НАБОР И СПОСОБ ЗАХВАТА МОЛЕКУЛЫ МАГНИТНЫМИ СРЕДСТВАМИ Российский патент 2024 года по МПК G01N33/543 

Настоящее изобретение относится к набору для захвата молекулы. Изобретение также относится к способу захвата молекулы.

Тест ELISA (аббревиатура для "Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay" (метод иммуноферментного анализа на основе использования энзим-связанного иммуносорбента)) обычно используется для количественной диагностики молекулярных маркеров (антигенов, антител и т.п.), присутствующих в текучих средах, биоптатах, культурах или любом другом образце.

Однако этот метод, который в настоящее время является наиболее надежным и одним из наиболее распространенных методов диагностики, имеет недостатки, а именно сложность, использование дорогостоящих автоматов и продолжительность, которая может достигать нескольких часов.

Тест ELISA представляет собой метод гетерогенного фазового иммунологического анализа, т.е. он требует твердой подложки (обычно планшета для титрования, содержащего множество лунок), к которой заранее присоединяется молекула, подходящая для захвата анализируемой молекулы.

После захвата интересующей молекулы на указанной подложке промывка позволяет удалить остальную часть образца и перейти к этапу обнаружения и количественного определения указанной молекулы.

Например, в случае так называемого "сэндвич"-теста ELISA, который позволяет анализировать антиген в растворе, поверхность подложки покрывают определенным количеством так называемого иммобилизованного антитела, причем указанное антитело является подходящим для связывания с желаемым антигеном.

Затем раствор, способный содержать указанный антиген, наносят на подложку; затем указанный антиген связывается с иммобилизованным антителом, расположенным на поверхности подложки.

Затем подложку промывают для удаления любого несвязанного антигена, оставшегося в растворе. Затем раствор, содержащий антитело, называемое детектирующим антителом, соединенное с детектирующим средством, приспособленным для связывания с антигеном, закрепленным на подложке, наносят на подложку. Указанное детектирующее антитело может быть непосредственно помечено и может испускать обнаруживаемый сигнал, но также может быть связано с биокатализатором, который катализирует субстрат, вызывая эмиссию обнаруживаемого сигнала.

Для удерживания антигена связанным с детектирующим антителом на подложке осуществляют новую стадию промывки, при этом само указанное антитело связано с биокатализатором.

Наконец, для обнаружения и количественного определения антигена на подложку наносят субстрат, который преобразуется биокатализатором в обнаруживаемый сигнал (например, цвет, анализируемый спектроскопически или с помощью флуоресцентной эмиссии), представляющий связывание между антигеном и детектирующим антителом.

Указанный сигнал можно наблюдать невооруженным глазом или с помощью прибора, такого как спектрофотометр.

В статье D. Issadore и др., Lab Chip, 2011, 11, 147, описан метод захвата молекулы в образце путем циркуляции указанного образца в микроканале с текучей средой, расположенном под полидиметилсилоксановой (PDMS, ПДМС) матрицей, в которой были иммобилизованы магнитные гранулы NdFeB.

В документе WO 2014111187 описан способ захвата молекулы в образце, включающий следующие этапы: смешивание указанного образца с магнитными частицами, причем каждая из указанных частиц связана с элементом, способным избирательно связываться с указанной молекулой, подлежащей захвату, с образованием по меньшей мере одного комплекса, содержащего магнитную частицу, указанный элемент и указанную молекулу, связанную с указанным элементом; и иммобилизацию указанного по меньшей мере одного комплекса на подложке, содержащей упорядоченные микроисточники магнитного поля.

Эти упорядоченные микроисточники магнитного поля распределены вблизи поверхности подложки, предназначенной для контакта с образцом, по определенной схеме, а также имеют определенную магнитную ориентацию.

Способ, описанный в этом документе, интересен. Однако подложка для захвата сложна в производстве и промышленном внедрении, особенно в чистой среде, что предполагает высокую стоимость производства.

Задачей настоящего изобретения является, в частности, преодоление этих недостатков уровня техники.

Точнее, задачей настоящего изобретения является создание набора и способа захвата молекулы, содержащейся в образце, благодаря высокоэффективным магнитным средствам и уменьшенным финансовым затратам, свойственным недорогими технологиями производства.

Таким образом, настоящее изобретение относится к набору для захвата молекулы, содержащейся в образце, содержащем:

а) магнитные наночастицы, имеющие наибольший размер меньше 1 мкм, причем каждая из указанных наночастиц связана по меньшей мере с одним элементом для захвата, при этом указанный по меньшей мере один элемент для захвата специфически связывается с указанной молекулой; и

b) подложку для захвата указанных магнитных наночастиц, содержащую по меньшей мере один магнитный слой или состоящую по существу по меньшей мере из одного магнитного слоя, при этом указанный магнитный слой содержит контактный участок, в случае необходимости повторяющийся, по меньшей мере первой и второй областей, при этом первая область содержит магнитные частицы, поляризованные в первом направлении, а вторая область содержит магнитные частицы, которые неполяризованы или поляризованы во втором направлении, отличном от первого направления поляризации магнитных частиц первой области, так что указанный по меньшей мере один магнитный слой генерирует магнитное поле, имеющее по меньшей мере одно изменение магнитной индукции, составляющее не меньше 0,1 мТл на расстоянии не меньше 1 мкм от указанного по меньшей мере одного магнитного слоя, при этом указанное по меньшей мере одно изменение индукции магнитного поля определяет максимум и минимум нормы индукции указанного магнитного поля для определения в указанном максимуме нормы указанного магнитного поля область для захвата магнитных наночастиц на подложке для захвата.

Вопреки всем ожиданиям было обнаружено, что можно притягивать наночастицы, связанные с элементом захвата, используя магнитный слой, содержащий магнитные частицы со слабыми магнитными свойствами.

Магнитные слои, используемые в настоящем изобретении, являются гибкими и соответствуют, в частности, магнитным лентам. Магнитные слои согласно настоящему изобретению состоят из магнитных композитных материалов, таких как ферриты, случайно распределенных в полимере или ориентированных иным образом вдоль предварительно ориентированной оси. Ферриты представляют собой ферромагнитную керамику, получаемую литьем под высоким давлением и при высокой температуре (>1000°С) из оксида железа Fe2O3XO, где X может быть марганцем, цинком, кобальтом, никелем, барием, стронцием и т.п.

Таким образом, настоящее изобретение состоит в изменении использования магнитных лент, обычно используемых для надежного хранения информации (в аудио- и видеокассетах, кредитных картах, пропусках, транспортных билетов и т.п.), которые трудно размагнитить, чтобы использовать их для захвата нанометровых магнитных частиц в растворе.

Для ясности в остальной части описания магнитные частицы, составляющие магнитный слой согласно настоящему изобретению, называются "порошками" или "магнитными зернами", чтобы четко отличать их от "магнитных наночастиц", связанных с элементами захвата.

Магнитные слои согласно настоящему изобретению являются "кодированными", т.е. по меньшей мере часть составляющих их магнитных зерен поляризованы/намагничены. В дальнейшем термины "поляризованный" и "намагниченный" рассматриваются как синонимы и используются единообразно.

Это кодирование (или эту поляризацию) не выполняют случайным образом, но конфигурируют для выявления по меньшей мере одного контактного участка первой области, содержащей магнитные зерна, поляризованные в первом направлении, и второй области, содержащей магнитные зерна, которые неполяризованы или поляризованы во втором направлении, отличном от первого направления поляризации магнитных зерен, тем самым определяя по меньшей мере один переход между первой и второй областями. Таким образом, каждая область (когда она поляризована) излучает свое собственное магнитное поле, так что магнитный слой можно смоделировать как множество источников магнитного поля.

Поляризация магнитных зерен, составляющих указанный по меньшей мере один магнитный слой, осуществляется, в частности, с помощью записывающей головки, которая хорошо известна в области кодирования магнитных лент. Обычно локальное магнитное поле применяют к области магнитного слоя с помощью миниатюрного электромагнита.

Этот конкретный контактный участок первой и второй областей поляризации позволяет создавать изменения интенсивности генерируемого магнитного поля на расстоянии по меньшей мере 1 мкм от указанного по меньшей мере одного магнитного слоя и, следовательно, создавать максимумы и минимумы нормы индукции магнитного поля. Норма индукции магнитного поля соответствует абсолютному значению индукции магнитного поля (в теслах, Тл). В настоящем изобретении вместо них могут использоваться термины "норма магнитной индукции" и "норма". Максимумы нормы индукции магнитного поля образуют области, которые притягивают указанные взвешенные наночастицы, и в которых указанные магнитные наночастицы минимизируют свою магнитную энергию, так что эти области называются "локальными минимумами" магнитной энергии наночастиц или "стоками энергии".

Таким образом, при ортогональной проекции на поверхность указанного магнитного слоя максимумы нормы индукции магнитного поля задают области захвата наночастиц. Таким образом, области захвата и стоки энергии совпадают в одном месте.

Эти области захвата проходят на расстояние самое большее 35 мкм от ортогональной проекции на поверхность указанного магнитного слоя указанного или каждого максимума нормы индукции магнитного поля. "Самое большее 35 мкм" означает 35 мкм, 34 мкм, 33 мкм, 32 мкм, 31 мкм, 30 мкм, 29 мкм, 28 мкм, 27 мкм, 26 мкм, 25 мкм, 24 мкм, 23 мкм, 22 мкм, 21 мкм, 20 мкм, 19 мкм, 18 мкм, 17 мкм, 16 мкм, 15 мкм, 14 мкм, 13 мкм, 12 мкм, 11 мкм, 10 мкм, 9 мкм, 8 мкм, 7 мкм, 6 мкм, 5 мкм, 4 мкм, 3 мкм, 2 мкм и 1 мкм.

Магнитная энергия (Е) наночастицы равна величине, обратной скалярному произведению намагниченности наночастицы и магнитного поля генерируемого указанным по меньшей мере одним магнитным слоем, в соответствии со следующей формулой:

где:

Е - магнитная энергия наночастицы (в джоулях);

М - намагниченность наночастицы (в амперах на метр); и

В - индукция магнитного поля (в теслах).

Намагниченность в случае материалов, обладающих магнитными свойствами, используемых в настоящем изобретении, является монотонно возрастающей функцией индукции магнитного поля, так что минимумы магнитной энергии наночастиц соответствуют максимумам нормы магнитного поля и, таким образом, областям захвата.

Когда магнитная наночастица намагничена одиночным магнитным полем, генерируемым указанным по меньшей мере одним магнитным слоем, области захвата расположены в переходах между первой и второй областями.

Магнитное поле, генерируемое указанным по меньшей мере одним магнитным слоем, демонстрирует изменения магнитной индукции величиной по меньшей мере 0,1 мТл и самое большее 1 Т, предпочтительно по меньшей мере 0,1 мТл и самое большее 500 мТл, более предпочтительно по меньшей мере 0,5 мТл и самое большее 300 мТл, еще более предпочтительно по меньшей мере 1 мТл и самое большее 200 мТл.

Эти изменения индукции магнитного поля позволяют генерировать сильный градиент магнитного поля, т.е. достаточный градиент магнитного поля для проявления значительной силы захвата по отношению к броуновскому движению наночастиц. Таким образом, такой градиент магнитного поля локализован. Кроме того, указанный градиент указывает на область захвата и имеет значение по меньшей мере 10 Тл⋅м^-1 на расстоянии 10 мкм от указанного по меньшей мере одного магнитного слоя, предпочтительно в диапазоне от 10 Тл⋅м^-1 до 10⁵ Тл⋅м^-1, более предпочтительно от 500 Тл⋅м^-1 до 5*10³ Тл⋅м^-1. Таким образом, сильные градиенты магнитного поля направляют взвешенные наночастицы к области (областям) захвата указанного по меньшей мере одного магнитного слоя.

Когда магнитные наночастицы захвачены указанным по меньшей мере одним магнитным слоем, они располагаются в одной или каждой области захвата. Это конкретное расположение является очень интересным для прямого обнаружения и количественной оценки захваченных молекул, как более подробно описано ниже.

Индукция магнитного поля может быть измерена с использованием магнитооптического метода, называемого MOIF (Magneto-Optical Imaging Film, магнитооптическая пленка для создания изображения).

Метод MOIF основан на эффекте Фарадея. В целом, этот метод заключается в погружении в магнитное поле объекта, магнитная индукция которого необходимо измерить, плоской пленки, состоящей из материала, на оптические свойства которой известным образом воздействуют магнитные поля. Как правило, указанная пленка соединена с указанным объектом. Указанная плоская пленка имеет ширину и длину, по меньшей мере равные ширине области исследуемого объекта. После этого первого этапа указанную плоскую пленку освещают пучком света известной амплитуды и поляризации, причем этот луч проходит через указанную плоскую пленку. Анализ поляризации и амплитуды светового луча, прошедшего через указанную плоскую пленку, обеспечивает измерение присутствующих в ней планарных составляющих магнитного поля. Пример измерения индукции магнитного поля объекта методом MOIF приведен в статье Grechishkin и др., J. Appl. Phys. 120, 174502 (2016).

На практике, тонкую плоскую пленку, толщина которой обычно меньше чем один микрон, и которая состоит из магнитооптического материала (например, граната на основе редкоземельных элементов), осаждают на прозрачную немагнитную подложку (например, стекло, кварц или кремний), затем ее покрывают очень тонким отражающим слоем, зеркальным слоем (например, из золота, серебра или алюминия), толщина которого составляет меньше чем 100 нм). Таким образом, пленка компаунда магнитооптического материала закрыта с одной стороны прозрачной немагнитной подложкой, а с другой стороны отражающим слоем. Этот пакет прикрепляют к объекту, излучающему магнитное поле, такому как подложка для захвата согласно настоящему изобретению. Затем указанную пленку из магнитооптического материала освещают лучом поляризованного света, который сначала проходит через прозрачный немагнитный слой (оптические свойства которого не подвержены влиянию магнитного поля магнитного объекта, и который, таким образом, не оказывает никакого воздействия на поляризацию указанного луча), затем проходит через пленку из оптического материала (магнитное поле которого, генерируемое магнитным объектом, влияет на оптические свойства, и которое, таким образом, оказывает воздействие на поляризацию луча), отражается отражающим слоем, снова проходит через пленку из оптического материала (которая снова влияет на поляризацию луча), затем снова проходит через стекло (которое не влияет на поляризацию луча) и наконец достигает поляризационного анализатора. Угол поворота поляризации отраженного луча относительно падающего луча пропорционален магнитному полю, фарадеевскому коэффициенту вращения граната и толщине указанного магнитооптического материала. Таким образом, получено распределение индукции магнитного поля, генерируемого указанным по меньшей мере один магнитным слоем, в виде калибровочной кривой, которая представляет вращение светового луча за счет эффекта Фарадея в зависимости от индукции магнитного поля. Эта кривая зависит от конкретного используемого магнитооптического материала.

В частности индукция магнитного поля может быть измерена методом MOIF с использованием КМОП-системы марки MagView, коммерчески доступной в компанией MATESY GmBH, с датчиком модели С в качестве поляризационного анализатора, с использованием граната типа DLGi5 в качестве пленки магнитооптического материала, калибровочная кривая которого показана на ФИГ. 11. В этом приборе зеркало заменено датчиком КМОП, так что свет не должен отражаться.

Результаты могут быть подтверждены численным и аналитическим моделированием, например, одним из следующих двух подходов:

Метод конечных элементов, выполняемый с использованием программного обеспечения для моделирования COMSOL (Multiphasics® 5.0). Это программное обеспечение позволяет выполнять численное моделирование в двухмерной среде толщиной 10 мм. Сначала измеряют толщину и ширину указанного по меньшей мере одного магнитного слоя, с одной стороны, обычно оптическим способом, используя изображение, полученное с помощью светлопольной микроскопии, а затем, с другой стороны, измеряют значения его послесвечения или воздействия; подробности см. ниже. Эти данные вводят в программное обеспечение, и магнитное поле, генерируемое указанным по меньшей мере одним магнитным слоем, моделируют с использованием набора инструментов MFNC (Magnetic Field No Current) в устойчивом состоянии.

