Штамм бактерии "Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1/44/ВНИИЗЖ" возбудителя контагиозной плевропневмонии КРС для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики контагиозной плевропневмонии КРС Российский патент 2025 года по МПК C12N1/20 C12R1/35 

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и биотехнологии, может быть использовано для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики контагиозной плевропневмонии КРС.

Контагиозная плевропневмония крупного рогатого скота (КПП КРС) - это бактериальное респираторное заболевание КРС, вызываемое Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC), характеризующееся тяжелой фибринозной экссудативной плевропневмонией и вызывает значительные потери производительности в животноводческой отрасли из-за высокой летальности и заболеваемости, летальность в пораженных стадах варьировала от 10 до 90% [1, 2, 3].

Возбудитель инфекции – Mycoplasma mycoides subspecies mycoides (MmmSC) относящийся к классу Mollicutes, порядку Mycoplasmatales, семейству Mycoplasmataceae, роду Mycoplasma, виду Mycoplasma mycoides, подвиду mycoides Small Colony (MmmSC). MmmSC является одной из самых мелких бактерий с небольшим размером генома и, соответственно, малым количеством синтезируемых белков. Геном характеризуется единственной кольцевой молекулой ДНК с низким содержанием гуанина/цитозина и самой высокой плотностью инсерционных последовательностей (13% от размера генома) среди всех секвенированных бактериальных геномов [1, 2].

Контагиозная плевропневмония КРС является заболеванием, внесенным в список Всемирной организации здравоохранения животных (ВОЗЖ), и подлежащее обязательному уведомлению. Страны, эндемичные по контагиозной плевропневмонии, ограничены в международной торговле КРС. До конца 2004 года это было единственное бактериальное заболевание из 15 «Списке А» заболеваний ВОЗЖ [3], о случаи возникновения или повторного возникновения, которого в любой стране-члене необходимо сообщать организации в течение 24 часов, с еженедельным отслеживанием и оценкой ситуации каждые 6 месяцев. За исключением Южной Америки и Мадагаскара, случаи КПП происходили во многих странах мира. После борьбы с чумой КРС, КПП является наиболее значимым заболеванием для здоровья животных в Африке, где оно присутствует и в настоящее время [1, 4].

Российская Федерация – первая из стран ЕАЭС, которая в 2020 г. включена ВОЗЖ в список из 20 стран, официально благополучных по контагиозной плевропневмонии КРС (всего членами ВОЗЖ являются 182 страны мира). В настоящее время основное внимание сосредоточено на предотвращении заноса возбудителя болезни на территорию РФ с импортным скотом и сырьем из неблагополучных регионов [4].

На основе молекулярно-эпидемиологического исследования MmmSC была разделена на два основных эпизоотологически различных кластера. Один кластер содержит штаммы, выделенные в разных европейских странах с 1980 г., а второй – африканские и австралийские штаммы, собранные за последние 50 лет. При этом хорошо известно, что африканские штаммы MmmSC обладают более эвысокой вирулентностью по сравнению с европейскими [5].

В настоящее время многие страны Африки с целью контроля, профилактики, или ликвидации КПП используют традиционные живые вакцины на основе аттенуированных штаммов возбудителя, размноженных в организме кроликов или путем серийного культивирования в куриных эмбрионах для снижения вирулентности [6, 7].

Известны производственные штаммы возбудителя контагиозной плевропневмонии КРС, которые применяются или использовались ранее в мире для производства средств специфической профилактики контагиозной плевропневмонии КРС:

− штамм «KH3J»;

− штамм «KH3J-SR»;

− штамм «T1/SR»;

− штамм «Ben-1»;

− штамм «T1/44».

Штаммы «KH3J» и «KH3J-SR» были исключены из применения в связи с их недостаточной и кратковременной иммуногенностью [8, 9].

Штамм «T1/SR» входит в состав стрептомицинорезистентной дериват вакцины против КПП, однако, исследования показывают, что в Ботсване во время вспышек контагиозной плевропневмонии в 1995 году, штамм показал свою низкую активность, поскольку не смог остановить распространение инфекции; следовательно, его использование не оправдалось [10].

