СМЕСЬ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ШТАММОВ, ОБЛАДАЮЩАЯ ЦЕЛЛЮЛОЗОЛИТИЧЕСКОЙ И ФУНГИЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2021 года по МПК C12N1/20 A01N63/20 C12R1/07 

Изобретение относится к биотехнологии и сельскохозяйственной микробиологии и касается получения микробного препарата на основе смеси бактериальных штаммов, предназначенного для использования в сельском хозяйстве для ускоренного разложения пожнивных остатков и борьбы с болезнями сельскохозяйственных культур.

Основу изобретения составляют спорообразующие штаммы Bacillus amyloliquefaciens (ВКПМ В-11987), Bacillus mojavensis (ВКПМ В-13580) и Paenibacillus polymyxa (ВКМ В-747).

Современное ведение сельского хозяйства в настоящее время не представляется возможным без применения агрохимикатов, а использование биологического потенциала микроорганизмов позволяет создавать высокоэффективные препараты, отвечающие текущим сельскохозяйственным нуждам. Поэтому разработка новых микробиологических препаратов и удобрений является актуальной проблемой сельскохозяйственной микробиологии.

Известен биопрепарат Фитоспорин для защиты растений от болезней, который содержит бактериальный штамм Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 с концентрацией клеток 1⋅10⁹-1⋅10¹⁰ КОЕ/мл в количестве 92-98 об. % и наполнитель в количестве 2-8 об. %. (патент РФ №2099947).

Известны консорциумы бактерий Bacillus subtilis 1С-1435-1-1, Bacillus amyloliquefaciens IC-1436-1-23, Bacillus amyloliquefaciens IC-1437-1-23, Bacillus licheniformis ВКПМ B-10561 (пат. РФ №2482174) и бактерий Bacillus licheniformis IC-831-1-2, Bacillus licheniformis IC-832-1-2, Bacillus licheniformis IC-833-1-2, Bacillus licheniformis IC-834-1-2 (пат. РФ 2440413), обладающие антибактериальной и фунгицидной активностью и обеспечивающие восстановление микробиоценоза почвы. Однако спектр антимикробной активности консорциума в отношении фитопатогенов сельскохозяйственных культур недостаточно широк.

Известен биопрепарат, состоящий из смеси суспензий следующих штаммов, депонированных в ВКПМ: Agrobacterium tumefaciens В-4116, Agrobacterium radiobacter В-956, Azotobacter chroococcum B-2375, Bacillus thurengiensis B-2918, Bacillus subtillis B-6554, Bacillus subtillis B-4419, Bacillus megaterium B-4440, Bacillus megaterium B-200, Bradyrhizobium japonicum B-1978, Ervinia ananas B-5292, Lactobacillus casei B-3961, Pseudomonas fluorescens B-1138, Rhodopseudomonas palustris B-1620. Изобретение позволяет восстановить плодородие почвы и улучшить ее структуру, увеличить всхожесть семян, укрепить иммунную систему растений, повысить сопротивляемость болезням и вредителям, что значительно увеличивает урожайность и качество получаемого продовольствия (пат. РФ №2322061). Однако способ получения препарата на основе 10-13 штаммов довольно трудоемкий: изначально штаммы бактерий выращивают раздельно в течение (36_±2) часов при температуре 37°С на питательной среде, оптимальной для каждого штамма, смывают выросшие культуры 9% раствором хлорида натрия и рассчитывают по оптическому стандарту мутности (ОСО 45-28-59-85-П) количество микробных клеток в 1 мл суспензии, затем готовят суспензию каждого штамма в защитной среде, например в сахарозожелатиновой смеси, доводя концентрацию микробных клеток каждой культуры до 1,0-1,5⋅10⁹ КОЕ/мл, после чего готовят смесь суспензий штаммов в определенном соотношении.

Известен препарат (пат. РФ №2313941) для защиты растений от возбудителей болезней сельскохозяйственных культур с ростостимулирующим эффектом, включающий культуральную жидкость штаммов микроорганизмов, отличающийся тем, что в составе он содержит культуральные жидкости штамма бактерий Bacillus subtilis БАГ-65 и штамма актиномицета Streptomyces sindenensis БАГ-55, а также вспомогательные добавки.

