КОМПЛЕКСНОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЗАЩИТЫ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ Российский патент 2024 года по МПК C12N1/00 

Изобретение относится к средствам биологической защиты сельскохозяйственных растений на основе конидий энтомопатогенного гриба Beauveria bassiana, в качестве вторичных метаболитов микроорганизмов содержит авермектины, может быть использовано для борьбы с комплексом членистоногих - вредителей сельскохозяйственных растений.

Известно изобретение «Композиция и способы для борьбы с вредителями» (патент RU2549761, A01N43/78 (2006.01), опубл. 27.04.2015 г.). Изобретение относится к сельскому хозяйству. Средство для обработки семян содержит в качестве активных ингредиентов этабоксам и авермектин при отношении массы этабоксама к массе авермектина в диапазоне от 1:0,01 до 1:50. Семя растения обрабатывают эффективными количествами этабоксама и авермектина. Для борьбы с корневой гнилью наносят эффективные количества этабоксама и авермектина на семя, на растение или на почву для выращивания растения. Изобретение позволяет повысить эффективность обработки. 4 н.п.ф-лы, 2 табл., 22 пр.

Известно изобретение «Энтомопатогенные продукты, Metarhizium anisopliae или Metarhizium robertsii» (патент WO2017200563, A01N63/04 2006.1, опубл 23.11.2017 г.). В патенте описаны энтомопатогенные штаммы грибов, составы, а также методы и составы выделения и использования штаммов для снижения общего повреждения насекомыми. Раскрывается способ получения энтомопатического продукта, содержащего энтомопатогенные штаммы грибов, отобранные из группы, состоящей из Metarhizium anisopliae 15013-1 (NRRL 67073), Metarhizium robertsii 23013-3 (NRRL 67075), Metarhizium anisopliae 3213-1 (NRRL 67074) или любых их комбинаций.

Известно изобретение «Способ улучшения роста, спорообразующей способности и токсичности грибов для биоконтроля насекомых» (патент CN113956986, С12 N 1/15, опубл. 21.01.2022 г.). Изобретение относится к гену, повышающему токсичность или эффект биоконтроля грибов боверия (Beauveria) и метаризиум (Metarhizium), вектор экспрессии, штамм гриба, полученный с помощью гена и вектора экспрессии, и грибной инсектицид, содержащий штамм гриба в качестве активного компонента.

Промышленные штаммы Beauveria bassiana, Metarhizium robertsii и Metarhizium acridum, а также промышленные штаммы с избыточной экспрессией гомологичных генов MrEng1 и MaEng1 Metarhizium robertsii и Metarhizium acridum получают путем гиперэкспрессии BbEng1, кодируемого геном бета-глюканазы Beauveria bassiana. Промышленные штаммы Beauveria bassiana, Metarhizium robertii и Metarhizium acridum обладают функциями стимулирования роста и улучшения спорообразующей способности и токсичности.

Известно изобретение «Масляно - водная композиция авермектинов» (патент WO013798, A01N 43/90 (2006.01), опубл. 30.06.2010 г.). Изобретение относится к композициям масляно-водных эмульсий (EW) авермектинов на основе сложных эфиров жирных кислот в качестве растворителя и к применению таких композиций для борьбы с вредителями и защиты урожая против таких вредителей.

Известно изобретение «Авермектинсодержащий инсектицидный препарат с повышенным контактным эффектом» (патент RU2156064, A01N 63/00, опубл. 20.09.1996 г.). Изобретение относится к средствам защиты сельскохозяйственных культур и предназначено для борьбы с комплексом членистоногих вредителей растений. Предложенный инсектицидный препарат в качестве антипаразитарного средства содержит авермектиновый комплекс.

Техническим результатом заявляемого изобретения является разработка композитного, комплексного биологического средства защиты растений от членистоногих-вредителей на основе энтомопатогенных грибов и вторичных метаболитов, обладающего инсектоакарицидным действием.

Указанный технический результат достигается созданием средства для биологической защиты сельскохозяйственных растений, характеризующегося тем, что оно содержит суспензию конидий энтомопатогенного гриба Beauveria bassiana, в качестве вторичных метаболитов микроорганизмов содержит абамектин, состоящий из суммы авермектинов B1a и B1b, где доля B1a составляет>90% и характеризующийся наибольшей инсектоакарицидной активностью по сравнению с остальными авермектинами. Авермектины представляют собой группу макроциклических лактонов, продуцентом которых является бактерия (актиномицет) Streptomyces avermitilis. S. avermitilis синтезирует восемь близких по химической структуре вторичных метаболитов (авермектинов) представляющих собой четыре пары гомологов, названных А1, А2, В1 и В2. Четыре из них с индексом «а» являются мажорными, четыре с индексом «b» - минорными метаболитами. Мишенью для авермектинов являются ГАМК-рецепторы периферической нервной системы беспозвоночных. Наибольшую инсектоакарицидную активность показали авермектины В1.

