Тест-система для выявления ДНК возбудителя контагиозной плевропневмонии крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, к средствам молекулярной диагностики, а именно к выявлению генома возбудителя контагиозной плевропневмонии крупного рогатого скота (КПП КРС).

КПП КРС - высококонтагиозное трансграничное заболевание жвачных животных эмерджентное для Российской Федерации, т.к. ранее никогда не регистрировалась на территории страны. В связи со значительным социально-экономическим ущербом, негативным воздействием на продовольственную безопасность многих стран мира, болезнь относится к особо опасным (карантинным) болезням и включена в число нотифицируемых заболеваний списка Всемирной организации здоровья животных (ВОЗЖ).

КПП КРС представляет собой контагиозное респираторное заболевание жвачных животных (родов Bos и Bubalus, т.е. в основном КРС, зебу, яков (Bos grunniens) и буйволов (Bubalus bubalis), вызываемое бактерией Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (Mmm SC) семейства Mycoplasmataceae.

MmmSC - это микоплазма, бесстеночная бактерия (молликут), которая принадлежит к так называемому “кластеру мукоидов”, который образует пять видов микоплазм, являющихся патогенами жвачных [1]. У данных пяти видов микоплазм одинаковые фенотипические и генотипические характеристики, которые вызывают перекрестные реакции при традиционных диагностических методах. Ближайшим родственником MmmSC является M. mycoides подвид capri (Mmc), который обычно встречается у коз.

Основным резервуаром инфекции является крупный рогатый скот, в естественных условиях могут поражаться также овцы и козы, но роль их в эпизоотологии КПП пока не ясна. Человек КПП не болеет. Устойчивость возбудителя КПП к физическим, химическим и другим факторам внешней среды относительно низкая. Инкубационный период болезни составляет от 3 недель до 6 месяцев.

Болезнь проявляется в отсутствии аппетита, лихорадке и таких респираторных признаках, как затрудненное, учащенное дыхание, кашель и выделения из носа у бычьих. Диагностика требует выделения этиологического агента. Основными проблемами, связанными с контролем и искоренением болезни, являются частое возникновение подострой и субклинической инфекции, персистентность хронических носителей после клинической фазы и отсутствие экстенсивного охвата вакцины. Основными источниками возбудителя являются больные и переболевшие животные, у которых до наступления полной инкапсуляции пораженных очагов возбудитель длительное время выделяется в окружающую среду с истечениями из носа, бронхиальным секретом при кашле, мочой, калом, молоком и околоплодной жидкостью. Основной путь передачи - аэрогенный. В естественных условиях не исключается передача возбудителя алиментарным, половым, трансплацентарным путями. Факторами передачи могут быть сперма, корма и объекты внешней среды, контаминированные возбудителем.

Заболевание оказывает серьезное воздействие на животноводство в связи с возможностью его быстрого распространения. В результате страны, где регистрируется КПП КРС, исключаются из международной торговли живыми животными, что приводит к значительным потерям производительности в животноводстве из-за высокого уровня смертности и заболеваемости. Контагиозная плевропневмония КРС является энзоотичной во многих расположенных к югу от Сахары африканских странах.

Долгое время заболевание ограничивалось центрально-восточными Альпами, которые представляют собой колыбель КПП КРС. Из-за роста торговли скотом она распространилась по всему миру (Европа, США, Австралия, Африка, Азия), за исключением Южной Америки и Мадагаскара [2].

В течение 20-го века реализация стратегий массовой вакцинации и санитарного убоя позволила искоренить КПП КРС в большинстве стран. Впоследствии вспышки КПП происходили с 1984 г. в некоторых странах Средиземноморья (Португалия, Франция, Италия и Испания), пока они не были окончательно ликвидированы в 1999 г., когда последний случай был зарегистрирован в Португалии [3].

В настоящее время КПП является эндемичным заболеванием во многих странах Африки к югу от Сахары, где она значительно снижает прибыльность животноводства. За период 2019 - 2022гг ВОЗЖ зарегистрировано 19 стран Африки, неблагополучные по КПП КРС, при этом, наибольшее количество очагов КПП КРС было диагностировано в Того (112 очагов) и в Нигерии (56 очагов).

В настоящее время Российская Федерация имеет Статус исторического благополучия по КПП КРС, с постоянным контролем ввозимого поголовья КРС, в том числе через регионы с неизвестным статусом по КПП КРС, что обуславливает необходимость наличия высокочувствительных методов диагностики, позволяющих оперативно проводить мониторинг эпизоотической ситуации в стране.