Наиболее близким аналогом является препарат для защиты растений от возбудителей болезней сельскохозяйственных культур, обладающий фитопротекторными, целлюлолитическими и ростостимулирующими свойствами, включающий культуральную жидкость штаммов микроорганизмов, отличающийся тем, что в составе он содержит культуральные жидкости штаммов бактерий Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11986, Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11987, Pseudomonas brassicacearum ВКПМ В-11984, Rahnella aquatilis ВКПМ В-11985, Serratia plymuthica ВКПМ В-12008 в соотношении 1:1:1:1:1 с титром бактерий не менее 1⋅10⁹ КОЕ/мл (пат. РФ №2595405).

Технической задачей изобретения является расширение ассортимента микробиологических препаратов, разработка новой смеси бактериальных штаммов для сельского хозяйства широкого спектра действия, а именно для ускоренного разложения пожнивных остатков и борьбы с болезнями сельскохозяйственных растений.

Поставленная задача достигается использованием смеси спорообразующих бактериальных штаммов Bacillus amyloliquefaciens (ВКПМ В-11987), Bacillus mojavensis (ВКПМ В-13580) и Paenibacillus polymyxa (ВКМ В-747), обладающих целлюлозолитическими и антагонистическими свойствами, смешанных в соотношении 1:1:1 и имеющих общий титр не менее 1⋅10⁹ КОЕ/мл.

Штамм Bacillus amyloliquefaciens депонирован в Национальном Биоресурсном Центре - Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ В-11987; штамм Bacillus mojavensis депонирован в Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ В-13580; штамм Paenibacillus polymyxa депонирован в Всероссийской коллекции микроорганизмов под регистрационным номером ВКМ В-747, где было получено разрешение на его коммерческое использование.

Композицию получают путем смешивания культуральных жидкостей раздельно выращенных бактерий Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11987, Bacillus mojavensis ВКПМ В-13580, Paenibacillus polymyxa ВКМ В-747 в соотношении 1:1:1.

Свойства штаммов-продуцентов:

Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11987

1. Культурально-морфологические и биохимические свойства: Палочки бациллярной формы с округлыми концами. Споры эллипсовидные. Окраска по Граму -положительная. При культивировании на МПА образует колонии сероватого цвета с ровным краем, 3-5 мм в диаметре, слизистые, приподнятые у молодой культуры и шероховатые, плоские у стареющей.

2. Способ, условия и состав питательных сред для хранения штамма: Хранится в холодильнике при температуре 3±2°С в пробирках на мясопептонном агаре (рН 6,9-7,0).

3. Способ, условия и состав питательных сред для размножения микроорганизма: Для размножения штамма используют глубинное культивирование при температуре 28-30°С в течение 36-48 ч на питательной среде следующего состава, г/л: меласса - 30,0; K₂HPO₄⋅3H₂O - 7,0; K₂HPO₄ - 3,0; (NH₄)₂SO₄ - 1,5; Na-цитрат-3H₂O - 0,5; MgSO₄⋅7H₂O - 0,1; вода водопроводная - 1 л; рН 7,0-7,2.

4. Способ обнаружения микроорганизма в микробных ассоциациях окружающей среды и биоматериале: метод предельных разведений с последующим высевом на авизированную среду МПА, содержащую 30 мкг/мл стрептомицина и 10 мкг/мл хлорамфеникола.

5. Продукт, синтезируемый штаммом: Антимикробные метаболиты, протеаза, амилаза, целлюлаза.

Paenibacillus polymyxa BKM-747

1. Культурально-морфологические и биохимические свойства: Палочки бациллярной формы с округлыми концами. Споры овальные, раздувающие спорангий. Окраска по Граму - положительная. При культивировании на ГМФ образует кремовые полупрозрачные блестящие колонии, 3-5 мм в диаметре; на R2A - белые полупрозрачные блестящие слизистые колонии, с неровным краем, выпуклые.

2. Способ, условия и состав питательных сред для хранения штамма: Хранится в холодильнике при температуре 3±2°С в пробирках на R2A или ГМФ агаре (рН 7,0-7,2).

3. Способ, условия и состав питательных сред для размножения микроорганизма: Для размножения штамма используют глубинное культивирование при температуре 28-30°С в течение 36-48 ч на питательной среде следующего состава, г/л: меласса - 30,0; K₂HPO₄⋅3H₂O - 7,0; K₂HPO₄ - 3,0; (NH₄)₂SO₄ - 1,5; N-цитрат-3H₂O - 0,5; MgSO₄⋅7H₂O -0,1; вода водопроводная - 1 л; рН=6,5-7,0.