Заявленное комплексное средство содержит водную суспензию конидий энтомопатогенного гриба Beauveria bassiana в количестве от 1х10⁷ до 1х10⁸ конидий/мл, в качестве вторичных метаболитов микроорганизмов авермектины в количестве 0,05 - 5 мкг/мл, неионогенное поверхностно-активное вещество, например, Полисорбат-80 в количестве 0,3 мг/мл, диметилсульфоксид в качестве растворителя и стабилизатора для авермектинов в количестве 0,01-1 мг/мл.

Использование высоковирулентных штаммов энтомопатогенных грибов и/или бактерий в сочетании с вторичными метаболитами микроорганизмов позволяет создать линейку инновационных комплексных биологических средств защиты растений от насекомых-вредителей сельского хозяйства и повысить эффективность применения биопрепаратов, что крайне важно для расширения возможностей получения органической сельхозпродукции.

Примеры реализации изобретения.

Пример 1. Биологическая эффективность комплексного средства на основе энтомопатогенного гриба Beauveria bassiana и абамектина против обыкновенного паутинного клеща Tetranichus urticae.

Лабораторная популяция паутинного клеща Tetranychus urticae поддерживается круглогодично на растениях фасоли при световом режиме день: ночь 16:8, при постоянных условиях температуры+24±1°С.

Лабораторную оценку биологической эффективности против обыкновенного паутинного клеща проводили чашечным методом. На дно стеклянной чашки Петри диаметром 9 см, помещали фильтр, смоченный водой для поддержания влажности воздуха. За сутки до эксперимента на чистые растения укладывали листья с паутинным клещом для его перехода. На следующий день листья заселенные клещом срезали и подсчитывали количество перешедших особей. На фильтр помещали лист фасоли с находящимися на них имаго и подвижными нимфами обыкновенного паутинного клеща. Обработку препаратом проводили ручным опрыскивателем для равномерного распределения суспензии по поверхности листа. В контрольном варианте листья обрабатывали водой с 0,03% (0,3 мг/мл) неионогенного ПАВ Полисорбат-80. Чашки Петри с опытными клещами содержали при постоянной температуре+24±1°С. Каждый вариант опыта состоял из 4-5 повторностей. Учеты живых особей клеща проводили до обработки, а также через 2,3,5,7 суток после опрыскивания. Для корректного сравнения результатов по численности клещей количество особей вредителя переводили в проценты, первоначальное количество брали за 100%. В опытах использовали водную суспензию с концентрацией абамектина 0,05 мкг/мл, энтомопатогенного гриба Beauveria bassiana 1х10⁷ конидий/мл, Полисорбата-80 0,3 мг/мл, диметилсульфоксида 10 мкг/мл. Полученные результаты отражены в таблице 1.

Таблица 1. Биологическая эффективность против обыкновенного паутинного клеща Tetranichus urticae.

Варианты опыта Численность паутинного клеща (экз. на лист) Исходная численность Средняя эффективность по дням учета, (% гибели) 2 сутки 3 5 7 Контроль 29±7 3 9 12 18 B. bassiana 1х10⁷ кон/мл 37±13 21 36 82 83 Абамектин, 0,05 мкг/мл 31±14 85 92 90 100 Микс (B. bassiana+абамектин) 29±6 93 99 100 100

Полученные результаты показывают очень высокую эффективность комплексного средства в качестве акарицида против паутинного клеща. Результат близкий к 100% был получен уже на 3 сутки.

Пример 2. Биологическая эффективность комплексного средства на основе энтомопатогенного гриба Beauveria bassiana и абамектина против гусениц капустной совки Mamestra brassicae.

Лабораторная популяция капустной совки была получена из яиц, собранных в природе на капусте белокочанной Brassica oleracea на приусадебных участках города Новосибирска. Вышедших из яиц гусениц содержали на листьях белокочанной капусты при температуре 23°C и фотопериоде 18 часов свет: 6 ч темнота. Вылетевших имаго содержали на медовом сиропе 12% в отдельных емкостях объемом 0,5 л для спаривания и получения яиц. В экспериментах использовали гусениц 3-4 возраста.

