ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение касается области молекулярной биологии, в частности, рекомбинантного вируса, который способен устойчиво экспрессировать белки-мишени, и его применения.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Вирус ящура (FMDV) представляет собой рибонуклеиновокислотный (РНК) вирус, относящийся к роду афтовирусов семейства пикорнавирусов (Cooper et al., Intervirology, 1978, 10, 165-180). Будучи "раздетым" икосаэдрическим вирусом диаметром приблизительно 25 нм, FMDV содержит молекулу одноцепочечной РНК, состоящую из приблизительно 8500 нуклеотидов, с положительной полярностью. Эта молекула РНК включает одну открытую рамку считывания (ORF), кодирующую один полипротеин, включающий, помимо прочего, предшественник капсидного белка, также известный как белок Р1. Белок Р1 миристилируется на его амино-конце. В процессе созревания белок Р1 расщепляется протеазой 3С на три белка, известные как VP0, VP1 и VP3 (Belsham G. J., Progress in Biophysics and Molecular Biology, 1993, 60, 241-261). В вирионе белок VP0 затем расщепляется на два белка, VP4 и VP2. Механизм преобразования белков VP0 в VP4 и VP2 и образования зрелых вирионов неизвестен. Белки VP1, VP2 и VP3 имеют молекулярную массу приблизительно 26000 Да, тогда как белок VP4 является меньшим, приблизительно 8000 Да.
В зонах эпидемии FMD вакцинация является эффективным и главным средством борьбы с болезнью. Нынешние вакцины промышленного производства против FMDV в большинстве представляют собой полностью инактивированные вакцины против FMDV. Производство таких вакцин требует размножения большого объема вирулентного FMDV в условиях высокого уровня защиты, поддержание которого связано с большими расходами и риском утечки живого FMDV. Кроме того, некоторые дикие штаммы трудно адаптируются к суспензии клеток ВНК, и трудно достичь их высокого титра. Другая проблема полностью инактивированных вакцин состоит в том, что иногда бывает невозможно эффективно стимулировать иммунный ответ, в частности, у свиней, и, таким образом, требуются регулярные бустерные инъекции.
Одна из новых вакцин против FMD представляет собой вакцину на основе вирусоподобных частиц (VLP). Будучи производными от белка-предшественника Р1-2А, VLP содержат полный спектр иммуногенных сайтов, присутствующих на интактном вирусе, и являются такими же иммуногенными, как и вирионы в организмах животных. VLP лишены нуклеиновой кислоты и не заразны, поэтому вакцины на основе VLP имеют высокий профиль безопасности в отношении производства и применения на животных. VLP FMDV могут быть экспрессированы с применением различных систем и векторов экспрессии и могут доставляться как субъединичные вакцины (Luis L. Rodriguez and Marvin J. Grubman, Foot and mouth disease virus vaccines, Vaccine 27 (2009) D90 - D94). Несмотря на безопасность и легкость в приготовлении, субъединичные вакцины на основе VLP иногда не могут успешно вызывать долгосрочный иммунитет против болезни. Живые вакцины могут обеспечивать иммунитет в одной или двух дозах, тогда как субъединичные вакцины на основе VLP могут требовать повторного введения в течение заданных периодов времени.
Живые векторные вакцины на основе VLP рассматриваются как перспективные кандидатные вакцины для борьбы с FMDV. Для разработки живых векторных вакцин против FMDV на основе VLP должен быть создан рекомбинантный вирус, который содержит кодирующий VLP ген. Кодирующий VLP ген должен состоять из гена предшественника Р1-2А и гена протеазы 3С, таким образом, чтобы VLP могли экспрессироваться и собираться автоматически во время репликации рекомбинантного вируса. К сожалению, было обнаружено, что гены Р1-2А не могут устойчиво поддерживаться во время непрерывных пассажей рекомбинантных вирусов, например аденовируса, а это отрицательно сказывается на количестве полученных VLP и эффективности вакцины. (L. Robinson, Т. J. D. Knight-Jones, В. Charleston. Global Foot-and-Mouth Disease Research Update and Gap Analysis: 3 - Vaccines. Transboundary and Emerging Diseases (2016) P30 - 41).
Существует потребность в разработке содержащего кодирующий VLP ген рекомбинантного вируса, который позволял бы устойчиво поддерживать кодирующий VLP ген в рекомбинантном вирусе во время его непрерывных пассажей in vitro.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Решение вышеописанной технической проблемы обеспечивается описанием и вариантами осуществления, характеризуемыми в формуле изобретения, и изобретение в его различных аспектах осуществляется в соответствии с формулой.
В целом настоящее изобретение обеспечивает рекомбинантный вирус и соответствующий способ повышения устойчивости экспрессии гена-мишени.
В вышеупомянутом рекомбинантном вирусе ген-мишень предусмотрен таким образом, чтобы быть функционально связанным с существенным геном рекомбинантного вируса и располагаться перед существенным геном, чтобы ген-мишень и существенный ген могли экспрессироваться совместно. Например, ген-мишень может быть вставлен перед существенным геном рекомбинантного вируса в пределах одной ORF, поскольку такой ген-мишень должен быть устойчиво совместно экспрессирован с существенным геном при условии возможности репликации рекомбинантного вируса. Рекомбинантный вирус с потерей экспрессии гена-мишени или любыми мутациями за пределами рамки в гене-мишени не способен к репликации. В одном варианте осуществления рекомбинантный вирус происходит из семейства вирусов герпеса, в частности, лошадиного альфа-герпесвируса 1 (EHV-1). В одном варианте осуществления ген-мишень включает ген Р1, ген 2А и ген 3С FMDV. В контексте настоящего описания термины "ген-мишень" и "первый полинуклеотид" применяются взаимозаменяемо, и термины "существенный ген" и "второй полинуклеотид" применяются взаимозаменяемо.
При применении вышеупомянутого рекомбинантного вируса ген-мишень может устойчиво экспрессироваться рекомбинантным вирусом, который его содержит.
Настоящее изобретение также обеспечивает клетку-хозяин, включающую рекомбинантный вирус в соответствии с настоящим изобретением, и способ ее получения.
Настоящее изобретение также обеспечивает иммуногенную композицию, фармацевтическую композицию или вакцинную композицию, которая включает рекомбинантный вирус в соответствии с настоящим изобретением и/или нужный полипептид, экспрессируемый рекомбинантным вирусом в соответствии с настоящим изобретением, и способ ее получения. Настоящее изобретение также обеспечивает применение рекомбинантного вируса в соответствии с настоящим изобретением при приготовлении иммуногенной / фармацевтической / вакцинной композиции.
Настоящее изобретение также обеспечивает способ лечения и/или профилактики клинических признаков, вызываемых вирусом у животных, путем введения животному рекомбинантного вируса в соответствии с настоящим изобретением или иммуногенной / фармацевтической / вакцинной композиции в соответствии с настоящим изобретением.
Настоящее изобретение также касается способа иммунизации животных, таких, как продовольственных животных, в том числе свиней, который включает введение такому животному рекомбинантного вируса в соответствии с настоящим изобретением или иммуногенной / фармацевтической / вакцинной композиции в соответствии с настоящим изобретением.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение касается рекомбинантного вируса, включающего экспрессионную кассету в геноме рекомбинантного вируса, причем экспрессионная кассета включает первый полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере один нужный полипептид, и второй полинуклеотид, являющийся существенным геном рекомбинантного вируса или его функциональным фрагментом, и первый полинуклеотид функционально связан со вторым полинуклеотидом, причем первый полинуклеотид располагается перед вторым полинуклеотидом, а вышеупомянутый второй полинуклеотид является единственной копией вышеупомянутого существенного гена или его функционального фрагмента, который активен в рекомбинантном вирусе.
Настоящее изобретение также касается способа получения рекомбинантного вируса, который включает построение экспрессионной кассеты в геноме рекомбинантного вируса, причем экспрессионная кассета включает первый полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере один нужный полипептид, и второй полинуклеотид, являющийся существенным геном рекомбинантного вируса или его функциональным фрагментом, и первый полинуклеотид функционально связан со вторым полинуклеотидом, причем первый полинуклеотид располагается перед вторым полинуклеотидом, а вышеупомянутый второй полинуклеотид является единственной копией вышеупомянутого существенного гена или его функционального фрагмента, который активен в рекомбинантном вирусе.
Настоящее изобретение также касается способа повышения устойчивости экспрессии нужного полипептида в пределах рекомбинантного вируса, который включает построение экспрессионной кассеты в геноме рекомбинантного вируса, причем экспрессионная кассета включает первый полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере один нужный полипептид, и второй полинуклеотид, являющийся существенным геном рекомбинантного вируса или его функциональным фрагментом, и первый полинуклеотид функционально связан со вторым полинуклеотидом, причем первый полинуклеотид располагается перед вторым полинуклеотидом, а вышеупомянутый второй полинуклеотид является единственной копией вышеупомянутого существенного гена или его функционального фрагмента, который активен в рекомбинантном вирусе.
Рекомбинантный вирус в соответствии с настоящим изобретением строят на основе новой идеи, состоящей в коэкспрессии генов-мишеней с существенным геном рекомбинантного вируса. Ожидается, что коэкспрессия генов-мишеней и существенного гена рекомбинантного вируса должна быть благоприятной для устойчивой экспрессии белков-мишеней. Репликация рекомбинантного вируса должна зависеть от экспрессии генов-мишеней, что, в свою очередь стабилизирует экспрессию генов-мишеней. Если рекомбинантный вирус теряет экспрессию гена-мишени или имеет любые мутации за пределами рамки в гене-мишени, расположенный далее существенный ген также не будет функционально экспрессироваться, и в результате рекомбинантный вирус будет не способен к репликации. То есть, при функциональной комбинации ген-мишень устойчиво экспрессируется под давлением отбора репликации.
Коэкспрессия генов-мишеней и существенного гена рекомбинантного вируса может достигаться путем функционального связывания гена-мишени с существенным геном. В типичном варианте осуществления ген-мишень и существенный ген могут быть предусмотрены таким образом, чтобы располагаться в пределах одной ORF. Таким образом, в одном варианте осуществления первый полинуклеотид и второй в типичном варианте осуществления находятся в пределах одной ORF.
Существуют два типичных варианта достижения функционального связывания гена-мишени с существенным геном. Первый вариант состоит в делеции или сайленсинге эндогенного существенного гена рекомбинантного вируса (т.е., существенного гена, встречающегося в природе в геноме рекомбинантного вируса), и инсерции того же существенного гена, который экзогенно включают после гена-мишени, таким образом, чтобы ген-мишень был функционально связан с существенным геном. Таким образом, в одном варианте осуществления второй полинуклеотид является экзогенным, а эндогенный существенный ген рекомбинантного вируса был сайленсирован. Второй вариант заключается в инсерции гена-мишени перед эндогенным существенным геном вируса, таким образом, чтобы ген-мишень был функционально связан с существенным геном. Таким образом, в одном варианте осуществления второй полинуклеотид является эндогенным существенным геном рекомбинантного вируса.
В одном варианте осуществления второй полинуклеотид является эндогенным существенным геном рекомбинантного вируса. В другом варианте осуществления второй полинуклеотид является экзогенным, а эндогенный существенный ген рекомбинантного вируса был сайленсирован.
В одном варианте осуществления первый полинуклеотид кодирует антигенный полипептид или терапевтический полипептид. Антигенный полипептид может быть выбран, например, из группы, к которой относятся антиген FMDV, антиген PRRSV, антиген DEV и антиген PRV, предпочтительно антиген FMDV. В одном варианте осуществления первый полинуклеотид включает ген Р1, ген 2А и ген 3С FMDV. В одном варианте осуществления Нуклеотидная последовательность гена Р1 показана как SEQ ID NO: 1. В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность гена 2А показана как SEQ ID NO: 2. В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность гена 3С показана как SEQ ID NO: 3. В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность генной кассеты Р1-2А-3С показана как SEQ ID NO: 4.
В одном варианте осуществления второй полинуклеотид является существенным геном рекомбинантного вируса или его функциональным фрагментом. Существенными генами являются гены организма, которые считаются ключевыми для его репликации. Так же, как для вируса, к существенным генам относятся, помимо прочих, гены, кодирующие капсидный белок, ДНК-геликазу, ДНК-репликазу и т.п.В одном варианте осуществления существенный ген кодирует белок, выбранный, например, из группы, к которой относятся капсидный белок, связанный с репликацией ДНК белок, ДНК-геликаза, ДНК-репликаза, рецептор-связывающий реагент и связанный с эгрессом белок. В одном варианте осуществления существенный ген взят из генома EHV-1. В одном варианте осуществления существенным геном является ген EHV-1 ORF43 или ген EHV-1 ORF54. В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность гена ORF43 показана как SEQ ID NO: 5. В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность гена ORF54 показана как SEQ ID NO: 6.
В одном варианте осуществления первый полинуклеотид связан со вторым полинуклеотидом через линкер. В одном варианте осуществления линкер может быть гибким линкером, таким, как линкер (GGGGS)n, или геном 2А, предпочтительно геном 2А. В одном варианте осуществления первый полинуклеотид прямо связан со вторым полинуклеотидом. В одном варианте осуществления экспрессионная кассета включает конструкт, показанный через структуру "первого полинуклеотида - линкера - второго полинуклеотида".
В одном варианте осуществления рекомбинантный вирус происходит от вируса, выбранного, например, из семейства вирусов герпеса, таких, как лошадиный альфа-герпесвируса 1 (EHV-1), лошадиный альфа-герпесвирус 4 (EHV-4) и альфа-герпесвирус 1 крупного рогатого скота (герпесвирус 1 крупного рогатого скота, BHV-1). В одном варианте осуществления рекомбинантный вирус происходит от вируса, выбранного из числа представителей семейства вирусов герпеса, предпочтительно рода альфа-герпесвирусов, более предпочтительно - подрода Varicellovirus, и в наиболее предпочтительном варианте вышеупомянутый рекомбинантный вирус происходит от лошадиного альфа-герпесвируса 1 (EHV-1).
В одном варианте осуществления рекомбинантный вирус происходит от EHV-1, и первый полинуклеотид включает ген Р1, ген 2А и ген 3С FMDV. В одном варианте осуществления Нуклеотидная последовательность гена Р1 показана как SEQ ID NO: 1. В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность гена 2А показана как SEQ ID NO: 2. В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность гена 3С показана как SEQ ID NO: 3. В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность генной кассеты Р1-2А-3С показана как SEQ ID NO: 4. В одном варианте осуществления рекомбинантный вирус происходит от EHV-1, и существенным геном является ген EHV-1 ORF43 или ген EHV-1 ORF54. В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность гена ORF43 показана как SEQ ID NO: 5. В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность гена ORF54 показана как SEQ ID NO: 6. В одном варианте осуществления рекомбинантный вирус происходит от EHV-1, существенным геном является ген EHV-1 ORF43 или ген EHV-1 ORF54, и первый полинуклеотид включает ген Р1, ген 2А и ген 3С FMDV.
В одном варианте осуществления экспрессионная кассета также включает, например, регуляторные элементы, такие, как промотор, терминатор и т.п.В одном варианте осуществления промотор является промотором CMV. В одном варианте осуществления терминатор является сигналом polyA (поладенилирования), предпочтительно сигналом polyA BGH (гормона роста крупного рогатого скота). В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность сигнала polyA BGH показана как SEQ ID NO: 7.
В одном варианте осуществления экспрессионная кассета включает конструкт, показанный через структуру "промотора - первого полинуклеотида -второго полинуклеотида - терминатора". В одном варианте осуществления экспрессионная кассета включает конструкт, показанный через структуру "промотора - первого полинуклеотида линкера - второго полинуклеотида -терминатора". В одном варианте осуществления промотор является промотором CMV, предпочтительно промотором CMV5. В одном варианте осуществления первый полинуклеотид является геном-мишенью и включает или состоит из гена Р1, гена 2А и гена 3С FMDV. В одном варианте осуществления второй полинуклеотид является существенным геном и представляет собой ген EHV-1 ORF43 или ген EHV-1 ORF54. В одном варианте осуществления терминатором является BGH. В одном варианте осуществления линкером является ген 2А. В одном варианте осуществления экспрессионная кассета включает или состоит из конструкта CMV-P1-2A-3C-2A-ORF43-BGH. В одном варианте осуществления экспрессионная кассета включает или состоит из конструкта CMV-P1-2A-3C-2A-ORF54-BGH. В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность конструкта CMV-P1-2A-3C-2A-ORF43-BGH включает или показана как SEQ ID NO: 8. В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность конструкта CMV-P1-2A-3C-2A-ORF54-BGH включает или показана как SEQ ID NO: 9.
Настоящее изобретение также касается клетки-хозяина, которая включает рекомбинантный вирус в соответствии с настоящим изобретением. Клетка-хозяин в соответствии с настоящим изобретением включает линию эукариотных клеток-хозяев, характеризующуюся тем, что допускает репликацию рекомбинантного вируса в соответствии с настоящим изобретением. В одном варианте осуществления вышеупомянутая линия клеток-хозяев является линией клеток млекопитающих или линия клеток насекомых, наиболее предпочтительно она является линией клеток RK13, линией клеток MDBK, линией клеток ST, линией клеток AI-ST, линией клеток VERO, линией клеток Sf9, Sf21, линией клеток MDCK, и/или их производными. В одном варианте осуществления линия клеток-хозяев является линией клеток MDBK.
Настоящее изобретение также касается способа получения клетки-хозяина, который характеризуется следующими этапами: а) инфицирования линии эукариотных клеток-хозяев рекомбинантным вирусом в соответствии с настоящим изобретением; б) культивирования инфицированных клеток в соответствующих условиях и в) необязательно сбора вышеупомянутых клеток-хозяев.
Вышеперечисленные линии клеток-хозяев млекопитающих, как правило, культивируют в пластиковых сосудах для тканевых культур, погруженных в среду для культур клеток млекопитающих, такую, как минимальная питательная среда (MEM), дополненная солевым раствором Эрла и эмбриональной телячьей сывороткой. Линии клеток млекопитающих держат в инкубаторе при 37°С в обычной атмосфере, дополненной 5% CO2, и влажности приблизительно 80%. Линии клеток насекомых культивируют в пластиковых сосудах для тканевых культур, погруженных в культуральную среду для клеток насекомых и держат при 27°С в обычной атмосфере в инкубаторе.
