Биологический препарат с высокой ростостимулирующей и противогрибковой активностью Российский патент 2024 года по МПК C12N11/00 A01N63/22 C12R1/07 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к получению нового сухого микробиологического удобрения для культурных растений, обладающего высокой ростостимулирующей активностью, защитным действием против фитопатогенных грибов и длительным сроком хранения.

Защита сельскохозяйственных растений - овощных культур, картофеля, зерновых и фруктов - от болезней является серьезной экономической проблемой. Ежегодные потери сельского хозяйства от болезней растений достигают нескольких миллиардов рублей. К числу экономически значимых болезней относятся, в частности, болезни, вызываемые микроскопическими грибами. Так, например, зерновые культуры (пшеница, рожь, ячмень, овес) подвержены болезням грибной этиологии, которые не только снижают на 20-30% уровень сельскохозяйственной продукции, но и снижают качество семенного материала (всхожесть, скорость роста). Фитопатогенные грибы продуцируют высокотоксичные и канцерогенные метаболиты, загрязняющие зерно и продукты его переработки.

Выделение и разработка новых штаммов микроорганизмов, обладающих антагонистической активностью по отношению к фитопатогенам и способствующих повышению урожайности культурных растений, является актуальной задачей, решение которой открывает принципиальную возможность в промышленном масштабе достичь высокой урожайности сельскохозяйственных культур и высокого качества получаемых сельскохозяйственных продуктов

Уровень техники

Известен [RU 2625977] биопрепарат комплексного действия на основе штамма Bacillus amyloliquefaciens OPS-32 ВКПМ: В-12464. Биопрепарат представляет собой жидкую споровую культуру с титром не менее 5×109 КОЕ/мл, спорообразованием не менее 95% и может быть использован для защиты сельскохозяйственных растений от фитопатогенных грибов, стимуляции их роста и повышения урожайности. Срок хранения препарата при температуре +2 - +30°С составляет 1 год.

Известен [RU 2478290] биопрепарат для стимуляции роста и защиты растений от болезней на основе штамма Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11008 и гуматов. Препарат содержит биомассу Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11008 с титром вегетативных клеток 1,24÷1,30×10¹⁰ КОЕ/мл и содержанием спор 94% от общего количества КОЕ и гуматы при соотношении компонентов по объему 99,0:1,0. Срок хранения препарата при температуре +4 - +28°С составляет 1 год.

Недостатком препаратов являются низкий титр бактерий в препарате и небольшой хранения – 1 год.

Известен [RU 2528058] препарат на основе штамма Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11475 для защиты зерновых растений от заболеваний, вызываемых фитопатогенными грибами. Препарат состоит из культуральной жидкости штамма Bacillus amyloliquefaciens B-11475, содержащей комплекс спор, вегетативных клеток и продуктов метаболизма, иммобилизованных на высокопористых мелкодисперсных гранулах диатомита. Биологический препарат получают путём смешивания активного начала в виде культуральной жидкости вышеуказанного штамма с титром 2-3×10⁹ КОЕ/мл и носителя в виде мелкодисперсных гранул диатомита в соотношении по объёму 1:3 с последующим высушиванием. Препарат позволяет повысить урожайность зерновых растений и уменьшить процент заражённости фитопатогенными грибами. Препарат хорошо хранится и удобен для транспортировки, но имеет низкий титр бактерий.

Краткое описание изобретения

Технической задачей, на решение которой направлено представленное изобретение является расширение арсенала биологических препаратов, обладающих антагонистической активностью против грибковых возбудителей болезней культурных растений и ростостимулирующим эффектом.

Техническим результатом заявляемого изобретения является биопрепарат, комплексного действия обладающий высокой ростостимулирующей и противогрибковой активностью.

Заявленный препарат получают путем культивирования в питательной среде штамма бактерий Bacillus amyloliquefaciens List 1 ВКПМ B-14463 и иммобилизации образующейся культуральной жидкости, а именно бактериальных клеток и продуктов их синтеза, на инертном носителе, представляющем собой натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы.

С целью увеличения активности и срока действия препарата, иммобилизацию бактериальных клеток и продуктов их синтеза на натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы осуществляют в процессе культивирования штамма с дополнительной «дробной» подпиткой, содержащий глюкозу.