Штамм «Ben-1» входит в состав лапинизированной вакцины в рамках комплексной программы ликвидации КПП КРС в Китае и было сообщено, что эта вакцина обеспечивает 95-100% защиту в течение 2 лет. Однако метод, используемый для ее производства – внутрибрюшинная инокуляция овец – неприемлем по современным стандартам благополучия и защиты животных. Кроме того, экспериментальная партия вакцины на основе этого штамма, произведенная на культуральных средах, была сравнена с коммерческой вакциной «T1/44» в in vivo исследовании на африканских породах КРС, однако ее защитная способность не превосходила коммерческую вакцину на основе штамма «T1/44» [11].

Штамм «T1/44» который входит в состав вакцины КПП КРС был аттенуирован путем серийного культивирования в куриных эмбрионах для снижения его вирулентности в 1950-х годах и основан на штамме T1, полученным со вспышки в Танзании, а в качестве вакцинного материала использован его 44-й пассаж «T1/44» [11]. Вакцина на основе штамма «T1/44» контагиозной плевропневмонии КРС рекомендуется ВОЗЖ для использования в эндемических районах Африки, поскольку в большинстве стран Африки, где заболевание является эндемичным, трудно реализовать ликвидацию и контроль передвижения КРС [12].

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является штамм «T1/44» контагиозной плевропневмонии КРС, используемый в Африке для изготовления средств профилактики и диагностики КПП КРС.

Недостатком данных штаммов является то, что вследствие сложившегося статуса благополучия в РФ по данному заболеванию (присвоен России в 2020 году ВОЗЖ), на территории РФ данные штаммы отсутствуют, и соответственно отсутствуют отечественные средства диагностики и профилактики, которые могут иметь практическое значение как для подтверждения этого статуса диагностическими методами, так и наличие возможности экстренной профилактики в случае возникновения опасности заноса контагиозной плевропневмонии КРС в Российскую Федерацию.

В задачу создания настоящего изобретения входило получение нового диагностического штамма бактерии, вызывающего контагиозную плевропневмонию КРС, обладающего широким антигенным спектром действия, высокой биологической, генетической и иммуногенной активностью и обеспечивающего изготовление биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики данного заболевания. Указанная задача решена в результате депонирования нового штамма бактерии «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ» возбудителя контагиозной плевропневмонии КРС, который может быть использован для изготовления биопрепаратов для диагностики и средств профилактики данного заболевания.

Технический результат позволяет расширить арсенал производственных штаммов контагиозной плевропневмонии КРС, обладающих высокой антигенной и иммуногенной активностью, пригодный для изготовления чувствительных и высокоспецифичных диагностических тест-систем и иммуногенных вакцинных препаратов путем получения штамма бактерий «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ» возбудителя контагиозной плевропневмонии КРС для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики.

Аттенуированный штамм бактерий «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC T1 / 44» передан в ФГБУ «ВНИИЗЖ» от Ветеринарной биолого-фармацевтической производственной компании «БИОФАРМА» Королевства Марокко в 2022 году.

Штамм бактерий «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ» возбудителя контагиозной плевропневмонии КРС получен путем адаптации штамма бактерии «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC T1 / 44» возбудителя контагиозной плевропневмонии КРС к репродукции в бесклеточной питательной среде Фриса в течение пяти последовательных пассажей в условиях ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Полученный штамм бактерии «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ» депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №522 – деп / 24-02 – ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Экспериментально подтверждена возможность использования штамма бактерии «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ» возбудителя контагиозной плевропневмонии КРС для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики контагиозной плевропневмонии КРС.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:

Фиг. 1 - Дендрограмма, отражающая филогенетическое родство штамма бактерии «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ» возбудителя контагиозной плевропневмонии КРС с другими штаммами M. mycoides по локусу LepA.

Фиг. 2 – Фазы роста и накопление штамма бактерии «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ» при культивировании в бесклеточной питательной среде Фриса.

Фиг. 3 –Колонии Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ, 3 (А) и 7 (Б) суточная культура (увеличение 40х при культивировании на плотной питательной среде Фриса), имеющая форму «яичницы».