Поскольку клинические признаки КПП КРС не являются патогномоничными (специфичными), диагноз следует подтверждать лабораторными исследованиями. Согласно руководству ВОЗЖ диагноз на КПП КРС может быть поставлен с помощью ряда серологических методов, к которым относится реакции связывания комплемента (РСК), иммуноферментный анализ (ИФА), который считается предпочтительным при недоступности молекулярных методов исследования или при неудовлетворительном состоянии биологических образцов. Данный метод также может быть рекомендован при проведении мониторинговых исследований сывороток крови с целью выявления циркуляции вируса у восприимчивого поголовья и оценки иммунитета. Однако в случае подозрения на наличие возбудителя и для его подтверждения необходимо использовать методы, выявляющие геном возбудителя.

Наиболее распространенными и надежными лабораторными методами обнаружения генома возбудителя является ПЦР.

Целью изобретения является создание тест-системы для выявления ДНК возбудителя контагиозной плевропневмонии крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.

Согласно рекомендациям ВОЗЖ ПЦР стала предпочтительным методом по причине возможности быстрой и специфической идентификации MmmSC для подтверждения клинических случаев заболевания. Разные авторы разработали систему ПЦР для идентификации MmmSC, но предпочтительного метода нет. Праймеры, комплементарные области ДНК САР-21, гену IppA и гену 16S рРНК генома MmmSC, были разработаны разными авторами и используются в системах ПЦР, после чего проводится рестрикционный эндонуклеазный анализ продукта амплификации (ампликона) (PCR-REA) или повторная амплификация (гнездовая ПЦР).

Известна тест-система ПЦР, используемая при рутинной идентификации MmmSC, процедура постановки PCR-REA, описана в материалах Bashiruddin et al., 1994. [4]. Одноэтапная ПЦР была также описана Miles et al. (2006) [5].

Известен способ выявления одиннадцати вирусных и бактериальных патогенов КРС, включая MmmSC с помощью количественной ПЦР в режиме реального времени в формате мультиплекс [6]. Недостатком этого способа является одновременная амплификация 11 локусов бактерии и вирусов, что сказывается на чувствительности детекции нуклеиновой кислоты, находящейся в наименьшей концентрации и может приводить к ложноотрицательным результатам.

В настоящее время в мире выпускают коммерческие тест-системы (Bioin Gentech Biotechnology, Чили) [7], которые являются логистически труднодоступными, в РФ подобные тест-системы не выпускаются.

Таким образом, разработка отечественной чувствительной и специфичной тест-системы для выявления ДНК возбудителя контагиозной плевропневмонии крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, с возможностью исследования широкого спектра биологического материала (назальные, трахеальные смывы; бронхо-альвеолярный лаваж; бурсальная суставная жидкость; пунктат из плевральной полости; стабилизированная кровь; патологический материал (фрагменты органов и тканей); сперма и др.), является актуальной технической проблемой. Для ее решения была создана тест-система для выявления ДНК возбудителя контагиозной плевропневмонии крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, содержащая специфичные олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченный олигонуклеотидный зонд, а также осуществлен подбор условий проведения исследований с помощью разработанного диагностикума, обеспечивающий минимальный риск контаминации тестируемых образцов и исключающих субъективность при оценке результатов.

Изобретение относиться к тест-системе для специфичной идентификации ДНК возбудителя контагиозной плевропневмонии КРС методом ПЦР в режиме реального времени, состоящей из смеси олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченного зонда, фермента Taq-полимеразы, обратной транскриптазы, положительного контроля, отрицательного контроля, отрицательного контрольного образца и внутреннего контрольного образца.

Флуоресценцию измеряют на каналах Green/FAM и Red/Cy5. Результаты интерпретируются на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, что соответствует наличию или отсутствию на каналах FAM/Green и Cy5/Red значения порогового цикла (Ct) в соответствующей графе таблицы результатов, отображаемой амплификатором. Значение порогового цикла амплификации для положительного контроля амплификации регистрируется не более 35 (Ct≤35); значение порогового цикла амплификации на каналах Green / FAM и Red/Cy5 для отрицательного контроля ПЦР не регистрируется; значение порогового цикла амплификации на канале FAM/Green для отрицательного контрольного образца не регистрируется.

Изобретение может быть использовано для выявления ДНК возбудителя КПП КРС в различных пробах биологического материала, с целью проведения клинической и лабораторной диагностики, а также научно-исследовательских работ в области ветеринарии.

Техническим результатом изобретения являются: высокая специфичность в отношении всех возможных генетических вариантов возбудителя КПП КРС; расширенный спектр пригодного для проведения исследований биологического материала, без риска получения ложноположительных результатов; минимальные требования для постановки ПЦР-РВ, что дает возможность использования широкого спектра амплификаторов; сокращение времени тестирования проб на наличие ДНК КПП КРС, в том числе и при проведении массовых исследований; расширение арсенала средств диагностики КПП КРС.