- Так называемый полуаналитический подход. Он основан на методе, разработанном, например в статье Chigirinsky S. и др., Advanced Study Center Co. Ltd., 20 (2009), 85-91. В данном случае также сначала измеряют, с одной стороны, толщину и ширину указанного по меньшей мере одного магнитного слоя, а, с другой стороны, измеряют значения остаточной намагниченности или удерживающей способности указанного, по меньшей мере одного магнитного слоя. Указанный по меньшей мере один магнитный слой разбивают на сумму элементов, имеющих однородную намагниченность, затем выполняют аналитическое решение уравнений, определяющих магнитное поле каждого элемента, например, с использованием программного обеспечения Scilab® 6.02 (издатель Scilab Enterprises). Поле, генерируемое каждым элементом указанного по меньшей мере одного магнитного слоя, суммируют с полем, генерируемым всеми другими элементами указанного по меньшей мере одного магнитного слоя в каждой точке пространства. В случае, когда также присутствует по меньшей мере один дополнительный источник магнитного поля, более подробно см. ниже, магнитное поле, создаваемое указанным по меньшей мере одним дополнительным источником, добавляют в каждой точке к общему полю, создаваемому указанным по меньшей мере одним магнитным слоем.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения вторая область содержит магнитные зерна, поляризованные во втором отличающемся направлении, которое отклонено по меньшей мере на 30° относительно первого направления поляризации магнитных зерен первой области, предпочтительно указанное отклонение лежит в диапазоне от 30° до 180°. В настоящем документе выражение "от 30° до 180°", следует понимать как означающее 30°, 31°, 32°, 33°, 34°, 35°, 36°, 37°, 38°, 39°, 40°, 41°, 42°, 43°, 44°, 45°, 46°, 47°, 48°, 49°, 50°, 51°, 52°, 53°, 54°, 55°, 56°, 57°, 58°, 59°, 60°, 61°, 62°, 63°, 64°, 65°, 66°, 67°, 68°, 69°, 70°, 71°, 72°, 73°, 74°, 75°, 76°, 77°, 78°, 79°, 80°, 81°, 82°, 83°, 84°, 85°, 86°, 87°, 88°, 89°, 90°, 91°, 92°, 93°, 94°, 95°, 96°, 97°, 98°, 99°, 100°, 101°, 102°, 103°, 104°, 105°, 106°, 107°, 108°, 109°, 110°, 111°, 112°, 113°, 114°, 115°, 116°, 117°, 118°, 119°, 120°, 121°, 122°, 123°, 124°, 125°, 126°, 127°, 128°, 129°, 130°, 131°, 132°, 133°, 134°, 135°, 136°, 137°, 138°, 139°, 140°, 141°, 142°, 143°, 144°, 145°, 146°, 147°, 148°, 149°, 150°, 151°, 152°, 153°, 154°, 155°, 156°, 157°, 158°, 159°, 160°, 161°, 162°, 163°, 164°, 165°, 166°, 167°, 168°, 169°, 170°, 171°, 172°, 173°, 174°, 175°, 176°, 177°, 178°, 179° или 180°.

Предпочтительно вторая область содержит магнитные зерна, поляризованные во втором отличающемся направлении, отклоненном по меньшей мере на 60°, более предпочтительно отклоненном по меньшей мере на 90°, еще более предпочтительно отклоненным по меньшей мере на 120°, еще более предпочтительно отклоненным по меньшей мере на 150°.

Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая область содержит магнитные зерна, поляризованные во втором направлении, противоположном первому направлению поляризации магнитных зерен первой области, т.е. поляризационная инверсия составляет 180°.

Согласно еще одному варианту реализации магнитные зерна второй области не поляризованы. Такая конфигурация также допускает появление изменения индукции магнитного поля и, таким образом, максимума нормы индукции магнитного поля, генерируемого указанным по меньшей мере одним магнитным слоем.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения указанная по меньшей мере одна первая область и указанная по меньшей мере одна вторая область имеют одинаковые размеры. Альтернативно они имеют отличающиеся размеры, в частности, различные ширины и/или длины.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения указанная по меньшей мере одна первая область и/или указанная по меньшей мере одна вторая область имеют ширину в диапазоне от 10 мкм до 500 мкм. В настоящем документе выражение "от 10 мкм до 500 мкм" следует понимать как означающее 10 мкм, 20 мкм, 30 мкм, 40 мкм, 50 мкм, 60 мкм, 70 мкм, 80 мкм, 90 мкм, 100 мкм, 110 мкм, 120 мкм, 130 мкм, 140 мкм, 150 мкм, 160 мкм, 170 мкм, 180 мкм, 190 мкм, 200 мкм, 210 мкм, 220 мкм, 230 мкм, 240 мкм, 250 мкм, 260 мкм, 270 мкм, 280 мкм, 290 мкм, 300 мкм, 310 мкм, 320 мкм, 330 мкм, 340 мкм, 350 мкм, 360 мкм, 370 мкм, 380 мкм, 390 мкм, 400 мкм, 410 мкм, 420 мкм, 430 мкм, 440 мкм, 450 мкм, 460 мкм, 470 мкм, 480 мкм, 490 мкм, 500 мкм.

Предпочтительно указанная по меньшей мере одна первая область и/или указанная по меньшей мере одна вторая область имеют ширину предпочтительно в диапазоне от 50 мкм до 250 мкм, более предпочтительно от 70 мкм до 150 мкм, еще более предпочтительно от 90 мкм до 110 мкм.

Согласно одному варианту реализации указанная по меньшей мере одна первая область и указанная по меньшей мере одна вторая область образуют один и тот же шаблон. Этот шаблон может, в частности, соответствовать ленте.

Согласно еще одному варианту реализации они представляют собой различные шаблоны.

Согласно одному варианту реализации указанный по меньшей мере один магнитный слой покрыт защитной пленкой толщиной менее 1 мкм. Такая пленка предпочтительно позволяет защитить указанный по меньшей мере один магнитный слой, однако не ограничивая его способность захвата/притяжения благодаря его очень малой толщине.

Указанный по меньшей мере один магнитный слой как таковой может сам составлять подложку для захвата. В этом случае он предпочтительно имеет толщину по меньшей мере 5 мкм и более предпочтительно в диапазоне от 10 мкм до 20 мкм.

Указанный магнитный слой предпочтительно размещен на элементе подложки.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения материал, используемый для элемента подложки, выбран из следующего списка: стекло, кремний, полимер пластика, органической материал, такой как бумага или бамбук, кварц, золото, клейкая лента, немагнитный металлический сплав, такой как дюралюминий или титан, или сочетание этих материалов.

Предпочтительно полимер выбран из следующего списка: полидиметилсилоксан (ПДМС), полиметилметакрилат (РММА), полимер циклоолефина (ЦОП), сополимер циклоолефина (СОС), поликарбонат, полиимид, поливинилхлорид (ПВХ), полиэтилен, полипропилен, кремнийорганический материал, полиэстер или сочетание этих материалов.

Элемент подложки может быть одиночным слоем указанного выше материала.

Магнитный слой, расположенный на элементе подложки, может быть растянут, например, с использованием намоточных катушек, подобных кассете VHS.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения подложка для захвата содержит приемное гнездо для захвата, выполненное с возможностью размещения в нем образца, содержащего молекулу, которая должна быть захвачена и ограничена по меньшей мере одной стенкой, содержащей указанный по меньшей мере один магнитный слой. Это приемное гнездо для захвата имеет самый малый размер, лежащий в диапазоне от 20 мкм до 1000 мкм. В настоящем документе выражение "от 20 мкм до 1000 мкм" следует понимать как означающее 20 мкм, 40 мкм, 60 мкм, 80 мкм, 100 мкм, 120 мкм, 140 мкм, 160 мкм, 180 мкм, 200 мкм, 220 мкм, 240 мкм, 260 мкм, 280 мкм, 300 мкм, 320 мкм, 340 мкм, 360 мкм, 380 мкм, 400 мкм, 420 мкм, 440 мкм, 460 мкм, 480 мкм, 500 мкм, 520 мкм, 540 мкм, 560 мкм, 580 мкм, 600 мкм, 620 мкм, 640 мкм, 660 мкм, 680 мкм, 700 мкм, 720 мкм, 740 мкм, 760 мкм, 780 мкм, 800 мкм, 820 мкм, 840 мкм, 860 мкм, 880 мкм, 900 мкм, 920 мкм, 940 мкм, 960 мкм, 980 мкм и 1000 мкм.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения подложка для захвата выбрана из камеры, камеры в виде параллелепипеда, полого прямого цилиндра, лунки, лунки в форме прямого конуса, в частности, усеченного прямого конуса или усеченной пирамиды, микрофлюидного канала, титровальной пластины, пробирки и микропробирки.

В случае камеры и камеры в форме параллелепипеда указанной по меньшей мере один магнитный слой расположен на одной, и если присутствуют несколько магнитных слоев, по меньшей мере одной стенке указанной камеры.

В случае полого прямого цилиндра указанный по меньшей мере один магнитный слой расположен на периферийной стенке указанного цилиндра.

В случае лунки указанный по меньшей мере один магнитный слой расположен на одной, и если присутствуют несколько магнитных слоев, по меньшей мере одной стенке указанной лунки. Предпочтительно указанный по меньшей мере один магнитный слой расположен на стенке, образующей нижнюю часть указанной лунки.

В случае лунки в форме конуса, в частности, усеченного или усеченного пирамидального прямого конуса указанный по меньшей мере один магнитный слой расположен на одной, и если присутствуют несколько магнитных слоев, по меньшей мере одной стенке указанной лунки.

В случае микрофлюидного канала указанный по меньшей мере один магнитный слой расположен на одной, и если присутствуют несколько магнитных слоев, по меньшей мере одной стенке указанного канала.

В случае титровальной пластины, содержащей множество лунок, указанный по меньшей мере один магнитный слой расположен на одной, и если присутствуют несколько магнитных слоев, по меньшей мере одной стенке указанной по меньшей мере одной лунки. Предпочтительно указанный по меньшей мере один магнитный слой расположен на стенке, образующей нижнюю часть указанной по меньшей мере одной лунки.

В случае пробирки или микропробирки указанный по меньшей мере один магнитный слой расположен на одной, и если присутствуют несколько магнитных слоев, по меньшей мере одной стенке указанной пробирки или микропробирки. Предпочтительно указанный по меньшей мере один магнитный слой расположен на периферийной стенке указанной пробирки или микропробирки.

Указанный по меньшей мере один магнитный слой может быть закреплен на подложке. Предпочтительно указанное крепление необратимо. В этом случае указанное крепление может быть выполнено, например, склеиванием, прокаткой или штамповкой. Альтернативно указанное крепление обратимо. Таким образом, указанный по меньшей мере один магнитный слой может быть прикреплен системой крючков и петель, чаще называемой системой застежек-липучек, или же обратимым клеем, таким как клей животного происхождения.

Подложка для захвата может содержать по меньшей мере один магнитный слой согласно настоящему изобретению.

Согласно одному варианту реализации указанный по меньшей мере один магнитный слой складывается сам на себя, так что часть указанного магнитного слоя накладывается на другую часть.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения указанная подложка для захвата содержит по меньшей мере два магнитных слоя. Предпочтительно указанные магнитные слои расположены в той же самой плоскости.

Альтернативно указанные магнитные слои расположены на различных плоскостях, так что указанные два или по меньшей мере два слоя накладываются друг на друга.

Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения подложка для захвата содержит по меньшей мере одну стенку для притяжения указанных магнитных наночастиц, при этом указанная стенка содержит по меньшей мере один из магнитных слоев. Предпочтительно подложка для захвата содержит несколько стенок для притяжения, каждая из которых имеет по меньшей мере один магнитный слой, и по меньшей мере одна из указанных стенок расположена в плоскости, отличной от другого магнитного слоя (слоев); предпочтительно по меньшей мере одна из указанных стенок наложена на одну или по меньшей мере одну из других стенок. Альтернативно или дополнительно по меньшей мере одна из указанных стенок расположена перпендикулярно по отношению к другой стенке или по меньшей мере одной из других стенок.

Использование магнитных слоев согласно настоящему изобретению для захвата нанометрических магнитных частиц противоречит здравому смыслу, поскольку обычно наночастицы захватываются посредством магнитных слоев, имеющих сильные магнитные свойства, таких как, например, магнитные слои, выполненные из сплавов на основе редкоземельных элементов. Действительно, для захвата наночастиц, которые по своей природе обладают слабой намагниченностью из-за их малого объема. Обычно используют магнитные слои с сильными магнитными свойствами. Примеры таких "сильных" магнитных слоев на основе редкоземельных элементов описаны, в частности, в документе WO 2014111187. Сильные магнитные слои показывают остаточную магнитную индукцию в диапазоне от 0,7 Тл до 1,5 Тл и коэрцитивное поле в диапазоне от 600 кА/м до 2400 кА/м.

Указанный по меньшей мере один магнитный слой согласно настоящему изобретению имеет в 5-15 раз более низкие значения наблюдаемой остаточной намагниченности и удерживающей способности. Коэрцитивное поле указанного по меньшей мере одного магнитного слоя находится в диапазоне от 10 кА/м до 400 кА/м.

Выражение "наблюдаемая остаточная намагниченность" относится к остаточной намагниченности указанного по меньшей мере одного магнитного слоя, взятого в целом, а не каждого из магнитных зерен, составляющих его.

Коэрцитивное поле ферромагнитного материала обозначает индукцию магнитного поля, которое необходимо применить к материалу, первоначально достигшему своей намагниченности при насыщении, чтобы устранить намагниченность материала.

Остаточная магнитная индукция представляет собой материалоемкую физическую величину, которая измеряет индукцию или плотность магнитного потока, которая сохраняется в ферромагнитном материале после того, как его намагнитят с использованием сильного внешнего магнитного поля. Остаточная магнитная индукция измеряется в теслах (Тл). Образец постоянного магнитного материала, предварительно намагниченный, имеет магнитный момент, пропорциональный его объему и остаточной магнитной индукции материала. Магнитный момент представляет собой векторную физическую величину, которая позволяет характеризовать индукцию магнитного источника. Магнитный поток, генерируемый этим образцом, пропорционален его моменту. Этот магнитный поток может быть измерен с помощью магнитометра с вибрирующим образцом (VSM), экстракционного магнитометра или СКВИД-магнитометра (SQUID). Как правило, достаточно сильное магнитное поле (обычно в диапазоне от 4 Тл до 6 Тл) применяют к образцу вдоль его преимущественной оси намагниченности для насыщения его намагниченности, затем это так называемое магнитное поле "насыщения" прекращается. Измерение потока, генерируемого образцом в нулевом магнитном поле (0 Тл) после насыщения, позволяет определить остаточный магнитный момент образца. Затем получают остаточную магнитную индукцию материала, которая равна моменту образца, деленному на объем образца.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения указанный по меньшей мере один магнитный слой имеет остаточную магнитную индукцию, которая меньше чем или равна 0,6 Тл, предпочтительно остаточная магнитная индукция находится в диапазоне от 0,01 Тл до 0,6 Тл. В настоящем документе выражение "от 0,01 Тл до 0,6 Тл" следует понимать как означающее 0,01 Тл, 0,02 Тл, 0,03 Тл, 0,04 Тл, 0,05 Тл, 0,06 Тл, 0,07 Тл, 0,08 Тл, 0,09 Тл, 0,1 Тл, 0,11 Тл, 0,12 Тл, 0,13 Тл, 0,14 Тл, 0,15 Тл, 0,16 Тл, 0,17 Тл, 0,18 Тл, 0,19 Тл, 0,2 Тл, 0,21 Тл, 0,22 Тл, 0,23 Тл, 0,24 Тл, 0,25 Тл, 0,26 Тл, 0,27 Тл, 0,28 Тл, 0,29 Тл, 0,3 Тл, 0,31 Тл, 0,32 Тл, 0,33 Тл, 0,34 Тл, 0,35 Тл, 0,36 Тл, 0,37 Тл, 0,38 Тл, 0,39 Тл, 0,4 Тл, 0,41 Тл, 0,42 Тл, 0,43 Тл, 0,44 Тл, 0,45 Тл, 0,46 Тл, 0,47 Тл, 0,48 Тл, 0,49 Тл, 0,5 Тл, 0,51 Тл, 0,52 Тл, 0,53 Тл, 0,54 Тл, 0,55 Тл, 0,56 Тл, 0,57 Тл, 0,58 Тл, 0,59 Тл, 0,6 Тл.

Более предпочтительно указанный по меньшей мере один магнитный слой показывает остаточную магнитную индукцию в диапазоне от 0,01 Тл до 1 Тл, более предпочтительно от 0,02 Тл до 0,5 Тл, еще более предпочтительно от 0,05 Тл до 0,2 Тл.