Штамм бактерии «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ» возбудителя контагиозной плевропневмонии КРС характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм бактерии «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ» возбудителя контагиозной плевропневмонии КРС относится к классу Mollicutes, порядку Mycoplasmatales, семейству Mycoplasmataceae, роду Mycoplasma, виду Mycoplasma mycoides, подвиду mycoides Small Colony (MmmSC) и обладает морфологическими признаками, характерными для представителей Mollicutes: полное отсутствие клеточной стенки, небольшой геном с низким содержанием гуанина и цитозина (от 23 до 40 мол. %), рост колонии происходит медленно, и может потребоваться несколько дней для первичной изоляции, на жидких питательных средах рост виден в течение 3-10 дней в виде однородной мутности с завихрениями при встряхивании, и на плотных питательных средах колонии первичных изолятов MmmSC небольшие (диаметр <1 мм) с типичной формой «яичницы» [1].

Антигенные свойства

Инокуляция в организм животного штамма бактерии «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ» возбудителя контагиозной плевропневмонии КРС сопровождается образованием специфических антител в сыворотке крови в титре от 13,64 log₂ до 14,64 log₂ у кроликов.

Гено- и хемотаксономическая характеристики

Геном Mycoplasma mycoides subspecies mycoides SC (MmmSC) характеризуется единственной кольцевой хромосомой длиной 1,211,703 нуклеотидных пар с низким содержанием гуанина/цитозина (менее 30%) и самой высокой плотностью инсерционных последовательностей (13% от размера генома) среди всех секвенированных бактериальных геномов [1]. В настоящее время охарактеризованы многие липопротеины Mycoplasma mycoides subspecies mycoides SC (MmmSC). К ним относятся LppA (также известный как P72) - мембранный липопротеин массой 72 кДа; LppB - липопротеин массой 70 кДа, отсутствующий у новых европейских штаммов M. mycoides subsp. mycoides SC [13]; LppQ - липопротеин массой 48 кДа, который, по-видимому, высокоспецифичен для вида M. mycoides subsp. mycoides SC [14]; Vmm, вариабельный поверхностный белок из 59 аминокислот, претерпевающий обратимые фазовые изменения; и липопротеин LppC, иммунодоминантный антиген, и соответствующий ему ген lppC были охарактеризованы у Mycoplasma mycoides subspecies mycoides small colony (SC), этиологического агента контагиозной плевропневмонии КРС (КПП). Ген lppC был обнаружен у типового штамма MmmSC и в полевых штаммах, выделенных в Европе, Африке и Австралии, а также в вакцинных штаммах [14].

Также сущность изобретения пояснена на дендрограмме, отражающей филогенетические взаимоотношения штамма «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ» с другими штаммами M. mycoides по локусу LepA (Фиг. 1).

На фиг. 1 представлено филогенетическое дерево, отражающее родство штамма бактерии «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ» возбудителя контагиозной плевропневмонии КРС по локусу гена LepA, кодирующего фактор элонгации.

Устойчивость к внешним факторам

Устойчивость возбудителя к физическим, химическим и другим факторам внешней среды относительно низкая, в среднем выживает вне хозяина не более трех дней в тропических районах, до двух недель в умеренных зонах, и может сохраняться более 10 лет в замороженном состоянии. Возбудитель погибает при 10-кратном замораживании и оттаивании, а также после 6-часового воздействия этиловым спиртом и эфиром. В гниющем материале выживает до 9 суток, погибает через 6 часов при воздействии этилового спирта и эфира. Возбудитель инактивируется в течение часа при 56°C и в течение 2 минут при 60°C, он чувствителен к 1% гипохлориту натрия, 70% этанолу, йодофорам, глютаральдегиду и пероксиуксусной кислоте, и дезактивируется хлоридом ртути (0,01% при 1 мин), фенолом (1% при 3 мин) и раствором формальдегида (0,5% при 30 сек) [2].

Дополнительные признаки и свойства:

Патогенность – патогенен для естественно-восприимчивых животных.

Вирулентность – вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Безвреден для кроликов и белых мышей при внутримышечном и подкожном заражении.