Представленная тест-система включает последовательности олигонуклеотидов, специфичные для возбудителя контагиозной плевропневмонии КРС и имеющие следующую нуклеотидную последовательность:

Forward (прямой праймер) - TATGTTTAGTGACACAAAACAATTTA

Reverse (обратный праймер) - CTCGATAAAACATATTTTTCATATTTTTAACA

Probe (зонд) (FAM) - TTTTAACATTACTTACATTT (BHQ).

Сущность изобретения заключается в том, что тест-система способна выявлять полевые изоляты и вакцинные штаммы возбудителя КПП КРС (MmmSC). Высокая степень специфичности тест-системы подтверждена с помощью лабораторных исследований на панели гомологичных и гетерологичных проб.

Сущность изобретения пояснена на графическом изображении:

Фиг. 1 - Линейность результатов ПЦР в режиме реального времени при тестировании 10-кратных разведений выделенной ДНК возбудителя КПП КРС (штамм «Madugri-8»).

Детекция продуктов амплификации осуществляется методом регистрации флуоресценции, генерируемой в результате разрушения гибридизационного зонда, находящегося на 5’-конце флуорофор FAM для целевого фрагмента и Cy5 для ВКО, а на 3’-конце - гасителя BHQ1 для целевого фрагмента и BHQ2 для ВКО. В отсутствии мишени флуорофор и гаситель сближены, и наблюдается лишь незначительная флуоресценция, так как гаситель поглощает испускаемое флуорофором излучение. При накоплении в ходе ПЦР специфических продуктов зонд гибридизируется на ампликон, что ведет к его разрушению за счет 5’-экзонуклеазной активности Taq-полимеразы. В результате флуорофор отделяется от гасителя и его излучение может быть детектировано. Таким образом, увеличение флуоресценции прямо пропорционально количеству синтезированного ПЦР-продукта.

Тест-система для выявления ДНК возбудителя контагиозной плевропневмонии крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени состоит из следующих компонентов:

№ 1 готовая ПЦР- смесь «КПП», объем 0,800 см³ - 1 пробирка;

№ 2 фермент Taq ДНК-полимераза, объем 0,030 см³ - 1 пробирка;

№ 3 отрицательный контроль ПЦР, 0,150 см³ - 1 пробирка;

№ 4 положительный контроль «КПП», 0,150 см³ - 1 пробирка;

№ 5 внутренний контрольный образец «ВКО», 0,500 см³ - 1 пробирка;

№ 6 отрицательный контрольный образец «ОКО», 1,000 см³ - 1 пробирка.

В качестве отрицательного контроля (пробирка №3) используется деионизованная вода, а в качестве положительного контроля «КПП» (пробирка № 4) - материал, содержащий выделенную ДНК возбудителя КПП КРС, строго соответствующую участку гена, кодирующего мембранный липопротеин IppQ. Положительный контроль позволяет удостовериться в том, что все компоненты, входящие в состав реакционной смеси, обеспечивают прохождение реакции. Экстракция ДНК из исследуемого биоматериала проводится в присутствии экзогенного внутреннего контрольного образца «ВКО» (пробирка №5) (искусственно синтезированный препарат ДНК, который имеет принципиально отличную от искомой олигонуклеотидную последовательность), позволяющий контролировать все этапы ПЦР-анализа.

ПЦР в режиме реального времени проводится в программируемом амплификаторе в одну стадию с использованием смеси, включающей на одну реакцию: готовую ПЦР-смесь (пробирка №1) и фермент Taq-ДНК-полимеразу (пробирка №2). Перед началом постановки реакции необходимо разморозить готовую ПЦР-смесь, встряхнуть на шейкере, затем центрифугировать несколько секунд на низкоскоростной центрифуге.

Смесь для проведения реакции готовят в пробирке в расчете на одну реакцию следующим образом:

- Готовая ПЦР-смесь «КПП» 15 мкл, - Фермент Taq ДНК-полимераза 0,5 мкл.

Приготовленную в отдельных пробирках смесь для проведения реакции переносят по 15 мкл в пробирки соответствующего объема и вносят 10 мкл проб ДНК. В соответствующие пробы вносят также отрицательный контроль экстракции, выделенный из отрицательного контрольного образца «ОКО» (пробирка № 6), отрицательный контроль ПЦР (пробирка № 3) и положительный контроль «КПП» (пробирка №4). Общий объем смеси - 25 мкл.

Пробирки устанавливают в амплификатор для постановки ПЦР в режиме реального времени, отмечают в программе расположение и характеристику проб, выбирают рабочие красители FAM и Cy5, устанавливают в программе температурно-временной профиль реакции.

