcctat

73560

caacaccaac aattgttttg aagaaggcaa tttaattgtt ggagcaagtt tattatttaa

73620

tgcctgctta gtcgatacaa attttataat atttttgatc attttaattt tttcaggctc

73680

ggttaatttt aaaaattcgc tctccacatc gatcgtttgt gctttacgac atctgtacgc

73740

taaacatttc cacggcaaag tttgcaccag ttcgttgaaa cgctgttgat tcaaagtcaa

73800

acccgacacc ataatattta ttgtagactc gttggtgaac gtgtttctag catcaacgta

73860

cggtttaatg acacttttta aatgcgggaa aagagctaga aagtcatcgt gttcgccatt

73920

tataacaagc tgcgccaatt tagtaggatt ttcagcacgg ctctgatttt tgtgcatgtt

73980

caaatacacg tcgcttttaa tcttgcatag tggcgcgttg tttttatcgt aaactacaaa

74040

tccttcttcc aaatttttca actgggccgc gtgttcgaca cattcttgca cagacgtaaa

74100

ctcgtaacat ttggggtatt tgcaaaacgg caaattggaa cagtaaaaat aatcgcccgt

74160

ttcgttgttt ctgcttgcca aataccacaa cgttggctgt tcatcgtaaa cggttacaat

74220

tctgttgtgt ttgcttgtta actcaaacat gtgagtcgac gcgcagtcta aatattcgtt

74280

acacaacgct tgaaattgat tgtgggcctc gtcaagttga agagcttgca aaactaaacg

74340

tttaaacgtc acgtctgaca cgcaaaggtt ttctgcaaaa gcacttcctc gggtgctggc

74400

atgccattcg ccgttgtact tgtagatttt aattaaactt ccgtcgattt tttcgtaaaa

74460

cttaaaattc tccttcgatt ggaacagttt gtgatgagca tcttcgccgc cgatattttg

74520

tagcaattct tgaaaattaa agaaacgatc gaaagaacgc gacacaacgg cgtacgtgcg

74580

gctgttaaga attaaaccgc gacattccac gaccacagga tgatctcgat cgcgttcaaa

74640

cgattcgtaa ttaagaacca tcaaatcgtg ttcggtataa tttttaattt tgactttaaa

74700

cttgtcacaa agatttttca ctccgccgtt tgcaagtaga cgcgaaacgt gcaacatgat

74760

tgctgtttaa taatgcatac caatgctaaa ctgtctatta tataaagtgc agtgataact

74820

ttgttatcaa cgcgttcgat gccgacatat ataaacgcaa tgtaacagtt tttgctagta

74880

ccatcgcata caacattatg aatacaaggg gttgtgttaa taataataaa atgatattta

74940

tgaatgcttt gggcttgcaa cctcaaagta aattgaaaat tattgcacat aaaatactag

75000

aaaaatgtaa acgtgacgcg tacacgcgtt tcaagggcgt aaaggcgatc aagaatgaac

75060

taaaaacata caatcttacg ttgcaacaat acaacgaggc gctcaatcag tgcgctttaa

75120

acgatagccg atggcgcgac acaaataatt ggcatcacga tattgaagaa ggtgtgaaaa

75180

taaacaagag acatatatat agagttaatt ttaattctaa aacccaagaa attgaagaat

75240

attattacat taaagtagaa tgttatgtaa acagttaatt aatctacatt tattgtaaca

75300

tttgtggtaa tagtggcgtt ggttatacat ttatatgatt gtaatgttgt gtactcgttt

75360

tgtaataaat ttttgtgttt aatcaattca atatttttat ttgataaaac cttattttcg

75420

ctactcaatt tggcgttttt agacgcaagt tttgcgtaat cgtcattgag cgattttagc

75480

gccttttcag ttgtaattcg tttcagttgc aattctttaa aagatttatg catgttgttg

75540

tagtcgcttt taattttgtc taacttttct tgcatagaaa cgcttgtttg ttgtaatttg

75600

tctaaatcta attgttgttt aatgttgagc tgcgtttgtt cggcaatgtc tacctgtagt

75660

ttttttagta tcgcttgtgc ttcagacagc atagtgtcgt cggcatttgc gttgttgtct

75720

tctgcgtcgt ccaacagact tttttcaaac aacacactgg ccaaagaggc cgcatcaaaa

75780

ttagcgttta ttttattcca ttgtgcgaca ctcgacgcgc tgcatttaat cacatccaca

75840

acgtttcggt ttacgctgta aacgttgaaa tgcaaacttt caaccctaca caagggacat

75900

ggtacttttt ttcgttttct aatcttgcgt atacacattg agcataattg atgtttgcac

75960

gtgtctagtt ctaatacggg tattatagtc aatctgtcta ttggttgcag aaaataattt

76020

ttaatttctg caaccgaaaa acaaatgttg cattgcaatt taacaaactc catttttaga

76080

cggctattcc tccacctgct tcgcctgcaa caccaggcgc aggacctgcc actgcgccgc

76140

cgcccagagt agcgttagga tttgctcttg gtataaagtc gttgcgcaaa aagttgtttt

76200

ctgaattgat tatttggtat cccaaaaaca gcggaacgta cgtcgggtat tcttcgtatc

76260

cgctaagcgt tctgtccagc tcacgtgtgt cgccttcaaa tttcaaaacg tttctaattt

76320

gcaaacgatt gggttgactt ctcataatgt cactgcttct tatcgggttg tacaactcgg

76380

ggccgtcggg cacagacgcg accagacccg tttcgtcaat tatacacgtg gcgcaatttc

76440

taaacctcaa ttcctccgtg tcgatttgca agtactcggg cgctactgcg cgtcgaatca

76500

aattttgcaa aaatccactg taattgttaa ataattgatc gccagcaccg cctcgaagcg

76560

ctcgggcgtt ggtcacgtca aagaaacgca attcgtctcg cgacacccgc gaacaaaacg

76620

tgttcgggtt tgtggtgtcc agaatgcttt ttgtagttgc gtaaacgctg tgtataacgc

76680

gttgcgtgtt gcttgtgaaa ccttcggtat attttagatt gtcgcatata gtgttaactg

76740

cgttttcgtt gttatatatc aaatgaaaga ttagctgttc ggcttgcatc atactgttta

76800

gattaaacac gtcttggtaa ttggttgcgc ttggaattaa aattcgcttg atacctcttt

76860

ctttatttcc aactaaatgc ctagcgatcg tcattttgaa ttgattgtcg tcttcgtcga

76920

aaatgggcaa aaccattttt gacattttaa aacgttttat gaggtggttg ttgcaaataa

76980

accatccatc gtcatgatac gcgtcgggcg aacacggcga tttgtatgtt atgcacgcgt

77040

cgaacgacac gatggacgcg aaaatgcagc gattaactct catttgtcgc ggcgccatac

77100

ccacgggcac tagcgccata ttgttgccgt tataaatatg gactacggcg attttgtgat

77160

tgagaaagaa atctcttatt caataaattt tagccaagat ttgttgtata aaattttaaa

77220

ttcttatatt gttcctaatt attcgctggc acaacaatat ttcgatttgt acgacgaaaa

77280

cggctttcgc actcgtatac ctattcagag cgcttgcaat aacataatat caagcgtgaa

77340

aaagactaat tccaaacaca aaaaatttgt ttattggcct aaagatacca acgcgttggt

77400

gccgttggtg tggagagaaa gcaaagaaat caaactgcct tacaagactc tttcgcacaa

77460

cttgagtaaa ataattaaag tgtacgttta ccaacacgat aaaattgaaa tcaaatttga

77520

acatgtatat ttttcgaaaa gtgacattga tctatttgat tccacgatgg cgaacaagat

77580

atccaaactg ctgactttgt tggaaaatgg ggacgcttca gagacgctgc aaaactcgca

77640

agtgggcagc gatgaaattt tggcccgcat acgtctcgaa tatgaatttg acgacgacgc

77700

gcccgacgac gcgcagctaa acgtgatgtg caacataatt gcggacatgg aagcgttaac

77760

cgacgcgcaa aacatatcac cgttcgtgcc gttgaccacg ttgattgaca agatggcccc

77820

tcgaaaattt gaacgggaac aaaaaatagt gtacggcgac gacgcgttcg acaacgcgtc

77880

cgtaaaaaaa tgggcgctca aattggacgg tatgcggggc agaggtctgt ttatgcgcaa

77940

tttttgcatt attcaaaccg acgatatgca attctacaaa accaaaatgg ccaatctgtt

78000

tgcgctaaac aacattgtgg cctttcaatg cgaggttatg gacaaacaaa agatttacat

78060

tacagatttg ctgcaagtgt ttaaatacaa atacaacaat cgaacacagt acgaatgcgg

78120

cgtgaacgcg tcatacgcta tagatccggt gacggccatc gaatgtataa actacatgaa

78180

caacaacgtg caaagcgtca cgttgaccga cacttgcccc gcaattgaat tacggtttca

78240

gcaatttttt gatccaccgc tacagcagag caattacatg accgtgtccg tggacgggta

78300

tgtcgtgctc gacaccgagt tgagatacgt caaatataaa tggatgccaa caaccgagtt

78360

agagtatgac gccgtgaata agtcgtttaa cacactcaat gggccattga acggtctcat

78420

gattttaacc gacttgccgg agttactgca cgaaaacatt tacgaatgtg taatcacgga

78480

cacgacaata aacgtgttga aacatcgtcg cgaccgaatc gtgccaaatt aaagcacgtt

78540

aagcggatac aacgggcagt ccgagctgtt aaagtcaata caaccatcgt taacaaacga

78600

atacgcattg ttgtgacagc tgaggatata aaaaggaata gagaagtaat tgcaatgaaa

78660

tatcccgtta caattccacg gcacagcgta tgttgctcga gttctatcag ttgcacacaa

78720

cggcctaaga aaatttatta atgcttcatt tgtatctata ttagaaggat aatacatagg

78780

ttcgcccaaa ggactgggag aaggcggcgg cgaaggtgta ggtgtaggag gaataggaga

78840

aggcggcggc gaaggtgtag gtgttggagg aataggagaa ggcggcggcg aaggtgtagg

78900

tgtaggagga ataggagaag gtggaggtgt aggtgtaggt gttggaggta taggtgttgg

78960

aggaggtgta ggtgtaggtg ttggaggtat aggtgttgga ggaggtgtag gcgaaggtgg

79020

agaaggtgta ggagtaggtg gaggtgtagg taacggtaca attggtggag atgtaggtgg

79080

tggtacaatt ggtggatttg gatacaattc ctgaatgtcg tctaatattt ttaaagttaa

79140

taaaattatt ataaataaat ttaatattat tattattatt attatcacaa taatgtacca

79200

catgttgctt aaatataaaa attaaacaaa gaatgttgta ttattgcaaa tttaacaatt

79260

ttttgtattc tccccatgtc atgcgttcgt aatgagcggg cggtttttta tttctttgta

79320

tccacttgta atcgttaatg tggttgtgaa aagtcatact gacgtaggcc attaaatttt

79380

tcatgagcat attatttgac acaactgcaa catctgcgcc tgccgtttct tgctggtacg

79440

aatcgacaaa cgtaatgtct gtgccgtatt tttctttgtc aagtgcaatt tctataagct

79500

caatgtggta aatgatgaaa cctttgacgt tcatataatg atcgcggcac atggcgcact

79560

gtagtatgaa aaatacgttg taaaatagca ccttcattgt tttcaactgc tgcatgacaa

79620

aatctaaact gcttttgtct cgcgtataca ccatatcgtc gatgatgaga ctgagaaagt

79680

gcatggtgtc ccatatggta gtaaacgtgt aagtaaaact cttgggctgg cacgaacgca

79740

aattgagttc tgtggttttg tccataaatt ctatgcgaaa ctgttgcaag tccatgtcgg

79800

gggatgcgtt aatggcccat tcgatcaact gctgcacctc gtacttttga atgtctttgt

79860

atttcatcaa acacgcaaaa tggtataagt aagttgcttg cgaagacaac agtttggtga

79920

ggtgcgtcga tttagaggct cgcaaaaggt ctatgagacg aaacgaatac aacagatagc

79980

tgtctttgta acgagaaaaa agcggcgtca gcggtatcat ggcgactagc aaaacgatcg

80040

tgctgtactt gtgtcaggcg ccggccacag cgtcgttgta cgttagcgca gacacggacg

80100

ccgacgagcc tattatttat ttcgaaaata ttacagaatg tcttacggac gaccaatgcg

80160

acaagtttac ttattttgct gaactcaaac aggagcaagc cttatttatg aaaaaagtat

80220

acaaacactt ggtgcttaaa aacgagggtg cttttaacaa acaccacgta ttgttcgatg

80280

caatgattat gtataagaca tatgtgcatt tggtcgacga gtctgcgttc ggaagcaacg

80340

ttatcaacta ttgcgaacag tttatcacgg ccatttttga aatttttacg ctcagcagta

80400

aaatcgtcgt ggccgtgccc gtcaattggg aaaacgataa tttaagtgta cttttgaaac

80460

atttgcacaa cctaaatctc attggaattg aaattgtaaa ttaaaacaaa tcatgtgggg

80520

aatcgtgtta cttatcgttt tgctcatact gttttatctt tattggacga atgcattaaa

80580

tttcaattcc ttaaccgagt cgtcgcccag tttagggcag agcagcgact cggtggaatt

80640

agacgagaac aaacaattaa acgtaaagct gaataacggc cgggtggcca acttgcgcat

80700

cgcacacggc gataataaat tgagccaagt gtatattgcc gaaaaaccgc tatctataga

80760

cgacatagtc aaagagggct ccaacaaggt gggcactaac agcgtttttc tgggcaccgt

80820

atacgactat ggaatcaaat caccaaacgc ggccagcaca tctagtaatg taaccatgac

80880

gcgcggcgcc gcaaactttg atatcaagga attcaagtcc atgtttatcg tattcaaggg

80940

tgtgacgccc actaaaactg tagaggacaa tggcatgttg cgattcgaag tcgacaacat

81000

gattgtgtgt ttgatcgacc ccaacacggc gccgctgtcc gaacgagagg tgcgcgaatt

81060

gcgcaaatct aattgcactt tggtgtacac aagaaacgcg gcagctcagc aagttttatt

81120

ggaaaataac tttaccgtca ttaatgctga acaaaccgcc tatctcaaaa actataaatc

81180

atacagagaa atgaattaat aaaacaaaaa gtctatttat ataatatatt atttattaac

81240

atacaaaatt tggtacacta gtgttcaaat cgtttctgtt caacgccatt gtcatgttat

81300

aaaacacatt tgtagtttta ttgtaattat ttttaaattt atttttaatt tgctgtaata

81360

aaacttgttc attaaataca aaagactttg aactacttgc gtttatattc tttttataat

81420

tgtactgaac aaacgagggg tgcaaaaagt ttttcaaatg ctgcacggca atacctatca

81480

tctcctccat tttgtcctct cctattgtaa tagtggcact gcgcaccgtt ttaatgttta

81540

gaatgtaaat gagcgcatac agcggactat tgttggtgct caagcacatt aggttgtgct

81600

tatgcatagg gtcgttgctc agcagcgttt tgtatactac aaagcccgtt ttggggtcgc

81660

gtctgtacat tagtacgtgc gacaaaaaca aacgcaccgg cgtcacaagc gactcgtaat

81720

acatgctttc tatcggaaac tgtttggact tgatgtgttc gtacacggag ccggcaaact

81780

tgacgctgtc tacaaactta tggttcgtgt aaacaatcaa aaatctgtct tgtacaccgt

81840

cgtcataatc gtccacgtac agcggcttgt tgttaacaat taacattttg tagttggctt

81900

catactttag cagcccttgg tattttctgc tcttggaatc gctcttgctc gaatcggcat

81960

gcttcttaaa gtacgactcg ctgcattgtt tcaactcgtt gatagtgtac aactgcgagt

82020

tgagtttgct cacttccttg tcgctcgttt ccttgttgga ctctccgctg tggttgtcat

82080

cgtcaaactt gtgcatcaac accaaatagt ccaacagctc aaaaaacgac gacttgcccg

82140

aacccggttc gccgggcatg taaatagcct tctttccgta atctacggga atggccaaac

82200

tagcggcgaa atgcatcaac ataatcgcgt tcgcgtgatt aaaattggtg aagcgtttaa

82260

agtacaaata gccttcgaca atctttttca aataattgta cgagtactcc ttcaagtcca