4. Способ обнаружения микроорганизма в микробных ассоциациях окружающей среды и биоматериале: Метод предельных разведений с последующим высевом на агаризованную среду R2A.

5. Продукт, синтезируемый штаммом: Азотфиксатор, продуцент антимикробных метаболитов (полимиксин), ауксинподобных веществ, эндо-1,4-Р-глюканазы, протеаз, амилаз, целлюлаз.

Bacillus mojavensis ВКПМ В-13580

1. Культурально-морфологические и биохимические свойства: Палочки бациллярной формы с округлыми концами. Споры овальные. Окраска по Граму -положительная. При культивировании на ГМФ образует бежевые колонии, 3-5 мм в диаметре.

2. Способ, условия и состав питательных сред для хранения штамма: Хранится в холодильнике при температуре 3±2°С в пробирках на мясопептонном агаре или среде ГМФ (рН 6,9 -7,0).

3. Способ, условия и состав питательных сред для размножения микроорганизма: Для размножения штамма используют глубинное культивирование при температуре +28-30°С в течение 36-48 ч на питательной среде следующего состава, г/л: меласса - 30,0; K₂HPO₄⋅3H₂O - 7,0; K₂HPO₄ - 3,0; (NH₄)₂SO₄ - 1,5; Na-цитрат-3H₂O - 0,5; MgSO₄-7H₂O -0,1; вода водопроводная - 1 л; рН 7,0-7,2.

4. Способ обнаружения микроорганизма в микробных ассоциациях окружающей среды и биоматериале: Метод предельных разведений с последующим высевом на агаризованную среду ГМФ.

5. Продукт, синтезируемый штаммом: Антимикробные метаболиты, протео-, амило- и целлюлозолитические ферменты.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Для лабораторных и полевых экспериментов, отраженных в примерах 1-11, предлагаемые бактериальные штаммы выращивали на питательной среде следующего состава (г/л): меласса - 30,0; K₂HPO₄⋅3H₂O - 7,0; K₂HPO₄ - 3,0; (NH₄)₂SO₄ - 1,5; Na-цитрат-3H₂O - 0,5; MgSO₄⋅7H₂O - 0,1; вода водопроводная - 1 л. Раздельное культивирование каждого из штаммов проводили на лабораторных ферментерах Biostat А (Sartorius, Германия) с рабочим объемом 1 л до достижения максимального выхода спор. В анализе хозяйственно-ценных свойств участвовали культуральные жидкости каждого из штаммов с титром 1,5-4,5⋅10⁹ КОЕ/мл, а также их смесь в соотношении 1:1:1, при этом титр бактериальной смеси составлял не менее 1,0⋅10⁹ КОЕ/мл.

Пример 1: Изучение целлюлозолитической активности штаммов (см. табл. 1) Анализируемые бактерии были проверены на способность к растворению натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы, входящей в состав питательной среды. После посева бактерий и инкубации в течение 48 ч агаровые пластины окрашивали раствором Конго красного и измеряли зону растворения Na-КМЦ. Было показано, что все 3 штамма способны к растворению целлюлозного субстрата, при этом наиболее активным явился В. amyloliquefaciens.

Пример 2: Активность эндо-1,4-р-глюканазы штаммов (см. табл. 2)

Была проанализирована активность эндо-1,4-Р-глюканазы с использованием окрашенного субстрата (целлюлозы) по методике Megazyme (S-ACMCL 09/12). При инкубировании субстрата с суспензиями бактерий, продуцирующих целлюлазы, целлюлоза деполимеризуется с образованием низкомолекулярных окрашенных фрагментов, переходящих в надосадочную жидкость, при этом высокомолекулярные фрагменты осаждаются центрифугированием. Результаты анализа показывают, что один штамм из анализируемой композиции (P. polymyxa) способен к синтезу эндо-1,4-β-глюканазы.

Пример 3: Протеолитическая активность штаммов (см. табл.3)

Анализируемые бактерии были проверены на способность к протеолизу белка по разжижению желатинового столбика. Для этого штаммы высевали уколом в мясо-пептонный желатиновый столбик, посевы инкубировали 7 суток при комнатной температуре. По истечении времени инкубирования было показано, что все 3 штамма продуцируют протеолитические ферменты, при этом наиболее активным явился штамм В. amyloliquefaciens.

