СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ Российский патент 2024 года по МПК C12N1/14 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам получения биологических поверхностно-активных веществ (биоПАВ) микробиологического происхождения и может быть использовано для добычи и транспортировки нефти, восстановления нефтезагрязненных территорий, а также в медицине, косметологии и пищевой промышленности.

Известна ассоциация бактерий родов Rhodococcus и Pseudomonas, включающая штаммы бактерий Rhodococcus sp. BKM Ас-2532Д, Rhodococcus sp. BKM Ас-2533Д, Pseudomonas sp. BKM В-2387Д и Pseudomonas putida BKM В-2380Д, продуцирующие биоэмульгаторы для биодеградации нефти и нефтепродуктов в почвах, пресной и морской воде. RU 2312891 C1). Недостатком ассоциации бактерий является способность продуцировать биоэмульгатор при культивировании на минеральной среде, содержащей нефтепродукты, что ограничивает сырьевую базу для его получения.

Известен состав для снижения вязкости нефти в условиях низкотемпературных месторождений с применением уреазной группы микроорганизмов (RU 2467050 C1, опубл. 20.11.2012). Недостатком изобретения является сложный состав, содержащий помимо экстракта уробактерий карбамид, аммиачную селитру, смесь НПАВ - АФ 9-12, или NP-40, или NP-50 и АПАВ - волгонат или сульфонол и воду.

Известен способ получения биоэмульгатора, обладающего поверхностными свойствами, путем разрушения клеточных стенок биомассы цианобактерий, добавления к полученному продукту последовательно хлороформа, метанола, водного раствора сульфата аммония с поочередным перемешиванием смесей, образующихся после каждого добавления (RU 2547175 C1 10.04.2015). Недостатком способа является длительный способ выращивания (96-120 часов), необходимость поддержания температурного режима не ниже 30-45°С в процессе культивирования, использование сложной по компонентному составу и дорогостоящей питательной среды, сложный процесс извлечения биоэмульгатора из клеток.

Известен штамм Pseudomonas aeruginasa - продуцент биоПАВ (Турковская О.М. Штамм Pseudomonas aeruginasa ВКПМ В-72208 - продуцент биоПАВ /О.А. Турковская, Т.В. Дмитриева, А.Ю. Муратова //Прикладная биохимия и микробиология, 2001.-Т.37.-№1.-С.80-85) путем выращивания в глубинных условиях в течение 5 дней на синтетической питательной среде в диапазоне рН=7,0-8,0. Наиболее подходящими источниками для синтеза биоПАВ оказались глицерин, глюкоза и сорговый сироп, для роста штамма и синтеза биоПАВ необходимо присутствие ионов Mg²⁺. Синтезируемый Pseudomonas aeruginasa экзопродукт, обладающий поверхностно-активными свойствами, извлекали путем экстракции хлороформом, этилацетатом, смесью хлороформ-метанол (1:1). Недостатком способа является высокая стоимость питательной среды, длительность процесса культивирования, использование органических растворителей при извлечении биоПАВ из среды культивирования.

Известны нефтесобирающие и нефтедиспергирующие свойства монокарбоновых кислот и кислотных фракций масел и жиров. В качестве индивидуальной монокарбоновой кислоты использованы пальмитиновая, стеариновая (насыщенные) и олеиновая (ненасыщенная) кислоты. При исследовании воздействия индивидуальных монокарбоновых кислот на нефтяные пленки установлено, что они в отдельности проявляют очень слабые нефтесобирающие способности. Одними из основных компонентов фракций, выделенные из касторового, подсолнечного, соевого, оливкового, кукурузного, льняного и хлопкового масел, а также из рыбьего, бараньего и говяжьего жиров. являются пальмитиновая, стеариновая и олеиновая кислоты, а также более низкомолекулярные жирные кислоты - миристиновая, тетрадеценовая и гексадеценовая. Для обеспечения нефтесобирающих и нефтедиспергирующих свойств и для обеспечения продолжительности удержания собранной и диспергированной нефти пороговая концентрация насыщенных жирных кислот, входящих в состав фракций, должна составлять около 17-24%. Фракции кислот говяжьего и бараньего жира, с содержанием насыщенных жирных кислот более 24% обладали заметной собирающей и нефтедиспергирующей активностью (Асадов З.Г. Исследование нефтесобирающих и нефтедиспергирующих свойств высших карбоновых кислот и кислотных фракций из масел и жиров / З.Г. Асадов, А.Д.Ага-заде, Г.А Ахмедова, И.А.Зарбалиева, С.К.Эюбова //Нефтяное хозяйство, 2004.-№ 4.- С.116-119). Известный способ использования пищевых жиров в качестве поверхностно-активных веществ дорогостоящий для применения в нефтяной промышленности