82320

ctttggacat gatgatgcgc atgtagaatc gagtcagcca agtgggcaaa tcgtccgtgc

82380

tgcgcgccaa tatgattttg tcccaccaca cattgtactt cttcaagatc attaacgcgt

82440

cggcgtggtg cgtgtaaaat ttggaaatgt tatccgattc ttcaaactga acatcgggtt

82500

cacgtgcaac atcatcgcgc aattcggtta aaaacaaacg tttatcatta aacttgtcca

82560

tcaacatgtc gacatattcg attttgtgaa ttgttcgata caagtactga ataattttgt

82620

tgtgttcttt ggaaaaaaac tctccgtgtt ggttaacaaa ttcgctgttc gtgcgaatca

82680

acgtggtcga cacgtacgtt ttgttagtaa aaattagcat ccaaatcaat tcgctcaatt

82740

ctgcatcgtt accgaacatg tccgccatca agcagacttt tagcgctttt ctattgatct

82800

ttattttctt gtagcatttg cattttggtc gagatcccga taccgttgac cgacacggtt

82860

tgcattttag gttgtgcaac atgtcggaaa ccctgttctt gtttacgtac agagcgagcg

82920

taatcagatt ttcatcgtcc aaattccaca aatcgcgaaa caggttgttt aacgcgactc

82980

gcatatcggc ttggcatgtg ttgcaattgc ccatgtagtt aactatggcc gtgttagttt

83040

ttagcatttt tacatctcgg cacattttgg cgatgtgata agttctataa atgctgagct

83100

cgtcggcgct agtagatagc atgtaattaa acgcgtcctc gggcaaatac ttttcgtcgg

83160

tgggcttctt gaatgtctgc ggcaacgtgg tgcccaacaa aaatggacag ctcgaatgaa

83220

agctgttggt gaacacgttg tacacaccgt gcgttgtcaa gtacaagtat ttccaattgt

83280

taaattttat gttgctcaac ttgtaacaat tgcttttggt caatttgaat aggtcatcct

83340

ctttctttac aatttgataa tgtttgccgt tgaaaaccaa attgactccg gtcactacgt

83400

tttccaattt tctaaagaat cctttacaca caatgtcagg cggcaagttt agcgccatca

83460

cattctcgta cgtgtacgcc cacaattcat cgtgatccaa aatttcgttt ttagccgact

83520

gagtcaaata tatcatgtag tgtatgccaa aataatagcc caacgatacg cacaatttgg

83580

tatcgtcaaa gtcaaaccaa tgattgcagg ccctattaaa cactattttc tcttgttttt

83640

tgtaaggctc acatcgcttc aaagcttcat tcaaagcttc tttgtcgcag gcaaataatg

83700

attcacacaa aagttccaaa aacagtttga tgtcggtttc tctgtacgag aaattttcgt

83760

tcttggtcaa tatcttccac agtacataga ttaaaaaatc aaaattttta aatttgcttt

83820

tttcaaagta ttgttgtaga aggtttggat cgttggctcg ttcgtgggtc gccaaaactt

83880

taaccatgtt ctcgtgaatt gctataagcc ccaaattgat ttgcgtttga atgtagtctg

83940

cattttcgct gctcgccgat ataatgggta cgatgcgcgg ttttctggaa cgcgtgtcgc

84000

tcaagtccac gtcgtttttg tcaaaattgt tgttctcgaa cactctgagg cttttgaggt

84060

tgacgttgac gatatgcttg tacttgggca ccgtaatgca ttcctccaaa ttaatgtcgt

84120

ccctaatgta attgaaaaaa tttttatccg aattgaccag ctcgccatta actttgcacg

84180

tggccacagt gccgtcggcc attttgagta taaacaagtc ttcgtgagaa tcgtcaaact

84240

tggtttttcc atttacaaac agcgtttgcg gcggatcgtg attcgtgcgc aggctgagct

84300

cgacgttgag aaaacattta gggtcaaaca caaacaaatc cacagggcct agttttttgt

84360

tgtgtatgat tggtatcgtg ggttcgatga caattccaaa ttttatattt aaaaacagct

84420

gccatccgtt aaaagagaaa gcttgctttt tgggccagtt gggccaataa tagtaatcgc

84480

ccgcttgcac gcatttgtta atgtatccag ggtcggtgct cttgaaaaaa tcttcaaaat

84540

taatatactt ttgtatgatg tcatagtgct tcttcaaaat gaaaggtttt acaaaaatgc

84600

aaaaatcgtt actttccaac acccagtcgt ggccgtctaa tgtttgagct gcgtgtttct

84660

ctgcaggttc ttcggtgtct tcgcaagatg cgcccatgtc gtgtttcgcg cacggaccgt

84720

taaagttgtt tctaattgtg tttaagaact gttgaaagtt gttgacgtac tcaaacaatc

84780

tacgtgttcc tgttcgcgtg tttctaatga ttaaatgatt tgcatcttgc aagttgttaa

84840

tctcgtacgt tttgtcttga ggcacgtttt tcaaaaaaaa ttgtaaaatg ttgtcaatca

84900

tgttggctat cgtgtttgta cttttcgtgt taatttattt aataatttcg atcaaaaatc

84960

accatccatt cttacataga atagaaacgc taatacaaga tttcaacaac acattgttgt

85020

ttggcgcgta tgtacagatt tacgatttaa gcacgcccgc ccgcaccgaa cgattgttta

85080

ttattgcgcc cgaaaatgtg gtgttgtata attttaacaa aacgctctat tattacttgg

85140

actcggcgaa cgtgttttgt cccaacgagt ttagcgtgac cacgttcacg caatccacta

85200

ttaaaacgat caacgagacg ggaatatatg ccaccgcatg cacgccggtc agcagcttga

85260

cgctaattga acattttgca acattaaaaa ataacgtgcc cgatcacacg ctcgttctcg

85320

atgtggtcga ccaacagatt cagttttcaa tactcgacat tatcaattat ttgatttaca

85380

atggctacgt ggatttgttg gccgaataac gcgtatatag acgcttgtac gttcatcgta

85440

gtaatcattt taatacattt gattgaacta aacatacatc tgcaatgggt gaaagagtca

85500

ctaaattttg caatggaaaa cggcgataaa gaagacagcg acaatgaata gagtttatat

85560

ttttatttaa taaaatattg ttcgtaatcc ataatgtttt gtattatttc attgtgataa

85620

tgttcccaat cttgcacggg ggtggggcat cgtttgactt tgacgtagaa atcgtacgcg

85680

tagttattag ttggcagatc gtcgacaagt gtgatcgact tgaaaaagtt tacattttta

85740

tcgctcaaat atttaattac aatttttggc gatttgggta tattgttgtc ggatcgatga

85800

ttgtgaatgt caaaaacaaa tttattttca atgaaacgct tttttaaatt gtaatctaca

85860

atagcgttgt gtgaattttg aactaaatca gagcgttctt cttgaacggt ggaaccttcg

85920

ctgataatga tatcaaaata gccttccaaa tcgacgtctc gcatcgagtg tgctacatga

85980

tctctactgc catacgacca caagactaaa acgcaaccca tctcgtgcaa ctcctgcaag

86040

ctgtcataca caaacggatc tcgaatctca acttgctcct cttcggttat gagagtgctg

86100

tccaaatcaa acacgaccac gtgcggaaat ccccacgtca aagattcgct tttgagagag

86160

accactttgt agtgtggcaa tagaaaccat tctttaagaa acgaatacat tggcggtttg

86220

ttgctaagca cgcacatgtg gcccaacact ggcgttttga atgcgcgttt aatattgtgc

86280

ctgatgtcgc gcatgtcgtc ggcgggcgct ttgaatattt gcatacagta attgtaattg

86340

ttttctatga tcttgcacag ctgcgggtcg ttgcaaaatt gaaatattac atattcaaaa

86400

aatttatact tttcaaagcc aaggtatttg aggtcggcgt actcgcttaa aacgagaaca

86460

tgtcgtttga tgatggcgtc gttaaggcgc aaacagatcc atttgctttg aagcgaggag

86520

gccataatgt acaaaaatgg accagttacg ccttatttaa actgtttaaa gagtttcgta

86580

taaacaaaaa ctactctaaa ctaatagatt tcttaacaga aaattttccc aacaacgtca

86640

aaaacaaaac gttcaacttt tcgtctaccg gccatctgtt tcactcgttg cacgcgtacg

86700

tgcccagcgt cagtgatttg gtgaaagagc gcaaacaaat tcgattgcag acagaatatt

86760

tggcaaagct gttcaacaac acaataaacg atttcaaact gtacactgag ctgtacgagt

86820

ttatcgaacg gaccgaaggc gtcgattgct gttgtccgtg ccagctattg cacaagagtc

86880

tactcaacac caaaaattac gtggaaaact taaattgcaa actgtttgac ataaagccgc

86940

ccaaatttaa aaaaaaacct tttgacaaca ttctttacaa gtattcccta aattacaaaa

87000

gtttgttgtt gaaaaataag gaaaaacata ccagcactgg gtgtacacgc aaaaagaaaa

87060

tcaaacacag gcaaatattg aatgataaag ttatttattt acaaaacagt aataaaaata

87120

aactatttga gcttagcggg cttagtttaa aatcttgcag acatgatttt gtaacagtcg

87180

aaagccaaac gagggcaggc gacgaaatcg cttcgttcat tcgctactgt cggctgtgtg

87240

gaatgtctgg ttgttaatag tagcgtgttc tgtaacttcg gcgacctgtc gatgaacggc

87300

tcctggatct tctgtatgtg cggggtctac ccgggcggcg tctgtaaccc gagcttctgc

87360

gcctgcgtgt cgaaccatat gtggtaccgg ttgaagaacg gcgacggcga cgataaacca

87420

tgtttaaatt gtgtaattta tgtagctgta atttttacct tattaatatt ttttacgctt

87480

tgcattcgac gactgaactc ccaaatatat gtttaactcg tcttggtcgt ttgaattttt

87540

gttgctgtgt ttcctaatat tttccatcac cttaaatatg ttattgtaat cctcaatgtt

87600

gaacttgcaa ttggacacgg catagttttc catagtcgtg taaaacatgg tattggctgc

87660

attgtaatac atccgactga gcgggtacgg atctatgtgt ttgagcagcc tgttcaaaaa

87720

ctctgcatcg tcgcaaaacg gaatttcggt accgctgttg atgtattgtt gcggctgcaa

87780

catttgtatc ttttcgccgc gctcgatcaa caattcttca agagtggtgc gtttgtcgcg

87840

ctgtaaagcc acgttttgta acagcactat tttcgcatat ctcataatcg gactgttgaa

87900

acagcgtgca aacgacgacc gcataatatc gacggtcgtc aagtcgattg tggtcgaagg

87960

catctccaac agagatcgca cggcgtccaa cagcgtgtcc gtttgaacct gcgtcatttg

88020

cggtctgcac gtgtagtcgt caaacgtggt ttcgagcagt ttgaacaacg aatgatactt

88080

ttccgatcgc agcaaaaata tcatggtcat gaccacgtcg ctgattttgt attctgtaga

88140

actggtgctg ttcaacgaat agtgatggat tagtttgcga gcagcatttc tgtatcggcg

88200

catgttgatc aactcttcgg aaggctgcgc gggcgcggcg gcgttggctc gcgcaaacaa

88260

atttattacg ggacgcggcg taggctgcgc ggacgctggc gcggcgacga cgtccgcgtt

88320

tcccgccgcg tactgagacg ctatggcagc gttgttattt aaaattgtgt tttgcgattt

88380

gcgagccacg tgcatcataa aatttatcaa cacgtcggtg ttcaactgca cgctttgatg

88440

ttcgtcgcag agcaaaggaa atagctgggg ccatatcgcc aattgcatag gctcgtctat

88500

ttttaaccgc aatttgttta tttccaaata caacgcgata gcgctcatcg tgaccgacga

88560

cgcacactta ctctgtaact atcacttgga tcgtgttgtc gtaaacgctt cccaaaaagt

88620

ctaacacgtt gaccgtttcg attctattca acttaattgt ggacgcgttg gcttgcatcg

88680

gttccaacag actgcgcgct ccgacagatt gagtagacaa aatttttaaa ctttccgtct

88740

tattgggcgt aatgtcgttg attaacaacg acgcagccgt ttgagaggcc gcagtgttga

88800

tggtttgcaa catgtcgacg gccgccattt gcgtttgcgc cgaaggtctt gctggcggcc

88860

tgttgcggcg gtttcttcgt gcttgcgaca tgttgtcgtc agtgtccata tcggtatcat

88920

ttattgaagc aatcatggtt gagttcgata agcagagata tttcgttgtc caattggtac

88980

ttggtaatga tgtgccttat aaatgtttcg ggcacaatca tttctgtcat tagcacgtta

89040

caaatatcta ttttgatcaa tttcaattta tgaattaaca gattaatgtt ttcgtccgag

89100

tacttgctca tgatgaaacg acaaacgttg cggagttcca actccgctac cggatacgct

89160

ttgttgggca aactctctaa atagtgtctc aaataaaagc cgatcaatac ggtggacgct

89220

attttgttaa cctttttcat tttagtattg cggcccattt ctatcatgaa gtttttaaac

89280

ggtagcaaca gcctgtctcc gttagcaaca gtggagcagc cgttgcattg cgcgctcaaa

89340

atactcaaca cgcgctcgtg atcttcttgg cgcaatccga cggttgcttt tttgcattct

89400

ttgacaaatg gcacgcacat gtcgcgtttc gtgtacaaag aatacgcttt gtcgcaaatc

89460

aagttataga aaaattgcac aaatatctgc gtaatcaagt tgttttcgtt aataatgtca

89520

ctttcgtttt tgtaatcggt tcgaagcaac acgtacaaca tcagaggcat gccgaacatg

89580

ggtcttaaaa aaatgtccca accattttgc aagcccgcgt cgagggtgct cagcgaggac

89640

gccaagtatt tgcatttgca ctcaaaacat tgaattttgt ttgcgggctt gcacgactga

89700

cacatgatcg catccacgtc gggtgccggc gtcggattgt aatatttttg caagtattgc

89760

ataatggtcc taaaatgggg tacctgtttg ataaactcgt cgcgcaaaaa tatcgaaaaa

89820

atgtttttta cattgtgtat gttgtctgtg ttgttggctt gattctcaaa actactcttt

89880

atggaaacaa tacatttgtt aaattctgtg aaaaaagtaa gacctttact gtccacgatc

89940

aagctttggt tgaaatattt tgaaaataaa aaacacaacg aatcgatttc atcttgtaac

90000

aattgcgctt caaaacacac gttttcaaag cggtcgtaaa tgttaaacct taaactgtat

90060

tgtaatctgt aagcgcacat ggtgcattcg atataacctt ataatatgaa cgattccaat

90120

tctctgttga ttacgcgttt ggcagcgcaa atactgtcca gaaacatgca aacggtggat

90180

gtgattgttg acgacaaaac gctcagtttg gaagaaaaaa tagacacgtt gaccagcatg

90240

gtgttggctg taaatagccc gccgcaatcg ccgccgcggg taacatccag cgacctggcc

90300

gcatcgatca ttaaaaataa cagcaaaatg gtgggcaacg attttgaaat gcgatacaac

90360

gtgttgcgta tggccgtcgt ttttgttaag cattatccca agtattacaa cgagacgacc

90420

gccggtttag ttgccgaaat agaaagtaat ctgttgcaat atcaaaatta tgtaaaccaa

90480

ggcaattatc agaacattga gggttacgat agtttattaa ataaggcgga agagtgttat

90540

gttaaaattg atagactatt taaagagagc attaaaaaaa tcatggacga cacggaagcg

90600

ttcgaaagag aacaggaagc ggagagattg agggccgaac aaactgccgc aaacgctctt

90660

ctggagaggc gagcgcagac gtccgcagac gatgtcgtta atcgtgccga cgccaatatt

90720

cccacggcat ttagcgatcc gcttccaggc cccagcgcgc cgcggtacat gtacgaaagt

90780

tcagagtcgg acacgtacat ggaaaccgcc cgacgtaccg ccgaacatta caccgatcag

90840

gacaaagact acaacgcggc gtacactgcc gacgagtaca attccctggt caagacggtt

90900

cttttgcgtt taatcgaaaa ggcgctggcc actctaaaaa atcggttgca cataacaact

90960

attgatcaat tgaaaaagtt tagagattat ctgaatagcg atgctgatgc tggagaattt

91020

