СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ Российский патент 2024 года по МПК C12N1/16 

Изобретение относится к области микробиологической и комбикормовой промышленности, преимущественно к способам получения полноценной по аминокислотному составу белковой биомассы микроорганизмов путем выращивания на питательных средах, содержащих лигноцеллюлозные виды сырья - отходы сельскохозяйственного производства.

Одним из способов повышения качества кормов является обогащение растительного сырья белком микроорганизмов.

Белки кормовых культур неполноценны по незаменимым аминокислотам. Лимитирующими аминокислотами в белках злаков является лизин, метионин и изолейцин, а в белках кукурузы еще и триптофан. [Karikurubu J., Kasyanov G.I., Shtatskaya T.V. Perspectives in development of the technology of tropical fruits transformation in the Republic of Burundi //Agriculture, forestry and water management. - 2013. - № 11. -URL: http://agro.snauka. Ren.2013.11.1245]. Недостаток или отсутствие незаменимых аминокислот в кормах ведет к серьезным нарушениям обмена веществ в организме животных. Известно, что одним из факторов, лимитирующих развитие производства белка микробного происхождения, является высокая стоимость сырья. Самым доступным субстратом для получения кормового белка на основе биомассы микроорганизмов является солома злаковых культур. По питательности солома злаковых культур уступает многим углеводсодержащим отходам сельского хозяйства из-за низкого содержания белка и жира, высокого содержания клетчатки (целлюлозы и гемицеллюлозы) и лигнина. В соломе практически отсутствуют витамины. Целлюлоза и ксилан не перевариваются пищеварительной системой животных с однокамерным желудком (свиньи, птицы, кролики). Микроскопические грибы при их непосредственном культивировании на лигноцеллюлозных субстратах, способны проявлять широкую целлюлолитическую, гемицеллюлолитическую и лакказную активность, катализируя процесс деградации субстратов до ди- и моносахаров, являющихся субстратами для дальнейшего роста и роста и биосинтетических процессов. Белки грибного мицелия богаты лизином и в целом по содержанию незаменимых аминокислот, сходны с белками сои, имеют высокую усвояемость и биологическую ценность. Положительным фактором является и волокнистое строение мицелиальных культур грибов, поэтому выращенная биомасса легко отделяется простым фильтрованием и не требует использования дорогостоящего оборудования для сепарации и ультрафильтрации.

Известен способ получения биомассы микроорганизмов, включающий приготовление питательной среды на основе крахмал- и целлюлозосодержащего сырья, проведение предварительного ферментативного гидролиза субстрата при слабом нагревании в слабокислой среде с использованием в качестве биокатализатора мультиэнзимной композиции, охлаждение питательной среды до температуры, оптимальной для выращивания микроорганизмов, засев штаммов микроорганизмов с использованием дрожжевой культуры Endomycopsis fibuligera ВКПМ-У-2173 или гриба Aspergillus niger ВКПМ-F-710 с последующим проведением ферментации (RU 2112806 C1,: 10.06.1998). Недостатком способа является многоэтапность и длительность подготовки питательной среды, применение биокатализаторов.

Известен способ получения биомассы путем выращивания дрожжевых культур в условиях аэрации на питательной среде, содержащей отруби и/или муку злаковых культур, подвергнутых предварительно ферментативной обработке, а также минеральные соли и микроэлементы, с последующим выделением целевого продукта. Способ позволяет получать высокобелковую биомассу, которую используют в качестве кормовой добавки для сельскохозяйственных животных. Ферментативную обработку субстрата проводят амилолитическими или протеолитическими ферментами, взятыми в количестве 0,5-1,0% на ACВ (абсолютно сухие вещества) сырья, при 50-70°C, pH 7,0-7,4 в течение 1-1,5 часов, а выращивание кормовых дрожжей Candida gulirmondij ВСБ-654 или Candida tropicalus осуществляют в условиях избытка ионов железа и фосфата. Получаемый продукт содержит помимо белка незаменимые аминокислоты и витамины. (RU 2041946 C1, 20.08.1995). Существенным недостатком предлагаемого способа является отсутствие способности дрожжей к биосинтезу амилолитических, целлюлолитических и протеолитических ферментов. Недостатком способа является также необходимость проведения предварительного ферментативного гидролиза растительных субстратов в узких интервалах кислотности среды (рН=7,0-7,4) и при строгом поддержании интервала температур (50- 70°С).