Когда толщина указанного магнитного слоя или всех магнитных слоев слишком мала, т.е. когда он имеет ширину и/или длину, намного большую, по меньшей мере в 10 раз большую, чем его толщина, становится трудным определить объем магнитного материала и, таким образом, вычислить его остаточную магнитную индукцию. Это, в частности, касается имеющихся в продаже магнитных лент, в которых тонкий магнитный слой лежит на слое подложки, и, кроме того, границу между этими двумя слоями часто трудно оценить из-за промышленных производственных процессов. В этом случае вместо этого измеряют удерживающую способность магнитного слоя или набора магнитных слоев. Удерживающая способность равна магнитному моменту образца, деленному на поверхность образца (а не на его объем). Удерживающая способность выражается в единицах поверхностной плотности магнитного потока, т.е. в мкм⋅Гаусс. Обычно образец размером 2×2 мм (типичный размер для размещения в лабораторном магнитометре) отрезают от подложки для захвата для испытания. Его точную площадь измеряют под оптическим микроскопом. Процедура получения резонанса магнитного материала является той же самой, как и для остаточной магнитной индукции, т.е. его намагниченность насыщают для получения его магнитного момента.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к набору, определенному выше, в котором указанный по меньшей мере один магнитный слой имеет удерживающую способность в диапазоне от 2000 мкм⋅Гаусс до 30000 мкм⋅Гаусс. В настоящем документе выражение "от 2000 мкм⋅Гаусс до 30000 мкм⋅Гаусс" следует понимать как означающее 2000 мкм⋅Гаусс, 2500 мкм⋅Гаусс, 3000 мкм⋅Гаусс, 3500 мкм⋅Гаусс, 4000 мкм⋅Гаусс, 4500 мкм⋅Гаусс, 5000 мкм⋅Гаусс, 5500 мкм⋅Гаусс, 6000 мкм⋅Гаусс, 6500 мкм⋅Гаусс, 7000 мкм⋅Гаусс, 7500 мкм⋅Гаусс, 8000 мкм⋅Гаусс, 8500 мкм⋅Гаусс, 9000 мкм⋅Гаусс, 9500 мкм⋅Гаусс, 10000 мкм⋅Гаусс, 11000 мкм⋅Гаусс, 12000 мкм⋅Гаусс, 13000 мкм⋅Гаусс, 14000 мкм⋅Гаусс, 15000 мкм⋅Гаусс, 16000 мкм⋅Гаусс, 17000 мкм⋅Гаусс, 18000 мкм⋅Гаусс, 19000 мкм⋅Гаусс, 20000 мкм⋅Гаусс, 21000 мкм⋅Гаусс, 22000 мкм⋅Гаусс, 23000 мкм⋅Гаусс, 24000 мкм⋅Гаусс, 25000 мкм⋅Гаусс, 26000 мкм⋅Гаусс, 27000 мкм⋅Гаусс, 28000 мкм⋅Гаусс, 29000 мкм⋅Гаусс, 30000 мкм⋅Гаусс.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения указанный по меньшей мере один магнитный слой имеет удерживающую способность в диапазоне от 5000 мкм⋅Гаусс до 20000 мкм⋅Гаусс, предпочтительно от 8000 мкм⋅Гаусс до 14000 мкм⋅Гаусс, более предпочтительно от 9000 до 11000 мкм⋅Гаусс. Захваченные магнитные наночастицы имеют наибольший размер, который меньше чем 1 мкм.

В силу своих размеров используемые магнитные частицы обладают свойствами суперпарамагнетика.

Термин "суперпарамагнетик" обозначает свойство частиц ферромагнитного или ферримагнитного материала малых размеров беспорядочно изменять направление намагниченности под действием теплового возбуждения в отсутствие приложенного магнитного поля.

"Суперпарамагнитный" характер магнитных частиц подразумевает, что в отсутствие внешнего возбуждающего магнитного поля магнитные частицы не имеют суммарного магнитного момента, поэтому они не притягиваются друг к другу, что предотвращает их агломерацию.

По сравнению с микрочастицами, связанными с элементами захвата, наночастицы, связанные с элементами захвата, обладают гораздо большей эффективностью с точки зрения захвата молекул, в частности, благодаря более высокому коэффициенту диффузии (умноженному на 10) и значительно увеличенной (умноженной на 10³) концентрации (количество регистраций на 1 м³). Однако магнитная сила каждой из них разделена на 10³ (цифры в этом случае составляют 1/10 уменьшенного размера).

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения магнитные наночастицы имеют наибольший размер в диапазоне от 50 нм до 500 нм, предпочтительно от 50 нм до 250 нм, более предпочтительно от 100 нм до 250 нм, еще более предпочтительно от 150 нм до 200 нм.

Согласно одному варианту реализации магнитные наночастицы содержат от 10% до 90% железа, предпочтительно от 30% до 80%, более предпочтительно от 50% до 70% железа. Чем большее количество железа содержится в наночастицах, тем больше их намагниченность в присутствии дополнительного магнитного поля, и тем сильнее их притяжение к указанному по меньшей мере одному магнитному слою. Таким образом, чем больше количество железа, тем меньше надо увеличивать намагниченность частиц, чтобы они быстрее притягивались, как это показано ниже.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения наночастицы инкапсулированы. Они могут быть получены, в частности, сополимеризацией оксида железа и полистирола. Это инкапсулирование позволяет ограничить высвобождение железа из наночастиц. Действительно, такое высвобождение нарушает обнаружение и количественную оценку захваченной молекулы.

Магнитные наночастицы могут иметь форму, такую как параллелепипедальная, тороидальная, сферическая и т.п. Наночастицы могут иметь гладкую или неправильную поверхность. Когда они имеют неправильную поверхность, они имеют так называемую "картофелевидную" форму.

Предпочтительно магнитные наночастицы являются сферическими и подобны "бусинам". Таким образом, частицы могут называться "бусинами", даже если их геометрическая форма не является идеальной сферой.

Предпочтительно указанные бусины являются монодисперсными, при этом однородность размеров бусин придает им одинаковые свойства и, таким образом, улучшает диффузию бусин для их захвата указанным по меньшей мере одним магнитным слоем. Термин "монодисперсный" означает, что стандартное отклонение среднего диаметра бусин меньше или равно значению в диапазоне от 40 нм до 200 нм, предпочтительно от 20 нм до 200 нм.

В некоторых случаях бусины продаются в форме, диспергированной в матрице с небольшим количеством магнитного материала или без него, такого как пластиковый полимер, кремнезем (SiO₂) и т.п.

Бусины предпочтительно биологически совместимы, т.е. имеют способность не смешиваться с биологической средой, в которой они используются, или разлагать указанную биологическую среду.

Для обеспечения связывания элемента захвата с магнитными наночастицами поверхность частиц функционализируют, в частности, белками А или G Staphylococcus aureus или карбодиимидом. Если используются белки А или G, связь между элементом захвата и наночастицами не будет ковалентной, в отличие от использования карбодиимида.

К наночастицам могут быть присоединены различные элементы захвата. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения элемент захвата выбирают из антитела, Fab-фрагмента, Р(ab')2-фрагмента или Fv-фрагмента антитела, антигена, последовательности нуклеиновой кислоты, органеллы, соответствующей, в частности, везикуле, клетке, аптамеру или бактерии.

Антитело или "иммуноглобулин" состоит из 4 цепочек аминокислот, из которых можно выделить две легких цепочки и две так называемых тяжелых цепочки. Каждая тяжелая цепочка связана дисульфидным мостиком с легкой цепочкой. Кроме того, конец тяжелой цепочки и конец связанной с ней легкой цепочки вместе определяют паратоп благодаря гипервариабельным областям. Таким образом, антитело содержит два паратопа, каждый из которых позволяет связываться с эпитопом антигена. Тяжелые цепочки связаны в так называемой шарнирной области.

Фрагмент антитела, соответствующий одному из двух паратопов, называется Fragment Fv; это наименьший фрагмент антитела, сохраняющий свойства распознавания эпитопа.

Фрагмент Fab соответствует всей легкой цепочке и концу тяжелой цепочки, связанной с этой легкой цепочкой. Таким образом, фрагмент Fab содержит фрагмент Fv. Имеются два фрагмента Fab для антитела.

Фрагмент F(ab')2 соответствует ассоциации двух Fab-фрагментов, связанных между собой шарнирной областью тяжелых цепочек.

Фрагменты Fv, Fab и F(ab')2 проявляют такое же сродство к антигену, как и полное антитело.

Нуклеиновая кислота представляет собой полимер, основной единицей которого является нуклеотид. Нуклеиновая кислота может быть либо дезоксирибонуклеиновой кислотой (ДНК), либо рибонуклеиновой кислотой (РНК).

Органелла представляет собой дифференцированный компартмент, содержащийся в цитоплазме эукариотических клеток, в котором выполняются специфические биологические функции. В частности, среди органелл могут быть найдены эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи, митохондрии, лизосомы и пероксисомы.

Везикула представляет собой компартмент, присутствующий в цитоплазме клетки и состоящий как минимум из одного липидного двойного слоя. Везикулы циркулируют в цитозоле и выполняют различные функции, такие как хранение, транспортировка или переваривание клеточных отходов.

Клетка представляет собой компартмент, состоящий из живых существ; она ограничена мембраной и содержит, с одной стороны, ДНК, которая необходима для ее воспроизводства, и, с другой стороны, протеины, которые необходимы для ее функционирования.

Аптамер представляет собой синтетический олигонуклеотид, чаще всего РНК, способный связывать специфический лиганд и иногда катализировать химическую реакцию на этом лиганде. Аптамеры обычно представляют собой синтетические соединения, выделенные in vitro из комбинаторных библиотек большого количества соединений случайной последовательности методом итеративной селекции, называемым как "систематическая эволюция лигандов путем экспоненциального обогащения" (SELEX). Дополнительные сведения о синтезе аптамеров с использованием метода SELEX можно найти в статье "Аптамеры и SELEX в химии и биологии" (Chem Biol. 2014 Sep 18; 21(9): страницы 1055-8).

Бактерия представляет собой одноклеточный прокариотический микроорганизм, содержащий один цитоплазматический компартмент, содержащий ДНК. Таким образом, эта ДНК, в отличие от эукариотических клеток, не изолирована от цитоплазмы ядром. Бактерии размножаются простым делением пополам.

Специалист в данной области техники сможет легко адаптировать тип используемого захватывающего элемента в зависимости от типа захватываемой молекулы.

Настоящее изобретение также относится к набору, определенному выше, дополнительно содержащему по меньшей мере один дополнительный источник магнитного поля, при этом указанный дополнительный источник является внешним по отношению к указанному по меньшей мере одному магнитному слою.

Магнитное поле, генерируемое указанным по меньшей мере одним дополнительным источником магнитного поля, будет оказывать несколько воздействий на элементы набора, которые, с одной стороны, позволяют ускорить захват наночастиц подложкой для захвата, а с другой стороны позволяют получить более локализованные области захвата, т.е. более точные, менее широкие, обычно простирающиеся на расстояние меньше чем 15 мкм от ортогональной проекции на поверхности указанного магнитного слоя.

С одной стороны, приложение магнитного поля указанного по меньшей мере одного дополнительного источника магнитного поля позволяет увеличить намагниченность магнитных наночастиц и, таким образом, ускорить или даже инициировать их захват указанным по меньшей мере одним магнитным слоем подложки для захвата.

С другой стороны, присутствие дополнительного магнитного поля с нормой, которая больше или равна норме магнитного поля, генерируемого указанным по меньшей мере одним магнитным слоем, добавляется к магнитному полю, генерируемому указанным по меньшей мере одним магнитным слоем, так что на основании ориентация дополнительного магнитного поля амплитуда некоторых стоков энергии результирующего полного магнитного поля больше, чем амплитуда стоков энергии единственного магнитного поля, генерируемого указанным по меньшей мере одним магнитным слоем, которое также участвует в ускорении захвата наночастиц.

Области захвата усовершенствованы, на поверхности подложки, где магнитное поле, генерируемое выше переходов между первой и второй областями указанным по меньшей мере одним магнитным слоем, следует вдоль той же самой оси и в том же самом направлении, что и дополнительное магнитное поле. Таким образом, норма полной интенсивности магнитного поля значительно увеличена. Наоборот, над первой и второй областями норма равнодействующей дополнительного магнитного поля с создаваемым указанным по меньшей мере одним магнитным слоем не увеличивается на столько, поскольку они не коллинеарны. Поэтому максимумы нормы индукции магнитного поля значительно увеличены по сравнению с минимумами; таким образом, амплитуда некоторых стоков энергии акцентирована. Это, с одной стороны, ускоряет захват в этих областях захвата, притягательная сила которых значительно увеличена этими стоками энергии, а с другой стороны, это уменьшает протяженность областей захвата, которые, таким образом, географически заданы лучше и точнее.

Когда магнитное поле, генерируемое указанным по меньшей мере одним дополнительным источником в переходе между первой и второй областями на поверхности подложки, больше чем магнитное поле, генерируемое указанным по меньшей мере одним магнитным слоем вдоль той же самой оси, но в противоположном направлении, области захвата ликвидируются. Действительно, норма индукции магнитного поля, генерируемого на этом уровне, больше не является максимумом, и энергия наночастиц там уже не минимизируется.

В конкретном случае, когда поляризации первой и второй областей противоположны друг другу и параллельны поверхности подложки, при этом дополнительное магнитное поле направлено в том же направлении, что и магнитное поле, совместно создаваемое указанными первой и второй областями на их переходе на поверхности подложки, каждая другая область захвата усиливается, а каждая другая область захвата ослабляется или даже отменяется по причинам, указанным выше.

Когда дополнительное поле больше или равно магнитному полю, генерируемому указанным по меньшей мере одним источником магнитного поля, область захвата расположена в точке, где дополнительное магнитное поле имеет ту же самую ориентацию и находится в том же самом направлении, что и поле, генерируемое указанной по меньшей мере одной магнитной лентой. В этом случае области захвата могут быть смещены от их исходного положения, как показано ниже.

Намагниченность объекта соответствует векторной физической величине, которая характеризует магнитное поведение указанного объекта в макроскопическом масштабе. Она возникает из орбитального магнитного момента и магнитного спинового момента электронов. Она измеряется в амперах на метр или иногда в теслах.

Предпочтительно указанный по меньшей мере один дополнительный источник магнитного поля выбран из постоянного магнита, катушки или электромагнита.

При наличии нескольких источников магнитного поля, они могут быть выбраны из сочетания по меньшей мере одного постоянного магнита, по меньшей мере одной катушки и/или по меньшей мере одного электромагнита. В частности, они могут быть выбраны из совокупности постоянных магнитов, катушек, электромагнитов и сочетания указанных совокупностей.

Источники магнитного поля могут быть расположены рядом друг с другом на плоскости, в частности, линейно, или иным образом в трехмерной форме. Источники магнитного поля могут быть размещены рядом друг с другом. В настоящем документе выражение "рядом" следует понимать как означающее, что последние являются смежными или разнесенными иным образом на некоторое расстояние друг от друга. В частности, источники магнитного поля, которые являются смежными, демонстрируют поляризационную инверсию.

Постоянным магнитом является объект, выполненный из твердого магнитного материала, который имеет искусственно или естественно приобретенное длительное свойство генерации магнитного поля. Особенность постоянного магнита состоит в том факте, что его магнитное поле, приобретенное когда-то, генерируется непрерывно без потребности в любом конкретном действии. Твердый магнитный материал относится к материалу, остаточная намагниченность и коэрцитивное поле которого являются большими, больше чем 0,3 Тл и 250 кА/м соответственно.

Магнитотвердый материал может быть выбран из магнита на основе редкоземельных элементов, сплава переходного металла серии 3d (Fe, Со, Ni)-благородный металл (Pt или Pd в качестве основного элемента), ферритового магнита и магнита на основе MnBi, MnAl, MnGa, FeGa, AlNiCo. Когда материал представляет собой редкоземельный магнит, он может быть выбран из RFeB (где R состоит из Nd, Pr, Tb, Dy или смеси нескольких из этих элементов), SmCo или RCoCu (кристаллографической структуры типа 1/5), SmCoCuFe (кристаллографических структур типа 1/7 или 2/17), RFeN (где R состоит в основном из Sm).

В оставшейся части описания термин "постоянный магнит" может быть обозначен просто как "магнит".

Когда указанный по меньшей мере один дополнительный источник магнитного поля представляет собой магнит, он предпочтительно соединен с мягким ферромагнитным элементом, иначе называемым "ярмом" или "магнитопроводом". Этот мягкий ферромагнитный элемент удлиняет магнит и имеет магнитную проницаемость более чем 100 SI ("международная система", безразмерная), и насыщение в диапазоне от 1,6 Тл до 2,4 Тл. В отличие от твердых ферромагнитных элементов, мягкие ферромагнитные элементы обладают низкой остаточной намагниченностью и слабым коэрцитивным полем. Такой мягкий ферромагнитный элемент не проявляет намагниченность в отсутствии внешнего магнитного поля и позволяет направлять линии магнитного поля магнита, и, таким образом, увеличивать значение магнитного поля, генерируемого магнитом.

Катушка состоит из обмотки из проводящей проволоки. Эта обмотка может быть дополнительно изготовлена вокруг ферромагнитного материала, называемого сердечником. В противоположность магниту, катушка излучает магнитное поле только тога, когда приложено конкретное действие, в данном случае когда приложен электрический ток, который проходит через проводящую проволоку. Следовательно, как только этот электрический ток не приложен, магнитное поле не генерируется.

