МАТРИКС АДГЕЗИОННЫЙ БИОАКТИВНЫЙ ДЛЯ РАБОТЫ С КУЛЬТУРАМИ КЛЕТОК И СПОСОБ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2024 года по МПК A61K35/16 A61K47/36 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно обработке посуды для выращивания культур клеток эукариот. Предложен способ обработки культуральной посуды, повышающий скорость адгезии клеток. Предлагаемый способ включает предобработку посуды клетками эмбриональной рабдомиосаркомы человека, с последующим покрытием её композицией на основе биополимеров и везикулярных факторов роста. Предлагаемая композиция включает хитозан, обогащённый микровезикулами, выделенными из эмбриональной сыворотки КРС путём соосаждения, а также коллаген.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Клеточная адгезия, т.е. связывание клеток с внеклеточным матриксом, другими клетками или специфической поверхностью, является необходимым условием выживания и роста клеток, а также их взаимодействия между собой. Процесс адгезии включает ряд молекулярно-биологических событий, таких как трёхмерная пространственная реорганизация цитоскелета, изменения гомеостаза и экспрессии поверхностных маркеров. Раковые клетки, а в особенности клетки метастазирующих опухолей, считаются обладающими повышенными способностями к адгезии, которые, среди прочего, обуславливают их способность к миграции в пределах организма. В связи с этим, исследования клеточной адгезии зачастую используются для характеризации метастатической активности клеток.

Таким образом, формирование гибко настраиваемых, воспроизводимых условий для клеточной адгезии in vitro является необходимым для исследования биологии клетки, особенно в областях, связанных с изучением стволовых клеток и онкологических заболеваний.

Существуют различные способы обработки лабораторной посуды, обеспечивающие повышение адгезии клеток, которые могут быть условно разделены на физические, химические и биологические. Каждый из этих способов воздействует на свою сторону процесса клеточной адгезии, и в настоящее время считается устоявшимся мнение о том, что наиболее благоприятные условия для культур клеток могут быть достигнуты только использованием комбинированных подходов. Так, заявляемый способ можно считать наиболее близким к сочетанию химических и биологических методов.

Физические способы в основном заключаться в модификации поверхности лабораторной посуды без изменения её состава - например, путём придания ей определённой степени гидрофобности, шершавости или даже формирования упорядоченного микрорельефа. Химические способы заключаются в обработке культуральной посуды различными веществами, такими как синтетические соединения (полилизин), биополимеры (коллаген) или биогенные многокомпонентные смеси (матригель). Биологические методы включают регуляцию метаболизма клеток, обеспечивающие бесперебойную работу белков адгезии, например, путём введения в культуральную среду кофакторов работы таких белков.

При этом поиск новых решений в области стимуляции клеточной адгезии остаётся актуальным, т.к., несмотря на широту спектра существующих методов, они не лишены определённых недостатков, ограничивающих их применение.

Коллаген является наиболее известным материалом для формирования адгезивного покрытия культуральной посуды, что обусловлено его ролью, как основного белка, формирующего межклеточную среду в организме. Обработка культуральной посуды коллагеном известна со второй половины XX века и активно используется в настоящее время.

Так, известны способы выращивания кератиноцитов кожи на твердом покрытии, обработанном коллагеном и на нитроцеллюлозных подложках, предварительно обсеянных корнеальными клетками КРС (DOI:10.1111/1523-1747.ер12540324). Обработка коллагеном может быть достигнута путём выращивания на посуде клеток и её повторного использования. Именно такой подход приведен в описанном способе в части, касающейся обработки нитроцеллюлозных подложек. Также существуют технологии выращивания высокочувствительных клеточных линий на т.н. питающем слое, состоящем из более жизнеспособных клеток, однако подобные технологии относятся к иной области техники, нежели заявляемый способ.

Обширный опыт работы с коллагеновыми покрытиями для исследовательских целей позволил адаптировать данные технологии и для медицинского применения.