Настоящее изобретение также касается иммуногенной композиции, фармацевтической композиции или вакцинной композиции, включающей рекомбинантный вирус в соответствии с настоящим изобретением и/или нужный полипептид, экспрессируемый рекомбинантным вирусом в соответствии с настоящим изобретением. В одном варианте осуществления иммуногенная / фармацевтическая / вакцинная композиция включает: а) рекомбинантный вирус в соответствии с настоящим изобретением; и/или б) нужный полипептид, экспрессируемый рекомбинантным вирусом в соответствии с настоящим изобретением; и в) необязательно приемлемый с фармацевтической или ветеринарной точки зрения носитель или эксципиент, причем предпочтительно вышеупомянутый носитель является подходящим для перорального, внутрикожного, внутримышечного или интраназального применения.
Настоящее изобретение также касается способа получения иммуногенной / фармацевтической / вакцинной композиции, который включает следующие этапы: а) инфицирования линии клеток-хозяев в соответствии с настоящим изобретением рекомбинантным вирусом в соответствии с настоящим изобретением; б) культивирования инфицированных клеток в соответствующих условиях; в) сбора инфицированных клеток; г) необязательно очистки материала, собранного на этапе в); и д) смешивания вышеупомянутого собранного материала с фармацевтически приемлемым носителем. В одном варианте осуществления, собранный материал представляет рекомбинантный вирус, вырабатываемый инфицированными клетками, или же собранный материал представляет нужный полипептид, экспрессируемый рекомбинантным вирусом.
Настоящее изобретение также касается применения рекомбинантного вируса в соответствии с настоящим изобретением при приготовлении иммуногенной / фармацевтической / вакцинной композиции. В одном варианте осуществления иммуногенную / фармацевтическую / вакцинную композицию применяют для профилактики и/или лечения клинических признаков болезни, вызванной инфицированием патогеном у животного, или для использования согласно способу лечения или профилактики инфицирования патогеном у животного, причем предпочтительно вышеупомянутое животное является продовольственным животным, таким, как свинья.
Настоящее изобретение также касается рекомбинантного вируса в соответствии с настоящим изобретением или иммуногенной / фармацевтической / вакцинной композиции в соответствии с настоящим изобретением для применения согласно способу снижения или предотвращения клинических признаков болезни, вызванной инфицированием патогеном у животного, или для использования согласно способу лечения или профилактики инфицирования патогеном у животного, причем предпочтительно вышеупомянутое животное является продовольственным животным, таким, как свинья.
Настоящее изобретение также касается способа иммунизации животного, такого, как продовольственное животное, включая свинью, который включает введение такому животному рекомбинантного вируса в соответствии с настоящим изобретением или иммуногенной / фармацевтической / вакцинной композиции в соответствии с настоящим изобретением.
Настоящее изобретение также касается способа иммунизации животного, такого, как продовольственное животное, включая свинью, против клинической болезни, вызываемой патогеном у вышеупомянутого животного, причем вышеупомянутый способ включает этап введения животному рекомбинантного вируса в соответствии с настоящим изобретением или иммуногенной / фармацевтической / вакцинной композиции в соответствии с настоящим изобретением, причем вышеупомянутый рекомбинантный вирус или вышеупомянутая иммуногенная / фармацевтическая / вакцинная композиция не вызывает клинических признаков инфекции, но способна вызывать иммунный ответ, иммунизирующий животное против патогенных форм вышеупомянутого патогена.
В одном варианте осуществления иммунизация в результате обеспечивает снижение частоты инфицирования конкретным вирусом в стаде или снижение тяжести клинических признаков, вызываемых или связанных с конкретной вирусной инфекцией.
Кроме того, иммунизация продовольственных животных, которые нуждаются в обеспечиваемых изобретением иммуногенных композициях, в результате предотвращает заражение продовольственных животных вирусной инфекцией. В еще более предпочтительном варианте иммунизация обеспечивает эффективный, долговременный, иммунологический ответ против вышеупомянутой вирусной инфекции. Специалистам станет понятно, что вышеупомянутый период времени длится более 2 месяцев, предпочтительно более 3 месяцев, более предпочтительно - более 4 месяцев, более предпочтительно более 5 месяцев, еще более предпочтительно более 6 месяцев. Следует понимать, что иммунизация может не быть эффективной для всех иммунизированных животных / субъектов. Однако условия требуют, чтобы значительная часть животных / субъектов в стаде была эффективно иммунизирована.
Настоящее изобретение также касается способа лечения или профилактики клинических признаков, вызываемых вирусом у животного, такого, как продовольственное животное, которое в этом нуждается, причем способ включает введение животному терапевтически эффективного количества рекомбинантного вируса в соответствии с настоящим изобретением или иммуногенной / фармацевтической / вакцинной композиции в соответствии с настоящим изобретением.
Предпочтительно клинические признаков снижаются по меньшей мере на 50%, еще более предпочтительно - по меньшей мере на 60%, еще более предпочтительно - по меньшей мере на 70%, еще более предпочтительно - по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно - по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 95%, наиболее предпочтительно на 100% по сравнению с животным, не подвергавшимся лечению или профилактике (не иммунизированным), но впоследствии инфицированным вирусом.
В одном варианте осуществления клинические признаки или болезнь, как упоминается выше, вызываются вирусом рода афтовирусов и рода альфа-герпесвирусов, предпочтительно FMDV.
Настоящее изобретение также касается комплекта для вакцинации животных, предпочтительно продовольственных животных, таких, как свиньи или крупный рогатый скот, против болезни, связанной с одним или несколькими клиническими признаками, связанными с патогеном или вызываемыми им у животного, и/или снижение их частоты или тяжести. Комплект в соответствии с настоящим изобретением включает: а) распределительное устройство, способное вводить вакцину вышеупомянутому животному; б) иммуногенную / фармацевтическую / вакцинную композицию в соответствии с настоящим изобретением и в) необязательно листок-вкладыш с инструкцией.
ОБЩИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Если не указывается иное, все применяемые в описании технические и научные термины имеют значение, являющееся общепринятым среди специалистов в области, которой касается данное изобретение, на момент подачи заявки. Значение и область применения терминов должны быть понятны; однако в случае какой-либо скрытой неясности представленные авторами определения имеют приоритетную силу над любым словарным или не касающимся данного документа определением. Кроме того, если контекст не требует иного, термины в единственном числе включают и форму множественного числа, а термины во множественном числе включают форму единственного числа. В контексте данного описания применение "или" означает "и/или", если не указано иное. Кроме того, применение термина "включая", а также других его форм, таких, как "включает" и "включенный" не ограничивается. Все упомянутые в описании патенты и публикации включены в него путем ссылки.
При практическом осуществлении настоящего изобретения, если не указано иного, применяют традиционные технологии вирусологии, молекулярной биологии, микробиологии, технологию рекомбинантных ДНК, белковой химии и иммунологии, которые известны специалистам в данной области. Такие технологии полностью поясняются в литературе. См., например, публикации Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. I, II and III, Second Edition (1989); DNA Cloning, Vols. I and II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R. K. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL press, 1986); Perbal, В., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the series, Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Protein purification methods a practical approach (E.L.V. Harris and S. Angal, eds., IRL Press at Oxford University Press); и Handbook of Experimental Immunology, Vols. I - IV (D. M. Weir and С.C. Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications).
Также следует понимать, что применяемая авторами терминология предназначена лишь для описания конкретных вариантов осуществления изобретения и не является ограничивающей. Следует заметить, что, применяемые в этом описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа также охватывают формы множественного числа, если контекст явно не предполагает иного. Таким образом, например, ссылка на "антиген" охватывает смесь двух или более антигенов, ссылка на "эксципиент" охватывает смеси двух или более эксципиентов, и т.п.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ
Термин "нуклеиновая кислота", "нуклеиновокислотная
последовательность", "нуклеотидная последовательность", "полинуклеотид", "полинуклеотидная последовательность", "последовательность РНК" или "последовательность ДНК" в контексте данного описания означают олигонуклеотид, нуклеотид или полинуклеотид и их фрагменты и части и ДНК или РНК геномного или синтетического происхождения, которые могут быть одно- или двухцепочечными и представлять смысловую или антисмысловую цепь. Последовательность может быть некодирующей последовательностью, кодирующей последовательностью или их смесью. Нуклеиновокислотные последовательности в соответствии с настоящим изобретением получают с применением стандартных способов, общеизвестных среди специалистов в данной области.
Термины "нуклеиновая кислота" и "полинуклеотид" также могут включать нуклеиновые кислоты, состоящие из оснований, отличных от пяти природных оснований (аденин, гуанин, тимин, цитозин и урацил).
Термин "полипептиды" означает биологические короткие цепи аминокислотных мономеров, связанных пептидными (амидными) связями. В контексте настоящего изобретения, если не указано иного, термины "полипептиды" и "белки" являются взаимозаменяемыми.
Термин "нужный полипептид" относится к полипептиду, кодируемому полинуклеотидной последовательностью любой длины, которая кодирует нужный продукт. В конкретном аспекте полинуклеотидная последовательность, кодирующая нужный полипептид, является экзогенной. По определению каждая полинуклеотидная последовательность или каждый ген, содержащийся в рекомбинантном вирусе, и соответствующий белок или РНК, которые им кодируются, называются "экзогенными", "экзогенными последовательностями", "экзогенными генами", "экзогенными кодирующими последовательностями" или "трансгенами", в частности, если они происходят от другого вида (вируса). В конкретном аспекте нужный полипептид является антигенным полипептидом или терапевтическим полипептидом. В конкретном аспекте нужный полипептид является антигеном FMDV. В контексте настоящего изобретения, если не указано иного, термины "нужный полипептид" и "белок-мишень" являются взаимозаменяемыми.
Термин "вектор" в известном специалистам в данной области значении относится к полинуклеотидной последовательности, обычно плазмиде или бактериальной искусственной хромосоме, которую используют для переноса генетического материала в клетку-хозяин. Векторами могут быть, например, бактерии, вирусы, фаги, бактериальные искусственные хромосомы, космиды или плазмиды. Вектор в контексте данного описания может состоять из ДНК или РНК или содержать любую из них. В некоторых вариантах осуществления вектор состоит из ДНК. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой инфекционный вирус. Такой вирусный вектор содержит вирусный геном, подвергнутый манипуляции таким образом, чтобы он нес чужеродный ген, который не выполняет функции в репликации вирусного вектора ни в культуре клеток, ни в организме-хозяине животного. В конкретном аспекте вектор может применяться для разных целей, например, для простой передачи генетического материала, для трансфекции клеток-хозяев или организмов, для экспрессии гена-мишени, для применения в качестве вакцин, например, ДНК-вакцин или для экспрессии генов. Экспрессия генов - термин, описывающий биосинтез белка в клетке, направленный специфической полинуклеотидной последовательностью, называемой геном. В частном аспекте вектор может быть "вектором экспрессии", который является вектором, способным направлять экспрессию белка, кодируемого одним или несколькими генами, которые несет вектор, когда присутствует в соответствующей среде.
Векторы и способы получения и/или применения векторов (или рекомбинантов) для экспрессии могут быть аналогичны способам, раскрываемым в следующих источниках: патентах США №№4,603,112, 4,769,330, 5,174,993, 5,505,941, 5,338,683, 5,494,807, 4,722,848, 5,942,235, 5,364,773, 5,762,938, 5,770,212, 5,942,235, 382,425, публикациях РСТ WO 94/16716, WO 96/39491, WO 95/30018; публикациях Paoletti, "Applications of pox virus vectors to vaccination: An update, "PNAS USA 93: 11349 - 11353, October 1996; Moss, "Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety," PNAS USA 93: 11341 - 11348, October 1996; Smith et al., Патенте США №4,745,051 (рекомбинантный бакуловирус); Richardson, С.D. (Editor), Methods in Molecular Biology 39, "Baculovirus Expression Protocols" (1995 Humana Press Inc.); Smith et al., "Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector", Molecular and Cellular Biology, December, 1983, Vol. 3, No. 12, p. 2156-2165; Pennock et al., "Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector, "Molecular and Cellular Biology March 1984, Vol. 4, No. 3, p. 406; EPAO 370 573; Заявке США №920,197, поданной 16 октября 1986 г.; публикации заявки на европейский патент №. 265785; Патенте США №4,769,331 (рекомбинантный герпесвирус); Roizman, "The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors," PNAS USA 93: 11307-11312, October 1996; Andreansky et al., "The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors," PNAS USA 93: 11313 - 11318, October 1996; Robertson et al., " Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to В lymphocytes", PNAS USA 93: 11334-11340, October 1996; Frolov et al., "Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications," PNAS USA 93: 11371-11377, October 1996; Kitson et al., J. Virol. 65, 3068-3075, 1991; Патентах США №№5,591,439, 5,552,143; публикации WO 98/00166; акцептованных заявках США сер. №№08/675,556 и 08/675,566, обе поданы 3 июля 1996 г. (рекомбинантный аденовирус); Grunhaus et al., 1992, "Adenovirus as cloning vectors," Seminars in Virology (Vol. 3) p. 237-52, 1993; Ballay et al. EMBO Journal, vol. 4, p. 3861-65, Graham, Tibtech 8, 85-87, April, 1990; Prevec et al., J. Gen Virol. 70, 42434; PCT WO 91/11525; Feigner et al. (1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561, Science, 259: 1745 - 49, 1993; and McClements et al., "Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease", PNAS USA 93: 11414 - 11420, October 1996; и Патентах США №№5,591,639, 5,589,466 и 5,580,859, а также публикациях WO 90/11092, WO 93/19183, WO 94/21797, WO 95/11307, WO 95/20660; Tang et al., Nature, and Furth et al., Analytical Biochemistry, касающихся, помимо прочего, векторов экспрессии ДНК. См. также публикации WO 98/33510; Ju et al., Diabetologia, 41: 736-739, 1998 (лентивирусная система экспрессии); Sanford et al., Патент США №4,945,050; Fischbachet al. (Intracel); публикации WO 90/01543; Robinson et al., Seminars in Immunology vol. 9, pp. 271-283 (1997), (системы ДНК-вектора); Szoka et al., Патент США №4,394,448 (способ вставки ДНК в живые клетки); McCormick et al., Патент США №5,677,178 (применение цитопатических вирусов); и Патент США №5,928,913 (векторы для доставки генов); а также другие приведенные авторами документы.
Термин "вирусный вектор" описывает генетически модифицированный вирус, подвергнутый манипуляции с применением технологии рекомбинантных ДНК таким образом, чтобы его введение в клетку-хозяин в результате могло обеспечивать специфическую биологическую активность, например, экспрессию чужеродного гена-мишени, который несет вектор. Вирусный вектор может быть или не быть репликационно-компетентным в клетке-, ткани- или организме-мишени. Вирусный вектор может включать последовательности из генома любого известного организма. Последовательности могут быть включены в их нативной форме или могут быть модифицированы любым способом для достижения нужной активности. Например, последовательности могут включать инсерции, делеции или замещения. Вирусный вектор также может включать место инсерции для экзогенной полинуклеотидной последовательности. В конкретном аспекте вирусный вектор относится к семейству вирусов герпеса, например EHV-1.
Генерацию вирусного вектора осуществляют с применением любой технологии генной инженерии, общеизвестной среди специалистов в данной области, включая, помимо прочих, стандартные технологии расщепления рестрикционной эндонуклеазы, лигирование, трансформацию, очистку плазмид, секвенирование ДНК, трансфекцию в культуры клеток, например, как описывается в публикациях Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1989)) или K. Maramorosch and H. Koprowski (Methods in Virology Volume VIII, Academic Press Inc. London, UK (2014)).
Термин "рекомбинантный вирус" применяется для описания вируса, включающего экзогенную последовательность в его геноме, путем искусственной манипуляции с вирусным геномом, т.е., с применением технологии рекомбинантных ДНК. В конкретном аспекте вирус, включающий экзогенную последовательность, такую, как экзогенная кодирующая антиген последовательность, является рекомбинантным вирусом. В конкретном аспекте рекомбинантный вирус может считаться вирусом, содержащим экзогенную полинуклеотидную последовательность, кодирующую нужный полипептид. В конкретном аспекте рекомбинантный вирус происходит из семейства вирусов герпеса, например EHV-1, и включает ген-мишень.
Технологии рекомбинантных ДНК для получения рекомбинантного вируса хорошо известны специалистам в данной области и, как правило, включают построение комплементарных копий ДНК полной длины (инфекционных клонов) вирусного генома, который затем может быть модифицирован путем применения способов рекомбинации и манипуляции ДНК.
Термин "функционально связанный" применяется для описания связи между регуляторными элементами и геном или его кодирующим участком. Как правило, экспрессия генов выполняется под контролем одного или нескольких регуляторных элементов, к которым, например, помимо прочих, относятся конститутивные или индуцибельные промоторы, тканеспецифичные регуляторные элементы и энхансеры. Ген или кодирующий участок называют "функционально связанным" с регуляторными элементами в том смысле, что ген или кодирующий участок контролируется или подвергается воздействию регуляторного элемента. Например, промотор является функционально связанным с кодирующей последовательностью, если промотор выполняет транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности.
Кроме того, в контексте настоящего описания термины "функциональное связывание" или "функционально связанный" означают, что две или более нуклеиновокислотных последовательностей располагаются таким образом, чтобы это позволяло им экспрессироваться в правильной форме и функционировали надлежащим образом. Например, полинуклеотид, функционально связан с последовательностью существенного гена, если транскрипция или трансляция последовательности существенного гена зависит от правильной экспрессии полинуклеотида.
"Открытая рамка считывания" или "ORF" относится к длине нуклеиновокислотной последовательности, ДНК или РНК, которая включает сигнал запуска трансляции или инициирующий кодон, такой, как ATG или AUG, и терминирующий кодон и может быть потенциально транслирована в полипептидную последовательность.
"Два полинуклеотида находятся в пределах одной ORF" - это означает, что два полинуклеотида находятся в одной транскрипционной молекуле и имеют общий сигнал запуска трансляции или инициирующий кодон и общий терминирующий кодон. В конкретном аспекте ген-мишень и существенный ген находятся в одной транскрипционной молекуле и имеют общий сигнал запуска трансляции или инициирующий кодон и общий терминирующий кодон.
Термин "экспрессия" в контексте данного описания относится к транскрипции и/или трансляции нуклеиновокислотной последовательности. В соответствии с частными аспектами настоящего изобретения, термин "экспрессия" относится к транскрипции и/или трансляции экзогенной нуклеиновокислотной последовательности.