Стабильность − сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) в бесклеточной питательной среде Фриса.

Контаминация бактериями, грибами, другими видами микоплазмами и посторонними вирусами – штамм бактерии «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ» не контаминирован бактериями, грибами, другими видами микоплазмами и посторонними вирусами.

Условия хранения.

При хранении штамма в нативном состоянии при температуре минус 60±5°С допустимая длительность хранения без освежения составляет 12 мес., а при хранении в жидкой замороженной суспензии при той же температуре - 10 лет.

Бактерии MmmSC чувствителена к дигитонину, не образует «пленочных пятен», ферментирует глюкозу, восстанавливает соли тетразолия (аэробно и анаэробно), и переваривает казеин; она не гидролизует аргинин, не обладает фосфатазной активностью и не имеет/ или имеет слабые протеолитические свойства.

Биотехнологические характеристики

Штамм бактерии «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ» возбудителя контагиозной плевропневмонии КРС репродуцируется в бесклеточной питательной среде Фриса.

Биологические и ростовые свойства характеризуют путем специфичности роста колоний микоплазм на плотной питательной среде, титровании с подсчетом КОЕ (культуральный способ) и определении цветоизменяющих единиц ЦИЕ каждого пассажа в бесклеточной питательной среде Фриса. При культивировании штамма бактерии «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ» на 3-4 сутки наблюдается формирование колоний, имеющих под микроскопом характерный для MmmSC вид «яичницы», и сохраняет исходные характеристики при пассировании в течение не менее 5 пассажей (срок наблюдения) (табл. 1).

Результаты исследования биологических и ростовых свойств представлены на фигуре 2.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исследования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Получение антигена штамма бактерии «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ» при культивировании в бесклеточной питательной среде Фриса.

Для культивирования штамма использовали бесклеточную питательную среду Фриса, содержащую 10% свежего дрожжевого экстракта, 10% сыворотки крови лошади и 10% сыворотки крови свиньи.

Подготовленную бактериальную суспензию, содержащую штамм «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ» в объеме 10 мкл высевали на чашки Петри с твердой питательной средой (жидкая бесклеточная питательная среда Фриса с добавлением агара) в трех повторностях. Посевы культивировали в термостате при температуре 37±0,5°C в присутствии 5% CO₂, на 3-4 сутки наблюдали формирование колоний, имеющих под микроскопом характерный для MmmSC вид «яичницы» (фиг. 3).

Для увеличения объема биомассы, полученные в результате смывов с чашек Петри культуру микроорганизмов в объеме 1,0 см³ образца штамма вносили во флакон, содержащий 9,0 см³ питательной среды Фриса (жидкая). Полученную бактериальную суспензию помещали в термостат при температуре 37,0 ±0,5⁰С и 5% СО₂ и инкубировали в течение 3-4 суток. По мере репродукции штамма среда начинала опалесцировать и слегка мутнеть в основании флакона, что являлось одним из признаков роста/накопления MmmSC, также проводили контроль изменения цвета питательной среды в пробирке в кислую сторону (пожелтения). Биологическая активность полученного штамма составляла- 5,65х10⁵ КОЕ/см³ и 10⁶ ЦИЕ/см³

В ходе проведенных исследований установлено, что штамм бактерии «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ» возбудителя контагиозной плевропневмонии КРС в течение 5 последовательных пассажей в бесклеточной питательной среде Фриса проявляет стабильную биологическую активность, которая находилась в пределах от 5,63х10⁵ до 5,62х10⁶ КОЕ/см³ и от 10⁵ до10⁷ ЦИЕ/см³ (табл. 1).

Таким образом был получен антиген штамма бактерии «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ», который может быть использован для создания биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики.

Пример 2. Определение активности роста и времени максимального накопления штамма бактерии «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ» возбудителя контагиозной плевропневмонии КРС.