Известен способ получения покрытия на основе коллагена, включающий нанесение водной дисперсии коллагена на различные поверхности, в том числе на поверхности имплантов, где нанесение проводят путём аэрозольного распыления. При этом для удаления остаточного количества растворителя из получаемого покрытия осуществляют его термообработку при температуре, не превышающей температуру денатурации коллагена, формируя покрытие из отдельных микрокапель, не образующих сплошного слоя. Этим достигается сохранение фибриллярной структуры коллагена, что позволяет фибробластам организма пациента эффективно закрепляться на поверхности импланта. (RU 2730839 С1).

Такие способы создают двухмерную поверхность, которая предоставляет основные условия способствующие закреплению на ней клеток. Зачастую они используются для культивирования фибробластов и кератиноцитов, т.е. клеток тех тканей, которые содержат большие количества коллагена. Однако, для высокочувствительных к структуре поверхности клеточных линий, эти условия могут оставаться недостаточными для обеспечения всей полноты физиологических условий. В связи с этим учёными разрабатываются всё новые способы, основанные на поперечном связывании молекул коллагена с различными соединениями, придающими поверхности желаемые свойства.

Так, известен способ создания композитного материала путём формирования поперечных связок из молекул глутарового альдегида между желатином и силиконом. Такой материал обладает желаемым уровнем гидрофобности, что позволяет эффективно использовать его для культивирования клеток сосудистого эндотелия. При этом было продемонстрировано, что увеличение концентрации глутарового альдегида (до определённого порога) увеличивает эффективность покрытия и повышает адгезию эндотелиоцитов, что свидетельствует о ведущей роли поперечных связок между молекулами в его биологической активности. (DOI: 10.1290/1071-2690(2002)038<0487:GCOSRT>2.0.CO;2).

Недостатком таких носителей, имеющих в основе поперечно сшитые молекулы биоразлагаемых полимеров, является происходящее при биодеградации высвобождение глутаральдегида, оказывающего токсическое действие на клетки, вызывающего развитие непредвиденных побочных эффектов при лабораторных исследованиях и осложнений при выполнении лечебных мероприятий. В связи с этим, появляются новые способы, основанные на использовании других методов поперечного сшивания молекул, с использованием иных связующих соединений или иных физико-химических принципов. Данные способы, однако, также не лишены недостатков.

Известен способ покрытия силиконовой поверхности коллагеном, отличающийся тем, что в нём используются силиконовые изделия, функционализированные аминогруппами. При этом в качестве связывающего агента используется аскорбиновая кислота, формирующая поперечные сшивки между аминогруппами в молекуле коллагена и аминогруппами на поверхности изделия (DOI: 10.1098/rsif.2017.0318). За счёт использования аскорбиновой кислоты вместо глутарового альдегида, авторам удалось в первые трое суток культивирования достичь значительного (до 2-4 раз) повышения численности стволовых клеток жировой ткани человека, высеянных на посуду, обработанную таким образом, по сравнению с посудой, обработанной аналогичным способом, но с использованием глутарового альдегида.

Существенным недостатком данного способа является невозможность самостоятельного изготовления в большинстве лабораторий посуды и изделий на основе силикона, функционализированного аминогруппами.

Также известен способ получения синтетического покрытия для клеточных культур, заключающийся в том, что в растворе формируется ковалентное соединение линейного полимера с полипептидами, при этом используется такое соотношение полипептидов и полимера, что полипептидные участки обеспечивают полную водорастворимость полученного соединения. Затем полученное соединение помещают на поверхность изделия, которое необходимо обработать, и подвергают электромагнитному или тепловому воздействию, достаточному для того, чтобы полимерная часть его молекул связалась с поверхностью изделия. Таким образом, достигается иммобилизация полипептидов, которые, собственно, и отвечают за адгезию клеток, на поверхности изделия без использования токсичного глутарового альдегида (US10941312B2).