Известен способ получения кормового продукта, предусматривающий измельчение соломы, гидролиз её раствором щелочи с последующим добавлением к полученному гидролизату минеральных солей и выращиванием гриба Penicillium verruculosum БИМ Г-122(А.С. СССР 983140, 23.12.1982). Недостатком способа является предварительная обработка измельченной соломы щелочью, поскольку она сопровождается частичным растворением гемицеллюлоз и лигнина, что приводит к уменьшению исходной массы субстрата. Более того, процесс обработки субстрата гидроокисью натрия с последующей нейтрализацией кислотой сложен при осуществлении его в производственных условиях.

Известен способ повышения питательной ценности пивной дробины путем культивирования микофильного гриба Hypomyces rosellus в глубинных условиях. Максимальное образование белка, содержащего все незаменимые аминокислоты, отмечается через 24 часа глубинного культивирования. Образование биомассы сопровождается накоплением липидов. Анализ метиловых эфиров жирных кислот показал, что в мицелии преобладает олеиновая жирная кислота. (Буракаева А.Д. Повышение питательной ценности пивной дробины путем культивирования микофильного гриба //А.Д. Буракаева, Е.В. Левин, Р.Ф. Сагитов //Экология и промышленность России. - 2015. - Т. 19. - 3. - С. 45-47). Недостатком способа является ограниченная ресурсная база.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ получения полноценной по аминокислотному составу биомассы микофильного гриба Hypomyces odoratus ВКПМ F-242 путем непосредственной микробиологической переработки отходов спиртовой, пивоваренной и винодельческой промышленности. Биомассу гриба получают путем глубинного периодического культивирования в ферментере мешалочного типа емкостью 100 л с рабочим объемом среды 50 л на жидкой питательной среде состава (в %): NH₂H₂PO₄ - 0,3; MgSO₄ - 0,05; KCl - 0,1; FeSO₄ - 0,0001; CaCO₃-0,3; вода водопроводная. водопроводная, pH_исх. = 6,0-6,5. В качестве источника углерода добавляют послеспиртовую (зерновую) барду (пивную дробину, виноградные выжимки, которые вносят в среду культивирования в количестве 20 - 40 %. Посевной мицелий выращивают в течение 48 часов на сусле 4° по Баллингу, инокулируют питательную среду для ферментации. в количестве 10%. Процесс культивирования ведут 24 часа, мицелий отделяют фильтрованием. Наряду с полноценной по аминокислотному составу биомассой, гриб синтезирует целлюлолитические, протеолитические ферменты и алкогольдегидрогеназу (Буракаева А.Д. Биотехнологические решения в утилизации отходов спиртовых, винодельческих и пивоваренных производств /А.Д. Буракаева, Г.В. Петрова, С.В. Сорокун, П.В. Игонтов //Экология и промышленность России, 2018. - Т. 22. -№11. - С. 30-33). Недостатком способа является ограниченная ресурсная база, способ не предусматривает обогащение целлюлозосодержащего субстрата окислительно-восстановительными ферментами, также липидами, содержащими омега-6 ненасыщенные жирные кислоты и витаминами.

Технический результат предлагаемого изобретения заключается в расширении ресурсной базы и улучшение качества целевого продукта. Указанный технический результат достигается в результате получения полноценной белковой биомассы гриба Hypomyces odoratus ВКПМ F-242, обладающей комплексом гидролитических и окислительно-восстановительных ферментов, содержащей омега-6 ненасыщенные жирные кислоты и витамины группы В путем глубинного культивирования на питательных средах, содержащих в качестве источника углерода измельченную солому хлебных злаков.