Полученную в процессе культивирования иммобилизованную биомассу отделяют, смешивают со стерильным тальком до получения пасты, сушат при комнатной температуре, вносят компоненты питательной среды (глюкозу, дрожжевой экстракт, мясной экстракт и т.д) и затем фасуют в твердые желатиновые капсулы. Капсулирование в желатиновую капсулу с источниками питания позволяет быстро и удобно провести предварительную активацию биоудобрения при простом добавлении воды.

Примеры осуществления изобретения

Пример 1. Получение препарата

Посевной материал штамма бактерии Bacillus amyloliquefaciens List 1 ВКПМ B-14463 выращивают на скошенной агаризованной питательной среде состава (г/л): (пептон-10, глюкоза – 5, дрожжевой экстракт – 5, NaCl – 5, агар – 5., вода водопроводная - остальное) в течение 48 часов при температуре 30(±2)°С. Биомассу смывают 10 мл стерильного физиологического раствора.

Полученный посевной материал переносят в конические колбы с питательной средой состава (г/л) (пептон-10, глюкоза – 10 , дрожжевой экстракт – 5, NaCl – 5, вода водопроводная – остальное) из расчета 125 мл. посевного материала на 1250 мл. питательной среды. Наращивание биомассы проводят в термостатируемом орбитальном шейкере при температуре 30(±2)°С в течение 24 часов.

Полученный материал стерильно переносят в 30 литровый посевной ферментер с культуральной средой объема 25 литров состава (г/л) (пептон-10, глюкоза – 10 , дрожжевой экстракт – 5, NaCl – 5, вода водопроводная - остальное). Культивирование проводят при постоянном перемешивании (скорость вращения мешалки (400±20) об/мин)., подаче стерильного воздуха и постоянной температуре 30(±2)°С в течение 24 часов. Подача стерильного воздуха составляет 0,5 л/мин/1 л среды в течение первых 7 часов с последующим увеличением до 1 л/мин /1л среды.

Окончательное культивирование осуществляют в 300 литровом ферментере с объемом питательной среды 220 литров следующего состава (г/л) (пептон-10, глюкоза – 10 , дрожжевой экстракт – 5, NaCl – 5, вода водопроводная - остальное). Культивирование проводят при постоянном перемешивании (400±20 об/мин)., подаче стерильного воздуха - 1 л/мин /1л среды и постоянной температуре 30(±2)°С в течение 48 часов. Затем в стерильных условиях в ферментер вносят 2,4 кг натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы и начинают подавать дополнительную питательную жидкость содержащую глюкозу из расчета поддержания содержания сахаров (РВ) на уровне 0,5 -1 гр./литр в питательной среды. Через 24 часа подачу дополнительной питательной среды и подачу воздуха прекращают и в таком режиме продолжают культивирование в течение 24 часов до полного спорообразования. В дальнейшем проводят отделение полученной биомассы с помощью роторной центрифуги при скорости вращения 5000 об/мин 10 мин при 5ºС.

К полученной биомассе в стерильных условиях добавляют тальк из расчета 1 часть биомассы и 10 частей талька и сушат под ламинарным потоком в течение 30-минут. К полученному порошку добавляют дрожжевой экстракт и глюкозу в соотношении: 1:1:1. Полученную смесь перемешивают в течении 3-х часов в смесителе и капсулируют в твердые желатиновые капсулы размером 00.

Получают капсулированное иммобилизованное микробиологическое удобрение для стимуляции роста растений и борьбы с грибковыми заболеваниями с тиром активных клеток не менее 7*10¹² и сроком хранения не менее 3-х лет.

Во всех дальнейших экспериментах используют рабочий раствор препарата, приготовленный следующим образом: 1 капсулу биоудобрения растворяют в 1 литре прокипяченной воды, оставляют на оживление на 1 сутки, периодически перемешивая раствор путем встряхивания (далее: рабочий раствор биопрепарата).

Пример 2. Оценка фунгицидной активности

Фунгицидную активность полученного препарата проверяют в отношении фитопатогенных грибов Phytophtora infestans, Rhizoctonia solani, Fusarium culmorum, Fusarium solani, с использованием метода «лунок».