К недостаткам данного способа следует отнести манипуляции с культуральной посудой, требующие воздействия высоких температур или электромагнитного поля. Такие манипуляции невозможно проводить в условиях ламинарного шкафа, в которых, как правило, проводится работа с культурами клеток, из-за чего необходимо перемещать посуду внутри лаборатории, что, в свою очередь, чревато нарушением стерильности.

Другим природным носителем-полимером для выращивания клеток является хитозан, обладающий бактериостатическими и фунгицидными свойствами, а также высокой гигроскопичностью. Эти свойства позволяют успешно применять его в качестве биологически активного носителя при выращивании монослоя клеток человека и животных (DOI: 10.1021/cr030441b).

Недостатком хитозана является его цитотоксичность для некоторых линий клеток. Ряд авторов связывает гибель клеток с особенностями химического строения хитозана. Полимерные цепи хитозана не позволяют полного прикрепления клеток к ним, а не прикрепившиеся клетки погибают, т.к. они не способны жить без прикрепления к поверхности. Данный недостаток ограничивает область применения хитозана. Следует отметить, что в настоящее время существуют данные, подтверждающие зависимость цитотоксичности и адгезионных свойств хитозана от его физико-химических свойств, которые, в свою очередь, зависят от метода и источника его получения.

Дополнительным недостатком однокомпонентных покрытий в целом и хитозана в частности является его инородность по отношению к клеткам млекопитающих, которая делает хитозан неспособным создать необходимое паракринное микроокружение, включающее факторы роста и продукты ремоделирования клетками окружающего покрытия. Для борьбы с этим недостатком исследователи вводят дополнительные компоненты в состав питательной среды, однако это приводит к тому, что факторы роста и сигнальные молекулы сначала поступают к клеткам в свободном, растворённом, виде в большой концентрации, а затем их концентрация снижается по мере истощения питательной среды. Хотя такой подход может быть допустим и даже желателен для некоторых клеточных линий (например, для имитации гормональных циклов в организме), существуют типы клеток, для которых необходимо поддерживать постоянство условий. С этой целью создаются различные технологии иммобилизации факторов роста и сигнальных молекул в составе покрытия.

Наиболее близким к заявляемому решению, по лежащему в основе принципу, является способ, предполагающий сбор внеклеточных везикул из культуральной среды, в которой выращивались плацентарные мезенхимальные стволовые клетки человека (hPMSC), и их конъюгацию с синтетическим коллаген-связывающим пептидом SILY [Hao et al., 2022.doi:10.7150/thno.70448]. Сбор микровезикул осуществлялся путём посева hPMSC при плотности 20000 клеток на квадратный сантиметр с последующим их выращиванием в культуральной среде, содержащей сыворотку КРС, обеднённую собственными микровезикулами, в течение 48 часов. Полученную таким образом кондиционированную среду очищали центрифугированием и фильтрацией, после чего собирали везикулы ультрацентрифугированием. Затем, к полученным везикулам добавляли дибензоциклооктинсульфо-N-гидроксисукцинимидиловый эфир (DBCO-sulfo-NHS), инкубировали в течение двух часов и промывали от остатков непрореагировавшего DBCO-sulfo-NHS с последующей очисткой повторным ультрацентрифугированием. Затем к микровезикулам добавляли синтетический пептид SILY, содержащий азидную группу в остатке лизина (SILY-azide), инкубировали, промывали и центрифугировали. В результате реакции между поверхностными белками микровезикул и пептидом SILY образовывался ковалентно связанный мостик из DBCO.

Полученные конъюгированные микровезикулы in vitro продемонстрировали способность к повышенному связыванию с коллагеновым покрытием, а также статистически достоверное повышение пролиферации эндотелиальных колониеобразующих клеток человека (hECFC) и значительное повышение экспрессии про-ангиогенных генов (KDR и TIE2). Таким образом, можно утверждать, что с помощью везикулярных факторов роста и сигнальных молекул можно расширить спектр поведения, проявляемого культурами клеток in vitro, что является ценным результатом с точки зрения проведения исследований на клеточных культурах.