Оценку активности роста штамма «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ» контагиозной плевропневмонии КРС проводили с использованием метода измерения цветоизменяющих единиц (ЦИЕ) в 96-луночных культуральных планшетах. Для этого в первых лунках планшета смешивали 20 мкл исходной бактериальной суспензии антигена штамма «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ» контагиозной плевропневмонии КРС, полученного в примере 1, со 180 мкл модифицированного бульона Фриса с феноловым красным. Путем последовательных переносов по 20 мкл получали серии десятикратных разведений исследуемой суспензии от 10^-1 до 10^-10. В качестве контроля питательной среды использовали лунки без добавления MmmSC. Планшеты инкубировали при температуре 37±0,5°C в присутствии 5% CO₂, учет результатов проводили на 3-4 сутки. Накопление продуктов метаболизма бактерий штамма «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ» контагиозной плевропневмонии КРС приводило к смещению pH в кислую сторону, который, в свою очередь, вызывал изменение цвета индикатора с красного на желтый цвет. Концентрацию в ЦИЕ/см³ определяли, как максимальное разведение суспензии, содержащей штамм бактерии «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ» контагиозной плевропневмонии КРС, в котором наблюдалось изменение цвета.

Для определения ростовой активности культуральным методом - с подсчетом числа колониеобразующих единиц в мл (КОЕ/мл) в солевом растворе Хенкса готовили ряд десятикратных последовательных разведений бактериальной суспензии, содержащей штамм бактерии «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ» (10^-1 - 10^-5) возбудителя контагиозной плевропневмонии КРС. По 10 мкл микробной суспензии из каждого разведения высевали на чашки Петри с твердой питательной средой (жидкая бесклеточная питательная среда Фриса с добавлением агара) в трех повторностях. Посевы культивировали в термостате при температуре 37±0,5°C в присутствии 5% CO₂, на 3-4 сутки наблюдали формирование колоний, имеющих под микроскопом характерный для штамма бактерии «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ» контагиозной плевропневмонии КРС вид «яичницы» (фиг. 3). Учет результатов титрования проводили путем подсчёта количества одиночных колоний, высчитывая среднее количество КОЕ в 10 мкл наибольшего разведения суспензии, в котором наблюдается рост колоний штамма бактерии «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ» возбудителя контагиозной плевропневмонии КРС. Делали пересчет для вычисления количества КОЕ в 1 мл исходного суспензии испытуемого материала.

Результаты показали, что для штамма бактерии «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ» логарифмическая фаза роста наступает после 24 часов культивирования и максимальный уровень накопления биомассы микоплазм регистрируется к 72 часам, после чего наступает фаза спада со снижением биологической активности культивируемого материала (фиг.2).

Пример 3. Контроль стабильности биологической активности штамма «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ» возбудителя КПП КРС.

Контроль стабильности биологической активности штамма бактерии «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ» возбудителя КПП КРС определяли в течение 5 последовательных пассажей в бесклеточной питательной среде Фриса. Результаты изучения стабильности штамма по его биологической активности в течение 5 пассажей представлены в таблице 1. В ходе проведенных исследований установлено, что штамм бактерии «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ» возбудителя КПП КРС в течение 5 последовательных пассажей в бесклеточной питательной среде Фриса проявлял стабильную биологическую активность, которая находилась в пределах от 5,63х10⁵ до 5,62х10⁶ КОЕ/см³, и от 10⁵ до10⁷ ЦИЕ/см³ (табл. 1).

Пример 4. Исследование специфичности штамма бактерии «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ» возбудителя КПП КРС и отсутствия контаминации (методы ПЦР-РВ и культивирования).

Провели проверку на специфичность штамма бактерии «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ» возбудителя КПП КРС полученного в бесклеточной питательной среде Фриса следующими методами:

− контроль стерильности (отсутствие бактериальной и грибковой контаминации);

− методом ПЦР-РВ (специфичность и отсутствие бактериальной и вирусной контаминации);

− методом культивирования (специфичность и отсутствие бактериальной контаминации).

Контроль стерильности проводили для подтверждения отсутствия контаминации исследуемого образца штамма бактериями и грибами при посевах на микробиологические питательные среды.

Испытание на стерильность проводили в соответствии с ГОСТ 28085-89 «Препараты биологические. Методы биологического контроля на стерильность».

Для проведения испытания на стерильность использовали 5 флаконов со штаммом бактерии «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ».