caaatatttt taaaccagga agattgtgtg atactgaaaa atttgtcaaa tttagcgtca

91080

aagtttttca acgttcgttg cgtggccgac acgttagagg taatgttgga agcgcttcgc

91140

aataatattg agttggtgca gcctgaaagc gatgccgtac ggcgaatagt cataaaaatg

91200

acgcaagaaa ttaaagattc gagcacgccg ctgtacaaca ttgccatgta caaaagcgat

91260

tatgacgcca taaaaaacaa aaacattaaa accttgttcg acttgtacaa cgacaggctg

91320

ccaatcaatt tcttggacac gtccgcaacc agtccagttc gcaaaacttc cggcaagaga

91380

tctgcggaag acgacttgtt gccgactcgc agcagcaaac gtgccaatag acccgaaatt

91440

aatgtaatat cgtcagaaga cgagcaggaa gatgatgacg ttgaagatgt cgactacgaa

91500

aaagaaagta aacgcagaaa attagaagac gaagattttc tcaaattaaa agcattagaa

91560

tttagcaagg acattgtcaa cgaaaagctt caaaaaatta ttgtggtcac cgacggtatg

91620

aaacggctgt acgaatactg caactgcaaa aattctttag agactttacc gagcgccgct

91680

aactatggca gcttgctcaa aaggctaaac ctgtacaatc tcgatcatat cgaaatgaat

91740

gtaaattttt acgagttgct gtttccattg acactgtaca atgacaatga taacagtgac

91800

aaaacgcttt ctcatcaatt ggtaaattac atatttttgg ccagtaacta ttttcaaaac

91860

tgcgctaaaa acttcaacta tatgcgcgaa acttttaacg tgtttggccc gtttaaacaa

91920

atcgacttta tggtcatgtt tgttataaaa tttaactttt tatgcgacat gcgtaatttt

91980

gccaaattaa tcgacgagct ggtgcccaac aaacagccca acatgagaat tcacagcgtg

92040

ttggtcatgc gggataaaat tgttaaacta gcttttagta atttacaatt tcaaaccttt

92100

tcaaagaaag acaagtcgcg caacacaaaa catttgcaaa gactaataat gttgatgaac

92160

gcaaactaca atgttatata ataaaaaatt ataaaatatt tttaattttt atttatattc

92220

agtacattta cacatattaa catattgttt atacaaattc ttataatcat tatgatttaa

92280

attgaattgt tgtctaaaca aattaaacac tttattaaac aataactttt cgttgtaatt

92340

ttttactttg cacatgttat aacaaaaaat taaaattttc atcatgtctg atttgtctat

92400

ggcgtcacag ttgcttttaa tgtaatcgca agttaaccac tcaaaaggac ccttttctat

92460

ttttaatttg tttaaatctt tataatcaga cttcagtttg taaattagat ttccacatcg

92520

aataataaat ccttccagcg ggctttgggg aaacattaaa gacttgaaat ttaacctttc

92580

tacaaaatcg ttgtacaaat atttgtgaca cggaatagta ttaaacccca cgttagtcaa

92640

caactcttgc gcctccacaa agggcacaaa ctccccgccg tataattgaa tttcgtaagc

92700

gtagtatttc aaactctctt tctggtccac gtagttaatt acgttaatgg gtgtcgtttt

92760

tgcgtcgtct ttccaaccca ttaattcgcc gtagacaata aaaccgtcat tgaaccgcgc

92820

ctgaagcgat cgcatgcacg tttctaaatc ttttcgaatg cggtaataat tcataaaatt

92880

gccgtccggt ctgtaagtgt ttcttgaccc gtacgtaatt ttattttggt tgcaaatgat

92940

tctgaaatta caaccgtcca acttttcttg aacaataatt tctttgtcgg ccaacgtacc

93000

ttttttacct tgatctagat gcgacacaga tggataaatt tgatacacaa ttttattctc

93060

atcttcgggc attacgggtc cgcgttcatt taacgcgtac atgacaatgt tgtggcgaat

93120

gtcggtgcgc tccggcggtt ctggcacgtg gtgcagtctg tcctgcaatt gttgcttcca

93180

ttgttgaaaa tattcggtcc attcttgttg atactcgccg cgttgcatga gttttacgta

93240

cagttttaaa agtttgacat tctttacaaa taacgttaga gtttcgtcga ttttgtatcc

93300

tccattattt ttgtttaaat ccaatacatt taaatcgttc actaccagtt gattgttttt

93360

atccatcgta atttttatct catcgcccac gttgaacaac atgtttaaaa ttttggtgga

93420

tttcggcgca cgtttataat ctaaataata ttcaacgtac acgtaattga acatgagctg

93480

caacaatcct ttggcattgt tcaaaatttt gtatctcatc aaagtataaa taattttcac

93540

catcgacacc gtcatcaact tggttacaaa ctcgtacaat tgcaagtttt caataccgta

93600

tttgtcttta aaatcttcac gtttactgaa catgcttaat tcgggagatt ttccagtcaa

93660

aatgccaatt aatcccgtgt acaagtcaac gtatttgaca tcgttgcccg attcatcttt

93720

tgcatgtcga tttttcaaaa gctctttatt gtcgataaat ttttcaaagg tctctcgatc

93780

acatttagtg taaatatggt agtcagtgtc gctgctttcg accgcgtatc ccttggcatg

93840

gctgcccgta tcaatgcaaa tgtacaccat gttagaatgt gctgcttact gtgcctgtat

93900

caagccttat atacctcaaa atatttcaca tttttgcatc atcgtaaaat atacatgcat

93960

ataattgtgt acaaaatatg actcattaat cgatcgtgcg ttacaagtag aattctactg

94020

gtaaagcaag ttcggttgtg agccgtgtgc aaaacatgac atcataacta atcatgttta

94080

taatcatgtg caaaatatga catcatccga cgattgtgtt ttacaagtag aattctactc

94140

gtaaagcgag tttaaaaatt ttgtgacgtc aatgaaacaa cgtgtaatat tttttacaat

94200

atttaagtga aacattatga cttccaataa ttttgtggat gtggatacgt ttgcaagaca

94260

attgattaca gataaatgta gtgctctaat caaaagtgcg gatctgttgc cggcaaacat

94320

tttagagatt gtagagaagg ccagagacaa gtattttgag gagccaactc aaaaaaacta

94380

tgaatacatt aaaaaattat ttttacgaac aaaatatatg gacgattcga tagattataa

94440

agattttaac agacgcatcc tattgatagt ttttaaattc gctttaaaca agagcaccaa

94500

ctactttcca tcgtacaaag agatcatcga ggtggccatt aaacgtttaa acaaaattaa

94560

ccccgattta aagagttctc cgcgcgcaat gcttcagcat tacaatgaat gtttggaaaa

94620

tctagacaat ccagtcacgg acgaacatca tttgttaaca tttggaaaag aagttgctac

94680

aaaaatattt atcgaagcgt ttgaatacag ttacaccaac actaatgcca tcagcatgga

94740

caaaacagat gaatttgatt ttattaaacc ggcattgaaa cctttgccag atgcaagacc

94800

gccatcgctt ttggccaacg tgatgaacga acgtaaaaga aaattacaaa acaccaactc

94860

aacggcaaaa tgtttgctac cagcaccacc gccacaattg cgtaaacttg aaaaaaagaa

94920

tcatttattg cctttgtttt ctttgtaatt atattgttgc atttctattt ctaatatcat

94980

agttttctaa taaagtagtt tcatattttt gtttttgtac agtaattgtt tcttggttta

95040

acaagatcac aaccaataac ataaagaata acacaatcat aacaaaaatt aaaaagccgc

95100

atactactag aacaaattct ttaattagcg atcggtttct atttacaaat tggccgagct

95160

gatcgccttc agtcggcgag ttgtgggctt ggatgatgtc gacgatattg ttgccggcgc

95220

gaccgcctgt cgctctcgat ataatgtcgg ccgccgtcgg tttcatgatg tgcttaacta

95280

caaataatag ttgtacttga cgggcgtcac cgtgatgccg ctgctaaaac ctccgtccgt

95340

taagacgcgt tgcgttacaa aattaatgtt tgtccgatta gcgtagtcgg aataatcaaa

95400

cgtgttgggc ggactaaaat cgggcatgtt gatgggcaca atgccgctgg agctgatagc

95460

aatgctgtcg ttcttgcaaa acagccgaat ttttttgtag ggctctgctt tattcggcgc

95520

agacgacacc atctggtcaa agttgttcaa ttttatgatt acgttgggta ccaattgata

95580

ggggaaaatt attttctgga acattttgac aaagtccaca accgtttggc tatagtcggg

95640

aatgccgagc aaagactgcg cctgtttaat gtatttgaga ctggagcggt ttactgtagc

95700

gcaattggat ggcacgtcgc ccttcataag ccggcgcgtt ctctcccaat tcaatttgtt

95760

gtacaaatta tcaatctcct cgtgcggcag attgattaca tagcgcgcgg gctgtttgcg

95820

atattgaaag atgcaaaaaa tgcgtttcaa cgacaatatc ttcaccatgg tggacgtttc

95880

cagattgaaa cataacaaaa agtcattgct ttccaccaat tctttaaaat gagacagcgg

95940

aatttcacaa gcgatcggtc gcaaattgct ttttattgga ggcggaacgc tttgaccgtt

96000

gcggtttttt agtaacgcgc tgcacgcaga ttgcatgtcc gtttcgggat acgtaaactc

96060

gatgggacat ttggggtttt catggtgaac gatcatagtg ttgcaataaa acaagttgtt

96120

ggtcaggagc acgctaaaaa cacgcgtttc gcccgcaccg atttcggtga tgggtaccaa

96180

cgggttccag tagactatgg tggcggacgc tgtttttttt ggcgatcgac tgtctatgtt

96240

aacatcatgc tcgtgcctgt acactagcac agaattgaat tttggaaatt gttttttgtc

96300

aatgtacaac cggtcgtcgt ctgtgggcac gtacacgatc aagttttcga ttaatttgtt

96360

gcctacgtcg ctttgcggtt ccaccaaatt gtgagggaac gcaaaaaagc gatcgctaat

96420

acaaacttga atctgaaacg ggcactccat cgtgatgtat atgtcttact tcattagact

96480

ttagattatt ttaatttgtg aactcgtacc gtattcaata gggtgtcggg cacgtaattg

96540

taatggtaaa acagatcctg ttgaacacgt gcgttgttca ctacgattga aatgcaaaaa

96600

tacatcaagt acataaacac tatgattaga aaggtagcag acagaaaata tttcatcttt

96660

aaatcttatg ctagttgaat aaaatacata gtacttttat acgtttattt atatttgttt

96720

tctttgttat aaccgtaatt gtaaaacttg tgatcgtgct cgccaggcat aatttctttg

96780

cacatcagct tgcgaatata tgtgacatct tcgtacaccg atttcttgat gttaccatcg

96840

tgaagcgttg tcggcttgag aggtttgcgg tcgttgttgt aaaaattttg caccgaataa

96900

ttatccatag tgcagcacag gcaatgtcac tgatgcatat gctttaattt tttattgcat

96960

tcagttatta tatgatttaa taaacgtaca caatagcacg tttatcggtt aaagataact

97020

ttcaatatat aaaagtgttt gaattgcgag accgtcaaca taacgtttat caacgcgatg

97080

actaaacgac aatttgcttt gctgtttgtg tggcaccacg acaaccaatt tgtttgcaac

97140

acggacgaat acccgttttg gcacaacatt gaataccatg cacggcgcta taaatgcatc

97200

gttttgtact gtgtggaaaa cgacggatcg ctacaactgc ccgtttgcaa aaacataaat

97260

ctcataaatt ataaaaaagc gtatcctcat tattatggaa actgtgttga cagtatagtg

97320

aaacgtgctg gcaaaattga ttatatgaaa gtaactgcaa tgttaaaccc ccacctgttg

97380

gacgtcgcgt acaattattt gctgttgatg gacatggatt gtgtggtgca aagcgtgcaa

97440

tggaaacaat tgtcaaccga cacgtattgt tttgagccgt tttacgactc tcaaattaaa

97500

tggttgtacg cgcccaaaag cggacaaagt tttgatagtt atcttgaaaa ctatgcaact

97560

ctaattcgag tcaaacaagt gcagcaacat cgaaaagaat taatactgca ttgtgtggat

97620

tttcttacaa tgaaagcaaa tgacaatttt atggtgttca aaaattatat taacatgatt

97680

ataaaagtgt atttgcaatt ttacaattac agatttccca tcaattttga ggacaacacg

97740

atgaaacctt gtgtaaattt aacttttaga cgtggcggca gttggaaaac tcaactgcaa

97800

cccgtatgca attatgttta caaaagtaaa aatatgccaa aatttattaa ataaaacaaa

97860

ttaatttaaa caagcgtttt tattgacaat actcacattt gatattattt ataatcaaga

97920

aatgatgtca tttgttttca aaattgaact ggctttacga gtagaatttt acttgtaaaa

97980

cacaatcaag aaatgatgtc atttttgtac gtgattataa acatgtttaa acatggtaca

98040

ttgaacttaa tttttgcaag ttgataaaca tgattaatgt acgactcatt tgtttgtgca

98100

agttgataaa cgtgattaat atatgactca tatgtttgtg caaaaatgat gtcatcgtac

98160

aaactcgctt tacgagtaga attctacttg taacgcatga tcaagggatg atgtcatttg

98220

tttttttaaa attcaactcg ctttacgagt agaattctac ttgtaaaaca caatcgaggg

98280

atgatgtcat ttgtagaatg atgtcatttg tttttcaaaa ccgaactcgc tttacgagta

98340

gaattctact tgtaacgcaa gatcggtgga tgatgtcatt ttaaaaatga tgtcatcgta

98400

caaactcgct ttacgagtag aattctacgt gtaaaacacg attacagcac ttcgtagttg

98460

tatcgaaaat tgttcaatgg ctctttgtta atgtcgtaat tgattaatat gtcgtacaat

98520

ttggcggcgt tgtgtttgca cacgaccgtt tttagttctt gaaacatttt ttcgtgtatg

98580

tttagcatgt tgtatttcag agtgcgatgt gtaatgctgg tgacgagcat caaaatgata

98640

aaatctaaag cggctaattt gtaatcccgt tcatacgctc tgtaatcgcc aacaactctg

98700

tggccagatc tttttagatt ttgacaggcg ttatggtacg aattgataat atttactata

98760

gtttctcttg ttatcggttt gtcgattaaa ctgttaacaa acatcacgtt gcccaagcgc

98820

gacggtttag acaccgactt gttttttgtc tgttcaaatt tgtacaaatt aaaaacgctc

98880

atagactggt cgtcaggcag tgtgtcgtta tacaaacaaa atggtaaaac gtttaattcg

98940

acaaacgacg agcacattaa agtttgttgg ctgttaacgt cctggggatg taaactgtta

99000

ttcataacgt aacacacttc aatgtcggaa tgcttgtttt caaatttgtc cttgtctaca

99060

gtttcaatgg tgattgagcg aggtttgagt ttattttgta aattcatttg gatattttca

99120

atatggtata ccaccgacac gttgtgagcc agcgatcctt gattggtttt aatcatattc

99180

aaaatattca tgatatggtt gaaaaaagag tctgtcaaaa cgtttgtgtc gttgttaaat

99240

atcgctttcc agggtttact gttgcgtgac tcaacgacgg ccgtgtaaca taacaagcgc

99300

gccagttgca tgtgcgacaa cttaatgtta tcaatgtcgg tgatgtttgg caccagattt

99360

tcattgccgt cttccagtag cgtgctcagt tcggtcgagt agttattcaa cgatcgattg

99420

tgcgattcaa acaagtttac tatcgcaggt tgtacatagt tttttatgtc gtcaaattga

99480

attatatcga tcttgtcctt gttctccagc ataaacgaca aattttttag gtcgaattta

99540

atatttggcg cgttttcgtt ggactttttg taatttaaca acatcgccaa cagtttgtgt

99600

aactcgccgt tagcttgatc tttgctaaac agtttattgg tagcgtaatt cacgttgtcg

99660

ttcaaaaaca gcaactcgtt gatgatcatt ttttgtaaaa gcgcgtactt gctcatgttg

99720

acagaatctc ttacatttca gttgtaaacg cgtctgtaca aattggccat gcgattcgga