В разогретую и остывшую до температуры 35°С среду БТН (г/л) (гидролизат рыбный -10,5; пептон ферментативный 10,5; дрожжевой экстракт 2; хлорид натрия – 5; агар - 12; вода водопроводная - остальное) добавляют суспензию спор грибов (10⁵ КОЕ/мл) из расчета 1 мкл суспензии на 1 мл среды. Полученную смесь разливают по чашкам Петри, после застывания в ней делают в центре 1 отверстие. В отверстия заливают по 100 мкл рабочего раствора биопрепарата, разведенного в 200 раз водопроводной водой.

Одну чашка оставляют с пустой «лункой» как контрольный вариант. Все варианты исполняют в 10 повторностях. Чашки культивируют в течение 72 ч при температуре 32°C. Фунгицидную активность определяют как зоны ингибирования роста фитопатогенного гриба вокруг «лунки». Результаты измерений представлены в табл. 1.

Таблица 1. Оценка фунгицидной активности заявленного препарата.

Штамм бактерий Зоны ингибирования роста, мм. Phytophtora infestans Rhizoctonia solani Fusarium culmorum Fusarium solani Bacillus amyloliquefaciens List 1 32,8±1,5 37,05±1,8 37,5±2,5 31,2±3.2

Пример 3. Оценка эффективности обработки семян растений

Оценку эффективности обработки семян осуществляют в тепличных условиях на семенах пшеницы (сорт Омская 36), огурцов (сорт Апрельский), томатов (сорт Юсуповский).

Предпосевную обработку семян опытной группы осуществляют из расчета 1 капсула препарата на 1 тонну семян путем опрыскивания семян рабочим раствором биопрепарата, разведенного в 20 раз водопроводной водой.

Эксперименты проводят на почве, ранее зараженной грибами рода Fusarium, Rhizoctonia, Phytophtora.

Эффективность защитного (противогрибкового) действия биоудобрения оценивают по проценту развития заболевания корневой гнили в фазу полных всходов растений (50 растений в каждой группе). Контролем служат семена, обработанные путем опрыскивания кипяченной водопроводной водой из расчета 20 литров на 1 тонну семян (50 растений в каждой группе).

Биологическую эффективность рассчитывают на основе формулы: (А-Б)/А; где А – процент развития корневой гнили на растениях контрольной группы и Б – процент корневых гнилей в опытной группе. Результаты приведены в табл.2.

Таблица 2. Оценка эффективности обработки семян растений

Варианты Развитие корневых гнилей, % Пшеница, сорт Омская 36 Огурцы, сорт
Апрельский Томаты, сорт Юсуповский Контрольная группа 32,5 26,8 28,3 Опытная группа 0,9 1,5 0,6 Биологическая эффективность 97 94 98

Результаты эксперимента показывают, что предпосевная обработка семян биопрепаратом значительно снижает процент развития корневых гнилей в опытной группе.

Пример 4. Оценка ростостимулирующей активности препарата.

Оценку ростостимулирующей активности препарата проводят в мелкоделяночных испытаниях в Рязанской области, Рязанский район, Окское сельское поселение, посёлок Денежниково, в теплице на грунте ранее зараженным грибами рода Fusarium и Verticillium. Оценку осуществляют на примере пшеницы (сорт Омская 36), огурцов (сорт Апрельский), томатов (сорт Юсуповский). В расчет берется средний вес из 50 проростков и 20 взрослых растений каждого вида.

Предпосевную обработку семян опытной группы проводят как описано в примере 3.

В течение вегетации полив растений контрольной группы проводят водопроводной водой 1 раз в два дня, на глубину пропитывания 3-5 см. Опытную делянку один раз в неделю обрабатывают вместо водопроводной воды рабочим раствором биопрепарата, разведенным в 200 раз водопроводной водой

Результаты приведены в табл.3.

Таблица 3. Оценка ростостимулирующей активности препарата

Растения, сорт Ср. вес проростка, гр. Стимуляция роста, в % Средний вес корней одного растения, гр Стимуляция роста, в % Пшеница, сорт Омская 36 Опыт 0,53 153,6 0,81 219 Контроль 0,345 0,37 Огурцы, сорт
Апрельский Опыт 0,59 203,4 0,89 296 Контроль 0,29 0,30 Томаты, сорт Юсуповский Опыт 0,12 200 0,78 162 Контроль 0,06 0,48

Как показывают результаты, предпосевная обработка семян и последующий полив по вегетации раствором биоудобрения позволяют значительно увеличить урожайность сельскохозяйственных культур за счет высокой антагонистической активности по отношению к фитопатогенным микроорганизмам и ростостимулирующего действия.