Когда указанный по меньшей мере один дополнительный источник магнитного поля представляет собой катушку, предпочтительно она является плоской катушкой, т.е. все витки находятся по меньшей мере в одной плоскости, предпочтительно в 1 по 5 плоскостях.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения указанный по меньшей мере один магнитный слой имеет две противоположных поверхности, которые являются поверхностью захвата и противоположной поверхностью, а указанный по меньшей мере один дополнительный источник магнитного поля представляет собой плоскую катушку, примыкающую к поверхности захвата указанного по меньшей мере одного магнитного слоя. Таким образом, плоская катушка по меньшей мере частично покрывает поверхность захвата указанного по меньшей мере одного магнитного слоя. В таком случае наночастицы будут иммобилизованы по меньшей мере частично на плоской катушке в областях захвата.

Электромагнит создает магнитное поле при подаче электрического тока: он преобразует электрическую энергию в магнитную энергию. Он состоит из катушки и сердечника, и/или одного или более полюсных наконечников, изготовленных из мягкого ферромагнитного материала. Таким образом, как и в случае с катушкой, электромагнит не излучает магнитное поле, когда через него не проходит электрический ток.

Указанный по меньшей мере один дополнительный источник магнитного поля может быть соединен или не соединен с подложкой для захвата.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения указанный по меньшей мере один дополнительный источник магнитного поля прикреплен к подложке для захвата. Предпочтительно указанное крепление является обратимым. Таким образом, это крепление может быть достигнуто путем пристегивания к подложке для захвата. Альтернативно указанное крепление является необратимым. Таким образом, это крепление может быть достигнуто приклеиванием к подложке.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения указанный по меньшей мере один дополнительный источник магнитного поля выполнен с возможностью излучения однородного магнитного поля.

Термин "однородное магнитное поле" означает магнитное поле, градиент которого составляет меньше чем 100 Тл.м^-1 вдоль оси намагниченности указанного по меньшей мере одного дополнительного источника магнитного поля и меньше чем 150 Тл.м^-1 вдоль оси, перпендикулярной оси намагниченности на поверхности указанного по меньшей мере одного дополнительного источника магнитного поля. В настоящем документе выражение "меньше чем 100 Тл.м^-1" означает 100 Тл.м^-1, 90 Тл.м^-1, 80 Тл.м^-1, 70 Тл.м^-1, 60 Тл.м^-1, 50 Тл.м^-1, 40 Тл.м^-1, 30 Тл.м^-1, 20 Тл.м^-1, 10 Тл.м^-1 или 0 Тл.м^-1. В настоящем документе выражение "меньше чем 150 Тл.м^-1" означает 150 Тл.м^-1, 140 Тл.м^-1, 130 Тл.м^-1, 120 Тл.м^-1, 110 Тл.м^-1, 100 Тл.м^-1, 90 Тл.м^-1, 80 Тл.м^-1, 70 Тл.м^-1, 60 Тл.м^-1, 50 Тл.м^-1, 40 Тл.м^-1, 30 Тл.м^-1, 20 Тл.м^-1, 10 Тл.м^-1 или 0 Тл.м^-1.

Магнитное поле, генерируемое указанным по меньшей мере одним дополнительным источником, может иметь любое направление; предпочтительно его направление перпендикулярно поверхности подложки, более предпочтительно его направление и знак являются теми же самыми, как и у магнитного поля, генерируемого указанным по меньшей мере одним магнитным слоем, на поверхности подложки для захвата в переходах между первой и второй областями.

Указанный по меньшей мере один дополнительный источник магнитного поля может быть расположен в любом местоположении вокруг подложки для захвата. Таким образом, указанный по меньшей мере один дополнительный источник может быть одинаково хорошо расположен, будучи обращенным как к поверхности захвата указанного по меньшей мере одного магнитного слоя, так и к его второй поверхности. Альтернативно указанный по меньшей мере один дополнительный источник не может быть размещен на расстоянии от подложки для захвата на первой или второй поверхности захвата указанного по меньшей мере одного магнитного слоя.

Указанный по меньшей мере один дополнительный источник магнитного поля может иметь площадь, превышающую размер площади указанного по меньшей мере одного магнитного слоя, к которому он обращен. В этом смысле, когда указанный по меньшей мере один источник магнитного поля размещен под магнитным слоем, его поверхность выступает с обеих сторон магнитного слоя. Например, когда дополнительный источник магнитного поля представляет собой совокупность магнитов, часть поверхности одного или по меньшей мере одного из магнитов не обращена к указанному по меньшей мере одному магнитному слою, или по меньшей мере один магнит не имеет поверхности, обращенной к указанному по меньшей мере одному магнитному слою.

Действительно, во всех случаях, значительные эффекты, вызываемые этим по меньшей мере одним источником магнитного поля, представляют собой, с одной стороны, намагниченность магнитных наночастиц, а с другой стороны, увеличение амплитуды стоков энергии, как указано выше.

Таким образом, указанный по меньшей мере один дополнительный источник магнитного поля предпочтительно выполнен с возможностью генерирования магнитного поля с магнитной индукцией в диапазоне от 1 мТл до 400 мТл в наночастицах, когда используется набор согласно настоящему изобретению. Для избежания риска размагничивания магнитного слоя желательно, чтобы значение коэрцитивного поля указанного по меньшей мере одного дополнительного источника магнитного поля составляло самое большее 90% значения коэрцитивного поля указанного по меньшей мере одного магнитного слоя.

В настоящем документе выражение "от 1 мТл до 400 мТл" означает 1 мТл, 5 мТл, 10 мТл, 15 мТл, 20 мТл, 25 мТл, 30 мТл, 35 мТл, 40 мТл, 45 мТл, 50 мТл, 55 мТл, 60 мТл, 65 мТл, 70 мТл, 75 мТл, 80 мТл, 85 мТл, 90 мТл, 95 мТл, 100 мТл, 105 мТл, 110 мТл, 115 мТл, 120 мТл, 125 мТл, 130 мТл, 135 мТл, 140 мТл, 145 мТл, 150 мТл, 155 мТл, 160 мТл, 165 мТл, 170 мТл, 175 мТл, 180 мТл, 185 мТл, 190 мТл, 195 мТл, 200 мТл, 205 мТл, 210 мТл, 215 мТл, 220 мТл, 225 мТл, 230 мТл, 235 мТл, 240 мТл, 245 мТл, 250 мТл, 255 мТл, 260 мТл, 265 мТл, 270 мТл, 275 мТл, 280 мТл, 285 мТл, 290 мТл, 295 мТл, 300 мТл, 305 мТл, 310 мТл, 315 мТл, 320 мТл, 325 мТл, 330 мТл, 335 мТл, 340 мТл, 345 мТл, 350 мТл, 355 мТл, 360 мТл, 365 мТл, 370 мТл, 375 мТл, 380 мТл, 385 мТл, 390 мТл, 395 мТл, 400 мТл.

Предпочтительно указанный по меньшей мере один источник магнитного поля выполнен с возможностью генерирования магнитного поля с магнитной индукцией в диапазоне от 10 мТл до 400 мТл, более предпочтительно от 50 мТл до 200 мТл.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения указанный по меньшей мере один дополнительный источник магнитного поля выполнен с возможностью излучения магнитного поля непрерывно.

Альтернативно указанный по меньшей мере один дополнительный источник магнитного поля выполнен с возможностью излучения импульсного магнитного поля. Предпочтительно длительность импульса больше или равна 1 мс. Такая длительность позволяет увеличить намагниченность магнитных наночастиц на период времени, достаточно длительный для воздействия на их движение по сравнению с простым броуновским движением.

Изобретение также относится к набору, определенному выше, в котором указанный по меньшей мере один магнитный слой имеет поверхность захвата, при этом указанный по меньшей мере один магнитный слой по меньшей мере частично покрыт на указанной поверхности захвата немагнитным слоем.

Когда присутствует такой немагнитный слой, происходит захват и иммобилизация наночастиц на поверхности немагнитного слоя для части упомянутого по меньшей мере одного магнитного слоя с покрытием вследствие того, что так называемая поверхность "захвата" указанного по меньшей мере одного магнитного слоя имеет покрытие.

Присутствие этого немагнитного слоя выгодно тем, что позволяет отсрочить инициирование притяжения наночастиц подложкой для захвата в желаемый момент, как подробно описано ниже.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения материал немагнитного слоя выбран из следующего списка: стекло, кремний, полимер пластика, силиконовая бумага, клейкая лента, немагнитный металлический сплав, такой как дюралюминий или титан, кварц, органические материалы, такие как бумага или бамбук, дерево, золото или сочетание этих материалов.

Предпочтительно полимер выбран из следующего списка: полидиметилсилоксан (ПДМС), полиметилметакрилат (ПММА),

циклоолефиновый полимер (СОС/ЦОП), поликарбонат, полиимид, поливинилхлорид (ПВХ), полиэтилен, полипропилен, силикон, полиэфир или сочетание этих материалов.

Согласно одному варианту реализации указанный немагнитный слой имеет тот же самый состав, что и элемент подложки. Альтернативно указанный немагнитный слой имеет состав, отличающийся от состава элемента подложки.

Предпочтительно указанный по меньшей мере один источник магнитного поля не проявляет флюоресценцию. Более предпочтительно он является матовым и не отражает свет.

Предпочтительно материал немагнитного слоя состоит из адгезионной ленты или содержит адгезионную ленту с наложением слоя поливинилхлорида (ПХВ) и клейкого слоя, или слоя полипропилена и акрилового клея.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения указанный по меньшей мере один магнитный слой покрыт по меньшей мере на 1% его поверхности захвата указанным немагнитным слоем. Выражение "по меньшей мере на 1%" следует понимать как означающий 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%.

Предпочтительно указанный по меньшей мере один магнитный слой покрыт по меньшей мере на 30% его поверхности захвата, более предпочтительно по меньшей мере на 50% его поверхности захвата, еще более предпочтительно по меньшей мере на 60% его поверхности захвата, предпочтительно по меньшей мере на 80% его поверхности захвата.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения поверхность захвата указанного по меньшей мере одного магнитного слоя полностью покрыта указанным немагнитным слоем.

Настоящее изобретение также относится к набору, определенному выше, в котором указанный немагнитный слой имеет толщину в диапазоне от 1 мкм до 300 мкм. В настоящем документе выражение "от 1 мкм до 300 мкм" следует понимать как означающее 1 мкм, 2 мкм, 3 мкм, 4 мкм, 5 мкм, 6 мкм, 7 мкм, 8 мкм, 9 мкм, 10 мкм, 11 мкм, 12 мкм, 13 мкм, 14 мкм, 15 мкм, 16 мкм, 17 мкм, 18 мкм, 19 мкм, 20 мкм, 21 мкм, 22 мкм, 23 мкм, 24 мкм, 25 мкм, 26 мкм, 27 мкм, 28 мкм, 29 мкм, 30 мкм, 31 мкм, 32 мкм, 33 мкм, 34 мкм, 35 мкм, 36 мкм, 37 мкм, 38 мкм, 39 мкм, 40 мкм, 41 мкм, 42 мкм, 43 мкм, 44 мкм, 45 мкм, 46 мкм, 47 мкм, 48 мкм, 49 мкм, 50 мкм, 51 мкм, 52 мкм, 53 мкм, 54 мкм, 55 мкм, 56 мкм, 57 мкм, 58 мкм, 59 мкм, 60 мкм, 61 мкм, 62 мкм, 63 мкм, 64 мкм, 65 мкм, 66 мкм, 67 мкм, 68 мкм, 69 мкм, 70 мкм, 71 мкм, 72 мкм, 73 мкм, 74 мкм, 75 мкм, 76 мкм, 77 мкм, 78 мкм, 79 мкм, 80 мкм, 81 мкм, 82 мкм, 83 мкм, 84 мкм, 85 мкм, 86 мкм, 87 мкм, 88 мкм, 89 мкм, 90 мкм, 91 мкм, 92 мкм, 93 мкм, 94 мкм, 95 мкм, 96 мкм, 97 мкм, 98 мкм, 99 мкм, 100 мкм, 101 мкм, 102 мкм, 103 мкм, 104 мкм, 105 мкм, 106 мкм, 107 мкм, 108 мкм, 109 мкм, 110 мкм, 111 мкм, 112 мкм, 113 мкм, 114 мкм, 115 мкм, 116 мкм, 117 мкм, 118 мкм, 119 мкм, 120 мкм, 121 мкм, 122 мкм, 123 мкм, 124 мкм, 125 мкм, 126 мкм, 127 мкм, 128 мкм, 129 мкм, 130 мкм, 131 мкм, 132 мкм, 133 мкм, 134 мкм, 135 мкм, 136 мкм, 137 мкм, 138 мкм, 139 мкм, 140 мкм, 141 мкм, 142 мкм, 143 мкм, 144 мкм, 145 мкм, 146 мкм, 147 мкм, 148 мкм, 149 мкм, 150 мкм, 151 мкм, 152 мкм, 153 мкм, 154 мкм, 155 мкм, 156 мкм, 157 мкм, 158 мкм, 159 мкм, 160 мкм, 161 мкм, 162 мкм, 163 мкм, 164 мкм, 165 мкм, 166 мкм, 167 мкм, 168 мкм, 169 мкм, 170 мкм, 171 мкм, 172 мкм, 173 мкм, 174 мкм, 175 мкм, 176 мкм, 177 мкм, 178 мкм, 179 мкм, 180 мкм, 181 мкм, 182 мкм, 183 мкм, 184 мкм, 185 мкм, 186 мкм, 187 мкм, 188 мкм, 189 мкм, 190 мкм, 191 мкм, 192 мкм, 193 мкм, 194 мкм, 195 мкм, 196 мкм, 197 мкм, 198 мкм, 199 мкм, 200 мкм, 201 мкм, 202 мкм, 203 мкм, 204 мкм, 205 мкм, 206 мкм, 207 мкм, 208 мкм, 209 мкм, 210 мкм, 211 мкм, 212 мкм, 213 мкм, 214 мкм, 215 мкм, 216 мкм, 217 мкм, 218 мкм, 219 мкм, 220 мкм, 221 мкм, 222 мкм, 223 мкм, 224 мкм, 225 мкм, 226 мкм, 227 мкм, 228 мкм, 229 мкм, 230 мкм, 231 мкм, 232 мкм, 233 мкм, 234 мкм, 235 мкм, 236 мкм, 237 мкм, 238 мкм, 239 мкм, 240 мкм, 241 мкм, 242 мкм, 243 мкм, 244 мкм, 245 мкм, 246 мкм, 247 мкм, 248 мкм, 249 мкм, 250 мкм, 251 мкм, 252 мкм, 253 мкм, 254 мкм, 255 мкм, 256 мкм, 257 мкм, 258 мкм, 259 мкм, 260 мкм, 261 мкм, 262 мкм, 263 мкм, 264 мкм, 265 мкм, 266 мкм, 267 мкм, 268 мкм, 269 мкм, 270 мкм, 271 мкм, 272 мкм, 273 мкм, 274 мкм, 275 мкм, 276 мкм, 277 мкм, 278 мкм, 279 мкм, 280 мкм, 281 мкм, 282 мкм, 283 мкм, 284 мкм, 285 мкм, 286 мкм, 287 мкм, 288 мкм, 289 мкм, 290 мкм, 291 мкм, 292 мкм, 293 мкм, 294 мкм, 295 мкм, 296 мкм, 297 мкм, 298 мкм, 299 мкм или 300 мкм.

Предпочтительно, указанный немагнитный слой имеет толщину в диапазоне от 1 мкм до 150 мкм, более предпочтительно от 5 мкм до 100 мкм, еще более предпочтительно от 10 мкм до 80 мкм, предпочтительно от 30 мкм до 60 мкм.

Немагнитный слой должен быть ни слишком тонким, ни слишком толстым. Действительно, в случае, когда указанный немагнитный слой является слишком тонким, т.е. с толщиной меньше чем 1 мкм, он не оказывает значительного влияния на ослабление притяжения наночастиц указанным по меньшей мере одним магнитным слоем.

Следует отметить, что толщина слоя будет зависеть от удерживающей способности указанного по меньшей мере одного магнитного слоя и от ширины первой и второй областей. Специалисты в данной области техники легко смогут адаптировать толщину магнитного слоя в зависимости от удерживающей способности и ширины областей указанного по меньшей мере одного магнитного слоя.

Обычно для магнитного слоя с удерживающей способностью 12000 мкм⋅Гс, первая и вторая области которого имеют ширину 50 мкм, немагнитный слой преимущественно имеет толщину от 20 мкм до 60 мкм. Для магнитных слоев с более низкой удерживающей способностью толщина магнитного слоя должна быть соответственно уменьшена.

В случае, когда немагнитный слой слишком толстый (в зависимости от толщины и ширины областей указанного по меньшей мере одного магнитного слоя), сильные градиенты магнитного поля будут скрыты этим немагнитным слоем. Таким образом, магнитное поле на поверхности указанного немагнитного слоя будет однородным или будет отсутствовать, в зависимости от случая применения. В этом случае наночастицы не будут иммобилизованы или же будут иммобилизованы случайным образом, а не по определенному образцу, на поверхности немагнитного слоя.