Программирование амплификатора осуществляется согласно инструкции производителя. Режим термического профиля должен соответствовать показателям, описанным в таблице 1.

Результаты после амплификации интерпретируют на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, что соответствует наличию или отсутствию на каналах Green/FAM и Red/Cy5 значений пороговых циклов амплификации (Ct), в соответствующих графах в таблицах результатов, отображаемых амплификатором.

Результат считают верным при получении правильных результатов для отрицательного контроля ПЦР (пробирка № 3), отрицательного контрольного образца «ОКО» (пробирка № 6) и положительного контроля «КПП» (пробирка № 4). Требования к контролям описаны в таблице 2.

Интерпретацию результатов для исследуемых образцов необходимо проводить согласно требованиям, описанным в таблице 3. Для отрицательного контроля ПЦР значения порогового цикла Ct по каналам Green/FAM и Red/Cy5 должны отсутствовать; для отрицательного контрольного образца «ОКО» после экстракции с добавлением «ВКО» по каналу Red/Cy5 значение порогового цикла должно быть Ct≤35, а по каналу Green/FAM значение Ct должно отсутствовать; значения порогового цикла Ct положительного контроля «КПП» по каналам Green/FAM и Red/Cy5 должны соответствовать указанному пределу ≤35.

После соответствия контролей проводят интерпретацию полученных результатов анализа исследуемых проб: проба считается отрицательной, если по каналу Green/FAM значение Ct не регистрируется, а по каналу Red/Cy5 имеет значение в пределах Ct ≤ 35, что говорит об отсутствии ДНК возбудителя контагиозной плевропневмонии; проба считается положительной, если по каналу Green/FAM Ct ≤ 35 и по каналу Red/Cy5 Ct определено или отсутствует, что говорит о наличие в исследуемом образце ДНК возбудителя КПП КРС. Если после амплификации по каналу Green/FAM получен результат Ct > 35, а по каналу Red/Cy5 Ct ≤ 35, то это интерпретируется как сомнительный результат и необходимо провести повторное исследование для соответствующих образцов, начиная с этапа экстракции ДНК, и при повторении результата считается, что ДНК возбудителя КПП КРС в образце выявлена.

Не достоверным считается результат если отмечается отсутствие Ct или когда его значение > 35 на обоих каналах считывания, в таком случае также необходимо провести повторное исследование для соответствующих образцов с этапа экстракции ДНК.

Предлагаемая разработанная ФГБУ «ВНИИЗЖ» тест-система для выявления ДНК возбудителя контагиозной плевропневмонии крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени является новой и промышленно применимой. Тест-система создана путем дизайна и подбора праймеров, компоновки компонентов тест-системы, лабораторной оценки основных характеристик и совместного использования сведений, содержащихся в уровне техники, а также общих знаний специалиста в области биотехнологии.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Применение тест-системы и оценка специфичности тест-системы (предлагаемого изобретения)

Для оценки специфичности тест-системы (предлагаемого изобретения) использовались следующие образцы генома различных гомологичных и гетерологичных вирусов и бактерий: штамм «Вологда/2020» респираторно-синцитиального вируса КРС, штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса вирусной диареи КРС, штамм «ВГНКИ-4» вируса парагриппа-3 КРС, бактериальные штаммы: «Madugri-8» MmmSC, «Т1/44» MmmSC, «ЕС-21» E.coli, №1412 Mannheimia haemolytica, №1414 Pasteurella multocida, №19852 Mycoplasma bovigenitalium (АТСС), №27140 Mycoplasma dispar (АТСС), №25523 Mycoplasma bovis (АТСС). Результаты оценки специфичности изложены в таблице 4.

Работу с нуклеиновой кислотой проводили в условиях, регламентированных МУ 1.3. 2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенности» [8].

Процедуру выделения нуклеиновых кислот из исследуемого материала проводили с использованием «Набор реагентов для выделения РНК/ДНК из биологического материала «Про100сорб» (ФГБУ «ВНИИЗЖ», Россия) или аналога.

ПЦР в режиме реального времени и регистрацию результатов проводили в приборе по описанной выше программе.

Результаты интерпретировали на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линии, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла Ct в соответствующей графе в таблице результатов. Результат считали положительным в случае, если кривая накопления флуоресценции для соответствующего образца имела характерную «сигмовидную» форму и пересекала пороговую линию.

При тестировании специфичности тест-системы для выявления ДНК возбудителя контагиозной плевропневмонии крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием ДНК возбудителя КПП КРС и гетерологичных вирусов и бактерий ложноположительных и ложноотрицательных результатов не выявлено (табл. 4).