Пример 5. Исследование сохранности биопрепарата при хранении.

Для исследования сохранности закладывают на хранение по 50 капсул препарата при двух температурах: 5 и 37°С. Подсчет титра клеток осуществляют посредством десятикратных разведений и высева на плотную питательную среду (БТА агар) по методу Коха. Титр клеток проверяют каждые три месяца хранения в первый год, каждые 6 месяцев во второй год и 1 раз в конце третьего года. Результаты приведены в табл. 4

Таблица 4. Исследование сохранности биопрепарата при хранении.

Темпера
турный режим хранения, °С Титр клеток (КОЕ) по месяцам хранения 0 3 6 9 12 18 24 36 5 (7,0±0,1) х10¹² (6,2±0,1)х10¹² (5,5±0,1)х10¹² (5,1±0,1)х10¹² (4,8±0,1)х10¹² (4,5±0,1)х10¹² (4,4±0,1)х10¹² (3,9±0,1)х10¹² 37 (7,0±0,5)
х10¹² (5±0,1)
х10¹² (4,8±0,1)х10¹² (4,4±0,1)х10¹² (4,0±0,1)х10¹² (3,3±0,1)х10¹² (2,8±0,1)х10¹² (0,2±0,1)х10¹²

Полученные результаты показывают, что при обоих режимах хранения к концу третьего года происходит только незначительное снижение титра клеток, что не отражается на эффективности действия препарата.

Таким образом показано, что заявляемый препарат обладает высокой ростостимулирующей и противогрибковой активностью, что позволяет значительно увеличить урожайность сельскохозяйственных культур

Высокая эффективность и длительный срок хранения препарата обеспечивается за счет:

-использования в качестве основы препарата нового активного штамма Bacillus amyloliquefaciens List 1, обладающего высокой противогрибкой активностью и ростостимулирующим действием;

- иммобилизации бактериальных клеток на натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы в процессе культивирования, что способствует увеличению активности и длительной сохранности как самих бактериальных клеток, так и активных продуктов их жизнедеятельности (противогрибковых и ростостимулирующих веществ белковой природы) в широком температурном диапазоне 5-40°С;

- применения глубинного способа высокоплотностного культивирования нового штамма Bacillus amyloliquefaciens (List 1) с дополнительной «дробной» подпиткой, содержащий глюкозу, что обеспечивает накопление высокого титра клеток в препарате;

- оптимизации препаративной формы путем концентрирования бактериальных клеток методом центрифугирования и смешения их со стерильным тальком, что обеспечивает длительный срок хранения без значительного падения титра;

- капсулирования препарата в желатиновую капсулу совместно с источниками питания, что позволяет быстро и удобно провести предварительную активацию биоудобрения при простом добавлении воды.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен биологический препарат, полученный путём культивирования в питательной среде штамма бактерий Bacillus amyloliquefaciens List 1 ВКПМ B-14463 и иммобилизации бактериальных клеток и продуктов их синтеза на инертном носителе, представляющем собой натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы. Изобретение обеспечивает расширение арсенала средств, обладающих повышенной ростостимулирующей активностью, защитным действием против фитопатогенных грибов сельскохозяйственных растений и длительным сроком хранения. 2 з.п. ф-лы, 4 табл., 5 пр.

1. Биологический препарат, обладающий противогрибковой и ростостимулирующей активностью, полученный путём культивирования в питательной среде штамма бактерий Bacillus amyloliquefaciens и иммобилизации бактериальных клеток и продуктов их синтеза на инертном носителе, отличающийся тем, что в качестве штамма бактерий Bacillus amyloliquefaciens используют штамм Bacillus amyloliquefaciens List 1 ВКПМ B-14463, а в качестве инертного носителя используют натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы.

2. Биологический препарат по п.1, отличающийся тем, что иммобилизацию бактерий на натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы осуществляют в процессе культивирования штамма с подачей дополнительной питательной среды, содержащий глюкозу, в течение 24 ч.

3. Биологический препарат по пп. 1, 2, отличающийся тем, что полученную в процессе культивирования иммобилизованную биомассу отделяют и смешивают со стерильным тальком до получения пасты.