Высевы контролируемого образца осуществляли на питательные среды: МПА (мясопептонный агар), МПБ (мясопептонный бульон), МППБ (мясо-пептонный печеночный бульон) под вазелиновым маслом, Сабуро и агар Сабуро (среды производства ФГБУ «ВНИИЗЖ»). При посевах использовали по 3 пробирки каждой из указанных сред, оставляя дополнительно по одной для контроля. Объем посева образца штамма в каждую пробирку составил 0,1 см³. Среды с посевом (кроме Сабуро) выдерживали при температуре 37±0,5°С в течение 14 суток. Контрольную и засеянную среду Сабуро и агар Сабуро выдерживали в течение того же времени при комнатной температуре 22±0,5°C в затемненном месте. Все пробирки подвергались ежедневному визуальному контролю. Результаты проверки представлены в таблице 2.

В посевах образца штамма роста бактерий и грибов в течение указанного периода наблюдения не обнаружено.

Проверку штамма «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ» возбудителя КПП КРС на специфичность и отсутствие бактериальной и вирусной контаминации проводили методом ПЦР-РВ на наличие генома возбудителя КПП КРС, и отсутствие других геномов возбудителей:

− возбудителя Mycoplasma bovis;

− возбудителя Mycoplasma bovigenitalium;

− возбудителя Mycoplasma dispar;

− возбудителя Mycoplasma gallisepticum;

− возбудителя Mycoplasma synoviae;

− вируса герпесвируса-1 КРС;

− вируса парагриппа-3 КРС;

− вируса вирусной диареи КРС.

В результате проведенных исследований в пробах культуральной суспензии обнаружен только геном возбудителя контагиозной плевропневмонии КРС. Геномы других возбудителей не обнаружены.

Также методом культивирования исследовали штамм бактерии «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ» возбудителя КПП КРС на специфичность и отсутствие бактериальной контаминации другими возбудителями:

− возбудителя Mycoplasma bovis;

− возбудителя Mycoplasma bovigenitalium;

− возбудителя Mycoplasma dispar;

− возбудителя Mycoplasma gallisepticum;

− возбудителя Mycoplasma synoviae.

В результате проведенных исследований был выделен только возбудитель контагиозной плевропневмонии КРС, а рост других возбудителей не был отмечен, результаты были подтверждены с помощью ПЦР-РВ.

Пример 5. Получение гипериммунной сыворотки крови лабораторных животных (кролики) против антигена штамма бактерии «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ».

Антиген штамма бактерии «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ», полученный как описано в примере 1, использовали для получения высокоактивной гипериммунной сыворотки, предназначенной для оценки иммунобиологических свойств бактерии данного штамма.

Для гипериммунизации применяли антиген с биологической активностью 5,65х10⁵ КОЕ/см³ и 10⁶ ЦИЕ/см³, определенной до инактивации. Для получения препарата антигена для иммунизации проводили его инактивацию с помощью β-пропиолактона в конечном разведении 0,1%, время выдержки 24 ч при температуре от +4 до +8°С.

Подопытные кроликов, в количестве 3 голов, иммунизировали по схеме:

- первая иммунизация: антиген смешивали с адъювантом «Montanide ISA70» в соотношении 1:1. Объем вводимого препарата - 2,0 см³. Место введения: подкожно в несколько мест вдоль спины – 1,0 см³, внутримышечно – 1,0 см³;

- вторая иммунизация (через 14 дней): внутривенно, 0,2 см³;

- третья иммунизация (через 3 дня): внутривенно, 0,4 см³;

- четвертая иммунизация (через 3 дня): внутривенно, 0,6 см³.

Кроликов в количестве 3 голов оставили в качестве контроля.

Титр антител к антигену штамма бактерии «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ» в сыворотках крови кроликов определяли через 3 дня после последней иммунизации методом ИФА.