Данным примером показана возможность использования предлагаемого изобретения - тест-системы для выявления ДНК возбудителя контагиозной плевропневмонии крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для проведения диагностических исследований по выявлению ДНК возбудителя КПП КРС с 100% специфичностью.

Пример 2. Оценка предела обнаружения (аналитическая чувствительность) тест-системы

Предел обнаружения ДНК MmmSC с помощью разработанной тест-системы определяли с использованием ДНК MmmSC штамма «Madugri-8», выделенного из ряда десятикратных последовательных разведений культурального материала, с исходной активностью 4×10⁵ КОЕ/см³. Каждое разведение исследовалось в пяти повторностях.

Проведённые исследования показали, что для тест-системы для выявления ДНК возбудителя контагиозной плевропневмонии крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (предлагаемое изобретение) предел обнаружения ДНК MmmSC составляет 40 КОЕ/см³ (табл. 5), и показывает, что аналитическая чувствительность тест-системы соответствует заявленным параметрам и позволяет выявлять не менее 40 колониеобразующих единиц (клеток бактерий) в единице объема - 1 см³.

Пример 3. Оценка эффективности амплификации тест-системы (предлагаемого изобретения)

Эффективность амплификации при постановке ПЦР-РВ с использованием тест-системы для выявления ДНК возбудителя контагиозной плевропневмонии крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени оценивали с помощью серии последовательных 10-кратных разведений положительного образца биоматериала, содержащего ДНК MmmSC в трех повторностях.

На основе полученных средних значений порогового цикла каждого разведения значение эффективности амплификации (Е) составило 92,2%. Коэффициент детерминированности r2 составил 0,9964. Стандартное отклонение (SD) на протяжении разведений варьировало от 0,28 до 0,62 (табл. 6) (Фиг. 1). Полученные результаты свидетельствуют о высокой эффективности и минимальных значениях стандартного отклонения при повторных постановках, что соответствует основным валидационным критериям.

Пример 4. Оценка повторяемости и воспроизводимости тест-системы

Оценку промежуточной прецизионности в условиях повторяемости (сходимость) проводили с одним образцом, который тестировали в 5 повторностях в течение трех запусков (n=15).

Среднее значение порогового цикла (Ct) на протяжении трёх запусков повторений варьировало от 30,74 до 30,94 с разбросом стандартного отклонения (SD) от 0,26-0,31. Коэффициент вариации составил 0,91% при максимальном допустимом значении 10%. Суммирование результатов трёх запусков показало среднее значение порогового цикла (Ct) 30,86 и стандартного отклонения ±0,28 (табл. 6).

Таким образом, результаты исследования одной пробы в 5 повторностях, выполненных в одних и тех же условиях измерения (оборудование, оператор и короткий промежуток времени, т.е. в условиях повторяемости) в течение одного дня полностью совпадают с ожидаемым результатом.

Оценку внутри лабораторной прецизионности в условиях воспроизводимости (воспроизводимость) проводили с учётом таких показателей, как: «персонал», «время» и «оборудование». Испытания проводили с использованием биологического материала, содержащего или не содержащего ДНК MmmSC.

Результаты проведённых исследований показали, что результаты выявления ДНК MmmSC с использованием разработанной тест-системы (предлагаемое изобретение) полностью совпадают с ожидаемым результатом и не зависят от показателей «время», «персонал» и «оборудование» (табл. 7).

Таким образом, предлагаемое изобретение может быть использовано в ветеринарной практике для выявления генетического материала возбудителя КПП КРС в биологических и культуральных образцах, с целью постановки и уточнения диагноза, для решения научно-исследовательских задач, проведения мониторинга распространения КПП КРС среди восприимчивых животных. Использование специфических праймеров и зонда позволяет выявить генетический материал всех генетических вариантов возбудителя КПП КРС методом ПЦР в режиме реального времени.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Тест-система для выявления ДНК возбудителя контагиозной плевропневмонии крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени»:

1. Manso-Silvan, L., Vilei, E.M., Sachse, K., Djordjevic, S.P., Thiaucourt, F., Frey, J. 2009. Mycoplasma leachii sp. nov. as a new species designation for Mycoplasma sp. bovine group 7 of Leach, and reclassification of Mycoplasma mycoides subsp. mycoides LC as a serovar of Mycoplasma mycoides subsp. capri. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 59: 1353-1358.

2. Contagious bovine pleuropneumonia: A Comprehensive overview / G. Di Teodoro, G. Marruchella, A. Di Provvido [et al.] // Veterinary Pathology. - 2020. - № 4(57). - P. 476-489.

3. Nicholas, R. Contagious Bovine Pleuropneumonia. / R. Nicholas, R. Ayling, L. McAuliffe - Wallingford UK: CABI, 2008. - P. 69-97.