Вместе с тем, описанный способ имеет ряд существенных недостатков. Первым из них является использование клеток, полученных из человеческой плаценты, что вызывает сложности на юридическом, моральном и техническом уровнях. Вторым недостатком является необходимость неоднократного ультрацентрифугирования, для выполнения которого необходимо дорогостоящее оборудование. Наконец, описанный способ предназначен для получения везикул в виде взвеси главным образом для применения in vivo, а не для нанесения на поверхность посуды. Это напрямую указывается авторами, и является причиной сложности способа, которая в противном случае могла бы считаться избыточной.

Целью настоящего изобретения является разработка состава и способа применения белкового матрикса, включающего свободные молекулы хитозана и коллагена, а также внеклеточные микровезикулы FBS, которые позволяют добиться повышения адгезии клеток в культуре после обработки данным матриксом лабораторной посуды. При этом состав и способ получения композиции выбраны таким образом, чтобы избежать использования дорогостоящего оборудования и донорских клеток.

Технический результат - упрощение технологии обработки посуды композицией, вызывающей ускорение адгезии, т.е. закрепления клеток на лабораторной посуде в условиях клеточной культуры, что позволяет повысить жизнеспособность клеточных линий, обладающих слабой способностью к адгезии.

Для достижения указанной цели культуральную посуду, предназначенную для обработки, обсеивают клетками эмбриональной рабдомиосаркомы человека и оставляют в течение суток в подходящей питательной среде в инкубаторе при 37°С, 5% концентрации углекислого газа и повышенной влажности. На следующие сутки клетки удаляют с поверхности посуды обработкой 0,02% раствором ЭДТА (раствор версена), вносят в посуду 100 мкл адгезионного матрикса на квадратный сантиметр поверхности (получение матрикса описано ниже) и оставляют до высыхания. Высушенную посуду сначала промывают фосфатным буферным раствором (PBS), содержащим 1% глутарового альдегида, в количестве 300 мкл на квадратный сантиметр поверхности, в течение 5 минут, а затем троекратно промывают обычным PBS. Обработанную данным способом посуду используют для посева клеток.

Для приготовления адгезионного матрикса к эмбриональной телячьей сыворотке добавляют раствор хитозана, предпочтительно с молекулярной массой не менее 200 кДа, в 1% (масс/об) растворе уксусной кислоты. Смесь тщательно перемешивают и инкубируют от 1 до 3 часов при 4°С, после чего по каплям добавляют 5% раствор гидроксида калия или натрия до появления опалесценции. Опалесцирующую смесь инкубируют дополнительно в течение 30-60 минут, после чего центрифугируют при 12 000 g в течение 20 минут и собирают осадок, содержащий микровезикулы, адсорбированные на молекулах хитозана. Осадок растворяют в 0,1% растворе коллагена, инкубируют в течение 30 минут, разводят в 10 раз и используют для покрытия посуды, как описано выше.

Поставленная цель достигается следующим образом:

Приготовляют раствор хитозана, предпочтительно с молекулярной массой не менее 200 кДа, в концентрации от 400 до 600 мкг/мл. Для достижения наилучшего результата расчётное количество хитозана закладывают в половинный объём дистиллированной воды (800-1200 мкг/мл), тщательно перемешивают и оставляют данную взвесь при температуре 4°С для набухания на время от 2 до 16 часов. Отдельно подготавливают 2% (масс/об) раствор уксусной кислоты, а именно растворяют ледяную уксусную кислоту в дистиллированной воде из расчёта от 0,32 до 0,36 моль (19,2-21,6 г) кислоты на 1 литр воды. Взвесь хитозана доводят 2% раствором уксусной кислоты до конечной концентрации от 400 до 600 мкг/мл, что соответствует разведению в два раза. Возможно приготовление раствора хитозана напрямую путём смешивания сухого вещества с 1% раствором уксусной кислоты (9,6-10,8 г/литр), однако при таком подходе смесь содержит большое количество пузырьков, что, в свою очередь, может затруднять дозирование. Отдельно подготавливают 5% раствор гидроксида калия или натрия массо-объёмным способом из сухой щёлочи и дистиллированной воды. Раствор хитозана можно приготовить заранее и он остаётся пригодным для применения как минимум в течение 4 суток.