Лабораторную оценку биологической эффективности проводили следующим образом. Поверхность капустных листьев площадью 16 кв. см обрабатывали погружением на 30 секунд в водную суспензию, содержащую либо абамектин с концентрацией 1,25 мкг/мл, либо конидии энтомопатогенного гриба Beauveria bassiana с концентрацией 1х10⁸ конидий/мл, либо микс из абамектина и конидий гриба с вышеуказанными концентрациями. Суспензия содержала 0,3 мг/мл неионогенного ПАВ Полисорбата-80 и 250 мкг/мл диметилсульфоксида. После 20 минутного подсушивания при комнатной температуре листья помещали в контейнеры к гусеницам (1 повторность=10 гусениц). Гусениц содержали при постоянной температуре 28°C. Замену корма необработанным проводили ежедневно. Период наблюдения и учет выживаемости личинок составил 10 суток. В каждом варианте было использовано 30 особей. Полученные результаты отражены в таблице 2.

Таблица 2. Биологическая эффективность против гусениц капустной совки Mamestra brassicae.

Варианты опыта Численность гусениц в опыте Исходная численность Эффективность по дням учета, (% гибели) 2 сутки 5 7 10 Контроль 30 2 4 6 8 B. bassiana 1х10⁸ кон/мл 30 6 30 40 57 Абамектин, 1,25 мкг/мл 30 3 6 10 29 Микс (B. bassiana+абамектин) 30 16 37 67 73

Грибная инфекция привела к выживаемости 45% особей на 10-ые сутки эксперимента. Летальное время LT₇₅ составило 4±1,04 суток. Выживаемость гусениц после обработки абамектином составила 71%. Значительно более низкая выживаемость гусениц капустной совки наблюдалась при совместном действии грибной инфекции и абамектина, и медиана летального времени LT₅₀ составила 6±0,34 суток и достоверно отличалась от выживаемости при заражении грибом (p=0,038). Аддитивный эффект действия грибной инфекции и абамектина наблюдался на 2-10 день эксперимента (χ2<3,78). Полученные результаты показывают ярко выраженный аддитивный эффект комплексного средства в качестве биоинсектицида против капустной совки.

Пример 3. Биологическая эффективность комплексного средства на основе энтомопатогенного гриба Beauveria bassiana и абамектина против гусениц лугового мотылька Loxostege sticticalis.

Лабораторная популяция лугового мотылька была получена из яиц, отложенных бабочками, собранными в природе в окрестностях Новосибирска в 2021 г.Вышедших из яиц гусениц содержали на искусственной питательной среде (ИПС) при температуре 23-25°C и фотопериоде 18 часов свет: 6 ч темнота. Вылетевших имаго содержали на медовом сиропе 12% в отдельных емкостях объемом 0,5 л для спаривания и получения яиц. Лабораторная линия стабильно поддерживается течение более 2 лет без снижения жизнеспособности, весовых характеристик и плодовитости. В экспериментах использовали гусениц 3 возраста.

Лабораторную оценку биологической эффективности проводили следующим образом. 550 мкл раствора абамектина с концентрацией 1,25 мкг/мл вносили в 1,7 г ИПС из расчета на 10 гусениц. В контроле был использован водный раствор, содержащий 0.03% (0,3 мг/мл) неионогенного ПАВ Полисорбат-80 и 250 мкг/мл диметилсульфоксида. После 20 минутного подсушивания при комнатной температуре ИПС помещали в контейнеры к гусеницам (1 повторность=10 гусениц). Гусениц содержали при постоянной температуре 25°C. Замену корма необработанным проводили ежедневно.

Заражение энтомопатогенными грибами проводили методом погружения. Гусениц погружали в суспензию конидий энтомопатогенного гриба Beauveria bassiana с концентрацией 1х10⁸ конидий/мл, затем помещали в контейнеры с ИПС. В контроле был использован водный раствор, содержащий 0.03% (0,3 мг/мл) неионогенного ПАВ Полисорбат-80 и 250 мкг/мл диметилсульфоксида.

Обработку смесью (миксом) из абамектина и конидий гриба с вышеуказанными концентрациями проводили следующим образом. Гусениц погружали в суспензию конидий энтомопатогенного гриба как указано выше. Затем помещали в контейнеры с ИПС, обработанной абамектином как указано выше. Замену корма необработанным проводили ежедневно. Период наблюдения и учет выживаемости гусениц составил 7 суток. В каждом варианте было использовано 40 особей. Полученные результаты отражены в таблице 3.