Полученную сыворотку крови кроликов исследовали методом ИФА на наличие антител к бактериям штамма «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ» возбудителя контагиозной плевропневмонии КРС. Постановка ИФА осуществлялась согласно «Методическим рекомендациям по выявлению антител к возбудителю контагиозной плевропневмонии в сыворотках крови крупного рогатого скота в конкурентном варианте иммуноферментного анализа», ФГБУ «ВНИИЗЖ», 2023г [15]. Согласно методическим рекомендациям, в сыворотках крови определяли «процент ингибирования» (ПИ), сыворотки с ПИ<50% считались отрицательными, сыворотки с ПИ≥50% - положительными (табл. 3).

Данные, представленные в таблице 3, свидетельствуют, что описанным способом получены диагностические сыворотки со специфичной активностью 13,64-14,64 lоg₂ в ИФА.

Таким образом, заявляемый штамм бактерии «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ» возбудителя контагиозной плевропневмонии КРС может быть пригоден для изготовления биопрепаратов, используемых для диагностики и специфической профилактики контагиозной плевропневмонии КРС.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента Российской Федерации на изобретение «Штамм бактерии «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ» возбудителя контагиозной плевропневмонии КРС для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики контагиозной плевропневмонии КРС»:

1. Di Teodoro, G., [и др.]. Contagious Bovine Pleuropneumonia: A Comprehensive Overview / Di Teodoro, G., Marruchella, G., Di Provvido, A., D'Angelo, A. R., Orsini, G., Di Giuseppe, P., Sacchini, F., Scacchia, M. // Veterinary pathology. - 2020. - № 57(4). - С. 476–489.

2. Пискунов, А. В., Кононов, А. В., Мищенко, А. В. Проблема контагиозной плевропневмонии крупного рогатого скота / А. В. Пискунов, А. В. Кононов, А. В. Мищенко // Ветеринария сегодня. — 2016. — № 3. — С. 27-36.

3. Патент № EP1240328B1 European Patent Office. Antigenic protein lppq of mycoplasma mycoides subsp. mycoides sc., its preparation and use: № 00977578.4: заявл. 29.11.1999: опубл. 24.11.2000 / Joachim Frey, Jacques Nicolet, El-Mostafa Abdo.

4. WOAH. Infection with Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (contagious bovine pleuropneumonia). Chapter 11.5. / [Электронный ресурс] //: [сайт]. - URL:https://www.woah.org/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/terrestrial-code-online access/?id=169&L=1&htmfile=chapitre_mycoplasma_mycoides.htm.

5. Vilei, E. M. [и др.]. Genomic and antigenic differences between the European and African/Australian clusters of Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC / Vilei, E. M., Abdo, E. M., Nicolet, J., Botelho, A., Gonçalves, R., Frey, J. // Microbiology (Reading, England). - 2000. - № 146 (Pt 2). - С. 477–486.

6. Kairu-Wanyoike, S. W. [и др.]. Control of contagious bovine pleuropneumonia: knowledge, attitudes, perceptions and practices in Narok district of Kenya / Kairu-Wanyoike, S. W., Kiara, H., Heffernan, C., Kaitibie, S., Gitau, G. K., McKeever, D., Taylor, N. M. // Preventive veterinary medicine. - 2014. - № 115(3-4). - С. 143–156.

7. Патент № CA2445997A1 Canada. Saponin inactivated mycoplasma vaccine: № GB 2002/002062: заявл. 03.05.2002: опубл. 14.11.2002 / Robin Ashley, John Nicholas.

8. Thiaucourt, F. [и др.]. Contagious bovine pleuropneumonia vaccines, historic highlights, present situation and hopes / Thiaucourt, F., Dedieu, L., Maillard, J. C., Bonnet, P., Lesnoff, M., Laval, G., Provost, A. // Developments in biologicals. — 2003. - № 114. - С. 147-160.

9. Tulasne, J. J. [и др.]. Contagious bovine pleuropneumonia vaccines: the current situation and the need for improvement / Tulasne, J. J., Litamoi, J. K., Morein, B., Dedieu, L., Palya, V. J., Yami, M., Abusugra, I., Sylla, D., Bensaid, A. // Revue scientifique et technique (International Office of Epizootics). - 1996. - № 15(4). - С. 1373–1396.