Способ описывается следующими примерами:

Пример 1 Подготовка субстрата и подбор условий культивирования Солому, из расчета 100 г/л, измельчают до размеров частиц 10 см, 6 см, 3 см, 2 см и 1 см, каждую партию заливают водопроводной водой в соотношении 1:5, доводят до кипения и выдерживают 1 час при температуре 60°С. Далее к гидролизатам доливают воду до нужного объема и вносят компоненты модифицированной среды Чапека-Докса состава (в %): NH₂H₂PO₄ - 0,3; MgSO₄ - 0,05; KCl - 0,1; FeSO₄ - 0,0001; CaCO₃-0,3, pH_исх. = 6,0-6,2. Среду стерилизуют в течение 20 мин. при температуре 105°С и избыточном давлении 0,5 атм. Как показали результаты эксперимента, при размерах частиц 10 см, 6 см, 3 см, 2 см уровень редуцирующих веществ недостаточен для обеспечения роста гриба и накопления белковой биомассы. Размер соломы частиц 1 см обеспечивает повышенное содержание сахаров в среде культивирования (сахарозы 10,2 г/л и глюкозы 8,4 г/л). Посевной материал для инокулирования ферментера выращивают 48 часов на сусле 4° по Баллингу в колбах на круговых качалках (200-220 об/мин.) при 24-26°С. Культивирование гриба осуществляют в ферментере мешалочного типа, емкостью 100 л в течение 24 часов при температуре 24-26°С. В мицелии определяют вес сухой биомассы, содержание белка, аминокислотный состав, сырой жир, клетчатку и витамины. В культуральной жидкости ферментативную активность и содержание свободных сахаров. В работе используют следующие методы исследований: вес сухой биомассы - весовым методом, общий белок - по Кельдалю, истинный белок - по Барнштейну, количественное содержание белка в мицелии гриба -методом Лоури и по сумме аминокислот, аминокислотный, состав белка на аминокислотном анализаторе Т 339 М (Чехославакия), количественное содержание триптофана методом Хорна, редуцирующие и легкогидролизуемые полисахариды по Хагедорну-Йенсену и методом Бертрана (Методы экспериментальной микологии. Справочник.- Киев: Наук. думка, 1982, 550 с.); сырой жир, витамины; содержание клетчатки общепринятыми методами (Филиппович Ю.Б., Егорова Т.А., Севастьянова Г.А. Практикум по общей биохимии. - М.: Просвещение, 1982, С. 192-216, С. 277 - 278), протеолитическую активность модифицированным методом Ансона, активность эндоцеллюлазы (С_х-фермента) вискозиметрически, осахаривающую экзоцеллюлазу и β-глюкозидазу известными методами (Синицын А.П., Черноглазов В.М., Гусаков А.В. Методы изучения и свойства целлюлолитических ферментов. - Итоги науки и техники.- Сер. «Биотехнология». - М.: Наука, 1990. - Т. 25.- С. 152); активность ксиланазы определяют по количеству редуцирующих сахаров, которые образуются при гидролизе 1% ксилана, активность лакказы спектрофотометрическим методом при длине волны 410 нм (Королева О.В. Выделение и изучение некоторых свойств лакказ из базидиомицетов /О.В. Королева, И.С. Явметдинов, С.В. Шлеев, Е.В. Степанова, В.П. Гаврилова //Биохимия, 2001. - Т. 66. - №6. - С.762). Экстракцию липидов ведут из разрушенных клеток мицелия непосредственно после культивирования последовательно петролейным эфиром и хлороформом при объемном соотношении мицелия и растворителя 1:3. Полученные петролейно-эфирные, хлороформные и хлороформ-иопропанольные экстракты липидов анализируют с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ), очищают препаративной тонкослойной хроматографией (ПТСХ), полученные фракции подвергают метанолизу с использованием диазометана и далее анализируют спектральными методами.

Пример 2 Ферментативная активность культуральной жидкости гриба

Способность Hypomyces odoratus продуцировать целый комплекс внеклеточных гидролитических ферментов и окислительно-восстановительные ферменты (лакказу) позволяет осуществлять гидролиз труднорасщепляемых высокомолекулярных растительных полисахаридов до свободных сахаров, что обеспечивает рост гриба и накопление белковой биомассы (таблица 1).