99780

atgcacacgg ggatcgtgcg agccagtgcc gtttggcgaa atagcatttt ttcatagccg

99840

ctcgaacaat cgcacgcgtc cggcgaaaat tgcaccgtgt tcaaattcat attcaaccgg

99900

ccgtcgttgc atagataagg cctcggtgtt cccgtatcgt ccaccaagtc tctgtacgtg

99960

ctcacgcatg tttgagacac gacaaaatct ccgccggcgg agaaaacgtg aaccaagccc

100020

agtgcgggat cgcattctat caagtccgga gcctgcgcgt ttaccaaagc gtcggaggcg

100080

ttgcaaaagc catcctggca ggtcaactcg tttgcagcgc tggagatcac gcagttgtct

100140

ctacactgct gatccgtcac gcacggtaac cggttcaatg aacaatctac gcctcgattg

100200

cgctgaaacg taaaatttaa cggcggcgct tccaactcgt taatgtgcat gtatgcatct

100260

tgcaaaataa atttttgaac aaatttaaac gtgtacatgt acacgattag tataattacc

100320

agtagaataa gtatttgcca aaagttcaac atgatcgtct taactgagtg tgaaaagcgt

100380

ggtgtgacgc acgaaatgac tggttgcgca aaaaataaac cggggtctat ataactcggc

100440

gtcgaccgcg ttcattttta ccgtcatgca tctgacggct aatgtattgc tcgttcctaa

100500

cgcgctcaaa aagcgggacg tgaaatacat ttataatacc tatttgaaaa attacagtgt

100560

aattgaaggt gtgatgtgtt gcaatggcga ttgtttggcc gtggtggtgt tggaccgaaa

100620

tcagctgcaa aacacggaca tggaagtgtt ggagagttta gaatacacta gtgacaacat

100680

tgaactgtta tgcgaaaaaa tatgtgtgat agttgataat tacgacaagt attaccaaaa

100740

aaattgtgta taaataaaat accaaatttt attatatcat tttgttttat ttaataatta

100800

aagaatacaa cgccacatct attcctagta caacaaataa tttgattatt atttttgagt

100860

gcacattaaa aaataacaaa cagtgtaaaa atactacaga ataatacaat acataaatat

100920

tatagtaaat agctgcaatt ttgatagcgt aatttatact ttgatatttt tcaacgtaca

100980

acgttaaatg ttgatacgca ttattcacaa ataacaaaat ttttctaata tgccatttgt

101040

ccgcaattgt ttttgcgata tcaaagcctt tttcaaacaa ttgaaaaatt gcaaacaaaa

101100

ccacgtacat gacgttatac atagtgttaa agtttttaca taacaattct ataatgaaga

101160

aaattgctaa acacggcatg agcgcgcaca taatcgcgtt ggccgcaaat atctcgtacg

101220

tacaaaaata ctcggacatt ctccaataag taaaatgcat tttgctatta tactgttgtt

101280

tcttctagtg attattgcaa tagtgtacac gtatgtagac ttgatagatg tgcaccatga

101340

agaggtgcgt tatcctatta cggtttttga caacacacgc gcgccgctta ttgaaccgcc

101400

gtccgaaata gtaatcgaag gcaatgcaca cgaatgtcac aaaactttga cgccgtgctt

101460

cacacacggc gattgcgatc tgtgccgcga aggattagcc aactgccagt tgtttgacga

101520

agatacaata gtcaagatgc gtggagatga cggccaagaa cacgagacgc ttattcgagc

101580

gggagaagcg tactgcttgg ctttggatcg agaacgcgcc cgatcgtgta accccaacac

101640

gggtgtgtgg ttgttggccg aaactgaaac tggtttcgct cttttgtgca actgcttacg

101700

gcccggactt gttacgcagc tcaacatgta cgaagactgc aacgtgcccg tgggctgcgc

101760

gcctcacggc cgtatcgaca atatcaacag cgcttcgatc cggtgcgtgt gcgacgacgg

101820

gtacgtgagc gactataacg ccgacaccga aactccgtat tgccgtccgc gcaccgtgcg

101880

cgacgtaatg tacgacgaga gtttttttcc gcgggcgcca tgcgcagacg gccaagttcg

101940

tctggatcat ccggcgctca atgattttta ccgcagacac tttagactcg aagacatttg

102000

cgtgatcgac ccttgctcgg tggacccgat tagcgggcaa cgcacatcgg gacgcttatt

102060

tcaccaacca accgtaaatg gtgtgggaat caacggatgc aattgtccgg ccgatgacgg

102120

gttactgccc gtgtttaatc gacacaccgc cgacacgggc atggttagac aaagcgaccg

102180

caccgtcgcg aacgcttgct tgcagccgtt taacgtgcac atgttatcgt tgcgtcatgt

102240

ggattacaaa tttttctggg gccgcagcga ccacaccgag tttgccgacg cggacatggt

102300

gtttcaagcg aatgtcaacc aactcagtca cgaacggtat cgagcgattt tgtactcgtt

102360

gctcgagtcg cacccggacg taacagaaat cgtaacagtc aacatgggtg tcatgaaaat

102420

ttccgtgtca tacgatacca cattgaaaaa tatactatta ccatcttctg tttttaggct

102480

atttagattt aaagaaagtg gcactgctca gccggtatgc ttctttccag gcgtaggacg

102540

gtgcataacc gtcaattccg attcgtgcat caggcgacac gctggtggtc aagtgtggac

102600

cgcagaaacg ttcaccaact cgtggtgtgt actgagtcgt gaaggtacgc atataaaagt

102660

ttggagtcgc gcgtcacgat atccacgcgg agacgcgcct gcagcgttaa gattgcgcgg

102720

cttctttctg aacaacgatc gcgaacgaaa cacaataaga gcggtcacta caggcgacat

102780

gacccaaggg caacaaatag acgcattaac ccaaatactt gaaacttacc ccaactactc

102840

tgtataacaa catgagcatt ttaaaagttg tagaagcgtg cgatttggca cacacttttt

102900

tgaaattggg ttatttattt agggccaaga cttgtttgga tatcgcttta gataatttgg

102960

aactattgcg tcgaaagact aacataaaag aagtggcagt catgttaaac aagaaaacta

103020

cagagtgttt gcaattgaaa cgaaaaatag ataaaaaaat tgcacaacgt gttttaataa

103080

aaatttacac tatcaaatga tgacatcata acgggttcaa tattctgtgt gcaaaaataa

103140

atgacatcat atttcaaact tgttttacgc gtaaaattct actggtaaaa caagtttgag

103200

atatgatgtc atcatcacaa ataatagtat gtaataaaat aaacatattt gtgtgtaaat

103260

ataatttatt acaaataaat tttacattga atcaatctgt cttcgtgttt gttgtaaggt

103320

cttcgaatct tgtgtttcag cccctcggga tggtcaaaat gcgccgtagt aattgttaat

103380

ggatctttca acgatttttt gcccatggcg agtgtgacaa acgcggccac gacaaacagc

103440

aggataatca gtttcatggt gttctatatt tgacaatata tgggtcgctt ctaaatcacc

103500

ttgtccccaa aagcctcttt tatagttttt tagaacacgt tgtgtattcc aacagtaatt

103560

gttccatctc tttcaacagc cattcagcat ccggtcgttg actgtaatca tgctgaatta

103620

atttacaaac aatttcggtc aatttaggat ggccttggga taaacttgcc ggcatttgct

103680

gtacattgtt tctaaagtta gttagcgtag tttcgcgttc caaagcagtc ttgaagggca

103740

ttatcaattc gaataaaaca atgcccaaac tatacatgtc atttttgggg gtgtacactt

103800

ttttgatttg ttctggtgca gcgtacaaag ttatattttg agggttgttt ttgataaacg

103860

ttttgtatag actgccaaac atgccgccca catacaaatc aaagtcgggc ccagtcatga

103920

aaatatcttc gggattaata ttgtggtgca cgatatttac ggaatgaatc gctttcacgg

103980

cgctcaccaa atcaacaaac ttgctaatat aaaagccaaa atccgccgga actttaatgt

104040

tggtctttgc aaaagtttgc aaattgcgtt gtttcaaata gtcgctcaac atgtactcgt

104100

ttagaggcga cgcaaaatat atgcggtgct gccgcggatt caaataaacc aattgttcgg

104160

gtttcatggt atacagttaa gtgttaacgc gtcactaaat tcagacacga gcgcacgccc

104220

tatatacata caatttatcg cacaagatgc ttaacgcgat ctgtttataa actaaaacgc

104280

actgcaataa attttagcaa gcatttgtat ttaatcaatc gaaccgtgca ctgatataag

104340

aattaaaaat gggtttgttt gcgtgttgca caaaatacac aaggctgtcg accgacacaa

104400

aaatgaagtt tccctatgtt gcgttgtcgt acatcaacgt gacgctgtgc acctacaccg

104460

ccatgttggt gggatacatg gtaacattca atgactccag cgaattgaaa tatttacaat

104520

actggttgct gttgtcgttt ttgatgtccg tggtgctaaa cgctccgact ctgtggacga

104580

tgctcaaaac cacagaagcc catgaagtaa tttacgaaat gaagctgttc cacgccatgt

104640

actttagtaa cgtgctgttg aattatgtgg tgtttttgga caatcaaatg ggtacaaatt

104700

ttgtttttgt taacaattta attcactgtt gtgtactttt tatgatattt gttgaattgc

104760

ttatcctgtt gggccacaca atgggcacgt acacggatta tcaatatgtc aaatcgtgtt

104820

atatggttat attgtttgtt tcagttatga gtgttactat tgttatgggt ttagagtgtt

104880

tgaaaacgaa actaattgat aacagtttga tgtttaacgc gtttgtgtgc gctttgtaca

104940

ttgtgattgc aataatgtgg tctttaaaaa ataatttgac tagttattac gtttcaaatt

105000

tacaaagtat tcaagttgtt ccgttttcat acaacgatcc gccgccaccg ttctctaaca

105060

ttgtaatgga tgacataaaa aataaaaaat aatttataaa aatgtttttt attctttcac

105120

aattctgtaa attctaaaca aaaaatataa atacaaactt attatgttgt cgtctaaata

105180

aacatcaatt tgtaaatctg gacacctatt catatcattg atattacagt ctactataca

105240

acaattaaaa ctaaccaaat tatctttaca acaattaaag caattaaaac aatttaaata

105300

atcttcattg tcgtcgtata agtttatttg cactgtagac ggtgttacac agcgatccat

105360

tcgacgttcg tgttcgatca actttctcgc caacttgtac cataaaaatt gtttggacaa

105420

aaagttttcc aacaatggta acggccaatt caacgtgacg atgcgcacgt cctcgggtat

105480

gcatttgtta aaaaacacac agctcgcttt accaaacgaa agcaaaggta ctaaatatgg

105540

cgccattggc tgatttgtta ttccaagata attacaaata aactgatccg tcgtggggtg

105600

ataactggca ggtgtcagct ttaaataatc ttcaacgttg ttgtcgcgca aaagtctgca

105660

ttttacacgc gttgttaatc ccacgacttt tgcatgtaaa atcggatcca aatactgcag

105720

aatcgtgtct ataatttcta atggtaaacg tatgcgtttt gctcgtgggc gctttgtaac

105780

gctcgacatc ctaataacaa ctaacacaaa actaaaatga tactcaatat attgctttta

105840

cagttcatct ttaggtttaa actgtgcgtt tatcgcgttg agcaagtcgc cgttatcggc

105900

atcaatctcc caagcaaaca ggccgcccaa tttatttcgg tcgacatatt taacttttcc

105960

taacacagag tcgacgctgt caaacgaaat caaatcacct ttacttttat cgaaaacgta

106020

cgacgcttga gcggcgctgt caaacgtgta cacataattg ttgagatctt tttgaatttg

106080

acgataatct acaacaccgt cctcccacgt gcccgacacc ggcccgttgc cagtgccgga

106140

aaaatagttg tcattcgtat aatttgttac gccggtccag ccgcggccgt acatggcgac

106200

gcccacaatt attttgttgg gatcgacgcc ttgtttcagt aacgcatcga cagcgtagtg

106260

tgtagtgtat agctcttccg agttccaact tggcgcgtag actgttgttt ggtagcccaa

106320

atccgtgttt gaccaagccc ctttaaaatc gtaactcatg agaaatattt tgcctaatga

106380

cttttgcgct tcggcgtagt ttaccacggc aatcttgtcg taacccgcgc ttatagcgct

106440

tgttaattcg taaaccctgc cggtttgcgc ttcgaggtcg tctagcattg cgcgcagctc

106500

ctccaacaac aaaatgtatg ttttggcgtc acgctccgca tcgcccaacg acgggttagc

106560

ccctttgccg cccggaaact cccaatcgat gtctacaccg tcaaagaatt tccacacttg

106620

cagaaattcc ttaaccgaat ctacaaaaac gtttcttttt tcaacatcgt gcataaaata

106680

aaatgggtct gatagagtcc agcctcctat tgaaggaaga atttttaaat gggggtttgc

106740

taattttgcc gccatcaact gtccaaaatt gcctttatac ggctcgttcc aagcggacac

106800

acctttttgg ggtttttgta cggcggccca cggatcgtga atggcaactt tgaaatcttc

106860

gcgtcccttg cacgatcttt gcaaagattc aaagcttccg ggtatcgttt tgagggcgtc

106920

gtttattcca tcgccgccgc agatgggtat gaaaccatac aacaagtgtg ataaatttgg

106980

caagggaact ttgtctacgg gaaagttgcg cccgtacaca ccccactcaa caaagtacgc

107040

agcgacaatt ttatcctctc tcctgccagg tttgttgttt tccagccatg tgtattcgag

107100

cggtgccaga tggccgccgt cggtgtctgc gactttgacc aacacgggat cgctcacgga

107160

acagccgtcc tcattgcaaa gtttgacacg catgttaaat tgcccgctca caagaacttt

107220

aatggtagcc cttttacttt cggcgtcgcc tttccatacc tgctgctcgt caaacaacac

107280

gtacgctatg tcgccaatgt cgccgttcca gacgttccaa ctgacttgaa cgtcgacttg

107340

ttctttaggc tttattaaat tttcgtaagc ggtggcctcg taatttattt ctacgagcgc

107400

ataattgcga tcggcccaat cgatcaccgg cgtgccggga atcgcgttag aaacggcgac

107460

caaccacaaa acgtttaaca atttgtacaa cattttaatt tatcttaatt ttaagttgta

107520

attattttat gtaaaaaaat gaacaaaatt ttgttttatt tgtttgtgta cggcgttgta

107580

aacagcgcgg cgtacgacct tttgaaagcg cctaattatt ttgaagaatt tgttcatcga

107640

ttcaacaaag attatggtag cgaagttgaa aaattgcgaa gattcaaaat tttccaacac

107700

aatttaaatg aaattattaa taaaaaccaa aacgattcgg ccaaatatga aataaacaaa

107760

ttctcggatt tgtccaaaga cgaaactatc gcaaaataca caggtttgtc tttgcctatt

107820

cagactcaaa atttttgcaa agtaatagtc ctagaccagc caccgggcaa agggcccctt

107880

gaattcgact ggcgtcgtct caacaaagtc actagcgtaa aaaatcaggg catgtgtggc

107940

gcctgctggg cgtttgccac tctggctagt ttggaaagtc aatttgcaat caaacataac

108000

cagttgatta atctgtcgga gcagcaaatg atcgattgtg attttgtcga cgctggctgt

108060

aacggcggct tgttgcacac agcgttcgaa gccatcatta aaatgggcgg cgtacagctg

108120

gaaagcgact atccatacga agcagacaat aacaattgcc ttatgaactc caataagttt

108180

ctagttcaag taaaagattg ttatagatac attaccgtgt acgaggaaaa acttaaagat

108240

ttgttacgcc ttgtcggccc tattcctatg gccatagacg ctgccgacat tgttaactat

108300

aaacagggta ttataaaata ttgtttcaac agcggtctaa accatgcggt tcttttagtg

108360

ggttatggtg ttgaaaacaa cattccatat tggaccttta aaaacacttg gggcacggat