Термин "экспрессионная кассета" или "транскрипционная единица" определяет участок в пределах генома рекомбинантного вируса, который содержит один или несколько генов, подлежащих транскрипции. В конкретном аспекте гены, содержащиеся в экспрессионной кассете, могут быть геном-мишенью и эндогенным существенным геном рекомбинантного вируса. В конкретном аспекте гены, содержащиеся в экспрессионной кассете, могут быть геном-мишенью и экзогенным существенным геном. Нуклеотидные последовательности, кодирующие транскрибированный(е) ген(ы), а также полинуклеотидные последовательности, содержащие регуляторные элементы, содержащиеся в пределах экспрессионной кассеты, функционально связаны между собой. Они транскрибируются из промотора, и транскрипция прекращается по меньшей мере одним сигналом поладенилирования. В одном частном аспекте они транскрибируются из одного промотора. В результате различные гены связываются по меньшей мере транскрипционно. Несколько белков или продуктов могут быть транскрибированы и экспрессированы из каждой транскрипционной единицы (мультицистронной транскрипционной единицы). Каждая транскрипционная единица включает регуляторные элементы, необходимые для транскрипции и трансляции любой из выбранных последовательностей, которые содержатся в пределах единицы. И каждая транскрипционная единица может содержать одинаковые или различные регуляторные элементы. Например, каждая транскрипционная единица может содержать одинаковый терминатор, участок внутренней посадки рибосомы или интроны могут использоваться для функционального связывания генов в пределах транскрипционной единицы.
Термин "существенный ген" означает гены, необходимые для репликации организма и, таким образом, считающиеся необходимыми для основания жизни.
Термин "функциональный фрагмент" или "функциональная производная" существенного гена означает, что фрагмент или производная продолжает влиять на активность существенного гена. Что касается вируса, ген также считается существенным (т.е., выполняет роль культуры клеток), если его делеция приводит к снижению титра вируса более чем в 10 раз в одно- или многоступенчатой кривой роста. Большинство существенных генов кодируют белки для поддержания центрального метаболизма, репликации ДНК, трансляции генов в белки, поддержания основной клеточной структуры м опосредования процесса транспорта в клетку и из нее. Что касается вируса, все гены, задействованные в образовании обернутого вириона, образовании актинового хвоста и высвобождении внеклеточного вириона также считались существенными. Применяют две главных стратегии для распознавания существенных генов на полногеномной основе: прямая делеция генов и неспецифический мутагенез с применением транспозонов. В первом случае отдельные гены (или ORF) полностью удаляют из генома синтетическим способом. В опосредованном транспозонами мутагенезе транспозоны случайно вставляются в максимальное количество позиций в геноме с целью инактивации генов-мишеней. Инсерционные мутанты, которые сохраняют способность к выживанию или росту, отсутствуют в существенных генах. (Zhang, R., 2009 & Gerdes, S., 2006).
Термин "эндогенный" в контексте данного описания относится к полинуклеотиду или белку, встречающемуся в природе в данном виде. Существенный ген называют "эндогенным существенным геном вируса", то есть, существенный ген встречается в природе в геноме вируса. В конкретном аспекте ген-мишень вставляется перед эндогенным существенным геном рекомбинантного вируса и функционально связан с ним.
Термин "экзогенный" в контексте данного описания относится к полинуклеотиду или белку, который взят из чужеродного вида или производится им, или, если взят из того же вида, изменен путем инженерии относительно первоначальной формы. В конкретном аспекте эндогенный существенный ген рекомбинантного вируса сайленсирован, и тот же экзогенный существенный ген вставлен после гена-мишени и функционально связан с ним.
Термин "конструкт" в контексте данного описания относится к рекомбинантной нуклеиновой кислоте, такой, как искусственно генерированная плазмида.
Термины "регуляторный элемент", "регуляторная нуклеиновая кислота", "элемент контроля экспрессии" применяются взаимозаменяемо и относятся к нуклеиновокислотным молекулам, которые могут влиять на экспрессию функционально связанной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине. Эти термины применяются в широком значении и охватывают все элементы, которые способствуют транскрипции или регулируют ее, включая промоторы, промоторные последовательности, коровые элементы, необходимые для основного взаимодействия РНК-полимеразы и факторы транскрипции, вышележащие элементы, энхансеры и элементы ответа. Типичными регуляторными элементами в прокариотах являются промоторы, операторные последовательности и сайты связывания рибосом. К регуляторным элементами, применяемым в эукариотных клетках, относятся, помимо прочих, транскрипционные и трансляционные контрольные последовательности, такие, как промоторы, энхансеры, сигналы сплайсинга, сигналы поладенилирования, терминаторы, сигналы разрушения белка, участки внутренней посадки рибосом (IRES), пикорнавирусные 2А последовательности и т.п., которые обеспечивают и/или регулируют экспрессию кодирующей последовательности и/или выработку кодированного полипептида в клетке-хозяине.
В контексте данного описания термин "промотор" или "промоторная последовательность" означает нуклеотидную последовательность, обеспечивающую возможность связывания РНК-полимеразы и направляющую транскрипцию гена. Как правило, промотор располагается на 5' некодирующем участке гена, ближнем относительно сайта начала транскрипции гена. Элементы последовательности в пределах промоторов, которые функционируют для инициации транскрипции, часто характеризуются консенсусными нуклеотидными последовательностями. Примерами промоторов могут быть, помимо прочих, промоторы из бактерий, дрожей, растений, вирусов и организмов животных, таких, как млекопитающие (включая лошадей, свиней, крупный рогатый скот и человека), птицы или насекомые. Промотор может быть индуцибельным, репрессируемым и/или конститутивным. Индуцибельные промоторы вызывают повышения уровня транскрипции из ДНК под их контролем в ответ на некоторые изменения в условиях культивирования, такие, как изменение температуры (Ptashne, 2014). Примерами промоторов, общеизвестных среди специалистов в данной области, включают, например, CMV-5, большой Т-антиген SV40, немедленно-ранний ген 1 HCMV и MCMV, альфа-промотор гена человеческого фактора элонгации.
Термин "энхансер" означает полинуклеотидную последовательность, которая в cis- положении действует на активность промотора и, таким образом, стимулирует транскрипцию гена или кодирующей последовательности, функционально связанной с этим промотором. В отличие от промоторов, эффект энхансеров не зависит от позиции и ориентации, и, таким образом, они располагаются напротив или транскрипционной единицы или за ней, в пределах интрона или даже в пределах кодирующего участка. Энхансер может быть расположен как в непосредственной близости от транскрипционной единицы, так и на значительном расстоянии от промотора. Также возможно физическое и функциональное перекрытие с промотором. Специалистам в данной области известны многие энхансеры из разных источников (которые хранятся в банках данных, таких, как GenBank, например, энхансеры SV40, энхансеры CMV, энхансеры полиомы, энхансеры аденовируса), доступные как независимые элементы или элементы, клонируемые в пределах полинуклеотидных последовательностей (например, депонированных в АТСС или доступных из коммерческих и частных источников). Многие из промоторных последовательностей также содержат энхансерные последовательности, такие, как часто используемый промотор CMV. Человеческий энхансер CMV является одним из сильнейших ранее идентифицированных энхансеров. Одним из примеров индуцибельных энхансеров является энхансер металлотионеина, который стимулируется глюкокортикоидами или тяжелыми металлами.
"Регуляторные элементы транскрипции" обычно включают промотор перед последовательностью гена, подлежащего экспрессии, сайты инициации и терминации транскрипции и сигнал поладенилирования.
Термин "сайт инициации транскрипции" относится к нуклеиновой кислоте в конструкте, которая соответствует первой нуклеиновой кислоте, включенной в первичный транскрипт, т.е., предшественник мРНК. Сайт инициации транскрипции может перекрываться с промоторными последовательностями.
"Сигнал терминации" или "терминатор" или "сигнал поладенилирования" или "polyA" или "сайт терминации транскрипции" или "элемент терминации транскрипции" представляет собой сигнальную последовательность, которая вызывает расщепление в конкретном месте на 3' конце эукариотной мРНК и посттранскрипционное включение последовательности из приблизительно 100 -200 нуклеотидов аденина (polyA-хвост) на расщепленном 3' конце и, таким образом, вызывает терминацию транскрипции РНК-полимеразой. Сигнал поладенилирования включает последовательность ААТААА из приблизительно 10-30 нуклеотидов перед сайтом расщепления и последовательности, расположенной далее. Известны разные элементы поладенилирования, такие, как tk polyA, поздний и ранний polyA SV40, BGH polyA (описанный, например, в Патенте США №5,122,458) или polyA гормона роста хомяка (WO 2010010107).
"Регуляторные элементы трансляции" включают сайт инициации трансляции (AUG), стоп-кодон и сигнал polyA для каждого отдельного полипептида, подлежащего экспрессии. В некоторые конструкты может быть включен участок внутренней посадки рибосомы (IRES). Для оптимизации экспрессии может быть желательным удаление, добавление или изменение 5'-и/или 3'-нетранслированных участков нуклеиновокислотной
последовательности, подлежащей экспрессии, с целью удаления любых потенциально лишних ненадлежащих альтернативных кодонов инициации трансляции или других последовательностей, которые могут вмешиваться в экспрессию или снижать ее, на уровне транскрипции или трансляции. Консенсусные сайты связывания рибосом (последовательность Козака) могут быть вставлены непосредственно перед старт-кодоном для усиления трансляции и, таким образом, экспрессии. Повышенное содержание A/U вокруг этого сайта связывания рибосом способствует более эффективному связыванию рибосом.
Термин "внерамочная мутация", также называемая ошибкой рамки или сдвигом рамки считывания, относится к генетической мутации, вызываемой инсерцией или делецией многих нуклеотидов в последовательности ДНК, которая не делится на три. Внерамочная мутация в пределах ORF в результате приводит к отклонениям в экспрессии генов в пределах ORF.
Термин "сайленсинг гена" означает процесс "выключения" гена, что предотвращает его экспрессию в форме выработки белка или других форм экспрессии. Сайленсинг гена представляет собой важную лабораторную технологию, поскольку выключение гена является высокоэффективным способом определения назначения этого гена. Ген может быть сайленсирован различными способами и через один из многих различных механизмов. Сайленсинг гена часто рассматривается как то же самое, что и нокаут гена. То есть, когда гены нокаутируются, они полностью удаляются из генома организма и, таким образом, не имеют экспрессии. В контексте настоящего изобретения сайленсинг гена также включает снижение экспрессии гена до такого уровня, что активность гена в состоянии покоя является недостаточной для достижения его функции. Например, в конкретном аспекте эндогенный существенный ген вируса был сайленсирован до такого уровня, что активность существенного гена в состоянии покоя не может повлиять на контроль гена-мишени на существенном гене, который экзогенно включен и функционально связан с геном-мишенью.
"Клетка-хозяин" означает клетки, в которых рекомбинантный вирус может реплицироваться. В конкретном аспекте клетка-хозяин может быть линией эукариотных клеток-хозяев, предпочтительно линией клеток млекопитающих или линией клеток насекомых. К клеткам-хозяевам, помимо прочих, относятся линия клеток RK13, линия клеток MDBK, линия клеток ST, линия клеток AI-ST, линия клеток VERO, линия клеток Sf9, Sf21, линия клеток MDCK и/или их производные.
Термин "устойчивая экспрессия" или "устойчивость экспрессии" в контексте данного описания означает, что рекомбинантный вирус способен правильно экспрессировать экзогенный полинуклеотид во время его пассажа без потери экзогенного полинуклеотида или каких-либо мутаций за пределами рамки в экзогенном полинуклеотиде. В контексте настоящего изобретения устойчивой экспрессии экзогенного полинуклеотида достигают, позволяя экзогенному полинуклеотиду функционально связываться с существенным геном рекомбинантного вируса и располагаться перед существенным геном. Рекомбинантный вирус с потерей экзогенного полинуклеотида или каких-либо мутаций за пределами рамки в экзогенном полинуклеотиде не будет реплицироваться и, таким образом, будет удален из культуральной жидкости для рекомбинантного вируса. Таким образом, доминантными рекомбинантными вирусами, присутствующими в культуральной жидкости, будут те, которые способны правильно коэкспрессировать экзогенный полинуклеотид и существенный ген.
Экспрессию экзогенного полинуклеотида определяют различными способами, например, путем ELISA, вестерн-блоттинга, радиоиммунных анализов, путем иммунопреципитации, путем анализа на биологическую активность белка или путем иммуноокрашивания белка с последующим FACS-анализом. В конкретном аспекте экспрессию экзогенного полинуклеотида определяют путем вестерн-блоттинга.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ EHV-1
"Вирус герпеса" или "вектор вируса герпеса" означает вид в семействе Herpesviridae отряда Herpesvirales.
Термин "вектор вируса герпеса лошадей" или "вирус герпеса лошадей" или "EHV" означает представителя семейства Herpesviridae, поражающего лошадей. На данный момент распознано восемь разных видов вирусов герпеса лошадей, пять из которых относятся к подсемейству альфа-герпесвирусов (EHV-1, EHV-3, EHV-4, EHV-8 и EHV-9), и три относятся к гамма-герпесвирусам (http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp Virus Taxonomy: 2015 Release EC 47, London, UK, July 2015; Email ratification 2016 (MSL #30).
Термин "лошадиный" или "лошадь" означает принадлежность к семейству лошадиных, включающему лошадей, ослов и зебр, предпочтительно лошадей. Кроме того, термин "лошадиный" или "лошадь" также охватывает гибриды представителей семейства лошадиных (например, мулов, лошаков и т.п.).
Термин "EHV-1" означает лошадиный альфа-герпесвирус 1, представителя подрода Varicellovirus рода альфа-герпесвирусов семейства Herpesviridae. Одной из стандартных последовательностей для EHV-1 является, например, штамм аЬ4 EHV-1 дикого типа (Номер доступа в Genbank AY665713.1) или RacH (Hubert 1996). В конкретном аспекте рекомбинантный вирус происходит из семейств Herpesviridae, таких, как EHV-1 или EHV-4, предпочтительно EHV-1.
Ген EHV-1 ORF43 кодирует капсидный белок, известный как VP23, который является компонентом межкапсомерного триплекса (Elizabeth A. R. Telford, et al, Journal of General Virology, 1998, 79, 1197-1203). В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность гена EHV-1 ORF43 показана как SEQ ID NO: 5.
Ген EHV-1 ORF54 кодирует белок, являющийся компонентом комплекса ДНК-геликаза-праймаза (Elizabeth A. R. Telford, et al, Journal of General Virology, 1998, 79, 1197-1203). В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность EHV-1 ORF54 ген показана как SEQ ID NO: 6.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ FMDV
"Вирус ящура" или "FMDV" относится к виду рода Aphthovirus семейства Picornaviridae.
Термин "белок Р1" означает белок-предшественник, который содержит 4 капсидных белка, VP4, VP2, VP3 и VP1. В процессе созревания белок Р1 расщепляется протеазой 3С на три белка, известных как VP0, VP1 и VP3. В вирионе белок VP0 затем расщепляется на два белка, VP4 и VP2. В одном варианте осуществления Нуклеотидная последовательность гена Р1 показана как SEQ ID NO: 1.
Термин "пептид 2А" означает саморасщепляющийся пептид и применяется в нескольких семействах вирусов, наиболее известным из которых является FMDV семейства Picornaviridae, для продуцирования множества полипептидов. В FMDV пептид 2А располагается на С-конце предшественника Р1-2А. В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность гена 2А показана как SEQ ID NO: 2.
Термин "протеаза 3С" означает фермент протеазу и эндопептидазу, находящийся в пикорнавирусе, который расщепляет пептидные связи нетерминальных последовательностей. Протеаза 3С располагается в предшественнике Р3 и может перерабатывать белок-предшественник Р1 в VP0 (предшественник VP4 и VP2), VP3 и VP1. В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность гена 3С показана как SEQ ID NO: 3.
Кассета Р1-2А-3С означает единую ORF, содержащую ген Р1 и ген 3С, связанные последовательностью, содержащей ген пептида 2А. В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность генной кассеты Р1-2А-3С показана как SEQ ID NO: 4.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ
"Иммуногенная или иммунологическая композиция" означает композицию из материала, включающего по меньшей мере один антиген или его иммуногенную часть, который обеспечивает иммунный ответ у хозяина, проявляющего клеточно- или антитело-опосредованный иммунный ответ на композицию.
Термин "антиген" применен авторами в общепринятом среди специалистов в данной области значении и охватывает вещества, которые являются иммуногенными, т.е., иммуногенами, а также вещества, вызывающие иммунологическую толерантность или анергию, т.е., отсутствие реакций со стороны защитных механизмов организма на чужеродные вещества. В контексте данного описания термин "антиген" означает белки полной длины, а также их пептидные фрагменты, содержащие или включающие эпитоп.
Термин "продовольственные животные" означает животных, которых человек использует в потребительских целях, таких, как свиньи, крупный рогатый скот, домашняя птица и т.п., предпочтительно продовольственные животные означают свиней и крупный рогатый скот, наиболее предпочтительно свиней. В частном аспекте настоящего изобретения "продовольственными животными" являются парнокопытные животные, включая крупный рогатый скот, овец, коз и свиней, предпочтительно свиньи.
"Иммуногенная композиция" в контексте данного описания относится к полипептиду или белку, такому, как, например, вирусный поверхностный белок, обеспечивающий иммунный ответ, как описывается авторами. Термин "иммуногенный фрагмент" или "иммуногенная часть" означает фрагмент или усеченную и/или замещенную форму белка или полипептида, которая включает один или несколько эпитопов и, таким образом, обеспечивает иммунный ответ, описываемый авторами. В целом такие усеченные и/или замещенные формы или фрагменты включают по меньшей мере шесть смежных аминокислот из белка полной длины. Такие фрагменты распознают, применяя множество технологий картирования эпитопов, известных специалистам в данной области. См., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. Например, линейные эпитопы могут определяться одновременным синтезированием большого количества пептидов на твердых подложках, пептидов, соответствующих частям белковой молекулы, и приведение пептидов в реакцию с антителами, тогда как пептиды остаются прикрепленными к подложкам. Такие технологии известны специалистам в данной области и описаны. См., например, Патент США №4,708,871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002; and Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23: 709 - 715. Подобным образом конформационные эпитопы легко распознаются путем определения пространственной конформации аминокислот, например, при помощи рентгеновской кристаллографии и двухмерного ядерного магнитного резонанса. См. выше Epitope Mapping Protocols. Синтетические антигены также охватываются этим определением, например, полиэпитопы, фланкирующие эпитопы и другие рекомбинантные или синтетически полученные антигены. См., например, Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23: 2777 - 2781; Bergmann et al. (1996), J. Immunol. 157: 3242-3249; Suhrbier, A. (1997), Immunol, and Cell Biol. 75: 402 - 408; и Gardner et al., (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, June 28 - July 3, 1998 (рекомендации и содержание которых включены в данное описание путем ссылки).