Таблица 1 - Активность экзоферментов культуральной жидкости H.odoratus через 24 часа глубинного культивирования на питательной среде с измельченной соломой хлебных злаков

Источники углерода Ксиланаза,
ед/мл С_х-фермент, ед/мл С₁-фермент, ед/мл β-глю-козидаза, ед/мл Лакказа,
ед/мл Солома озимой пшеницы 25,5 18,5 16,8 56 2,2 Солома яровой пшеницы 26, 8 19,3 13,6 60 2,8

Пример 3 Динамика накопления свободных сахаров, белковой биомассы H.odoratus и других биологически активных веществ

На питательных средах с 10% соломы хлебных злаков через 6 часов роста культуры гриба содержание сахарозы и глюкозы увеличилось в 2 раза и составляло 19,0 -23,5% и 11,2 - 18,9% соответственно. Через 12 часов роста гриба наблюдался более интенсивный гидролиз полисахаридов соломы, содержание сахарозы достигало 34,5-38,4% и глюкозы 21,0 -27,2 %. Через 18 часов культивирования, содержание сахара и глюкозы понизилось и не достигало исходного уровня, что свидетельствует о завершении процесса культивирования (таблица 2). Динамика накопления сахаров в культуральной жидкости гриба не зависит от вида соломы.

Таблица 2 - Изменение содержания свободных сахаров в процессе глубинного культивирования гриба на соломе хлебных злаков.

Источники углерода Содержание сахарозы и глюкозы, г/л В среде в начале роста Через 6 часов роста Через 12 часа роста Через 24 часа
роста сах глю сах глю сах глю сах глю Солома озимой пшеницы 8,2 5,4 19,0 11,2 34,5 21,0 7,4 - Солома яровой пшеницы 9,3 6.8 23,5 18,9 38,4 27,2 8,5 2,2

После 24 часового глубинного культивирования гриба Hypomyces odoratus ВКПМ F-242 вес сухой биомассы мицелия составляет 2,2 г/100 мл, содержание сырого протеина увеличивается до 20,53 - 21,20%. Аминокислотный состав белковой биомассы гриба по предлагаемому способу приведен в таблице 3. Белковая биомасса гриба отличается от контроля полноценным аминокислотным составом, содержит как заменимые, так незаменимые аминокислоты, общая сумма которых составляет при культивировании гриба на соломе яровой пшеницы 219,04 мг/г от абсолютно сухого вещества, на соломе озимой пшеницы - 202, 19мг/г. Особую ценность для кормопроизводства представляет способность гриба продуцировать лизин ( 16,44 мг/г и 15,43 мг/г соответственно на соломе яровой пшеницы и соломе озимой пшеницы).

Таблица 3 - Аминокислотный состав белка после 24 часового культивирования гриба на соломе хлебных злаков

Аминокислоты Содержание мг/г Белок гриба на соломе яровой пшеницы Белок гриба на соломе озимой пшеницы Белок измельченной соломы яровой пшеницы L-Аспарагиновая кислота 12,90 5,40 0,19 L-Треонин 14,04 3,98 0,02 L-Серин 16,90 14,08 0,05 L-Глютаминовая кислота 11.21 14,18 0,14 L-Пролин 5.22 12,83 0,10 L-Глицин 7,46 5,31 0,09 L-Аланин 21,16 14,20 0.22 L-Валин 14,73 16,79 0,60 L-Цистин/цистеин 3,96 13,05 0,23 L-Метионин 5,71 13,69 0,03 L-Изолейцин 22,10 17,18 0,01 L-Лейцин 10,59 5,08 0,10 L-Тирозин 10,27 7,57 - L-Фенилаланин 19,41 16,55 - L-Лизин 16,44 15,93 0,07 L-Гистидин 9,90 13,76 - L-Аргинин 8,96 6,31 0,6 L-триптофан 8,08 6,4 - Сумма аминокислот 219,04 202,19 2,45

Содержание в биомассе липидов в петролейно-эфирной фракции составляет 12 % от веса сухой биомассы. Разделение экстракта методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) в системе растворителей для нейтральных липидоввыявляют пятна с R_f = 0,05 - (1-0-моноалкиловые эфиры глицерина), с R_f = 0,1 - стерины, R_f = 0,3 - (высшие алифатические спирты); R_f = 0,4 - (жирные кислоты); R_f = 0,6 - (триацилглицериды). Далее методом препаративной тонкослойной хроматографии ( ПТСХ) на силикагеле, полученные элюенты анализируют. Согласно данным ИК-, ЯМР- и хромато-масс- спектроскопии обнаруживаются олеиновая (30%), и относящиеся к омега-6 жирным кислотам 8Z,11Z-эйкозадиеновая (36%) и линолевая (4%) кислоты. Присутствие последних в биомассе гриба представляет особую ценность для разработки кормовых добавок для сельскохозяйственных животных. Мицелий гриба содержит витамин В₁ (тиамин) - 0,12 мг/%, В₂ (рибофлавин) 3,4 мг/%, пиридоксин - 6,1 мг/%. Отмечается уменьшение количества сырой клетчатки в соломе хлебных злаков до 18-14% (таблица 3).