108420

tggggagagg acggattttt cagggtacaa caaaacataa acgcctgtgg tatgagaaac

108480

gaacttgcgt ctactgcagt catttattaa tctcaacaca ctcgctattt ggaacataat

108540

catatcgtct cagtagctca aggtagagcg tagcgctctg gatcgtatag atcttgctaa

108600

ggttgtgagt tcaagtctcg cctgagatat taaaaaactt tgtaatttta aaaattttat

108660

tttataatat acaattaaaa actatacaat tttttattat tacattaata atgatacaat

108720

ttttattatt acatttaata ttgtctatta cggtttctaa tcatacagta caaaaataaa

108780

atcacaatta atataattac aaagttaact acatgaccaa acatgaacga agtcaattta

108840

gcggccaatt cgccttcagc catggaagtg atgtcgctca gactggtgcc gacgccgcca

108900

aacttggtgt tctccatggt ggttatgagg ttgctttttt gttgggcaat aaacgaccag

108960

ccgctggcat ctttccaact gtcgtgatag gtcgtgttgc cgatggtcgg gatccaaaac

109020

tcgacgtcgt cgtcaattgc tagttccttg tagttgctaa aatctatgca ttgcgacgag

109080

tccgtgttgg ccacccaacg cccttctttg tagatgctgt tgttgtagca attactggtg

109140

tgtgccggcg gattggtgca cggcatcagc aaaaacgtgt cgtccgacaa aaatgttgaa

109200

gaaacagagt tgttcatgag attgccaatc aaacgctcgt ccaccttggc cacggagact

109260

atcaggtcgt gcagcatatt gtttagcttg ttgatgtgcg catgcatcag ctcaatgttc

109320

attttcagca aatcgttttc gtacatcagc tcctcttgaa tatgcatcag gtcgcctttg

109380

gtggcagtgt ctccctctgt gtacttggct ctaacgttgt ggcgccaagt gggcggccgc

109440

ttcttgactc ggtgctcgac tttgcgttta atgcatctgt taaacttgca gttccacgtg

109500

tttttagaaa gatcatatat atcattgtca atcaaacagt gttcgcgtgt caccgactcg

109560

gggttatttt tgtcatcttt aatgagcaga cacgcagctt ttatttggcg cgtggtgaac

109620

gtagactttt gtttgagaat catactcacg ccgtctcgat gaagcacagt gtccacggtc

109680

acgttgatgg ggttgccctc agcgtccaaa atgtatacct ggcactcgtc cgtgtcgtcc

109740

tggcactcga gcctgctgta cattttcgaa gtggaaatgc cgcatcgcca cgatttgttg

109800

cacgtgtggt gcgcaaagtg attgttattc tgccgcttca ccaactcttt gcctttgacc

109860

cactggccgc ggccctcgtt gtcgcgaaaa cagtcgtcgc tgtcactgcc ccaacggtcg

109920

atcagctctt cgcccacctc gcactgctgc ctgatgctcc acataagcaa atcctctttg

109980

cccacattca gcgttttcat ggtttcttcg acgcgtgtgt tgggatccag cgagccgccg

110040

ttgtacgcat acgcctggta gtaccccttg tagccgataa tcacgttttc gttgtagtcc

110100

gtctccacga tggtgatttc cacgtccttt tgcagcgttt ccttgggcgg ggtaatgtcc

110160

aagtttttaa tcttgtacgg acccgtcttc atttgcgcgt tgcagtgctc cgccgcaaag

110220

gcagaatgcg ccgccgccgc caaaagcaca tataaaacaa tagcgcttac catcttgctt

110280

gtgtgttcct tattgaagcc ttggtgtgac tgatttacta gtagcattga ggcatcttat

110340

atacccgacc gttatctggc ctacgtgaca caaggcacgt tgttagatta ataatcttat

110400

ctttttatct taattgataa gattattttt atctggctgt tataaaaacg ggatcatgaa

110460

cacggacgct cagtcgacat cgaacacgcg caacttcatg tactctcccg acagcagtct

110520

ggaggtggtc atcattacca attcggacgg cgatcacgat ggctatctgg aactaaccgc

110580

cgccgccaaa gtcatgtcac cttttcttag caacggcagt tcggccgtgt ggaccaacgc

110640

ggcgccctcg cacaaattga ttaaaaacaa taaaaattat attcatgtgt ttggtttatt

110700

taaatatctg tcaaattaca atttaaataa taaaaagcgt cctaaagagt attacaccct

110760

taaatcgatt attagcgact tgcttatggg cgctcaaggc aaagtatttg atccgctttg

110820

cgaagtaaaa acgcaactgt gtgcgattca ggagagtctc aacgaggcta tttcgatttt

110880

gaacgttcat agcaacgatg cggccgccaa cccgcctgcg ccagacatta acaagttgca

110940

agaactgata caagatttgc agtctgaata caataaaaaa attaccttta ccactgatac

111000

aattttggag aatttaaaaa atataaagga tttaatgtgc ctgaataaat aataataagg

111060

gttttgtacg atttcaacaa tgaacttttg ggccacgttt agcatttgtc tggtgggtta

111120

tttggtgtac gcgggacact tgaataacga gctacaagaa ataaaatcaa tattagtggt

111180

catgtacgaa tctatggaaa agcatttttc caatgtggta gacgaaattg attctcttaa

111240

aacggacacg tttatgatgt tgagcaactt gcaaaataac acgattcgaa cgtgggacgc

111300

agttgtaaaa aatggcaaaa aaatatccaa tctcgacgaa aaaattaacg tgttattaac

111360

aaaaaacggg gtagttaaca acgtgctaaa cgttcaataa acgcttatca ctaagttaat

111420

atactaaaaa tcacatagtc actacaatat ttcaaaatat gaagccgacg aataacgtta

111480

tgttcgacga cgcgtcggtc ctttggatcg acacggacta catttatcaa aatttaaaaa

111540

tgcctttgca ggcgtttcaa caacttttgt tcaccattcc atctaaacat agaaaaatga

111600

tcaacgatgc gggcggatcg tgtcataaca cggtcaaata catggtggac atttacggag

111660

cggccgttct ggttttgcga acgccttgct cgttcgccga ccagttgttg agcacattta

111720

ttgcaaacaa ttatttgtgc tacttttacc gtcgtcgccg atcacgatca cgctcacgat

111780

cacgctcgcg atcacgttct cctcattgca gacctcgttc gcgctctcct cattgcagac

111840

ctcgttcgcg atctcggtcc cggtctagat cgcggtcacg ttcatcgtct cccaggcgag

111900

ggcgtcgaca aatattcgac gcgctggaaa agattcgtca tcaaaacgac atgttgatga

111960

gcaacgtcaa ccaaataaat ctcaaccaaa ctaatcaatt tttagaattg tccaacatga

112020

tgacgggcgt gcgcaatcaa aacgtgcagc tcctcgcggc gttggaaacc gctaaagatg

112080

ttattttgac cagattaaac acattgcttg ccgagattac agactcgtta cccgacttga

112140

cgtccatgtt agataaatta gctgaacaat tgttggacgc catcaacacg gtgcagcaaa

112200

cgctgcgcaa cgagttgaac aacaccaact ctattttgac caatttagcg tcaagcgtca

112260

caaacatcaa cggtacgctc aacaatttgc tagccgctat cgaaaactta gtaggcggcg

112320

gcggcggtgg caattttaac gaagccgaca gacaaaaact ggacctcgtg tacactttgg

112380

ttaacgaaat caaaaatata ctcacgggaa cgctgacaaa aaaataagca tgtccgacaa

112440

aacaccaaca aaaaagggtg gcagccatgc catgacgttg cgagagcgcg gcgtaacaaa

112500

acccccaaaa aagtctgaaa agttgcagca atacaagaaa gccatcgctg ccgagcaaac

112560

gctgcgcacc acagcagatg tttcttcttt gcagaacccc ggggagagtg ccgtttttca

112620

agagttggaa agattagaga atgcagttgt agtattagaa aatgaacaaa aacgattgta

112680

tcccatatta gatacgcctc ttgataattt tattgtcgca ttcgtgaatc cgacgtatcc

112740

catggcctat tttgtcaata ccgattacaa attaaaacta gaatgtgcca gaatcagaag

112800

cgatttactt tacaaaaaca aaaacgaagt cgctatcaac aggcctaaga tatcgtcttt

112860

taaattgcaa ttgaacaacg taattttaga cactatagaa actattgaat acgatttaca

112920

aaataaagtt ctcacaatta ctgcacctgt tcaagatcaa gaactaagaa aatccattat

112980

ttattttaat attttaaata gtgacagttg ggaagtacca aagtatatga aaaaattgtt

113040

tgatgaaatg caattggaac ctcccgtcat tttaccatta ggtctttaga tttggtaagg

113100

ctagcacgtc gacatcatgt ttgcgtcgtt gacctcagag caaaagctgt tattaaaaaa

113160

atataaattt aacaattatg tgaaaacgat cgagttgagt caagcgcagt tggctcattg

113220

gcgttcaaac aaagatattc agccaaaacc tttggatcgt gcagaaattt tacgtgtcga

113280

aaaggccacc aggggacaaa gcaaaaatga gctgtggacg ctattgcgtt tggatcgcaa

113340

cacagcgtct gcatcgtcca actcgtccgg caacatgtta caacgaccag cgcttttgtt

113400

tggaaacgcg caagaaagtc acgtcaaaga aaccaacggc atcatgttag accacatgcg

113460

cgaaatcata gaaagtaaaa ttatgagcgc ggtcgttgaa acggttttgg attgcggcat

113520

gttctttagc cccttgggtt tgcacgccgc ttcgcccgat gcgtattttt ctctcgccga

113580

cggaacgtgg atcccagtgg aaataaaatg tccgtacaat taccgagaca cgaccgtgga

113640

gcagatgcgt gtcgagttgg ggaacggcaa tcgcaagtat cgcgtgaaac acaccgcgct

113700

gttggttaac aagaaaggca cgccccagtt cgaaatggtc aaaacggatg cgcattacaa

113760

gcaaatgcaa cggcagatgt atgtgatgaa cgcgcctatg ggcttttacg tggtcaaatt

113820

caaacaaaat ttggtggtgg tttctgtgcc gcgcgacgaa acgttctgca acaaagaact

113880

gtctacggaa aacaacgcgt acgtggcgtt tgccgtggaa aactccaact gcgcgcgcta

113940

ccaatgcgcc gacaagcgac ggctttcatt caaaacgcac agctgcaatc acaactatag

114000

tggtcaagaa atcgatgcta tggtcgatcg cggaatatat ttagattatg gacatttaaa

114060

atgtgcgtac tgtgatttta gctcagacag tcgggaaacg tgcgattctg ttttaaaacg

114120

cgagcacacc aactgcaaaa gttttaactt gaaacataaa aactttgaca atcctacata

114180

ctttgattat gttaaaagat tgcaaagttt gctaaagagt caccacttta gaaacgacgc

114240

taaaacactt gcctattttg gttactattt aactcataca ggaaccctga agaccttttg

114300

ctgcggatcg caaaactcgt cgcccaccaa acacgatcat ttaaacgact gtgtatatta

114360

tttggaaata aaataaacct ttatattata tataattctt ttatttatac atttgtttat

114420

acaattttat ttacgacaaa tattgactcg ttgttcagaa agtttaataa gcttgtcaat

114480

ttcttcggct tgcaaagggc tgccaacgcg ttcgttttga atgcgcgtaa tccggtttac

114540

ggtattgttg gcgcgaacaa taaactcctc aactggcaaa ttaacaattt tgtttgcgta

114600

ctcattgtgc actgcggcca ggttttgtag aatgttttcg ggaaaaatgg caattctatt

114660

aaatttgaca tgtttttgat tgtatacata gttttgatat tcttccagcg taggatattt

114720

gtttaaactc ttgacgcatt caatgtacaa tttgtgcagt gacaaaattc tgttaaaatc

114780

caaacgagaa catttctcaa aagttatttc ttgaccgttg aaatgtacac tttgcaattg

114840

tttcaataaa ctgtcgtaaa aagtttttcc ttcttcaagc acaaacgcgg ggcgcatcgt

114900

gttatctaca acgcttatgt acttgtcaaa atcttcaatt atatgataga aatacaaata

114960

tctctccgcg tttatggacg tgtcgtttaa aacatgttcg tcaacaactc cgttatgatt

115020

tactttcaaa aatttcaaat cttgcaaagc gtccgcgttg gtcaacttgt tgataataaa

115080

tttgtctttg cattcaaacg ctctgtttgc aatccactcc acagcgtcca aaacggacat

115140

gcgtttaaac atgttgatac gttttagaca atacgctcgt ttttttaccg cctcaacgtt

115200

cacgtccgtg tagtcgcacc attgcaggat ttgcaacatg tcctcggcaa aatgcgcgaa

115260

ctgccgcagc ttttcctttc caaaatgttg attgtcgtgt ttaaaaagca acgttgaaat

115320

ttccgagaca taccacaaag ccgtgggcaa ttttactttg atcagcggct ccatagccag

115380

gttgctgaac ccgatcatgc attccgtgtt gttaatgcgg taaatgacat agcgtttaaa

115440

gtagtccttt acattatcgt caatgtattc tgcgtcgttt atgtgcttgt acagcaaata

115500

gtacataagg cccgcgttaa acgcgacctt tttagcgtca aaatacgtgc acgccaacac

115560

gtaatcgttg tattcgtcga attgctcgtt gggcactatg gcgcccgtaa aagggcgtct

115620

gctgcgcggt gacaaacgcg ttccatgctg aatcaactgc ttcaaacttt ccaaattata

115680

acaatattca attgaatttt taatctcttt attttggctc cataaaagag gaaactcgag

115740

tcggctttta aacttggtca aactgccctg aattgtttca aacaagttgt aatgtgttaa

115800

caatatggcc ggcacaccgc tatcgttggc taaaatacaa tcggggaatc gaatattttc

115860

tacgttgctg taatcgtacg cttcgtcgtc gtcgttggca acaacatcgt cggtttcggc

115920

gtccacgctc gctaacttgt tctgatagtg taaatttttc attacatcaa aagcgtatga

115980

cttgttgcga ttgtgcaaat aatttatggc cgtgctaatg gtgctgtcga taattttatc

116040

aaaattgaga acatcggcgt tatacaacgt tttataaaat tctgttgact tgaacgtgtt

116100

tacaaactca tttttatttt taatctggtc aaaattcata ctagaattgt tagtttgttt

116160

gatttcgctg aatagccgct ggcggagacg cttcagcttg tccacctcgt ttaacacgtt

116220

ggcgtccgtc ggcatggaat tgataaattt gaaccgaaca aaagacagca gttcatcttt

116280

tttcgatata aaattttcgg ttgtaatgat atcgtagtta aattctttgg ttaaattgac

116340

ccattcgacc atttcatcgt tgcgataaat cttgcagtcc gagttgttga caaacgccga

116400

ggcaacggac aaatcaatct gttccgtgtt attattgatg gcataaaaca caatgcgttc

116460

gaaactaaac ggtttttcgt ttagcaaatt tttgcaaacg tttgcctcat ttttggaaat

116520

ttggccgtcg gtcaccatgt acaaaagttt caacttgccg tcgagcaagt ttatattctt

116580

gtgaatccac tttatgaatt cgctgggcct ggtgtcagta ccctcgccat tgcggcgcaa

116640

ataacgactc ttgacgtctc cgatttcttt ttggcggcaa taagcactcc aatgcaaata

116700

caaaactttg tcgcaactac tgatgttttc gatttcattc tgaaattgtt ctaaagtttg

116760

taacgcgttc ttgttaaagt aatagtccga gtttgtcgac aaggaatcgt cggtggcgta

116820

cacgtagtag ttaatcatct tgttgattga tatttaattt tggcgacgga tttttatata

116880

cacgagcgga gcggtcacgt tctgtaacat gagtgatcgt gtgtgtgtta tctctggcag

116940

cgcgatagtg gtcgcgaaaa ttacacgcgc gtcgtaacgt gaacgtttat attataaata

117000