Центрифугируют эмбриональную телячью сыворотку (FBS) в течение 10 минут при 3000 g, чтобы удалить возможные загрязнители в виде фрагментов клеток.

К образцам сыворотки в асептических условиях добавляют полученный раствор хитозана с молекулярной массой не менее 200 кДа, в концентрации от 400 до 600 мкг/мл в соотношении хитозан:сыворотка, равном 1:5. Смесь тщательно перемешивают и инкубируют от 1 до 3 часов при 4°С, после чего в асептических условиях по каплям добавляют 5% раствор гидроксида калия или натрия до появления опалесценции. Опалесценция чаще всего принимает вид тонких белёсых волокон у поверхности раствора. При её появлении добавление щёлочи прекращают и оставляют нейтрализованную смесь для дополнительной инкубации на 30-60 минут.После этого смесь центрифугируют при 12000 g в течение 20 минут и собирают осадок, содержащий микровезикулы, адсорбированные на молекулах хитозана. Осадок растворяют в 0,1% растворе коллагена в 0,25% уксусной кислоте с таким расчётом, чтобы на каждый миллилитр FBS, использованной для получения осадка, приходился 1 мл 0,1% раствора коллагена в 0,25% уксусной кислоте. Полученную смесь, инкубируют в течение 30 минут, после чего она может храниться в течение не менее 1 суток перед дальнейшим применением. Смесь представляет собой жидкий прозрачный гетерогенный белковый матрикс, включающий свободные молекулы хитозана и коллагена, а также внеклеточные микровезикулы FBS, содержащие фактора роста.

Перед непосредственным применением смесь разводят 0,25% уксусной кислотой в 10 раз и используют для покрытия посуды.

Для покрытия смесью культуральной посуды, в посуду сначала высаживают клетки перевиваемой линии RD (эмбриональная рабдомиосаркома человека) в количестве 30000 клеток на квадратный сантиметр поверхности посуды, добавляют рекомендованное количество питательной среды, при этом предпочтительно использовать ту питательную среду, которая используется в работе с данными клетками в данной лаборатории постоянно. Клетки оставляют на сутки в инкубаторе при 37°С, 5% концентрации углекислого газа и повышенной влажности. На следующие сутки клетки RD удаляют с поверхности посуды обработкой 0,02% раствором ЭДТА (раствор версена), вносят в посуду 100 мкл адгезионного матрикса на квадратный сантиметр поверхности и оставляют до высыхания. Высушенную посуду сначала промывают фосфатным буферным раствором (PBS), содержащим 1% глутарового альдегида, в количестве 300 мкл на квадратный сантиметр поверхности, в течение не более, чем 5 минут, а затем троекратно промывают обычным PBS. Более длительная экспозиция с глутаровым альдегидом может повысить цитотоксичность матрикса, сделаем его непригодным для применения.

В результате высушивания и последующей кратковременной обработки глутаровым альдегидом, матрикс переходит в сшитую форму, в которой между аминогруппами молекул хитозана и коллагена сформированы поперечные сшивки. Данные сшивки предотвращают повторное растворение матрикса после посева культур клеток. Обработанную данным способом посуду используют для посева клеток согласно необходимому дизайну эксперимента.

Предварительная обработка (прекондиционирование) обрабатываемой посуды клетками RD позволяет сформировать на поверхности посуды участки, покрытые выделяемым ими межклеточным веществом. Эти участки после дальнейшей обработки матрикса глутаровым альдегидом образуют межмолекулярные сшивки с молекулами биополимеров (хитозана и коллагена) в составе матрикса, чем улучшают его закрепление. Помимо этого, выделяемые клетками RD на посуду структурные белки и паракринные регуляторы способствуют адгезии сами по себе (пример 2).