Пример 4: Амилолитическая активность штаммов (см. табл.4 и 5)

Была оценена амилолитическая активность штаммов по гидролизу крахмала при высеве бактерий на питательную среду и последующему окрашиванию агаровой пластины раствором Люголя. Было обнаружено, что все анализируемые штаммы способны к синтезу амилаз, при этом наиболее активным штаммом явился В. amyloliquefaciens.

Таким образом, продемонстрировано, что предлагаемая смесь бактериальных штаммов продуцирует комплекс ферментов, необходимых для деструкции пожнивных растительных остатков. Сводные результаты опытов представлены в таблице 5.

Пример 5: Целлюлозолитическая активность смеси штаммов

Анализируемая бактериальная смесь была проверена на способность разрушать целлюлозу (фильтровальную бумагу) при культивировании на жидкой среде Гетчинсона на шейкере-инкубаторе при постоянном перемешивании при 220 об/мин и температуре 28°С.Показано, что по истечении 20 суток абсолютно сухая масса целлюлозы в варианте с внесением смеси штаммов снизилась на 25,3%, что сопровождалось значительным изменением размеров фрагментов фильтровальной бумаги, а также ее структуры, ставшей более однородной, по сравнению с контролем.

Пример 6: Деструкция льняных полотен смесью штаммов (см. табл.6 и 7) Целлюлозолитическую активность смеси штаммов оценивали по интенсивности разложения льняного полотна аппликационным методом. Для этого полоски льняной ткани размером 10x5 см в 6-кратной повторности обрабатывали рабочим раствором бактериальной композиции, в контроле ткань обрабатывали дистиллированной водой, после чего полоски закапывали в почву. По истечении 14 суток инкубирования ткань извлекали, отмывали, высушивали и измеряли убыль массы полотна. Показано, что к 14-м суткам дополнительная обработка льнополотна смесью штаммов ускоряет разложение ткани на 9,8% по сравнению с контролем.

Почва, использованная в аппликационном опыте, была оценена на возможность проявления токсического последействия на растения. Для этого в почву высевали семена кресс-салата, через 5 суток проращивания при 16/8-часовом световом дне и температуре 24°С проростки извлекали и измеряли длину корня и сравнивали с контрольными значениями.

Показано, что внесение в почву анализируемой бактериальной смеси посредством обработки льняных полотен не только не оказывает негативного влияния на последующее развитие кресс-салата, но и стимулирует его рост: длина корня в варианте применения смеси превышала контрольные значения в среднем в 2,2 раза.

Пример 7: Деструкция пожнивных остатков кукурузы (см. табл.8 и 9) Активность деструкции также оценивали в опыте на растительных послеуборочных остатках кукурузы. Для этого стерню нарезали на фрагменты 5-6 см, стерилизовали автоклавированием при 121°С в течение 30 мин, готовили навески согласно гектарному расходу стерни в пересчете на площадь поверхности пластикового контейнера. Пожнивные остатки обрабатывали рабочим раствором бактериальной смеси, перемешивали с увлажненной почвой и помещали смесь в капроновый мешочек, который закапывали в почву в контейнере. В контрольном варианте стерню обрабатывали стерильной дистиллированной водой. Посевы инкубировали при 25°С в течение 2 месяцев, после чего мешочки извлекали, отмывали остатки стерни от почвы и высушивали в сухожаровом шкафу. По разности массы до и после опыта определяли убыль сухой растительной массы и выражали ее в процентах.

Обнаружено, что максимальный процент деструкции стерни кукурузы наблюдался в варианте Биокомпозит-Деструкт, значительно превосходивший контрольные значения, а также препарат, служащий эталоном сравнения.

Пример 8: Фунгицидная активность штаммов (см. табл.10) Антагонистическую активность штаммов оценивали методом двухслойного агара с использованием 5 фитопатогенных грибов. Для опыта предварительно разливали по чашкам Петри стерильный 2%-ный по агару картофельно-сахарозный агар (КСА). Для анализа готовили суспензию спор и мицелия грибов. Для этого 1/8 часть агара, засеянного грибом, переносили в стерильную чашку Петри, добавляли 10 мл стерильной воды и смывали конидии и мицелий стерильным шпателем. После чего добавляли 20 мкл полученной суспензии в 4,98 мл остуженной до 45°С среды 1,2% КСА, тщательно перемешивали и разливали вторым слоем. Через 1 час в агаре стерильным пробойником делали «лунки», в которые вносили по 100 мкл анализируемых бактериальных суспензий. Посевы культивировали 4-7 суток (в зависимости от скорости роста грибов) при температуре 20°С, после чего регистрировали наличие или отсутствие зон угнетения роста фитопатогенов.