4. Contagious bovine pleuropneumonia: An update/ G.O. Egwu, R.A.J. Nicholas, J.A. Ameh, J. B. Bashiruddin // The Veterinary bulletin 66(9):875-888 (1996).

5. Office International des Epizooties (OIE). Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals 2017. Chapter 2.4.9. Contagious bovine pleuropneumonia. Available http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/. No date.

6. Патент CN113249517A. Primer, probe and kit for real-time fluorescent quantitative PCR (polymerase chain reaction) detection of bovine plague.

7. https://bioingentech.com/

8. МУ 1.3.2569-09 Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности.

Таблица 1
Режим термического профиля амплификации Этап Температура, °С Время, сек. Измерение флуоресценции Количество циклов амплификации Удержание температуры 95 600 - 1 Амплификация со считыванием 95 10 - 40

Таблица 2
Требования к результатам контролей после амплификации Контроль Значение порогового цикла (Ct) канал Green / FAM канал Red / Cy5 отрицательный контроль ПЦР отсутствует отсутствует отрицательный контрольный образец «ОКО» отсутствует ≤35 положительный контроль «КПП» ≤35 ≤35

Таблица 3
Интерпретация результатов для исследуемых образцов Значение порогового цикла (Ct) Результат канал Green / FAM
(ДНК возбудителя КПП КРС) канал Red / Cy5
(ВКО) отсутствует ≤35 ДНК возбудителя контагиозной плевропневмонии крупного рогатого скота не выявлена ≤35 определено или отсутствует ДНК возбудителя контагиозной плевропневмонии крупного рогатого скота выявлена >35 ≤35 сомнительный¹ отсутствует или > 35 отсутствует или > 35 не достоверен² Примечание: 1 - провести повторное исследование для соответствующих образцов, начиная с этапа экстракции ДНК. При повторении результата считать, что ДНК КПП КРС в образце выявлена 2 - провести повторное исследование для соответствующих образцов с этапа экстракции ДНК.

Таблица 4
Штаммы и изоляты различных микроорганизмов, использованные для оценки специфичности разработанной тест-системы (предлагаемое изобретение) Наименование возбудителя Штамм Результат
(предлагаемое изобретение) E.coli «ЕС-21» отр. Mannheimia haemolytica №1412 отр. Pasteurella multocida №1414 отр. Mycoplasma bovigenitalium АТСС №19852 отр. Mycoplasma dispar АТСС №27140 отр. Mycoplasma bovis АТСС №25523 отр. Вирус парагриппа-3 КРС «ВГНКИ-4» отр. Респираторно-синцитиальный вирус КРС «Вологда/2020» отр. Вирусная диарея КРС «NADL-ВНИИЗЖ» отр. Вода свободная от нуклеаз --- отр. MmmSC «Madugri-8» пол. MmmSC «Т1/44» пол. Примечание: отр. - результат отрицательный пол. - результат положительный

Таблица 5
Определение предела обнаружения специфичной матрицы (ДНК штамма «Madugri-8» MmmSC) тест-системы для выявления ДНК возбудителя контагиозной плевропневмонии крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени Характеристика матрицы Результат выявления ДНК КПП КРС, повторность Соответствие с ожидаемым результатом, % 1 2 3 4 5 400000 КОЕ/см³ пол.* пол. пол. пол. пол. 100% 40000 КОЕ/см³ пол. пол. пол. пол. пол. 100% 4000 КОЕ/см³ пол. пол. пол. пол. пол. 100% 400 КОЕ/см³ пол. пол. пол. пол. пол. 100% 400 КОЕ/см³ пол. пол. пол. пол. пол. 100% 40 КОЕ/см³ пол. пол. пол. пол. пол. 100% 4 КОЕ/см³ отр.** пол. пол. отр. отр. 40% Примечание: пол.* - ДНК КПП КРС выявлена отр.** - ДНК КПП КРС не выявлена

Таблица 6
Определение повторяемости результатов исследования при использовании тест-системы (предлагаемое изобретение) Номер запуска Номер повторности Полученное значение Ct Среднее значение Ct Стандартное отклонение Коэффициент вариации I 1 30,37 30,74 ±0,27 ±0,88 2 30,59 3 30,76 4 31,08 5 30,89 II 1 30,92 30,94 ±0,31 ±1,00 2 31,27 3 30,91 4 31,15 5 30,45 III 1 31,03 30,89 ±0,26 ±0,84 2 30,47 3 31,16 4 30,94 5 30,86 Итого: 30,86 ±0,28 ±0,91