Термин "вакцина" в контексте данного описания относится к фармацевтической композиции, включающей по меньшей мере один иммунологически активный компонент, вызывающий иммунный ответ у животного и, возможно, но не обязательно, один или несколько дополнительных компонентов, повышающих иммунологическую активность активного компонента. Вакцина дополнительно может включать другие компоненты, типичные для фармацевтических композиций. В качестве отличительной особенности иммунологически активный компонент вакцины может включать частицы полного вируса в их исходной форме или в форме аттенюированных частиц в так называемой ослабленной живой вакцине (MLV) или частиц, инактивированных с применением соответствующих способов в так называемой убитой вакцине (KV). В другой форме иммунологически активный компонент вакцины может включать соответствующие элементы организмов (субъединичные вакцины), причем эти элементы генерируются путем разрушения всей частицы или культур для выращивания, содержащих такие частицы, с необязательным последующими этапами очистки, что дает на выходе нужную(ые) структуру(ы), или с применением процессов синтеза, включающих соответствующую манипуляцию путем использования подходящей системы, например, на основе бактерий, насекомых, млекопитающих или других видов, и с необязательными последующими процедурами изоляции и очистки, или путем вызывания синтетических процессов в организме животного, нуждающегося в вакцине, путем прямого включения генетического материала с использованием подходящих фармацевтических композиций (полинуклеотидная вакцинация). Вакцина может включать один или одновременно несколько описанных выше элементов. В пределах конкретных аспектов настоящего изобретения термин "вакцина" относится к живой вакцине или живому вирусу, которые также называются рекомбинантной вакциной. В другом конкретном аспекте настоящего изобретения термин "вакцина" относится к инактивированному или убитому вирусу, включая вирусоподобные частицы (VLP). Таким образом, вакцина может быть субъединичной вакциной или убитой (KV) или инактивированной вакциной.
"Фармацевтическая композиция" преимущественно состоит из одного или нескольких ингредиентов, способных модифицировать физиологические, например, иммунологические функции организма, в который ее вводят, или организмов, живущих в/на этом организме. Термин охватывает, помимо прочих, антибиотики или противопаразитарные средства, а также другие составляющие, которые обычно применяют для достижения определенных целей, к которым, помимо прочих, относятся технологические характеристики, стерильность, устойчивость, возможность введения композиции энтеральным или парентеральным путем, например, пероральным, интраназальным, втутривенным, внутримышечным, подкожным, внутрикожным или другим подходящим путем, переносимость после введения или характеристики контролируемого высвобождения. В одном неограничивающем примере такой фармацевтической композиции, представленном лишь в целях демонстрации, приготовление может осуществляться следующим образом: супернатант культуры инфицированных клеток смешивают со стабилизатором (например, спермидином и/или альбумином сыворотки крупного рогатого скота (BSA) и смесь затем лиофилизируют или обезвоживают другими способами. Перед вакцинацией смесь разводят в водных (например, солевом, фосфатно-буферном растворе (PBS)) или неводных растворах (например, масляной эмульсии, адъюванте на основе алюминия).
В контексте данного описания "приемлемый с фармацевтической или ветеринарной точки зрения носитель" включает любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, адъюванты, стабилизаторы, разбавители, консерванты, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические агенты, агенты, задерживающие адсорбцию, и т.п. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, в частности, в тех, которые включают лиофилизированные иммуногенные композиции, стабилизаторы для применения в соответствии с настоящим изобретением включают стабилизаторы для лиофилизации или сушки замораживанием.
В некоторых вариантах осуществления иммуногенная композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит адъювант."Адъюванты" в контексте данного описания могут включать гидроксид алюминия и фосфат алюминия, сапонины, например, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL), эмульсия типа "вода в масле", эмульсия типа "масло в воде", эмульсия типа "вода в масле в воде". Эмульсия, в частности, может быть на основе легкого вазелинового масла (согласно Европейской фармакопее); изопреноидного масла, такого, как сквалан или сквален; масла, образуемого в результате олигомеризации алкенов, в частности, изобутена или децена; сложных эфиров кислот или спиртов, содержащих линейную алкильную группу, в частности, растительных масел, этилолеата, пропиленгликольди-(каприлата / капрата), глицерилтри-(каприлата / капрата) или пропиленгликольдиолеата; сложных эфиров разветвленных жирных кислот или спиртов, в частности, сложных эфиров изостеариновой кислоты. Масло применяют в комбинации с эмульгаторами для образования эмульсии. Эмульгаторы предпочтительно являются неионными поверхностно-активными веществами, в частности, сложными эфирами сорбита, маннида (например, ангидроманнитолеатом), гликоля, полиглицерина, пропиленгликоля и олеиновой, изостеариновой, рициноленовой или гидроксистеариновой кислоты, которые необязательно являются этоксилированными, и сополимерными блоками полиоксипропилена-полиоксиэтилена, в частности, плюроники, в особенности L121. См. Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed. Stewart-Tull, D. E. S.), JohnWiley and Sons, NY, pp 51-94 (1995) и Todd et al., Vaccine 15: 564-570 (1997). Типичными адъювантами являются эмульсия SPT, описанная на странице 147 публикации "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" издательства M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995, и эмульсия MF59, описанная на странице 183 этой же книги.
Еще одним примером адъюванта является соединение, выбранное из числа полимеров акриловой или метакриловой кислоты и сополимеров малеинового ангидрида и производной алкенила. Предпочтительными адъювантными соединениями являются полимеры акриловой или метакриловой кислоты, сшитые, в частности, с полиалкениловыми эфирами Сахаров или многоатомных спиртов. Эти соединения известны как карбомеры (Phameuropa Vol.8, No. 2, June 1996). Специалисты в данной области также могут обратиться к Патенту США №2,909,462, в котором описываются такие акриловые полимеры, сшитые с полигидроксилированным соединением, имеющим по меньшей мере 3 гидроксильных группы, предпочтительно не более 8, причем атомы водорода по меньшей мере трех гидроксилов заменены на ненасыщенные алифатические радикалы, имеющие по меньшей мере 2 атомов углерода. Предпочтительными радикалами являются те, которые содержат от 2 до 4 атомов углерода, например, винилов, аллилов и других этилен-ненасыщенными группами. Ненасыщенные радикалы сами могут содержать другие заместители, такие, как метил. Продуктам, продаваемым под названием CARBOPOL®; (BF Goodrich, Ohio, США), отдают особенное предпочтение. Они сшиты с аллилсахарозой или с аллилпентаэритритом. Среди них можно упомянуть Carbopol 974Р, 934Р и 971Р. Наиболее предпочтительно применение CARBOPOL® 971Р. Среди сополимеров малеинового ангидрида и производной алкенила можно назвать сополимеры EMA (Monsanto), являющиеся сополимерами малеинового ангидрида и этилена. Растворение этих полимеров в воде ведет к образованию кислотного раствора, который подлежит нейтрализации, предпочтительно до физиологического уровня рН, с целью получения адъювантного раствора, в который включают саму иммуногенную, иммунологическую или вакцинную композицию.
К другим подходящим адъювантами относятся, помимо прочих, адъювантная система RIBI (Ribi Inc.), блоксополимер (CytRx, Atlanta GA), SAF-M (Chiron, Emeryville CA), монофосфорилированный липид А, липидно-аминный адъювант Avridine, термолабильный энтеротоксин из Е. coli (рекомбинантный или другой), холерный токсин, IMS 1314 или мурамилдипептид, или встречающиеся в природе или рекомбинантные цитокины или их аналоги или стимуляторы высвобождения эндогенного цитокина и др.
Адъювант добавляют в количестве от приблизительно 100 мкг до приблизительно 10 мг на дозу, предпочтительно в количестве от приблизительно 100 мкг до приблизительно 10 мг на дозу, более предпочтительно в количестве от приблизительно 500 мкг до приблизительно 5 мг на дозу, еще более предпочтительно в количестве от приблизительно 750 мкг до приблизительно 2,5 мг на дозу, наиболее предпочтительно - в количестве от приблизительно 1 мг на дозу. В альтернативном варианте адъювант может присутствовать в концентрации приблизительно от 0,01 до 50%, предпочтительно в концентрации приблизительно от 2% до 30%, более предпочтительно в концентрации приблизительно от 5% до 25%, еще более предпочтительно - в концентрации приблизительно от 7% до 22%, и наиболее предпочтительно в концентрации от 10% до 20% по объему готового продукта.
К "разбавителям" относятся вода, солевой раствор, декстроза, этанол, глицерин и т.п.К изотоническим агентам, помимо прочих, относятся хлорид натрия, декстроза, маннит, сорбит и лактоза. К стабилизаторам, помимо прочих, относятся альбумин и щелочные соли этилендиаминтетрауксусной кислоты.
"Выделенный" означает измененный "рукой человека" относительно природного состояния, т.е., если встречается в природе, то измененный или удаленный из природной среды, или и то, и другое. Например, полинуклеотид или полипептид, присутствующий в природе в живом организме, не является "выделенным", но тот же полинуклеотид или полипептид, отделенный от сопутствующих материалов его природного состояния, является "выделенным" в значении применяемого авторами термина.
СОСТАВЫ
Субъектом, которому вводят композицию, предпочтительно является животное, включая, помимо прочих, крупный рогатый скот, лошадей, овец, свиней, домашнюю птицу (например, кур), коз, кошек, собак, хомяков, мышей и крыс, причем наиболее предпочтительно животным является свинья.
Составы, согласно изобретению, включают эффективное иммунизирующее количество одной или нескольких иммуногенных композиций и физиологически приемлемую основу. Вакцины включают эффективное иммунизирующее количество одной или нескольких иммуногенных композиций и физиологически приемлемую основу. Составы должны соответствовать режиму введения.
Иммуногенная композиция в случае надобности также может содержать небольшое количество смачивающего средства или эмульгатора или рН-буферных средств. Иммуногенная композиция может быть жидким раствором, суспензией, эмульсией, таблеткой, пилюлей, капсулой, составом с замедленным высвобождением или порошком. Составы для перорального введения могут включать стандартные носители фармацевтического качества, такие, как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, натриевая соль сахарина, целлюлоза, карбонат магния и т.п.
СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ
Предпочтительные способы введения включают, помимо прочих, интраназальный, пероральный, внутрикожный и внутримышечный. Желательно введение с питьевой водой, наиболее предпочтительно единой дозой. Специалистам в данной области станет понятно, что композиции в соответствии с изобретением также могут вводиться одной, двумя или большим количеством доз, а также другими способами введения. Например, к таким другим способам относятся подкожный, внутрикожный, внутрибрюшинный, и, в зависимости от необходимой длительности и эффективности лечения, композиции в соответствии с изобретением вводят один или несколько раз, также периодически, например, раз в день в течение нескольких дней, недель или месяцев и в разных дозах, например, приблизительно от 103 до 108 TCID50 (см. вирусный титр выше).
Композиции в случае необходимости могут быть предусмотрены в упаковке или распределительном устройстве, которое может содержать одну или несколько единичных лекарственных форм, включающих активный ингредиент. Упаковка может состоять, например, из металлической фольги или пластиковой пленки, как, например, блистерная упаковка. Упаковка или распределительное устройство могут сопровождаться инструкциями по введению, предпочтительно по введению млекопитающим, в частности, свиньям. К упаковке может прилагаться информационная записка в форме, предписываемой правительственным органом, регулирующим производство, применение или продажу фармацевтических или биологических продуктов, в которой должно быть отражено, что производство, применение или продажа с целью введения человеку одобрены этим органом.
ОБЗОР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
В настоящем изобретении подробно раскрываются и описываются
следующие последовательности:
SEQ ID NO: 1 Нуклеотидная последовательность гена P1,
SEQ ID NO: 2 Нуклеотидная последовательность гена 2А,
SEQ ID NO: 3 Нуклеотидная последовательность гена 3С,
SEQ ID NO: 4 Нуклеотидная последовательность экспрессионной кассеты генов Р1-2А-3С,
SEQ ID NO: 5 Нуклеотидная последовательность гена EHV-1 ORF43,
SEQ ID NO: 6 Нуклеотидная последовательность гена EHV-1 ORF54,
SEQ ID NO: 7 Нуклеотидная последовательность сигнала polyA BGH,
SEQ ID NO: 8 Нуклеотидная последовательность кассеты CMV5-P12A3C2AORF43-BGH,
SEQ ID NO: 9 Нуклеотидная последовательность кассеты CMV5-P12A3C2AORF54-BGH,
SEQ ID NO: 10 Последовательность праймера, и
SEQ ID NO: 11 Последовательность праймера.
ПУНКТЫ
В настоящем изобретении описываются следующие пункты:
Настоящее изобретение предусматривает следующие пункты:
1. Рекомбинантный вирус, включающий экспрессионную кассету в геноме рекомбинантного вируса, причем экспрессионная кассета включает первый полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере один нужный полипептид, и второй полинуклеотид, являющийся существенным геном рекомбинантного вируса или его функциональным фрагментом, и первый полинуклеотид функционально связан со вторым полинуклеотидом, причем первый полинуклеотид располагается перед вторым полинуклеотидом, а вышеупомянутый второй полинуклеотид является единственной копией вышеупомянутого существенного гена или его функционального фрагмента, который активен в рекомбинантном вирусе.
2. Рекомбинантный вирус по пункту 1, отличающийся тем, что первый полинуклеотид и второй полинуклеотид находятся в пределах одной ORF.
3. Рекомбинантный вирус по пункту 1 или пункту 2, отличающийся тем, что второй полинуклеотид является эндогенным существенным геном рекомбинантного вируса.
4. Рекомбинантный вирус по пункту 1 или пункту 2, отличающийся тем, что второй полинуклеотид является экзогенным, а эндогенный существенный ген рекомбинантного вируса был сайленсирован.
5. Рекомбинантный вирус по любому из пунктов 1-4, отличающийся тем, что первый полинуклеотид кодирует антигенный полипептид или терапевтический полипептид.
6. Рекомбинантный вирус по пункту 5, отличающийся тем, что антигенный полипептид выбран из группы, к которой относятся антиген FMDV, антиген PRRSV, антиген DEV и антиген PRV, предпочтительно антиген FMDV.
7. Рекомбинантный вирус по любому из пунктов 1-4, отличающийся тем, что первый полинуклеотид включает ген Р1, ген 2А и ген 3С FMDV.
8. Рекомбинантный вирус по любому из пунктов 1-7, отличающийся тем, что рекомбинантный вирус происходит от вируса, выбранного из группы, к которой относятся семейство вирусов герпеса, таких, как лошадиный альфа-герпесвирус 1 (EHV-1), лошадиный альфа-герпесвируса 4 (EHV-4) и другие варицелловирусы, такие, как вирус инфекционного бульбарного паралича (PrV) и герпесвирус 1 крупного рогатого скота (BHV-1), аденовирусы (AdV), такие, как собачий аденовирус (CAdV), аденоассоциированные вирусы, лентивирусы, такие, как ретровирусы и поксвирусы.
9. Рекомбинантный вирус по пункту 8, отличающийся тем, что вирус является представителем семейства вирусов герпеса, предпочтительно рода альфа-герпесвирусов, более предпочтительно подрода варицелловирусов, наиболее предпочтительно лошадиным альфа-герпесвирусом 1 (EHV-1).
10. Рекомбинантный вирус по пункту 1, отличающийся тем, что рекомбинантный вирус происходит от EHV-1, и первый полинуклеотид включает ген Р1, ген 2А и ген 3С FMDV.
11. Рекомбинантный вирус по любому из пунктов 1-10, отличающийся тем, что существенный ген кодирует белок, выбранный из группы, к которой относятся а капсидный белок, связанный с репликацией ДНК белок, ДНК-геликаза, ДНК-репликаза, рецептор-связывающий реагент и связанный с эгрессом белок.
12. Рекомбинантный вирус по пункту 11, отличающийся тем, что рекомбинантный вирус происходит от EHV-1, первый полинуклеотид включает ген Р1, ген 2А и ген 3С FMDV, и существенным геном является ген EHV-1 ORF43 или ген EHV-1 ORF54.
13. Рекомбинантный вирус по любому из пунктов 1-12, отличающийся тем, что первый полинуклеотид связан со вторым полинуклеотидом через линкер.
14. Рекомбинантный вирус по пункту 13, отличающийся тем, что линкер может быть гибким линкером или геном 2А, предпочтительно геном 2А.
15. Рекомбинантный вирус по любому из пунктов 1-13, отличающийся тем, что первый полинуклеотид прямо связан со вторым полинуклеотидом.
16. Рекомбинантный вирус по любому из пунктов 1-15, отличающийся тем, что экспрессионная кассета также включает регуляторные элементы, такие, как промотор, предпочтительно промотор CMV5.
17. Рекомбинантный вирус по любому из пунктов 1-16, отличающийся тем, что экспрессионная кассета включает конструкт P1-2A-3C-2A-ORF43 или конструкт P1-2A-3C-2A-ORF54, предпочтительно конструкт CMV-P1-2A-3C-2A-ORF43-BGH или конструкт CMV-P1-2A-3C-2A-ORF54-BGH, более предпочтительно - конструкт CMV-P1-2A-3C-2A-ORF43-BGH, как показано в SEQ ID NO: 8, или конструкт CMV-P1-2A-3C-2A-ORF54-BGH, как показано в SEQ ID NO: 9.
18. Способ получения рекомбинантного вируса по любому из пунктов 1 -17, который включает построение экспрессионной кассеты в геноме рекомбинантного вируса, причем экспрессионная кассета включает первый полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере один нужный полипептид, и второй полинуклеотид, являющийся существенным геном рекомбинантного вируса или его функциональным фрагментом, и первый полинуклеотид функционально связан со вторым полинуклеотидом, причем первый полинуклеотид располагается перед вторым полинуклеотидом, а вышеупомянутый второй полинуклеотид является единственной копией вышеупомянутого существенного гена или его функционального фрагмента, который активен в рекомбинантном вирусе.
19. Способ повышения устойчивости экспрессии нужного полипептида в пределах рекомбинантного вируса, который включает построение экспрессионной кассеты в геноме рекомбинантного вируса, причем экспрессионная кассета включает первый полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере один нужный полипептид, и второй полинуклеотид, являющийся существенным геном рекомбинантного вируса или его функциональным фрагментом, и первый полинуклеотид функционально связан со вторым полинуклеотидом, причем первый полинуклеотид располагается перед вторым полинуклеотидом, а вышеупомянутый второй полинуклеотид является единственной копией вышеупомянутого существенного гена или его функционального фрагмента, который активен в рекомбинантном вирусе.