Обнаружено, что все 3 бактериальных штамма обладают антагонистической активностью и способны ингибировать рост проанализированных фитопатогенных грибов.

Пример 9: Влияние предпосевной обработки почвы смесью штаммов на развитие сахарной свеклы (см. табл. 11, 12, 13).

Культура: свекла сахарная гибрида Митика;

Место проведения опытов: Воронежская область, Рамонский район;

Размер опытных участков: посевная площадь 640 м², учетная площадь - 5 м²; Количество повторностей: 4.

Схема опыта:

1. Контроль - без обработки микробиологическими препаратами (обработка водой);

2. Смесь штаммов (1:1:1) - опрыскивание почвы и растительных остатков с немедленной заделкой в почву; норма расхода 2,0 л/га, расход рабочей жидкости 300 л/га.

Пример 10: Влияние предпосевной обработки почвы смесью штаммов на развитие яровой пшеницы (см. табл. 14)

Культура: яровая пшеница Омская 36;

Место проведения опыта: Кетовский район, Курганская область;

Схема опыта:

1. Контроль - без обработки микробиологическими препаратами (обработка водой);

2. Смесь штаммов (1:1:1) - опрыскивание почвы и растительных остатков с немедленной заделкой в почву; норма расхода 2,0 л/га, расход рабочей жидкости 300 л/га.

Пример 11: Влияние предпосевной обработки почвы смесью штаммов на развитие кукурузы (см. табл. 15)

Культура: кукуруза РОСС 199;

Место проведения опыта: Алтай, учхоз «Пригородное»;

Схема опыта предполагала внесение 2-х доз пшеничной соломы - 3 и 4 т/га в чистом виде и обработанной микробиологическим деструктором - смесью штаммов с нормой расхода 2 л/т.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Бактериальная композиция представлена смесью трех высокоэффективных штаммов, в состав которой входит 2 культуры с целлюлозолитической активностью: Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11987 и Bacillus mojavensis ВКПМ В-13580, а также штамм с азотфиксирующей активностью Paenibacillus polymyxa ВКМ В-747, обладающий не только деструкторным действием, но и способный к связыванию атмосферного азота, необходимого для эффективного разложения растительных пожнивных остатков. Все 3 штамма также обладают выраженной антагонистической активностью против фитопатогенных грибов, способствующей оздоровлению сельскохозяйственных почв.

Высокая активность заявленной смеси штаммов подтверждается результатами лабораторных экспериментов, а также полевых опытов, проведенных на различных культурах, где проявляется не только деструкторное действие, но и последующее ростостимулирующее влияние на сельскохозяйственные культуры и увеличение их урожайности.

Также помимо ферментативной, антагонистической, рострегуляторной активности и других хозяйственно-ценных свойств дополнительным конкурентоспособным преимуществом является технологичность штаммов-продуцентов, высокая скорость роста при периодическом культивировании, а также стабильное хранение готового препарата в широком диапазоне температур.

Таким образом, заявляемая бактериальная композиция является высокоэффективной и высококонкурентной продукцией для применения в сельском хозяйстве.

Изобретение относится к биотехнологии и сельскохозяйственной микробиологии. Предложена смесь спорообразующих бактериальных штаммов Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11987, Bacillus mojavensis ВКПМ В-13580 и Paenibacillus polymyxa ВКМ В-747, обладающих ферментативной, антагонистической, рострегуляторной активностью, смешанных в соотношении 1:1:1 и имеющих общий титр не менее 1⋅10⁹ КОЕ/мл. Изобретение обеспечивает расширение арсенала микробиологических препаратов на основе смеси бактериальных штаммов широкого спектра действия для сельского хозяйства, а именно для ускоренного разложения пожнивных остатков и борьбы с болезнями сельскохозяйственных растений. 15 табл., 11 пр.

Смесь спорообразующих штаммов для разложения пожнивных остатков и защиты растений от возбудителей болезней сельскохозяйственных культур, включающая штаммы микроорганизмов Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11987, Bacillus mojavensis ВКПМ В-13580 и Paenibacillus polymyxa ВКМ В-747, смешанных в соотношении 1:1:1 и имеющих общий титр жизнеспособных клеток не менее 1⋅10⁹ КОЕ/мл.