ttcaacgttg cttgtattaa gtgagcattt gagctttacc attgcaaaat gtgtgtaatt

117060

tttccggtag aaatcgacgt gtcccagacg attattcgag attgtcaggt ggacaaacaa

117120

accagagagt tggtgtacat taacaagatt atgaacacgc aattgacaaa acccgttctc

117180

atgatgttta acatttcggg tcctatacga agcgttacgc gcaagaacaa caatttgcgc

117240

gacagaataa aatcaaaagt cgatgaacaa tttgatcaac tagaacgcga ttacagcgat

117300

caaatggatg gattccacga tagcatcaag tattttaaag atgaacacta ttcggtaagt

117360

tgccaaaatg gcagcgtgtt gaaaagcaag tttgctaaaa ttttaaagag tcatgattat

117420

accgataaaa agtctattga agcttacgag aaatactgtt tgcccaaatt ggtcgacgaa

117480

cgcaacgact actacgtggc ggtatgcgtg ttgaagccgg gatttgagaa cggcagcaac

117540

caagtgctat ctttcgagta caacccgatt ggtaacaaag ttattgtgcc gtttgctcac

117600

gaaattaacg acacgggact ttacgagtac gacgtcgtag cttacgtgga cagtgtgcag

117660

tttgatggcg aacaatttga agagtttgtg cagagtttaa tattgccgtc gtcgttcaaa

117720

aattcggaaa aggttttata ttacaacgaa gcgtcgaaaa acaaaagcat gatctacaag

117780

gctttagagt ttactacaga atcgagctgg ggcaaatccg aaaagtataa ttggaaaatt

117840

ttttgtaacg gttttattta tgataaaaaa tcaaaagtgt tgtatgttaa attgcacaat

117900

gtaactagtg cactcaacaa aaatgtaata ttaaacacaa ttaaataaat gttaaaattt

117960

attgcctaat attattttgt cattgcttgt catttattaa tttggatgat gtcatttgtt

118020

tttaaaattg aactggcttt acgagtagaa ttctacgcgt aaaacacaat caagtatgag

118080

tcataatctg atgtcatgtt ttgtacacgg ctcataaccg aactggcttt acgagtagaa

118140

ttctacttgt aatgcacgat cagtggatga tgtcatttgt ttttcaaatc gagatgatgt

118200

catgttttgc acacggctca taaactcgct ttacgagtag aattctacgt gtaacgcacg

118260

atcgattgat gagtcatttg ttttgcaata tgatatcata caatatgact catttgtttt

118320

tcaaaaccga acttgattta cgggtagaat tctacttgta aagcacaatc aaaaagatga

118380

tgtcatttgt ttttcaaaac tgaactcgct ttacgagtag aattctacgt gtaaaacaca

118440

atcaagaaat gatgtcattt gttataaaaa taaaagctga tgtcatgttt tgcacatggc

118500

tcataactaa actcgcttta cgggtagaat tctacgcgta aaacatgatt gataattaaa

118560

taattcattt gcaagctata cgttaaatca aacggacgtt atggaattgt ataatattaa

118620

atatgcaatt gatccaacaa ataaaattgt aatagagcaa gtcgacaatg tggacgcgtt

118680

tgtgcatatt ttagaaccgg gtcaagaagt gttcgacgaa acgctaagcc agtaccacca

118740

atttcctggc gtcgttagtt cgattatttt cccgcaactc gtgttaaaca caataattag

118800

cgttttgagc gaagacggca gtttgctcac gttgaaactc gaaaacactt gttttaattt

118860

tcacgtgtgc aataaacgct ttgtgtttgg caatttgcca gcggcggtcg tgaataatga

118920

aacgaagcaa aaactgcgca ttggagctcc aatttttgcc ggcaaaaagc tggtttcggt

118980

cgtgacggcg tttcatcgtg ttggcgaaaa cgaatggctg ttaccggtga cgggaattcg

119040

agaggcgtcc cagctgtcgg gacatatgaa ggtgctgaac ggcgtccgtg ttgaaaaatg

119100

gcgacccaac atgtccgtct acgggactgt gcaattgccg tacgataaaa ttaaacagca

119160

tgcgctcgag caagaaaata aaacgccaaa cgcgttggag tcttgtgtgc tattttacaa

119220

agattcagaa atacgcatca cttacaacaa gggggactat gaaattatgc atttgaggat

119280

gccgggacct ttaattcaac ccaacacaat atattatagt taaataagaa ttattatcaa

119340

atcatttgta tattaattaa aatactatac tgtaaattac attttattta caatcatgtc

119400

aaagcctaac gttttgacgc aaattttaga cgccgttacg gaaactaaca caaaggttga

119460

cagtgttcaa actcagttaa acgggctgga agaatcattc cagcttttgg acggtttgcc

119520

cgctcaattg accgatctta acactaagat ctcagaaatt caatccatat tgaccggcga

119580

cattgttccg gatcttccag actcactaaa gcctaagctg aaaagccaag cttttgaact

119640

cgattcagac gctcgtcgtg gtaaacgcag ttccaagtaa atgaatcgtt tttaaaataa

119700

caaatcaatt gttttataat attcgtacga ttctttgatt atgtaataaa atgtgatcat

119760

taggaagatt acgaaaaata taaaaaatat gagttctgtg tgtataacaa atgctgtaaa

119820

cgccacaatt gtgtttgttg caaataaacc catgattatt tgattaaaat tgttgttttc

119880

tttgttcata gacaatagtg tgttttgcct aaacgtatac tgcataaact ccatgcgagt

119940

gtatagcgag ctagtggcta acgcttgccc caccaaagta gattcgtcaa aatcctcaat

120000

ttcatcaccc tcctccaagt ttaacatttg gccgtcggaa ttaacttcta aagatgccac

120060

ataatctaat aaatgaaata gagattcaaa cgtggcgtca tcgtccgttt cgaccatttc

120120

cgaaaagaac tcgggcataa actctatgat ttctctggac gtggtgttgt cgaaactctc

120180

aaagtacgca gtcaggaacg tgcgcgacat gtcgtcggga aactcgcgcg gaaacatgtt

120240

gttgtaaccg aacgggtccc atagcgccaa aaccaaatct gccagcgtca atagaatgag

120300

cacgatgccg acaatggagc tggcttggat agcgattcga gttaacgctt tggcagtcac

120360

ggtcagcgtt ttgatggcga tcacgttgag cgagtgcact aacgcggctt tgtaagtctc

120420

tcccaacatg cgcacggtca cgcgccgagt cgtgctaagc aacatgtgtt tcatggccgg

120480

aatgagagaa gtgttaattt ttttcaacat gcttttaaac ccggacatta gcatatcaaa

120540

gccaatgtcc gtagcaatac cgaaaacgag cgcgtaatct tccaaaaacg atgttataat

120600

tgactccaag tcttggtcgc tgattgaacg gtcgagcgcc tcgaaatgtt cgacacgtgc

120660

acgttcgtta ccgcggtaat tgtatgcgat cggagtttta gtaaagccgg tttcggccgt

120720

gtacgtgatc tggacgggcg acccgttgac gatcatgccc aaatcgttta gtgttggatt

120780

tttgttaaaa agtttttcaa attccaagtc tgtggcgtta tcgcgcacgc tgcgccattg

120840

cgctagtatt gcgttggagt ccacgttggg tcgtggcggt agtatgctgg aaggcgcttt

120900

gtaatcaaaa tcgcgcagtt cgctaaaaat gttgttggcc agcattttga aagtgacaaa

120960

gatcgtgtcg cccagcacga atccgatgag cgattcccac catctaaacg aacaaccgcc

121020

gttgaatagc tctctgccga aacgtcgaca gtaggcttcg ttgaattcgc ctttaaagcg

121080

ttcgggaaac aaggggtcgg gatcgggccg aacgttaaaa gccggcacat cgtccacgcc

121140

catgatcgtg tgttcttcgg tgcgcaagta tgggctgtta aagtacattt tggacagcga

121200

gtccactaag atgcatttgt tgtcgagcgt gtatctaaac tcggcagact gaacttgggt

121260

ttcggcgcct tcacgcatgg ccgccgccct gtccaggtgg tagcacgcgg gctgcgcgta

121320

acccacgcta gtctcggagg tctgcgtgta catgaacggc gtcgtgttgg acacgacgcc

121380

ggtttcgtga aacggatagc agctcatgct ttcacacccg cgcttgctga aagccagttt

121440

gacggccagc gctttgtcgg ccaatttcgg cggcacataa taatcgtcgt cacttgacgc

121500

gggacgcagc gtgtagtcga ttagtatatg cggaaacctg gtgcgccatc tcgaaataaa

121560

ctcgagacga tgcatatgta tggcatacct actggcatta gttaaatcga cggctgttaa

121620

aaccgccatg ttatatagga cttaaaataa acaacaatat ataatgaaat atttattaga

121680

ttatattata gcaatacatt tacatttatt ataacaatac tttttattta atctgattat

121740

attataacga tacattttta tttagacatt gttatttaca atattaatta actttttata

121800

catttttaaa tcataatata taatcatttc gttgtgcatt tcaaagcttt tgatagcttc

121860

aaagtaatac atgaatttag agtattcagg aaaatgataa acgttggtaa acccgcattt

121920

ggtacaatat aacacgggat ttttataata cagtttagtt tttttacaca atttgcaata

121980

gttgttagtt gtaggtttca aaggaaacgt gattgcgccg tccaatacct gggtaaactt

122040

tttgacttta acagtggcaa acacggttcc tttgataccc gaaaatcggt tgtcttgcag

122100

agcggccatc atttcgcttg gctcttgaag tataaaacag ttgacgtcat ccaccacgtc

122160

gggtctggtg cacatgcttc ggtagcgctg caacactata ttggtgtatg tttccctgag

122220

aacgagaccg ccggtggtgc taagatcgat tgtttgaatg cgctcgttgg gctctttgtg

122280

atttcgaatt atgcgccgaa ttatttcaaa cactttgcag ttgtgatcgt caattctcaa

122340

ttctttaact tccgtcgtgt gctctaaact tacagggaaa atgtattggt aaaaaaacct

122400

ctctctggct aaatagctga ggtcgaccaa attgatagaa ggatatattt cgtacgaggt

122460

ttttggaacg ttgtgatata gatagcattt ttgacagcag atgtctatgc ggtcaggatc

122520

gtccaacggc ttttcgatgt gaaccacaac atacaaaaac cattcgcgcg tgttgtcttt

122580

gaatctataa ttgcaagtgg tgcatcgcga atcgctcatg tgctccatag tcttcttgta

122640

tttcacaggc ctgcttgcaa atttgcccgt catgcgcata tctttgctgt ttatgtagcc

122700

cataatgtaa ttggtggaaa attttagcgt ggctttcatg atgtcgcgtt ctaaatcgct

122760

catgaaatgc atacgtagat cgcgctcttg tttgaaatcc agtttgtcgc tgtacgcggg

122820

caaaccttca aacttgttcc caaactcggg cggcacaaaa tatccatctt ttctgttgac

122880

gactggtttt ttacttacaa tgctgctgtg ctccaacggc ttggccggag aggtgcgcgt

122940

aggctgttta ggcggagaga tgcgcgtagg tggtttgatg ttagattttg gcggcggacg

123000

aacaggcgac ggcggcgagt tggcggcagg cgctggcaaa gatttggcac gacccttgcc

123060

cccggtcctt ggcgcgtcaa aaatgttatt ctctcgaaaa aaacggttca ttgtaactgt

123120

tagttagcac tcagaaatca acacgatact gtgcacgttc agccatcgag aggctttata

123180

tatggaaacc ttatctatag agataagatt gtatatgcgt aggagagcct ggtcacgtag

123240

gcactttgcg cacggcacta gggctgtgga ggggacaggc tatataaagc ccgtttgccc

123300

aactcgtaaa tcagtatcaa ttgtgctccg gcgcacacgc tcgcttgcgc gccggatagt

123360

ataagtaatt gataacgggc aacgcaacat gataagaacc agcagtcacg tgctgaacgt

123420

ccaggaaaat ataatgacgt caaactgtgc gtcatcgcca tattcgtgcg aggcaacgtc

123480

cgcttgcgca gaagctcaac aggtaatgat cgataacttt gttttctttc acatgtacaa

123540

cgccgacata caaattgacg caaagctgca atgcggcgtg cgctcggccg cgtttgcaat

123600

gatcgacgat aaacatttgg aaatgtacaa gcatagaata gagaataaat ttttttatta

123660

ctatgatcaa tgtgccgaca ttgccaaacc cgaccgtctg cccgatgacg acggcgcgtg

123720

ctgtcaccat tttatttttg atgcccaacg tattattcaa tgtattaaag agattgaaag

123780

cgcgtacggc gtgcgtgatc gcggcaatgt aatagtgttt tatccgtact tgaaacagtt

123840

gcgagacgcg ttgaagctaa ttaaaaactc ttttgcgtgt tgttttaaaa ttataaattc

123900

tatgcaaatg tacgtgaacg agttaatatc aaattgcctg ttgtttattg aaaagctgga

123960

aactattaat aaaactgtta aagttatgaa tttgtttgta gacaatttgg ttttgtacga

124020

atgcaatgtt tgtaaagaaa tatctacgga tgaaagattt ttaaagccaa aagaatgttg

124080

cgaatacgct atatgcaacg cgtgctgcgt taacatgtgg aagacggcca ccacgcacgc

124140

aaaatgtcca gcgtgcagga catcgtataa ataagcacgc aacgcaaaat gagtggtggc

124200

ggcaacttgt tgactctgga aagagatcat tttaaatatt tatttttgac cagctatttt

124260

gatttaaaag ataatgaaca tgttccttca gagcctatgg catttattcg caattacttg

124320

aattgcacgt ttgatttgct agacgatgcc gtgctcatga actatttcaa ttacttgcaa

124380

agcatgcaat tgaaacattt ggtgggcagc acgtcgacaa acattttcaa gtttgtaaag

124440

ccacaattta gatttgtgtg cgatcgcaca actgtggaca ttttagaatt tgacacgcgc

124500

atgtacataa aacccggcac gcccgtgtac gccacgaacc tgttcacgtc caatccccgc

124560

aagatgatgg ctttcctgta cgctgaattt ggcaaggtgt ttaaaaataa aatattcgta

124620

aacatcaaca actacggctg cgtgttggcg ggcagtgccg gtttcttgtt cgacgatgcg

124680

tacgtggatt ggaatggtgt gcgaatgtgt gcggcgccgc gattagataa caacatgcat

124740

ccgttccgac tgtatctact gggcgaggac atggctaagc actttgtcga taataatata

124800

ctaccgccgc acccttctaa cgcaaagact cgcaaaatca acaattcaat gtttatgctg

124860

aaaaactttt acaaaggtct gccgctgttc aaatcaaagt acacggtggt gaacagcact

124920

aaaatcgtga cccgaaaacc caacgatata tttaatgaga tagataaaga attaaatggc

124980

aactgtccgt ttatcaagtt tattcagcgc gactacatat tcgacgccca gtttccgcca

125040

gatttgcttg atttgctaaa cgaatacatg accaaaagct cgatcatgaa aataattacc

125100

aagtttgtga ttgaagaaaa ccccgctatg agcggtgaaa tgtctcgcga gattattctt

125160

gatcgctact cagtagacaa ttatcgcaag ctgtacataa aaatggaaat aaccaaccag

125220

tttcctgtca tgtacgatca tgaatcgtcg tacatttttg tgagcaaaga ctttttgcaa

125280

ttgaaaggca ctatgaacgc gttctacgcg cccaagcagc gtatattaag tattttggcg

125340

gtgaatcgtt tgtttggcgc cacggaaacg atcgactttc atcccaacct gctcgtgtac

125400

cggcagagtt cgccgccggt ccgtttgacg ggcgacgtgt atgttgttga taagaacgaa

125460

aaagtttttt tggtcaaaca cgtgttctca aacacggtgc ctgcatatct tttaataaga

125520

ggtgattacg aaagttcgtc tgacttgaaa tcccttcgcg atttgaatcc gtgggttcag

125580

aacacgcttc tcaaattatt aatccccgac tcggtacaat aatatgattt acactgatcc

125640