20. Способ по пункту 19, отличающийся тем, что первый полинуклеотид и второй полинуклеотид находятся в пределах одной ORF.
21. Способ по пункту 19 или пункту 20, отличающийся тем, что второй полинуклеотид является существенным геном, встречающимся в природе в геноме рекомбинантного вируса.
22. Способ по пункту 19 или пункту 20, отличающийся тем, что второй полинуклеотид является экзогенным, и существенный ген встречающегося в природе в геноме рекомбинантного вируса был сайленсирован.
23. Способ по любому из пунктов 19-22, отличающийся тем, что первый полинуклеотид кодирует антигенный полипептид или терапевтический полипептид.
24. Способ по пункту 23, отличающийся тем, что антигенный полипептид выбран из группы, к которой относятся антиген FMDV, антиген PRRSV, антиген DEV и антиген PRV, предпочтительно антиген FMDV.
25. Способ по любому из пунктов 19-22, отличающийся тем, что первый полинуклеотид включает ген Р1, ген 2А и ген 3С FMDV.
26. Способ по любому из пунктов 19-22, отличающийся тем, что рекомбинантный вирус происходит от вируса, выбранного из группы, к которой относятся вирусы герпеса, такие, как лошадиный альфа-герпесвирус 1 (EHV-1), лошадиный альфа-герпесвирус 4 (EHV-4) и другие варицелловирусы, такие, как вирус инфекционного бульбарного паралича (PrV) и герпесвирус 1 крупного рогатого скота (BHV-1), аденовирусы (AdV), такие, как собачий аденовирус (CAdV), аденоассоциированные вирусы, лентивирусы, такие, как ретровирусы и поксвирусы.
27. Способ по пункту 26, отличающийся тем, что вирус является представителем семейства вирусов герпеса, предпочтительно рода альфа-герпесвирусов, более предпочтительно - подрода варицелловирусов, наиболее предпочтительно - лошадиным альфа-герпесвирусом 1 (EHV-1).
28. Способ по пункту 19, отличающийся тем, что рекомбинантный вирус происходит от EHV-1, и первый полинуклеотид включает ген Р1, ген 2А и ген 3С FMDV.
29. Способ по любому из пунктов 19-28, отличающийся тем, что существенный ген кодирует белок, выбранный из группы, к которой относятся а капсидный белок, связанный с репликацией ДНК белок, ДНК-геликаза, ДНК-репликаза, рецептор-связывающий реагент и связанный с эгрессом белок.
30. Способ по пункту 29, отличающийся тем, что рекомбинантный вирус происходит от EHV-1, первый полинуклеотид включает ген Р1, ген 2А и ген 3С FMDV, и существенным геном является ген EHV-1 ORF43 или ген EHV-1 ORF54.
31. Способ по любому из пунктов 19-30, отличающийся тем, что первый полинуклеотид связан со вторым полинуклеотидом через линкер.
32. Способ по пункту 31, отличающийся тем, что линкер может быть гибким линкером или геном 2А, предпочтительно геном 2А.
33. Способ по любому из пунктов 19-30, отличающийся тем, что первый полинуклеотид прямо связан со вторым полинуклеотидом.
34. Способ по любому из пунктов 19-30, отличающийся тем, что экспрессионная кассета также включает другие регуляторные элементы, такие, как промотор, polyA и т.п., предпочтительно промотор, более предпочтительно промотор CMV5.
35. Способ по любому из пунктов 19-31, отличающийся тем, что экспрессионная кассета включает конструкт P1-2A-3C-2A-ORF43 или конструкт P1-2A-3C-2A-ORF54, предпочтительно конструкт CMV-P1-2A-3C-2A-ORF43-BGH или конструкт CMV-P1-2A-3C-2A-ORF54-BGH, предпочтительно конструкт CMV-P1-2A-3C-2A-ORF43-BGH, как показано в SEQ ID NO: 8, или конструкт CMV-P1-2A-3C-2A-ORF54-BGH, как показано в SEQ ID NO: 9.
36. Клетка-хозяин, включающая рекомбинантный вирус по любому из пунктов 1-17, предпочтительно клетка-хозяин представляет линию эукариотных клеток-хозяев; более предпочтительно линия клеток-хозяев является линией клеток млекопитающих или линией клеток насекомых; наиболее предпочтительно линия клеток-хозяев является линией клеток RK13, линией клеток MDBK, линией клеток ST, линией клеток AI-ST, линией клеток VERO, линией клеток Sf9, Sf21, линией клеток MDCK и/или их производными.
37. Способ получения клетки-хозяина по пункту 36, характеризующийся следующими этапами:
а. инфицирования линии клеток-хозяев рекомбинантным вирусом по любому из пунктов 1-17,
б. культивирования инфицированных клеток в соответствующих условиях, и
в. необязательно сбора вышеупомянутых клеток-хозяев.
38. Иммуногенная, фармацевтическая или вакцинная композиция, включающая:
а. рекомбинантный вирус по любому из пунктов 1-17 и/или
б. нужный полипептид, экспрессируемый рекомбинантным вирусом по любому из пунктов 1-17, и
б. необязательно приемлемый с фармацевтической или ветеринарной точки зрения носитель или эксципиент, причем предпочтительно вышеупомянутый носитель является подходящим для перорального, внутрикожного, внутримышечного или интраназального применения.
39. Способ получения иммуногенной, фармацевтической или вакцинной композиции, который включает следующие этапы:
а. инфицирования клетки-хозяина по пункту 36 рекомбинантным вирусом по любому из пунктов 1-17,
б. культивирования инфицированных клеток в соответствующих условиях,
в. сбора инфицированных клеток,
г. необязательно очистки клеток, собранных на этапе в), и
д. необязательно смешивания вышеупомянутых собранных клеток с фармацевтически приемлемым носителем.
40. Способ по пункту 39, отличающийся тем, что собранный материал представляет рекомбинантный вирус, вырабатываемый инфицированными клетками, или же собранный материал представляет нужный полипептид, экспрессируемый рекомбинантным вирусом.
41. Применение рекомбинантного вируса по любому из пунктов 1-17 при приготовлении иммуногенной, фармацевтической или вакцинной композиции для профилактики и/или лечения клинических признаков или болезни, вызванной инфицированием патогеном у животного, или для использования согласно способу лечения или профилактики инфицирования патогеном у животного, причем предпочтительно вышеупомянутое животное является продовольственным животным, таким, как свинья.
42. Рекомбинантный вирус по любому из пунктов 1-17 или иммуногенная, фармацевтическая или вакцинная композиция по пункту 38 для применения согласно способу снижения или предотвращения клинических признаков или болезни, вызванной инфицированием патогеном у животного, или для использования согласно способу лечения или профилактики инфицирования патогеном у животного, причем предпочтительно вышеупомянутое животное является продовольственным животным, таким, как свинья.
43. Способ иммунизации, лечения или профилактики животных, таких, как продовольственные животные, такие, как свиньи или крупный рогатый скот, от болезни, вызываемой патогеном у вышеупомянутого животного, причем вышеупомянутый способ включает этап введения животному рекомбинантного вируса по любому из пунктов 1-17 или иммуногенной, фармацевтической или вакцинной композиции по пункту 38.
44. Комплект для вакцинации животных, предпочтительно продовольственных животных, таких, как свиньи или крупный рогатый скот, от болезни, связанной с клиническими признаками, и/или снижение частоты или тяжести одного или нескольких клинических признаков, связанных с патогеном у животного или вызываемых им, который включает:
а. распределительное устройство, способное вводить рекомбинантный вирус по любому из пунктов 1-17 или иммуногенную, фармацевтическую или вакцинную композицию по пункту 38 вышеупомянутому животному;
б. рекомбинантный вирус по любому из пунктов 1-17 или иммуногенную, фармацевтическую или вакцинную композицию по пункту 38 и
в. необязательно листок-вкладыш с инструкцией.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
Следующие фигуры составляют часть данного описания и включены для дальнейшей демонстрации определенных аспектов настоящего изобретения. Изобретение дополнительно поясняется путем ссылки на одну или несколько этих фигур в комбинации с подробными описанием представленных авторами конкретных вариантов осуществления.
ФИГ. 1. Пояснение концепции транслокации существенного гена. А: существенный ген был удален и транслоцирован с геном-мишенью; и В: ген-мишень также может быть вставлен перед существенным геном в его первоначальной позиции.
ФИГ. 2. Построение кассеты FMDV Р12А3С.
ФИГ. 3. Поясняется процедура построения трансферной плазмиды. Ген-мишень Р12А3С синтезировали и клонировали в вектор pUC19-CMV5-ORF1/3-линкер, получая в результате pUC19-CMV5-P12A3C. Существенный ген EHV-1 ORF43 или ORF54 также был синтезирован и клонирован в pUC19-CMV5-Р12А3С с образованием в результате конечной трансферной плазмиды, которую использовали для образования рекомбинантного EHV-1.
ФИГ. 4. Результат гель-электрофореза CMV5-P12A3C2AORF43-BGH. Расщепление трансферной плазмиды рестрикционным ферментом I-CeuI. После расщепления фрагмент-мишень около 7 т.н. высвобождался и использовался для рекомбинации.
ФИГ. 5. Ген ORF43 или ORF54 удаляли из вектора EHV-1, и делеционный мутантный вирус был не способен реплицироваться in vitro. В качестве контроля дикого типа EHV-1 может быть легко спасен и успешно размножен через 2 дня после трансфекции. Поскольку спасенный вирус содержит ген EGFP, пятна демонстрируют зеленую флуоресценцию.
ФИГ. 6. Структура гена рекомбинантного EHV-1 с транслокацией гена ORF43. Ген ORF43 был удален с его первоначальной позиции и транслоцирован в позицию после гена FMDV Р12А3С.
ФИГ. 7. Подтверждение экспрессии белка FMDV и восстановления EHV-1 ORF71 при помощи IFA. Рекомбинантные вирусы с транслокацией EHV-1 ORF43 или ORF54 могут быть спасены после трансфекции. Экспрессия белка-мишени FMDV подтверждалась IFA. EHV-1 gp2 окрашивали для демонстрации присутствия пятен EHV-1.
ФИГ. 8. Серия рекомбинантных EHV-1 была построена по обычной схеме, но она не может устойчиво экспрессировать белок-мишень. (А) отрицательные пятна EHV-1 были обнаружены при помощи двойной IFA; (В) секвенирование отрицательных пятен показало случайные генетические изменения, включая однонуклеотидную делецию, в результате чего произошла внерамочная мутация последующих генов.
ФИГ. 9. Пояснение показательного результата двойной IFA, показывающего пятна, способные экспрессировать как белок-мишень FMDV, так и белки EHV-1.
ФИГ. 10. Обнаружение FMDV VLP из разных уровней пассажа рекомбинантных вирусов.
ФИГ. 11. А: Пояснение экспрессионной кассеты гена-мишени и расположения праймера;
В: Результаты ПЦР из разных уровней пассажа рекомбинантных вирусов.
ФИГ. 12. In vitro кинетика одиночного цикла роста рекомбинантного EHV-1 по сравнению с родительским EHV-1.
ПРИМЕРЫ
Представленные ниже примеры включены для демонстрации предпочтительных вариантов осуществления изобретения. Специалистам в данной области станет понятно, что технологии, раскрываемые в представленных ниже примерах, представляют технологии, которые, согласно выводам авторов изобретения, хорошо функционируют при практическом осуществлении изобретения и, таким образом, считаются предпочтительными режимами его практического осуществления. Однако специалистам в данной области, в свете представленного описания, станет понятной возможность многих изменений в описываемых частных вариантах осуществления при сохранении возможности получения подобного результата без отклонения от сути и объема изобретения.
В исследовании, если прямо не указано исключение, все использованные материалы выпускаются серийно и были закуплены у QIAGEN, Promega, Thermo Fisher и BIO-RAD.
ПРИМЕР 1: ПОСТРОЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО EHV-1 СОГЛАСНО ИЗОБРЕТЕНИЮ, КОТОРЫЙ СПОСОБЕН УСТОЙЧИВО ЭКСПРЕССИРОВАТЬ АНТИГЕНЫ FMDV
1.1 Построение экспрессионной кассеты гена Р1-2А-3С FMDV
Для экспрессии FMDV VLP строили экспрессионную кассету гена Р1-2А-3С, полученную из штамма FMDV серотипа О (GenBank ID: JN998085). В этом исследовании экспрессионная кассета гена Р1-2А-3С FMDV была химически синтезирована Genscript на основе нуклеотидных последовательностей гена Р1 (SEQ ID NO: 1), гена 2А (SEQ ID NO: 2) и гена 3С (SEQ ID NO: 3). Нуклеотидная последовательность синтетической экспрессионной кассеты гена Р1-2А-3С, используемой в исследовании, показана как SEQ ID NO: 4. Построение кассеты Р1-2А-3С поясняется на Фиг. 2.
1.2 Построение трансферных плазмид
В исследовании использовали трансферный вектор pUC19-CMV5-ORF1/3-линкер (Genscript), который содержит гомологичные фланкирующие участки для двухступенчатой Red-опосредованной рекомбинации, канамицин-устойчивый ген, а также промотор и сигнал BGH poly А.
Для образования трансферных плазмид ген Р1-2А-3С (SEQ ID NO: 4) вставляли в трансферный вектор в сайте ORF1/3. Затем ген ORF43 (SEQ ID NO: 5) и ген ORF54 (SEQ ID NO: 6) химически синтезировали и клонировали в позицию после гена Р1-2А-3С (SEQ ID NO: 4), получая в результате трансферные плазмиды pUC19-CMV5-P12A3C2AORF43 и pUC19-CMV5-P12A3C2AORF54, соответственно. Процедура построения трансферной плазмиды pUC19-CMV5-P12A3C2AORF43 поясняется на Фиг. 3.
Трансферные плазмиды расщепляли рестрикционным ферментом I-CeuI (NEB), при этом высвобождались два фрагмента около 7 т.н., содержащие CMV5-P12A3C2AORF43-BGH (SEQ ID NO. 8) и CMV5-P12A3C2AORF54-BGH (SEQ ID NO. 9), соответственно, которые затем очищали гелем (Invitrogen) и подтверждали путем гель-электрофореза. Высвобожденные фрагменты использовали для дальнейшей рекомбинации. Результат гель-электрофореза CMV5-P12A3C2AORF43-BGH поясняется на Фиг. 4.
1.3 Построение вирусного вектора EHV-1
Вакцинный штамм EHV-1 RacH (Patel, JR and Heldens, J, 2005) использовали в качестве вирусного вектора для экспрессии ген Р12А3С FMDV серотипа О в этом исследовании. Штамм RacH потерял свою вирулентность в природном хозяине, а именно, в организме лошади, и используется в качестве ослабленной живой вакцины (MLV) как в Европе, так и в США (Patel, JR and Heldens, J, 2005). Вирусный геном RacH строили как бактериальную искусственную хромосому (ВАС) путем замены большей части гена ORF71 (кодирующего gp2) на последовательность репликона mini-F и бакмиду обозначали как pRacH (Rudolph and Osterrieder, 2002, Virology 293, 2002, 356 -367; US7482441B2).
В этом исследовании существенные гены ген ORF43 и ген ORF54 удаляли из pRacH, соответственно, и pRacH с делетированным геном ORF43 (показан как EHV-1-delORF43 P1 на Фиг. 5) и pRacH с делетированным геном ORF54 (показанным как EHV-1-delORF54 P1 на Фиг. 5) распознавали путем анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ).
Путем трансфекции EHV-1-delORF43 P1 и EHV-1-delORF54 P1 в клетки MDBK было подтверждено, что делеционные мутанты не способны реплицироваться в культуре клеток. Результаты показаны ниже на Фиг. 5.
1.4 Построение рекомбинантного EHV-1 согласно изобретению Рекомбинантный EHV-1 в соответствии с изобретением строили с
применением стратегии двухступенчатой Red-опосредованной рекомбинации (Tischer BK et al, BioTechniques 2006 (40), 191-197). В частности, трансферные плазмиды, полученные на этапе 1.2, расщепляли для высвобождения фрагментов CMV5-P12A3C2AORF43-BGH (SEQ ID NO. 8) и CMV5-P12A3C2AORF54-BGH (SEQ ID NO. 9), соответственно. Два высвобожденных фрагмента электропорировали в компетентные клетки E.coli, содержащие EHV-1-delORF43 P1 и EHV-1-delORF54 P1, соответственно. Структура гена рекомбинантного вируса поясняется на Фиг. 6. Рекомбинантные клоны затем отбирали на планшетах с агаром Луриа-Бертани с двойной резистентностью к хлорамфениколу и канамицину. Рекомбинантную бакмидную ДНК извлекали и анализировали при помощи ПЦР и ПДРФ. На 2-м этапе рекомбинации Red использовали 1% арабинозу для вызывания экспрессии хоминг-эндонуклеазы I-SceI, что приводило к расщеплению сайта рестрикции I-SceI перед геном канамицина и в итоге к вырезанию канамициновой кассеты.
1.5 Спасение и очистка вируса
Для спасения рекомбинантного EHV-1 рекомбинантную бакмидную ДНК извлекали и трансфицировали в клетки MDBK (Sigma) в 6-луночном планшете с применением липофектамина 3000 (Thermo Fisher). После трансфекции клетки ежедневно наблюдали для проверки образования GFP-положительных и -отрицательных пятен. Трансфицированные клетки вместе с супернатантом культуры дважды замораживали и размораживали, осветляли путем центрифугирования и рекомбинантный вирус, определяемый как пассаж 1, хранили при -80°С для дальнейшего анализа. Предельное разведение или клонирование с помощью бляшкообразования выполняли для отделения GFP-отрицательного рекомбинантного вируса, при котором mini-F, содержащий ген EGFP, удаляли и недостающий ORF71 восстанавливали через механизм внутримолекулярной гомологичной рекомбинации. Каждый цикл предельного разведения распознавали как один пассаж.
ПРИМЕР 2: ЭКСПРЕССИЯ И ОБНАРУЖЕНИЕ БЕЛКА FMDV
2.1 IFA, центрифугирование в градиенте концентрации сахарозы и вестерн-блоттинг
Для подтверждения экспрессии белков FMDV выполняли анализ непрямой флуоресценции (IFA) с применением моноклонального антитела против FMDV VP1 (Jeno-Biotech, Cat#9172). Клетки MDBK инфицировали и накрывали слоем 1,5% метилцеллюлозы. Через три дня после инфицирования клетки промывали 1xPBS, фиксировали 4% формальдегидом, пропитывали 0,1% Trition Х-100 и окрашивали соответствующими антителами. Экспрессию белка FMDV подтверждали путем IFA (Фиг. 7).