Наиболее близким к предлагаемому нами способу является получение биоПАВ путем глубинного культивирования микофильного гриба Hypomyces odoratus F-242 на сточных водах винодельческих предприятий. Полученная в процессе культивирования биомасса и выделенный экзополисахарид способствовали снижению поверхностного натяжения нефти и улучшали её реологические показатели (Буракаева А.Д. Повышение эффективности очистки сточных вод винодельческих предприятий с одновременным получением биоПАВ для нефтяной отрасли /А.Д. Буракаева, Г.В. Петрова, А.И. Хлытчиев, Н.А. Ахалаиа, С.В. Сорокун, З.А.Баширова // Экология и промышленность России, 2020. - Т.24.- №2.- С. 41-45). Недостатком способа является ограниченная ресурсная база для получения биоПАВ и недостаточные поверхностно-активные свойства.

Техническим результатом, на достижение которого направлено изобретение, заключается в получении более эффективного биоПАВ, обладающего более высокими поверхностно-активными свойствами, расширение ресурсной базы.

Указанный технический результат достигается в результате глубинного культивирования микроскопического гриба Hypomyces odoratus ВКПМ F-242 на простых по составу питательных средах, содержащих источник углерода, азота, минеральные соли, а в качестве источника углерода отход пищевой промышленности - мезга картофеля.

Способ поясняется следующими примерами.

Пример 1. Получение биоПАВ и определение поверхностно-активных свойств.

Штамм Hypomyces odoratus ВКПМ F-242 выращивают в аэробных условиях в 100 л ферментерах мешалочного типа с рабочим объемом 50 л на питательной среде состава (в %): мезга картофеля - 3, NH₄H₂PO₄ - 0,1, MgSO₄ - 0,05 г; FeSO₄ - 0,001; вода водопроводная, pН исх. = 6,0-6,2.

Культивирование ведут в аэробных условиях в течение 72 часов в интервале температур 24-26°С. Воздух в ферментер подается со скоростью 1л О₂ на 1 л среды в минуту при оборотах мешалки 100- 300 об./мин.

Таблица 1 - Сравнительный анализ биосинтетической активности гриба на различных источниках углерода.

Источник
углерода Содержание липидов, % Белок, % 2 3 4 2 3 4 Мезга картофеля 17,3 30 12,5 25 20 15 Отруби пшеничные 15,2 22,5 9,4 21 19 13 Отруби ржаные 14,9 21,9 9,0 20 17,9 12,4 Отруби пшеничные + отруби ржаные (1:1) 13,8 19,6 8,8 18,6 15,0 10,7

На питательных средах, представленных в таблице 1 Hypomyces odoratus хорошо растет и синтезирует липиды. Наиболее благоприятный источник углерода для биосинтеза липидов оказалась мезга картофеля. Максимальный биосинтез липидов отмечался на 3 сутки роста культуры, причем на всех питательных средах. Однако при росте на среде с мезгой картофеля отмечается максимальное накопление липидов. Максимальное накопление белка наблюдается на 2 сутки роста и к 4 суткам значительно снижается.

Перед изучением реологических показателей нефть выдерживают в контакте с составом прототипа и предлагаемого состава в течение 24 часов, после такого контакта определяют поверхностно-активные свойства биомассы гриба и реологические параметры проб нефти. Устойчивость эмульсии полученного продукта и нефти Баклановского месторождения Оренбургской области, показатели поверхностного натяжения (ПН) и критической концентрации мицелообразования (ККМ) по сравнению с прототипом представлены в таблице 2. В контроле поверхностное натяжение на границе вода-нефть из разных скважин составляло 73-76 Дж/м². Добавление полученной биомассы микроскопического гриба по предлагаемому способу снижает поверхностное натяжение и оказывает более эффективное воздействие по сравнению с прототипом. Полученный биоПАВ образует стойкую эмульсию нефти с водой, которая не разделяется в течение 36 часов. Как можно видеть из таблицы 2 реологические показатели нефти после контакта с биомассой гриба по предлагаемому способу по сравнению с прототипом: улучшаются.