Приложение магнитного поля указанного по меньшей мере одного дополнительного источника магнитного поля предпочтительно позволяет в таком случае "выявлять" сильные градиенты магнитного поля у поверхности немагнитного слоя путем увеличения амплитуды стоков энергии. Этот аспект настоящего изобретения позволяет "инициировать" захват и иммобилизацию наночастиц в областях захвата, как описано более подробно ниже.

Настоящее изобретение также относится к подложке для захвата, содержащей несколько (от 1 до 100) микрофлюидных каналов, имеющих либо общий по меньшей мере с некоторыми из каналов вход, либо независимый вход для каждого канала, с одной стороны, и на выходе одно вентиляционное отверстие на канал, или же одно вентиляционное отверстие, общее по меньшей мере для некоторых каналов, с другой стороны. Эти микрофлюидные каналы связаны с немагнитным слоем, который, в свою очередь, осажден на магнитный слой, связанный с элементом подложки. Магнитный слой предварительно закодирован с намагниченностью вдоль горизонтальной плоскости указанного магнитного слоя и ориентацией, изменяющейся на 180° от одной области к другой. Сантиметровый или миллиметровый магнит, изготовленный из неодима-железа-бора, используется в качестве дополнительного источника магнитного поля для приложения внешнего магнитного поля, ориентация и направление которого такие же, как у магнитного слоя на переходах между первой и второй областями.

Настоящее изобретение также относится к способу захвата молекулы, содержащейся в образце, причем указанный способ включает следующие этапы:

a) приведение указанного образца в контакт с магнитными наночастицами, как определено выше, с образованием по меньшей мере одного захватного комплекса между указанной молекулой и указанным по меньшей мере одним элементом захвата, связанным с указанными магнитными наночастицами;

b) притяжение указанного по меньшей мере одного захватного комплекса, образованного на этапе а), магнитным полем, создаваемым по меньшей мере одним магнитным слоем подложки для захвата, как определено выше, так что указанный по меньшей мере один захватный комплекс иммобилизуется на указанной подложке для захвата по меньшей мере в одной области захвата, как определено выше.

Цель этапа а) настоящего изобретения состоит в образовании комплекса молекул, которые должны быть захвачены, с наночастицами посредством элемента захвата, так что эти комплексообразующие молекулы могут косвенно притянуты посредством наночастиц на последующем этапе b) с помощью указанного по меньшей мере одного магнитного слоя и, наконец, захвачены иммобилизацией на подложке.

В оставшейся части описания захватный комплекс может быть просто обозначен термином "комплекс".

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения указанный элемент захвата представляет собой антитело или антиген, так что указанный по меньшей мере один захватный комплекс, образованный на этапе а), является иммунным комплексом.

В настоящем документе термин "образец" означает любую простую или сложную текучую среду.

В настоящем документе выражение "сложная текучая среда" означает смесь, в которой сосуществуют две фазы: твердо-жидкая (суспензии или растворы макромолекул, таких как полимеры), твердо-газовая (гранулированная), жидко-газовая (пены) или жидко-жидкая (эмульсии). Сложные жидкости отклоняются от классической линейной ньютоновской зависимости между напряжением и скоростью сдвига. Они проявляют необычную механическую реакцию на приложенное напряжение или деформацию из-за геометрических ограничений, налагаемых сосуществованием фаз. Механическая реакция содержит переходы между поведением, подобным поведению твердого вещества, и поведением, подобным поведению текучей среды, а также флуктуации. В частности, образец может представлять собой биологическую текучую среду, такую как кровь, моча, лимфа, плазма, сыворотка, слюна, слезы, сперма, вагинальные выделения, гной из раны, желудочная жидкость или спинномозговая жидкость. Образец также может представлять собой среду, используемую в биопроцессах, такую как культуральная среда или очищенная, или осветленная культуральная среда.

В настоящем документе выражение "простая текучая среда" означает ньютоновскую текучую среду, механическое поведение которой характеризуется единственной функцией температуры, вязкости, меры "скольжения" жидкости. Напряжение, приложенное к простой текучей среде, прямо пропорционально скорости деформации. В частности, образцом может быть деионизированная вода. Преимущество деионизированной воды заключается в том, что она значительно ограничивает или даже предотвращает образование кластеров наночастиц.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения, после того, как образец приводится в контакт с наночастицами на этапе а), его размещают на подложке для захвата, чтобы обеспечить возможность притяжения указанного по меньшей мере одного захватного комплекса на этапе b).

Таким образом, этап приведения в контакт и этап притяжения выполняют отдельно, так что наночастицы не притягиваются указанным по меньшей мере одним магнитным слоем при их контакте с образцом. Это преимущественно позволяет получить однородное распределение наночастиц в образце и, следовательно, более эффективное комплексообразование элементов захвата с захватываемой молекулой.

Альтернативно образец сначала наносят на подложку перед тем, как привести его в контакт с наночастицами на этапе а). Таким образом, этапы а) и b) выполняют в одном и том же месте, т.е. на подложке. Этот вариант реализации представляет большой интерес в некоторых случаях применения, в частности, поскольку он не требует обращения с текучей средой с помощью исполнительных механизмов типа микронасоса или микроклапана.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения между этапом а) и этапом b) выполняют обработку ультразвуком смеси, содержащей комплексы наночастиц-молекул в суспензии, которые должны быть захвачены, с целью разрушения любого агрегата комплексов, которые могут образовываться. Эти агрегаты действительно могут нарушать этап количественного анализа, описанный ниже. Такая обработка ультразвуком может, в частности, выполняться на частоте по меньшей мере 10000 Гц. Обработка ультразвуком может быть непрерывной или импульсной. Когда обработка ультразвуком является импульсной, длительность каждой операции обработки ультразвуком может колебаться в диапазоне от 200 мс до 700 мс, в частности, от 300 мс до 600 мс, в частности, может составлять 500 мс, с интервалом в диапазоне от 1 сек до 6 сек, в частности, от 1 сек до 4 сек, в частности, может составлять 2 сек. Эти условия обработки ультразвуком позволяют обеспечить функцию разрушения агрегатов с одновременным предотвращением перегрева среды, который может вызвать денатурацию элементов захвата, захватываемых молекул и элементов обнаружения.

На этапе а) концентрация наночастиц предпочтительно находится в диапазоне от 10⁶ частиц/мл до 10¹¹ частиц/мл. В настоящем документе выражение "от 10⁶ частиц/мл до 10¹¹ частиц/мл" означает 10⁶ частиц/мл, 10⁷ частиц/мл, 10⁸ частиц/мл, 10⁹ частиц/мл, 10¹⁰ частиц/мл и 10¹¹ частиц/мл.

Минимальная концентрация 10⁶ частиц/мл обеспечивает достаточную концентрацию для эффективного захвата молекул, подлежащих захвату, рассеянных в образце. Кроме того, максимальная концентрация 10¹¹ частиц/мл позволяет избежать слишком большой агломерации наночастиц (кластеров с диаметром меньше или равным 15 мкм), что, с одной стороны, нарушило бы связь между элементом захвата и молекулу, подлежащей захвату, и, с другой стороны, оказывает негативное воздействие на количественный анализ захваченной молекулы. Высокая концентрация наночастиц также способствует экранированию магнитных полей, т.е. их ослаблению, и оказывает негативное воздействие на притяжение наночастиц. В настоящем документе выражение "кластер с диаметром меньше или равным 15 мкм" означает 15 мкм, 10 мкм, 5 мкм, 4, мкм, 3 мкм, 2 мкм, 1 мкм, 0,5 мкм и 0,2 мкм.

Согласно одному варианту реализации этап а) дополнительно включает приведение образца в контакт с элементом для обнаружения указанной молекулы.

Этот элемент обнаружения имеет маркер, который может быть флуоресцентным, люминесцентным или окрашенным, чтобы его можно было распознать с помощью соответствующих средств обнаружения. Этот маркер также может быть ферментом с окислительно-восстановительными свойствами.

Таким образом, на этапе а) создается так называемый комплекс типа "сэндвич", образуемый магнитной наночастицей, элементом захвата, молекулой, подлежащая захвату, и элементом обнаружения. Затем захватываемая молекула окружается, образуя "сэндвич", между элементом захвата и элементом обнаружения.

Образование таких комплексов типа "сэндвич", в которых элемент обнаружения соединяется с молекулой, подлежащей захвату, на первом этапе, становится возможным благодаря хорошим диффузионным характеристикам в смеси магнитных наночастиц. Так что, образование таких комплексов затруднено при использовании магнитных микрочастиц.

Этап обработки ультразвуком, описанный выше, также может быть выполнен в этом варианте реализации при тех же условиях, чтобы избежать любой агрегации комплексов типа "сэндвич".

Альтернативно элемент обнаружения может быть размещен в присутствии молекулы, подлежащей захвату, на этапе с) после иммобилизации на подложке комплексов, образуемых наночастицей, элементом захвата и захватываемой молекулой. Таким образом, так называемые комплексы типа "сэндвич", как описано выше, образуются a posteriori во время этапа с).

В конечном счете, в конце этапа а) получают смесь, содержащую комплексы наночастиц, элементов захвата и молекул, подлежащих захвату, или комплексы наночастиц, элементов захвата, молекул, подлежащих захвату, и элемента обнаружения, если он присутствует. В этой смеси могут оставаться только одиночные молекулы, подлежащие захвату, и наночастицы, связанные только с элементами захвата, и при необходимости только элементы обнаружения.

Указанная смесь может быть нанесена, например, с помощью пипетки, на подложку для захвата, чтобы иммобилизировать наночастицы на этапе b). Указанная смесь также может быть введена на подложку для захвата в случае, когда эта подложка для захвата является, например, камерой.

После размещения указанной смеси на подложке все магнитные наночастицы (комплексированные или некомплексированные) будут притягиваться указанным по меньшей мере одним магнитным слоем и останутся на подложке, точнее, на поверхности захвата указанного по меньшей мере одного магнитного слоя.

Магнитные наночастицы (комплексированные или некомплексированные) во время их иммобилизации не распределяются случайным образом по подложке, точнее, на поверхности захвата указанного по меньшей мере одного магнитного слоя.

Фактически, наночастицы иммобилизуются в областях захвата, как определено в настоящем изобретении. Таким образом, только незначительная часть наночастиц, составляющая менее 15%, будет либо иммобилизована вне этих областей захвата, либо не будет захвачена.

Таким образом, наночастицы распределены на подложке, а именно, на поверхности захвата указанного по меньшей мере одного магнитного слоя, согласно конкретному шаблону, заданному всеми переходами между первой и второй областями.

Это распределение является очень интересным, поскольку оно позволяет определить, где будут захвачены наночастицы, что обеспечивает возможность прямого количественного анализа указанных захваченных молекул, не выполняя этап промывки.

Организация первой и второй областей указанного по меньшей мере одного магнитного слоя обеспечивает возможность выполнения обнаружения и количественного анализа без промывки подложки непосредственно после иммобилизации захватных комплексов и связывания с элементами обнаружения или иммобилизации захватных комплексов типа "сэндвич".

Для этого в первую очередь необходимо определить количество маркировок в областях захвата, а затем вне областей захвата.

Специалисты легко смогут адаптировать средства для определения количества маркировок, которые могут быть осуществлены в зависимости от типа маркера, соединенного с элементами обнаружения. В частности, эти средства могут быть выбраны из спектрофотометра в сканирующем режиме, эпифлуоресцентного микроскопа, конфокального микроскопа, двухфотонного микроскопа, измерения окислительно-восстановительной активности фермента и т.п.

Например, в контексте флуоресцентной маркировки специалистам в данной области будет полезно использовать флуоресцентный микроскоп, оснащенный кубом "GFP" (с возбуждением 460-490 нм) или кубом "ПЦР" (с возбуждением 650 необходим, эмиссией 660 нм), соединенный с устройством с зарядовой связью (CCD) или камерой CMOS, как представлено в разделе "Примеры" настоящего описания.

Количество маркировок вне областей захвата соответствует "фоновому сигналу". Иными словами, эта маркировка соответствует элементам обнаружения, не связанным с захватными комплексами и с миноритарной фракцией комплексов, иммобилизированных вне областей захвата, а также влиянию матрицы (остаточного сигнала среды).

Чтобы получить количество специфической маркировки, излучаемой в областях захвата, количество маркировки, полученное вне областей захвата, вычитают из количества маркировки, полученного в областях захвата.

Настоящее изобретение также относится к способу захвата, определенному выше, согласно которому притяжение указанного по меньшей мере одного захватного комплекса на этапе b) осуществляется совместным действием магнитного поля, создаваемого указанным по меньшей мере одним магнитным слоем, и магнитного поля, генерируемого по меньшей мере одним дополнительным источником магнитного поля, как определено выше.

Как указано выше, указанный по меньшей мере один дополнительный источник магнитного поля позволяет увеличить или даже насытить намагниченность магнитных наночастиц и, кроме того, увеличить амплитуду стоков энергии и, таким образом, ускорить притяжение наночастиц указанным по меньшей мере одним магнитным слоем.

Кроме того, как описано выше, дополнительное магнитное поле позволяет усилить определенные области захвата и, таким образом, способствует локализованному захвату, что, следовательно, способствует обнаружению без промывки захваченной молекулы, как описано выше.

Это совместное действие также позволяет избежать использования испарения растворителя из образца с целью приблизить наночастицы к подложке для захвата и тем самым ускорить их захват. Такое испарение фактически требует нагревания образца или очень длинного времени ожидания, что может иметь негативные последствия для связи между элементом захвата/элементом обнаружения и молекулой, подлежащей захвату, и, таким образом, для количественного анализа молекулы, подлежащей захвату.

Таким образом, притяжение наночастиц достигается совместным действием указанного по меньшей мере одного источника магнитного поля и указанного по меньшей мере одного магнитного слоя, каждый из которых оказывает различное действие и выполняет различные функции.

Вследствие своей функции и своего действия указанный по меньшей мере один источник магнитного поля может быть размещен в любом месте по отношению к подложке для захвата, как указано выше.

Таким образом, указанный по меньшей мере один дополнительный источник с одинаковым успехом может быть расположен:

обращенным к поверхности захвата указанного по меньшей мере одного магнитного слоя и/или немагнитного слоя,

обращенным к противоположной поверхности или элементу подложки или

в любом другом положении, например, со смещением в боковом направлении.

Значительная намагниченность наночастиц предпочтительно достигается путем приложения магнитного поля на их уровне в диапазоне от 1 мТл до 400 мТл, предпочтительно от 10 мТл до 400 мТл, более предпочтительно от 50 мТл до 200 мТл.

Воздействие указанного по меньшей мере одного дополнительного источника магнитного поля может быть осуществлено на этапах а) и b).

Предпочтительно оно инициируется на этапе b). Таким образом, во время этапа а) и до инициирования действия указанного по меньшей мере одного дополнительного источника магнитного поля его магнитное поле в магнитных наночастицах является недостаточным или даже нулевым.

Инициирование действия указанного по меньшей мере одного дополнительного источника поля на этапе b) обеспечено генерацией в магнитных наночастицах магнитного поля с магнитной индукцией в диапазоне от 1 мТл до 400 мТл, предпочтительно от 10 мТл до 400 мТл, более предпочтительно от 50 мТл до 200 мТл.

Таким образом, чтобы инициировать действие указанного по меньшей мере одного дополнительного источника магнитного поля, последний согласно первой альтернативе может быть приближен к подложке для захвата. Для этого варианта реализации указанный по меньшей мере один дополнительный источник магнитного поля предпочтительно является постоянным магнитом.

Согласно второй альтернативе указанное инициирование достигается пропусканием электрического тока через указанный дополнительный источник магнитного поля. Для этого варианта реализации указанным по меньшей мере одним дополнительным источником магнитного поля предпочтительно является катушка или электромагнит, а инициирование достигается пропусканием электрического тока через указанный дополнительный источник магнитного поля.

Предпочтительно, даже если действие указанного по меньшей мере одного дополнительного источника магнитного поля прекращено в конце этапа b), например, отдалением этого источника или прекращением электрического тока, проходящего через него, захваченные наночастицы остаются на месте на подложке для захвата в областях захвата. Таким образом, обеспечена возможность перемещения подложки для захвата в подходящее место для обнаружения маркера элементов обнаружения без воздействия на положение этих наночастиц и, следовательно, прямого обнаружения без ущерба для этапа промывки.

Настоящее изобретение также относится к способу захвата, как определено выше, согласно которому подложка для захвата дополнительно содержит немагнитный слой, как определено выше, а притяжение указанного по меньшей мере одного захватного комплекса подложкой для захвата на этапе b) инициируется посредством магнитного поля указанного по меньшей мере одного дополнительного источника магнитного поля.

В этом варианте реализации присутствие немагнитного слоя уменьшает или даже устраняет возможность того, что наночастицы будут притягиваться только магнитным полем, генерируемым указанным по меньшей мере одним магнитным слоем.