Таблица 7
Определение внутри лабораторной прецизионности тест-системы по выявлению ДНК возбудителя КПП КРС методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, с учётом показателя «время», «персонал», «оборудование» № п/п Характеристика матрицы Результат Соответствие с ожидаемым результатом день 1 день 2 день 3 ДНК штамма ««Madugri-8»» MmmSC пол.* пол. пол. 100% ДНК штамма «ЕС-21» E.coli отр.** отр. отр. 100% ДНК штамма №1412 Mannheimia haemolytica отр. отр. отр. 100% ДНК штамма №1414 Pasteurella multocida отр. отр. отр. 100% ДНК штамма АТСС №19852 Mycoplasma bovigenitalium отр. отр. отр. 100% ДНК штамма АТСС №25523 Mycoplasma bovis отр. отр. отр. 100% ДНК штамма АТСС №27140 Mycoplasma dispar отр. отр. отр. 100% ДНК штамма «ВГНКИ-4» вируса парагриппа-3 отр. отр. отр. 100% РНК штамма «Вологда/2020» вируса респираторно-синцитиальной инфекции КРС отр. отр. отр. 100% РНК штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса вирусной диареи КРС отр. отр. отр. 100% вода свободная от нуклеаз отр. отр. отр. 100% стабилизированная кровь, содержащая ДНК штамма «Madugri-8» MmmSC пол. пол. пол. 100% культуральная жидкость, содержащая ДНК штамма «Madugri-8» MmmSC пол. пол. пол. 100% смыв слизистой носовой полости, содержащая ДНК штамма ««Madugri-8»» MmmSC пол. пол. пол. 100% плевральную жидкость, содержащая ДНК штамма «Madugri-8» MmmSC пол. пол. пол. 100% стабилизированная кровь, содержащая РНК штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса вирусной диареи КРС отр. отр. отр. 100% плевральная жидкость, содержащая РНК штамма «Вологда/2020» вируса респираторно-синцитиальной инфекции КРС отр. отр. отр. 100% смыв слизистой носовой полости, содержащая ДНК штамма №1412 Mannheimia haemolytica отр. отр. отр. 100% проба лимфатических узлов, содержащая ДНК штамма АТСС №25523 Mycoplasma bovis отр. отр. отр. 100% проба лимфатических узлов, содержащая ДНК штамма «Madugri-8» MmmSC пол. пол. пол. 100% проба бурсальной жидкости, содержащая ДНК штамма «Madugri-8» MmmSC пол. пол. пол. 100% культуральная жидкость, содержащая ДНК штамма «Madugri-8» MmmSC пол. пол. пол. 100% проба лёгких, содержащая ДНК штамма «Madugri-8» MmmSC пол. пол. пол. 100% стабилизированная кровь, содержащая ДНК штамма АТСС №19852 Mycoplasma bovigenitalium отр. отр. отр. 100% проба лимфатических узлов, содержащая ДНК штамма АТСС №27140 Mycoplasma dispar отр. отр. отр. 100% смыв слизистой носовой полости, содержащая ДНК штамма №1412 Mannheimia haemolytica отр. отр. отр. 100% проба трахеи, содержащая ДНК штамма №1414 Pasteurella multocida отр. отр. отр. 100% стабилизированная кровь, содержащая ДНК штамма «ВГНКИ-4» вируса парагриппа-3 отр. отр. отр. 100% смыв слизистой носовой полости, содержащая РНК штамма «Вологда/2020» вируса респираторно-синцитиальной инфекции КРС отр. отр. отр. 100% смыв слизистой носовой полости, содержащая ДНК штамма №1414 Pasteurella multocida отр. отр. отр. 100% проба трахеи, содержащая РНК штамма «Вологда/2020» вируса респираторно-синцитиальной инфекции КРС отр. отр. отр. 100% стабилизированная кровь, содержащая РНК штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса вирусной диареи КРС отр. отр. отр. 100% плевральная жидкость, содержащая ДНК штамма ««Madugri-8»» MmmSC пол. пол. пол. 100% смыв слизистой носовой полости, содержащая ДНК штамма АТСС №27140 Mycoplasma dispar отр. отр. отр. 100% культуральная жидкость, содержащая РНК штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса вирусной диареи КРС отр. отр. отр. 100% стабилизированная кровь, содержащая ДНК штамма «ВГНКИ-4» вируса парагриппа-3 отр. отр. отр. 100% плевральная жидкость, содержащая РНК штамма «Вологда/2020» вируса респираторно-синцитиальной инфекции КРС отр. отр. отр. 100% смыв слизистой носовой полости, содержащая ДНК штамма АТСС №27140 Mycoplasma dispar отр. отр. отр. 100% проба лёгких, содержащая ДНК штамма «№1412» Mannheimia haemolytica отр. отр. отр. 100% стабилизированная кровь, содержащая ДНК штамма №1412 Mannheimia haemolytica отр. отр. отр. 100% плевральную жидкость, содержащая ДНК штамма №1412 Mannheimia haemolytica отр. отр. отр. 100% смыв слизистой носовой полости, содержащая ДНК штамма АТСС №19852 Mycoplasma bovigenitalium отр. отр. отр. 100% стабилизированная кровь, содержащая ДНК штамма «ВГНКИ-4» вируса парагриппа-3 отр. отр. отр. 100% стабилизированная кровь, содержащая РНК штамма «Вологда/2020» вируса респираторно-синцитиальной инфекции КРС отр. отр. отр. 100% культуральная жидкость, содержащая ДНК штамма «Madugri-8» MmmSC пол. пол. пол. 100% смыв слизистой носовой полости, содержащая ДНК штамма «ВГНКИ-4» вируса парагриппа-3 отр. отр. отр. 100% проба лимфатических узлов, содержащая ДНК штамма АТСС №19852 Mycoplasma bovigenitalium отр. отр. отр. 100% стабилизированная кровь, содержащая ДНК штамма ««Madugri-8»» MmmSC пол. пол. пол. 100% проба бурсальной жидкости, содержащая ДНК штамма «Madugri-8» MmmSC пол. пол. пол. 100% смыв слизистой носовой полости, содержащая ДНК штамма «ЕС-21» E.coli отр. отр. отр. 100% культуральная жидкость, содержащая ДНК штамма «ЕС-21» E.coli отр. отр. отр. 100% Примечание: пол.* - ДНК MmmSC выделена отр** - ДНК MmmSC не выделена