Коллаген является основным структурным белком организма для многих видов животных, что обуславливает его роль в адгезии клеток к полученному матриксу. Поверхностные белки многих клеток способны избирательно распознавать молекулы коллагена и связываться с ними.

Хитозан за счёт распределения электронной плотности в его молекулах способен адсорбировать на себе микровезикулы, за счёт чего и достигается их сбор из FBS. При этом высокая молекулярная масса хитозана позволяет собрать микровезикулы без использования сверхвысоких ускорений, характерных для ультрацентрифугирования, что позволяет применять заявляемый способ без применения дорогостоящих ультрацентрифуг. В составе матрикса хитозан так же выступает в качестве компонента, связывающего везикулы, и обеспечивая медленный, постепенный выход из них факторов роста.

Глутаровый альдегид является связывающим агентом, обеспечивающим переход матрикса в слаборастворимую форму, создавая стабильное покрытие лабораторной посуды. При этом экспозиция матрикса с глутаровым альдегидом продолжается недолго, после чего матрикс промывается от излишков, чем снижается общее содержание глутарового альдегида в готовом матриксе в сшитой форме. Сокращение времени экспозиции позволяет, таким образом, контролировать цитотоксическое действие данного компонента.

Везикулы, выделенные из FBS, представляют собой микроскопические внеклеточные везикулы диаметром от 30 до 100 нм с билипидным слоем, выделяемые в межклеточное пространство клетками различных тканей и органов эмбриона КРС, от которого была получена FBS. Сыворотки эмбрионов КРС богаты факторами роста и другими сигнальными молекулами, которые регулируют рост и развитие эмбриона, а в условиях клеточных культур обеспечивают благоприятные условия для адгезии, роста и пролиферации клеток.

Таким образом, общий состав заявляемой композиции, а также способ её получения и применения, обеспечивают эффективное создание на поверхности лабораторной посуды условий, обеспечивающих ускоренную адгезию, т.е. закрепление клеток на лабораторной посуде в условиях клеточной культуры, что позволяет повысить жизнеспособность клеточных линий, обладающих слабой способностью к адгезии. Помимо этого, решается проблема использования факторов роста, полученных из везикул донорских тканей и клеток, и сокращается количество дорогостоящего оборудования, задействованного в процессе.

Пример 1

Оценка токсичности прекондиционированной с клетками RD среды проводилась путём измерения индекса площади (ИП) первичных эксплантов.

Отбор фрагментов ткани для культуры первичных эксплантов проводился следующим образом. Самцов беспородных мышей-альбиносов наркотизировали парами диэтилового эфира, после чего умерщвляли путём цервикальной дислокации. С участка площадью 1 кв. см. сбривали волосяной покров и обрабатывали его 70% этанолом, после чего отделяли фрагмент кожи, удаляли фасции и переносили полученный фрагмент в среду DMEM с добавлением гентамицина (4 мг/мл). Затем обрабатывали спиртом задние лапы, удаляли кожу и отбирали m. gastrocnemius и m. soleus, которые так же переносили в DMEM с гентамицином. После этого проводили вскрытие брюшной полости, отбирали доли печени и переносили в среду DMEM с гентамицином. Ёмкость с фрагментами тканей осторожно взбалтывали, чтобы обеспечить полное покрытие фрагментов антибиотиком. Оба эксперимента на первичных эксплантах проводили в трёх повторениях, для каждого из которых использовалось одно животное.

Собранные таким образом фрагменты тканей асептически переносили в ламинарный бокс и осторожно разделяли с помощью пинцета, скальпеля и ножниц на мелкие части величиной около 1 куб. мм., которые помещали в чашки Петри с обработанной поверхностью. Питательная среда состояла из 90% среды DMEM и 10% фетальной телячьей сыворотки. В среду добавляли гентамицин (0,4 мг/мл).