Для вестерн-блоттинга сгустки инфицированных клеток подвергали лизису и смешивали с буфером для образца 4х LDS (Invitrogen) и 10х восстановителем Nupage (Invitrogen). После нагрева при 85°С в течение 5 мин белки разделяли на гелях NuPAGE (Invitrogen) и переносили на мембрану PVDF (Lifetech). После блокирования мембраны мембрану икубировали с mAb против FMDV VP1 (1-е антитело, Jeno-Biotech) в течение 1 ч, а затем с антителом против IgG мыши -HRP (2-е антитело, Santa-Cruz) в течение 1 ч после промывания. Изображение проявляли после нанесения мембраны с субстратом с максимальной чувствительностью SuperSignal West Femto (Thermo Scientific).
Для подтверждения образования FMDV VLP культуру инфицированных клеток предварительно осветляли путем центрифугирования и концентрировали путем ультрафильтрации с применением центробежного фильтра Amicon Ultra-15mL (Merk, Ultracel-100KDa), затем подвергали ультрацентрифугированию в градиенте концентрации сахарозы 10% - 60% в количестве 53,720 г в течение 22 ч при 10°С. Градиент сахарозы разделяли на 14 фракций сверху вниз. Белки в каждой фракции анализировали путем вестерн-блоттинга с применением mAb против FMDV VP1, как описано выше.
ПРИМЕР 3: ИССЛЕДОВАНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ ЭКСПРЕССИИ БЕЛКА FMDV
3.1 Ген Р1-2А-3С FMDV не может устойчиво экспрессироваться по обычной схеме
Различные рекомбинантные EHV-1 в качестве контрольных (с разными промоторами и инсерционными сайтами) строили по обычной схеме прямого включения гена FMDV Р1-2А-3С в вирусный вектор EHV-1. Результаты испытания генетической устойчивости различных рекомбинантных EHV-1 сведены ниже в таблице.
Как можно увидеть, при применении обычной схемы ген FMDV Р1-2А-3С не может устойчиво поддерживаться и склонен к потере экспрессии белка-мишень во время последовательных пассажей, как показывает двойная IFA (Фиг. 8А). Анализ секвенирования также показал наличие случайных делеций во вставке (Фиг. 8 В).
3.2 Транслокация существенного гена для решения проблемы генетической устойчивости
Для того, чтобы оценить, может ли белок FMDV устойчиво экспрессироваться рекомбинантным EHV-1 в соответствии с изобретением, рекомбинантный EHV-1 в соответствии с изобретением непрерывно пересеивали на клетках MDBK с MOI 0.01. После каждого пересеивания монослои свежих клеток MDBK инфицировали рекомбинантным вирусом с соответствующим разведением и накрывали слоем 1,5% метилцеллюлозы. Через три дня после инфицирования выполняли двойную IFA с использованием смеси mAb против FMDV VP1 и козьего pAb против EHV-1 (VMRD). Отдельные пятна исследовали под флуоресцентной микроскопией. Пятна, окрашенные обоими антителами FMDV VP1 и EHV-1, распознавали как положительные, а те, которые демонстрировали лишь окрашивание EHV-1, считались отрицательными. Показатель положительных пятен рассчитывали и сравнивали на разных уровнях пассажа. Показательные результаты двойной IFA показаны на Фиг. 9.
После каждого 5-го пассажа (Р5, Р10, Р15 и Р20) вирусную ДНК извлекали из инфицированных клеток и полную вставку подвергали ПЦР-амплификации (прямой праймер: taacaccatggcaggcctgttg (SEQ ID NO: 10), обратный праймер: gagcgattcgcacctcatctcc (SEQ ID NO: 11)) с использованием высокоточной pfx ДНК полимеразы Accuprime (Invitrogen). Продукт ПЦР затем секвенировали. Кроме того, экспрессию VLP обнаруживали, применяя центрифугирование в градиенте концентрации сахарозы и вестерн-блоттинг каждые 5 пассажей (Rational Engineering of Recombinant Picornavirus Capsids to Produce Safe, Protective Vaccine Antigen. PLOS Pathogens. 2013 Mar; 9(3):el003255.). Результаты FMDV VLP из разных уровней пассажа рекомбинантного EHV-1 были показаны на Фиг. 10.
Процент положительных на белок FMDV пятен от общего количества пятен EHV-1 был рассчитан и показан в Таблице 2. Результаты четко показывают, что белок FMDV может устойчиво экспрессироваться во время пассажа по меньшей мере до Р20.
Вирусную ДНК из каждых пяти пассажей извлекали из рекомбинантного EHV-1 и ПЦР применяли для амплификации полной вставки. Результаты показали, что целая вставка может быть амплифицирована без явной разницы в длине фрагментов (Фиг. 11), что указывает на отсутствие генетических изменений во время непрерывного пересеивания вируса. Продукт ПЦР также секвенировали, и генетических изменений не было обнаружено.
ПРИМЕР 4: IN VITRO КИНЕТИКА РОСТА РЕКОМБИНАНТНЫХ ВИРУСОВ
Для оценки свойств in vitro роста рекомбинантного вируса клетки MDBK в 24-луночных планшетах инфицировали родительским вирусом и рекомбинантным вирусом с MOI 5. После 2-часового связывания при 37°С клетки промывали цитратным буфером (рН 3,0). В разные моменты времени супернатант культуры собирали и титровали.
Кинетику одиночного цикла роста обоих рекомбинантных вирусов с транслокацией ORF43 или ORF54 определяли и сравнивали с родительским вирусом. Как можно увидеть на Фиг. 12, рекомбинантный вирус обладает сходной кинетикой роста с родительским вирусом и может достигать пикового титра через 36 ч после инфицирования, хотя пик приблизительно на 1 logTCID50/4m ниже, чем ожидавшийся для родительского вируса, поскольку экспрессия чужеродного белка влияет на рост вируса.
Из приведенных выше экспериментальных данных можно определить следующее: (1) по обычной схеме белок-мишень FMDV не может устойчиво экспрессироваться; (2) EHV-1 ORF43 или ORF54 являются существенными генами для репликации EHV-1; и (3) конструкты rEHV-1/FMD в соответствии с изобретением могут экспрессировать белок-мишень со значительно улучшенной устойчивостью при сохранении сравнимой с родительским EHV-1 способности к росту.
Все композиции и способы, раскрываемые и заявляемые авторами могут быть получены и осуществлены без лишних экспериментов в свете представленного описания. Хотя композиции и способы согласно данному изобретению описаны с точки зрения предпочтительных вариантов осуществления, специалистам в данной области станет понятно, что существует возможность видоизменений в композициях и способах и в этапах или в последовательности этапов описываемого авторами способа без отклонения от идеи, сущности и объема изобретения. Более конкретно, станет очевидно, что некоторые агенты, близкие как химически, так и физиологически, могут использоваться вместо описанных авторами агентов, и при этом будут достигаться те же или подобные результаты. Все эти подобные заместители и модификации, очевидные для специалистов в данной области, считаются такими, что охватываются сущностью, объемом и идеей изобретения, как определено в представленной ниже формуле изобретения.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> БЁРИНГЕР ИНГЕЛЬХАЙМ ВЕТМЕДИКА (ЧАЙНА) КО., ЛТД.
<120> РЕКОМБИНАНТНЫЙ ВИРУС, СПОСОБНЫЙ К УСТОЙЧИВОЙ ЭКСПРЕССИИ
БЕЛКОВ-МИШЕНЕЙ
<130> P20192930
<160> 11
<170> PatentIn версия 3.5
<210> 1
<211> 2205
<212> ДНК
<213> Вирус ящура
<400> 1
atgggagccg gacaatccag tccggctact gggtcacaga accaatcagg caacaccggg 60
agtatcatca acaattacta catgcagcag taccagaact ccatggacac ccaacttggt 120
gacaatgcta tcagcggagg ctccaacgag ggatccacag acacaacctc cacccacaca 180
accaacactc agaacaatga ctggttttca aagttggcca gctctgcctt cagcggtctt 240
ttcggcgccc tcctcgccga taagaaaacc gaggagacca ctcttctcga ggaccgcatc 300
ctcaccaccc gaaacggaca caccacctcg acaacccagt cgagtgttgg cataacgcac 360
gggtacgcaa cagctgagga ttttgtgaac gggccaaaca cctctggtct tgagaccaga 420
gttgtccagg cggaacggtt ctttaaaacc cacctgttcg actgggtcac cagtgatccg 480
ttcggacggt gctacttgtt ggagctcccg actgaccaca aaggtgtcta cggcagcctg 540
accgactcat acgcctacat gagaaacggt tgggatgttg aggtcaccgc tgtggggaat 600
cagttcaacg gaggctgcct actggtggcc atggtgcctg aactttgttc catcgagcgg 660
agagagctgt tccagcttac gctcttcccc caccagttca tcaacccccg gacgaacatg 720
acagcccaca tcaaggtgcc ctttgttggc gtcaaccgtt acgatcagta caaggtacac 780
aagccgtgga cccttgtggt tatggtcgta gccccactga ctgtcaacac cgaaggcgct 840
ccgcagatca aggtgtatgc caacatcgca cccaccaacg tgcacgtcgc gggtgagttc 900
ccttccaaag aggggatttt ccctgtggcc tgtagcgacg gttatggcgg cttggtgaca 960
actgacccaa agacggctga ccccgtttac ggcaaagtgt tcaacccccc ccgcaacatg
1020
ttgccggggc ggttcaccaa cctcctggac gtggctgagg cttgccccac gtttctgcac
1080
ttcgatggtg acgtaccgta tgtgaccact aagacggatt cggacagggt gctcgcacaa
1140
tttgacttgt ctttggcagc aaaacacatg tcaaacacct tccttgcagg tcttgcccag
1200
tactacacgc agtacagcgg caccgtcaac ctgcacttca tgttcacagg tcccactgac
1260
gcgaaagcgc gttacatgat tgcgtatgcc cctccgggca tggagccgcc caaaacacct
1320
gaggctgctg ctcactgcat tcacgcagag tgggacacgg gtctgaactc aaagtttacc
1380
tttccatcc cctacctctc ggcggctgat tacgcgtaca ccgcgtctga cgctgctgag 1440
accacaaatg ttcagggatg ggtctgctta tttcaaataa cacacgggaa agctgagggt
1500
gacgctcttg tcgtgctggc cagtgctggc aaagactttg agctgcgcct gcctgtggac
1560
gctcggcaac agaccacttc gacgggcgag tcggctgacc ccgtgactgc caccgttgag
1620
aattacggtg gcgagacaca ggtccagagg cgccaccaca cagacgtctc attcatattg
1680
gacagatttg tgaaagtcac accaaaagac tcaataaatg tattggacct gatgcagacc
1740
ccctcccaca ccctagtagg ggcgctcctc cgcactgcca cttactattt cgctgatcta
1800
gaggtggcag tgaaacacga gggggacctt acctgggtgc caaatggagc acctgaagca
1860
gccttggaca acaccaccaa cccaacggcg taccataagg cgccgcttac tcggcttgca
1920
ttgccctaca cggcaccaca ccgtgttttg gccaccgttt acaacgggaa ctgcaaatac
1980
gccgggggct cactgcccaa cgtgagaggc gatctccaag tgctggctca gaaggcagcg
2040
aggccgctgc ctacttcttt caactacggt gccatcaaag ccactcgggt gacagaactg
2100
ctgtaccgca tgaagagggc cgagacgtac tgtcctcggc ccctcttggc tgttcacccg
2160
agtgcggcca gacacaaaca gaaaatagtg gcgcctgtaa agcag 2205
<210> 2
<211> 54
<212> ДНК
<213> Вирус ящура
<400> 2
tccttgaact ttgatctgct caagttggca ggggacgtgg agtccaaccc tggg 54
<210> 3
<211> 642
<212> ДНК
<213> Вирус ящура
<400> 3
agtggtgccc ccccgaccga cttgcaaaag atggtcatgg gtaacaccaa gcccgttgag 60
ctcatactcg acgggaagac agtagccatc tgctgtgcta ctggagtatt tggcactgcc 120
tacctcgtgc ctcgtcatct tttcgctgag aagtacgaca agatcatgtt ggacggtaga 180
accatgacag acagtgacta cagagtgttt gagtttgaga ttaaagtaaa aggacaggac 240
atgctctcag acgctgcgct catggtgctg caccgtggga accgcgtgag agacatcacg 300
aaacactttc gtgacacagc aagaatgaag aaaggcaccc ccgtcgttgg tgtgatcaac 360
aacgctgacg tcgggagact gattttctca ggtgaggccc tcacctacaa ggacattgta 420
gtgtgcatgg atggagacac catgccgggc ctatttgcct acaaagccgc caccaaagct 480
ggctactgcg ggggagccgt ccttgctaag gatggagccg acacattcat cgttggcact 540
cactctgcag gtggcaatgg agttgggtac tgctcatgcg tatccagatc catgctccaa 600
aaaatgaagg cacacatcga ccctgaacca caccacgagt aa 642
<210> 4
<211> 2985
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Экспрессионная кассета генов P1-2A-3C
<400> 4
atgggagccg gacaatccag tccggctact gggtcacaga accaatcagg caacaccggg 60
agtatcatca acaattacta catgcagcag taccagaact ccatggacac ccaacttggt 120
gacaatgcta tcagcggagg ctccaacgag ggatccacag acacaacctc cacccacaca 180
accaacactc agaacaatga ctggttttca aagttggcca gctctgcctt cagcggtctt 240
ttcggcgccc tcctcgccga taagaaaacc gaggagacca ctcttctcga ggaccgcatc 300
ctcaccaccc gaaacggaca caccacctcg acaacccagt cgagtgttgg cataacgcac 360
gggtacgcaa cagctgagga ttttgtgaac gggccaaaca cctctggtct tgagaccaga 420
gttgtccagg cggaacggtt ctttaaaacc cacctgttcg actgggtcac cagtgatccg 480
ttcggacggt gctacttgtt ggagctcccg actgaccaca aaggtgtcta cggcagcctg 540
accgactcat acgcctacat gagaaacggt tgggatgttg aggtcaccgc tgtggggaat 600
cagttcaacg gaggctgcct actggtggcc atggtgcctg aactttgttc catcgagcgg 660
agagagctgt tccagcttac gctcttcccc caccagttca tcaacccccg gacgaacatg 720
acagcccaca tcaaggtgcc ctttgttggc gtcaaccgtt acgatcagta caaggtacac 780
aagccgtgga cccttgtggt tatggtcgta gccccactga ctgtcaacac cgaaggcgct 840
ccgcagatca aggtgtatgc caacatcgca cccaccaacg tgcacgtcgc gggtgagttc 900
ccttccaaag aggggatttt ccctgtggcc tgtagcgacg gttatggcgg cttggtgaca 960
actgacccaa agacggctga ccccgtttac ggcaaagtgt tcaacccccc ccgcaacatg
1020
ttgccggggc ggttcaccaa cctcctggac gtggctgagg cttgccccac gtttctgcac
1080
ttcgatggtg acgtaccgta tgtgaccact aagacggatt cggacagggt gctcgcacaa
1140
tttgacttgt ctttggcagc aaaacacatg tcaaacacct tccttgcagg tcttgcccag
1200
tactacacgc agtacagcgg caccgtcaac ctgcacttca tgttcacagg tcccactgac
1260
gcgaaagcgc gttacatgat tgcgtatgcc cctccgggca tggagccgcc caaaacacct
1320
gaggctgctg ctcactgcat tcacgcagag tgggacacgg gtctgaactc aaagtttacc
1380
ttttccatcc cctacctctc ggcggctgat tacgcgtaca ccgcgtctga cgctgctgag
1440
accacaaatg ttcagggatg ggtctgctta tttcaaataa cacacgggaa agctgagggt
1500
gacgctcttg tcgtgctggc cagtgctggc aaagactttg agctgcgcct gcctgtggac
1560
gctcggcaac agaccacttc gacgggcgag tcggctgacc ccgtgactgc caccgttgag
1620
aattacggtg gcgagacaca ggtccagagg cgccaccaca cagacgtctc attcatattg
1680
gacagatttg tgaaagtcac accaaaagac tcaataaatg tattggacct gatgcagacc
1740
ccctcccaca ccctagtagg ggcgctcctc cgcactgcca cttactattt cgctgatcta
1800
gaggtggcag tgaaacacga gggggacctt acctgggtgc caaatggagc acctgaagca
1860
gccttggaca acaccaccaa cccaacggcg taccataagg cgccgcttac tcggcttgca
1920
ttgccctaca cggcaccaca ccgtgttttg gccaccgttt acaacgggaa ctgcaaatac
1980
gccgggggct cactgcccaa cgtgagaggc gatctccaag tgctggctca gaaggcagcg
2040
aggccgctgc ctacttcttt caactacggt gccatcaaag ccactcgggt gacagaactg
2100
ctgtaccgca tgaagagggc cgagacgtac tgtcctcggc ccctcttggc tgttcacccg
2160
agtgcggcca gacacaaaca gaaaatagtg gcgcctgtaa agcagtcctt gaactttgat
2220
ctgctcaagt tggcagggga cgtggagtcc aaccctgggc ccggatctgg aggaccttac
2280
gagggaccgg tgaagaagcc tgtcgctttg aaagtgaaag ctaagaactt gatcgtcact
2340
gagagtggtg cccccccgac cgacttgcaa aagatggtca tgggtaacac caagcccgtt
2400
gagctcatac tcgacgggaa gacagtagcc atctgctgtg ctactggagt atttggcact
2460
gcctacctcg tgcctcgtca tcttttcgct gagaagtacg acaagatcat gttggacggt
2520
agaaccatga cagacagtga ctacagagtg tttgagtttg agattaaagt aaaaggacag
2580
gacatgctct cagacgctgc gctcatggtg ctgcaccgtg ggaaccgcgt gagagacatc
2640
acgaaacact ttcgtgacac agcaagaatg aagaaaggca cccccgtcgt tggtgtgatc
2700
aacaacgctg acgtcgggag actgattttc tcaggtgagg ccctcaccta caaggacatt
2760
gtagtgtgca tggatggaga caccatgccg ggcctatttg cctacaaagc cgccaccaaa
2820
gctggctact gcgggggagc cgtccttgct aaggatggag ccgacacatt catcgttggc
2880
actcactctg caggtggcaa tggagttggg tactgctcat gcgtatccag atccatgctc
2940
caaaaaatga aggcacacat cgaccctgaa ccacaccacg agtaa 2985
<210> 5
<211> 945
<212> ДНК
<213> Вирус герпеса лошадей 1
<400> 5
atggcgagtg ccgcctttga gattgacatc ctactgccca gtgacctatc tcccgctgac 60
ctgtcagctc ttcaaaaatg cgagggtaag cttgtgtttt tgaccgctct gcgtcgtcgc 120