Таблица 3. Биологическая эффективность против гусениц лугового мотылька Loxostege sticticalis.

Варианты опыта Численность гусениц в опыте Исходная численность Эффективность по дням учета, (% гибели) 2 сутки 3 5 7 Контроль 40 0 0 2 2 B. bassiana 1х10⁸ кон/мл 40 12 15 37 45 Абамектин, 1,25 мкг/мл 40 10 10 40 55 Микс (B. bassiana+абамектин) 40 40 42 62 65

Инфицирование грибами гусениц лугового мотылька привело к выживаемости 55% особей, что значительно отличалось от контроля (p<0,001). Летальное время LT₇₅ при инфицировании грибами составило 4±0,628 суток. Обработка абамектином привела к выживаемости 45% особей на 7 сутки эксперимента, что значительно отличалось от контрольной группы насекомых (p<0,001). Летальное время LT₇₅ при воздействии абамектином составило 4±0,905 суток. Значительно более низкая выживаемость личинок наблюдалась при совместном воздействии грибов и абамектина, LT₅₀ составило 4±0,383 дня, что отличалось от контроля (P<0,001). Синергический эффект действия грибов и авермектинов был зарегистрирован на 2-3 день после воздействия (χ2>7.6, p<0.001). На 4-й день эксперимента наблюдался аддитивный эффект действия агентов (χ2=1,43).

При исследовании совместного действия вторичных метаболитов микроорганизмов (авермектинов) и энтомопатогенных грибов были обнаружены аддитивные и синергические эффекты.

На основании данных, ранее полученных в ходе проведенных нами исследований, были сформированы подходы к созданию прототипов композитных, комплексных биопрепаратов для защиты сельскохозяйственных растений, в том числе зерновых культур, от насекомых-вредителей на основе энтомопатогенных грибов, где в качестве вторичных метаболитов микроорганизмов был выбран абамектин.

Абамектин является высоко гидрофобным соединением, он плохо растворим в воде, хорошо растворим в ряде органических растворителей (ацетон, толуол, этилацетет, ксилол, диметилсульфоксид). Все перечисленные растворители, за исключением диметилсульфоксида (ДМСО), могут быть достаточно токсичны для живых организмов, в том числе энтомопатогенных микроорганизмов, поэтому в качестве растворителя для абамектина был выбран ДМСО.

В качестве поверхностно-активных веществ (ПАВ) для создания стабильных водных суспензий энтомопатогенных микроорганизмов широко применяются полисорбаты - неионогенные ПАВ, которые являются эмульгаторами и стабилизаторами, давно используемыми в биотехнологии, фармакологии и пищевой промышленности, поэтому в качестве ПАВ был выбран Полисорбат-80.

Полученные результаты являются базой для создания линейки инновационных комплексных биологических средств защиты растений от насекомых-вредителей сельского хозяйства и позволят повысить эффективность применения биопрепаратов, что крайне важно для расширения возможностей получения органической сельхозпродукции.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой комплексное средство для биологической защиты сельскохозяйственных растений, обладающее инсектоакарицидным действием, характеризующееся тем, что оно содержит водную суспензию конидий энтомопатогенного гриба Beauveria bassiana в количестве от 1×10⁷ до 1×10⁸ конидий/мл, в качестве вторичных метаболитов микроорганизмов авермектины в количестве 0,05-5 мкг/мл, неионогенное поверхностно-активное вещество Полисорбат-80 в количестве 0,3 мг/мл, диметилсульфоксид в качестве растворителя и стабилизатора для авермектинов в количестве 0,01-1 мг/мл. Изобретение защищает сельскохозяйственные растения от насекомых-вредителей. 3 табл, 3 пр.

Комплексное средство для биологической защиты сельскохозяйственных растений, обладающее инсектоакарицидным действием, характеризующееся тем, что оно содержит водную суспензию конидий энтомопатогенного гриба Beauveria bassiana в количестве от 1×10⁷ до 1×10⁸ конидий/мл, в качестве вторичных метаболитов микроорганизмов авермектинов выбран абамектин в количестве 0,05–1,25 мкг/мл, неионогенное поверхностно-активное вещество Полисорбат-80 в количестве 0,3 мг/мл, диметилсульфоксид в качестве растворителя и стабилизатора для авермектинов в количестве 0,01-0,25 мг/мл.