Культивирование клеток проводили в среде DMEM с добавлением 10% FBS и 1% раствора пенициллина-стрептомицина. Клетки наращивали в CO2-инкубаторе при температуре 37°С и 5% содержании углекислого газа. Для наращивания клеток использовали пластиковые чашки Петри с обработанной поверхностью.

Экспланты тканей помещали в чашки Петри диаметром 3,5 см с обработанной поверхностью в количестве не более 9 эксплантов на чашку. В экспланты каждого вида ткани разделяли на две группы (n=40) - экспланты контрольной группы культивировали в обычной среде, как описано выше, а экспланты экспериментальной группы - в прекондиционированной среде. Прекондиционирование среды проводили путём засевания в чашку Петри клеток линии RD в количестве 500 тыс. клеток на чашку в среде DMEM, содержащей 10% FBS и гентамицин, как описано выше. Спустя сутки культуральную среду собирали и центрифугировали в течение 15 минут при 1500 оборотах в минуту на центрифуге LMC-3000 (bioSan, Латвия). Освобождённую таким образом от клеток и клеточного дебриса среду, содержащую метаболиты клеток линии RD, использовали в дальнейшем исследовании. На третьи сутки экспланты фотографировали на микроскопе Zeiss Imager.Zl. Индекс площади (ИП) рассчитывали как отношение площади всего эксплантата (вместе с зоной выселяющихся клеток) к площади центральной зоны эксплантата. Для расчёта ИП эксплантатов использовали программу «AxioVision». Значения ИП выражали в процентах. Величину ИП в контрольных культурах (без добавления прекондиционированной среды) принимали за 100%.

В ходе изучения активности кондиционированной среды, содержащей продукты метаболизма клеток линии RD, в отношении клеток в культуре первичных эксплантов тканей кожи, мышц и печени, были получены следующие значения среднего ИП в экспериментальных группах: для кожи - 98,90±2,1%, для мышц - 117,81±6,6%, для печени - 101,55±4,3%.

Статистическая обработка результатов подтвердила отсутствие статистически достоверных отличий между контрольной и экспериментальной группами эксплантов кожи и печени. При этом было установлено, что повышение пролиферации ткани мышц носит достоверный характер (р=0.0487). Такое положительное воздействие среды, содержащей метаболиты клеток RD, на клетки мышц, может быть связано с тем, что линия RD представлена клетками рабдомиосаркомы, и выделяемые ей в кондиционированную среду факторы роста могут быть специфичны в отношении клеток мышц.

Таким образом, установлено, что метаболиты клеток линии RD не токсичны для первичных культур клеток мыши, и могут быть использованы в качестве ингредиента адгезионного матрикса.

Пример 2

Оценку адгезии опухолевых клеток к посуде, обработанной клетками RD, проводили по поглощению клетками, закрепившимися на подложке, красителя. Тест проводили в 24-луночных плоскодонных планшетах с необработанной поверхностью. Лунки были разделены на три экспериментальные группы, а также группы негативного и позитивного контроля (n=16). Лунки в экспериментальных группах были предварительно обсеяны клетками RD в количестве 50 тысяч клеток на лунку, после чего клетки RD были оставлены для роста на трое суток. На четвёртые сутки клетки RD удаляли из лунок посредством обработки раствором версена в течение 15 минут и троекратного отмывания PBS. После этого в лунки экспериментальной группы I не засевалось никаких клеток (0% адгезии), а в лунки групп II и III были засеяны клетки SK-MEL-2 в количестве 100 тысяч клеток на лунку, при этом в группе II клетки были смыты PBS через 20 минут, в группе III клетки смывались через 2 часа. Негативная контрольная группа включала лунки, не подвергавшиеся никакой обработке клетками, однако подвергавшиеся всем остальным процедурам. Группа позитивного контроля включала лунки, не подвергавшиеся предварительной обработке клетками RD, но засеянные клетками SC-MEL-2 так же, как экспериментальная группа III (без смывания).