Таким образом, предпочтительно

- с одной стороны, магнитное поле, генерируемое всеми указанными по меньшей мере одним магнитным слоем и указанным по меньшей мере одним дополнительным источником, имеет по меньшей мере одно изменение своей магнитной индукции по меньшей мере на 0,1 мТл на расстоянии по меньшей мере 1 мкм от поверхности захвата указанного немагнитного слоя, при этом указанное по меньшей мере одно изменение его магнитной индукции определяет максимум и минимум нормы индукции магнитного поля для определения области захвата магнитных наночастиц на подложке для захвата при указанном максимуме нормы указанного магнитного поля, и

- с другой стороны, магнитное поле, генерируемое указанным по меньшей мере одним магнитным слоем, не показывает по меньшей мере одно изменение его магнитной индукции по меньшей мере на 0,1 мТл на расстоянии по меньшей мере 1 мкм от поверхности указанного немагнитного слоя, так что магнитное поле, генерируемое только указанным по меньшей мере одним магнитным слоем, не позволяет определить область захвата магнитных наночастиц на поверхности указанного немагнитного слоя.

Поверхность подложки соответствует своей поверхности, на которой иммобилизованы наночастицы.

Таким образом, притяжение магнитных наночастиц на этапе b) зависит от действия указанного по меньшей мере одного источника магнитного поля на эти наночастицы, т.е.

- значительного увеличения намагниченности этих частиц посредством магнитного поля, генерируемого этим источником, и/или

- увеличения амплитуды стоков энергии.

Этот аспект настоящего изобретения очень интересен, поскольку он позволяет оптимизировать выполнение этапов а) и b) в одном и том же месте, т.е. на подложке для захвата путем уменьшения или даже исключения возможности того, что наночастицы могут притягиваться только под действием указанного по меньшей мере одного магнитного слоя во время этапа а).

Благодаря присутствию немагнитного слоя, по меньшей мере часть наночастиц (комплексированных или некомплексированных) будет иммобилизирована не на указанном по меньшей мере одном магнитном слое, но на этом немагнитном слое. Точнее, благодаря немагнитному слою, имеющему поверхность захвата и противоположную поверхность, обращенную к указанному по меньшей мере одному магнитному слою, по меньшей мере часть наночастиц иммобилизуются во время этапа b) на первой поверхности захвата немагнитного слоя.

Настоящее изобретение также относится к способу захвата, как определено выше, согласно которому образец размещают на подложке для захвата перед этапом а) приведения в контакт с магнитными наночастицами.

Предпочтительно действие указанного по меньшей мере одного источника магнитного поля инициируется на этапе b).

Таким образом, на этапе а) намагниченность магнитных наночастиц и/или амплитуда стоков энергии указанного по меньшей мере одного магнитного слоя не достаточны для обеспечения возможности притяжения указанных наночастиц действием только указанного по меньшей мере одного магнитного слоя, покрытого указанным немагнитным слоем. Таким образом, смешивание наночастиц с образцом почти не нарушается или вообще не нарушается ранним притяжением указанного по меньшей мере одного дополнительного источника магнитного поля.

Неожиданно было обнаружено, что несмотря на присутствие немагнитного слоя и его влияние на способность указанного по меньшей мере одного магнитного слоя притягивать наночастицы, если действие магнитного поля, генерируемого указанным по меньшей мере одним дополнительным источником магнитного поля, прекращается в конце этапа b), например, путем отдаления этого источника или путем прекращения подачи электрического тока, иммобилизированные наночастицы остаются в месте на подложке в областях захвата.

Одно из объяснений этого явления может состоять в том, что градиенты магнитных полей, вырабатываемых указанным по меньшей мере одним магнитным слоем и присутствующих на поверхности немагнитного слоя, являются достаточными для удержания наночастиц на месте на указанном немагнитном слое. Дополнительное объяснение может состоять в том, что существует адсорбция, т.е. химическая/физическая связь между, с одной стороны, магнитными наночастицами, которые агломерировали друг с другом, и, с другой стороны, частицами, поглощенными поверхностью захвата немагнитного слоя.

Таким образом, в данном случае опять же подложка для захвата может быть перемещена в подходящее место для обнаружения маркера элементов обнаружения без воздействия на положение этих частиц и, следовательно, для прямого обнаружения без ущерба для этапа промывки.

Настоящее изобретение также относится к способу захвата, как определено выше, включающему последующий этап с) смещения магнитных наночастиц, захваченных на подложке, в область восстановления.

Это смещение осуществляют с помощью метода, называемого "шатун-кривошип", согласно которому:

- "кривошип" представляет собой магнитное поле, генерируемое магнитными областями указанного по меньшей мере одного магнитного слоя; это магнитное поле может быть обозначено как b(R) (R - точка в пространстве). Указанный по меньшей мере один магнитный слой показывает изменение магнитной индукции генерируемого магнитного поля с созданием минимумов магнитной энергии;

- "шатун" представляет собой пространственно однородное (по направлению и по магнитной индукции) магнитное поле, генерируемое указанным по меньшей мере одним дополнительным источником магнитного поля. В этом случае применения амплитуда и ориентация указанного магнитного поля могут быть изменены.

"Однородное" магнитное поле, генерируемое "шатуном", приложено по всей области, где генерируется магнитное поле "кривошипа". Таким образом, магнитное поле, генерируемое "шатуном", сосуществует в пространстве с магнитным полем, генерируемым указанным по меньшей мере одним магнитным слоем, так что их векторные значения накладываются линейно в среде с относительной проницаемости, равной единице (такой как воздух или вода).

Вследствие того, что магнитное поле, генерируемое "шатуном", можно модулировать, на этапе с) его можно поворачивать по меньшей мере на 1° по часовой стрелке или против часовой стрелки вокруг по меньшей мере одной оси вращения, и/или можно усилить указанное магнитное поле. Следовательно, можно временно изменить магнитное поле "шатуна". Таким образом, магнитное поле шатуна может быть обозначено как B(t) (t - время).

Следовательно, магнитное поле "кривошипа" изменяется в пространстве, но не во времени, а магнитное поле "шатуна" изменяется во времени.

Таким образом, в области, в которой действуют "шатун" и "кривошип", полное магнитное поле ST представляет собой векторную сумму b и В, или BT(R,t)=b(R)+B(t).

Таким образом, на этапе с) можно изменять положение областей захвата магнитных наночастиц относительно подложки.

В настоящем документе выражение "от 1° до 360°" означает 1°, 2°, 3°, 4°, 5°, 6°, 7°, 8°, 9°, 10°, 11°, 12°, 13°, 14°, 15°, 16°, 17°, 18°, 19°, 20°, 21°, 22°, 23°, 24°, 25°, 26°, 27°, 28°, 29°, 30°, 31°, 32°, 33°, 34°, 35°, 36°, 37°, 38°, 39°, 40°, 41°, 42°, 43°, 44°, 45°, 46°, 47°, 48°, 49°, 50°, 51°, 52°, 53°, 54°, 55°, 56°, 57°, 58°, 59°, 60°, 61°, 62°, 63°, 64°, 65°, 66°, 67°, 68°, 69°, 70°, 71°, 72°, 73°, 74°, 75°, 76°, 77°, 78°, 79°, 80°, 81°, 82°, 83°, 84°, 85°, 86°, 87°, 88°, 89°, 90°, 91°, 92°, 93°, 94°, 95°, 96°, 97°, 98°, 99°, 100°, 101°, 102°, 103°, 104°, 105°, 106°, 107°, 108°, 109°, 110°, 111°, 112°, 113°, 114°, 115°, 116°, 117°, 118°, 119°, 120°, 121°, 122°, 123°, 124°, 125°, 126°, 127°, 128°, 129°, 130°, 131°, 132°, 133°, 134°, 135°, 136°, 137°, 138°, 139°, 140°, 141°, 142°, 143°, 144°, 145°, 146°, 147°, 148°, 149°, 150°, 151°, 152°, 153°, 154°, 155°, 156°, 157°, 158°, 159°, 160°, 161°, 162°, 163°, 164°, 165°, 166°, 167°, 168°, 169°, 170°, 171°, 172°, 173°, 174°, 175°, 176°, 177°, 178°, 179°, 180°, 181°, 182°, 183°, 184°, 185°, 186°, 187°, 188°, 189°, 190°, 191°, 192°, 193°, 194°, 195°, 196°, 197°, 198°, 199°, 200°, 201°, 202°, 203°, 204°, 205°, 206°, 207°, 208°, 209°, 210°, 211°, 212°, 213°, 214°, 215°, 216°, 217°, 218°, 219°, 220°, 221°, 222°, 223°, 224°, 225°, 226°, 227°, 228°, 229°, 230°, 231°, 232°, 233°, 234°, 235°, 236°, 237°, 238°, 239°, 240°, 241°, 242°, 243°, 244°, 245°, 246°, 247°, 248°, 249°, 250°, 251°, 252°, 253°, 254°, 255°, 256°, 257°, 258°, 259°, 260°, 261°, 262°, 263°, 264°, 265°, 266°, 267°, 268°, 269°, 270°, 271°, 272°, 273°, 274°, 275°, 276°, 277°, 278°, 279°, 280°, 281°, 282°, 283°, 284°, 285°, 286°, 287°, 288°, 289°, 290°, 291°, 292°, 293°, 294°, 295°, 296°, 297°, 298°, 299°, 300°, 301°, 302°, 303°, 304°, 305°, 306°, 307°, 308°, 309°, 310°, 311°, 312°, 313°, 314°, 315°, 316°, 317°, 318°, 319°, 320°, 321°, 322°, 323°, 324°, 325°, 326°, 327°, 328°, 329°, 330°, 331°, 332°, 333°, 334°, 335°, 336°, 337°, 338°, 339°, 340°, 341°, 342°, 343°, 344°, 345°, 346°, 347°, 348°, 349°, 350°, 351°, 352°, 353°, 354°, 355°, 356°, 357°, 358°, 359° или 360°.

Затем получают результат векторного суммирования магнитных полей "шатуна" и "кривошипа", который отличается от полученного в конце этапа b), и расположение максимумов нормы индукции магнитного поля, генерируемого совокупностью "шатун-кривошип", перемещают таким образом, чтобы области захвата сместились относительно положения областей захвата на этапе b). Таким образом, наночастицы, притягиваемые генерируемым магнитным полем с указанными градиентами, одновременно перемещаются до тех пор, пока не будут расположены в новом положении областей захвата.

Предпочтительно этап с) повторяют в том же направлении вращения до тех пор, пока наночастицы, постепенно перемещаясь в том же направлении, не достигнут области восстановления.

Путем повторения этапа с) получают эффект "конвейерной ленты", когда наночастицы перемещаются в одном и том же направлении вдоль поверхности подложки для захвата к области восстановления. Поскольку захватываемая молекула образует комплекс с наночастицами, она также восстанавливается в этой области восстановления.

В конечном счете, с использованием настоящего изобретения можно регенерировать молекулу, подлежащую захвату, без подачи на подложку потока текучей среды, который может сместить все молекулы, содержащиеся в смеси.

Настоящее изобретение также относится к использованию набора, как определено выше, для захвата молекулы, содержавшейся в образце, предпочтительно для захвата и обнаружения молекулы, содержащейся в образце.

Изобретение также относится к использованию магнитного слоя для притяжения наночастиц, имеющих наибольший размер меньше 1 мкм, при этом указанный магнитный слой содержит контактный участок, возможно повторяющийся, по меньшей мере между первой и второй областями, причем первая область содержит магнитные зерна, поляризованные в первом направлении, а вторая область содержит магнитные зерна, которые неполяризованы или поляризованы во втором направлении, отличающемся от первого направления поляризации магнитных частиц первой области, так что указанный один магнитный слой генерирует магнитное поле, имеющее по меньшей мере одно изменение его магнитной индукции по меньшей мере на 0,1 мТл на расстоянии по меньшей мере 1 мкм от указанного по меньшей мере одного магнитного слоя, при этом указанное по меньшей мере одно изменение его магнитной индукции определяет максимум и минимум нормы указанной индукции магнитного поля с тем, чтобы определять при указанном максимуме нормы указанного магнитного поля область захвата магнитных наночастиц на указанном магнитном слое, и каждая из указанных наночастиц связана по меньшей мере с одним элементом захвата молекулы.

Также описан другой набор для захвата молекулы, содержащейся в образце, содержащий:

a) магнитные наночастицы, имеющие размер меньше чем 1 мкм в качестве наибольшего размера, причем каждая из указанных наночастиц связана по меньшей мере с одним элементом захвата, при этом указанный по меньшей мере один элемент захвата специфически связывается с указанной молекулой, и

b) подложку для захвата указанных магнитных наночастиц, содержащую по существу по меньшей мере один магнитный слой или состоящую по меньшей мере из одного магнитного слоя, при этом указанный магнитный слой содержит контактный участок, возможно повторяющийся, по меньшей мере между первой и второй областями, причем первая область содержит магнитные частицы, поляризованные в первом направлении, а вторая область содержит магнитные частицы, которые неполяризованы или поляризованы во втором направлении, отличающемся от первого направления поляризации магнитных частиц первой области, так что указанный по меньшей мере один магнитный слой генерирует магнитное поле, не показывающее по меньшей мере одно изменение его магнитной индукции по меньшей мере на 0,1 мТл на расстоянии по меньшей мере 1 мкм от указанного по меньшей мере одного магнитного слоя,

c) по меньшей мере один дополнительный источник магнитного поля, так что магнитное поле, генерируемое совокупностью указанного по меньшей мере одного магнитного слоя и указанного по меньшей мере одного дополнительного источника, показывает по меньшей мере одно изменение его магнитной индукции по меньшей мере на 0,1 мТл на расстоянии по меньшей мере 1 мкм от указанного по меньшей мере одного магнитного слоя,

при этом указанное по меньшей мере одно изменение его магнитной индукции определяет максимум и минимум нормы магнитной индукции указанного магнитного поля, чтобы определять при указанном максимуме нормы указанного магнитного поля область для захвата магнитных наночастиц на подложке для захвата.

Предпочтительно указанный дополнительный источник является внешним по отношению к указанному по меньшей мере одному магнитному слою.

К тому же, предпочтительно указанный по меньшей мере один магнитный слой имеет поверхность захвата, при этом указанный по меньшей мере один магнитный слой по меньшей мере частично покрыт на указанной поверхности захвата немагнитным слоем, а магнитное поле, генерируемое всеми из указанного по меньшей мере одного магнитного слоя и указанного по меньшей мере одного дополнительного источника, демонстрирует по меньшей мере одно изменение его магнитной индукции по меньшей мере на 0,1 мТл на расстоянии по меньшей мере 1 мкм от поверхности захвата указанного немагнитного слоя, причем указанное по меньшей мере одно изменение его магнитной индукции определяет максимум и минимум нормы магнитной индукции указанного магнитного поля, чтобы определять при указанном максимуме нормы указанного магнитного поля область для захвата магнитных наночастиц на подложке для захвата.

Все признаки, описанные выше, относящиеся к подложке для захвата, дополнительному источнику магнитного поля и наночастицам, относящимся к набору, описанному выше, применимы с соответствующими изменениями к этому набору.

Настоящее изобретение также относится к способу захвата молекулы, содержащейся в образце, включающему следующие этапы:

a) приведение указанного образца в контакт с магнитными наночастицами, как определено выше, с образованием по меньшей мере одного захватного комплекса между указанной молекулой и указанным по меньшей мере одним элементом захвата, связанным с указанными магнитными наночастицами;

b) притяжение указанного по меньшей мере одного захватного комплекса, образованного на этапе а), магнитным полем, генерируемым совокупностью по меньшей мере одного магнитного слоя подложки для захвата и по меньшей мере одного дополнительного источника магнитного поля, как определено выше, так что указанный по меньшей мере один захватный комплекс иммобилизирован на указанной подложке для захвата по меньшей мере в одной области захвата, как определено выше.

Настоящее изобретение также относится к использованию набора, как определено выше, для захвата молекулы, содержащейся в образце, предпочтительно для захвата и обнаружения молекулы, содержащейся в образце.

Наконец, настоящее изобретение относится к использованию совокупности, содержащей магнитный слой и дополнительный источник поля, для притяжения наночастиц, имеющих размер меньше 1 мкм в качестве наибольшего размера, при этом указанный магнитный слой содержит контактный участок, возможно повторяющийся, по меньшей мере между первой и второй областями, причем первая область содержит магнитные зерна, поляризованные в первом направлении, а вторая область содержит магнитные зерна, которые неполяризованы или поляризованы во втором направлении, отличающемся от первого направления поляризации магнитных частиц первой области, так что магнитное поле, генерируемое всеми из указанного одного магнитного слоя и указанного дополнительного источника, показывает по меньшей мере одно изменение его магнитной индукции по меньшей мере на 0,1 мТл на расстоянии по меньшей мере 1 мкм от указанного по меньшей мере одного магнитного слоя, при этом указанное по меньшей мере одно изменение его магнитной индукции определяет максимум и минимум нормы магнитной индукции указанного магнитного поля, чтобы определить при указанном максимуме нормы указанного магнитного поля область для захвата магнитных наночастиц на указанном магнитном слое.