Таблица 3 - Сравнительный анализ содержания органических веществ в субстрате для культивирования и в биомассе гриба H.odoratus

№ Субстрат/Продукт Содержание, в % Сырой жир, в % Витамины,
мг/% Клетчатка,
в % Сырой протеин Истинный белок В₁ В₂ В₆ 1 Солома яровой пшеницы 5 1,2 1,3 - - - 35 2 Солома озимой пшеницы 3,8 0,9 0,8 - - - 42 3 Биомасса гриба на соломе яровой пшеницы 20,20 16,96 12 0,12 3,4 6,1 14 4. Биомасса гриба на соломе озимой пшеницы 219,53 9,3 7,0 0,11 4,2 5,8 18

Как видно из таблицы 3 в соломе яровой пшеницы содержание сырого протеина не превышает 4-5%, истинного белка - 1,0 - 1,2%, сырого жира 1,3-1,5%, витамины практически отсутствуют. Солома хлебных злаков отличается высоким содержанием клетчатки - 35-42%.

Предлагаемый способ расширяет ресурсную базу и позволяет получить полноценную белковую биомассу на таких лигноцеллюлозных субстратах, как солома хлебных злаков. Полученный продукт по предлагаемому способу отличается от исходного субстрата (соломы хлебных злаков) по содержанию белка, его аминокислотному составу, ферментативной активности культуральной жидкости (ксиланаза, комплекс целлюлолитических ферментов, лакказа), содержанию сырого жира, витаминов, биомасса содержит ненасыщенные жирные кислоты, в том числе Омега-6. Сравнительный анализ с прототипом показал, что при расширении ресурсной базы для получения биомассы микроскопический гриб проявляет новые свойства, неописанные в известном способе (таблица 4).

Таблица 4 - Сравнительная характеристика химического состава полученной белковой биомассы гриба H.odoratus по прототипу и предлагаемому способу

Параметры По прототипу По предлагаемому способу Ресурсная база Послеспиртовая барда, пивная дробина, виноградные выжимки Солома хлебных злаков Жирнокислотный состав липидов - Олеиновая кислота, 8Z,11Z-эйкозадиеновая и линолевая Витамины - В₁ (тиамин), В₂ (рибофлавин), В₆ (пиридоксин)

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения полноценной по аминокислотному составу белковой биомассы путем культивирования микроскопического гриба Hypomyces odoratus в глубинных условиях на питательной среде, содержащей такие лигноцеллюлозные отходы сельского хозяйства, как измельченная солома злаковых культур. Продукт, полученный по предлагаемому способу, отличается от исходного субстрата (соломы хлебных злаков) по содержанию белка, его аминокислотному составу, ферментативной активности культуральной жидкости (ксиланаза, комплекс целлюлолитических ферментов, лакказа), содержанию сырого жира, витаминов. Особую ценность представляет способность гриба продуцировать незаменимую аминокислоту лизин (16,44 мг/г и 15,43 мг/г соответственно на соломе яровой пшеницы и соломе озимой пшеницы), ненасыщенные жирные кислоты, относящиеся к Омега-6 жирным кислотам - 8Z,11Z-эйкозадиеновой (36%) и линолевой (4%), также олеиновой кислоте (30%), витамины группы В. 4 табл., 2 пр.

Способ получения биомассы, включающий глубинное культивирование микроскопического гриба Hypomyces odoratus ВКПМ F-242 в условиях аэрации в течение 24 часов на питательной среде, содержащей источник углерода, азота, минеральные соли, отличающийся тем, что в качестве источника углерода используют солому хлебных злаков в количестве 10%, которую предварительно измельчают до размеров частиц 1 см, заливают водопроводной водой в соотношении 1:5, доводят до кипения и выдерживают 1 час при температуре 60°С, процесс культивирования ведут при рН_исх.=6,0-6,2 и температуре 24-26°С.