cactactggc gctacgacta gcacagacgc gccgtccaca aactatttaa acaggctaac

125700

tccaaacatg ttcttgacca tcttggctgt agtagtaatt attgctttaa taattatatt

125760

tgttcaatct agcagtaatg gaaacagctc ggggggtaat gtacctccaa acgccctggg

125820

gggttttgta aatcctttaa acgctaccat gcgagctaat ccctttatga acacgcctca

125880

aaggcaaatg ttgtagataa gtgtataaaa aatgaaacgt atcaaatgca acaaagttcg

125940

aacggtcacc gagattgtaa acagcgatga aaaaatccaa aagacctacg aattggctga

126000

atttgattta aaaaatctaa gcagtttaga aagctatgaa actctaaaaa ttaaattggc

126060

gctcagcaaa tacatggcta tgctcagcac cctggaaatg actcaaccgc tgttggaaat

126120

atttagaaac aaagcagaca ctcggcagat tgccgccgtg gtgtttagca cattagcttt

126180

tatacacaat agattccatc cccttgttac taattttact aacaaaatgg agtttgtggt

126240

cactgaaacc aacgacacaa gcattcccgg agaacccatt ttgtttacgg aaaacgaagg

126300

tgtgctgctg tgttccgtgg acagaccgtc tatcgttaaa atgctaagcc gcgagtttga

126360

caccgaggct ttagtaaact ttgaaaacga caactgcaac gtgcggatag ccaagacgtt

126420

tggcgcctct aagcgcaaaa acacgactcg cagcgatgat tacgagtcaa ataaacaacc

126480

caattacgat atggatttga gcgattttag cataactgag gttgaagcca ctcaatattt

126540

aactctgttg ctgaccgtcg aacatgccta tttacattat tatattttta aaaattacgg

126600

ggtgtttgaa tattgcaaat cgctaacgga ccattcgctt tttaccaaca aattgcgatc

126660

gacaatgagc acaaaaacgt ctaatttact gttaagcaaa ttcaaattta ccattgaaga

126720

ttttgacaaa ataaactcaa attctgtaac atcagggttt aatatatata attttaataa

126780

ataattaaat aatatacaat gtttttatta attatatttt taatattaat taaagtatta

126840

atatttaaaa aaatgaatca aattcatcta aagtgtcaca gcgataaaat ttgtcctaaa

126900

gggtattttg gcctcaacgc cgatccctat gattgcacgg cgtattatct gtgtccgcat

126960

aaagtgcaaa tgttttgcga attaaatcac gaatttgact tggactccgc cagctgcaag

127020

cctatcgtgt acgatcacac gggcagcggg tgtacggctc gcatgtatag aaacttgtta

127080

ctatgaagag cgggtttcca gttgcacaac actattatcg atttgcagtt cgggacataa

127140

atgtttaaat atatcgatgt ctttgtgatg cgcgcgacat ttttgtaggt tattgataaa

127200

atgaacggat acgttgcccg acattatcat taaatccttg gcgtagaatt tgtcgggtcc

127260

attgtccgtg tgcgctagca tgcccgtaac ggacctcgta cttttggctt caaaggtttt

127320

gcgcacagac aaaatgtgcc acacttgcag ctctgcatgt gtgcgcgtta ccacaaatcc

127380

caacggcgca gtgtacttgt tgtatgcaaa taaatctcga taaaggcgcg gcgcgcgaat

127440

gcagctgatc acgtacgctc ctcgtgttcc gttcaaggac ggtgttatcg acctcagatt

127500

aatgtttatc ggccgactgt tttcgtatcc gctcaccaaa cgcgtttttg cattaacatt

127560

gtatgtcggc ggatgttcta tatctaattt gaataaataa acgataaccg cgttggtttt

127620

agagggcata ataaaagaaa tattgttatc gtgttcgcca ttagggcagt ataaattgac

127680

gttcatgttg gatattgttt cagttgcaag ttgacactgg cggcgacaag atcgtgaaca

127740

accaagtgac tatgacgcaa attaatttta acgcgtcgta caccagcgct tcgacgccgt

127800

cccgagcgtc gttcgacaac agctattcag agttttgtga taaacaaccc aacgactatt

127860

taagttatta taaccatccc accccggatg gagccgacac ggtgatatct gacagcgaga

127920

ctgcggcagc ttcaaacttt ttggcaagcg tcaactcgtt aactgataat gatttagtgg

127980

aatgtttgct caagaccact gataatctcg aagaagcagt tagttctgct tattattcgg

128040

aatcccttga gcagcctgtt gtggagcaac catcgcccag ttctgcttat catgcggaat

128100

cttttgagca ttctgctggt gtgaaccaac catcggcaac tggaactaaa cggaagctgg

128160

acgaatactt ggacaattca caaggtgtgg tgggccagtt taacaaaatt aaattgaggc

128220

ctaaatacaa gaaaagcaca attcaaagct gtgcaaccct tgaacagaca attaatcaca

128280

acacgaacat ttgcacggtc gcttcaactc aagaaattac gcattatttt actaatgatt

128340

ttgcgccgta tttaatgcgt ttcgacgaca acgactacaa ttccaacagg ttctccgacc

128400

atatgtccga aactggttat tacatgtttg tggttaaaaa aagtgaagtg aagccgtttg

128460

aaattatatt tgccaagtac gtgagcaatg tggtttacga atatacaaac aattattaca

128520

tggtagataa tcgcgtgttt gtggtaactt ttgataaaat taggtttatg atttcgtaca

128580

atttggttaa agaaaccggc atagaaattc ctcattctca agatgtgtgc aacgacgaga

128640

cggctgcaca aaattgtaaa aaatgccatt tcgtcgatgt gcaccacacg tttaaagctg

128700

ctctgacttc atattttaat ttagatatgt attacgcgca aaccacattt gtgactttgt

128760

tacaatcgtt gggcgaaaga aaatgtgggt ttcttttgag caagttgtac gaaatgtatc

128820

aagataaaaa tttatttact ttgcctatta tgcttagtcg taaagagagt aatgaaattg

128880

agactgcatc taataatttc tttgtatcgc cgtatgtgag tcaaatatta aagtattcgg

128940

aaagtgtgca gtttcccgac aatcccccaa acaaatatgt ggtggacaat ttaaatttaa

129000

ttgttaacaa aaaaagtacg ctcacgtaca aatacagcag cgtcgctaat cttttgttta

129060

ataattataa atatcatgac aatattgcga gtaataataa cgcagaaaat ttaaaaaagg

129120

ttaagaagga ggacggcagc atgcacattg tcgaacagta tttgactcag aatgtagata

129180

atgtaaaggg tcacaatttt atagtattgt ctttcaaaaa cgaggagcga ttgactatag

129240

ctaagaaaaa caaagagttt tattggattt ctggcgaaat taaagatgta gacgttagtc

129300

aagtaattca aaaatataat agatttaagc atcacatgtt tgtaatcggt aaagtgaacc

129360

gaagagagag cactacattg cacaataatt tgttaaaatt gttagcttta atattacagg

129420

gtctggttcc gttgtccgac gctataacgt ttgcggaaca aaaactaaat tgtaaatata

129480

aaaaattcga atttaattaa ttatacatat attttgaatt taattaatta tacatatatt

129540

ttatattatt tttgtctttt attatcgagg ggccgttgtt ggtgtggggt tttgcataga

129600

aataacaatg ggagttggcg acgttgctgc gccaacacca cctcctcctc ctcctttcat

129660

catgtatctg tagataaaat aaaatattaa acctaaaaac aagaccgcgc ctatcaacaa

129720

aatgataggc attaacttgc cgctgacgct gtcactaacg ttggacgatt tgccgactaa

129780

accttcatcg cccagtaacc aatctagacc caagtcgcca actaaatcac caaacgagta

129840

aggttcgatg cacatgagtg tttggcccgc aggaagatcg ctaatatcta cgtattgagg

129900

cgaatctggg tcggcggacg gatcgctgcc gcgacaaact gttttttcta cttcatagtt

129960

gaatccttgg cacatgttgg ttagttcggg cggattgtta ggcaacaagg ggtcgaatgg

130020

gcaaatggta acatccgact gatttagatt ggggtcttga cgacaagtgc gctgcaataa

130080

caagcaggcc tcggcgattt ctccggcgtc tttaccttgc acataataac ttccgccggt

130140

gttattgatg gcgttgatta tatcttgtac tagtgtggcg gcgctaaaca agaaatagcc

130200

gccggtggcc aagagtatgc ccgttcctcc tacttttaag ctttgcatgt aactatgtag

130260

acgggggttt tgctgcagtg cgttttgaac accttcgggc gtgcgcacgt tggtttccgg

130320

gaagttttgt ttgactgcat tggatcgcgt ctgcttggtg tggtaattaa agtctggcac

130380

gttgtccacg cgccgcaatt ggctcaatga gtttatttga gggtctgaaa tgccctgaaa

130440

tactccgcgt atgttgggga catcattgtt acgagtaatt ctgtttatgt ctgaagtgct

130500

cacaaactgg ttgttagata gttgatagcc cggctgaaat ctgttgtttc caatgttgcg

130560

tacactgggc gcgttgagca catttgtgaa accggcggga gtgcttgtta aaagacgcgt

130620

attatcagta ataaaactgg cctgattagg atacaattta ttgactgcgc gaagatttga

130680

aaaaaaactc attttaaagc aaacttattt aataaatata tcacagtaaa ggttttgcaa

130740

aactgccgtc gtcaatacaa cacggcagcg gcgtcatgtt ggtaaaatct aatcttctcc

130800

ttgctttaga ttctgggcga gaaggcgcat ttgttgtgta agttatttcg acgtctgcat

130860

tatttgttgt gtaaggtatc tcgacgtatg aagcaacttt aacattgtta taattttttt

130920

taaatattga tgcgctccac ggcgcgcgtt gatacggatg atatctctcc attgtatgat

130980

cgctaaattt atataccgtt tcaataaata tgttaaaacc caacatgtta attataatat

131040

tcataatagt ttgtttgttt tcaataatta tttttactgt tttgaaatct aaaagaggtg

131100

acgatgacga atcagacgac gggttcagtt gctataacaa accaattgga gtaaattttc

131160

cgcatcctac tagatgtgac gctttctaca tgtgtgtcgg tttaaatcaa aaattagagt

131220

taatctgccc tgaaggattt gaatttgatc cagatgttaa aaattgtgtt cctatatcag

131280

attatggatg taccgctaac caaaactaaa aataaaataa aatttatata gattaatgaa

131340

ataaaattta tatagattaa taaaataaaa tttatttaat atattatact atttatatta

131400

tttacaacac ttaacgtcta gacataacag tttgtaactt agaaactaaa tcagagttac

131460

tgcgctcaaa ctctgaaaat ttggcttgag actcggccac ctgcttacgc aattgttctt

131520

gcagattatt cacagtcgat tgcaactctt ctgatttctt ggtagattct tgcaagtcat

131580

agtttgcctt ttgtaaatct aattcggcga cagcatgctt gtgtttaagc ataatgtagt

131640

cgctgtttaa catggtcatt ttatgttcaa cttggctggt cttggctcgc agctcggaca

131700

gttctttttg caattgctcc acatagttca agtccgtggt gtgattgttg accgtgttat

131760

tttctaaaag ctcgcgccaa tgctgtttga tggaatcctg gttacgagtg acgttaatgg

131820

gcataaattc tacatacccg tgcttattgt acacgcgaca atctgatgaa gtagcgctgc

131880

aaaaacattt gtacacagaa ttgtccataa ttatcttgac ataacacttg aaacacacag

131940

catggttaca atgaatcgaa gtcacaaacg aggaatttac gtttttagtg tctttaaaag

132000

tagtaaaaca aatattacac gaaacctcta cttcttcttc gggttctgat tgctgctgct

132060

gctgctgctg cggctgcgga gactgcggcg aggcaaacaa atctggcgac tgtggtatta

132120

cgtaattcgg cgaataagat ggactataag tgggagacct tggggcaatc tcattcatca

132180

gctgagcctc aagatctaaa cctcgttgca gagccctctg cgcagctgtc tccgacgcaa

132240

tgttatcctg gtactgctgg gcagtgatgt cgggaaaccg ttcacgatcc acattttcac

132300

tattaattag tatgacgtca tcctcttgac ttaatagcgg atcgtcattg ctaatgttaa

132360

cctgaccgtg cacgtaatac gtgacaccct gacgatggta ggtgcgcgtc aacggctcgt

132420

tgacgttccc gataatctgc acgttttctt cgctgacacg ctgctcctga cgccgctcct

132480

gacggcgatg gctgcgactg cttgaagacg gctggctgcg actgcttgaa gacggctggg

132540

cttcgggaga tgttgtaaag ttgatgcggc gacggctgag agacagcctg tggcggcggc

132600

tgctgctggg agtggcggcg ttgatttggc gactcatggc tgggctggta ggatactgtt

132660

cactaggctg tgaggcttga actgtgctta cgagtagaac ggcagctgta tttatactgt

132720

ttatcagtac tgcacgactg ataagacaat agtggtgggg gaacttgcca ggcaaaaatg

132780

aacttttttg taatgcaaaa aagttgatag tgtagtagta tattgggagc gtatcgtaca

132840

gtgtagacta ttctaataaa atagtctacg atttgtagag attgtactgt atatggagtg

132900

tcaggcaaaa gtgaactttt ttgcattgca aaaaaattca ttttaaattt atcatatcac

132960

aggctgcagt ttctgttatc tgtcccccac tcaggcgtgc agctataaaa gcaggcactc

133020

accaactcgt aagcacagtt cgttgtgaag tgaacacgga gagcctgcca ataagcaaaa

133080

tgccaaggga caccaacaat cgccaccggt ctacgccata tgaacgtcct acgcttgaag

133140

atctccgcag acagttgcaa gacaatttgg acagcataaa cccccgagac agaatgcaag

133200

aagaacaaga agaaaacctg cgctatcaag tgcgtagaag gcagcgtcaa aaccagctcc

133260

gctccataca aatggaacag cagcgaatga tggcggaatt aaacaacgag ccggtgatta

133320

attttaaatt tgagtgtagt gtgtgtttag aaacatattc ccaacaatct aacgatactt

133380

gtcctttttt gattccgact acgtgcgacc acggtttttg tttcaaatgc gtcatcaatc

133440

tgcaaagcaa cgcgatgaat attccgcatt ccactgtgtg ctgtccattg tgcaataccc

133500

aggtaaaaat gtggcgttcc ttaaagccta acgctgttgt gacgtgtaag ttttacaaga

133560

aaactcaaga aagagttccg cccgtgcagc agtataaaaa cattattaaa gtgctacaag

133620

aacggagcgt gattagtgtc gaagacaacg acaataattg tgacataaat atggagaatc

133680

aggcaaagat agctgctttg gaagctgaat tggaagaaga aaaaaatcac agtgatcaag

133740

tagcttctga aaaccgacag ctgatagaag aaaatactcg tctcaatgaa cagattcaag

133800

agttgcagca tcaggtgagg acattggtgc cgcaacgtgg cattacggtt aatcagcaaa

133860

ttggccgtga cgacagtgcg ccagccgagc tgaacgagcg ttttcgctca cttgtctatt

133920

cgactatttc agagctgttt attgaaaatc gcgttcatag tattcaaaat tatgtttatg

133980

ccggaacttc tgctgctagt tcatgtgatg taaatgttac tgttaatttt gggtttgaaa

134040

attaatgtga tatgaaatgt atatataaaa atgatggaat aaataataaa catttttata

134100

ctttttatgt tttttttatt tcatgtgatt aagaaacttt taagatggat agtagtaatt

134160

gtattaaaat agatgtaaaa tacgatatgc cgttacatta tcaatgtgac aataacgcag

134220

ataaagacgt tgtaaatgcg tatgacacta tcgatgttga ccccaacaaa agatttataa