gtgatgctct ccagcgtcac cctctcgtca tactatgtca acggcgcacc cccggacacg 180
ctatccctga tggcggcgtt tcgtaggcgt tttcccgcta taatacagcg cgtgctgccc 240
aacaaaatga tagccgccgc cctgggagtc gcaccgcttc ctcccggggc gttcatacag 300
aacacaggcc cgtttgacct gtgcaacggg gactctgtgt gcgcgctgcc tcccattttg 360
gacgtggagg acaagctgcg cctaggatct gtgggcgagg aaatactatt tccgctgacc 420
gttccactcg cgcaagcgcg cgaactcatc gcgcggctgg tagcgcgcgc ggtgcaggct 480
ctcaccccaa acgcccaggc ccagcgcgga gcggaggtga tgttttacaa cggacgaaag 540
tacaacgtga ccccggatct cagacaccga gacgccgtta acggcgtggc gcggtctctg 600
gtgctaaaca tgatttttgc catgaacgag ggatcgcttg tgctgctctc gctgatacca 660
aacctgctca ccctgggaac ccaggacgga tttgtgaacg ccataatcca gatgggaagc 720
gccacccgtg aggttggcca gctcgtccac cagcagcccg tgccccaacc gcaggacggc 780
gctcgccgct tttgtgtgta cgacgctctg atgtcatgga tcagcgttgc ctcgcgtctt 840
ggtgacgtgg tcggtgggaa acccttggtg cggatctgta cgttcgaggg ccaggctacg 900
atttcccgcg gcgagaaggc ccctgtcatt caaacgcttt tgtaa 945
<210> 6
<211> 2256
<212> ДНК
<213> Вирус герпеса лошадей 1
<400> 6
atggagggca gcgtcgaatg gtttaacgga catgtttgtg ctaccagtat ttactctcta 60
tggacagatc cgcaccaccc agggcatctt caggcgctcg tctacatgct gtgtcggcgc 120
ggtagcgact acaccgcaga gttttgtcac gttcccgtct cgggcgaact cttgaaacgc 180
ggagctcgcg acgcatctct ggtaacaccg gcgcgcgttg ccagcgccgc gcagaccgcg 240
gctgtgcctg ggtgctggcc cctggctccc ctgggaaacg ccatgttgtg gaaatccgtc 300
tacggtggca taacggcggc gcttaagcgc gccgtgggaa gctttgcttt ctatcaaccc 360
ctggtgttag gaattaacac gcaaactgga cttttagtta ccctccgacc cgccgcgtct 420
gcgggtgaag gcggtggcga ccacgtctct ccgcgggcgg cgatcgtaaa tgtgtcggtg 480
gaggtagact tggacccagc gggcattgaa gcgagcgcgg ctagctccac aggatcgtct 540
ctcgccaggg ccagactctg cacgcttcga gatggatatt ttctctcaaa gcgggacatt 600
gccctagaag ttgagatcgc tacaaaggag gtttcatttt acagaaagta tgactctgtg 660
caacagcctg ccaacaagcg tcgcggcgac atggcagatt tgttcgtcgt gcacgaacga 720
acccttttgc tagggggatg taaacgaatg ggagttaagg ttctattgcc gcgaacgttt 780
gactgtttag ttgccagctc ccagtcagtg tcgggtttag ctgccatggc gctgtacaaa 840
cagtggcacg ctactctatt ctctgtagag ctaccagata ctgttgtgca aatttttgct 900
tacctagggc cagaattaaa cccgtgtgga gaggaagtcg actattgttg ctttgttgga 960
tttcccggac tcccgaccct caaggctagt tcgagcacca cggaggctgt gcgcgatgca
1020
atggccgcct atagactgtc cgacgggctg tggccggctc taggtatgag cgcgtttcac
1080
tttttggctc catgggaccc ggaagacagg tggcccggtg aatcggaggc aaaacgggta
1140
gagggggcgg tacacaggct tcagcttgga accgaggatg attggggggc tgggcgggta
1200
tcatgcattt tagagtcgga cgctgtaatg caggggccgt ggttcgcaaa gtttgacttt
1260
tcggcgtttt tccccacgct gtacctgttg ctgtttcccg ccaatgagcg cttggctgag
1320
gtggttagat tgagggcacg tggccaacac cccaccctta agctcgcctt ggtatccttt
1380
tttggggggc tgcagcacat caaccccgta gcctataggt ccatcatagc cctatccaac
1440
ggaatcagta agcggctgga gcacgaagtc aatcagaggg gttttgccat ctgtacatat
1500
gtcaaagatg gcttttgggg ggcagccgga aatctgccat cagactctgt atcctacgcc
1560
gacgcgctgg tttacgcaga ggagctaaga agcgccgctc agaaggcggc cctcggacac
1620
gtgtccgaga tggggttttc gctgccggag ggtgtccact tgaatttgcg gctggagggt
1680
ttgtttacag acgccatctc gtggtccacc cactgttact ggttgtacaa ccgcttcacc
1740
aagatggaag actttgtagg cttccccgcc aagagcgggg ccggcagagc cgcgaaggcg
1800
agcttgtctg ccttgctacc gctggtagcc gcggtatgcg actctagcga tatgagcacc
1860
ctccatcagt ctgtgcgggg ggcctgcgaa cagctggtag ccggcgcttt tgccgagcgc
1920
aacaacccgc agttttggag taccaggacg gggatcgagt cgtctacgct actccccccg
1980
gcagtttaca ggaacggcag cttgctcgac agagactgtg ggcagaggga aattgtgttg
2040
actcgcaaac acgactgtga atccccatcg cccgtaccct ggacgctctt cccaccaccc
2100
ttggttttgg ggcgcattga ctgtatggtc tatcttacgt ccattttcaa aacttatcta
2160
agcatgttaa acagagcaat atctgcctcg tgcgacgcgg atgaatctat gaatgtggac
2220
tttccaatct ctgattatgc atttttattt acctaa 2256
<210> 7
<211> 225
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Сигнал polyA BGH
<400> 7
gtcacctaaa tgctagagct cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat 60
ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc 120
tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg 180
ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agaca 225
<210> 8
<211> 4947
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кассета CMV5-P12A3C2AORF43-BGH
<400> 8
ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt 60
tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac 120
gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg 180
ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag 240
tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tagcatatgc caagtacgcc 300
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420
gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480
tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540
aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600
ggtctatata agcagagctc cgcgtggccg gccggatccg ccaccatggg agccggacaa 660
tccagtccgg ctactgggtc acagaaccaa tcaggcaaca ccgggagtat catcaacaat 720
tactacatgc agcagtacca gaactccatg gacacccaac ttggtgacaa tgctatcagc 780
ggaggctcca acgagggatc cacagacaca acctccaccc acacaaccaa cactcagaac 840
aatgactggt tttcaaagtt ggccagctct gccttcagcg gtcttttcgg cgccctcctc 900
gccgataaga aaaccgagga gaccactctt ctcgaggacc gcatcctcac cacccgaaac 960
ggacacacca cctcgacaac ccagtcgagt gttggcataa cgcacgggta cgcaacagct
1020
gaggattttg tgaacgggcc aaacacctct ggtcttgaga ccagagttgt ccaggcggaa
1080
cggttcttta aaacccacct gttcgactgg gtcaccagtg atccgttcgg acggtgctac
1140
ttgttggagc tcccgactga ccacaaaggt gtctacggca gcctgaccga ctcatacgcc
1200
tacatgagaa acggttggga tgttgaggtc accgctgtgg ggaatcagtt caacggaggc
1260
tgcctactgg tggccatggt gcctgaactt tgttccatcg agcggagaga gctgttccag
1320
cttacgctct tcccccacca gttcatcaac ccccggacga acatgacagc ccacatcaag
1380
gtgccctttg ttggcgtcaa ccgttacgat cagtacaagg tacacaagcc gtggaccctt
1440
gtggttatgg tcgtagcccc actgactgtc aacaccgaag gcgctccgca gatcaaggtg
1500
tatgccaaca tcgcacccac caacgtgcac gtcgcgggtg agttcccttc caaagagggg
1560
attttccctg tggcctgtag cgacggttat ggcggcttgg tgacaactga cccaaagacg
1620
gctgaccccg tttacggcaa agtgttcaac cccccccgca acatgttgcc ggggcggttc
1680
accaacctcc tggacgtggc tgaggcttgc cccacgtttc tgcacttcga tggtgacgta
1740
ccgtatgtga ccactaagac ggattcggac agggtgctcg cacaatttga cttgtctttg
1800
gcagcaaaac acatgtcaaa caccttcctt gcaggtcttg cccagtacta cacgcagtac
1860
agcggcaccg tcaacctgca cttcatgttc acaggtccca ctgacgcgaa agcgcgttac
1920
atgattgcgt atgcccctcc gggcatggag ccgcccaaaa cacctgaggc tgctgctcac
1980
tgcattcacg cagagtggga cacgggtctg aactcaaagt ttaccttttc catcccctac
2040
ctctcggcgg ctgattacgc gtacaccgcg tctgacgctg ctgagaccac aaatgttcag
2100
ggatgggtct gcttatttca aataacacac gggaaagctg agggtgacgc tcttgtcgtg
2160
ctggccagtg ctggcaaaga ctttgagctg cgcctgcctg tggacgctcg gcaacagacc
2220
acttcgacgg gcgagtcggc tgaccccgtg actgccaccg ttgagaatta cggtggcgag
2280
acacaggtcc agaggcgcca ccacacagac gtctcattca tattggacag atttgtgaaa
2340
gtcacaccaa aagactcaat aaatgtattg gacctgatgc agaccccctc ccacacccta
2400
gtaggggcgc tcctccgcac tgccacttac tatttcgctg atctagaggt ggcagtgaaa
2460
cacgaggggg accttacctg ggtgccaaat ggagcacctg aagcagcctt ggacaacacc
2520
accaacccaa cggcgtacca taaggcgccg cttactcggc ttgcattgcc ctacacggca
2580
ccacaccgtg ttttggccac cgtttacaac gggaactgca aatacgccgg gggctcactg
2640
cccaacgtga gaggcgatct ccaagtgctg gctcagaagg cagcgaggcc gctgcctact
2700
tctttcaact acggtgccat caaagccact cgggtgacag aactgctgta ccgcatgaag
2760
agggccgaga cgtactgtcc tcggcccctc ttggctgttc acccgagtgc ggccagacac
2820
aaacagaaaa tagtggcgcc tgtaaagcag tccttgaact ttgatctgct caagttggca
2880
ggggacgtgg agtccaaccc tgggcccgga tctggaggac cttacgaggg accggtgaag
2940
aagcctgtcg ctttgaaagt gaaagctaag aacttgatcg tcactgagag tggtgccccc
3000
ccgaccgact tgcaaaagat ggtcatgggt aacaccaagc ccgttgagct catactcgac
3060
gggaagacag tagccatctg ctgtgctact ggagtatttg gcactgccta cctcgtgcct
3120
cgtcatcttt tcgctgagaa gtacgacaag atcatgttgg acggtagaac catgacagac
3180
agtgactaca gagtgtttga gtttgagatt aaagtaaaag gacaggacat gctctcagac
3240
gctgcgctca tggtgctgca ccgtgggaac cgcgtgagag acatcacgaa acactttcgt
3300
gacacagcaa gaatgaagaa aggcaccccc gtcgttggtg tgatcaacaa cgctgacgtc
3360
gggagactga ttttctcagg tgaggccctc acctacaagg acattgtagt gtgcatggat
3420
ggagacacca tgccgggcct atttgcctac aaagccgcca ccaaagctgg ctactgcggg
3480
ggagccgtcc ttgctaagga tggagccgac acattcatcg ttggcactca ctctgcaggt
3540
ggcaatggag ttgggtactg ctcatgcgta tccagatcca tgctccaaaa aatgaaggca
3600
cacatcgacc ctgaaccaca ccacgagggg ttgatcgttg acaccagaga tgtggaagag
3660
cgcgtgcacg tcatgcgcaa gaccaagggt acctccttga actttgatct cctcaagttg
3720
gcaggggacg tagagtccaa cccagggcct atggcgagtg ccgcctttga gattgacatc
3780
ctactgccca gtgacctatc tcccgctgac ctgtcagctc ttcaaaaatg cgagggtaag
3840
cttgtgtttt tgaccgctct gcgtcgtcgc gtgatgctct ccagcgtcac cctctcgtca
3900
tactatgtca acggcgcacc cccggacacg ctatccctga tggcggcgtt tcgtaggcgt
3960
tttcccgcta taatacagcg cgtgctgccc aacaaaatga tagccgccgc cctgggagtc
4020
gcaccgcttc ctcccggggc gttcatacag aacacaggcc cgtttgacct gtgcaacggg
4080
gactctgtgt gcgcgctgcc tcccattttg gacgtggagg acaagctgcg cctaggatct
4140
gtgggcgagg aaatactatt tccgctgacc gttccactcg cgcaagcgcg cgaactcatc
4200
gcgcggctgg tagcgcgcgc ggtgcaggct ctcaccccaa acgcccaggc ccagcgcgga
4260
gcggaggtga tgttttacaa cggacgaaag tacaacgtga ccccggatct cagacaccga
4320
gacgccgtta acggcgtggc gcggtctctg gtgctaaaca tgatttttgc catgaacgag
4380
ggatcgcttg tgctgctctc gctgatacca aacctgctca ccctgggaac ccaggacgga
4440
tttgtgaacg ccataatcca gatgggaagc gccacccgtg aggttggcca gctcgtccac
4500
cagcagcccg tgccccaacc gcaggacggc gctcgccgct tttgtgtgta cgacgctctg
4560
atgtcatgga tcagcgttgc ctcgcgtctt ggtgacgtgg tcggtgggaa acccttggtg
4620
cggatctgta cgttcgaggg ccaggctacg atttcccgcg gcgagaaggc ccctgtcatt
4680
caaacgcttt tgtaatctag atagagggcc ctattctata gtgtcaccta aatgctagag
4740
ctcgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc
4800
ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg
4860
aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg
4920
acagcaaggg ggaggattgg gaagaca 4947
<210> 9
<211> 6258
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кассета CMV5-P12A3C2AORF54-BGH
<400> 9
ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt 60
tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac 120
gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg 180
ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag 240
tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tagcatatgc caagtacgcc 300
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420
gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480
tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540
aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600
ggtctatata agcagagctc cgcgtggccg gccggatccg ccaccatggg agccggacaa 660
tccagtccgg ctactgggtc acagaaccaa tcaggcaaca ccgggagtat catcaacaat 720
tactacatgc agcagtacca gaactccatg gacacccaac ttggtgacaa tgctatcagc 780
ggaggctcca acgagggatc cacagacaca acctccaccc acacaaccaa cactcagaac 840
aatgactggt tttcaaagtt ggccagctct gccttcagcg gtcttttcgg cgccctcctc 900
gccgataaga aaaccgagga gaccactctt ctcgaggacc gcatcctcac cacccgaaac 960
ggacacacca cctcgacaac ccagtcgagt gttggcataa cgcacgggta cgcaacagct
1020
gaggattttg tgaacgggcc aaacacctct ggtcttgaga ccagagttgt ccaggcggaa
1080
cggttcttta aaacccacct gttcgactgg gtcaccagtg atccgttcgg acggtgctac
1140
ttgttggagc tcccgactga ccacaaaggt gtctacggca gcctgaccga ctcatacgcc
1200
tacatgagaa acggttggga tgttgaggtc accgctgtgg ggaatcagtt caacggaggc
1260
tgcctactgg tggccatggt gcctgaactt tgttccatcg agcggagaga gctgttccag
1320
cttacgctct tcccccacca gttcatcaac ccccggacga acatgacagc ccacatcaag
1380
gtgccctttg ttggcgtcaa ccgttacgat cagtacaagg tacacaagcc gtggaccctt
1440
gtggttatgg tcgtagcccc actgactgtc aacaccgaag gcgctccgca gatcaaggtg
1500
tatgccaaca tcgcacccac caacgtgcac gtcgcgggtg agttcccttc caaagagggg
1560
attttccctg tggcctgtag cgacggttat ggcggcttgg tgacaactga cccaaagacg
1620
gctgaccccg tttacggcaa agtgttcaac cccccccgca acatgttgcc ggggcggttc
1680
accaacctcc tggacgtggc tgaggcttgc cccacgtttc tgcacttcga tggtgacgta
1740
ccgtatgtga ccactaagac ggattcggac agggtgctcg cacaatttga cttgtctttg
1800
gcagcaaaac acatgtcaaa caccttcctt gcaggtcttg cccagtacta cacgcagtac
1860
agcggcaccg tcaacctgca cttcatgttc acaggtccca ctgacgcgaa agcgcgttac
1920
atgattgcgt atgcccctcc gggcatggag ccgcccaaaa cacctgaggc tgctgctcac
1980
tgcattcacg cagagtggga cacgggtctg aactcaaagt ttaccttttc catcccctac
2040
ctctcggcgg ctgattacgc gtacaccgcg tctgacgctg ctgagaccac aaatgttcag
2100
ggatgggtct gcttatttca aataacacac gggaaagctg agggtgacgc tcttgtcgtg
2160
ctggccagtg ctggcaaaga ctttgagctg cgcctgcctg tggacgctcg gcaacagacc
2220
acttcgacgg gcgagtcggc tgaccccgtg actgccaccg ttgagaatta cggtggcgag
2280
acacaggtcc agaggcgcca ccacacagac gtctcattca tattggacag atttgtgaaa
2340
gtcacaccaa aagactcaat aaatgtattg gacctgatgc agaccccctc ccacacccta
2400
gtaggggcgc tcctccgcac tgccacttac tatttcgctg atctagaggt ggcagtgaaa
2460
cacgaggggg accttacctg ggtgccaaat ggagcacctg aagcagcctt ggacaacacc
2520
accaacccaa cggcgtacca taaggcgccg cttactcggc ttgcattgcc ctacacggca
2580
ccacaccgtg ttttggccac cgtttacaac gggaactgca aatacgccgg gggctcactg
2640
cccaacgtga gaggcgatct ccaagtgctg gctcagaagg cagcgaggcc gctgcctact
2700
tctttcaact acggtgccat caaagccact cgggtgacag aactgctgta ccgcatgaag
2760
agggccgaga cgtactgtcc tcggcccctc ttggctgttc acccgagtgc ggccagacac
2820
aaacagaaaa tagtggcgcc tgtaaagcag tccttgaact ttgatctgct caagttggca
2880
ggggacgtgg agtccaaccc tgggcccgga tctggaggac cttacgaggg accggtgaag
2940
aagcctgtcg ctttgaaagt gaaagctaag aacttgatcg tcactgagag tggtgccccc
3000
ccgaccgact tgcaaaagat ggtcatgggt aacaccaagc ccgttgagct catactcgac
3060
gggaagacag tagccatctg ctgtgctact ggagtatttg gcactgccta cctcgtgcct
3120
cgtcatcttt tcgctgagaa gtacgacaag atcatgttgg acggtagaac catgacagac
3180
agtgactaca gagtgtttga gtttgagatt aaagtaaaag gacaggacat gctctcagac
3240
gctgcgctca tggtgctgca ccgtgggaac cgcgtgagag acatcacgaa acactttcgt
3300
gacacagcaa gaatgaagaa aggcaccccc gtcgttggtg tgatcaacaa cgctgacgtc
3360
gggagactga ttttctcagg tgaggccctc acctacaagg acattgtagt gtgcatggat
3420
ggagacacca tgccgggcct atttgcctac aaagccgcca ccaaagctgg ctactgcggg
3480
ggagccgtcc ttgctaagga tggagccgac acattcatcg ttggcactca ctctgcaggt
3540
ggcaatggag ttgggtactg ctcatgcgta tccagatcca tgctccaaaa aatgaaggca
3600
cacatcgacc ctgaaccaca ccacgagggg ttgatcgttg acaccagaga tgtggaagag
3660
cgcgtgcacg tcatgcgcaa gaccaagggt acctccttga actttgatct cctcaagttg