10. Di Teodoro, G., [и др.]. Contagious Bovine Pleuropneumonia: A Comprehensive Overview / Di Teodoro, G., Marruchella, G., Di Provvido, A., D'Angelo, A. R., Orsini, G., Di Giuseppe, P., Sacchini, F., Scacchia, M. // Veterinary pathology. - 2020. - № 57(4). - С. 476–489.

11. Jores J. [и др.] Contagious Bovine and Caprine Pleuropneumonia: a research community’s recommendations for the development of better vaccines / Jores J. [и др.] // NPJ Vaccines. - 2020. - № 5(1). - С. 66.

12. Alhaji, N. B., Ankeli, P. I., Ikpa, L. T., Babalobi, O. O. Contagious Bovine Pleuropneumonia: Challenges and prospects regarding diagnosis and control strategies in Africa / Alhaji, N. B., Ankeli, P. I., Ikpa, L. T., Babalobi, O. O. // Veterinary Medicine: Research and Reports. - 2020. - №11. - С. 71-85.

13. Dedieu, L., Totte, P., Rodrigues, V., Vilei, E. M., Frey, J. Comparative analysis of four lipoproteins from Mycoplasma mycoides subsp. mycoides Small Colony identifies LppA as a major T-cell antigen / Dedieu, L., Totte, P., Rodrigues, V., Vilei, E. M., Frey, J. // Comparative immunology, microbiology and infectious disease. - 2010. - № 33(4). - С. 279–290.

14. Патент № DE60025522T2 Germany. Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC antigenic LPPQ protein, its manufacture and use: № 600 25 522.0: заявл. 24.11.2000: опубл. 06.07.2006 / Joachim Frey, Jacques Nicolet, El-Mostafa Abdo.

15. Методические рекомендации по выявлению антител к возбудителю контагиозной плевропневмонии в сыворотках крови крупного рогатого скота в конкурентном варианте иммуноферментного анализа», ФГБУ «ВНИИЗЖ», 2023 г.

Таблица 1

Стабильность штамма бактерии «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ» при культивировании в бесклеточной питательной среде Фриса

(n=3, p<0,005)

№ пассажа Чашки Петри (КОЕ/см³) Метод измерения цветоизменяющих единиц (ЦИЕ/см³) 1 пассаж 5,64 х 10⁵ 10⁷ 2 пассаж 5,76 х 10⁵ 10⁷ 3 пассаж 5,60 х 10⁶ 10⁶ 4 пассаж 5,63 х 10⁵ 10⁵ 5 пассаж 5,62 х 10⁶ 10⁶

Таблица 2

Исследование штамма бактерии «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1 / 44 / ВНИИЗЖ» возбудителя контагиозной плевропневмонии КРС на отсутствие посторонней микрофлоры

Номер
флакона Пересевы на среды МПА МПБ МППБ Агар Сабуро Ср. Сабуро 37⁰С 37⁰С 37⁰С 22⁰С 22⁰С 1 - - - - - 2 - - - - - 3 - - - - -

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и биотехнологии. Предложен штамм бактерии «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1/44/ВНИИЗЖ» возбудителя контагиозной плевропневмонии КРС семейства Mycoplasmataceae рода Mycoplasma вида Mycoplasma mycoides SС, депонированный во Всероссийскую государственную коллекцию экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №522 – деп/24-02 – ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ». Представленный штамм репродуцируется в бесклеточной питательной среде Фриса в течение 3-7 суток инкубирования, ростовая активность штамма составляет 5,65×10⁵ КОЕ/см³ и 10⁶ ЦИЕ/см³, сохраняет исходные характеристики при пассировании в бесклеточной питательной среде Фриса на протяжении 5 пассажей. Представленный штамм может быть использован для изготовления биопрепаратов для средств диагностики и специфической профилактики контагиозной плевропневмонии КРС. 3 табл., 3 ил., 5 пр.

Штамм бактерии «Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) T1/44/ВНИИЗЖ» возбудителя контагиозной плевропневмонии КРС Mycoplasma mycoides SC, депонированный во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №522 – деп/24-02 – ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ» предназначенный для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики контагиозной плевропневмонии КРС.