Предпочтительно каждая из указанных наночастиц связана по меньшей мере с одним элементом захвата молекулы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На ФИГ. 1 показан захват наночастиц магнитным слоем согласно настоящему изобретению. Систему захвата показана в разрезе. Магнитная индукция магнитных полей, создаваемых магнитным слоем, определяется цветовым кодом, шкала которого представлена справа от вида в разрезе (в теслах). Стрелки в магнитном слое обозначают направление поляризации зерен, составляющих его.

На ФИГ. 2 представлена фотография захвата системой, показанной в на ФИГ. 1. На этой фотографии белыми точками обозначены наночастицы.

На ФИГ. 3 показан захват наночастиц магнитным слоем согласно настоящему изобретению, при этом указанный слой покрыт немагнитным слоем. Система захвата показана в разрезе. Магнитная индукция магнитных полей, генерируемых магнитным слоем, определена цветовым кодом, шкала которого представлена справа от вида в разрезе (в теслах). Стрелки от наночастиц представляют направление перемещения наночастиц, притягиваемых магнитным слоем. Стрелки в магнитном слое обозначают направление поляризации зерен, составляющих его.

На ФИГ. 4 представлена фотография захвата системой, показанной на ФИГ. 3. На этой фотографии белыми точками обозначены наночастицы.

На ФИГ. 5а показан захват наночастиц магнитным слоем согласно настоящему изобретению, при этом указанный слой покрыт немагнитным слоем, а захват осуществляется в присутствии магнитного поля от дополнительного источника. Система захвата показана на виде в разрезе. Направление магнитного поля, генерируемого дополнительным источником, обозначено белой стрелкой с черным контуром над видом в разрезе перпендикулярно магнитному слою. Магнитная индукция магнитных полей, генерируемых магнитным слоем, определена цветовым кодом, шкала которого представлена справа от вида в разрезе (в теслах). Стрелки от наночастиц представляют направление перемещения наночастиц, притягиваемых магнитным слоем. Стрелки в магнитном слое представляют направление поляризации зерен, составляющих его.

На ФИГ. 5b показан захват наночастиц магнитным слоем согласно настоящему изобретению, при этом указанный слой покрыт немагнитным слоем, а захват осуществляется в присутствии магнитного поля от дополнительного источника. Система захвата показана на виде в разрезе. Направление магнитного поля, генерируемого дополнительным источником, обозначено белой стрелкой с черным контуром над видов в разрезе параллельно магнитному слою. Магнитная индукция всех магнитных полей (генерируемых магнитным слоем и дополнительным источником) определена цветовым кодом, шкала которого представлена справа от вида в разрезе (в теслах). Стрелки от наночастиц представляют направление перемещения наночастиц, притягиваемых магнитным слоем. Стрелки в магнитном слое представляют направление поляризации зерен, составляющих его.

На ФИГ. 6 представлена фотография захвата системой, показанной на ФИГ. 5а. На этой фотографии белыми точками представлены наночастицы.

На ФИГ. 7 показано процентное выражение количества захваченных наночастиц (ось Y) в зависимости от времени (ось X) для каждого захвата из захватов, показанных на ФИГ. 1-3. Время выражено в минутах. Кривая А соответствует кинетике захвата, показанного на ФИГ. 5а, кривая В соответствует кинетике захвата, показанного на ФИГ. 1, и кривая С соответствует кинетике захвата, показанного на ФИГ. 3.

На ФИГ. 8 показаны иммобилизованные антитела антимышиного обнаружения, несущие флуорохром и связанные с комплексами наночастиц, привитыми иммобилизованными антителами мышиного овальбумина. Это также наночастица с привитым овальбумином.

На ФИГ. 9 представлен график, показывающий количество вычисленной флюоресценции (в произвольных единицах) в зависимости от концентрации антиовальбуминовых антител (мкг/мл).

На ФИГ. 10 представлены фотографии после захвата комплексов на ФИГ. 8. Каждая белая точка представляет флуорохром, переносимый иммобилизованным антителом (антимышиным) по ФИГ. 8. Для ФИГ. 10А использовалась концентрация мышиного антиовальбумина приблизительно 50 мкг/мл; для ФИГ. 10 В использовалась концентрация приблизительно 25 мкг/мл; для ФИГ. ЮС использовалась концентрация приблизительно 12,5 мкг/мл; для ФИГ. 10D использовалась концентрация приблизительно 6,25 мкг/мл; на ФИГ. 10Е представлен отрицательный контроль без использования антител мышиного овальбумина.

На ФИГ. 11 представлен график, показывающий калибровочную кривую граната DLGi5 в системе MOIF типа MagView CMOS. Этот график показывает вращение поляризации светового луча (в градусах), прошедшего через указанный гранат, в зависимости от индукции магнитного поля (в теслах).

На ФИГ. 12 представлены фотографии после захвата наночастиц в микрофлюидных камерах. Белыми точками представлены наночастицы. На ФИГ. 12А-12Е показана кинематика захвата (А: 0 секунд; В: 10 секунд; С: 30 секунд; D: 80 секунд и Е: 120 секунд).

На ФИГ. 13 представлены фотографии после захвата наночастиц в микрофлюидных камерах в присутствии дополнительного источника магнитного поля. Белыми точками представлены наночастицы. На ФИГ. 13A-13F показана кинематика захвата (А: 0 секунд; В: 2 секунды; С: 5 секунд; D: 12 секунд; Е: 34 секунды и F: 60 секунд).

На ФИГ. 14 показано выраженное в процентах количество захваченных наночастиц (ось Y) в зависимости от времени (ось X) для захвата, показанного на ФИГ. 12. Время выражено в секундах.

На ФИГ. 15 представлен график спектроскопического анализа, показывающий размер наночастиц в растворе. Размер определяли методом динамического светорассеяния. Ось Y представляет относительную частоту наночастиц в процентах, и ось X представляет логарифмическую шкалу, отображающую размер наночастиц в нанометрах.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Захват наночастиц магнитной лентой

Сначала был испытан захват наночастиц магнитной полосой магнитной карты.

Протокол эксперимента

Используемые наночастицы (Chemicell nanoscreenmag ARA 200 нм) имеют средний диаметр 200 нм, плотность 1,25 г/см³, намагниченность насыщения 420000 А/м, концентрацию по массе 25 мг/мл, длину волны эмиссии 476 нм и длину волны возбуждения 490 нм. Наночастицы разведены в ddH₂O до уровня 1,1×10^∧12 наночастиц/г и 4,4×10⁹ наночастиц/мл.

Для разрушения агрегатов наночастиц, которые могут присутствовать, раствор наночастиц, разведенных в деионизированной воде (ddH₂O), перемешивали с помощью ультразвукового устройства SONIC RUPTOR 4000. Прерывистая обработка ультразвуком производилась внутри пробирки при 20% от общей мощности 400 Вт и расчетной частоте около 20000 Гц. Всего было выпущено 3 ультразвуковых импульса продолжительностью 500 миллисекунд каждые 2 секунды.

Для проверки того, что наночастицы, подлежащие захвату, не находятся в форме кластеров наночастиц, был измерен размер наночастиц в растворе с помощью "дифракционного светорассеяния". Результаты представлены на рис. 15.

Подложкой для захвата являлись магнитная карта, состоящая из элемента подложки из ПРИВЕДЕННЫХ, и магнитная лента, состоящая из трех магнитных слоев, расположенных в одной плоскости и изготовленных из магнитных полимеров с высокой коэрцитивной силой. Элемент подложки и магнитные слои были собраны в соответствии со стандартом ISO 7811. Каждый магнитный слой кодировался последовательностью "1", соответствующей 182-кратной БУКВЕ F в шестнадцатеричном формате с использованием кодировщика MSR605, который позволяет изменять ориентацию магнитного поля на 180 градусов примерно каждые 55 мкм.

Захват наночастиц выполняли путем нанесения 5 мкл раствора наночастиц и нанесения капли на магнитные слои магнитной карты.

Схема этого захвата показана на ФИГ. 1. На этом чертеже наночастицы 1 находятся в растворе, а некоторые 1' притягиваются магнитным слоем 3 магнитной полосы (обозначены черными стрелками). Магнитный слой имеет первые 5 и вторые 7 областей с обратной поляризацией зерен (обозначены большими белыми стрелками). Магнитное поле, генерируемое каждой из областей, представлено маленькими белыми стрелками, которые следуют за дугами, начинающимися на одной стороне области и заканчивающимися на другой стороне. Направление этих стрелок указывает направление генерируемого магнитного поля. Магнитная индукция поля представлена цветовой шкалой. Эта индукция магнитного поля была получена с помощью метода конечных элементов, выполненного с использованием программного обеспечения для моделирования COMSOL Multiphasics® 5.0, как описано выше. Белый цвет указывает на сильную индукцию магнитного поля. Над магнитным слоем 3 видна индукция магнитного поля, генерируемого первой и второй областями (5, 7), каждая из которых имеет ширину около 100 мкм, при этом поле демонстрирует вариации. Присутствие максимумов индукции магнитного поля 9 хорошо видно над переходами между первой областью 5 и второй областью 7, а также более низкую индукцию магнитного поля в каждой области (5, 7) непосредственно. Таким образом, при каждом максимуме нормы магнитного поля 9 ортогональной проекцией на поверхность магнитного слоя 3 определяется область 11 захвата, в которой наночастицы 1' будут иммобилизованы.

Затем получают изображения с помощью флуоресцентного микроскопа (Olympus ВХ41М), оснащенного кубом "GFP" (с возбуждением 460 нм и эмиссией 490 нм), соединенного с ПЗС-камерой (монохромной цифровой камерой Diagnostic Instruments SPOT RT). Используется источник синего возбуждающего света (460-490 нм). Изображения записываются с общим увеличением 50х и временем захвата 3 секунды (усиление 14 дБ). Пример захвата изображения можно видеть на ФИГ. 2. На этом чертеже белыми точками представлены наночастицы. Отчетливо видна упорядоченность захваченных наночастиц.

Процент наночастиц, захваченных магнитной полосой, определяли количественно, следуя протоколу, описанному в публикации Fratzl et al., Soft Matter (14) 2671-2680 (2018). Вкратце, эта количественная оценка получается отношением площади, покрытой наночастицами, к площади, не покрытой наночастицами.

Результаты кинетики захвата показаны на ФИГ. 7 и представлены кривой В.

Результаты

Как может быть видно на ФИГ. 7, захват магнитных наночастиц инициируется немедленно после нанесения капли на магнитную подложку и достигает 40% через 2 минуты.

Кроме того, результаты, показанные на ФИГ. 15, показывают один пик с взвешенными бусинами, имеющими средний диаметр 282 нм (стандартное отклонение 9,5 нм), что соответствует диаметру одиночной наночастицы. Эти результаты демонстрируют, что наночастицы независимы друг от друга и не образуют кластеров.

Пример 2: Захват наночастиц магнитной полосой, покрытой немагнитным слоем

В этом примере проверяется захват наночастиц магнитной полосой магнитной карты, покрытой немагнитным слоем.

Протокол эксперимента

Используемые наночастицы и подложка для захвата такие же, как в примере 1, за исключением того, что магнитная полоса покрыта самоклеящимся слоем черного полимера (винила) толщиной 60 мкм.

Способ захвата наночастиц, а также определение процента захваченных наночастиц такие же, как в примере 1.

Схема этого захвата показана на ФИГ. 3. Этот чертеж включает в себя элементы, показанные на ФИГ. 1. Кроме того, на поверхности магнитного слоя 3 расположен немагнитный слой 13. Как показано на ФИГ. 3, только часть магнитных полей, генерируемых магнитным слоем 3, выступает на поверхность немагнитного слоя 13, так что максимумы нормы магнитного поля "скрыты" немагнитным слоем. Следовательно, нет никакого изменения магнитной индукции указанного магнитного поля по меньшей мере на 0,1 мТл на расстоянии по меньшей мере 1 мкм от поверхности подложки для захвата и, следовательно, нет никаких областей захвата. Поэтому наночастицы очень слабо притягиваются, случайным образом иммобилизуются на магнитной полосе и преимущественно остаются в растворе.

Фотография полученного результата захвата показана на ФИГ. 4, где белыми точками представлены наночастицы. Упорядочение, видимое на ФИГ. 2, на этом чертеже отсутствует.

Результаты кинетики захвата показаны на ФИГ. 7 и представлены кривой С.

Результаты

Как может быть видно ФИГ. 7, наночастицы очень медленно захватываются магнитной полосой магнитной карты. Через 10 минут захват достигает всего 15%.

Пример 3: Захват наночастиц магнитной полосой, покрытой немагнитным слоем, при наличии дополнительного источника магнитного поля

В этом примере проверяется захват наночастиц магнитной полосой магнитной карты, покрытой немагнитным слоем, при наличии дополнительного источника магнитного поля.

Протокол эксперимента

Используемые наночастицы и подложка для захвата такие же, как в примере 2.

Дополнительным источником магнитного поля является совокупность типа "голова-хвост" (вертикальная/горизонтальная намагниченность) из макромагнитов NdFeB (N35, сила сцепления 800 г) параллелепипедальной формы (размером 20×10×1 мм), намагниченных вдоль оси, размер которой 1 мм.

Магнитная карта нанесена на дополнительный источник магнитного поля таким образом, что магнитные слои не расположены напротив указанного источника.

Способ захвата наночастиц, а также определение процента захваченных наночастиц такие же, как в примере 1.

Схема такого захвата показана на ФИГ. 5а и 5b. На ФИГ. 5а дополнительный источник магнитного поля (не показан) излучает магнитное поле с направлением, перпендикулярным магнитному слою 3, представленному белой стрелкой с черным контуром. На ФИГ. 5b дополнительный источник магнитного поля (не показан) излучает магнитное поле с направлением, параллельным магнитному слою 3, представленному белой стрелкой с черным контуром. Эти два изображения позволяют видеть влияние направления магнитного поля, генерируемого дополнительным источником поля, на положение областей захвата.

На этих изображениях показаны элементы, представленные на ФИГ. 1 и 3. Эти изображения ясно показывают, с одной стороны, что индукция магнитного поля, генерируемого на поверхности немагнитного слоя 13, намного сильнее, и что максимумы нормы индукции магнитного поля 9 больше не скрыты немагнитным слоем 13. Кроме того, присутствует только каждый другой максимум нормы индукции магнитного поля 9 по сравнению с первоначально показанными на ФИГ. 1, и, следовательно, присутствует любая другая область 11 захвата. Однако эти максимумы 9 имеют магнитную индукцию, которая больше, чем у первоначально показанных на ФИГ. 1.

На ФИГ. 5а при дополнительном магнитном поле, перпендикулярном магнитному слою 3, области 11 захвата лежат над переходами, в направлении к которым ориентирована поляризация смежных областей (5, 7). Однако норма поля минимизирована над переходами, в направлении от которых ориентирована поляризация смежных областей.

Интересно отметить на ФИГ. 5b, что при дополнительном магнитном поле с направлением, параллельным магнитному слою 3, области 11 захвата и максимумы нормы индукции магнитного поля 9 смещены и расположенный не в переходах между первой и второй областями (5, 7), а непосредственно в первых областях 5.

Фотография полученного результата захвата показана на ФИГ. 6, на котором белыми точками представлены наночастицы. В отличие от ФИГ. 4, на котором упорядочение захвата отсутствовало, на ФИГ. 6 появляется новое упорядочение, отличающееся от полученного на ФИГ. 2. В данном случае наночастицы образуют регулярно расположенные параллельные полосы, и можно видеть, что небольшое количество наночастиц присутствуют за пределами этих полос.

Результаты кинетики захвата показаны на ФИГ. 7 и представлены кривой А.

Результаты

В этом примере захват магнитных наночастиц инициируется непосредственно после приложения внешнего поля. Захват близок к 100% через 2 минуты.

Сочетая настоящий результат с результатом примера 2, можно сделать вывод о том, что можно инициировать иммобилизацию и очень быстрый захват (2 минуты) наночастиц, когда магнитная полоса покрыта немагнитным слоем, инициируя магнитное поле дополнительного источника.

Пример 4: Захват и количественный анализ элемента захвата, связанного с наночастицами

Наконец, были протестированы обнаружение и количественный анализ нескольких концентраций антител мышиного овальбумина (элемента захвата), связанных с магнитными наночастицами.

Каждое измерение выполняли, удерживая количество антител обнаружения (антимышиных антител) и общее количество наночастиц одинаковыми, но изменяя количество наночастиц, связанных с антителами мышиного овальбумина (путем добавления наночастиц, связанных с овальбумином).