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Тест-система для

выявления ДНК возбудителя контагиозной плевропневмонии крупного

рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в режиме реального

времени.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0"

productionDate="2024-03-19">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2023123488</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-10-13</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>534</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2023123488</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-10-13</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ &quot;Федеральный центр охраны

здоровья животных&quot; (ФГБУ &quot;ВНИИЗЖ&quot;)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FGBI &quot;ARRIAH&quot;</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Бьядовская Ольга

Петровна</InventorName>

<InventorNameLatin>Biadovskaia Olga Petrovna</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Тест-система для выявления ДНК

возбудителя контагиозной плевропневмонии крупного рогатого скота

методом полимеразной цепной реакции в режиме реального

времени</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>3</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>26</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..26</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q3">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Mycoplasma mycoides</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tatgtttagtgacacaaaacaattta</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>32</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..32</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q5">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Mycoplasma mycoides</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ctcgataaaacatatttttcatatttttaaca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q7">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Mycoplasma mycoides</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ttttaacattacttacattt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии. Описано средство молекулярной диагностики. Разработана высокочувствительная тест-система, состоящая из готовой ПЦР смеси «КПП», Taq-ДНК-полимеразы, положительного контроля «КПП», отрицательного контроля, внутреннего контрольного образца «ВКО» и отрицательного контрольного образца «ОКО», позволяющая в кратчайшие сроки выявить ДНК возбудителя контагиозной плевропневмонии крупного рогатого скота (MmmSC). Разработаны олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченый зонд для амплификации и детекции участка гена, кодирующего мембранный липопротеин IppQКПП КРС(MmmSC):

прямой праймер – TATGTTTAGTGACACAAAACAATTTA,

обратный праймер – CTCGATAAAACATATTTTTCATATTTTTAACA,

зонд FAM – TTTTAACATTACTTACATTT-BHQ.

Изобретение может быть использовано для выявления ДНК всех генетических вариантов возбудителя контагиозной плевропневмонии крупного рогатого скота в пробах широкого спектра патологического и биоматериала с целью постановки и уточнения клинической и лабораторной диагностики в ветеринарии. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 7 табл., 4 пр.

1. Тест-система для амплификации и детекции участка гена, кодирующего мембранный липопротеин IppQ возбудителя контагиозной плевропневмонии крупного рогатого скота, включающая ПЦР смесь, содержащую олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченый зонд:

Forward-прямой праймер - TATGTTTAGTGACACAAAACAATTTA,

Reverse-обратный праймер - CTCGATAAAACATATTTTTCATATTTTTAACA,

Probe-зонд FAM - TTTTAACATTACTTACATTT (BHQ),

фермент Taq-ДНК-полимеразу, отрицательный контроль, положительный контроль, отрицательный контрольный образец, внутренний контрольный образец.

2. Тест-система по п.1, обладающая чувствительностью 40 КОЕ/см³, позволяющая обнаружить и выявить ДНК возбудителя контагиозной плевропневмонии крупного рогатого скота в расширенном спектре биологического материала.