134280

ttaatcataa tcacgaacaa caacaagtca atgaaacaaa taaacaagtt gtcgataaaa

134340

cattcataaa tgacacagca acatacaatt cttgcataat aaaaatttaa atgacatcat

134400

atttgagaat aacaaatgac attatccctc gattgtgttt tacaagta 134448

<210>3

<211>296

<212>PRT

<213>Porcine circovirus

<400>3

Val Arg Arg Glu Ser Pro Lys His Arg Trp Cys Phe Thr Ile Asn Asn

1 5 10 15

Trp Thr Pro Thr Glu Trp Glu Ser Ile Val Glu Cys Gly Gly Ser Ile

20 25 30

Ala Arg Tyr Leu Ile Ile Gly Lys Glu Val Gly Lys Gly Gly Thr Pro

35 40 45

His Leu Gln Gly Tyr Val Asn Phe Lys Asn Lys Arg Arg Leu Ser Ser

50 55 60

Val Lys Arg Leu Pro Gly Phe Gly Arg Ala His Leu Glu Pro Ala Arg

65 70 75 80

Gly Ser His Lys Glu Ala Ser Glu Tyr Cys Lys Lys Glu Gly Asp Tyr

85 90 95

Leu Glu Ile Gly Glu Asp Ser Ser Ser Gly Thr Arg Ser Asp Leu Gln

100 105 110

Ala Ala Ala Arg Ile Leu Thr Glu Thr Ser Gly Asn Leu Thr Glu Val

115 120 125

Ala Glu Lys Met Pro Ala Val Phe Ile Arg Tyr Gly Arg Gly Leu Arg

130 135 140

Asp Phe Cys Gly Val Met Gly Leu Gly Lys Pro Arg Asp Phe Lys Thr

145 150 155 160

Glu Val Tyr Val Phe Ile Gly Pro Pro Gly Cys Gly Lys Thr Arg Glu

165 170 175

Ala Cys Ala Asp Ala Ala Ala Arg Glu Leu Gln Leu Tyr Phe Lys Pro

180 185 190

Arg Gly Pro Trp Trp Asp Gly Tyr Asn Gly Glu Gly Ala Val Ile Leu

195 200 205

Asp Asp Phe Tyr Gly Trp Val Pro Phe Asp Glu Leu Leu Arg Ile Gly

210 215 220

Asp Arg Tyr Pro Leu Arg Val Pro Val Lys Gly Gly Phe Val Asn Phe

225 230 235 240

Val Ala Lys Val Leu Tyr Ile Thr Ser Asn Val Val Pro Glu Glu Trp

245 250 255

Tyr Ser Ser Glu Asn Ile Arg Gly Lys Leu Glu Ala Leu Phe Arg Arg

260 265 270

Phe Thr Lys Val Val Cys Trp Gly Glu Gly Gly Ile Lys Lys Asp Met

275 280 285

Glu Thr Val Tyr Pro Ile Asn Tyr

290 295

<210>4

<211>214

<212>PRT

<213>Porcine circovirus

<400>4

Met Arg His Arg Ala Ile Phe Arg Arg Lys Pro Arg Pro Arg Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg His Arg Arg Arg Tyr Val Arg Arg Lys Leu Phe Ile Arg Arg

20 25 30

Pro Thr Ala Gly Thr Tyr Tyr Thr Lys Lys Tyr Ser Thr Met Asn Val

35 40 45

Ile Ser Val Gly Thr Pro Gln Asn Asn Lys Pro Trp His Ala Asn His

50 55 60

Phe Ile Thr Arg Leu Asn Glu Trp Glu Thr Ala Ile Ser Phe Glu Tyr

65 70 75 80

Tyr Lys Ile Leu Lys Met Lys Val Thr Leu Ser Pro Val Ile Ser Pro

85 90 95

Ala Gln Gln Thr Lys Thr Met Phe Gly His Thr Ala Ile Asp Leu Asp

100 105 110

Gly Ala Trp Thr Thr Asn Thr Trp Leu Gln Asp Asp Pro Tyr Ala Glu

115 120 125

Ser Ser Thr Arg Lys Val Met Thr Ser Lys Lys Lys His Ser Arg Tyr

130 135 140

Phe Thr Pro Lys Pro Ile Leu Ala Gly Thr Thr Ser Ala His Pro Gly

145 150 155 160

Gln Ser Leu Phe Phe Phe Ser Arg Pro Thr Pro Trp Leu Asn Thr Tyr

165 170 175

Asp Pro Thr Val Gln Trp Gly Ala Leu Leu Trp Ser Ile Tyr Val Pro

180 185 190

Glu Lys Thr Gly Met Thr Asp Phe Tyr Gly Thr Lys Glu Val Trp Ile

195 200 205

Arg Tyr Lys Ser Val Leu

210

<210>5

<211>2000

<212>DNA

<213>Porcine circovirus

<400>5

tagtattacc cggcacctcg gaacccggat ccacggaggt ctgtagggag aaaaagtggt 60

atcccattat ggatgctccg caccgtgtga gtggatatac cgggcagtgg atgatgaagc

120

ggcctcgtgt tttgatgccg caggacgggg actggataac tgagtttttg tggtgctacg

180

agtgtcctga agataaggac ttttattgtc atcctattct aggtccggag ggaaagcccg

240

aaacacaggt ggtgttttac gataaacaac tggaccccga ccgagtggga atctattgtg

300

gagtgtggag gcagtatagc gagatacctt attatcggca aagaggttgg aaaaggcggt

360

accccacact tgcaagggta cgtgaatttc aagaacaaaa ggcgactcag ctcggtgaag

420

cgcttacccg gatttggtcg ggcccatctg gagccggcga gggggagcca caaagaggcc

480

agcgagtatt gcaagaaaga gggggattac ctcgagattg gcgaagattc ctcttcgggt

540

accagatcgg atcttcaagc agcagctcgg attctgacgg agacgtcggg aaatctgact

600

gaagttgcgg agaagatgcc tgcagtattt atacgctatg ggcggggttt gcgtgatttt

660

tgcggggtga tggggttggg taaaccgcgt gattttaaaa ctgaagttta tgtttttatt

720

ggtcctccag gatgcgggaa aacgcgggaa gcttgtgcgg atgcggctgc gcgggaattg

780

cagttgtatt tcaagccacg ggggccttgg tgggatggtt ataatgggga gggtgctgtt

840

attctggatg atttttatgg gtgggttcca tttgatgaat tgctgagaat tggggacagg

900

taccctctga gggttcctgt taagggtggg tttgttaatt ttgtggctaa ggtattatat

960

attactagta atgttgtacc ggaggagtgg tattcctcgg agaatattcg tggaaagttg

1020

gaggccttgt ttaggaggtt cactaaggtt gtttgttggg gggagggggg gataaagaaa

1080

gacatggaga cagtgtatcc aataaactat tgattttatt tgcacttgtg tacaattatt

1140

gcgttggggt gggggtattt attgggtggg tgggtgggca gccccctagc cacggcttgt

1200

cgcccccacc gaagcatgtg ggggatgggg tccccacatg cgagggcgtt tacctgtgcc

1260

cgcacccgaa gcgcagcggg agcgcgcgcg aggggacacg gcttgtcgcc accggagggg

1320

tcagatttat atttattatc acttagagaa cggacttgta acgaatccaa acttctttgg

1380

tgccgtagaa gtctgtcatt ccagtttttt ccgggacata aatgctccaa agcagtgctc

1440

cccattgaac ggtggggtca tatgtgttga gccatggggt gggtctggag aaaaagaaga

1500

ggctttgtcc tgggtgagcg ctggtagttc ccgccagaat tggtttgggg gtgaagtaac

1560

ggctgtgttt ttttttagaa gtcataactt tacgagtgga actttccgca taagggtcgt

1620

cttggagcca agtgtttgtg gtccaggcgc cgtctagatc tatggctgtg tgcccgaaca

1680

tagtttttgt ttgctgagct ggagaaatta cagggctgag tgtaactttc atctttagta

1740

tcttataata ttcaaagcta attgcagttt cccattcgtt taggcgggta atgaagtggt

1800

tggcgtgcca gggcttatta ttctgagggg ttccaacgga aatgacgttc atggtggagt

1860

atttctttgt gtagtatgtg ccagctgtgg gcctcctaat gaatagtttt cttctgacat

1920

agcgccttct gtggcgtcgt cgtctccttg ggcggggttt tcttctgaat atagctctgt

1980

gtctcatttt ggtgccgggc 2000

<210>6

<211>645

<212>DNA

<213>Porcine circovirus

<400>6

atgcgccacc gtgctatctt caggcgtagg cctaggccca gaaggaggag gagacaccgc 60

cgtcgttacg ctagacgccg tctgttcatc aggagaccaa ccgccggtac ttactacacc

120

aagaagtact ccactatgaa cgtgatcagc gtcggcaccc cacagaacaa caagccttgg

180

cacgctaacc acttcatcac tcgcctgaac gagtgggaaa ctgccatcac cttcgagtac

240

tacaagatcc tgaagatgaa ggtgaccctg tcccctgtca tcagccccgc tcagcagacc

300

aagactatgt tcggccacac tgctatcgac ctggacggag cctggaccac taacacctgg

360

ctgcaggacg acccctacgc cgaatccagc actaggaagg tcatgaccca gccattctct

420

cactcaagat acttcactcc aaagcctctg ctggctggaa ccacttccgc ccaccctgga

480

cagtctctgt tcttcttctc ccgccccacc ccatggctga acacttacga ccctaccgtg

540

cagtggggtg ccctgctgtg gtctatctac gtccccgaga agactggtat gaccgacttc

600

tacggcacca aggaagtgtg gatcaggtac aagtcagtcc tgtga 645

<210>7

<211>735

<212>DNA

<213>Porcine circovirus

<400>7

atgcgccacc gtgctatctt ccgccgtagg ccaaggccta gacgccgtag gagacaccgc 60

cgtcgttacg ctagacgccg tctgttcatc aggagaccta ccgccggaac ttactacacc

120

aagaagtact ctactatgaa cgtgatctca gtcggtaccc ctcagaacaa caagccatgg

180

cacgctaacc acttcatcac tcgcctgaac gagtgggaaa ctgccatcac cttcgagtac

240

tacaagatcc tgaagatgaa ggtgaccctg tctccagtca tctcacctgc tcagcagacc

300

aagactatgt tcggtcacac tgctatcgac ctggacggcg cctggaccac taacacctgg

360

ctgcaggacg acccctacgc cgaatccagc actaggaagg tcatgacctc caagaagaag

420

cactcaagat acttcactcc caagccactg ctggctggca ccacttctgc ccacccagga

480

cagtccctgt tcttcttctc ccgccctacc ccctggctga acacttacga ccctactgtg

540

cagtggggcg ccctgctgtg gtccatctac gtccctgaga agactggaat gaccgacttc

600

tacggtacca aggaagtctg gatcaggtac aagagcgtgc tggtcaagat caacatcaac

660

ctgactcctc ccgtggctac ttctcgtgtg ccaagcagag ctctgccact gaggttcggt

720

tgcggccacc gttga 735

<210>8

<211>214

<212>PRT

<213>Porcine circovirus

<400>8

Met Arg His Arg Ala Ile Phe Arg Arg Arg Pro Arg Pro Arg Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg His Arg Arg Arg Tyr Ala Arg Arg Arg Leu Phe Ile Arg Arg

20 25 30

Pro Thr Ala Gly Thr Tyr Tyr Thr Lys Lys Tyr Ser Thr Met Asn Val

35 40 45

Ile Ser Val Gly Thr Pro Gln Asn Asn Lys Pro Trp His Ala Asn His

50 55 60

Phe Ile Thr Arg Leu Asn Glu Trp Glu Thr Ala Ile Thr Phe Glu Tyr

65 70 75 80

Tyr Lys Ile Leu Lys Met Lys Val Thr Leu Ser Pro Val Ile Ser Pro

85 90 95

Ala Gln Gln Thr Lys Thr Met Phe Gly His Thr Ala Ile Asp Leu Asp

100 105 110

Gly Ala Trp Thr Thr Asn Thr Trp Leu Gln Asp Asp Pro Tyr Ala Glu

115 120 125

Ser Ser Thr Arg Lys Val Met Thr Gln Pro Phe Ser His Ser Arg Tyr

130 135 140

Phe Thr Pro Lys Pro Leu Leu Ala Gly Thr Thr Ser Ala His Pro Gly

145 150 155 160

Gln Ser Leu Phe Phe Phe Ser Arg Pro Thr Pro Trp Leu Asn Thr Tyr

165 170 175

Asp Pro Thr Val Gln Trp Gly Ala Leu Leu Trp Ser Ile Tyr Val Pro

180 185 190

Glu Lys Thr Gly Met Thr Asp Phe Tyr Gly Thr Lys Glu Val Trp Ile

195 200 205

Arg Tyr Lys Ser Val Leu

210

<210>9

<211>244

<212>PRT

<213>Porcine circovirus

<400>9

Met Arg His Arg Ala Ile Phe Arg Arg Arg Pro Arg Pro Arg Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg His Arg Arg Arg Tyr Ala Arg Arg Arg Leu Phe Ile Arg Arg

20 25 30

Pro Thr Ala Gly Thr Tyr Tyr Thr Lys Lys Tyr Ser Thr Met Asn Val

35 40 45

Ile Ser Val Gly Thr Pro Gln Asn Asn Lys Pro Trp His Ala Asn His

50 55 60

Phe Ile Thr Arg Leu Asn Glu Trp Glu Thr Ala Ile Thr Phe Glu Tyr

65 70 75 80

Tyr Lys Ile Leu Lys Met Lys Val Thr Leu Ser Pro Val Ile Ser Pro

85 90 95

Ala Gln Gln Thr Lys Thr Met Phe Gly His Thr Ala Ile Asp Leu Asp

100 105 110

Gly Ala Trp Thr Thr Asn Thr Trp Leu Gln Asp Asp Pro Tyr Ala Glu

115 120 125

Ser Ser Thr Arg Lys Val Met Thr Ser Lys Lys Lys His Ser Arg Tyr

130 135 140

Phe Thr Pro Lys Pro Leu Leu Ala Gly Thr Thr Ser Ala His Pro Gly

145 150 155 160

Gln Ser Leu Phe Phe Phe Ser Arg Pro Thr Pro Trp Leu Asn Thr Tyr

165 170 175

Asp Pro Thr Val Gln Trp Gly Ala Leu Leu Trp Ser Ile Tyr Val Pro

180 185 190

Glu Lys Thr Gly Met Thr Asp Phe Tyr Gly Thr Lys Glu Val Trp Ile

195 200 205

Arg Tyr Lys Ser Val Leu Val Lys Ile Asn Ile Asn Leu Thr Pro Pro

210 215 220

Val Ala Thr Ser Arg Val Pro Ser Arg Ala Leu Pro Leu Arg Phe Gly

225 230 235 240

Cys Gly His Arg

<210>10

<211>244

<212>PRT

<213>Porcine circovirus

<400>10

Met Arg His Arg Ala Ile Phe Arg Arg Arg Pro Arg Pro Arg Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg His Arg Arg Arg Tyr Ala Arg Arg Arg Leu Phe Ile Arg Arg

20 25 30

Pro Thr Ala Gly Thr Tyr Tyr Thr Lys Lys Tyr Ser Thr Met Asn Val

35 40 45

Ile Ser Val Gly Thr Pro Gln Asn Asn Lys Pro Trp His Ala Asn His

50 55 60

Phe Ile Thr Arg Leu Asn Glu Trp Glu Thr Ala Ile Thr Phe Glu Tyr

65 70 75 80

Tyr Lys Ile Leu Lys Met Lys Val Thr Leu Ser Pro Val Ile Ser Pro

85 90 95

Ala Gln Gln Thr Lys Thr Met Phe Gly His Thr Ala Ile Asp Leu Asp

100 105 110

Gly Ala Trp Thr Thr Asn Thr Trp Leu Gln Asp Asp Pro Tyr Ala Glu

115 120 125

Ser Ser Thr Arg Lys Val Met Thr Gln Pro Phe Ser His Ser Arg Tyr

130 135 140

Phe Thr Pro Lys Pro Leu Leu Ala Gly Thr Thr Ser Ala His Pro Gly

145 150 155 160

Gln Ser Leu Phe Phe Phe Ser Arg Pro Thr Pro Trp Leu Asn Thr Tyr

165 170 175

Asp Pro Thr Val Gln Trp Gly Ala Leu Leu Trp Ser Ile Tyr Val Pro

180 185 190

Glu Lys Thr Gly Met Thr Asp Phe Tyr Gly Thr Lys Glu Val Trp Ile

195 200 205

Arg Tyr Lys Ser Val Leu Val Lys Ile Asn Ile Asn Leu Thr Pro Pro

210 215 220

Val Ala Thr Ser Arg Val Pro Ser Arg Ala Leu Pro Leu Arg Phe Gly

225 230 235 240

Cys Gly His Arg

<---