Протокол эксперимента

Используемые наночастицы (Carboxyl Adembeads 200 нм (ref. 02120 - Ademtech)) имеют диаметр 200 нм, приблизительную плотность 2,0 г/см³, приблизительную намагниченность насыщения 40 эме/г, приблизительное содержание оксида железа 70% и содержание твердых веществ 30 мг/мл (3%). Наночастицы покрыты карбоксильными группами СООН с плотностью более 350 мкмоль/г.

Подложкой для захвата является магнитная карта, состоящая из элемента подложки ПХВ, на который опираются три магнитных слоя, расположенных в одной плоскости и состоящих из магнитных полимеров с высокой коэрцитивной силой. Элемент подложки и магнитные слои были собраны в соответствии со стандартом ISO 7811. Каждый магнитный слой кодировали последовательностью 1 с посредством энкодера MSR605, как показано в примере 1.

Источником дополнительного магнитного поля является совокупность типа "голова-хвост" макромагнитов NdFeB (N35, сила сцепления 800 г) параллелепипедальной формы (размером 20×10×1 мм), намагниченных вдоль оси, совпадающей со стороной 1 мм.

Элементом захвата является антитело антиовальбумина (IgG), продуцируемое мышами. Эти антитела привиты к наночастицам в конечной концентрации в диапазоне от 10 мкг/мл до 50 мкг/мл.

Прививку наночастиц в конечной концентрации 10 мкг/мл проводят по следующему протоколу:

• активация 90 мкг наночастиц (т.е. 3 мкл исходного раствора наночастиц Ademtech 30 мг/мл) с 25 мкл раствора, содержащего EDC (10 мг/мл) и NHS (10 мг/мл);

• инкубация в течение 15 минут при комнатной температуре с перемешиванием;

• удаление супернатанта путем захвата наночастиц с использованием сантиметрового магнита. Этот сантиметровый магнит представляет собой никелированный неодимовый магнитный цилиндр диаметром 10 мм и высотой 40 мм;

• добавление раствора 25 мкл антитела антимышиного овальбумина в концентрации 1 мг/мл (т.е. 25 мкг);

• инкубация 2 часа при комнатной температуре с перемешиванием;

• удаление супернатанта путем захвата наночастиц с использованием сантиметрового магнита, как указано выше; и

• суспендирование наночастиц в растворе 50 мкл PBS-Tween 0,05% - BSA (1 мг/мл). Наночастицы, функционализированные антителом антиовальбумина, получены при потенциальной концентрации 500 мкг/мл.

Другая часть наночастиц привита овальбумином (OVA). Прививку проводят по тому же протоколу, что описан выше, с тем различием, что вместо раствора 25 мкл антиовальбуминового антитела добавляют 25 мкл OVA в концентрации 1 мг/мл (т.е. 25 мкг).

Элементом обнаружения является антитело, направленное специфически против мышиных антител (следовательно, против антитела антиовальбумина) и связанное с флуорохромом Alexa 488 (максимальное возбуждение=490 нм; максимальное излучение=525 нм) для обнаружения.

На ФИГ. 8 показаны антимышиные антитела 15, несущие флуорохром 17 и связанные с комплексами 19 наночастиц, привитыми антиовальбуминовыми антителами 21. Также показана наночастица 19, привитая OVA 23, используемая для тестирования специфичности взаимодействия между антителами.

Обнаружение и количественный анализ антител к мышиному овальбумину антител к мышиному овальбумину выполняют в соответствии со следующим протоколом:

• в пробирке на 0,5 мл: смесь 4,5 мкг наночастиц, предварительно привитых антиовальбуминовыми антителами и/или OVA); 2 мкл антимышиного обнаруживающего антитела (для конечной концентрации 1 мкг/мл); и 20 мкл PBS;

• инкубация в течение 15 минут при температуре окружающей среды в пробирке на 0,5 мл;

• удаление 5 мкл раствора и нанесение капли на магнитные слои магнитной карты; и

• размещение магнитной карты на дополнительном источнике магнитного поля таким образом, что элемент подложки ПВХ расположен между магнитными слоями и дополнительным источником магнитного поля.

Соблюдаются пять различных условий:

1) 4,5 мкг наночастиц с привитыми антителами против мышиного овальбумина (т.е. приблизительная концентрация антител против овальбумина 50 мкг/мл);

2) 2,25 мкг наночастиц с привитыми антителами антимышиного овальбумина и 2,25 мкг наночастиц с привитым овальбумином (т.е. приблизительная концентрация антител против овальбумина 25 мкг/мл);

3) 1,125 мкг наночастиц с привитыми антителами антимышиного овальбумина и 2,25 мкг наночастиц с привитым овальбумином (т.е. приблизительная концентрация антител против овальбумина 12,5 мкг/мл);

4) 0,625 мкг наночастиц с привитыми антителами антимышиного овальбумина и 2,25 мкг наночастиц с привитым овальбумином (т.е. приблизительная концентрация антител против овальбумина 6,25 мкг/мл);

5) 4,5 мкг наночастиц, привитых к овальбумину (т.е. нулевая концентрация антител против овальбумина);

Затем делают снимки магнитных слоев магнитной карты с помощью флуоресцентного микроскопа (Olympus ВХ41М), оснащенного кубом "GFP" (возбуждение 460-490 нм), соединенного с ПЗС-камерой (монохромной цифровой камерой Diagnostic Instruments SPOT RT). Используется источник синего возбуждающего света (460-490 нм). Изображения записываются с общим увеличением 50× и временем захвата 5 секунд (усиление 1).

На ФИГ. 10 показаны изображения, полученные после захвата. Отчетливо видно, что наночастицы, связанные с мышиным антителом, которое, в свою очередь, связано с антимышиным антителом, захватываются вдоль областей захвата в виде полос.ФИГ. 10А-10Е соответственно соответствуют условиям 1)-5), как описано выше. Количество обнаруженного антимышиного антитела является дегрессивным для изображений с условиями 1)-5), что согласуется с количеством антиовальбуминового антитела, используемого в каждом условии. Изображение для условия 5 является отрицательным контролем, поскольку иммобилизованные антитела отсутствуют. Эти результаты также согласуются с полученными на ФИГ. 9.

Флуоресцентный сигнал количественно определяют путем вычисления соответствующих площадей, соответствующих пикам флуоресценции в областях захвата, из которых вычитают общий "фоновый сигнал", измеренный между областями захвата. Фактически, в отличие от примеров 1-3, где наночастицы были флуоресцентными, в данном случае вся обнаруженная флюоресценция соответствует не только захваченным молекулам (антителам против овальбумина в данном случае), но также и элементам обнаружения, которые оставались в растворе. Затем необходимо вычесть флуоресценцию, испускаемую этими "свободными" элементами обнаружения, из флуоресценции, излучаемой элементами обнаружения, связанными с захваченной молекулой.

В примере захвата, показанного на ФИГ. 10, суммарная флуоресценция площадей областей захвата измеряется в виде флуоресцентных полос, из которых вычитают флюоресценцию, измеренную между этими областями.

Количественное определение флуоресценции получают в условных единицах (AU).

Полученные результаты представлены на ФИГ. 9.

Результаты

Как показано на ФИГ. 9, количественная оценка флуоресценции полученных областей захвата пропорциональна концентрации антител антиовальбумина, которые были добавлены к смеси (R²=0.97).

На основании используемого метода количественной оценки сигнала флуоресценции (специфического сигнала в областях захвата и неспецифического сигнала за пределами указанных областей) эти результаты позволяют заключить, что наночастицы, связанные с элементом обнаружения, действительно захвачены в областях захвата.

Однако эти результаты позволяют сделать вывод о возможности определения количества молекул, захваченных без этапа промывки между иммобилизацией наночастиц и обнаружением элемента обнаружения.

Пример 5: Захват наночастиц микрофлюидными камерами

Используемые наночастицы являются такими же, как в Примере 1, и были разбавлены в 500 раз деионизированной водой (ddH₂O) до достижения концентрации 50 мкг/мл.

Также выполнен этап обработки ультразвуком.

Подложка для захвата содержит 18 микрофлюидных камер, каждая из которых имеет независимый вход и вентиляционное отверстие на выходе. Каждая микрофлюидная камера имеет длину 6 мм, ширину 2,4 мм и глубину 240 мкм. Камеры выровнены относительно друг друга с шагом 4,5 мм, так что образуют стержень. Микрофлюидные камеры приклеены к магнитному слою, который, в свою очередь, приклеен к элементу подложки из ПВХ. Элемент подложки и магнитный слой собраны в соответствии со стандартом ISO 7811. Магнитный слой закодирован последовательностью "1", соответствующей 182-кратному увеличению БУКВЫ F в шестнадцатеричном формате с использованием энкодера MSR605, что позволяет изменять ориентацию магнитного поля на 180 градусов приблизительно через каждые 55 мкм.

В каждую из этих микрофлюидных камер ввели 6 микролитров раствора наночастиц. Камеры заполнялись одна за другой. После каждого заполнения захват визуализировали с помощью эпифлуоресцентного микроскопа, имеющего объектив с 10-кратным увеличением. Фильм был снят с частотой 1,12 кадра в секунду. Изображения, полученные в моменты времени 0, 10, 30, 80 и 120 секунд записи, показаны на ФИГ. 12.

Результаты

Несмотря на значительную глубину микрофлюидных камер, приближающиеся 300 мкм, на ФИГ. 12 видно, что наночастицы хорошо захватываются на дне микрофлюидных камер (наборы выровненных белых точек) от 10 секунд захвата.

Пример 6: Захват наночастиц микрофлюидными камерами в присутствии дополнительного источника магнитного поля

Наночастицы и используемая подложка для захвата такие же, как в Примере 5.

Кроме того, подложка для захвата основана на совокупности типа "голова-хвост" (вертикальная намагниченность) из 20 макромагнитов NdFeB (Supermagnete, артикул Q-10-04-02-N), имеющих параллелепипедальную форму (с размерами 10×4×2 мм), намагниченных вдоль оси, совпадающей со стороной 2 мм, и имеющих энергетическое произведение 50 мегагаусс-эрстед. Эти 20 магнитов расположены рядом друг с другом с шагом 0,5 мм вдоль оси, совпадающей со стороной 4 мм, образуя стержень. 18 из указанных 20 магнитов размещены под каждой из 18 микрофлюидных камер, и 2 магнита размещены с каждой стороны.

В каждую из этих микрофлюидных камер были введены 6 микролитров раствора наночастиц. Камеры заполнялись одна за другой. После каждого заполнения захват визуализировали с помощью эпифлуоресцентного микроскопа, имеющего объектив с 10-кратным увеличением. Пленка создавалась с захватом изображения со скоростью 1,12 кадра в секунду. Изображения, полученные в моменты времени 0, 2, 5, 12, 34 и 60 секунд, показаны на ФИГ. 13.

Процент наночастиц, захваченных микрофлюидными камерами, определен количественно в соответствии с протоколом, описанным в публикации Fratzl et al., Soft Matter (14) 2671-2680 (2018). Кинетику захвата регистрировали трижды тремя различными камерами. Результаты кинетики захвата показаны на ФИГ. 14.

Результаты

Как и в примере 5, наночастицы хорошо захватываются на дне микрофлюидных камер. По аналогии с Примерами 1 и 3, захват наночастиц в данном случае происходит намного быстрее, чем в Примере 5, без внешнего источника магнитного поля. Кроме того, как может быть видно на ФИГ. 13, все остальные области захвата, показанные на ФИГ. 12, исчезли (разделяющее расстояние между каждой линией точек на ФИГ. 13 удвоилось) из-за внешнего магнитного поля, генерируемого совокупностью макромагнитов.

Данные кинетики захвата, представленные на ФИГ. 14, показывают, что захват наночастиц завершается через 15 секунд.

Изобретение относится к набору и способу для захвата молекулы, содержащейся в образце, посредством по меньшей мере одного магнитного слоя. Набор для захвата молекулы, содержащейся в образце содержит a) магнитные наночастицы, имеющие наибольший размер меньше чем 1 мкм, причем каждая из указанных наночастиц связана по меньшей мере с одним элементом захвата, при этом указанный по меньшей мере один элемент захвата специфически связывается с указанной молекулой, и b) подложку для захвата указанных магнитных наночастиц, содержащую по существу по меньшей мере один магнитный слой или состоящую из него, при этом указанный магнитный слой содержит контактный участок, при необходимости повторяющийся, по меньшей мере между первой и второй областями, причем первая область содержит магнитные частицы, поляризованные в первом направлении, а вторая область содержит магнитные частицы, которые неполяризованы или поляризованы во втором направлении, отличающемся от первого направления поляризации магнитных частиц первой области, так что указанный по меньшей мере один магнитный слой генерирует магнитное поле, имеющее по меньшей мере одно изменение магнитной индукции по меньшей мере на 0,1 мТл на расстоянии по меньшей мере 1 мкм от указанного по меньшей мере одного магнитного слоя, при этом указанное по меньшей мере одно изменение магнитной индукции определяет максимум и минимум нормы магнитной индукции указанного магнитного поля, чтобы определять при указанном максимуме нормы указанного магнитного поля область для захвата магнитных наночастиц на подложке для захвата, при этом указанный по меньшей мере один магнитный слой имеет удерживающую способность в диапазоне от 2000 мкм⋅Гаусс до 30000 мкм⋅Гаусс. Техническим результатом является создание набора и способа захвата молекулы, содержащейся в образце простых в производстве и промышленном внедрении. 3 н. и 6 з.п. ф-лы, 15 ил.

1. Набор для захвата молекулы, содержащейся в образце, содержащий:

a) магнитные наночастицы, имеющие наибольший размер меньше чем 1 мкм, причем каждая из указанных наночастиц связана по меньшей мере с одним элементом захвата, при этом указанный по меньшей мере один элемент захвата специфически связывается с указанной молекулой, и

b) подложку для захвата указанных магнитных наночастиц, содержащую по существу по меньшей мере один магнитный слой или состоящую из него, при этом указанный магнитный слой содержит контактный участок, при необходимости повторяющийся, по меньшей мере между первой и второй областями, причем первая область содержит магнитные частицы, поляризованные в первом направлении, а вторая область содержит магнитные частицы, которые неполяризованы или поляризованы во втором направлении, отличающемся от первого направления поляризации магнитных частиц первой области, так что указанный по меньшей мере один магнитный слой генерирует магнитное поле, имеющее по меньшей мере одно изменение магнитной индукции по меньшей мере на 0,1 мТл на расстоянии по меньшей мере 1 мкм от указанного по меньшей мере одного магнитного слоя, при этом указанное по меньшей мере одно изменение магнитной индукции определяет максимум и минимум нормы магнитной индукции указанного магнитного поля, чтобы определять при указанном максимуме нормы указанного магнитного поля область для захвата магнитных наночастиц на подложке для захвата,

при этом указанный по меньшей мере один магнитный слой имеет удерживающую способность в диапазоне от 2000 мкм⋅Гаусс до 30000 мкм⋅Гаусс.

2. Набор по п. 1, дополнительно содержащий по меньшей мере один дополнительный источник магнитного поля.

3. Набор по любому из пп. 1, 2, в котором указанный по меньшей мере один магнитный слой имеет поверхность захвата, при этом указанный по меньшей мере один магнитный слой по меньшей мере частично покрыт на указанной поверхности захвата немагнитным слоем.

4. Набор по п. 3, в котором указанный немагнитный слой имеет толщину в диапазоне от 1 мкм до 300 мкм.

5. Способ захвата молекулы, содержащейся в образце, причем указанный способ включает следующие этапы:

a) приведение указанного образца в контакт с магнитными наночастицами по п. 1 с образованием по меньшей мере одного захватного комплекса между указанной молекулой и указанным по меньшей мере одним элементом захвата, связанным с указанными магнитными наночастицами;

b) притяжение указанного по меньшей мере одного захватного комплекса, образованного на этапе а), магнитным полем, генерируемым по меньшей мере одним магнитным слоем подложки для захвата по любому из пп. 1-4, так что указанный по меньшей мере один захватный комплекс иммобилизирован на указанной подложке для захвата в указанной по меньшей мере одной области захвата по п. 1.

6. Способ по п. 5, согласно которому притяжение указанного по меньшей мере одного захватного комплекса на этапе b) осуществляют совместным действием магнитного поля, генерируемого указанным по меньшей мере одним магнитным слоем, и магнитного поля, генерируемого по меньшей мере одним дополнительным источником магнитного поля по п. 2.

7. Способ по п. 6, согласно которому подложка для захвата дополнительно содержит немагнитный слой по п. 4, при этом притяжение указанного по меньшей мере одного захватного комплекса подложкой для захвата на этапе b) инициируют посредством магнитного поля указанного по меньшей мере одного дополнительного источника магнитного поля.

8. Способ по п. 7, согласно которому образец размещают на подложке для захвата перед этапом а) приведения в контакт с магнитными наночастицами.

9. Использование набора по любому из пп. 1-4 для захвата молекулы, содержащейся в образце, предпочтительно для захвата и обнаружения молекулы, содержащейся в образце.