3720
gcaggggacg tagagtccaa cccagggcct atggagggca gcgtcgaatg gtttaacgga
3780
catgtttgtg ctaccagtat ttactctcta tggacagatc cgcaccaccc agggcatctt
3840
caggcgctcg tctacatgct gtgtcggcgc ggtagcgact acaccgcaga gttttgtcac
3900
gttcccgtct cgggcgaact cttgaaacgc ggagctcgcg acgcatctct ggtaacaccg
3960
gcgcgcgttg ccagcgccgc gcagaccgcg gctgtgcctg ggtgctggcc cctggctccc
4020
ctgggaaacg ccatgttgtg gaaatccgtc tacggtggca taacggcggc gcttaagcgc
4080
gccgtgggaa gctttgcttt ctatcaaccc ctggtgttag gaattaacac gcaaactgga
4140
cttttagtta ccctccgacc cgccgcgtct gcgggtgaag gcggtggcga ccacgtctct
4200
ccgcgggcgg cgatcgtaaa tgtgtcggtg gaggtagact tggacccagc gggcattgaa
4260
gcgagcgcgg ctagctccac aggatcgtct ctcgccaggg ccagactctg cacgcttcga
4320
gatggatatt ttctctcaaa gcgggacatt gccctagaag ttgagatcgc tacaaaggag
4380
gtttcatttt acagaaagta tgactctgtg caacagcctg ccaacaagcg tcgcggcgac
4440
atggcagatt tgttcgtcgt gcacgaacga acccttttgc tagggggatg taaacgaatg
4500
ggagttaagg ttctattgcc gcgaacgttt gactgtttag ttgccagctc ccagtcagtg
4560
tcgggtttag ctgccatggc gctgtacaaa cagtggcacg ctactctatt ctctgtagag
4620
ctaccagata ctgttgtgca aatttttgct tacctagggc cagaattaaa cccgtgtgga
4680
gaggaagtcg actattgttg ctttgttgga tttcccggac tcccgaccct caaggctagt
4740
tcgagcacca cggaggctgt gcgcgatgca atggccgcct atagactgtc cgacgggctg
4800
tggccggctc taggtatgag cgcgtttcac tttttggctc catgggaccc ggaagacagg
4860
tggcccggtg aatcggaggc aaaacgggta gagggggcgg tacacaggct tcagcttgga
4920
accgaggatg attggggggc tgggcgggta tcatgcattt tagagtcgga cgctgtaatg
4980
caggggccgt ggttcgcaaa gtttgacttt tcggcgtttt tccccacgct gtacctgttg
5040
ctgtttcccg ccaatgagcg cttggctgag gtggttagat tgagggcacg tggccaacac
5100
cccaccctta agctcgcctt ggtatccttt tttggggggc tgcagcacat caaccccgta
5160
gcctataggt ccatcatagc cctatccaac ggaatcagta agcggctgga gcacgaagtc
5220
aatcagaggg gttttgccat ctgtacatat gtcaaagatg gcttttgggg ggcagccgga
5280
aatctgccat cagactctgt atcctacgcc gacgcgctgg tttacgcaga ggagctaaga
5340
agcgccgctc agaaggcggc cctcggacac gtgtccgaga tggggttttc gctgccggag
5400
ggtgtccact tgaatttgcg gctggagggt ttgtttacag acgccatctc gtggtccacc
5460
cactgttact ggttgtacaa ccgcttcacc aagatggaag actttgtagg cttccccgcc
5520
aagagcgggg ccggcagagc cgcgaaggcg agcttgtctg ccttgctacc gctggtagcc
5580
gcggtatgcg actctagcga tatgagcacc ctccatcagt ctgtgcgggg ggcctgcgaa
5640
cagctggtag ccggcgcttt tgccgagcgc aacaacccgc agttttggag taccaggacg
5700
gggatcgagt cgtctacgct actccccccg gcagtttaca ggaacggcag cttgctcgac
5760
agagactgtg ggcagaggga aattgtgttg actcgcaaac acgactgtga atccccatcg
5820
cccgtaccct ggacgctctt cccaccaccc ttggttttgg ggcgcattga ctgtatggtc
5880
tatcttacgt ccattttcaa aacttatcta agcatgttaa acagagcaat atctgcctcg
5940
tgcgacgcgg atgaatctat gaatgtggac tttccaatct ctgattatgc atttttattt
6000
acctaatcta gatagagggc cctattctat agtgtcacct aaatgctaga gctcgctgat
6060
cagcctcgac tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt
6120
ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat
6180
cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg
6240
gggaggattg ggaagaca 6258
<210> 10
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 10
taacaccatg gcaggcctgt tg 22
<210> 11
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 11
gagcgattcg cacctcatct cc 22
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| СЛИТЫЕ БЕЛКИ FMDV-E2 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2016 |
|
RU2714428C2 |
| ВАКЦИНЫ ПРОТИВ FMDV НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНОГО АДЕНОВИРУСНОГО ВЕКТОРА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2017 |
|
RU2725495C2 |
| ДНК-ПЛАЗМИДЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ ПОВЫШЕННОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ И СТАБИЛЬНОСТЬЮ | 2007 |
|
RU2456346C2 |
| ИММУНОГЕНЫ ДЛЯ ВАКЦИНАЦИИ ПРОТИВ ВИЧ | 2013 |
|
RU2648791C2 |
| ПЛАЗМИДА БЕЗ УСТОЙЧИВОСТИ К АНТИБИОТИКУ | 2010 |
|
RU2548809C2 |
| НУКЛЕИНОКИСЛОТНЫЕ И АМИНОКИСЛОТНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ АДЕНОВИРУСА ОБЕЗЬЯН, ВЕКТОРЫ, СОДЕРЖАЩИЕ УКАЗАННЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2010 |
|
RU2604815C2 |
| СИСТЕМА ДЛЯ УВЕЛИЧЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ВЕКТОР, СОДЕРЖАЩИЙ УКАЗАННУЮ СИСТЕМУ | 2010 |
|
RU2577971C2 |
| ВАКЦИНА ПРОТИВ ВИРУСА ЗАПАДНО-НИЛЬСКОЙ ЛИХОРАДКИ | 2002 |
|
RU2283138C2 |
| РЕКОМБИНАНТНЫЕ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ВИРУСА "СИНЕГО ЯЗЫКА", ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2011 |
|
RU2575599C2 |
| РЕКОМБИНАНТНЫЕ ВЕКТОРЫ HVT, ЭКСПРЕССИРУЮЩИЕ АНТИГЕНЫ ПАТОГЕНОВ ПТИЦ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2012 |
|
RU2620936C2 |
Настоящее изобретение относится к биотехнологии, а именно к молекулярной биологии. Предложен рекомбинантный вирус, обеспечивающий стабильную экспрессию антигена FMDV. Рекомбинантный вирус включает экспрессионную кассету в геноме рекомбинантного вируса. Экспрессионная кассета включает первый полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере один нужный полипептид, и второй полинуклеотид, являющийся существенным геном рекомбинантного вируса или его функциональным фрагментом. Первый полинуклеотид функционально связан со вторым полинуклеотидом, причем первый полинуклеотид располагается перед вторым полинуклеотидом, а вышеупомянутый второй полинуклеотид является единственной копией вышеупомянутого существенного гена или его функционального фрагмента, который активен в рекомбинантном вирусе. Предложен способ повышения устойчивости экспрессии антигена FMDV в пределах рекомбинантного вируса, а также клетка-хозяин, включающая рекомбинантный вирус, обеспечивающая стабильную экспрессию антигена FMDV. Изобретение позволяет устойчиво экспрессировать белки-мишени. 3 н. и 19 з.п. ф-лы, 12 ил., 2 табл., 4 пр.
1. Рекомбинантный вирус обеспечивающий стабильную экспрессию антигена FMDV, включающий экспрессионную кассету в геноме рекомбинантного вируса, причем экспрессионная кассета включает первый полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере один нужный полипептид, и второй полинуклеотид, являющийся существенным геном рекомбинантного вируса или его функциональным фрагментом, и первый полинуклеотид функционально связан со вторым полинуклеотидом, причем первый полинуклеотид располагается перед вторым полинуклеотидом, а вышеупомянутый второй полинуклеотид является единственной копией вышеупомянутого существенного гена или его функционального фрагмента, который активен в рекомбинантном вирусе.
2. Рекомбинантный вирус по п. 1, отличающийся тем, что первый полинуклеотид и второй полинуклеотид находятся в пределах одной ORF.
3. Рекомбинантный вирус по п. 1 или 2, отличающийся тем, что:
(i) второй полинуклеотид является эндогенным существенным геном рекомбинантного вируса; или
(ii) второй полинуклеотид является экзогенным, а эндогенный существенный ген рекомбинантного вируса был сайленсирован.
4. Рекомбинантный вирус по любому из пунктов 1-3, отличающийся тем, что первый полинуклеотид кодирует антигенный полипептид или терапевтический полипептид; предпочтительно антигенный полипептид выбран из группы, к которой относятся антиген FMDV, антиген PRRSV, антиген DEV и антиген PRV; более предпочтительно антигенный полипептид является антигеном FMDV; и наиболее предпочтительно - первый полинуклеотид включает ген Р1, ген 2А и ген 3С FMDV.
5. Рекомбинантный вирус по любому из пунктов 1-4, отличающийся тем, что рекомбинантный вирус происходит от вируса, выбранного из группы, к которой относятся семейство вирусов герпеса, предпочтительно рода альфа-герпесвирусов, таких, как лошадиный альфа-герпесвирус 1 (EHV-1), лошадиный альфа-герпесвирус 4 (EHV-4) и другие варицелловирусы, такие, как вирус инфекционного бульбарного паралича (PrV) и герпесвирус 1 крупного рогатого скота (BHV-1), аденовирусы (AdV), такие, как собачий аденовирус (CAdV), аденоассоциированные вирусы, лентивирусы, такие, как ретровирусы и поксвирусы.
6. Рекомбинантный вирус по любому из пунктов 1-5, отличающийся тем, что существенный ген кодирует белок, выбранный из группы, к которой относятся а капсидный белок, связанный с репликацией ДНК белок, ДНК-геликаза, ДНК-репликаза, рецептор-связывающий реагент и связанный с эгрессом белок.
7. Рекомбинантный вирус по любому из пунктов 1-6, отличающийся тем, что рекомбинантный вирус происходит от EHV-1, и первый полинуклеотид включает ген Р1, ген 2А и ген 3C FMDV; и предпочтительно рекомбинантный вирус происходит от EHV-1, первый полинуклеотид включает ген Р1, ген 2А и ген 3С FMDV, и существенным геном является ген EHV-1 ORF43 или ген EHV-1 ORF54.
8. Рекомбинантный вирус по любому из пунктов 1-7, отличающийся тем, что:
(i) первый полинуклеотид связан со вторым полинуклеотидом через линкер; предпочтительно линкер может быть гибким линкером или геном 2А FMDV, предпочтительно геном 2А FMDV; или
(ii) первый полинуклеотид прямо связан со вторым полинуклеотидом.
9. Рекомбинантный вирус по любому из пунктов 1-8, отличающийся тем, что экспрессионная кассета также включает регуляторные элементы, такие, как промотор, предпочтительно промотор CMV5.
10. Рекомбинантный вирус по любому из пунктов 1-9, отличающийся тем, что экспрессионная кассета включает конструкт PI-2A-3C-2A-ORF43 или конструкт P1-2A-3C-2A-ORF54, предпочтительно конструкт CMV-P1-2A-3C-2A-ORF43-BGH или конструкт CMV-P1-2A-3C-2A-ORF54-BGH, более предпочтительно конструкт CMV-P1-2A-3C-2A-ORF43-BGH, как показано в SEQ ID NO: 8, или конструкт CMV-P1-2A-3C-2A-ORF54-BGH, как показано в SEQ ID NO: 9.
11. Способ повышения устойчивости экспрессии антигена FMDV в пределах рекомбинантного вируса, который включает построение экспрессионной кассеты в геноме рекомбинантного вируса, причем экспрессионная кассета включает первый полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере один нужный полипептид, и второй полинуклеотид, являющийся существенным геном рекомбинантного вируса или его функциональным фрагментом, и первый полинуклеотид функционально связан со вторым полинуклеотидом, причем первый полинуклеотид располагается перед вторым полинуклеотидом, а вышеупомянутый второй полинуклеотид является единственной копией вышеупомянутого существенного гена или его функционального фрагмента, который активен в рекомбинантном вирусе.
12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что первый полинуклеотид и второй полинуклеотид находятся в пределах одной ORF.
13. Способ по п. 11 или 12, отличающийся тем, что:
(i) второй полинуклеотид является существенным геном, встречающимся в природе в геноме рекомбинантного вируса; или
(ii) второй полинуклеотид является экзогенным, и существенный ген встречающегося в природе в геноме рекомбинантного вируса был сайленсирован.
14. Способ по любому из пунктов 11-13, отличающийся тем, что
первый полинуклеотид кодирует антигенный полипептид или терапевтический полипептид; предпочтительно антигенный полипептид выбран из группы, к которой относятся антиген FMDV, антиген PRRSV, антиген DEV и антиген PRV; более предпочтительно антигенный полипептид является антигеном FMDV; и наиболее предпочтительно - первый полинуклеотид включает ген Р1, ген 2А и ген 3С FMDV.
15. Способ по любому из пунктов 11-14, отличающийся тем, что рекомбинантный вирус происходит от вируса, выбранного из группы, к которой относятся семейство вирусов герпеса, предпочтительно рода альфа-герпесвирусов, таких, как лошадиный альфа-герпесвирус 1 (EHV-1), лошадиный альфа-герпесвирус 4 (EHV-4) и другие варицелловирусы, такие, как вирус инфекционного бульбарного паралича (PrV) и герпесвирус 1 крупного рогатого скота (BHV-1), аденовирусы (AdV), такие, как собачий аденовирус (CAdV), аденоассоциированные вирусы, лентивирусы, такие, как ретровирусы и поксвирусы.
16. Способ по любому из пунктов 11-15, отличающийся тем, что существенный ген кодирует белок, выбранный из группы, к которой относятся а капсидный белок, связанный с репликацией ДНК белок, ДНК-геликаза, ДНК-репликаза, рецептор-связывающий реагент и связанный с эгрессом белок.
17. Способ по любому из пунктов 11-16, отличающийся тем, что рекомбинантный вирус происходит от EHV-1, и первый полинуклеотид включает ген Р1, ген 2А и ген 3С FMDV; предпочтительно рекомбинантный вирус происходит от EHV-1, первый полинуклеотид включает ген Р1, ген 2А и ген 3С FMDV, и существенным геном является ген EHV-1 ORF43 или ген EHV-1 ORF54.
18. Способ по любому из пунктов 11-17, отличающийся тем, что:
(i) первый полинуклеотид связан со вторым полинуклеотидом через линкер; предпочтительно линкер может быть гибким линкером или геном 2А, предпочтительно геном 2А; или
(ii) первый полинуклеотид прямо связан со вторым полинуклеотидом.
19. Способ по любому из пунктов 11-18, отличающийся тем, что
экспрессионная кассета также включает другие регуляторные элементы, такие, как промотор, polyA и т.п., предпочтительно промотор, более предпочтительно - промотор CMV5.
20. Способ по любому из пунктов 11-19, отличающийся тем, что экспрессионная кассета включает конструкт P1-2A-3C-2A-ORF43 или конструкт P1-2A-3C-2A-ORF54, предпочтительно конструкт CMV-P1-2A-3C-2A-ORF43-BGH или конструкт CMV-P1-2A-3C-2A-ORF54-BGH, предпочтительно конструкт CMV-P1-2A-3C-2A-ORF43-BGH, как показано в SEQ ID NO: 8, или конструкт CMV-P1-2A-3C-2A-ORF54-BGH, как показано в SEQ ID NO: 9.
21. Клетка-хозяин, включающая рекомбинантный вирус, обеспечивающая стабильную экспрессию антигена FMDV по любому из пп. 1-10.
22. Клетка-хозяин по п. 21, в которой клетка представляет линию эукариотических клеток-хозяев, выбранную из группы, состоящей из линии клеток-хозяев, которая является линией клеток млекопитающих или линией клеток насекомых, которая является линией клеток RK13, линией клеток MDBK, линией клеток ST, линией клеток AI-ST, линией клеток VERO, линией клеток Sf9, Sf21, линией клеток MDCK и/или их производными.
| CN 101444622 A, 03 June 2009 | |||
| Рогулька для ровничной машины | 1959 |
|
SU136651A1 |
| QIAN Ping et al | |||
| Переносная печь для варки пищи и отопления в окопах, походных помещениях и т.п. | 1921 |
|
SU3A1 |
| Способ изготовления электрических сопротивлений посредством осаждения слоя проводника на поверхности изолятора | 1921 |
|
SU19A1 |
| Переносная печь для варки пищи и отопления в окопах, походных помещениях и т.п. | 1921 |
|
SU3A1 |
| McGregor, | |||