Таблица 2 - Сравнительные физико-химические характеристики битуминизированной нефти Баклановского месторождения до и после воздействия на нее биоПАВ

№ скв. Плотность нефти,
г/см³ Вязкость нефти,
мм²/с Содержание Мех.
прим.
% к массе Серы
% Хлоридов
мг/дм³ АСП
% по массе Н₂О
% рН
ед. До воздействия биоПАВ 1 889,7 21,389 0,011 2,637 11568,23 0,85; 11,87; 2,69 3,0 6,7 2 917,7 1022,3 0,007 4,175 1064,42 6,90; 11,99; 1,39 46,2 7,5 3 978,7 2880,4 0,011 3,108 1076,54 12,69; 16,14; 2,89 27,8 7,8 После воздействия биоПАВ по прототипу 1 800,7 18,315 0,011 1,601 11300,10 0,75; 10,80; 2,05 2,2 6,1 2 890,7 820,25 0,007 3,674 1015,02 6,00; 10,75; 1,05 37,0 7,2 3 907,7 1870,4 0,011 2,991 900,50 11,72; 15,10; 2,62 19,0 7,0 После воздействия биоПАВ по предлагаемому способу 1 660,0 10,234 0,009 1,456 11200,0 0,50; 5,70; 1,38 0,9 6,8 2 700,7 710,32 0,005 3,000 1000,0 4,78; 7,10; 0,53 13,8 7,0 3 889,0 1100,1 0,011 1,236 880,0 8,20; 12,00; 1,68 15,2 7,4

Пример 2 Идентификация липофильных биологических поверхностно-активных веществ

Экстракцию липидов проводят из разрушенных клеток мицелия гриба экстракцией органическими растворителями: гексаном выделяют нейтральные липиды, смесью этанол-серный эфир (1:1) связанные липиды. Экстракцию полярных липидов проводят смесью хлорофом-изопропанол (1:2). Методом тонкослойной хроматографии устанавили, что в состав нейтральных липидов входят следующие соединения: R_f = 0.1-1,2-диглицериды; R_f = 0,3-высшие алифатические спирты; R_f = 0,6-триацилглицериды; R_f = 0,93-углеводороды. Связанные липиды экстрагируют в системе этанол- серный эфир (1:1) и методом тонкослойной хроматографии в системе петролейный эфир- диэтил. эф. - уксусная кислота (80:20:10). Липиды клеточной стенки включают в себя R_f = 0,6-триацилглицериды; R_f = 0,19-стерины; R_f = 0,38-жирные кислоты; R_f = 1,02-углеводороды, R_f = 0,88 - воска.

Липиды клеточной стенки гриба несколько отличаются от внутриклеточных липидов. Эти различия касаются соотношения полярных и нейтральных липидов, а также наличия в клеточной стенке восков. В клеточной стенке гриба содержится олеиновая кислота (44,02%), пальмитиновая кислота (30,65%), гептадекановая кислота ( 8,36%), стеариновая кислота 6,92%, линолевая кислота (9,05%). Полученная липидная фракция проявляет хорошие нефтесобирающие свойства в пресной воде (Кмакс.=71).

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить биомассу микроскопического гриба Hypomyces odoratus на отходах крахмального производства, обладающую новыми, не описанными ранее поверхностно-активными свойствами, обусловленными синтезом веществ липофильной природы, а именно комплекса насыщенных и ненасыщенных жирных кислот.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам получения биологических поверхностно-активных веществ (биоПАВ) микробиологического происхождения, и может быть использовано для добычи и транспортировки нефти, восстановления нефтезагрязненных территорий, а также в медицине, косметологии и пищевой промышленности. Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, заключается в получении более эффективного биоПАВ, обладающего более высокими поверхностно-активными свойствами, расширение ресурсной базы. Указанный технический результат достигается в результате глубинного культивирования микроскопического гриба Hypomyces odoratus ВКПМ F-242 на простых по составу питательных средах, содержащих минеральные соли и органический источник углерода - отходы крахмального производства. Более высокие поверхностно-активные свойства биомассы гриба по отношению к реологическим показателям высоковязких, обводненных, битуминизированных нефтей обусловлены синтезом биологических поверхностно-активных веществ липофильной природы, а именно комплекса насыщенных и ненасыщенных жирных кислот - олеиновой кислоты (44,02%), пальмитиновой кислоты (30,65%), гептадекановой кислоты (8,36%), стеариновой кислоты 6,92%, линолевой кислоты (9,05%). Полученная липидная фракция проявляет хорошие нефтесобирающие свойства в пресной воде (Кмакс.=71). 2 табл.

Способ получения биологических поверхностно-активных веществ (биоПАВ) для улучшения реологических свойств высоковязких, обводненных, битуминизированных нефтей путем глубинного культивирования микроскопического гриба Hypomyces odoratus ВКПМ F-242 в биореакторах в условиях аэрации на питательной среде, содержащей отходы пищевой промышленности, отличающийся тем, что в качестве питательной среды используется состав, %: мезга картофеля – 3, NH₄H₂PO₄ – 0,1, MgSO4 – 0,05, FeSO₄ – 0,001, остальное вода водопроводная, рНисх. 6,0-6,2, а выращивание гриба ведут при температуре 24-26°С в течение 72 ч.