После обработки клетками в соответствии с вышеописанным протоколом, все лунки осторожно освобождали от остатков ростовых сред, клетки фиксировали раствором формальдегида и окрашивали 0,5% водным раствором кристаллического фиолетового в течение 20 минут при комнатной температуре. После фиксации и окрашивания планшеты тщательно промывали дистиллированной водой так, чтобы не повредить зафиксированные клетки. Затем в лунки на 60 минут добавляли 500 мкл 5% водного раствора ТВИН-20, чтобы растворить краситель, содержащийся в клетках, и измеряли оптическую плотность раствора при длине волны 490 нм. Оптическая плотность полученных растворов пропорциональна количеству красителя, количество которого, в свою очередь, зависит от числа клеток в лунках.

При проведении спектрофотометрии были получены следующие значения (в условных единицах, у.е.): Негативный контроль - 58,93±0,19; Позитивный контроль - 66,56±0,41; Группа I - 57,69±0,45; Группа II - 66,69±0,34; Группа III - 69,5±0,31.

Статистическая обработка результатов не выявила статистически достоверных различий между группой I и негативным контролем, а также между группой II и позитивным контролем. Однако различия между группой III и позитивным контролем были статистически достоверны (р=0.032). Подобное повышение оптической плотности позволяет предполагать, что за равный временной промежуток в группе III, которая включала обработанные лунки, произошла адгезия большего числа клеток. Вместе с тем, отсутствие достоверных различий между группой II и позитивным контролем также свидетельствует о повышении адгезии, которая привела к равной оптической плотности при меньшем времени.

Таким образом, установлено, что метаболиты клеток линии RD могут напрямую способствовать адгезии клеток к прекондиционированной посуде.

Группа изобретений относится к жидкому гетерогенному белковому матриксу, включающему свободные молекулы хитозана и коллагена, а также внеклеточные микровезикулы эмбриональной телячьей сыворотки, характеризующемуся тем, что получен путем инкубации эмбриональной телячьей сыворотки с раствором хитозана с концентрацией 400-600 мкг/мл в соотношении 1:5 с последующей нейтрализацией, центрифугированием, удалением супернатанта и растворением осадка в 0,1% растворе коллагена из расчета 1 мл раствора коллагена на 1 мл использованной эмбриональной телячьей сыворотки, также относится к способу применения жидкого гетерогенного белкового матрикса, где жидкий гетерогенный белковый матрикс разводят в 10 раз 0,25% раствором уксусной кислоты и наносят на посуду, прекондиционированную путем культивирования на ней клеток эмбриональной рабдомиосаркомы человека в течение не менее чем 24 часов, после чего промывают 1% раствором глутарового альдегида в фосфатном буферном растворе в течение не более чем 5 минут. Группа изобретений обеспечивает упрощение технологии обработки посуды композицией, вызывающей ускорение адгезии, т.е. закрепления клеток на лабораторной посуде в условиях клеточной культуры, что позволяет повысить жизнеспособность клеточных линий, обладающих слабой способностью к адгезии. 2 н.п. ф-лы, 2 пр.

1. Жидкий гетерогенный белковый матрикс, включающий свободные молекулы хитозана и коллагена, а также внеклеточные микровезикулы эмбриональной телячьей сыворотки, характеризующийся тем, что получен путем инкубации эмбриональной телячьей сыворотки с раствором хитозана с концентрацией 400-600 мкг/мл в соотношении 1:5 с последующей нейтрализацией, центрифугированием, удалением супернатанта и растворением осадка в 0,1% растворе коллагена из расчета 1 мл раствора коллагена на 1 мл использованной эмбриональной телячьей сыворотки.

2. Способ применения жидкого гетерогенного белкового матрикса по п. 1, где жидкий гетерогенный белковый матрикс разводят в 10 раз 0,25% раствором уксусной кислоты и наносят на посуду, прекондиционированную путем культивирования на ней клеток эмбриональной рабдомиосаркомы человека в течение не менее чем 24 часов, после чего промывают 1% раствором глутарового альдегида в фосфатном буферном растворе в течение не более чем 5 минут.